JP2007522807A - 高分子電解質コーティングされたサイズ排除イオン交換粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
本教示は、イオン交換技術を用いてサンプルを濾過および/または精製するための装置および方法に関する。
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または配列決定反応から得られた反応生成物の精製は、その後の、下流の処理に関する多くの課題を提示し得る。不純物は、その後の処理工程にアーチファクトを引き起こし得る。アーチファクトを排除するための多くの精製工程は、面倒かつ非効率的であり得る。プライマー、取り込まれていないヌクレオチド、プライマーダイマー、小さなDNAフラグメントを捕獲すること、ならびに一部の場合、PCR生成物を脱塩することが所望され得る。プライマー、色素標識化プライマー、ヌクレオチド、色素標識化ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、および色素標識化ジデオキシヌクレオチドを捕獲すること、ならびにDNA配列決定反応生成物を脱塩することが所望され得る。従来の精製技術に関するこれらの問題および他の問題に対処する分離に対する必要性が存在する。
種々の実施形態によると、本教示は、イオン交換材料を含むコアおよび高分子電解質材料を含むコーティングを含む粒子を提供する。ここで、上記コアおよびコーティングは、PCR反応生成物を分離するように適合されている。種々の実施形態によると、本教示は、PCR反応生成物を精製するための方法を提供する。この方法は、複数の粒子を提供する工程(ここで、各粒子は、イオン交換のためのコアおよび高分子電解質のコーティングを含む)、ならびにPCR反応生成物を接触させて、dsDNAフラグメントを分離する工程を包含する。
本明細書において使用される節の表題は、構成目的のみのためであり、そして記載される対象を限定するものとして解釈されるべきではない。本出願において引用される全ての文献(特許、特許出願、論文、書籍、および学術論文が挙げられるが、これらに限定されない)は、任意の目的のために、それらの全体が明確に参考として援用される。
イオン交換樹脂を、1000μLの1M塩溶液、酸溶液もしくは塩基溶液で100μLの体積の樹脂を洗浄することによって、イオン交換体に変換した。この混合物を、5分間ボルテックスし、遠心分離機でスピンダウンした。上清を除去し、そして別の、塩溶液、酸溶液もしくは塩基溶液の1000μLアリコートを添加した。これを3回繰り返した。次いで、イオン交換コアを洗浄し、DI水の1000μLアリコートを用いて、5回スピンした。
粒子をコーティングするためのポリ(AA−co−DMA)高分子電解質を、過硫酸アンモニウムを開始剤として用い、そしてN,N,N’N’−テトラメチルエチレンジアミンを触媒として用いた、200mLのDI水中、45℃で15時間の、0.32g(4.44mmol)のアクリル酸と8.04g(81.07mmol)のN,N−ジメチルアクリルアミドとのフリーラジカル重合によって提供した。得られたポリマーを、透析(50K MWCO)および凍結乾燥によって精製し、7.70g(92%収率)のポリマーを提供した;Mw=3.40MDa、Mn=2.67MDa。
DNA配列決定反応物精製のため、400μLのdRhodamine Terminator Ready Reaction Mix(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)、50μLのM13ユニバーサルリバースプライマー(3.2pmol/μL)、25μLのテンプレートアンプリコン(約100ng/μL)、および525μLのDI水を含むように、サンプルを調製した。この溶液を、20μL/ウェルの体積でサーマルサイクラープレート中のウェルに分取した。この混合物を25サイクルの加熱に供した。ここで、各サイクルは、95℃で10秒間加熱し、50℃で5秒間加熱し、そして60℃で120秒間加熱する工程を含んだ。
PCR反応物の精製を実証するため、PCR生成物が蛍光キャピラリーシークエンサー上で分析され得るように、サンプルを蛍光標識されたプライマーを用いて調製した。溶液を、102μLのPCRマスターミックス(Applied Biosystems)、4μLのFAM標識されたフォワードプライマー(20pmol/μL)、4μLのリバースプライマー(20pmol/μL)、20μLのヒトgDNA、CEPH 1347−02(50μg/μL)、および70μLの脱イオン水(DI)を含むように調製した。この溶液を、20μL/ウェルの容量でサーマルサイクラープレートのウェルに分取した。この混合物を96℃で5分間加熱し、続いて40サイクル加熱した(ここで、各サイクルは96℃で30秒間、次いで60℃で120秒間加熱する工程を含んだ)。
DNA配列決定反応物の精製に関して、蛍光キャピラリーシークエンサー上で配列決定反応生成物が分析され得るように、蛍光標識化プライマーを用いてサンプルを調製した。400μLのdRhodamine Terminator Ready Reaction Mix(Applied Biosystems,Foster City,California)50μLのM13ユニバーサルリバースプライマー(3.2pmol/μL)、25μLのテンプレートアンプリコン(約100ng/μL)、および525μLのDI水を含むように、サンプルを調製した。このマスター溶液を、20μL/ウェルの体積でサーマルサイクラープレート中のウェルに分取した。この混合物を25サイクルの加熱に供した。ここで、各サイクルは、95℃で10秒間加熱し、50℃で5秒間加熱し、そして60℃で120秒間加熱する工程を含んだ。
PCR反応生成物の精製を、合成ポリマーを備える高分子電解質コーティングされた粒子によって提供した。Macro−Prep HQイオン交換樹脂を、ポリ(AA−co−DMA)によってコーティングした。図10は、種々のモル百分率のアクリル酸および種々の分子量のポリ(AA−co−DMA)を示す。分子量とモルパーセンテージとは、一番下のエレクトロフォトグラム(1.1モル%のアクリル酸と98.9モル%のDMAでコーティングされた樹脂による分離を表す)から一番上のエレクトロフォトグラム(N,N−ジメチルアクリルアミド(DMA)を含まない、100モル%のアクリル酸またはポリ(AA)でコーティングされた樹脂による分離を表す)まで、下から上にかけて増加する。100%のアクリル酸を含む高分子電解質コーティングされた粒子は、プライマー、プライマーダイマーおよびあらゆるDNAフラグメントを除去した。同じ現象が、低いアクリル酸含有量(1.1モル%アクリル酸)を含むポリ(AA−co−DMA)で観察された。図11は、上記の範囲のポリ(AA−co−DMA)でコーティングされた、非脱塩Macro−Prep 50 HQ(塩化物形態)イオン交換樹脂による、オリゴヌクレオチドプライマー、プライマーダイマーおよびDNAフラグメントの除去を示す。図11のレーン1には、サイズ標準をローディングし、レーン2には、1マイクロリットルの生(高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子による分離なし)のPCR生成物を20マイクロモル濃度のプライマーとともにローディングし、レーン3〜7には、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子による分離後の、1マイクロリットルのPCR生成物をローディングし、そしてレーン8〜12には、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子による分離後の、2マイクロリットルのPCR生成物をローディングした。レーン2は、未分離のPCR生成物(例えば、プライマー、プライマーダイマーなど)を、主要なバンドの下の拡散したバンドとして示す。レーン3〜12は、対応するバンドのようなものを有さない。図12は、上記の範囲のポリ(AA−co−DMA)でコーティングされた、非脱塩Macro−Prep 50 HQ(塩化物形態)イオン交換樹脂による、プライマーダイマーおよび非特異的に増幅されたdsDNAの、PCR生成物からのサイズベースの除去を示す。上のエレクトロフォトグラムは、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子で分離されていないPCR生成物を示す。下のエレクトロフォトグラムは、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子で分離されたPCR生成物を示す。この違いは、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子による分離の後、100bpより小さいdsDNAフラグメントが、溶液中に残るより大きなフラグメントから分離されたことを示す。
サイズベースの精製法を使用する精製の前に、DNA配列決定反応物に界面活性剤が添加され得る。例えば、サイズ排除スピンカラムを使用するDNA配列決定反応物の精製前に、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)が添加されて、精製を補助し得る。さらに、SDSを含むDNA配列決定反応物は、サイズ排除スピンカラムを使用する精製前に加熱され得る。種々の実施形態において、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子によって精製されたDNA配列決定反応物において、アニオン性界面活性剤は、非イオン性界面活性剤に置き換えられ得る。このような置き換えは、イオン性界面活性剤とイオン交換粒子との相互作用を防止して、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子のイオン交換能に対する有害な影響を回避し得る。本明細書中で使用される場合、用語「非イオン性」界面活性剤とは、非イオン性界面活性剤、双生イオン性界面活性剤、または溶液の導電性に実質的に寄与しない他の界面活性剤をいう。非イオン性界面活性剤の例としては、Brij 35およびBrij 58(CalBiochem、San Diego、CA)、Triton X−100(Sigma、St.Louis、MO)、オクチル−β−D−グルコシド、オクチルグルコピラノシド、および(3−[(3−コラミドプロピル(Cholamidopropyl))ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホネート)(「CHAPS」)(Pierce Biotechnology,Rockford,IL)が挙げられる。種々の実施形態において、非イオン性界面活性剤は、DNA配列決定反応物から取り込まれていないダイターミネーターの除去を促進するために、加熱することなく活性化可能であり得る。
ポリ(AA−co−DMA)高分子電解質を、上記のように調製した。ポリ(塩酸アリルアミン)または「PAH」(Mw 0.07MDa)、およびポリ(アクリル酸)または「PAA」(Mw 4.00MDa)(Aldrich Chemicals)は、容易に入手可能であった。以下の高分子電解質溶液(0.5重量%)を、適量のポリマーを脱イオン水に添加し、次いで一晩常温で転倒(tumble)させることによって調製した:ポリ(AA−co−DMA)0.2286g/39.915g H2O;PAH 0.2268g/40.033g H2O;PAA 0.1192g/19.99g H2O。
PAA(Mw 4.00MDa)(Aldrich Chemicals)およびFe3O4(EMG 1111)(Ferrotec Corp.)は、容易に入手可能であった。PAAの溶液(0.750mL)を樹脂(0.2gの湿った樹脂)と10mLの脱イオン水とのスラリー溶液に添加した。この混合物を1分間ボルテックスし、5分間常温でインキュベートし、1760rpmで3分間スピンし、そして上清をデカントした。樹脂を脱イオン水(10mL)で一度洗浄した。懸濁液を1760rpmで3分間スピンし、そして水をデカントした。脱イオン水とのFe3O4の水溶液(0.20mL)をこの湿った樹脂に添加した。この懸濁液をボルテックスによって1分間混合し、常温で5分間インキュベートした。この懸濁液を1670rpmで3分間スピンし、水溶液を除去した。この樹脂を3回洗浄し、過剰な未結合Fe3O4を除去した。コーティングした樹脂を脱イオン水(10mL)に再分散させた。樹脂の磁化を観察した。
上記に提供された反応物および/または実施例の各カテゴリーの範囲内で、多くの特定の用途が存在する。例えば、PCR反応物の高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子は、配列検出用途(終点およびリアルタイムの両方)、PCRクローニング用途などのための精製を提供し得、そしてDNA配列決定反応物の高分子電解質コーティングイオン交換粒子は、任意の型の核酸配列決定(例えば、配列決定、フラグメント分析、単一ヌクレオチド多型同定など)のための精製を提供し得る。
Claims (36)
- 粒子であって、以下:
イオン交換材料を含むコア;および
高分子電解質材料を含むコーティング
を含み、ここで、該コアおよび該コーティングは、PCR反応生成物またはDNA配列決定反応生成物を分離するために適合されている、
粒子。 - 前記コアが、プライマー、プライマーダイマー、ssDNAフラグメント、取り込まれていないヌクレオチドおよび塩から選択される、少なくとも1つのPCR反応生成物に結合する、請求項1に記載の粒子。
- 前記粒子が、100より多くの塩基対を有するdsDNAフラグメントを実質的に排除するように適合されている、請求項2に記載の粒子。
- 前記コアが、プライマー、色素標識化プライマー、ヌクレオチド、色素標識化ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、色素標識化ジデオキシヌクレオチドおよび塩から選択される、少なくとも1つのDNA配列決定反応生成物に結合する、請求項1に記載の粒子。
- 前記粒子が、45より多くのヌクレオチドを有する色素標識化ssDNAフラグメントを実質的に排除するように適合されている、請求項4に記載の粒子。
- 前記コーティングが生体高分子を含む、請求項1〜5に記載の粒子。
- 前記生体高分子が非サンプルDNAである、請求項6に記載の粒子。
- 前記コーティングが合成ポリマーを含む、請求項1〜5に記載の粒子。
- 請求項8に記載の粒子であって、前記合成ポリマーがコポリマーを含み、該コポリマーが以下:(メト)アクリルアミド、N−メチル(メチル)アクリルアミド、N,N−ジメチル(メチル)アクリルアミド、N−エチル(メト)アクリルアミド、N−n−プロピル(メト)アクリルアミド、N−イソ−プロピル(メト)アクリルアミド、N−エチル−N−メチル(メト)アクリルアミド、N,N−ジエチル(メト)アクリルアミド、N−ヒドロキシメチル(メト)アクリルアミド、N−(3−ヒドロキシプロピル)(メト)アクリルアミド、N−ビニルホルムアミド、N−ビニルアセトアミド、N−メチル−N−ビニルアセトアミド、酢酸ビニル(ビニルアルコールの前駆体)、2−ヒドロキシエチル(メト)アクリレート、3−ヒドロキシプロピル(メト)アクリレート、N−ビニルピロリドン、ポリ(エチレンオキシド)(メト)アクリレート、N−(メト)アクリルオキシスクシンイミド、N−(メト)アクリロイルモルホリン、N−2,2,2−トリフルオロエチル(メト)アクリルアミド、N−アセチル(メト)アクリルアミド、N−アミド(メト)アクリルアミド、N−アセトアミド(メト)アクリルアミド、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル(メト)アクリルアミド、スルホン酸スチレン、スルホン酸スチレンのホモポリマー、スルホン酸スチレンのコポリマー、N−(メチル)アクリロイルトリス(ヒドロキシメチル)メチルアミド、(メチル)アクリロイル尿素、ビニルオキサゾリドン、ビニルメチルオキサゾリドン、アクリル酸、メタクリル酸、スルホン酸ビニル、スルホン酸スチレン、4−アセトキシスチレン(4−ヒドロキシスチレンの前駆体)、およびホスホン酸ビニル、ならびにビニルメチルエーテル、から選択される少なくとも1つのモノマーを含む、粒子。
- 前記合成ポリマーが、ポリ(アクリル酸−co−N,N−ジメチルアクリルアミド)、ポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド−co−スルホン酸スチレン)、ポリ(塩酸アリルアミン)、およびポリ(アクリル酸)のうちの少なくとも1つを含む、請求項9に記載の粒子。
- 前記イオン交換材料が多孔質である、請求項1〜10のいずれかに記載の粒子。
- 前記イオン交換材料が表面活性化されている、請求項11に記載の粒子。
- 前記イオン交換材料が、100オングストローム〜2000オングストローム、または5オングストローム〜1000オングストロームの孔サイズを有する、請求項11に記載の粒子。
- 前記高分子電解質材料が、1.0メガダルトン〜3.0メガダルトンまたは1000ダルトン〜6.0メガダルトンのMwを有する、請求項13に記載の粒子。
- 前記イオン交換材料が、1000オングストロームの孔サイズおよび1.7メガダルトン〜2.4メガダルトンのMwを有するか、または10オングストローム〜50オングストロームの孔サイズおよび2.4メガダルトン〜4.9メガダルトンのMwを有する、請求項14に記載の粒子。
- 前記合成ポリマーがコポリマーを含み、該コポリマーが、以下:塩酸アリルアミン、(3−アクリルアミドプロピル)トリスメチル塩化アンモニウム、塩酸N−(3−アミノプロピル)メタクリルアミド、および加水分解されてアミノ基を1つ生じるN−ビニルアミド、から選択される少なくとも1つのモノマーを含む、請求項9に記載の粒子。
- 前記合成ポリマーが、ポリ(N−(3−アミノプロピル)メタクリルアミド−co−N,N−ジメチルアクリルアミド)である、請求項16に記載の粒子。
- 前記高分子電解質材料が複数の層を備える、請求項1〜17のいずれかに記載の粒子。
- 前記複数の層が、交互の層にポリアニオンおよびポリカチオンを含む、請求項18に記載の粒子。
- 前記コアがマクロ孔質であり、そして前記高分子電解質の複数の層の各々が、該マクロ孔質のコアに浸透し得る分子量を有する、請求項19に記載の粒子。
- 前記複数の層が磁性の層を備える、請求項18に記載の粒子。
- 溶液中にある請求項1〜21のいずれかに記載の粒子であって、該溶液が、カチオンイオン交換材料またはアニオンイオン交換材料を含む、粒子。
- 前記カチオンイオン交換材料または前記アニオンイオン交換材料が、前記粒子と混床を形成する、請求項22に記載の溶液。
- 前記カチオンイオン交換材料と前記アニオンイオン交換材料とが、化学量論的に当量で存在する、請求項23に記載の溶液。
- 非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項22に記載の溶液。
- 前記非イオン性界面活性剤が、取り込まれていないダイターミネーターの、DNA配列決定反応物からの除去を促進するように適合されている、請求項25に記載の溶液。
- 前記非イオン性界面活性剤が、加熱することなく活性化可能である、請求項26に記載の溶液。
- 請求項1〜27のいずれかに記載の粒子または溶液を使用するための方法であって、該方法は、以下:
複数の粒子を提供する工程;および
PCR反応生成物を接触させて、dsDNAフラグメントを分離する工程、またはDNA配列決定反応生成物を接触させて、色素標識化ssDNAフラグメントを分離する工程
を包含する、方法。 - 前記複数の粒子を単離する工程をさらに包含する、請求項28に記載の方法。
- 単離する工程が、前記複数の粒子に力を適用する工程を包含する、請求項29に記載の方法。
- 前記力が、遠心力、重力、磁力、および浮力のうちの少なくとも1つを包含する、請求項30に記載の方法。
- 前記複数の粒子が第一の体積を含み、前記PCR反応生成物またはDNA配列決定反応生成物が第二の体積を含み、そして該第一の体積が該第二の体積以上である、請求項28に記載の方法。
- 前記複数の粒子を固定位置に配置する工程をさらに包含する、請求項28に記載の方法。
- 前記固定位置が、カラムまたはコーティングである、請求項33に記載の方法。
- 前記溶液から、キャピラリー電気泳動のためにサンプルをローディングする工程をさらに包含する、請求項28〜34に記載の方法。
- 前記サンプルをローディングする工程が、サンプル注入位置を変更する工程を包含する、請求項35に記載の方法。
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