JP2005087109A

JP2005087109A - 核酸用緩衝溶液及び核酸ハイブリダイゼーション方法

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Publication number: JP2005087109A
Application number: JP2003325622A
Authority: JP
Inventors: Toru Yakabe; 徹矢ヶ部
Original assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Priority date: 2003-09-18
Filing date: 2003-09-18
Publication date: 2005-04-07

Abstract

【課題】核酸のハイブリダイゼーション反応において、反応時間を短縮し、効率的に行なえる核酸用緩衝溶液を提供すること。
【解決手段】核酸をハイブリダイゼーションする際にハイブリダイズさせる対象となる核酸を溶解させて使用する緩衝溶液であって、溶液中にリン脂質を有する物質を含む核酸用緩衝溶液であり、好ましくは、リン脂質を有する物質がホスホリルコリン基を有する高分子物質であり、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含む共重合体である核酸用緩衝溶液。

Description

本発明は、核酸をハイブリダイゼーションする際にハイブリダイズさせる対象となる核酸を溶解させて使用する核酸ハイブリダイゼーション用緩衝液に関するものである。

分子生物学、生物学において、相同な塩基配列を検出し、検体となる遺伝子の情報を得ることは、非常に重要な技術であり、その情報をもとにたくさんの知見が得られてきた。ブロッティング法や核酸マイクロアレイ法がその代表的な技術であるが、これらの技術はすべて核酸のハイブリダイゼーションに基づくものである。すなわち、放射性標識または蛍光や化学発光など非放射性標識した核酸を用いることによって、それに相同的な配列を持つ核酸を検出するというものである。核酸マイクロアレイでは、核酸がプラスチックやガラスなどの固相基板上に固定されており、検体となる核酸を含む溶液を基板上に添加する。検体となる核酸は、血液や細胞から抽出し、ＰＣＲによって増幅する際に蛍光標識され、基板上に固定された核酸に相同的な塩基を持つ核酸が存在した場合、ハイブリダイゼーションにより蛍光を発する。その蛍光のシグナルの解析によって、試料溶液に含まれる核酸の塩基配列に関する情報を得ることができる。
このように、ハイブリダイゼーション技術は、遺伝子配列の情報を得る上で非常に重要な手段であり、ハイブリダイゼーション技術の向上により、塩基配列情報の厳密性、感度の向上、検査時間の短縮などが克服されてきた。

ハイブリダイゼーションの起こりやすさ（ストリンジェンシー）は、温度、一価の陽イオン濃度、ｐＨ、塩基の長さ、ＧＣとＡＴの比率など、様々な要因によって変化する。そのため、目的に応じて反応液組成や反応条件が異なるが、最も一般的な組成として、２〜１０×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム緩衝液；１×ＳＳＣ組成：０．１５ＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１〜１．０ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液や２〜１０Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（デンハルト溶液；５０×デンハルト溶液組成：１％ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｍｉｎ、１％Ｆｉｃｏｌ、１％ｐｏｌｙｖｉｎｉｌｐｉｒｏｒｉｄｏｎｅ）、１〜５ＳＳＣ、０．１〜１．０％ＳＤＳの緩衝液が用いられる（例えば、非特許文献１）。これにｐｏｌｙＡや変性サケ精子ＤＮＡなどの核酸成分を添加することにより、非特異的なハイブリダイゼーションやプローブＤＮＡの膜および基板への吸着を防ぐことが知られている。あるいは、ベタインを添加することによっても、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制することが知られている。ＤＮＡの融点を下げるために、ホルムアミドを１０〜５０％（ｖ／ｖ）となるように添加することもある。また、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やデキストラン硫酸を添加すると、その強力な水和性により、プローブの水和する水分子を奪うために、有効プローブ濃度を上昇させ、ハイブリダイゼーションの速度をさせることも知られている（例えば、非特許文献２）。

しかし、これらの緩衝液を使用した場合、一晩ハイブリダイゼーションを行なっているのが現状であった。これまでにも、ハイブリダイゼーションを促進する方法として、ｐＨを調整し、陰イオン性界面活性剤やポリエチレングリコールを高濃度で有した緩衝液を用いる方法（例えば、特許文献３）などが知られているが、よりハイブリダイゼーションを促進し、かつ厳密に反応を行なうことのできるハイブリダイゼーション緩衝液が求められていた。
Analytical Biochemistry 308(2002) 5−17 「新・生物化学実験のてびき 3」化学同人、１９９６特開２０００−３２５０９９号公報

本発明の目的は、核酸のハイブリダイゼーション反応において、反応時間を短縮することや効率的にハイブリダイゼーションを行なうことができる核酸用緩衝溶液を提供することにある。

（１）核酸をハイブリダイゼーションする際にハイブリダイズさせる対象となる核酸を溶解させて使用する緩衝溶液であって、溶液中にリン脂質を有する物質を含む核酸用緩衝溶液、
（２）リン脂質を有する物質がホスホリルコリン基を有する高分子物質である（１）記載の核酸用緩衝溶液、
（３）ホスホリルコリン基を有する高分子物質が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含む共重合体である（１）又は（２）記載の核酸用緩衝溶液、
（４）緩衝溶液中にリン脂質を有する物質を０．０００１〜１０体積％含む（１）〜（３）いずれか記載の核酸用緩衝溶液、
（５）緩衝液中に界面活性剤、核酸成分、ベタイン、ホルムアミド、及びデンハルト溶液のうち少なくとも一つを含む（１）〜（４）いずれか記載の核酸用緩衝溶液、
（６）（１）〜（５）いずれか記載の核酸用緩衝溶液を使用して核酸のハイブリダイゼーションをマイクロアレイ上で行なう核酸ハイブリダイゼーション方法、
（７）マイクロアレイの基板がプラスチック製である（６）記載の核酸ハイブリダイゼーション方法、
（８）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（７）記載の核酸用ハイブリダイゼーション方法、
である。

本発明の核酸用緩衝溶液は、溶液中にホスホリルコリン基を有する高分子物質を含んでおり、プローブ核酸の水和する水分子を奪うために、有効プローブ濃度を上昇させることから、ハイブリダイゼーションの速度を上昇させることができる利点がある。

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の核酸用緩衝溶液で用いられるリン脂質とは、リン酸と脂質が結合したものの総称であって、おもに細胞の表面にあって細胞膜を構成する役割を担っている。本発明では、グリセロール誘導体であるホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンやセリン誘導体であるスフィンゴエミリンなどを好適に用いることができる。これらの物質は、ハイブリット核酸を安定化することが以前より知られている。

さらに本発明では、リン脂質を有する物質としてホスホリルコリン基を含む高分子物質を用いることが好ましい。ホスホリルコリン基を含む高分子物質として、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを構成単位とする共重合体（ＭＰＣポリマー）を好適に用いることができる。ＭＰＣポリマーはリン脂質二重層膜と類似の構造を有し、生理活性物質の吸着を抑制する効果を有することや生理活性分子を安定化することが知られている（Ishihara K, Tsuji T, Kurosaki T, Nakabayashi N, Journal of Biomedical Materials Research, 28(2), pp.225-232, (1994) などを参照）。

本発明者は、リン脂質を有する物質がハイブリダイゼーション溶液中に存在すると、ハイブリダイゼーションの速度を早めることを見出した。上述したように、リン脂質を有する物質は核酸を安定することができるため、ハイブリ溶液中にリン脂質を有する物質が存在すると、溶液中のプローブ核酸を安定化させ、さらに、その強力な水和性により、プローブ核酸の水和する水分子を奪うために、有効プローブ濃度を上昇させることができると推定される。
リン脂質を有する物質の緩衝溶液中の濃度は、０．０００１〜１０体積％が好ましく、０．０１〜５体積％がより好ましく、０．０５〜１．０体積％がさらに好ましい。

本発明の緩衝液中には界面活性剤を用いることが好ましい。界面活性剤としては、一般的なものを用いることができ、アニオン性、カチオン性、あるいはノニオン性であってもよいが、ノニオン性、アニオン性がより好ましく、アニオン性がさらに好ましい。ノニオン性界面活性剤として、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ポリエチレングリコールなどが挙げられ、陰イオン性界面活性剤として、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ-ドデシルサルコシン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸塩などを好適に用いることができるが、ドデシル硫酸ナトリウムが最も好ましい。ドデシル硫酸ナトリウムはバックグラウンドを抑える効果が高いことが以前から知られている。
界面活性剤の添加量は０．００１〜１０重量％が好ましく、０．０１〜１重量％がより好ましく、０．１〜０．５重量％が最も好ましい。過剰量の界面活性剤の添加は、室温における緩衝液中の界面活性剤の析出が著しく、ハンドリング面で困難を伴なうため好ましくない。逆に、界面活性剤添加量が過少であると、マイクロアレイ上でハイブリダイゼーション緩衝液を添加する際に、緩衝液の基板上での展開が進みにくいため、好ましくない。

本発明の緩衝液中には、ベタインや核酸成分を好適に用いることができる。ベタインや核酸成分を添加することにより非特異的なハイブリダイゼーションを抑制することが可能である。ベタインは核酸の塩基の水素結合に関与し、核酸のハイブリダイゼーションにおいてＧＣ含量の影響を受け難くなることが報告されている（Biochemistry 32, 137-144(1993)）。ベタインとしては、トリメチルグリシンが好適に用いられ、その濃度は０．１Ｍ〜５Ｍが好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましい。
核酸成分は、バックグランドを抑えることが以前より分かっている。核酸成分としては、変性サケ精子ＤＮＡやｐｏｌｙＡ、ｐｏｌｙｄＡが好適に用いられる。核酸成分の濃度は０．００１〜１．０μｇ／μｌが好ましく、０．０１〜０．１μｇ／μｌがさらに好ましい。

本発明の緩衝液中には、デンハルト溶液を用いることが好ましい。デンハルト溶液とは、５０×デンハルト溶液において、１％ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｍｉｎ、１％Ｆｉｃｏｌ、１％ｐｏｌｙｖｉｎｉｌｐｉｒｏｒｉｄｏｎｅの組成であり、核酸のハイブリダイゼーションにおいて、一般的に用いられる溶液である。ハイブリダイゼーション反応においては、２〜１０×デンハルト溶液で用いられる。

本発明では、核酸ハイブリダイゼーションの融点の調整を行なうために、ホルムアミドを好適に用いることができる。核酸のＴｍは塩濃度、又はホルムアミド濃度により調節することが可能である。例えば、通常１％ホルムアミドはＴｍを約０．６℃下げる。最適なＴｍでの反応のために、ホルムアミドを１０〜５０％（ｖ／ｖ）となるように添加することが好ましい。

本発明において用いられるハイブリダイゼーションの条件は、通常行なわれているハイブリダイゼーションと同様である。ハイブリダイゼーションの最適温度、塩濃度、或いはホルムアミド濃度等は、用いる核酸プローブの塩基配列又は長さ、或いは用いる核酸濃度等に依存する。しかし、一般にハイブリダイゼーションの温度は、融解温度（Ｔｍ）より１０〜２５℃程度低い温度が用いられるが、本発明では特に３７〜７２℃でハイブリダイゼーション反応を行なうことが好ましい。

以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、実施例の範囲に限定されるものではない。
（ＤＮＡ溶液の調整）
ＤＮＡ溶液１：５’末端にアミノ基を有した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡ（ＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧ（配列番号１）（倉敷紡績社製）を０．１μｇ／μｌの濃度で３×ＳＳＣ緩衝液で溶解した。
ＤＮＡ溶液２；ローダミン標識を有した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡ（ＣＡＴＣＧＴＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＡ（配列番号２）（倉敷紡績社製）を０．００２μｇ/μｌの濃度で下記の実施例又は比較例の核酸用緩衝溶液に溶解した。

（核酸用緩衝溶液の調整）
（実施例１）
２０×ＳＳＣ（クエン酸緩衝液）、１０重量％ＳＤＳ、０．５体積％の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート共重合体のエタノール溶液、１０μｇ／μｌｐｏｌｙＡを用いて、５×ＳＳＣ、０．３重量％ＳＤＳ、０．０５体積％２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート共重合体、０．１μｇ／μｌｐｏｌｙＡの核酸用緩衝溶液を調整した。

（実施例２）
２０×ＳＳＣ（クエン酸緩衝液）、５０×デンハルト溶液（シグマ社製）、１０重量％ＳＤＳ、ホルムアミド（シグマ社製）、０．５体積％の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート共重合体のエタノール溶液、１０μｇ／μｌｐｏｌｙＡを用いて、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、２５体積％ホルムアミド、０．３％重量ＳＤＳ、０．０５体積％２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート共重合体、０．１μｇ／μｌｐｏｌｙＡの核酸用緩衝溶液を調整した。

（比較例１）
２０×ＳＳＣ（クエン酸緩衝液）、１０重量％ＳＤＳ、１０μｇ／μｌｐｏｌｙＡを用いて、５×ＳＳＣ、０．３重量％ＳＤＳ、０．１μｇ／μｌｐｏｌｙＡの核酸用緩衝溶液を調整した。

（比較例２）
２０×ＳＳＣ（クエン酸緩衝液）、５０×デンハルト溶液（シグマ社製）、１０重量％ＳＤＳ、ホルムアミド（シグマ社製）、１０μｇ／μｌｐｏｌｙＡを用いて、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、２５体積％ホルムアミド、０．３重量％ＳＤＳ、０．１μｇ／μｌｐｏｌｙＡの核酸用緩衝溶液を調整した。

（スポットおよびハイブリダイゼーション）
ＤＮＡ溶液１を９６穴プレートに分注し、マイクロピン式のマイクロアレイスポッターを用いて基板上にスポットした。基板として、表面にアルデヒド基を導入したプラスチック製のものを用いた。点着終了後、余分なアルデヒド基をブロッキングした。この基板上に、ＤＮＡ溶液２を展開し、６５℃の多湿容器内で一晩接触させることにより、固定化されたオリゴＤＮＡとローダミン標識オリゴＤＮＡをハイブリダイゼーションを行なった。洗浄ののち、マイクロアレイスキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ」（パッカードバイオチップテクノロジー社製）を用いてスポットの蛍光を検出した。スキャナーに付属の解析用ソフトウェア「ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ」を用いてスポットの蛍光量を数値化した結果を表１に示す。

（実施例３）
ＤＮＡ溶液１、実施例１で調整した核酸用緩衝溶液を使用したＤＮＡ溶液２を用いて、上記と同様な方法でスポット、ハイブリダイゼーションを行ない、６５℃の多湿容器内で３時間接触させた。洗浄ののち、上記の方法と同様にスポットの蛍光量を数値化した。結果を表１に示す。

（比較例３）
ＤＮＡ溶液１、比較例１で調整した核酸用緩衝溶液を使用したＤＮＡ溶液２を用いて、上記と同様な方法でスポット、ハイブリダイゼーションを行ない、６５℃の多湿容器内で３時間接触させた。洗浄ののち、上記の方法と同様にスポットの蛍光量を数値化した。結果を表１に示す。

表１に示したように、実施例１、実施例２の蛍光値は、比較例１、比較例２の蛍光値よりも高い結果となった。これは、核酸用緩衝溶液にリン脂質を有する物質を含有させることによって、ハイブリダイゼーショ
ンの効率が上がったことを示している。
また、ハイブリダイゼーションの時間を短縮した実施例３および比較例３の蛍光値を比較すると、実施例３の蛍光値が高い。これは、核酸用緩衝溶液にリン脂質を有する物質を含有させることにより、ハイブリダイゼーションの速度が高くなったことを意味している。これらの結果は、核酸用緩衝液にリン脂質を有する物質の存在が、プローブ核酸の安定化に寄与していることを支持している。

核酸用緩衝溶液にリン脂質を有する物質を含有させることによって、効率良く核酸のハイブリダイゼーション反応を行なうハイブリダイゼーションを行なうことができるため、迅速な遺伝子の検出に適用できる。

Claims

核酸をハイブリダイゼーションする際にハイブリダイズさせる対象となる核酸を溶解させて使用する緩衝溶液であって、溶液中にリン脂質を有する物質を含む核酸用緩衝溶液。
リン脂質を有する物質がホスホリルコリン基を有する高分子物質である請求項１記載の核酸用緩衝溶液。
ホスホリルコリン基を有する高分子物質が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含む共重合体である請求項１又は２記載の核酸用緩衝溶液。
緩衝溶液中にリン脂質を有する物質を０．０００１〜１０体積％含む請求項１〜３いずれか記載の核酸用緩衝溶液。
緩衝液中に界面活性剤、核酸成分、ベタイン、ホルムアミド、及びデンハルト溶液のうち少なくとも一つを含む請求項１〜４いずれか記載の核酸用緩衝溶液。
請求項１〜５記載いずれか記載の核酸用緩衝溶液を使用して核酸のハイブリダイゼーションをマイクロアレイ上で行なう核酸ハイブリダイゼーション方法。
マイクロアレイの基板がプラスチック製である請求項６記載の核酸ハイブリダイゼーション方法。
プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである請求項７記載の核酸ハイブリダイゼーション方法。