JP5417752B2 - 高精度の標的核酸の検出方法および標的核酸検出用キット - Google Patents

Description

本発明は、核酸検出方法であるインベーダアッセイ法における検出精度を向上させることができる標的核酸の検出方法、および該検出方法に好適な標的核酸検出用キットに関する。

インベーダアッセイ法は、標的核酸にハイブリダイズし得る２種類のオリゴヌクレオチドを用いて、特異的な重なりあった構造を有する開裂構造体を構成し、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により、得られた開裂構造体を切断し、この切断断片を検出することにより、標的核酸を検出する方法である（例えば、特許文献１または２参照。）。

具体的には、標的核酸上の隣接する異なる部位に、２種類のオリゴヌクレオチドを、それぞれアニーリングさせたときに、１方のオリゴヌクレオチドの５’側を、標的核酸にアニーリングしている他方のオリゴヌクレオチドにオーバーラップさせるようにアニーリングさせ、特異的な重なりあった構造を有する開裂構造体を構成させる。該構造は、一方のオリゴヌクレオチドの下方に、他方のオリゴヌクレオチドの一部が侵入していることから、インベーダ反応と呼ばれており、この侵入するオリゴヌクレオチドを侵入オリゴヌクレオチド、オーバーラップしているオリゴヌクレオチドをアレルオリゴヌクレオチドという。該開裂構造体中のこの侵入構造を、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素が認識し、アレルオリゴヌクレオチドの５’側のオーバーラップしている部位を切断する。この切断されるアレルオリゴヌクレオチドを、５’ヌクレアーゼ活性による切断反応温度に近い融点を持つように設計することにより、切断後に残された標的核酸とアニーリングしていた部位も標的核酸から解離するため、切断前のアレルオリゴヌクレオチドが新たにアニーリングすることにより、再び開裂構造体が構成され、切断反応が繰り返され、切断された断片（フラップ断片）が増幅されていく。このため、このフラップ断片を測定することにより、標的塩基を検出することができる。

フラップ断片の測定方法として、様々な方法が開示されている。例えば、二次反応として、標的核酸とは異なる検出用核酸に、フラップ断片を侵入オリゴヌクレオチド、他のオリゴヌクレオチドをアレルオリゴヌクレオチドとして、それぞれアニーリングさせることにより開裂構造体を構成し、一次反応と同様にしてアレルオリゴヌクレオチドを切断し、第２次フラップ断片を増幅し、この第２次フラップ断片を検出することもできる（例えば、特許文献１参照。）。また、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、蛍光共鳴エネルギー移動)反応を利用して測定する方法も開示されている（例えば、非特許文献１参照。）。具体的には、分子内ヘアピン構造を有するＦＲＥＴプローブ（蛍光部位（Ｆ）と抑制部位（Ｑ）を有するプローブ）に、該フラップ断片が侵入オリゴヌクレオチドとして働くことにより開裂構造体を構成し、ＦＲＥＴプローブを切断して蛍光部位（Ｆ）と抑制部位（Ｑ）を分離させ、生じた蛍光シグナルを測定することにより、高感度にフラップ断片を測定することができる。これらのフラップ断片の測定反応は、フラップ断片の産生反応と同じ反応溶液中で同時に進行させることができる。

その他、インベーダアッセイの標的核酸を、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅し、より標的核酸の検出感度を高める方法も開示されている。例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）Ｐｌｕｓ検出キット（サードウェイブ社製）等のように、標的核酸増幅のためのＰＣＲとインベーダアッセイとを同一の反応系で行うことができるキット等も開示されている。具体的には、インベーダ反応の反応溶液に、ＰＣＲ増幅プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、伸長反応の基質となるｄＮＴＰ等を添加し、インベーダ反応前に温度の上下によりＰＣＲを行い、標的核酸を指数的に増幅する。このとき、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応と、５’ヌクレアーゼ活性によるインベーダ反応とが、互いに阻害しないためのバッファーおよび最適塩濃度を用いる（例えば、特許文献３参照。）。

一方で、核酸分子、特にＧＣリッチな核酸分子のＰＣＲによる増幅等を増強させ得る添加剤として、ベタインが広く用いられている（例えば、特許文献４〜７参照。）。
特表２００１−５１８８０５号公報 特表２００２−５１５７３７号公報 特表２００４−５３６５６２号公報 特表２００２−５０５８８６号公報 特表２０００−５１３５８５号公報 国際公開０１／０７７３１７号パンフレット 国際公開０１／０３４８３８号パンフレット ホール（Ｈａｌｌ），Ｊ・Ｇ、外１２名、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッドステーツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、２０００年、第９７巻第１５号、第８２７２〜８２７７ページ。

インベーダアッセイ法は、精度や感度に優れた標的核酸の検出技術である。しかしながら、未切断のアレルオリゴヌクレオチドが、フラップ断片の測定における精度を低下させてしまうという問題がある。例えば、非特許文献１には、フラップ断片の測定を、上述したＦＲＥＴプローブを用いて行う場合に、未切断のアレルオリゴヌクレオチドがＦＲＥＴプローブにハイブリダイズし、測定信号のバックグラウンド上昇の要因となることが報告されている。実際に、発明者が行った実験でも、バックグラウンド値は鋳型量（標的核酸量）と相関性を示すという結果が得られた。エンドポイント測定の場合には、リアルタイム測定（時間軸で検出値を測定する測定法）の場合よりも、バックグラウンドと正常反応の違いが判別し難く、このため、バックグラウンドと正常反応を区別できず、標的核酸の検出精度が損なわれるおそれが高い。
一方で、ベタインは、ＰＣＲ等に対する添加剤としては使用されているものの、インベーダアッセイにおける添加剤としては知られてはいなかった。

本発明は、核酸検出方法であるインベーダアッセイ法における検出精度を向上させることができる標的核酸の検出方法、および該検出方法に好適な標的核酸検出用キットを提供することを目的とする。

本発明は、
（１） 標的核酸を検出するための方法であって、（ａ）標的核酸と第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとで、第１開裂構造体を形成させる工程と、（ｂ）ベタイン存在下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ａ）において生成された第１開裂構造体を構成している前記第１オリゴヌクレオチドを開裂させ、前記第１オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第３オリゴヌクレオチドを生成させる工程と、（ｃ）工程（ｂ）において生成された第３オリゴヌクレオチドを検出する工程と、を有し、前記標的核酸は第１領域、第２領域および第３領域を含み、該第１領域は第２領域に隣接してその下流に位置し、該第２領域は第３領域に隣接してその下流に位置するものであり、前記第１オリゴヌクレオチドは、３’側部分に標的核酸の前記第３領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、前記第２オリゴヌクレオチドは、３’側部分に標的核酸の前記第２領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、５’側部分に標的核酸の前記第１領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、前記第１開裂構造体は、前記第２オリゴヌクレオチドが前記標的核酸の前記第１領域および前記第２領域にアニーリングし、かつ前記第１オリゴヌクレオチドが前記標的核酸の第３領域にアニーリングした時に、前記第１オリゴヌクレオチドの前記標的核酸の第３領域とアニーリングした領域の５’側部分は、前記標的核酸の第２領域にアニーリングした第２オリゴヌクレオチドの該３’側部分中の１以上のヌクレオチド配列とオーバーラップするように形成された構造体であり、前記工程（ｂ）における第１オリゴヌクレオチドの開裂部位が、第２オリゴヌクレオチドとオーバーラップしている部位にあり、前記工程（ａ）〜（ｃ）を終濃度が０．８〜１．０Ｍのベタイン存在下で行うことを特徴とする、標的核酸の検出方法、
（２） 前記工程（ｃ）が、（ｄ）工程（ｂ）において生成された第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドと検出用核酸とで、第２α開裂構造体を形成させる工程と、（ｅ）５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ｄ）において生成された第２α開裂構造体を構成している前記第４オリゴヌクレオチドを開裂させ、前記第４オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第５オリゴヌクレオチドを生成させる工程と、（ｆ）工程（ｅ）において生成された第５オリゴヌクレオチドを検出する工程と、を有し、前記検出用核酸は第１領域、第２領域および第３領域を含み、該第１領域は第２領域に隣接してその下流に位置し、該第２領域は第３領域に隣接してその下流に位置するものであり、前記第４オリゴヌクレオチドは、３’側部分に検出用核酸の前記第３領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、前記第３オリゴヌクレオチドは、３’側部分に検出用核酸の前記第２領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、５’側部分に検出用核酸の前記第１領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、前記第２α開裂構造体は、前記第３オリゴヌクレオチドが前記検出用核酸の前記第１領域および前記第２領域にアニーリングし、かつ前記第４オリゴヌクレオチドが前記検出用核酸の第３領域にアニーリングした時に、前記第４オリゴヌクレオチドの前記検出用核酸の第３領域とアニーリングした領域の５’側部分は、前記検出用核酸の第２領域にアニーリングした前記第３オリゴヌクレオチドの該３’側部分中の１以上のヌクレオチド配列とオーバーラップするように形成された構造体であり、前記工程（ｅ）における第４オリゴヌクレオチドの開裂部位が、第３オリゴヌクレオチドとオーバーラップしている部位にあり、前記工程（ｄ）〜（ｆ）を終濃度が０．８〜１．０Ｍのベタイン存在下で行うことを特徴とする、前記（１）記載の標的核酸の検出方法、
（３） 前記工程（ｃ）が、（ｇ）工程（ｂ）において生成された第３オリゴヌクレオチドと第６オリゴヌクレオチドとで、第２β開裂構造体を形成させる工程と、（ｈ）５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ｇ）において生成された第２β開裂構造体を構成している前記第６オリゴヌクレオチドを開裂させ、前記第６オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第７オリゴヌクレオチドを生成させる工程と、（ｉ）工程（ｈ）において生成された第７オリゴヌクレオチドを検出する工程と、を有し、前記第６オリゴヌクレオチドは、第１領域、第２領域および第３領域を含み、該第１領域は第２領域に隣接してその下流に位置し、該第２領域は第３領域に隣接してその下流に位置するものであり、該第１領域は前記第３オリゴヌクレオチドに完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、該第２領域は分子内ヘアピン構造を形成し得るヌクレオチド配列を有し、前記第２β開裂構造体は、前記第３オリゴヌクレオチドが前記第６オリゴヌクレオチドの前記第１領域にアニーリングし、かつ前記第６オリゴヌクレオチドの前記第２領域が分子内ヘアピン構造を形成した時に、前記第６オリゴヌクレオチドの前記第３領域が、前記第６オリゴヌクレオチドの第１領域にアニーリングした前記第３オリゴヌクレオチドの該３’側部分中の１以上のヌクレオチド配列とオーバーラップするように形成された構造体であり、前記工程（ｈ）における第６オリゴヌクレオチドの開裂部位が、第３オリゴヌクレオチドとオーバーラップしている部位にあり、前記工程（ｇ）〜（ｉ）を終濃度が０．８〜１．０Ｍのベタイン存在下で行うことを特徴とする、前記（１）記載の標的核酸の検出方法、
（４） 前記工程（ｃ）が、（ｊ）工程（ｂ）において生成された第３オリゴヌクレオチドと第８オリゴヌクレオチドとで、第２γ開裂構造体を形成させる工程と、（ｋ）５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ｊ）において生成された第２γ開裂構造体を構成している前記第８オリゴヌクレオチドを開裂させ、前記第８オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第９オリゴヌクレオチドを生成させる工程と、（ｌ）工程（ｋ）において生成された第９オリゴヌクレオチドを検出する工程と、を有し、前記第３オリゴヌクレオチドは、第１領域、第２領域および第３領域を含み、該第１領域は第２領域に隣接してその下流に位置し、該第２領域は第３領域に隣接してその下流に位置するものであり、該第２領域は該第１領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、前記第８オリゴヌクレオチドは、３’側部分に第３オリゴヌクレオチドの前記第３領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、前記第２γ開裂構造体は、前記第３オリゴヌクレオチドの前記第１領域が前記第２領域にアニーリングして分子内ヘアピン構造を形成し、かつ前記第８オリゴヌクレオチドが前記第３オリゴヌクレオチドの前記第３領域にアニーリングした時に、前記第８オリゴヌクレオチドの前記第３オリゴヌクレオチドの第３領域とアニーリングした領域の５’側部分は、前記第３オリゴヌクレオチドの第２領域にアニーリングした前記第１領域中の１以上のヌクレオチド配列とオーバーラップするように形成された構造体であり、前記工程（ｋ）における第８オリゴヌクレオチドの開裂部位が、第３オリゴヌクレオチドとオーバーラップしている部位にあり、前記工程（ｊ）〜（ｌ）を終濃度が０．８〜１．０Ｍのベタイン存在下で行うことを特徴とする、前記（１）記載の標的核酸の検出方法、
（５） 前記標的核酸が、遺伝子多型を含む核酸であることを特徴とする、前記（１）〜（４）のいずれか記載の標的核酸の検出方法、
（６） 前記（１）〜（５）のいずれか記載の標的核酸の検出方法に用いられるキットであって、前記第１オリゴヌクレオチド、前記第２オリゴヌクレオチド、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤、反応用バッファー、およびベタインからなる群より選択される１以上を含むことを特徴とする標的核酸検出用キット、
を提供する。

本発明の標的核酸の検出方法により、すなわち、ベタイン存在下でインベーダ反応を行うことにより、インベーダ反応におけるバックグラウンドを抑制し、標的核酸の検出精度を改善することができる。
また、本発明の標的核酸検出用キットを用いることにより、従来法よりも簡便かつ高精度に、標的核酸を検出することが可能となる。

本発明において、標的核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。また、二本鎖核酸であってもよく、一本鎖核酸であってもよい。二本鎖核酸である場合には、インベーダ反応前に、変性処理により一本鎖化しておくことにより、本発明の標的核酸検出方法に用いることができる。

本発明において、標的核酸は、天然のものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。例えば、血液等の生体試料から抽出された天然の核酸であってもよく、ＰＣＲ等により増幅されたものや、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等であってもよい。本発明においては、標的核酸として、生体試料由来の核酸、または該核酸を鋳型として増幅・合成された核酸であることが好ましい。生体試料としては、動物、植物、微生物等のいかなる生物種由来の生体試料であってもよい。

本発明において、標的核酸とは、検出対象である特定のヌクレオチド配列を有する核酸である。標的核酸は、該核酸とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを設計・合成することが可能な程度にヌクレオチド配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。本発明においては、標的核酸として、遺伝子多型を含むヌクレオチド配列を有する核酸であることが好ましい。本発明の標的核酸の検出方法は検出精度が良好であるため、検出結果に高い信頼性を要求される遺伝子多型の検出に好適であるためである。特にＳＮＰ（一塩基多型）を含むヌクレオチド配列を有する核酸であることが好ましい。

本発明の標的核酸の検出方法は、ベタインを添加した反応溶液中でインベーダ反応を行うことを特徴とする。ベタイン存在下でインベーダ反応を行うことにより、標的核酸の検出精度を向上させることができる。このような効果が得られる理由は明らかではないが、ベタインにより、各オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率、特に、反応温度に近い融点（Ｔｍ値）を持つように設計されているアレルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率を低下させることができる結果、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤の特異性が改善されるためと推察される。アレルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率が低下することにより、全体的な反応値は減少傾向になるが、特にバックグラウンド値が下がるため、ｓ／ｎ比が高くなる。

インベーダ反応は、例えば、特許文献１等に記載の方法により行うことができる。具体的には、本発明の標的核酸の検出方法は、（ａ）標的核酸と第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとで、第１開裂構造体を形成させる工程と、（ｂ）５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ａ）において生成された第１開裂構造体を構成している前記第１オリゴヌクレオチドを開裂させ、前記第１オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第３オリゴヌクレオチドを生成させる工程と、（ｃ）工程（ｂ）において生成された第３オリゴヌクレオチドを検出する工程と、を有し、前記標的核酸は第１領域、第２領域および第３領域を含み、該第１領域は第２領域に隣接してその下流に位置し、該第２領域は第３領域に隣接してその下流に位置するものであり、前記第１オリゴヌクレオチドは、３’側部分に標的核酸の前記第３領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、前記第２オリゴヌクレオチドは、３’側部分に標的核酸の前記第２領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、５’側部分に標的核酸の前記第１領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、前記第１開裂構造体は、前記第２オリゴヌクレオチドが前記標的核酸の前記第１領域および前記第２領域にアニーリングし、かつ前記第１オリゴヌクレオチドが前記標的核酸の第３領域にアニーリングした時に、前記第１リゴヌクレオチドの前記標的核酸の第３領域とアニーリングした領域の５’側部分は、前記標的核酸の第２領域にアニーリングした第２オリゴヌクレオチドの該３’側部分中の１以上のヌクレオチド配列とオーバーラップするように形成された構造体であり、前記工程（ｂ）における第１オリゴヌクレオチドの開裂部位が、第２オリゴヌクレオチドとオーバーラップしている部位にあり、前記工程（ａ）〜（ｃ）をベタイン存在下で行うことを特徴とする。
以下、工程ごとに説明する。

まず、工程（ａ）として、標的核酸と第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとで、第１開裂構造体を形成させる。ここで、標的核酸は第１領域（以下、Ｔ１領域、ということがある。）、第２領域（以下、Ｔ２領域、ということがある。）および第３領域（以下、Ｔ３領域、ということがある。）を含み、Ｔ１領域はＴ２領域に隣接してその下流に位置し、Ｔ２領域はＴ３領域に隣接してその下流に位置する。また、第１オリゴヌクレオチドは、３’側部分にＴ３領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有するものであり、第２オリゴヌクレオチドは、３’側部分にＴ２領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、５’側部分にＴ１領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有するものである。

つまり、第１オリゴヌクレオチドは、標的核酸のＴ３領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであり、第２オリゴヌクレオチドは、標的核酸のＴ１領域およびＴ２領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである。このため、反応溶液中に、標的核酸と第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとを添加し混合することにより、第２オリゴヌクレオチドがＴ１領域およびＴ２領域にアニーリングし、かつ第１オリゴヌクレオチドがＴ３領域にアニーリングした時に、第１オリゴヌクレオチドのうち、Ｔ３領域にアニーリングした領域の５’側部分が、Ｔ２領域にアニーリングした第２オリゴヌクレオチドの３’側部分中の１以上のヌクレオチド配列とオーバーラップするように形成された第１開裂構造体を得ることができる。

図１は、第１開裂構造体を模式的に示した図である。図中、「１」は標的核酸を、「Ｔ１」〜「Ｔ３」はＴ１領域〜Ｔ３領域を、「ｎ１」は第１オリゴヌクレオチドを、「ｎ２」は第２オリゴヌクレオチドを、それぞれ示している。このように、第２オリゴヌクレオチドが第１オリゴヌクレオチドの下に侵入し、第１オリゴヌクレオチドの５’側がその上にオーバーラップした分岐構造をとっており、この第１開裂構造体においては、第１オリゴヌクレオチドが上述したアレルオリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチドが上述した侵入オリゴヌクレオチドとして働く。

次に、工程（ｂ）として、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ａ）において生成された第１開裂構造体を構成している第１オリゴヌクレオチドを開裂させ、第１オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第３オリゴヌクレオチドを生成させる。ここで用いられる５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤は、第１開裂構造体中の分岐構造、すなわち、第１オリゴヌクレオチドの、Ｔ３領域とアニーリングしている３’側部分と、第２オリゴヌクレオチドにオーバーラップした５’側部分の境界部分（図１中、「▼」で示した部分）を認識して切断する。この切断により生成された第１オリゴヌクレオチドのＴ３領域にアニーリングした領域の５’側部分からなるオリゴヌクレオチドを、第３オリゴヌクレオチドとする。

工程（ｂ）において、切断反応が生じた後、第１オリゴヌクレオチドのＴ３領域とアニーリングしている３’側部分が、標的核酸から解離すると、未切断の第１オリゴヌクレオチドが再びＴ３領域とアニーリングし、第１開裂構造体を形成する。これにより、熱変性等の操作を要することなく、インベーダ反応が繰り返され、微量な標的核酸も高感度に検出することができる。

本発明において用いられる第１オリゴヌクレオチドや第２オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレオチド配列、用いる開裂剤の種類、インベーダ反応における反応温度、反応溶液の種類等を考慮して、常法により設計し合成することができる。ここで、第２オリゴヌクレオチドのＴｍ値が、反応温度よりも十分に高い場合には、第２オリゴヌクレオチドと標的核酸とのハイブリダイゼーションが強くなりすぎる恐れがある。一方、第２オリゴヌクレオチドのＴｍ値が、反応温度よりも低すぎる場合には、標的核酸とのアニーリング効率が悪くなりすぎる。そこで、第２オリゴヌクレオチドのＴｍ値は、反応温度程度であることが好ましい。

また、インベーダ反応が効率よく繰り返されるためには、切断反応後速やかに第１オリゴヌクレオチドの３’側部分が、Ｔ３領域から解離することが必要である。このため、第１オリゴヌクレオチドのＴ３領域とハイブリダイズする領域のＴｍ値が、インベーダ反応の反応温度よりも十分に低いことが好ましい。

また、第２オリゴヌクレオチド中、Ｔ２領域に完全に相補的なヌクレオチド配列の３’端が、第２オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目のヌクレオチドであることが好ましい。これにより、第２オリゴヌクレオチドの３’末端が、第１オリゴヌクレオチドのＴ３領域とアニーリングする部位の５’端のヌクレオチドとオーバーラップするため、効率よく、第１開裂構造体を得ることができる。この場合に、第２オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドは、標的核酸の対応するヌクレオチドと相補的なヌクレオチドであってもよく、非相補的なヌクレオチドであってもよいが、非相補的なヌクレオチドであることがより好ましい。第１開裂構造体中の分岐構造部分がより不安定となり、インベーダ反応の効率がより改善されるためである。

標的核酸が、遺伝子多型等のヌクレオチド配列中の特定のヌクレオチド（標的塩基）を含むものである場合には、この標的塩基は、標的核酸中、Ｔ２領域又はＴ３領域にあることが好ましく、第１開裂構造体中の分岐構造付近にあることが好ましく、分岐構造付近のＴ２領域にあることがより好ましい。分岐構造付近に標的塩基がくるように、第１オリゴヌクレオチドや第２オリゴヌクレオチドを設計することにより、標的塩基の検出精度を向上させることができる。

工程（ｂ）において用いられる５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤は、前記分岐構造を認識し得るものであって５’ヌクレアーゼ活性を有するものであれば、特に限定されるものではないが、構造特異的酵素であることが好ましい。また、５’ヌクレアーゼ活性のみを有する酵素であってもよく、他の酵素活性を有する酵素であってもよい。また、このような構造特異的酵素は、いかなる生物種由来の酵素であってもよく、合成酵素であってもよい。このような開裂剤として、例えば、５’ヌクレアーゼ活性を有する天然のＤＮＡポリメラーゼであってもよく、５’ヌクレアーゼ活性を有するがポリメラーゼ活性を欠く修飾ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。より具体的には、例えば、クリーブアーゼ（Ｃｌｅａｖａｓｅ）（登録商標、サードウェイブ社製）、ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ等が挙げられる。

本発明においては、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤として、５’ヌクレアーゼ活性を有する耐熱性酵素であることが好ましい。耐熱性酵素を用いることにより、標的核酸を予めＰＣＲにより増幅させたものを用いる場合に、同一の反応系を用いてＰＣＲとインベーダ反応を行うことができる。

本発明の標的核酸の検出方法において、反応溶液中に添加するベタイン量は、添加によるバックグラウンド低減効果の検出精度向上効果が得られる量であれば、特に限定されるものではないが、０．５Ｍ〜１．５Ｍであることが好ましく、０．６Ｍ〜１．４Ｍであることがより好ましく、０．８Ｍ〜１．２Ｍであることがさらに好ましい。

また、反応溶液に添加する第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドの量は、特に限定されるものではないが、第２オリゴヌクレオチドよりも第１オリゴヌクレオチドを多く添加することが好ましい。第１オリゴヌクレオチドの添加量が多い場合に、より効率よくインベーダ反応が繰り返されることが期待できるためである。例えば、第１オリゴヌクレオチドの添加量を、第２オリゴヌクレオチドの添加量の２倍以上にすることが好ましく、２〜１００倍程度にすることがより好ましく、５〜５０倍程度にすることがさらに好ましく、１０倍程度にすることが特に好ましい。

なお、反応溶液の組成は、開裂構造体を形成し得るものであって、かつ用いる開裂剤の５’ヌクレアーゼ活性を阻害しない組成であれば、特に限定されるものではなく、標的核酸の種類、第１オリゴヌクレオチドや第２オリゴヌクレオチドの種類、使用する開裂剤の種類等を考慮して、適宜決定することができる。また、反応温度も、使用する開裂剤の種類、第１オリゴヌクレオチドや第２オリゴヌクレオチドのＴｍ値等を考慮して、適宜決定することができる。

次に、工程（ｃ）として、工程（ｂ）において生成された第３オリゴヌクレオチドを検出することにより、標的核酸を検出することができる。第３オリゴヌクレオチドの検出方法は、特に限定されるものではなく、核酸を検出する場合に通常使用されるいずれの方法を用いてもよい。このような検出方法として、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー法、質量分析法等がある。その他、第３オリゴヌクレオチドとなる第１オリゴヌクレオチドの５’側部分を予め標識分子を用いて標識しておき、該標識分子を常法により検出することによっても、第３オリゴヌクレオチドを検出することができる。該標識分子として、例えば、蛍光分子、放射性同位体分子、ビオチンやジゴキシゲニン等のハプテン等が挙げられる。

第３オリゴヌクレオチドの検出は、第３オリゴヌクレオチドを直接検出する方法以外にも、例えば、第３オリゴヌクレオチドを侵入オリゴヌクレオチドとして、インベーダ反応を行うことによっても、検出することができる。具体的には、例えば、下記工程（ｄ）〜（ｆ）を行うことにより、第３オリゴヌクレオチドを検出することができる。
以下、工程ごとに説明する。

まず、工程（ｄ）として、工程（ｂ）において生成された第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドと検出用核酸とで、第２α開裂構造体を形成させる。ここで、検出用核酸は第１領域（以下、Ｄ１領域、ということがある。）、第２領域（以下、Ｄ２領域、ということがある。）および第３領域（以下、Ｄ３領域、ということがある。）を含み、Ｄ１領域はＤ２領域に隣接してその下流に位置し、Ｄ２領域はＤ３領域に隣接してその下流に位置する。また、第４オリゴヌクレオチドは、３’側部分に検出用核酸の前記第３領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有するものであり、第３オリゴヌクレオチドは、３’側部分に検出用核酸の前記第２領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、５’側部分に検出用核酸の前記第１領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有するものである。

つまり、第４オリゴヌクレオチドは、検出用核酸のＤ３領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであり、第３オリゴヌクレオチドは、検出用核酸のＤ１領域およびＤ２領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである。このため、反応溶液中に、検出用核酸と第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドとを添加し混合することにより、第３オリゴヌクレオチドがＤ１領域およびＤ２領域にアニーリングし、かつ第４オリゴヌクレオチドがＤ３領域にアニーリングした時に、第４オリゴヌクレオチドのうち、Ｄ３領域とアニーリングした領域の５’側部分が、Ｄ２領域にアニーリングした第３オリゴヌクレオチドの３’側部分中の１以上のヌクレオチド配列とオーバーラップするように形成された第２α開裂構造体を得ることができる。

図２は、第２α開裂構造体を模式的に示した図である。図中、「２」は検出用核酸を、「Ｄ１」〜「Ｄ３」はＤ１領域〜Ｄ３領域を、「ｎ３」は第３オリゴヌクレオチドを、「ｎ４」は第４オリゴヌクレオチドを、それぞれ示している。このように、第３オリゴヌクレオチドが第４オリゴヌクレオチドの下に侵入し、第４オリゴヌクレオチドの５’側がその上にオーバーラップした分岐構造をとっており、この第２α開裂構造体においては、第４オリゴヌクレオチドがアレルオリゴヌクレオチド、第３オリゴヌクレオチドが侵入オリゴヌクレオチドとして働く。

次に、工程（ｅ）として、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ｄ）において生成された第２α開裂構造体を構成している第４オリゴヌクレオチドを開裂させ、第４オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第５オリゴヌクレオチドを生成させる。具体的には、工程（ｂ）と同様にして、図２中、「▼」で示されている、第４オリゴヌクレオチドの、Ｄ３領域とアニーリングしている３’側部分と、第３オリゴヌクレオチドにオーバーラップした５’側部分の境界部分が、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により切断される。この切断により生成された第４オリゴヌクレオチドのＤ３領域とアニーリングした領域の５’側部分からなるオリゴヌクレオチドを、第５オリゴヌクレオチドとする。その後、工程（ｆ）において、生成した第５オリゴヌクレオチドを検出することにより、第３オリゴヌクレオチドを検出することができる。

また、例えば、下記工程（ｇ）〜（ｉ）を行うことにより、第３オリゴヌクレオチドを検出することができる。以下、工程ごとに説明する。
まず、工程（ｇ）として、工程（ｂ）において生成された第３オリゴヌクレオチドと第６オリゴヌクレオチドとで、第２β開裂構造体を形成させる。ここで、第６オリゴヌクレオチドは、第１領域（以下、Ｐ６−１領域、ということがある。）、第２領域（以下、Ｐ６−２領域、ということがある。）および第３領域（以下、Ｐ６−３領域、ということがある。）を含み、Ｐ６−１領域はＰ６−２領域に隣接してその下流に位置し、Ｐ６−２領域はＰ６−３領域に隣接してその下流に位置するものであり、Ｐ６−１領域は第３オリゴヌクレオチドに完全に相補的なヌクレオチド配列を有するものであり、Ｐ６−２領域は分子内ヘアピン構造を形成し得るヌクレオチド配列を有するものである。

つまり、第６オリゴヌクレオチドは、第３オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、かつ、分子内ヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチドである。このため、反応溶液中に、第３オリゴヌクレオチドと第６オリゴヌクレオチドとを添加し混合することにより、第３オリゴヌクレオチドがＰ６−１領域にアニーリングし、かつ隣接するＰ６−２領域が分子内ヘアピン構造を形成した時に、第６オリゴヌクレオチドの５’側部分であるＰ６−３領域が、Ｐ６−１領域にアニーリングした第３オリゴヌクレオチドの３’側部分中の１以上のヌクレオチド配列とオーバーラップするように形成された第２β開裂構造体を得ることができる。

図３は、第２β開裂構造体を模式的に示した図である。図中、「ｎ３」は第３オリゴヌクレオチドを、「ｎ６」は第６オリゴヌクレオチドを、「Ｐ６−１」〜「Ｐ６−３」はＰ６−１領域〜Ｐ６−３領域を、それぞれ示している。このように、第３オリゴヌクレオチドが第６オリゴヌクレオチドの下に侵入し、第６オリゴヌクレオチドのＰ６−３領域がその上にオーバーラップした分岐構造をとっており、この第２β開裂構造体においては、第６オリゴヌクレオチドがアレルオリゴヌクレオチド、第３オリゴヌクレオチドが侵入オリゴヌクレオチドとして働く。

次に、工程（ｉ）として、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ｇ）において生成された第２β開裂構造体を構成している第６オリゴヌクレオチドを開裂させ、第６オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第７オリゴヌクレオチドを生成させる。具体的には、工程（ｂ）と同様にして、図３中、「▼」で示されている、第６オリゴヌクレオチドの、Ｐ６−２領域と、第３オリゴヌクレオチドにオーバーラップした５’側部分のＰ６−３領域との境界部分が、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により切断される。この切断により生成された第６オリゴヌクレオチドのＰ６−２領域の５’側部分からなるオリゴヌクレオチドを、第７オリゴヌクレオチドとする。その後、工程（ｆ）において、生成した第７オリゴヌクレオチドを検出することにより、第３オリゴヌクレオチドを検出することができる。

その他、例えば、下記工程（ｊ）〜（ｌ）を行うことにより、第３オリゴヌクレオチドを検出することができる。以下、工程ごとに説明する。
まず、工程（ｊ）として、工程（ｂ）において生成された第３オリゴヌクレオチドと第８オリゴヌクレオチドとで、第２γ開裂構造体を形成させる。ここで、第３オリゴヌクレオチドは、第１領域（以下、Ｐ３−１領域、ということがある。）、第２領域（以下、Ｐ３−２領域、ということがある。）および第３領域（以下、Ｐ３−３領域、ということがある。）を含み、Ｐ３−１領域はＰ３−２領域に隣接してその下流に位置し、Ｐ３−２領域はＰ３−３領域に隣接してその下流に位置するものであり、Ｐ３−２領域はＰ３−１領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有するものである。また、第８オリゴヌクレオチドは、３’側部分に第３オリゴヌクレオチドのＰ３−３領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有するものである。

つまり、第３オリゴヌクレオチドは、第８オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、かつ、分子内ヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチドである。このため、反応溶液中に、第３オリゴヌクレオチドと第８オリゴヌクレオチドとを添加し混合することにより、第８オリゴヌクレオチドがＰ３−３領域にアニーリングし、かつ隣接するＰ３−２領域とＰ３−１領域とにより分子内ヘアピン構造を形成した時に、第８オリゴヌクレオチドのうち、Ｐ３−３領域にアニーリングした領域の５’側部分が、第３オリゴヌクレオチドの３’側のＰ３−１領域中の１以上のヌクレオチド配列とオーバーラップするように形成された第２γ開裂構造体を得ることができる。

図４は、第２γ開裂構造体を模式的に示した図である。図中、「ｎ３」は第３オリゴヌクレオチドを、「ｎ８」は第８オリゴヌクレオチドを、「Ｐ３−１」〜「Ｐ３−３」はＰ３−１領域〜Ｐ３−３領域を、それぞれ示している。このように、第３オリゴヌクレオチドが第８オリゴヌクレオチドの下に侵入し、第８オリゴヌクレオチドの５’側がその上にオーバーラップした分岐構造をとっており、この第２γ開裂構造体においては、第８オリゴヌクレオチドがアレルオリゴヌクレオチド、第３オリゴヌクレオチドが侵入オリゴヌクレオチドとして働く。

次に、工程（ｋ）として、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ｊ）において生成された第２γ開裂構造体を構成している第８オリゴヌクレオチドを開裂させ、第８オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第９オリゴヌクレオチドを生成させる。具体的には、工程（ｂ）と同様にして、図４中、「▼」で示されている、第８オリゴヌクレオチドの、Ｐ３−３領域とアニーリングしている３’側部分と、第３オリゴヌクレオチドにオーバーラップした５’側部分との境界部分が、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により切断される。この切断により生成された第８オリゴヌクレオチドのＰ３−３領域にアニーリングした領域の５’側部分からなるオリゴヌクレオチドを、第９オリゴヌクレオチドとする。その後、工程（ｆ）において、生成した第９オリゴヌクレオチドを検出することにより、第３オリゴヌクレオチドを検出することができる。

このように、インベーダ反応を行うことによって第３オリゴヌクレオチドを検出する場合には、該インベーダ反応を、第３オリゴヌクレオチドを産生するインベーダ反応と同様に、ベタイン存在下で行うことが好ましい。具体的には、工程（ｄ）〜（ｆ）、下記工程（ｇ）〜（ｉ）、および工程（ｊ）〜（ｌ）を、工程（ａ）〜（ｃ）と同様に、それぞれベタインを添加した反応溶液中で行うことが好ましい。

また、ＦＲＥＴ法を利用することにより、高感度に第３オリゴヌクレオチドを検出することができる。具体的には、例えば、工程（ｄ）〜（ｆ）において、第４オリゴヌクレオチドとして、５’側部分（第５オリゴヌクレオチドとなる部分）に蛍光部位（Ｆ）として機能する蛍光分子を、Ｄ３領域とアニーリングする部位に抑制部位（Ｑ）として機能する蛍光分子を、それぞれ標識しものを用いる。これにより、工程（ｅ）における切断反応により、蛍光部位（Ｆ）と抑制部位（Ｑ）が分離し、蛍光シグナルが発生する。この蛍光シグナルを検出することにより、第３オリゴヌクレオチドを検出することができる。同様に、例えば、工程（ｊ）〜（ｌ）において、第６オリゴヌクレオチドとして、５’側部分（第７オリゴヌクレオチドとなる部分）に蛍光部位（Ｆ）として機能する蛍光分子を、Ｐ６−２領域中に抑制部位（Ｑ）として機能する蛍光分子を、それぞれ標識しものを用いることによって、ＦＲＥＴ法を利用することができる。さらに、工程（ｊ）〜（ｌ）においては、第８オリゴヌクレオチドとして、５’側部分（第９オリゴヌクレオチドとなる部分）に蛍光部位（Ｆ）として機能する蛍光分子を、Ｐ３−３領域とアニーリングする部位に抑制部位（Ｑ）として機能する蛍光分子を、それぞれ標識しものを用いることによって、ＦＲＥＴ法を利用することができる。

なお、各工程で用いられるオリゴヌクレオチドや検出用核酸は、第１オリゴヌクレオチド等と同様に、検出用核酸等のアニーリングする核酸のヌクレオチド配列、用いる開裂剤の種類、インベーダ反応における反応温度、反応溶液の種類等を考慮して、常法により設計し合成することができる。

その他、本発明の標的核酸の検出方法において用いられる標的核酸として、予めＰＣＲ増幅したものを用いる場合には、開裂剤として耐熱性酵素を用いて、ＰＣＲとインベーダ反応の両方に適したバッファーとすることにより、ＰＣＲとインベーダ反応を同一の反応溶液中で行うことができる。ベタインはそもそもＰＣＲ増幅剤として使用されており、ベタインを添加することにより、標的核酸の増幅もより良好に行い得ることが期待できる。なお、ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼやｄＮＴＰ等は、通常用いられる試薬を通常用いられる量で用いることができ、また、ＰＣＲは、通常使用されるプロトコールに基づき、常法により行うことができる。

また、本発明の標的核酸の検出方法において用いられるオリゴヌクレオチドや試薬等をキット化することにより、より簡便に標的核酸を検出することができる。具体的には、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤、反応用バッファー、およびベタインからなる群より選択される１以上を含むキットとすることが好ましい。また、第３オリゴヌクレオチドの検出方法に応じて、上述した第４、６、８オリゴヌクレオチドや検出用核酸等を適宜含ませることができる。その他、標的核酸を予めＰＣＲにより増幅させる場合には、反応用バッファーを、インベーダ反応とＰＣＲの両方に適したバッファーとし、ＰＣＲに必要な増幅用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等を含むキットとすることができる。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｔａｓｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ２， ｍｅｍｂｅｒ ３８（ＴＡＳ２Ｒ３８）（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１７６８１７）のＴＡＳ−１変異またはＴＡＳ−２変異を、本発明の標的核酸の検出方法のうち、工程（ｇ）〜（ｉ）を用いる方法により検出した。なお、ＴＡＳ−１変異はＧ／Ｃ型のＳＮＰであり、ＴＡＳ−２変異はＡ／Ｇ型のＳＮＰである。
まず、ＴＡＳ−１変異（Ｃ型）を含む人工ポリヌクレオチド１０６またはＴＡＳ−２変異（Ｇ型）を含む人工ポリヌクレオチド１１６を合成した。これらの人工ポリヌクレオチドを、それぞれ、１０ｐｍｏｌ／μＬ、５ｐｍｏｌ／μＬ、１ｐｍｏｌ／μＬ、５００ｆｍｏｌ／μＬ、１００ｆｍｏｌ／μＬとなるように超蒸留水で希釈した。
ＴＡＳ−１変異を検出するためのＴＡＳ−１（＋）反応溶液として、インベーダ反応に必要な第１オリゴヌクレオチドとして、ＴＡＳ−１変異（Ｃ型）とハイブリダイズし得るプローブ１、およびＴＡＳ−１変異（Ｇ型）とハイブリダイズし得るプローブ２、第２オリゴヌクレオチドとしてプローブ３、第６オリゴヌクレオチドとして、ＦＡＭ標識されたＦＲＥＴプローブ１（サードウェイブ社製）、およびＲＥＤ標識されたＦＲＥＴプローブ２（サードウェイブ社製）を添加したＰｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ（サードウェイブ社製）を１μＬ、１０×Ｉｎｖａｄｅｒ Ｐｌｕｓバッファー（サードウェイブ社製）を１μＬ、上記各濃度の人工ポリヌクレオチド１０６溶液を１μＬ、５Ｍのベタインを２μＬ、４０×Ｉｎｖａｄｅｒ Ｐｌｕｓ酵素Ｍｉｘを０．２５μＬに、１０μＬになるように超蒸留水を添加して混合した。対照として、ベタインのみを添加していないＴＡＳ−１（−）反応溶液も同様に調製した。
ＴＡＳ−２変異を検出するためのＴＡＳ−２（＋）反応溶液として、インベーダ反応に必要な第１オリゴヌクレオチドとして、ＴＡＳ−２変異（Ｇ型）とハイブリダイズし得るプローブ４、およびＴＡＳ−２変異（Ａ型）とハイブリダイズし得るプローブ５、第２オリゴヌクレオチドとしてプローブ６、第６オリゴヌクレオチドとして、ＦＡＭ標識されたＦＲＥＴプローブ１、およびＲＥＤ標識されたＦＲＥＴプローブ２を添加したＰｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ（サードウェイブ社製）を１μＬ、１０×Ｉｎｖａｄｅｒ Ｐｌｕｓバッファー（サードウェイブ社製）を１μＬ、上記各濃度の人工ポリヌクレオチド１１６溶液を１μＬ、５Ｍのベタインを２μＬ、４０×Ｉｎｖａｄｅｒ Ｐｌｕｓ酵素Ｍｉｘを０．２５μＬに、１０μＬになるように超蒸留水を添加して混合した。対照として、ベタインのみを添加していないＴＡＳ−２（−）反応溶液も同様に調製した。
なお、これらのプローブ等のヌクレオチド配列を表１に示す。プローブ１、２、４および５中の下線が、インベーダ反応により切断されて産生される第３オリゴヌクレオチドとなる部位である。また、人工ポリヌクレオチド１０６および１１６中、括弧で括られたヌクレオチドがＳＮＰであり、二重下線部が、第２オリゴヌクレオチドとアニーリング部位である。
インベーダ反応により、人工ポリヌクレオチド１０６に対して特異的にプローブ１がアニールした場合には、プローブ１から切断された第３オリゴヌクレオチドがＲＥＤ標識されたＦＲＥＴプローブ２に対して侵入オリゴヌクレオチドとして働くため、ＲＥＤシグナルを測定することにより、ＴＡＳ−１変異（Ｃ型）を検出することができる。一方、人工ポリヌクレオチド１０６に対して非特異的にプローブ２がアニールした場合には、プローブ２から切断された第３オリゴヌクレオチドがＦＡＭ標識されたＦＲＥＴプローブ１に対して侵入オリゴヌクレオチドとして働くため、ＦＡＭシグナルが検出される。
同様に、人工ポリヌクレオチド１１６に対して特異的にプローブ４がアニールした場合には、プローブ４から切断された第３オリゴヌクレオチドがＦＡＭ標識されたＦＲＥＴプローブ２に対して侵入オリゴヌクレオチドとして働くため、ＦＡＭシグナルを測定することにより、ＴＡＳ−２変異（Ｇ型）を検出することができる。一方、人工ポリヌクレオチド１１６に対して非特異的にプローブ５がアニールした場合には、プローブ５から切断された第３オリゴヌクレオチドがＲＥＤ標識されたＦＲＥＴプローブ１に対して侵入オリゴヌクレオチドとして働くため、ＲＥＤシグナルが検出される。

調製した各反応溶液を、それぞれ、９９℃１０分間熱変性を行った後、クリベース反応を６３℃１０分間行った。反応温度を１０℃に下げてから、ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００測定機（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、ＦＡＭ（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ４８５ｎｍ、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ５３５ｎｍ）およびＲＥＤ（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ５６０ｎｍ、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ６１２ｎｍ）蛍光測定を行った。
図５に、各反応溶液（Ａ：ＴＡＳ−１、Ｂ：ＴＡＳ−２）に、１Ｍベタインを添加した場合（＋）又は添加しなかった場合（−）における測定結果を、反応溶液に添加した人工ポリヌクレオチド溶液の濃度毎に示した。図５中、縦軸は検出した蛍光強度であり、左カラムがＦＡＭ蛍光測定の結果を、右カラムがＲＥＤ蛍光測定の結果を、それぞれ示している。
ＴＡＳ−１においては、いずれの反応溶液においても、正常反応産物であるＲＥＤシグナルは高く、ＴＡＳ−１変異（Ｃ型）が検出されていた。また、非特異的反応物であるＦＡＭシグナルは、ベタイン添加の有無にかかわらず低かった。
一方、ＴＡＳ−２においては、いずれの反応溶液においても、正常反応産物であるＦＡＭシグナルは高く、ＴＡＳ−２変異（Ｇ型）は検出されていたが、１Ｍベタインを添加しなかった反応溶液（−）では、鋳型である人工ポリヌクレオチド量が多いほど非特異的反応物であるＲＥＤシグナル上昇が明確であったが、１Ｍベタインを添加した反応溶液（＋）では、ＲＥＤシグナルが明らかに抑制されていた。
したがって、これらの結果から、ベタインを添加することにより、インベーダ反応における非特異的反応が抑制され、核酸検出精度を向上させ得ることが明らかである。

［実施例２］
ベタインはＰＣＲ増幅剤として知られているが、上述したように、ベタインはクリベースの制御機能を示すため、Ｉｎｖａｄｅｒ Ｐｌｕｓ（サードウェイブ社製）を用いて遺伝子変異を検出する場合、ＰＣＲとインベーダ反応の双方に対する影響が予測される。そこで、互いに負の影響を及ぼさないか検証するために、米国Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｂａｎｋより入手した精製済みゲノムＤＮＡ４種類（ＮＡ１７２０４、ＮＡ１７２２１、ＮＡ１７２５２およびＮＡ１７２６６）を用いて、ＰＣＲサイクル数を変動してインベーダ反応を行った。なお、ＴＡＳ−２変異が、ＮＡ１７２０４はヘテロタイプ、ＮＡ１７２２１およびＮＡ１７２５２はＡ型ホモタイプ、ＮＡ１７２６６はＧ型ホモタイプである。
具体的には、実施例１におけるＴＡＳ−２（＋）反応溶液またはＴＡＳ−２（−）反応溶液に、それぞれ、人工ポリヌクレオチド１１６に代えて１０ｎｇの各ゲノムをそれぞれ添加し、かつ、ＰＣＲ増幅プライマーとして、表１記載のフォワードプライマー２とリバースプライマー２をさらに添加したものを、反応溶液とした。すなわち、特異的にインベーダ反応が起こった場合には、ＮＡ１７２０４ではＦＡＭシグナルとＲＥＤシグナルの両方が、ＮＡ１７２２１およびＮＡ１７２５２ではＲＥＤシグナルが、ＮＡ１７２６６ではＦＡＭシグナルが検出される。
調製した各反応溶液を、それぞれ、９５℃２分間、次に、９５℃１５秒間、７２℃４５秒間を、２５、３０、３５、または４０サイクル繰り返し、その後９９℃１０分間、最後に６３℃１０分間、反応させた。結果解析アルゴリズムはＴＷＴ推奨法に基づき行い、以下のように判定した。
Ｒａｔｉｏ≦０．２→ＲＥＤ；０．５≦Ｒａｔｉｏ≦２．０→ヘテロ；
Ｒａｔｉｏ≧５．０→ＦＡＭ

図６に、サイクル数ごとに測定した結果を示す。図６中、「２０４」はＮＡ１７２０４を、「２２１」はＮＡ１７２２１を、「２５２」はＮＡ１７２５２を、「２６６」はＮＡ１７２６６をそれぞれ示している。また、「●」はＴＡＳ−２（−）反応溶液（ベタイン無添加）の結果を、「▲」はＴＡＳ−２（＋）反応溶液（ベタイン添加）の結果を、それぞれ示している。
この結果、ＰＣＲサイクル数が少ないほど、ベタイン添加により、ホモ判定の明確化が得られた。即ち、ＰＣＲ産物量が少ないほど、ベタインはＩｎｖａｄｅｒ反応の特異性を促進し得ることが推測される。

［実施例３］
実施例２は、ベタイン濃度を１Ｍとして行った。そこで、次に、Ｉｎｖａｄｅｒ Ｐｌｕｓに添加する最適添加量を検証した。鋳型として、ＮＡ１７２６６を用いた。なお、ＮＡ１７２６６は、ＴＡＳ−１変異およびＴＡＳ−２変異のいずれもＧ型ホモタイプである。
具体的には、実施例１における各反応溶液に、それぞれ、人工ポリヌクレオチド１０６に代えて１０ｎｇのＮＡ１７２６６を添加し、ＰＣＲ増幅プライマーとして、表１記載のフォワードプライマー１とリバースプライマー１をさらに添加し、ベタインの終濃度を、０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２Ｍとなるように添加したものを、反応溶液として調製した。調製した各反応溶液を、９５℃２分間、次に、９５℃１５秒間、７２℃４５秒間を３５サイクル繰り返し、その後９９℃１０分間、最後に６３℃１０分間、反応させた。なお、ＴＡＳ−１変異検出において、特異的にインベーダ反応が起こった場合には、ＮＡ１７２６６ではＦＡＭシグナルが検出される。また、ＴＡＳ−２変異検出において、特異的にインベーダ反応が起こった場合にも、ＮＡ１７２６６ではＦＡＭシグナルが検出される。

図７に、測定した結果を示す。図中、縦軸は検出した蛍光強度の絶対値であり、左カラムがＦＡＭ蛍光測定の結果を、右カラムがＲＥＤ蛍光測定の結果を、それぞれ示している。また、点線は、ｓ／ｎ比（ＦＡＭ蛍光測定値をＲＥＤ蛍光測定値で除した値）を示している。
この結果、ベタイン終濃度が０〜０．４Ｍの条件では、バックグラウンドの大きな違いは認められなかったが、０．６Ｍ以上では、有意にバックグラウンドが制御されていることが確認できた。但し、１Ｍ以上の高ベタイン濃度では、特異的反応の値も減少する傾向が観察された。
したがって、これらの結果から、ｓ／ｎ比の大きな改善も可能となるため、ベタインの終濃度は０．８〜１．０Ｍであることが特に好ましいことが分かった。

第１開裂構造体を模式的に示した図である。 第２α開裂構造体を模式的に示した図である。 第２β開裂構造体を模式的に示した図である。 第２γ開裂構造体を模式的に示した図である。 実施例１において、各反応溶液（Ａ：ＴＡＳ−１、Ｂ：ＴＡＳ−２）における蛍光シグナルの測定結果を示した図である。図中、「−」はベタイン無添加の反応溶液、「＋」はベタインを添加した反応溶液を示す。 実施例２において、サイクル数ごとの測定結果の解析結果を示した図である。 実施例３において、各反応溶液（Ａ：ＴＡＳ−１、Ｂ：ＴＡＳ−２）におけるインベーダプラス測定結果を示した図である。

符号の説明

１…標的核酸、２…検出用核酸。

Claims (6)

1. 標的核酸を検出するための方法であって、
   （ａ）標的核酸と第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとで、第１開裂構造体を形成させる工程と、
   （ｂ）５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ａ）において生成された第１開裂構造体を構成している前記第１オリゴヌクレオチドを開裂させ、前記第１オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第３オリゴヌクレオチドを生成させる工程と、
   （ｃ）工程（ｂ）において生成された第３オリゴヌクレオチドを検出する工程と、
   を有し、
   前記標的核酸は第１領域、第２領域および第３領域を含み、該第１領域は第２領域に隣接してその下流に位置し、該第２領域は第３領域に隣接してその下流に位置するものであり、
   前記第１オリゴヌクレオチドは、３’側部分に標的核酸の前記第３領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、
   前記第２オリゴヌクレオチドは、３’側部分に標的核酸の前記第２領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、５’側部分に標的核酸の前記第１領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、
   前記第１開裂構造体は、前記第２オリゴヌクレオチドが前記標的核酸の前記第１領域および前記第２領域にアニーリングし、かつ前記第１オリゴヌクレオチドが前記標的核酸の第３領域にアニーリングした時に、前記第１オリゴヌクレオチドの前記標的核酸の第３領域とアニーリングした領域の５’側部分が、前記標的核酸の第２領域にアニーリングした第２オリゴヌクレオチドの該３’側部分中の１以上のヌクレオチド配列とオーバーラップするように形成された構造体であり、
   前記工程（ｂ）における第１オリゴヌクレオチドの開裂部位が、第２オリゴヌクレオチドとオーバーラップしている部位にあり、
   前記工程（ａ）〜（ｃ）を終濃度が０．８〜１．０Ｍのベタイン存在下で行うことを特徴とする、標的核酸の検出方法。
2. 前記工程（ｃ）が、
   （ｄ）工程（ｂ）において生成された第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドと検出用核酸とで、第２α開裂構造体を形成させる工程と、
   （ｅ）５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ｄ）において生成された第２α開裂構造体を構成している前記第４オリゴヌクレオチドを開裂させ、前記第４オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第５オリゴヌクレオチドを生成させる工程と、
   （ｆ）工程（ｅ）において生成された第５オリゴヌクレオチドを検出する工程と、
   を有し、
   前記検出用核酸は第１領域、第２領域および第３領域を含み、該第１領域は第２領域に隣接してその下流に位置し、該第２領域は第３領域に隣接してその下流に位置するものであり、
   前記第４オリゴヌクレオチドは、３’側部分に検出用核酸の前記第３領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、
   前記第３オリゴヌクレオチドは、３’側部分に検出用核酸の前記第２領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、５’側部分に検出用核酸の前記第１領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、
   前記第２α開裂構造体は、前記第３オリゴヌクレオチドが前記検出用核酸の前記第１領域および前記第２領域にアニーリングし、かつ前記第４オリゴヌクレオチドが前記検出用核酸の第３領域にアニーリングした時に、前記第４オリゴヌクレオチドの前記検出用核酸の第３領域とアニーリングした領域の５’側部分は、前記検出用核酸の第２領域にアニーリングした前記第３オリゴヌクレオチドの該３’側部分中の１以上のヌクレオチド配列とオーバーラップするように形成された構造体であり、
   前記工程（ｅ）における第４オリゴヌクレオチドの開裂部位が、第３オリゴヌクレオチドとオーバーラップしている部位にあり、
   前記工程（ｄ）〜（ｆ）を終濃度が０．８〜１．０Ｍのベタイン存在下で行うことを特徴とする、請求項１記載の標的核酸の検出方法。
3. 前記工程（ｃ）が、
   （ｇ）工程（ｂ）において生成された第３オリゴヌクレオチドと第６オリゴヌクレオチドとで、第２β開裂構造体を形成させる工程と、
   （ｈ）５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ｇ）において生成された第２β開裂構造体を構成している前記第６オリゴヌクレオチドを開裂させ、前記第６オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第７オリゴヌクレオチドを生成させる工程と、
   （ｉ）工程（ｈ）において生成された第７オリゴヌクレオチドを検出する工程と、
   を有し、
   前記第６オリゴヌクレオチドは、第１領域、第２領域および第３領域を含み、該第１領域は第２領域に隣接してその下流に位置し、該第２領域は第３領域に隣接してその下流に位置するものであり、該第１領域は前記第３オリゴヌクレオチドに完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、該第２領域は分子内ヘアピン構造を形成し得るヌクレオチド配列を有し、
   前記第２β開裂構造体は、前記第３オリゴヌクレオチドが前記第６オリゴヌクレオチドの前記第１領域にアニーリングし、かつ前記第６オリゴヌクレオチドの前記第２領域が分子内ヘアピン構造を形成した時に、前記第６オリゴヌクレオチドの前記第３領域が、前記第６オリゴヌクレオチドの第１領域にアニーリングした前記第３オリゴヌクレオチドの該３’側部分中の１以上のヌクレオチド配列とオーバーラップするように形成された構造体であり、
   前記工程（ｈ）における第６オリゴヌクレオチドの開裂部位が、第３オリゴヌクレオチドとオーバーラップしている部位にあり、
   前記工程（ｇ）〜（ｉ）を終濃度が０．８〜１．０Ｍのベタイン存在下で行うことを特徴とする、請求項１記載の標的核酸の検出方法。
4. 前記工程（ｃ）が、
   （ｊ）工程（ｂ）において生成された第３オリゴヌクレオチドと第８オリゴヌクレオチドとで、第２γ開裂構造体を形成させる工程と、
   （ｋ）５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤により、工程（ｊ）において生成された第２γ開裂構造体を構成している前記第８オリゴヌクレオチドを開裂させ、前記第８オリゴヌクレオチド由来の５’側部分からなる第９オリゴヌクレオチドを生成させる工程と、
   （ｌ）工程（ｋ）において生成された第９オリゴヌクレオチドを検出する工程と、
   を有し、
   前記第３オリゴヌクレオチドは、第１領域、第２領域および第３領域を含み、該第１領域は第２領域に隣接してその下流に位置し、該第２領域は第３領域に隣接してその下流に位置するものであり、該第２領域は該第１領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、
   前記第８オリゴヌクレオチドは、３’側部分に第３オリゴヌクレオチドの前記第３領域に完全に相補的なヌクレオチド配列を有し、
   前記第２γ開裂構造体は、前記第３オリゴヌクレオチドの前記第１領域が前記第２領域にアニーリングして分子内ヘアピン構造を形成し、かつ前記第８オリゴヌクレオチドが前記第３オリゴヌクレオチドの前記第３領域にアニーリングした時に、前記第８オリゴヌクレオチドの前記第３オリゴヌクレオチドの第３領域とアニーリングした領域の５’側部分は、前記第３オリゴヌクレオチドの第２領域にアニーリングした前記第１領域中の１以上のヌクレオチド配列とオーバーラップするように形成された構造体であり、
   前記工程（ｋ）における第８オリゴヌクレオチドの開裂部位が、第３オリゴヌクレオチドとオーバーラップしている部位にあり、
   前記工程（ｊ）〜（ｌ）を終濃度が０．８〜１．０Ｍのベタイン存在下で行うことを特徴とする、請求項１記載の標的核酸の検出方法。
5. 前記標的核酸が、遺伝子多型を含む核酸であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか記載の標的核酸の検出方法。
6. 請求項１〜５のいずれか記載の標的核酸の検出方法に用いられるキットであって、前記第１オリゴヌクレオチド、前記第２オリゴヌクレオチド、５’ヌクレアーゼ活性を有する開裂剤、反応用バッファー、およびベタインからなる群より選択される１以上を含むことを特徴とする標的核酸検出用キット。

Images