JP2023506338A - フローセルへの固定化 - Google Patents

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Abstract

一例では、標的材料は、第１及び第２流体を使用して、フローセルの２つの対向する配列決定表面に固定化される。第１流体は、標的材料の密度よりも低い密度を有し、第２流体は、標的材料の密度よりも高い密度を有し、又は、第２流体は、標的材料の密度よりも低い密度を有し、第１流体は標的材料の密度よりも高い密度を有する。第１流体（標的材料を含む）がフローセルに導入されることにより、標的材料の少なくとも一部が、配列決定表面の一方の表面上の捕捉部位によって固定化される。第１流体及び未固定化標的材料が除去される。第２流体（標的材料を含む）がフローセルに導入されることにより、標的材料の少なくとも一部が、別の配列決定表面上の捕捉部位によって固定化される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９４６，７１７の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
フローセルは、遺伝子配列決定、遺伝子型決定など、様々方法及び用途で使用される。いくつかの方法及び用途では、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的分子から、断片化及びタグ付けされたＤＮＡ分子のライブラリを生成することが望ましい。多くの場合、その目的は、ＤＮＡ配列決定反応において鋳型として使用するために、より大きなｄｓＤＮＡ分子からより小さなＤＮＡ分子（例えば、ＤＮＡ断片）を生成することである。鋳型は、短いリード長を得ることを可能にし得る。データの解析中に、重複する短い配列のリードを整列させて、より長い核酸配列を再構築することができる。場合によっては、データ解析を簡素化するために、事前配列決定ステップ（例えば、特定の核酸分子のバーコード化）を使用することができる。
米国仮特許出願第６２／９４６，７１７
本明細書に記載のキット及び方法の例のいくつかは、フローセルの対向する表面に１つ以上の標的材料を固定化するのに適する。該方法のいくつかの例は、順次固定化を可能にし、該方法の他の例は、同時固定化を可能にする。
本明細書に開示される第１態様は、フローセルの２つの対向する配列決定表面のそれぞれに標的材料を固定化するステップを含む方法であり、ここで固定化は、標的材料の第１部分を中に含む第１流体をフローセルに導入することにより、２つの対向する配列決定表面のうち１方の表面上の捕捉部位によって標的材料の少なくとも一部を固定化するステップと、フローセルから第１流体及び任意の未固定化標的材料を除去するステップと、標的材料の第２部分を中に含む第２流体をフローセルに導入することにより、２つの対向する配列決定表面のうち他方の表面上の捕捉部位によって標的材料の少なくとも一部を固定化するステップとを含み、ここで第１流体は、標的材料の密度よりも低い密度を有し、かつ第２流体は、標的材料の密度よりも高い密度を有する、又は、第２流体は、標的材料の密度よりも低い密度を有し、かつ第１流体は標的材料の密度よりも高い密度を有する、のいずれかである。
本明細書に開示される第２態様は、標的材料を中に含む調製流体を含むキットであり、ここで第１導入流体は標的材料の密度よりも低い密度を有し、かつ第２導入流体は標的材料の密度よりも高い密度を有する。
本明細書に開示される第３態様は、以下のステップによってフローセルの２つの対向する配列決定表面のそれぞれに標的材料を固定化するステップを含む方法であり、それらのステップは、標的材料を含む流体をフローセルに導入するステップであって、標的材料は、磁性を有する固形支持体、磁性を有する固形支持体に付着した配列決定可能（sequencing-ready）な核酸断片又は鋳型鎖を含み、流体は、磁性を有する固形支持体の密度と少なくともほぼ同等の密度を有するステップと、２つの対向する配列決定表面のうち一方の表面上にある捕捉部位によって標的材料の一部を固定化させるステップと、２つの対向する配列決定表面の他方の表面に磁力を印加し、それによって他のいくつかの標的材料を、２つの対向する配列決定表面のうち他方の表面上に引っ張り、２つの対向する配列決定表面のうち他方の表面上の捕捉部位によって標的材料が固定化されるステップとを含む。
本明細書に開示される第４態様は、フローセルに第１標的材料及び第２標的材料を含む標的流体を導入することにより、フローセルの２つの対向する配列決定表面の第１表面に第１標的材料を、かつ２つの対向する配列決定表面の第２表面に第２標的材料を同時に固定化するステップを含む方法であり、ここで標的流体のキャリア流体は流体密度を有し、第１標的材料は、流体密度よりも低い第１密度を有し、かつ第２標的材料は、流体密度よりも大きい第２密度を有する。
本明細書に開示される第５態様は、流体密度を有するキャリア流体と、流体密度よりも低い第１密度を有する第１標的材料と、流体密度よりも高い第２密度を有する第２標的材料とを含む標的材料である。
本明細書に開示される第６態様は、２つの対向する配列決定表面を含むフローセルに第１及び第２標的材料を導入するステップを含む方法であり、ここで第１標的材料は、第２標的材料とは異なる特性を少なくとも１つ有しており、少なくとも１つの特性は、密度、電荷、磁性、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されたものであり、第１及び第２標的材料を少なくとも１つの条件に露出し、それによって第１標的材料を２つの対向する配列決定表面上の第１捕捉部位によって固定化させ、第２標的材料を２つの対向する配列決定表面上の第２捕捉部位によって固定化させる。
態様のいずれか１つの任意の特徴は、任意の望ましい方法で共に組み合わせることができることを理解すべきである。更に、第１態様及び／又は第２態様及び／又は第３態様及び／又は第４態様及び／又は第５態様及び／又は第６態様の特徴の任意の組み合わせは、本明細書に開示される実施例のいずれかと組み合わせて、本開示に記載される利益を達成すること、例えば、フローセル内の配列決定表面にわたる標的材料のより均一な分布を達成することもできることを理解すべきである。
本明細書に記載の別の例は、オンフローセル増幅中の鋳型鎖の移動を低減又は防止するのに適する。
したがって、本明細書に開示される第７態様は、配列決定可能な核酸断片をフローセルに導入し、それにより、配列決定可能な核酸断片の少なくともいくつかを、フローセルの配列決定表面上のそれぞれのプライマーにシーディングするステップと、未シーディングの配列決定可能な核酸断片をフローセルから除去するステップと、液体形態の温度応答性材料を含む増幅混合物をフローセルに導入するステップと、液体形態の温度応答性材料をゲル化させるステップと、シーディングされた配列決定可能な核酸断片の増幅を開始して鋳型鎖を生成し、それによってゲル形態の温度応答性材料が鋳型鎖の拡散を低減するステップと、ゲル形態の温度応答性材料を液化させるステップと、フローセルから液体形態の温度応答性材料を除去するステップとを含む方法である。
第７態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で共に組み合わせることができることを理解すべきである。更に、第７態様の特徴の任意の組み合わせは、本明細書に開示される他の態様及び／又は実施例のいずれかと組み合わせて、例えば、フローセル内の配列決定表面全体にわたる標的材料のより均一な分布、及びフローセル増幅中の鋳型鎖の移動の低減を含む、本開示に記載される利益を達成し得ることも理解すべきである。
本開示の例の特徴は、以下の詳細な説明及び図面を参照することにより明らかになろう。図面において、同様の参照番号は、類似なものではあるが、おそらく同一ではない構成要素に対応している。簡潔にするために、前述の機能を有する参照番号又は特徴は、それらが現れる他の図面と関連させて記載してもよく、記載しなくてもよい。
本明細書に開示される標的材料の例の概略図である。 本明細書に開示される標的材料の例の概略図である。 本明細書に開示される標的材料の例の概略図である。 フローセルの一例の上面図である。 図２Ａの２Ｂ－２Ｂ線に沿って取られた、フローチャネル及びパターン化されていない配列決定表面の例の拡大断面図である。 図２Ａの２Ｃ－２Ｃ線に沿って取られた、フローチャネル及びパターン化された配列決定表面の例の拡大断面図である。 図２Ａの２Ｄ－２Ｄ線に沿って取られた、フローチャネル及びパターン化された配列決定表面の別の例の拡大断面図である。 本明細書に開示される方法の一例を示す。 本明細書に開示される方法の一例を示す。 本明細書に開示される方法の別の例を示す。 本明細書に開示される方法の別の例を示す。 本明細書に開示される方法の更に別の例を示す。 本明細書に開示される方法の更に別の例を示す。 本明細書に開示される方法の更に別の例を示す。 本明細書に開示される方法の更に別の例を示す。 本明細書に開示される方法の追加の例を示す。 本明細書に開示される方法の追加の例を示す。 本明細書に開示される方法の更に別の例を示す。 本明細書に開示される方法の更に別の例を示す。 増幅中の鋳型鎖の拡散及び対流を低減するための方法の例を示す。 増幅中の鋳型鎖の拡散及び対流を低減するための方法の例を示す。 増幅中の鋳型鎖の拡散及び対流を低減するための方法の例を示す。 パターン化された配列決定表面を含むフローセルの上部配列決定表面を示す。 下部配列決定表面に固定化された複合体の明視野像を示す。 配列決定が実行された後のフローセルの１つのレーンの上部及び下部配列決定表面の分子被覆のヒストグラムである。 配列決定が実行された後の１つのレーンの上部及び下部配列決定表面について、Ｑ３０（Ｙ軸）より大きいＱスコアのパーセンテージ対配列決定サイクル数（Ｘ軸）を示すグラフである。 異なる濃度（μＭ、Ｘ軸）のアルキンビオチンで処理されたフローセルの底面に２つの異なる導入液を使用して実行された、複合体ローディング（ビーズ数／ｍｍ２、Ｙ軸）を示す棒グラフである。 異なる濃度（μＭ、Ｘ軸）のアルキンビオチンで処理されたフローセルの上面に２つの異なる導入液を使用して実行された、複合体ローディング（ビーズ数／ｍｍ２、Ｙ軸）を示す棒グラフである。 ２つの異なるフローセルチャネルの長さ（Ｘ軸）に沿った底面及び上面における標的複合体ローディング及び実際の複合体ローディング（ビーズ数／ｍｍ２、Ｙ軸）を示すグラフである。 ２つの異なるフローセルチャネルの長さ（Ｘ軸）に沿った底面及び上面における目標複合体ローディング及び実際の複合体ローディング（ビーズ数／ｍｍ２、Ｙ軸）を示すグラフである。 目標／期待複合体ローディング、１つのフローセルチャネルの長さ（Ｘ軸）に沿った底面と上面の実際の複合体ローディング（ビーズ数／ｍｍ２、Ｙ軸）、及び各表面の直線あてはめを示すグラフである。
一部の配列決定技術は、配列決定可能な核酸断片を利用している。いくつかの例では、各配列決定可能な核酸断片は、遺伝物質の一部（断片）と、３’末端及び５’末端にアダプターとを含む。配列決定可能な核酸断片は、固形支持体に付着して複合体を形成し得る。これらの例では、当該断片が生成される、より長い遺伝物質に関する隣接情報を保存できることから、固形支持体の使用が望ましい場合がある。その他の配列決定技術には、固形支持体に付着した鋳型のクラスターを含む、クラスター化した固形支持体を利用するものがある。これらの例では、増幅（鋳型鎖の形成）をフローセル以外で実行でき、したがって、フローセルの化学的性質は、増幅プライマーを含まないという点で単純化されることから、固形支持体の使用が望ましい場合がある。しかしながら、それらの標的材料（例えば、複合体又はクラスター化した固形支持体）が、対向して配置した２つの配列決定表面（例えば、上表面／上面及び下表面／底面）を有するフローセルで使用される場合、標的材料は、フローセルの下部に配置した配列決定表面へと沈む傾向があることがわかっている。同様の問題は、反対側の表面を持つフローセルにおいて、タンパク質バイオマーカー、微生物叢、溶解物などの他の標的材料でも生じ得る。
本明細書に開示される方法のいくつかの例は、２つの対向する配列決定表面にわたる、標的材料のよりバランスのとれた固定化を提供する。いくつかの例では、同じタイプの標的材料が、２つの対向する配列決定表面にわたって固定化される。他の例では、２つの異なる標的材料（少なくとも１つの異なる特性を有する）が、２つの対向する配列決定表面にそれぞれ固定化される。
本明細書に開示される方法の一例は、異なる密度を有する流体の組み合わせを利用する。一方の流体密度は、標的材料（例えば、複合体、クラスター化した固形支持体）が、配列決定表面のうち１つの表面に移動して固定化されることを可能にし、他方の流体密度は、標的材料が他の配列決定表面に移動して固定化されることを可能にする。
該方法の別の例は、流体、実質的に均一な磁力、及び磁気応答性の標的材料（例えば、固形支持体）の組み合わせを利用する。この例では、流体は、磁気応答性の標的材料とほぼ同じ密度を有するように選択される。この流体では、標的材料の一部が沈む一方で（配列決定表面のうち１つの表面で固定化され）、当該標的材料のその他の一部は浮揚する。実質的に均一な磁力が他の配列決定表面に印加されると、浮遊している標的材料は、他の配列決定表面に移動し、固定化される。
本明細書に開示される方法の更に別の例は、異なる密度を有する２つの異なる標的材料を利用する。両方の標的材料が同じ流体に含まれる。（流体に関する）標的材料の１つの密度は、その標的材料（例えば、複合体、クラスター化した固形支持体）が、配列決定表面のうち１つの表面に移動し、固定化されることを可能にするものである一方で、（流体に関する）他の標的材料の密度は、その標的材料が他の配列決定表面に移動し、固定化されることを可能にする。
本明細書に開示される方法の更に別の例は、密度、電荷、磁性、又はそれらの組み合わせなど、少なくとも１つの異なる特性を有する２つの異なる標的材料を利用する。少なくとも１つの条件への露出は、異なる標的材料を、対向する配列決定表面のうちそれぞれに関する表面に移動させる。
両方の配列決定表面上に標的材料（例えば、複合体、クラスター化した固形支持体など）を固定化すると、フローセルの全体的な利用率が向上する。
２つの配列決定表面にわたり、固定化された標的材料をよりバランスよく分布させることで、フローセルの使用により得られる下流のメトリクスが改善され得る。一例では、２つの配列決定表面にわたる、固定化された標的材料のよりバランスのとれた分布は、改善された配列決定メトリクスにつながる可能性がある。一例では、標的材料は複合体を含み得、複合体がフローセルの２つの配列決定表面にわたってより均一に分布する場合、複合体から放出されたライブラリ断片もまた、それぞれの配列決定表面にわたってより均一にシーディングする。このシーディングは、クラスターが形成される複合体の位置に関して比較的局在化されている個々のクラスターの形成につながる。別の例では、標的材料は、クラスター化した固形支持体を含み得る。クラスター化した固形支持体がフローセルの２つの配列決定表面にわたってより均一に分散されると、クラスター化した鋳型鎖もより均一に分散される。配列決定中に、ヌクレオチドがクラスターのそれぞれの鋳型鎖に組み込まれると、個々のクラスターは、蛍光シグナルの「空間クラウド期待」を生成する。均一な分布は、空間クラウドの読みやすさを向上させることができる。
更に、両方の配列決定表面をローディングすると、それらの空間クラウドを生成するための領域が増える。
定義
本明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、関連技術の通常の意味をとるものと理解されるであろう。本明細書で使用されるいくつかの用語及びそれらの意味は、以下に記載される。
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、単数形並びに複数形の両方を指す。本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「包含する」、「含有する」又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非限定的であり、更なる列挙されていない要素又は方法工程を除外しない。
「一例」、「別の例」、「例」などへの本明細書全体を通じての言及は、例に関連して記載されている特定の要素（例えば、特徴、構造、組成、構成、及び／又は特性）が、本明細書に記載されている少なくとも１つの例に含まれており、他の例に存在していても、存在していなくともよいことを意味している。更に、文脈上明確に別段の指示がない限り、任意の例に関する記載の要素は、様々な例において任意の好適な様式で組み合わせ得ることを理解すべきである。
特許請求の範囲を含む本開示全体で使用される「実質的に」及び「約」という用語は、処理における変動などに起因するような小さな変動を記載及び説明するために使用される。それらの用語は、表示値から±１０％以下、例えば、表示値から±５％以下、表示値から±２％以下、表示値から±１％以下、表示から±０．５％以下、表示値から±０．２％以下、表示値から±０．１％以下、表示値から±０．０５％以下を指すことができる。
アダプター：例えば、ライゲーション又はタグメンテーションによって核酸分子に融合され得る直鎖状オリゴヌクレオチド配列。好適なアダプターの長さは、約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、又は約１２ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、又は約１５ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドの範囲であり得る。アダプターは、ヌクレオチド及び／又は核酸の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの例では、アダプターは、プライマー、例えば、ユニバーサルヌクレオチド配列（例えば、Ｐ５又はＰ７配列）を含むプライマーの少なくとも一部に相補的な配列を含むことができる。一例として、断片の一端のアダプターは、第１フローセル又は固形支持体プライマーの少なくとも一部に相補的な配列を含み、断片の他端のアダプターは、第２フローセル又は固形支持体プライマーの少なくとも一部と同一である配列を含む。相補的なアダプターは、第１フローセル又は固形支持体プライマーにハイブリダイズすることができ、同一のアダプターは、クラスター化中に第２フローセル又は固形支持体プライマーにハイブリダイズし得るその相補的なコピーの鋳型である。いくつかの例では、アダプターは、配列決定プライマー配列又は配列決定結合部位を含むことができる。異なるアダプターの組み合わせを、ＤＮＡ断片などの核酸分子に組み込むことができる。
ほぼ同等：少なくともほぼ同等とは、ある構成要素（例えば、流体）の密度が、別の構成要素（例えば、固形支持体）の密度の０．０８ｇ／ｃｍ３以内であることを意味する。場合によっては、２つの成分の密度は同等である。
捕捉部位又は化学的捕捉部位：標的物質（例えば、複合体、クラスター化した固形支持体、タンパク質バイオマーカーなど）の局在化を可能にする化学的特性を持つよう修飾したフローセル表面の一部。一例では、捕捉部位は、化学捕捉剤（即ち、標的分子（例えば、複合体、クラスター化した固形支持体、タンパク質バイオマーカーなど）に付着、保持、又は結合することができる材料、分子又は部分）を含み得る。化学捕捉剤の一例としては、標的材料（又は標的材料に付着した連結部分）に結合し得る受容体リガンド結合ペア（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、レクチン、炭水化物、核酸結合タンパク質、エピトープ、抗体など）のメンバーが挙げられる。化学捕捉剤の更に別の例としては、標的材料と静電相互作用、水素結合、又は共有結合（例えば、チオールジスルフィド交換、クリックケミストリー、ディールス・アルダー反応など）を形成することができる化学試薬が挙げられる。
複合体：固形支持体などのキャリア、及びキャリアに付着した配列決定可能な核酸断片。担体はまた、他のメンバーが捕捉部位の一部である結合ペアの、一方のメンバーを含むこともできる。
クラスター化した固形支持体：複数の増幅した鋳型鎖が付着している、固形支持体などのキャリア。複数の増幅された鋳型鎖は、「クラスター」と呼ばれ得る。
堆積：手動又は自動のものであってよく、場合によっては表面特性の変更をもたらす、任意の適切な塗布技術。一般に、堆積は、蒸着技術、コーティング技術、グラフト技術などを使用して実行され得る。いくつかの特定の例としては、化学蒸着（ＣＶＤ）、スプレーコーティング（例えば、超音波スプレーコーティング）、スピンコーティング、ダンク又はディップコーティング、ドクターブレードコーティング、液滴分配（puddle dispensing）、フロースルーコーティング、エアロゾル印刷、スクリーン印刷、マイクロコンタクト印刷、インクジェット印刷などが挙げられる。
くぼみ：基材又はパターン化された樹脂による隙間領域によって少なくとも部分的に囲まれる表面開口部を有する、基材又はパターン化された樹脂における別個の凹状の機構。くぼみは、表面の開口部において、例として、円形、楕円形、正方形、多角形、星形（任意の数の頂点を持つ）などの、様々な形状をとることができる。表面と直交するように取られたくぼみの断面は、湾曲形状、正方形、多角形、双曲線、円錐、角のある形状などであることができる。例として、くぼみは、ウェル又は２つの相互接続されたウェルであり得る。くぼみはまた、尾根、階段状の作りなど、より複雑な構造を有し得る。
それぞれ：アイテムのコレクションを指して使用される場合、それぞれがコレクション内の個々のアイテムを識別するが、必ずしもコレクション内のすべてのアイテムを指すわけではない。明示的な開示又は文脈がそうでないことを明確に指示する場合、例外が生じ得る。
外部固定剤：フローセルに導入された複合体と混和しない気体、液体、又は粘性媒体。気体外部固定剤を使用して、複合体又はサンプルの周りに液滴を作り出すことができる。気体外部固定剤の一例は、好適な流量でフローセルを通し誘導される空気である。例えば、空気を使用してフローセルから流体を吸引することもでき、この吸引により、フローセル内に固定化された複合体の周りに液体の液滴を形成する。形成された液滴は、拡散バリアとして機能する。液体又は粘性媒体は、複合体から放出された配列決定ライブラリの拡散を最小限に抑えるために使用される。配列決定ライブラリ又は他のポリヌクレオチドは外部固定剤にほとんど又は全く溶媒和しないため、外部固定剤は拡散バリアを形成し得る。液体形態の外部固定剤の例は、鉱油、シリコーン油、過フッ素化油、フッ素化炭素油（例えば、ＦＣ４０）、又はそれらの組み合わせなどの疎水性油を含む。粘性媒体形態の外部固定剤の例としては、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンなど）、デキストラン、スクロース、グリセロールなどを含有する緩衝液が挙げられる。いくつかの例では、粘性媒体は温度応答性ゲルである。温度応答性ゲルは、非シーディング温度では非粘性であり、シーディング温度では粘性媒体に変わる。温度応答性ゲルの例としては、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）及びポリエチレンオキシド－ポリプロピレンオキシド－ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ）／ラポナイトナノ粒子複合材料が挙げられる。
フローセル：反応を実行できるチャンバ（例えば、フローチャネル）と、チャンバに試薬を送達するための入口と、チャンバから試薬を除去するための出口とを有する容器。いくつかの例では、チャンバは、チャンバ内で発生する反応の検出を可能にする。例えば、チャンバは、アレイ、光学的に標識された分子などの光学的検出を可能にする１つ以上の透明な表面を含み得る。
フローチャネル：液体サンプルを選択的に受け取ることができ、結合又はその他の方法で付着した２つの構成要素間に画定された領域。いくつかの例では、フローチャネルは、２つのパターン化された又はパターン化されていない配列決定表面の間に画定され得、したがって、配列決定表面の１つ以上の構成要素と流体連通し得る。
断片：遺伝物質の一部又は断片（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）。隣接して保存されたライブラリ断片は、断片化された長い核酸サンプルの小さな断片であり、長い核酸サンプルにおける隣接情報が当該断片に保存されている。
核酸分子又はサンプル：任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドであり、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、又はそれらの混合物を含み得る。この用語は、一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドを指す場合がある。
「鋳型」核酸分子（又は鎖）は、解析されることになる配列を指し得る。鋳型鎖のクラスターは、ライブラリ断片のアンプリコンを含む。
核酸分子中のヌクレオチドは、天然に存在する核酸及びそれらの機能性類似体を含み得る。機能性類似体の例は、配列特異的な形式で核酸にハイブリダイズすることができるか、又は特定のヌクレオチド配列の複製のための鋳型として使用され得る。天然に存在するヌクレオチドは、一般には、ホスホジエステル結合を含有する骨格を有する。類似体構造は、当技術分野で知られている様々なもののいずれかを含む代替骨格結合を有することができる。天然に存在するヌクレオチドは、一般に、デオキシリボース糖（例えば、ＤＮＡに見られる）又はリボース糖（例えば、ＲＮＡに見られる）を有する。類似体構造は、当技術分野で知られている様々なもののいずれかを含む代替糖部分を有することができる。ヌクレオチドは、天然又は非天然の塩基を含むことができる。天然のＤＮＡは、アデニン、チミン、シトシン、及び／又はグアニンの１つ以上を含むことができ、天然のＲＮＡは、アデニン、ウラシル、シトシン、及び／又はグアニンの１つ以上を含むことができる。ロックド核酸（locked nucleic acid、ＬＮＡ）及びブリッジ構造核酸（bridged nucleic acid、ＢＮＡ）などの任意の非天然塩基が使用され得る。
プライマー：ライブラリ断片に付着したアダプターなど、標的配列にハイブリダイズし得る核酸分子。一例として、増幅プライマーは、鋳型増幅及びクラスター生成の開始点として機能し得る。別の例では、合成された核酸（鋳型）鎖は、合成された核酸鎖に相補的な新しい鎖の合成をプライミングするために、プライマー（例えば、配列決定プライマー）がハイブリダイズし得る部位を含み得る。任意のプライマーは、ヌクレオチド又はそれらの類似体の任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの例では、プライマーは、一本鎖のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。プライマーの長さは、任意の数の塩基の長さであることができ、様々な非天然ヌクレオチドを含むことができる。一例では、配列決定プライマーは、１０～６０塩基、又は２０～４０塩基の範囲の短鎖である。
配列決定可能な核酸断片：３’及び５’末端にアダプターを有する遺伝物質の一部。配列決定可能な核酸断片では、各アダプターは、既知のユニバーサル配列（例えば、フローセル上のプライマーの少なくとも一部に相補的又は同一である）及び配列決定プライマー配列を含む。両方のアダプターは、インデックス（バーコード又はタグ）配列を含むこともできる。一例では、一端（例えば、Ｐ５’又はＰ５配列を含む）は、ビーズインデックスを含み得、他端（Ｐ７又はＰ７’配列を含む）は、サンプルインデックスを含み得る。配列決定可能な核酸断片は、トランスポゾンの挿入を介して固形支持体に結合されてよく、挿入されたＤＮＡ分子は固形支持体（例えば、ビーズ）の表面に固定化され、又は、結合ペア若しくは他の切断可能なリンカーを介して直接固定化され、又は、ハイブリダイゼーションにより結合され、相補的なアダプター配列が固形支持体の表面上に存在する。
配列決定表面：配列決定を行うことができるフローセルの表面。いくつかの例では、配列決定表面は、それにグラフトされた１種以上のタイプの増幅プライマーを有する高分子ヒドロゲルを含む。これらの例では、配列決定表面はまた、増幅プライマー又はその近くで複合体を固定化するための捕捉部位を含み得る。他の例では、配列決定表面は、クラスター化した固形支持体を固定化するための捕捉部位を含む。
固形支持体：例えば、球形、卵形、微小球、又は規則的若しくは不規則な寸法を有するかどうかにかかわらずその他の認識される粒子形状を特徴とする形状を有する、硬質又は半硬質の材料で作製された小体（small body）。いくつかの例では、固形支持体は、それに付着した配列決定ライブラリを有し得る。他の例では、固形支持体は、それに付着した鋳型鎖のクラスターを有し得る。
標的材料：フローセル表面に固定化される物質。
トランスポソーム：組み込み酵素（例えば、インテグラーゼ又はトランスポサーゼ）と、組み込み認識部位（例えば、トランスポサーゼ認識部位）を含む核酸との間で形成される複合体。
本明細書に開示される実施例では、標的材料は、２つの対向する配列決定表面を含むフローセルに導入される。次に、標的材料及びフローセルについて説明し、続いて、２つの対向する配列決定表面のそれぞれに標的材料を固定化するための方法についての様々な例を説明する。
標的材料
標的材料１１の例を図１Ａ～図１Ｃに示す。本明細書に開示される実施例では、フローセルの表面上に固定化される任意の標的材料１１が利用され得る。例として、標的材料１１は、本明細書で定義される複合体１０Ａ、１０Ｂ（図１Ａ及び図１Ｂを参照）、本明細書で定義されるクラスター化した固形支持体１３（図１Ｃを参照）、特定のサンプルからのその他のＤＮＡライブラリ、細胞、固形支持体に結合したオリゴヌクレオチド複合タンパク質、タンパク質バイオマーカー、微生物叢などであり得る。以下の説明は、複合体１０Ａ、１０Ｂ及びクラスター化した固形支持体１３のいくつかの例を提供する。
複合体
いくつかの例示的な複合体１０Ａ及び１０Ｂが、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示される。本明細書に開示される方法の例では、複合体１０Ａ、１０Ｂは、固形支持体１２、１２’、及び固形支持体１２、１２’に付着した配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４”を含む。
異なる密度を有する流体、又は異なる密度を有する標的材料１１、又は非帯電標的材料１１の組み合わせを利用する方法の例では、固形支持体１２は、ヒドロゲル；ガラス（例えば、制御された細孔ガラスビーズ）；プラスチック、例えば、アクリル、ポリスチレン、又はスチレンと別の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン又はポリテトラフルオロエチレン（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｕｒｓ Ｃｏ．からのＴＥＦＬＯＮ（登録商標））；アガロース、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズ（Ｃｙｔｉｖｉａから入手可能なアガロースの架橋ビーズ形態）、又はＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ビーズ（Ｃｙｔｉｖｉａから入手可能なデキストランの架橋ビーズ形態）などの多糖類又は架橋多糖類；ナイロン；ニトロセルロース；樹脂；ケイ素及び変性ケイ素を含むシリカ又はシリカ系材料；炭素繊維；金属；無機ガラス；光ファイバーバンドル；又は他の様々なポリマーであり得るが、それらに限定されない。固形支持体１２のいくつかの例は、固形ビーズ、多孔質ビーズ、又は中空ビーズの形態を有し得る。
流体と磁力の組み合わせを利用する方法の例では、固形支持体１２’は磁気応答性材料である。「磁気応答性」材料は、磁場に対応する。磁気応答性固形支持体の例は、磁気応答性材料を含むか、又はそれらから構成される。磁気応答性材料の例としては、常磁性材料、強磁性材料、フェリ磁性材料、及びメタ磁性材料が挙げられる。適切な常磁性材料の例としては、鉄、ニッケル、及びコバルト、並びにＦｅ３Ｏ４、ＢａＦｅ１２Ｏ１９、ＣｏＯ、ＮｉＯ、Ｍｎ２Ｏ３、Ｃｒ２Ｏ３、及びＣｏＭｎＰなどの金属酸化物が挙げられる。市販の例の１つには、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＹＮＡＢＥＡＤ（商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジン（ストレプトアビジンでコーティングされた超常磁性ビーズ）を含む。いくつかの例では、磁気応答性材料は、ポリマービーズのシェルに埋め込まれる。他の例では、磁気応答性材料はビーズ形態であり、酸化ケイ素又は窒化ケイ素などの不動態化材料でコーティングされる。２つの異なる標的材料１１を利用する例示的な方法では、標的材料１１の一方は、本明細書に開示される磁気応答性固形支持体１２’のいずれかを含み得る。
固定化のために電場を利用する方法の例では、標的材料１１の固形支持体１２は、正に帯電していても、負に帯電していてもよい。これらの実施例では、固形支持体１２について記載された実施例のいずれかを使用し得、所望の電荷を与えるためにコーティング又は官能化し得る。固形支持体１２に電荷を与えるために、小分子又はポリマーのいずれかが使用され得る。例えば、固形支持体１２（例えば、ポリスチレン、シリカなど）のいずれかをアミンで官能化し、それらを正に帯電させることができる。任意の第一級、第二級、又は第三級アミンを使用し得る。適切なアミンの例は、アミノシラン、ポリリジン、又はキトサンを含む。別の例として、固形支持体１２（例えば、ポリスチレン、シリカ、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）など）のいずれかを、カルボキシル基又は硫酸基で官能化して、当該支持体を負に帯電させることができる。更に別の例としては、固形支持体１２（例えば、ポリスチレン、シリカ、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）など）のいずれかをポリグルタミン酸でコーティングし、当該支持体を負に帯電させることもできる。
図１Ａ及び図１Ｂには示されないが、固形支持体１２、１２’は、結合ペアの一方のメンバーで官能化され得る。「結合ペア」は、互いに付着することができる２つの剤（例えば、材料、分子、部分）を指す。この例では、固形支持体１２、１２’上のメンバーは、フローセルの配列決定表面上に位置する別のメンバーとの結合ペアである。他の例では、固形支持体１２、１２’は、フローセルの配列決定表面に対し化学的に結合され得る。
固形支持体１２、１２’の官能化は、固形支持体１２、１２’を結合ペアメンバーでコーティングすること、又は結合ペアメンバーと固形支持体１２、１２’の表面の官能基との間に結合を形成することを含み得る。一例の結合ペアメンバーは、フローセルの配列決定表面上に位置する他の結合ペアメンバーに結合することができる受容体リガンド結合ペア（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、レクチン、炭水化物、核酸結合タンパク質、エピトープ、抗体など）のメンバーを含む。結合ペアメンバーはまた、静電相互作用、水素結合、又は共有結合（例えば、チオールジスルフィド交換、クリックケミストリー、ディールス・アルダー反応など）を形成することができる化学試薬であり得る。いかなる形態の化学的結合もまた、フローセルの配列決定表面に固形支持体１２、１２’を付着させることができる。多くの場合、可逆的又は切断可能な相互作用が望ましいことから、固形支持体１２、１２’は配列決定の前に除去され得る。
複合体１０Ａ、１０Ｂの例では、配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’は、固形支持体１２、１２’に付着する。配列決定可能な各核酸断片１４、１４’、１４’’は、３’及び５’末端にアダプター（例えば、１８、１８’、１８’’、２２、２２’、２２’’）を有する長い遺伝物質の一部（例えば、断片１６、１６’、１６’’）を含む。配列決定可能な断片１４、１４’、１４’’は、より長い遺伝物質を断片化し、断片１６、１６’、１６’’の末端に望ましいアダプター１８、１８’、１８’’、２２、２２’、２２’’を組み込む任意のライブラリ調製技術を使用して調製され得る。いくつかの適切なライブラリ調製技術は、図１Ａ及び図１Ｂを参照して説明される。しかしながら、他のライブラリ調製技術もまた使用され得ることを理解すべきである。
図１Ａは、より大きな核酸サンプルからの断片１６、１６’を含み、その隣接性が固形支持体１２、１２’上に保存される、配列決定可能な核酸断片１４、１４’を含む複合体１０Ａの例を示す。複合体１０Ａを作製するための例示的な方法が本明細書に記載されるが、配列決定可能な核酸断片１４、１４’が固形支持体１２、１２’に付着するものであるならば、他の方法も使用できることを理解すべきである。
図１Ａに示す複合体１０Ａを形成する一例の方法では、アダプター配列１８、１８’は、結合ペアの１つのメンバー２０を介して固形支持体１２、１２’に結合される。一例では、該アダプター配列１８、１８’は、第１配列決定プライマー配列（例えば、読み取り１配列決定プライマー配列）及びフローセル上の増幅プライマー（例えば、Ｐ５）のうち１つの少なくとも一部に相補的である第１配列（Ｐ５’）を含み得る（図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃに示される）。該アダプター配列１８、１８’は、インデックス配列又はバーコート配列も含み得る。アダプター配列１８、１８’は、結合ペアの一方のメンバー２０（例えば、ビオチン）に結合され、その結果として結合ペアの他方のメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジンなど）を含む固形支持体１２、１２’の表面に結合され得る。この例では、固形支持体１２、１２’上の結合ペアのメンバーは、ｉ）配列決定可能な核酸断片１４、１４’を結合するために使用されるメンバー２０に結合し、ｉｉ）フローセルの配列決定表面に結合する。他の例では、固形支持体１２、１２’は、２つの異なる結合ペアメンバーで官能化され得るものであり、例えば、ｉ）そのうちの一方は配列決定可能な核酸断片１４、１４’を付着させるために使用されるメンバー２０に結合でき、ｉｉ）他方は、フローセルの配列決定表面に結合できる。
この例では、トランスポソーム複合体（図示せず）もまた、ライブラリ調製法の開始時に固形支持体１２、１２’に結合され得る。トランスポソーム複合体を固形支持体１２、１２’にロードする前に、部分的なＹアダプターをトランスポサーゼ酵素（例えば、２つのＴｎ５分子）と混合し、トランスポサーゼ複合体を形成することができる。部分的なＹアダプターは、互いにハイブリダイズする２つのモザイク末端配列を含み得る。モザイク末端配列の１つは、２つの遊離末端を有することから、遊離のモザイク末端配列と呼ばれ、例えば、一端はアダプター１８、１８’に付着でき、他端はタグ付け中に、断片化されたＤＮＡ鎖１６、１６’に付着できる。モザイク末端配列の一端は、別のアダプター（例えば、２２、２２’）に付着させることができ、当該アダプターは、第２配列決定プライマー配列（例えば、読み取り２配列決定プライマー配列）、及びフローセル上の別の増幅プライマー（Ｐ７）の少なくとも一部と同一である第２配列（Ｐ７）を含む。増幅中、同一の配列により、フローセル上の他の増幅プライマー（Ｐ７）の少なくとも一部に相補的なコピーの形成が可能になる。アダプター配列２２、２２’は、タグ付け中に、断片化されたＤＮＡ鎖１６、１６’に付着しない。
トランスポソーム複合体を固形支持体１２、１２’にロードすることは、トランスポソーム複合体を固形支持体１２、１２’と混合することと、混合物を、遊離モザイク末端の遊離末端のうち一端をアダプター配列１８、１８’の３’末端に連結するための適切な条件に露出することとを含み得る。個々のトランスポソーム複合体は、固形支持体１２、１２’上のアダプター配列１８、１８’のそれぞれに付着され得る。
次に、複合体１０Ａを形成するこの例示的な方法では、タグ付けプロセスが実行され得る。より長い核酸サンプル（例えば、ＤＮＡ）を含む流体（例えば、タグ付け緩衝液）が、アダプター配列１８、１８’及びそれに結合したトランスポソーム複合体を有する固形支持体１２、１２’に追加され得る。サンプルがトランスポソーム複合体と接触すると、より長い核酸サンプルにタグ付けられる。より長い核酸サンプルは断片１６、１６’に断片化され、（例えば、遊離モザイク末端配列の他方の遊離末端のライゲーションによって）それぞれがその５’末端で部分的なＹアダプターにタグ付けされる。より長い核酸サンプルの連続的なタグ付けにより、結果としてトランスポソーム複合体間で複数のブリッジ構造分子が得られる。該ブリッジ構造分子は、固形支持体１２、１２’を包み込む。トランスポソーム複合体は、ブリッジ構造の分子としてより長い核酸サンプルの隣接性を維持する。
次いで、トランスポサーゼ酵素を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理又は熱若しくはプロテイナーゼＫ消化によって除去することができる。トランスポサーゼ酵素を除去すると、隣接性が保存された（contiguity preserved）断片１６、１６’が固形支持体１２、１２’に付着したままになる。
配列決定可能な断片１４、１４’を完成させるために、サンプル断片１６、１６’が配列２２及び２２’に確実に付着するように、更なる伸長及びライゲーションが行われる。得られた複合体１０Ａは図１Ａに示される。
各配列決定可能な核酸断片１４、１４’は、両端にそれぞれのアダプター配列１８及び２２又は１８’及び２２’が付着した、隣接性が保存されたライブラリ断片１６、１６’を含む。アダプター配列１８、１８’は、最初に固形支持体１２、１２’に結合したものであり、第１配列決定プライマー配列、及びフローセルプライマーの一方に相補的な第１配列を含む。アダプター配列１８、１８’は、結合ペアの一方のメンバー２０に付着する。アダプター配列２２、２２’は部分的なＹアダプターからのものであり、別のフローセルプライマーと同一の第２配列及び第２配列決定プライマー配列を含む。配列決定可能な各核酸断片１４、１４’には、増幅（ブリッジ増幅など）及び配列決定に適したアダプターが含まれるため、ＰＣＲ増幅は実行されない。したがって、これらの断片１４、１４’は配列決定可能である。更に、隣接性が保存されたライブラリ断片１６、１６’は同じ長い核酸サンプルに由来するものであることから、元のサンプルの隣接性が保存され、ライブラリ断片１４、１４’は連結された長い読み取りアプリケーションに適し得る。
図１Ｂは、固形支持体１２、１２’と、固形支持体１２、１２’に付着した配列決定可能な核酸断片１４’’と、を含む別の複合体１０Ｂを示す。一例では、チューブ内でＰＣＲフリー（PCR-free）のヌクレオチドライブラリが作成され、次にライブラリがチューブ内の固形支持体１２、１２’にハイブリダイズさされる。図１Ｂに示す例では、アダプター１８’’、２２’’は、チューブ内のライブラリ断片１６’’に追加され、結合ペアの一方のメンバー２０を有するプライマーは、チューブ内でアダプター１８’’にハイブリダイズされ、次に、配列決定可能な核酸断片１４’’は、結合ペアのメンバー２０を介して固形支持体１２、１２’に結合される。別の例では、固形支持体１２、１２’は、結合ペアを介して当該支持体に付着したプライマー（例えば、支持体１２、１２’上のアビジン及びプライマーに付着したビオチン）を有し得る。これらのプライマーは、ライブラリ断片１６’’に付着したアダプター１８’’にハイブリダイズする（したがって、プライマー及び結合ペアメンバーは、断片の一方の末端にあり、他端にはない）。更に他の例では、伸長は、鎖置換酵素を使用して実行され得る。これにより、完全に二本鎖のライブラリ（例えば、図１Ｂに示すように、フォークやＹアダプターがない）が得られる。
前述のように、他のライブラリ調製技術もまた使用され得る。例えば、ライゲーションベースのライブラリ調製技術は、相補的なアダプター配列がフローセル上に固定化される場合に使用され得る。別の例として、ｍＲＮＡは、ポリＡテールハイブリダイゼーションを介して固形支持体１２、１２’に固定化され得る。
クラスター化した固形支持体
クラスター化した固形支持体１３の例が図１Ｃに示される。クラスター化した固形支持体１３は、プライマー４２又は４２’を介して固形支持体１２、１２’に付着した固形支持体１２、１２’及び鋳型鎖６４を含む。
固形支持体１２、１２’の任意の例は、クラスター化した固形支持体１３のコアとして使用され得る。固形支持体１２、１２’のタイプ、及びその特性／その複数の特性（例えば、密度、電荷、磁性など）は、使用される固定化方法によって異なり得る。
図１Ｃに示されないが、図１Ａ及び図１Ｂに示される複合体１０Ａ及び１０Ｂと同様であるが、固形支持体１２、１２’は、フローセルの捕捉部位に付着するための結合ペアの一方のメンバーで官能化され得る。
図１Ｃに示すように、固形支持体１２、１２’のこの例は、プライマー４２、４２’で官能化される。プライマー４２、４２’は、一点共有結合又はプライマー４２、４２’の５’末端又はその付近での強い非共有結合的相互作用によって固形支持体１２、１２’に固定化され得る増幅プライマー４２、４２’であり得る。この付着により、ｉ）プライマー４２、４２’のアダプター特異的部分は、その同族の配列決定可能な核酸断片に自由にアニーリングでき、ｉｉ）プライマー伸長のために３’ヒドロキシル基は遊離である。５’末端又はその付近で、プライマー４２、４２’は、共有結合又は強い非共有結合的相互作用が可能な化学的に修飾可能な官能基を含む。化学的に修飾可能な官能基の例としては、チオール、アジド、アルキン、アミノ、ビオチンなどが挙げられる。
好適なプライマー４２、４２’の特定の例としては、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＨｉＳｅｑＸ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑＤＸ（商標）、ＭｉＮＩＳｅｑ（商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（商標）、ＮｅｘｔＳｅｑＤＸ（商標）、ＮｏｖａＳｅｑ（商標）、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）、ＩＳＥＱ（商標）、及び他の装置プラットフォームでの配列決定のためにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．により販売される市販のフローセルの表面上で使用される、Ｐ５及びＰ７プライマーが挙げられる。Ｐ５及びＰ７プライマーのいずれも、固形支持体１２、１２’のそれぞれにグラフトされ得る。
一例では、プライマー４２、４２’の固形支持体１２、１２’へのグラフトは、固形支持体１２、１２’をプライマー４２、４２’、水、緩衝液、及び触媒を含み得るプライマー溶液又は混合物に浸漬することを含み得るダンクコーティングを含み得る。他のグラフト技術は、スプレーコーティング、液滴分配、又はプライマー４２、４２’を固形支持体１２、１２’に付着させる別の適切な方法を含み得る。グラフト法のいずれかを用い、プライマー４２、４２’は、固形支持体１２、１２’の反応基と反応する。
グラフト期間、プライマー４２、４２’の化学的に修飾可能な官能基は、固形支持体１２、１２’の反応基と反応又は相互作用する。以下は、グラフト期間に発生し得る反応又は相互作用の例である：アジド（例えば、スクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル）末端プライマーを固形支持体１２、１２’の表面上のヒドラジンと反応させ、又はアルキン末端プライマーを固形支持体１２、１２’の表面上のアジドと反応させ、又はアミノ末端プライマーを、固形支持体１２、１２’の表面上の活性化されたカルボキシレート基又はＮＨＳエステルと反応させ、又はチオール末端プライマーを固形支持体１２、１２’の表面上のアルキル化反応物（例えば、ヨードアセトアミン又はマレイミド）と反応させ、又はホスホルアミダイト末端プライマーを固形支持体１２、１２’の表面上でチオエーテルと反応させ、又はビオチン修飾プライマーを固形支持体１２、１２’の表面上でストレプトアビジンと相互作用させる。一部の核酸プライマー４２、４２’は、カオトロピック剤（ＫＩ、ＮＩ、又はＮａＳＣＮ）の存在下でシリカビーズに捕捉され得る。特定の一例として、ジベンゾシクロオクチン（アルキンを含むＤＢＣＯ）で終端されたプライマーは、銅を含まないクリックグラフトに使用され得る。
固形支持体１２、１２’上に鋳型鎖６４を生成するために、ライブラリ鋳型は、最初に、任意の核酸サンプル（例えば、ＤＮＡサンプル又はＲＮＡサンプル）から調製され得る。ＲＮＡサンプルを使用する場合、最初に相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）サンプルに変換される。この変換は、逆転写酵素を利用する逆転写を使用して行われ得る。いくつかの例では、逆転写及び二本鎖合成のためのキットが使用される。これらの例では、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃの大容量ｃＤＮＡ逆転写キットが使用され得る。他の例では、逆転写及び鋳型スイッチ（第２鎖用）用のキットが使用される。これらの例では、Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓの鋳型スイッチングＲＴ酵素混合物が使用され得る。
次に、ＤＮＡ又はｃＤＮＡサンプルは、一本鎖の、同様のサイズ（例えば、１０００ｂｐ未満）の断片に断片化され得る。調製中に、アダプターはこれらの断片の末端に追加され得る。サイクル増幅を低減することにより、配列決定結合部位、インデックス、及び固形支持体１２、１２’上のプライマー４２、４２’と相補的又は同一である領域などの、異なるモチーフがアダプターに導入され得る。最終的なライブラリ鋳型は、ＤＮＡ又はｃＤＮＡ断片と、両端にアダプターとを含む。いくつかの例では、単一の核酸サンプルからの断片は、断片に追加された同じアダプターを有する。
複数のライブラリ鋳型は複数の固形支持体１２、１２’に導入され得る。ライブラリ鋳型は、それぞれの固形支持体１２、１２’に固定化された２つのタイプのプライマー４２、４２’の一方にハイブリダイズする。次に、クラスター生成が実行され得る。クラスター生成の一例では、固形支持体１２、１２’のライブラリ鋳型は、ハイブリダイズしたプライマーから、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用する３’伸長によってコピーされる。元のライブラリ鋳型は変性され、コピー（例えば、鋳型鎖６４）は、図１Ｃに示すように、例えば、プライマー４２を介して、固形支持体１２、１２’に固定化されたまま残る。固定化されたコピーを増幅するために、等温ブリッジ増幅又は他の何らかの形態の増幅が使用され得る。例えば、コピーされた鋳型はループオーバーして隣接する相補的なプライマー（例えば、プライマー４２’）にハイブリダイズし、ポリメラーゼはコピーされた鋳型をコピーして二本鎖ブリッジ構造を形成し、このブリッジ構造は変性して２本の一本鎖を形成する。これらの２本の鎖は、ループオーバーして隣接する相補的なプライマー４２、４２’にハイブリダイズし、再度伸長し、２つの新しい二本鎖ループを形成する。このプロセスを、等温変性及び増幅のサイクルによって各鋳型コピーに対して繰り返して、密集したクローンクラスターを作り出す。二本鎖ブリッジ構造の各クラスターが変性される。一例では、逆方向鎖は、特異的な塩基切断によって除去され、順方向鋳型ポリヌクレオチド鎖を残す。クラスター化により、固形支持体１２、１２’にいくつかの鋳型ポリヌクレオチド鎖６４が形成される。このクラスター化の例にはブリッジ増幅があり、この増幅は実行できる増幅の一例である。
フローセル
フローセル２４の例の上面図が図２Ａに示される。本明細書で述べたように、フローセル２４は、２つの配列決定対抗（sequencing opposed）する配列決定表面を含む。パターン化されていない配列決定表面３０、３０’の例が図２Ｂに示され、パターン化された配列決定表面３２、３２’の例が図２Ｃに示され、パターン化された配列決定表面３１、３１’の別の例が図２Ｄに示される。パターン化されていない配列決定表面３０、３０’及びパターン化された配列決定表面３２、３２’は、プライマー４２、４２’を含み、したがって、フローセル２４で増幅されるライブラリ断片を導入する標的材料１１と共に利用され得る。パターン化した配列決定表面３１、３１’などの他の配列決定表面は、プライマー４２、４２’を含まず、したがって、クラスター化した固形支持体１３と共に利用され得る。
各配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’又は３１、３１’は基材（一般に図２Ａでは２６として示される）によって支持され、フローチャネル（一般に図２Ａでは２８として示される）は配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’又は３１、３１’の間に画定される。
基材２６は、単層／材料であり得る。単層基材の例は、図２Ｂの参照番号２６Ａ及び２６Ａ’に示される。適切な単層基材の例２６Ａ、２６Ａ’は、エポキシシロキサン、ガラス、修飾又は官能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、スチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（ＣｈｅｍｏｕｒｓのＴＥＦＬＯＮ（登録商標）など）を含む）、環状オレフィン／シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）（ＺｅｏｎのＺＥＯＮＯＲ（登録商標）など）、ポリアミドなど）、ナイロン（ポリアミド）、セラミック／酸化セラミック、シリカ、溶融シリカ、又はシリカベースの材料、ケイ酸アルミニウム、シリコン及び修飾シリコン（例えば、ホウ素ドープｐ＋シリコン）、窒化シリコン（Ｓｉ３Ｎ４）、酸化シリコン（ＳｉＯ２）、五酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）又は他の酸化タンタル（ＴａＯｘ）、酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、炭素、金属、無機ガラスなどを含む。
基材２６はまた、多層構造であり得る。多層基材の例は、図２Ｃ及び図２Ｄの参照番号２６Ｂ及び２６Ｂ’に示される。多層構造２６Ｂ、２６Ｂ’のいくつかの例は、表面に酸化タンタル又は別のセラミック酸化物のコーティング層を備えたガラス又はシリコンを含む。図２Ｃ及び図２Ｄを特に参照すると、多層構造２６Ｂ、２６Ｂ’の他の例は、その上にパターン化された樹脂３６、３６’を有する下部支持体３４、３４’を含む。多層基材２６Ｂ、２６Ｂ’の更に他の例は、シリコンオンインシュレータ（ＳＯＩ）基材を含み得る。
一例では、基材２６（単層であるか、多層である）は、約２ｍｍから約３００ｍｍの範囲の直径、又は最大約１０フィート（～３メートル）までの最大寸法を有する長方形のシート又はパネルを有し得る。一例では、基材２６は、約２００ｍｍから約３００ｍｍの範囲の直径を有するウェーハである。別の例では、基材２６は、約０．１ｍｍから約１０ｍｍの範囲の幅を有するダイである。例示的な寸法が提供されるが、任意の適切な寸法を有する基材２６を使用できることを理解すべきである。別の例として、３００ｍｍの丸いウェーハよりも大きな表面積を有する長方形の支持体であるパネルが使用され得る。
図２Ａに示す例では、フローセル２４は、フローチャネル２８を含む。いくつかのフローチャネル２８が示されるが、任意の数のチャネル２８がフローセル２４（例えば、単一のチャネル２８、４つのチャネル２８など）に含まれ得ることを理解すべきである。本明細書に開示される実施例では、各フローチャネル２８は、２つの配列決定表面（例えば、３０と３０’又は３２と３２’又は３１と３１’）と２つの付着した基材（例えば、２６Ａ及び２６Ａ’又は２６Ｂ及び２６Ｂ’）との間で画定される領域である。本明細書に記載の流体は、それぞれ入口及び出口を介してフローチャネル２８に導入及びフローチャネル２８から除去することができる。各フローチャネル２８は、フローセル２４内で互いにフローチャネル２８から分離され得、その結果、任意の特定のフローチャネル２８に導入された流体は、隣接するフローチャネル２８に流れ込まない。
フローチャネル２８の一部は、基材２６の材料に部分的に依存する任意の適切な技術を使用し、基材２６内に画定され得る。一例では、フローチャネル２８の一部がガラス基材２６へとエッチングされる。別の例では、フローチャネル２８の一部は、フォトリソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィーなどを使用し、多層基材２６Ｂ、２６Ｂ’の樹脂３６、３６’へとパターン化され得る。更に別の例では、別個の材料（例えば、図２Ｂ及び図２Ｃ及び図２Ｄの材料５０）は基材２６に適用され、別個の材料がフローチャネル２８の壁の少なくとも一部を画定することができる。
一例では、フローチャネル２８は長方形の構成を有する。フローチャネル２８の長さ及び幅は、基材２６の長さ及び幅よりもそれぞれ小さくてもよく、その結果、フローチャネル２８を取り囲む基材表面の一部は、別の基材２６への取り付けに利用可能である。場合によっては、各フローチャネル２８の幅は、少なくとも約１ｍｍ、少なくとも約２．５ｍｍ、少なくとも約５ｍｍ、少なくとも約７ｍｍ、少なくとも約１０ｍｍ、又はそれ以上であり得る。場合によっては、各フローチャネル２８の長さは、少なくとも約１０ｍｍ、少なくとも約２５ｍｍ、少なくとも約５０ｍｍ、少なくとも約１００ｍｍ、又はそれ以上であり得る。各フローチャネル２８の幅及び／又は長さは、上で指定された値よりも大きい、より小さい、又はそれらの間であり得る。別の例では、フローチャネル２８は正方形（例えば、１０ｍｍ×１０ｍｍ）である。
各フローチャネル２８の深さは、例えば、マイクロコンタクト、エアロゾル、又はインクジェット印刷を使用し、流路壁を画定する別個の材料（例えば、材料５０）を堆積する場合、複数の単層の厚さまで小さくすることができる。他の例では、各フローチャネル２８の深さは、約１μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、又はそれ以上であり得る。一例では、深さは、約１０μｍから約１００μｍの範囲であり得る。別の例では、深さは約５μｍ以下である。各フローチャネル２８の深さは、上で指定された値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であることを理解すべきである。フローチャネル２８の深さはまた、例えば、パターン化された配列決定表面３２、３２’又は３１、３１’が使用される場合、フローセル２４の長さ及び幅に沿って変化し得る。
図２Ｂは、パターン化されていない対向する配列決定表面３０、３０’を含むフローセル２４の断面図を示す。一例では、これらの表面３０、３０’のそれぞれは、基材２６Ａ、２６Ａ’上に調製され得、次に、基材２６Ａ、２６Ａ’は、フローセル２４の例を形成するために互いに付着し得る。接着剤、結合を助ける放射線吸収材料などの任意の適切な結合材料５０を使用し、基材２６Ａ、２６Ｂを共に結合し得る。
図２Ｂに示す例では、フローチャネル２８の一部は、単層基材２６Ａ、２６Ａ’のそれぞれに画定される。例えば、各基材２６Ａ、２６Ａ’は、その中に画定された凹状領域３８、３８’を有し得、凹状領域には配列決定表面３０、３０’の構成要素が導入され得る。配列決定表面３０、３０’の構成要素によって占有されていない凹状領域３８、３８’内の任意の空間は、フローチャネル２８の一部であると見なされ得ることを理解すべきである。
配列決定表面３０、３０’は、高分子ヒドロゲル４０、４０’、高分子ヒドロゲル４０、４０’に付着した増幅プライマー４２、４２’、及び化学的捕捉部位４４、４４’を含む。
高分子ヒドロゲル４０、４０’の例としては、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－コ－アクリルアミド、ＰＡＺＡＭなどのアクリルアミドコポリマーが挙げられる。ＰＡＺＡＭ及び他のいくつかの形態のアクリルアミドコポリマーは、次の構造（Ｉ）で表され、
Figure 2023506338000002
 （式中、
ＲＡは、アジド、任意選択で置換アミノ、任意選択で置換アルケニル、任意選択で置換アルキン、ハロゲン、任意選択で置換ヒドラゾン、任意選択で置換ヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、任意選択で置換テトラゾール、任意選択で置換テトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、硫酸塩、及びチオールからなる群から選択され、
ＲＢはＨ又は任意選択で置換アルキルであり、
ＲＣ、ＲＤ、及びＲＥはそれぞれ、Ｈ及び任意選択で置換アルキルからなる群から独立して選択され、
－（ＣＨ２）ｐ－のそれぞれは、任意選択で置き換えられ得、
ｐは１から５０の範囲の整数であり、
ｎは１から５０，０００の範囲の整数であり、及び
ｍは、１から１００，０００の範囲の整数である）。
当業者は、構造（Ｉ）において繰り返される特徴「ｎ」及び「ｍ」の配置が代表的なものであり、モノマーサブユニットがポリマー構造（例えば、ランダム、ブロック、パターン化、又はそれらの組み合わせ）中に任意の順序で存在し得ることを認識する。
ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーの分子量は、約５ｋＤａから約１５００ｋＤａ又は約１０ｋＤａから約１０００ｋＤａの範囲であり得るか、あるいは特定の例では、約３１２ｋＤａであり得る。
いくつかの例では、ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーは線状ポリマーである。他のいくつかの例では、ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーは、軽度に架橋されたポリマーである。
他の例では、高分子ヒドロゲル４０、４０’は、構造（Ｉ）の変形であり得る。一例では、アクリルアミドユニットはＮ，Ｎージメチルアクリルアミド
Figure 2023506338000003
 で置き換えられ得る。この例では、構造（Ｉ）のアクリルアミドユニットは
Figure 2023506338000004
 で置き換えられ得、ここで、ＲＤ、ＲＥ、及びＲＦはそれぞれＨ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、ＲＧ及びＲＨはそれぞれＣ１～Ｃ６アルキルである（アクリルアミドの場合のようにＨではない）。この例では、ｑは、１から１００，０００の範囲の整数であり得る。別の例では、アクリルアミドユニットに加えて、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドが使用され得る。この例では、構造（Ｉ）は繰り返す特徴「ｎ」及び「ｍ」に加えて
Figure 2023506338000005
 を含み得、ここでＲＤ、ＲＥ、及びＲＦはそれぞれＨ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、ＲＧ及びＲＨはそれぞれＣ１～Ｃ６アルキルである。この例では、ｑは、１から１００，０００の範囲の整数であり得る。
高分子ヒドロゲル４０、４０’の別の例として、構造（Ｉ）における繰り返す特徴「ｎ」は、構造（ＩＩ）を有する複素環式アジド基を含むモノマーで置き換えられ得、
Figure 2023506338000006
 式中、Ｒ１はＨ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｒ２はＨ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｌは、炭素、酸素、及び窒素からなる群から選択される２～２０個の原子と、炭素上の１０個の任意選択の置換基及び鎖中の任意選択の窒素原子を有する線状鎖を含むリンカーであり、Ｅは、炭素、酸素、及び窒素からなる群から選択される１～４個の原子を含む線状鎖であり、その線状鎖中の炭素原子及び任意の窒素原子上に任意選択の置換基を含み、Ａは、Ｈ又はＣ１～Ｃ４アルキルがＮに付着したＮ置換アミドであり、Ｚは窒素含有複素環である。Ｚの例としては、単環構造又は縮合構造として存在する５～１０員環が挙げられる。Ｚのいくつかの特定の例としては、ピロリジニル、ピリジニル、又はピリミジニルが挙げられる。
更に別の例として、高分子ヒドロゲル４０、４０’は、構造（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）のそれぞれの繰り返し単位を含み得、
Figure 2023506338000007
 ここで、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ１ｂ及びＲ２ｂのそれぞれは、水素、任意選択では置換アルキル又は任意選択では置換フェニルから独立して選択され、Ｒ３ａ及びＲ３ｂのそれぞれは、水素、任意選択で置換アルキル、任意選択で置換フェニル、又は任意選択で置換Ｃ７～Ｃ１４アラルキルから独立して選択され、Ｌ１及びＬ２のそれぞれは、任意選択で置換アルキレンリンカー又は任意選択で置換ヘテロアルキレンリンカーから独立して選択される。
オリゴヌクレオチドプライマー４２、４２’をグラフトするように官能化されるものであるならば、その他の分子を使用して、高分子ヒドロゲル４０、４０’を形成することもできることを理解すべきである。適切なポリマー層の他の例としては、アガロースなどのコロイド構造、又はゼラチンなどのポリマーメッシュ構造、又はポリアクリルアミドポリマー及びコポリマー、シランフリーアクリルアミド（ＳＦＡ）、又はアジド分解バージョンのＳＦＡなどの架橋ポリマー構造を有するものが挙げられる。適切なポリアクリルアミドポリマーの例は、アクリルアミドとアクリル酸若しくはビニル基を含むアクリル酸とから、又は［２＋２］光付加環化反応を形成するモノマーから合成され得る。適切な高分子ヒドロゲル４２の更に他の例としては、アクリルアミドとアクリレートとの混合コポリマーが挙げられる。本明細書に開示される実施例では、星状ポリマー、星型又は星型ブロックポリマー、デンドリマーなどを含む分岐ポリマーなど、アクリルモノマー（例えば、アクリルアミド、アクリレートなど）を含む様々なポリマー構造は利用され得る。例えば、モノマー（例えば、アクリルアミドなど）は、ランダムに又はブロックで、星型ポリマーの分岐（アーム）に組み込まれ得る。
高分子ヒドロゲル４０、４０’を凹状領域３８、３８’に導入するために、高分子ヒドロゲル４０、４０’の混合物が生成され得、次にそれぞれの基材２６Ａ、２６Ａ’（凹状領域３８、３８’が画定される）に適用され得る。一例では、高分子ヒドロゲル４０、４０’は、混合物（例えば、水との混合物、又はエタノールと水との混合物）中に存在し得る。次に、混合物は、スピンコーティング、浸漬又は浸漬コーティング、あるいは正圧又は負圧下での材料のフロー、又は別の適切な技術を使用し、それぞれの基材表面（凹状領域３８、３８’を含む）に適用され得る。これらのタイプの技術は、高分子ヒドロゲル４０、４０’を基材２６Ａ、２６Ａ’のそれぞれの基材上に（例えば、凹状領域３８、３８’及びそれに隣接する隙間領域４６、４６’に）全面的（blanketly）に堆積させる。他の選択的堆積技術（例えば、マスク、制御された印刷技術などを含む）を使用し、隙間領域４６、４６’ではなく、凹状領域３８、３８’に高分子ヒドロゲルを特異的に堆積させることができる。
いくつかの例では、基材表面（凹状領域３８、３８’を含む）が活性化され得、次に、混合物（高分子ヒドロゲル４０、４０’を含む）がそれに適用され得る。一例では、シラン又はシラン誘導体（例えば、ノルボルネンシラン）は、蒸着、スピンコーティング、又は他の堆積方法を使用し、基材表面に堆積され得る。別の例では、基材表面はプラズマ灰化に露出され、それによって高分子ヒドロゲル４０、４０’に付着し得る表面活性化剤（例えば、－ＯＨ基）を生成することができる。
高分子ヒドロゲル４０、４０’の化学的性質に応じて、適用された混合物は硬化プロセスに露出され得る。一例では、硬化は、室温（例えば、約２５℃）～約９５℃の範囲の温度で、約１ミリ秒～約数日の範囲の時間にわたって行うことができる。
凹状領域３８、３８’の周囲の隙間領域４６、４６’から高分子ヒドロゲル４０、４０’を除去し、かつ凹状領域３８、３８’の表面上に高分子ヒドロゲル４０、４０’を少なくとも実質的に無傷のまま残すために、研磨が実行され得る。
配列決定表面３０、３０’はまた、高分子ヒドロゲル４０、４０’に付着した増幅プライマー４２、４２’を含む。
グラフトプロセスが実行され、増幅プライマー４２、４２’は凹状領域３８、３８’の高分子ヒドロゲル４０、４０’にグラフトされ得る。一例では、増幅プライマー４２、４２’は、プライマー４２、４２’の５’末端又はその付近での一点共有結合又は強い非共有結合的相互作用によって高分子ヒドロゲル４０、４０’に固定化され得る。この付着により、ｉ）プライマー４２、４２’のアダプター特異的部分は、その同族の配列決定可能な核酸断片に自由にアニーリングでき、ｉｉ）プライマー伸長のために３’ヒドロキシル基は遊離である。この目的のために、任意の適切な共有結合又は強い非共有結合的相互作用が使用され得る。使用できる末端プライマーの例は、アルキン末端プライマー（例えば、高分子ヒドロゲル４０、４０’のアジド表面部分に付着し得る）、又はアジド末端プライマー（例えば、高分子ヒドロゲル４０、４０’のアルキン表面部分に付着し得る）、又はクラスター化した固形支持体１３に関して記載された他の末端プライマーのいずれかを含む。
適切なプライマー４２、４２’の特定の例としては、Ｐ５及びＰ７プライマーが挙げられる。Ｐ５及びＰ７プライマーのいずれも、高分子ヒドロゲル４０、４０’のそれぞれにグラフトされ得る。
一例では、グラフトは、フロースルー堆積（例えば、一時的に結合された蓋を使用する）、ダンクコーティング、スプレーコーティング、液滴分配、又はプライマー４２、４２’を高分子ヒドロゲル４０、４０’に付着させる別の適切な方法によるものであり得る。これらの例示的な技術のそれぞれは、プライマー４２、４２’、水、緩衝液、及び触媒を含み得るプライマー溶液又は混合物を利用し得る。グラフト法のいずれかを用い、プライマー４２、４２’は、凹状領域３８、３８’において高分子ヒドロゲル４０、４０’の反応基と反応し、周囲の基材２６Ａ、２６Ａ’に対して親和性を有さない。したがって、プライマー４２、４２’は、高分子ヒドロゲル４０、４０’に選択的にグラフトする。
図２Ｂに示す例では、化学的捕捉部位４４、４４’は、高分子ヒドロゲル４０、４０’の少なくとも一部に付着又は適用される化学捕捉剤を含む。本明細書で開示される化学捕捉剤の任意の例を使用することができる。例えば、化学捕捉剤は、結合ペアのメンバーであり得、ここで、結合ペアの他方のメンバーは、固形支持体１２、１２’に付着する。
いくつかの例では、高分子ヒドロゲル４０、４０’の遊離官能基（例えば、プライマー４２、４２’に付着しないもの）は、いくつかの化学的捕捉部位４４、４４’が高分子ヒドロゲル４０、４０’の表面にわたって形成されるよう、化学捕捉剤で官能化され得る。一例では、クリックケミストリーを使用し、アルキン－ＰＥＧ－ビオチンリンカー又はアルキン－ビオチン遊離アジド基を、高分子ヒドロゲル４０、４０’上の遊離アジドに共有結合させることができる。別の例では、増幅プライマー４２、４２’に相補的なプライマーは、当該プライマーに付着した化学捕捉剤を有し得る。これらの相補的なプライマーは、いくつかの増幅プライマー４２、４２’にハイブリダイズされ、化学的捕捉部位４４、４４’が形成され得る。
別の例では、化学捕捉剤は、マイクロコンタクト印刷、エアロゾル印刷などを使用して望ましい場所に堆積され、化学捕捉部位４４、４４’が形成され得る。更に別の例では、マスク（例えば、フォトレジスト）は、化学捕捉剤が堆積されて、ひいては化学的捕捉部位４４、４４’が形成される、空間／場所を画定することに使用され得る。次に、（例えば、リフトオフ、溶解、又は別の適切な技術を介して）化学的捕捉剤が堆積され、マスクが除去され得る。この例では、化学的捕捉部位４４、４４’は、化学捕捉剤の単層又は薄層を含み得る。
図２Ｃは、パターン化された対向する配列決定表面３２、３２’を含むフローセル２４の断面図を示す。一例では、これらの表面３２、３２’のそれぞれは、基材２６Ｂ、２６Ｂ’上に調製され得、次に、基材２６Ｂ、２６Ｂ’は、フローセル２４の例を形成するために互いに（例えば、材料５０を介して）付着し得る。
図２Ｃに示す例では、フローセル２４は、多層基材２６Ｂ、２６Ｂ’を含み、そのそれぞれは、支持体３４、３４’及び支持体３４、３４’上に配置されたパターン化された材料３６、３６’を含む。パターン化された材料３６、３６’は、隙間領域４６、４６’によって分離されたくぼみ４８、４８’を画定する。
図２Ｃに示す例では、パターン化された材料３６、３６’はそれぞれ、支持体３４、３４’に配置される。くぼみ４８、４８’及び隙間領域４６、４６’を形成するために選択的に堆積、又は堆積及びパターン化され得る任意の材料が、パターン化された材料３６、３６’に使用され得ることを理解すべきである。
一例として、無機酸化物は、蒸着、エアロゾル印刷、又はインクジェット印刷を介して支持体３４、３４’に選択的に適用され得る。適切な無機酸化物の例としては、酸化タンタル（例えば、Ｔａ２Ｏ５）、酸化アルミニウム（例えば、Ａｌ２Ｏ３）、酸化ケイ素（例えば、ＳｉＯ２）、酸化ハフニウム（例えば、ＨｆＯ２）などが挙げられる。
別の例として、樹脂は支持体３４、３４’に塗布されてからパターン化され得る。適切な堆積技術としては、化学蒸着、ディップコーティング、ダンクコーティング、スピンコーティング、スプレーコーティング、液滴分配、超音波スプレーコーティング、ドクターブレードコーティング、エアゾール印刷、スクリーン印刷、マイクロコンタクト印刷などを含む。適切なパターニング技術としては、フォトリソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィー（ＮＩＬ）、スタンピング技術、エンボス技術、成形技術、マイクロエッチング技術、印刷技術などが挙げられる。適切な樹脂のいくつかの例としては、多面体オリゴマーシルセスキオキサン樹脂（ＰＯＳＳ）ベースの樹脂、非ＰＯＳＳエポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂（例えば、開環エポキシ）、アクリル樹脂、アクリレート樹脂、メタクリレート樹脂、アモルファスフルオロポリマー樹脂（例えば、ＢｅｌｌｅｘからのＣＹＴＯＰ（登録商標））、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「多面体オリゴマーシルセスキオキサン」（ＨｙｂｒｉｄＰｌａｓｔｉｃｓからＰＯＳＳ（登録商標）として市販）という用語は、シリカ（ＳｉＯ２）とシリコーン（Ｒ２ＳｉＯ）とのハイブリッド中間体（例えば、ＲＳｉＯ１．５）である化学組成物を指す。多面体オリゴマーシルセスキオキサンの例は、Ｋｅｈａｇｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８６ （２００９），ｐｐ．７７６－７７８に記載されているものであり得、これは、参照によりその全体が組み込まれる。一例では、組成物は、化学式［ＲＳｉＯ３／２］ｎを有する有機ケイ素化合物であり、Ｒ基は同じであっても異なってもよい。多面体オリゴマーシルセスキオキサンの例示的なＲ基としては、エポキシ、アジド（ａｚｉｄｅ）／アジド（ａｚｉｄｏ）、チオール、ポリ（エチレングリコール）、ノルボルネン、テトラジン、アクリレート、及び／又はメタクリレート、あるいは、更に、例えば、アルキル、アリール、アルコキシ、及び／又はハロアルキル基を含む。本明細書に開示される樹脂組成物は、モノマーユニットとして１つ以上の異なるケージ又はコア構造を含み得る。多面体構造は、
Figure 2023506338000008
 などのＴ８構造であり得、
Figure 2023506338000009
 で表される。このモノマーユニットは典型的には、官能基Ｒ１からＲ８の８つのアームを有する。
モノマーユニットは、
Figure 2023506338000010
 などのＴ１０と呼ばれる１０個のケイ素原子及び１０個のＲ基を有するケージ構造を有し得るか、又は
Figure 2023506338000011
 などの、Ｔ１２と呼ばれる１２個のケイ素原子及び１２個のＲ基を有するケージ構造を有し得る。多面体オリゴマーシルセスキオキサンベースの材料は、代替的に、Ｔ６、Ｔ１４、又はＴ１６ケージ構造を含み得る。平均ケージ含有量は、合成期間に調整され得、及び／又は精製方法によって制御され得、モノマーユニットのケージサイズの分布は本明細書に開示される実施例で使用され得る。
本明細書に開示される多面体オリゴマーシルセスキオキサンの例のいくつかでは、Ｒ１からＲ８又はＲ１０又はＲ１２のうちの少なくとも１つはエポキシを含む。Ｒ１からＲ８又はＲ１０又はＲ１２は同じであっても同じでなくてもよく、いくつかの例では、Ｒ１からＲ８又はＲ１０又はＲ１２の少なくとも１つはエポキシを含み、Ｒ１からＲ８又はＲ１０又はＲ１２の少なくとも１つは非エポキシ官能基である。非エポキシ官能基は、（ａ）エポキシ基と直行的に反応する（例えば、エポキシ基とは異なる条件下で反応する）反応基、すなわち樹脂を増幅プライマー、ポリマー、又は重合剤に結合するためのハンドルとして機能する反応基であり得、又は（ｂ）樹脂の機械的又は官能的特性、例えば、表面エネルギー調整を調整する基であり得る。いくつかの例では、非エポキシ官能基は、アジド（azide）／アジド（azido）、チオール、ポリ（エチレングリコール）、ノルボルネン、テトラジン、アミノ、ヒドロキシル、アルキニル、ケトン、アルデヒド、エステル基、アルキル、アリール、アルコキシ、及びハロアルキルからなる群から選択される。
図２Ｃに示すように、パターン化された材料３６、３６’は、それぞれそこに画定されたくぼみ４８、４８’、及び隣接するくぼみ４８、４８’を分離する隙間領域４６、４６’を含む。規則的、繰り返し、及び非規則的なパターンを含む、くぼみ４８、４８’の多くの異なるレイアウトが想定され得る。一例では、くぼみ４８、４８’は、密なパッキング及び改善された密度のために六角形グリッドに配置される。他のレイアウトは、例えば、直線的な（長方形）レイアウト、三角形のレイアウトなどを含み得る。いくつかの例では、レイアウト又はパターンは、行及び列をなしているくぼみ４８、４８’のｘ－ｙ形式であり得る。他のいくつかの例では、レイアウト又はパターンは、くぼみ４８、４８’及び／又は隙間領域４６、４６’の繰り返し配置であり得る。更に他の例では、レイアウト又はパターンは、くぼみ４８、４８’及び／又は隙間領域４６、４６’のランダムな配置であり得る。パターンは、スポット、ストライプ、渦巻き、線、三角形、長方形、円、円弧、照合印、格子縞、対角線、矢印、正方形、及び／又は斜交平行を含み得る。
くぼみ４８、４８’のレイアウト又はパターンは、画定された領域におけるくぼみ４８、４８’の密度（例えば、くぼみ４８、４８’の数）により特徴付けられ得る。例えば、くぼみ４８、４８’は、１ｍｍ２あたり約２００万の密度で存在し得る。例えば、１ｍｍ２あたり約１００、１ｍｍ２あたり約１，０００、１ｍｍ２あたり約１０万、１ｍｍ２あたり約１００万、１ｍｍ２あたり約２００万、１ｍｍ２あたり約５００万、１ｍｍ２あたり約１０００万、１ｍｍ２あたり約５０００万、又はそれ以下の密度を含む、異なる密度に調整され得る。パターン化された材料３６、３６’のくぼみ４８、４８’の密度は、上記の範囲から選択された低い値の１つと高い値の１つとの間にあり得ることを更に理解すべきである。例として、高密度アレイは、約１００ｎｍ未満で分離されたくぼみ４８、４８’を有するものとして特徴付けられ得、中密度アレイは、約４００ｎｍから約１μｍ分離されたくぼみ４８、４８’を有するものとして特徴付けられ得、低密度アレイは、約１μｍを超えて分離されたくぼみ４８、４８’を有するものとして特徴付けられ得る。密度の例が提供されるが、任意の適切な密度を使用できることを理解すべきである。くぼみ４８、４８’の密度は、部分的には、くぼみ４８、４８’の深さによるものであり得る。場合によっては、くぼみ４８、４８’間の間隔が、本明細書に記載された例よりも更に大きいことが望ましい場合がある。
くぼみ４８、４８’のレイアウト又はパターンはまた、又は代替的に、平均ピッチ、又はくぼみ４８、４８’の中心から隣接するくぼみ４８、４８’の中心までの間隔（中心間の間隔）、又は１つのくぼみ４８、４８’の左端から隣接するくぼみ４８、４８’の右端までの間隔（エッジ間の間隔）に関して特徴付けられ得る。パターンは、平均ピッチ周辺の変動係数が小さくなるように規則的である場合もあれば、パターンが不規則である場合もあり、その場合、変動係数は比較的大きくなる可能性がある。いずれの場合も、平均ピッチは、例えば、おおよそ約５０ｎｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、又は約１００μｍであってもよい。くぼみ４８、４８’の特定のパターンの平均ピッチは、上記の範囲から選択された低い値の１つと高い値の１つとの間であり得る。一例では、くぼみ４８、４８’は、約１．５μｍのピッチ（中心間の間隔）を有する。平均ピッチ値の例が提供されるが、他の平均ピッチ値も使用され得ることを理解すべきである。
くぼみ４８、４８’のそれぞれのサイズは、その体積、開口面積、深さ、及び／又は直径によって特徴付けられ得る。
くぼみ４８、４８’のぞれぞれは、フローセル２４に導入される少なくともいくらかの流体を隔離する（confining）ことができる任意の容積を有し得る。最小又は最大の容量は、例えば、フローセル２４の下流での使用に期待されるスループット（例えば、多重度）、解像度、ヌクレオチド、又は分析物の反応性に対応するように選択され得る。例えば、体積は、少なくとも約１×１０－３μｍ３、少なくとも約１×１０－２μｍ３、少なくとも約０．１μｍ３、少なくとも約１μｍ３、少なくとも約１０μｍ３、少なくとも約１００μｍ３、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、体積は、最大で約１×１０４μｍ３、最大で約１×１０３μｍ３、最大で約１００μｍ３、最大で約１０μｍ３、最大で約１μｍ３、最大で約０．１μｍ３、又はそれ以下であり得る。
各くぼみの開口部が占有する面積は、上記の体積と同様の基準に基づいて選択され得る。例えば、各くぼみ開口部の面積は、少なくとも約１×１０－３μｍ２、少なくとも約１×１０－２μｍ２、少なくとも約０．１μｍ２、少なくとも約１μｍ２、少なくとも約１０μｍ２、少なくとも約１００μｍ２、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、面積は、最大で約１×１０３μｍ２、最大で約１００μｍ２、最大で約１０μｍ２、最大で約１μｍ２、最大で約０．１μｍ２、最大で約１×１０－２μｍ２、又はそれ以下であり得る。各くぼみの開口部が占有する面積は、上記の値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であり得る。
くぼみ４８、４８’のそれぞれの深さは、高分子ヒドロゲル４０、４０’の一部を収容するのに十分な大きさであり得る。一例では、深さは、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、深さは、最大で約１×１０３μｍ、最大で約１００μｍ、最大で約１０μｍ、又はそれ以下であり得る。いくつかの例では、深さは約０．４μｍである。くぼみ４８、４８’のそれぞれの深さは、上で指定された値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であり得る。
いくつかの例では、くぼみ４８、４８’のそれぞれの直径又は長さ及び幅は、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、直径又は長さ及び幅は、最大で約１×１０３μｍ、最大で約１００μｍ、最大で約１０μｍ、最大で約１μｍ、最大で約０．５μｍ、最大で約０．１μｍ、又はそれ以下（例えば、約５０ｎｍ）であり得る。いくつかの例では、直径又は長さ及び幅は約０．４μｍである。くぼみ４８、４８’のそれぞれの直径又は長さ及び幅は、上で指定された値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であり得る。
この例では、配列決定表面３２、３２’の構成要素の少なくともいくつかは、くぼみ４８、４８’に導入され得る。配列決定表面３２、３２’の構成要素によって占有されていないくぼみ４８、４８’内の任意の空間は、フローチャネル２８の一部であると見なされ得ることを理解すべきである。
図２Ｃに示す例では、高分子ヒドロゲル４０、４０’は、くぼみ４８、４８’のそれぞれの中に配置される。高分子ヒドロゲル４０、４０’は、図２Ｂを参照して説明されるように適用され得、その結果、高分子ヒドロゲル４０、４０’は、くぼみ４８、４８’に存在し、周囲の隙間領域４６、４６’には存在しない。
図２Ｃに示す例では、プライマー４２、４２’は、各くぼみ４８、４８’内の高分子ヒドロゲル４０、４０’にグラフトされ得る。プライマー４２、４２’は、図２Ｂを参照して説明されるように適用され得、したがって、周囲の隙間領域４６、４６’ではなく、高分子ヒドロゲル４０、４０’にグラフトされる。
図２Ｃに示す例では、化学的捕捉部位４４、４４’は、隙間領域４６、４６’の少なくともいくつかに適用される化学捕捉剤を含む。例えば、化学捕捉剤は、マイクロコンタクト印刷、エアロゾル印刷などを使用して隙間領域４６、４６’の少なくともいくつかに堆積され、化学的捕捉部位４４、４４’が形成され得る。更に別の例では、マスク（例えば、フォトレジスト）は、化学捕捉剤が堆積され、したがって化学的捕捉部位４４、４４’が形成される空間／場所を画定することに使用され得る。次に、（例えば、リフトオフ、溶解、又は別の適切な技術を介して）化学的捕捉剤が堆積され得、マスクが除去される。
他の例では、化学的捕捉部位４４、４４’は、高分子ヒドロゲル４０、４０’の遊離官能基（例えば、プライマー４２、４２’に結合されないもの）に付着された化学捕捉剤を含む。更に他の例では、化学的捕捉部位４４、４４’は、増幅プライマー４２、４２’のいくつかにハイブリダイズされるプライマーに付着された化学捕捉剤を含む。これらの例では、化学的捕捉部位４４、４４’はくぼみ４８、４８’に存在し、隙間領域４６、４６’に存在しない。
本明細書に開示される化学捕捉剤の任意の例は、図２Ｃに示す例において使用され得る。
図２Ｄは、パターン化された対向する配列決定表面３１、３１’を含むフローセル２４の断面図を示す。一例では、これらの表面３１、３１’のそれぞれは、基材２６Ｂ、２６Ｂ’上に調製され得、次に、基材２６Ｂ、２６Ｂ’は、フローセル２４の例を形成するために互いに（例えば、材料５０を介して）付着し得る。多層基材２６Ｂ、２６Ｂ’のそれぞれは、支持体３４、３４’と、支持体３４、３４’上に配置されたパターン化された材料３６、３６’とを含む。パターン化された材料３６、３６’は、隙間領域４６、４６’によって分離されたくぼみ４８、４８’を画定する。
対向する配列決定表面３１、３１’は、高分子ヒドロゲル４０、４０’又はプライマー４２、４２’を含まない。むしろ、対向する配列決定表面３１、３１’は、くぼみ４８、４８’のそれぞれに配置された化学的捕捉部位４４、４４’を含む。それぞれの化学的捕捉部位４４、４４’は、それぞれのクラスター化した固形支持体１３を固定化することができる。クラスター化した固形支持体のそれぞれは、鋳型鎖６４のそれぞれのクラスターを、くぼみ４８、４８’のそれぞれに導入する。
図２Ｄの化学的捕捉部位４４、４４’は、本明細書に記載の化学捕捉剤の任意の例を含む。この例では、化学捕捉剤は、マイクロコンタクト印刷、エアロゾル印刷などを使用してくぼみ４８、４８’に堆積され、化学的捕捉部位４４、４４’が形成され得る。更に別の例では、マスク（例えば、フォトレジスト）を使用し、隙間領域４６、４６’を遮断でき、その結果、化学捕捉剤は、隙間領域４６、４６’ではなく、くぼみ４８、４８’に堆積される。この例では、次に、（例えば、リフトオフ、溶解、又は別の適切な技術を介して）化学的捕捉剤が堆積され得、マスクは除去される。
図示されないが、フローセル２４の別の例は、図２Ｂのパターン化されていない表面を、図２Ｄの捕捉部位４４、４４’と組み合わせる。この例では、凹状領域３８、３８’（図２Ｂに示されるものと同様）は、高分子ヒドロゲル４０、４０’及びプライマー４２、４２’ではなく、化学捕捉剤でコーティングされ得る。したがって、化学的捕捉部位４４、４４’は、凹状領域３８、３８’のチャネル２８全体に沿って形成され得る。この例では、それぞれの化学的捕捉部位４４、４４’は、対向する配列決定表面に沿ってランダムな分布で、クラスター化した固形支持体１３を固定化することができる。
図２Ｂから図２Ｄに示すように、基材２６Ａと２６Ａ’又は２６Ｂと２６Ｂ’は、配列決定表面３０と３０’又は３２と３２’又は３１と３１’がそれらの間に画定されたフローチャネル２８で互いに向き合うように互いに付着する。
基材２６Ａと２６Ａ’又は２６Ｂと２６Ｂ’は、隙間領域４６、４６’のいくつか又はすべてで互いに結合され得る。基材２６Ａと２６Ａ’又は２６Ｂと２６Ｂ’との間に形成される結合は、化学的結合、又は機械的結合（例えば、留め具を使用するなど）であり得る。
レーザー結合、拡散結合、陽極結合、共晶結合、プラズマ活性化結合、ガラスフリット結合、又は当技術分野で知られる他の方法などの任意の適切な技術を使用し、基材２６Ａ及び２６Ａ’又は２６Ｂ及び２６Ｂ’を共に結合し得る。一例では、スペーサー層（例えば、材料５０）を使用し、基板２６Ａ及び２６Ａ’又は２６Ｂ及び２６Ｂ’を結合し得る。スペーサー層は、基板２６Ａと２６Ａ’又は２６Ｂと２６Ｂ’の少なくとも一部を共にシールする任意の材料５０であり得る。いくつかの例では、スペーサー層は、結合を助ける放射線吸収材料であり得る。
複数の流体を使用する方法及びキット
密度の異なる流体の組み合わせを利用する方法の例は図３Ａ及び図３Ｂに示される。
該方法は、一般に、標的材料１１（複合体１０Ａ、１０Ｂ、クラスター化した固形支持体１３など）の第１部分を含む第１流体５２（図３）をフローセル２４に導入することにより、フローセル２４の２つの対向する配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’又は３１、３１’のそれぞれに標的材料１１を固定化し、それによって２つの対向する配列決定表面３０、３２又は３０’、３２’、又は３１、３１’の一方の３０又は３０’、あるいは３２又は３２’、あるいは３１又は３１’上の捕捉部位４４、４４’によって標的材料１１の少なくとも一部を固定化するステップと、フローセル２４から第１流体及び任意の未固定化標的材料を除去するステップと、標的材料１１の第２部分を含む第２流体５４（図３Ｂ）をフローセル２４に導入し、それによって２つの対向する配列決定表面３０、３２又は３０’、３２’、又は３１、３１’の他方の３０’又は３０、あるいは３２’又は３２、あるいは３１’又は３１上の捕捉部位４４、４４’によって標的材料１１の少なくとも一部を固定化するステップとを含み、ここで第１流体５２は、標的材料１１の密度よりも低い密度を有し、かつ第２流体５４は、標的材料１１の密度よりも高い密度を有する、又は、第２流体５４の密度が標的材料１１の密度よりも低い密度を有し、かつ第１流体５２の密度が標的材料１１の密度よりも高い密度を有する、のいずれかである。
図３Ａ及び図３Ｂに示す方法を実行する前に、標的材料１１は調製又は取得され得る。
一例では、複合体１０Ａ又は１０Ｂは、核酸サンプルと、複数の固形支持体１２、１２’を含むライブラリ調製流体とを使用して調製され得る。いくつかの例では、図１Ａを参照して説明するように、ライブラリ調製流体中の固形支持体１２、１２’のそれぞれは、例えば、アダプター（アダプター１８など）と、アダプターに付着したトランスポソーム複合体とを有し得る。タグ付け及びライブラリ調製は、複合体１０Ａを形成するために、図１Ａに定義されるように実行され得る。核酸サンプル、固形支持体１２、１２’、部分的なＹアダプター、及びトランスポサーゼ酵素は、複合体１０Ａを形成することが望まれるまで、別々の流体に含まれ得る。他の例では、ライブラリ調製流体中の固形支持体１２、１２’のそれぞれは、例えば、当該支持体に付着したオリゴヌクレオチドを有し得る。いくつかの例では、ＰＣＲを含まないヌクレオチドライブラリ調製は、固形支持体１２、１２’とは別に行われ得、次に、図１Ｂを参照して説明するように、調製したライブラリ断片は、固形支持体１２、１２’の表面でオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ得る。固形支持体１２、１２’上のオリゴにハイブリダイズされる前に断片が一本鎖断片に変性されるものであるならば、ライブラリ調製のその他の例（例えば、ＰＣＲを含む）も使用され得る。
別の例では、クラスター化した固形支持体１３は、プライマー４２、４２’で官能化した複数の固形支持体１２、１２’の存在下でライブラリ断片を増幅することによって調製され得る。
標的材料１１（例えば、複合体１０Ａ又は１０Ｂ、あるいは配列決定可能な断片１４、１４’が付着した他の任意の固形支持体１２、１２’、あるいはクラスター化した固形支持体１３）は、第１及び第２部分に分割され得る。標的材料１１の第１部分は、第１流体５２に組み込まれ得、標的材料１１の第２部分は、第２流体５４に導入され得る。
第１及び第２流体５２、５４は異なる密度を有する。一例では、第１流体５２は、標的材料１１の密度よりも低い密度を有し、かつ第２流体５４は、標的材料１１の密度よりも高い密度を有する。１つの特定の例では、第１流体５２は、複合体１０Ａ又は１０Ｂあるいはクラスター化した固形支持体１３の固形支持体１２、１２’の密度よりも低い密度を有し、かつ第２流体５４は、複合体１０Ａ又は１０Ｂあるいはクラスター化した固形支持体１３の固形支持体１２、１２’の密度よりも高い密度を有する。別の例では、第２流体５４は、標的材料１１の密度よりも低い密度を有し、かつ第１流体５２は、標的材料１１の密度よりも高い密度を有する。別の特定の例では、第２流体５４は、複合体１０Ａ又は１０Ｂあるいはクラスター化した固形支持体１３の固形支持体１２、１２’の密度よりも低い密度を有し、かつ第１流体５２は、複合体１０Ａ又は１０Ｂあるいはクラスター化した固形支持体１３の固形支持体１２、１２’の密度よりも高い密度を有する。したがって、流体５２、５４のそれぞれの密度は、使用される標的材料１１に依存する。いくつかの例では、複合体１０Ａ若しくは１０Ｂ又はクラスター化した固形支持体１３の密度は、複合体１０Ａ若しくは１０Ｂ又はクラスター化した固形支持体１３で使用される固形支持体１２、１２’の密度にほぼ同等であり、したがって、提供される特定の例では、流体５２、５４のそれぞれの密度は、標的材料１１で使用される固形支持体１２、１２’に応じて異なる。
流体５２、５４の密度は、フローセル２４に導入される標的材料１１（例えば、複合体１０Ａ、１０Ｂ又はクラスター化した固形支持体１３）の捕捉温度で測定され得る。一例では、捕捉温度は約１８℃から約４０℃の範囲である。
一例では、捕捉温度での流体５２又は５４のうち一方の密度は、捕捉温度での標的材料１１（例えば、複合体１０Ａ又は１０Ｂの固形支持体１２、１２’又はクラスター化した固形支持体１３）の密度よりも少なくとも０．１ｇ／ｃｍ３低く、捕捉温度での流体５４又は５２のうち他方の密度は、捕捉温度での標的材料１１（例えば、複合体１０Ａ若しくは１０Ｂの固形支持体１２、１２’又はクラスター化した固形支持体１３）の密度よりも少なくとも０．１ｇ／ｃｍ３大きい。１つの特定の例では、標的材料（例えば、固形支持体１２、１２’）の密度がＸｇ／ｃｍ３である場合、捕捉温度での流体５２又は５４のうち一方の密度は、Ｘｇ／ｃｍ３～０．１ｇ／ｃｍ３であり、捕捉温度での他方の流体５４又は５２の密度は、Ｘｇ／ｃｍ３＋０．１ｇ／ｃｍ３である。
それぞれの密度を有することに加えて、流体５２、５４はまた、標的材料１１と適合性のあるものである必要がある。複合体１０Ａ、１０Ｂが使用される場合、流体５２、５４は、断片１４、１４’、１４’’及びプライマー４２、４２’が悪影響を受けないように、複合体１０Ａ、１０Ｂ及び配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’又は３１、３１’と適合性があるものでなければならない。クラスター化した固形支持体１３が使用される場合、流体５２、５４は、鋳型鎖６４が悪影響を受けないように、クラスター化した固形支持体１３と適合性があるものでなければならない。
低密度流体５２又は５４は、任意の緩衝水溶液であり得る（例えば、弱酸及びその塩の１つ（共役塩基）又は弱塩基及びその塩の１つ（共役酸）。低密度流体５２又は５４の密度が標的材料１１の密度（例えば、複合体１０Ａ、１０Ｂ又はクラスター化した固形支持体１３の固形支持体１２、１２’の密度）よりも低くなるように、緩衝水溶液中の塩濃度を調整することができる。標的材料１１と低密度流体５２又は５４との間の密度差が大きいほど、低密度流体５２又は５４における標的材料１１（例えば、複合体１０Ａ、１０Ｂ又はクラスター化した固形支持体１３）の沈降時間が速くなる。例として、低密度流体５２又は５４は、トリス－ＨＣｌ緩衝液又は０．５×生理食塩水クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液であり得る。一例では、低密度流体５２又は５４は、約１ｇ／ｃｍ３の密度を有する緩衝水溶液である。この低密度流体５２又は５４は、約１．１８ｇ／ｃｍ３の密度を有する標的材料１１と共に使用するのに特に適し得る。
高密度流体５４又は５２は、塩水溶液であり得る。選択した塩は、流体５２又は５４を「重い」ものとしてレンダリングするものである必要があり、かつ標的材料に悪影響を与えないようにする必要がある。複合体１０Ａ、１０Ｂが使用される場合、塩は複合体１０Ａ、１０Ｂ又はプライマー４２、４２’に悪影響を与えない。クラスター化した固形支持体１３が使用される場合、塩は鋳型鎖６４に悪影響を与えない。緩衝水溶液中の塩濃度は、高密度流体５４又は５２の密度が標的材料１１の密度よりも大きくなるように調整され得る。高密度流体５４又は５２の例は、ポリタングステン酸ナトリウム溶液及び塩化ナトリウム溶液を含む。一例では、高密度流体５４又は５２は、約２ｇ／ｃｍ３から約３ｇ／ｃｍ３の範囲の密度を有するポリタングステン酸ナトリウム溶液である。これらの高密度流体５４又は５２は、約１．１８ｇ／ｃｍ３の密度を有する標的材料１１と共に使用するのに特に適し得る。これらの例では、ポリタングステン酸ナトリウム溶液は、１ミリリットルの水あたり約１グラムのポリタングステン酸ナトリウムから、１ミリリットルの水あたり約２．５２グラムのポリタングステン酸ナトリウムの範囲である濃度を有する。別の例では、２５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム溶液は、約１．２ｇ／ｃｍ３の密度を有する。
一例では、標的材料の密度よりも低い密度を有する第１又は第２流体５２又は５４は、緩衝水溶液であり、標的材料の密度よりも高い密度を有する第２又は第１流体５４又は５２は、ポリタングステン酸ナトリウム溶液又は塩化ナトリウム溶液である。別の例では、標的材料の密度よりも低い第１又は第２流体５２又は５４の密度は、捕捉温度で約１ｇ／ｃｍ３であり、ここで標的材料の密度よりも大きい第２又は第１流体５４又は５２の密度は、捕捉温度で約２ｇ／ｃｍ３である。
図３Ａに示すように、方法の一例は、標的材料１１（例えば、図３Ａの複合体１０Ａ）のいくつかを含む第１流体５２をフローセル２４に導入するステップを含む。この例では、第１流体５２は、複合体１０Ａの固形支持体１２、１２’の密度よりも低い密度を有し、したがって、複合体１０Ａは、下部配列決定表面３０’に移動するか、又は沈降する。捕捉部位４４’（図３Ａに示されない）は、下部配列決定表面３０’で複合体１０Ａの少なくともいくつかを固定化する。
第１流体５２中のいくつかの複合体１０Ａ（又は他の標的材料１１）は沈降しない可能性があり、これらの複合体１０Ａ（又は他の標的材料）は、更なる処理の前にフローセル２４から除去されることを理解すべきである。フローセル２４から第１流体５２及び任意の未固定化標的材料（例えば、複合体１０Ａ）を除去する前に、所定の時間を経過させることもできる。一例では、所望の数の固定化された複合体１０Ａ又は他の標的材料１１を得るために、所定の時間は、約５分間から約３０分間の範囲であり得る。より長いインキュベーション時間も使用され得る。
次に、この例示的な方法は、フローセル２４から第１流体５２及び未固定化標的材料１１（例えば、複合体１０Ａ）を洗い流すステップを含む。洗浄は、洗浄流体をフローセル２４’’に導入するステップを含み得る。フローは、沈降せず、配列決定表面３０’で固定化された複合体１０Ａ（又は他の標的材料１１）を、フローセル２４の出口ポートを通して押し出し得る。複合体１０Ａ（又は他の標的材料１１）と配列決定表面３０’の捕捉部位４４’との間の固定化メカニズム（例えば、結合ペア、ハイブリダイゼーション、共有結合など）は、沈降及び固定化された複合体１０Ａ（又は他の固定化された標的材料１１）が出口フローの一部になることを防止し得る。更に、２つの対向する配列決定表面（例えば、図３Ａの配列決定表面３０’）の一方の表面上に固定化された標的材料１１（例えば、図３Ａの複合体１０Ａ）は、第２流体５４が導入されたとき、その配列決定表面上に固定化されたままである。
図３Ｂに示すように、この方法の例は、他のいくつかの標的材料１１（例えば、複合体１０Ａ）を含む第２流体５４をフローセル２４に導入するステップを含む。この例では、第２流体５４は、複合体１０Ａ（又は他の標的材料１１）の固形支持体１２、１２’の密度よりも高い密度を有し、したがって、複合体１０Ａは、上部配列決定表面３０に移動する。捕捉部位４４（図３Ｂには示されない）は、配列決定表面３０で複合体１０Ａの少なくともいくつかを固定化する。
シーディング、増幅、及び配列決定又は配列決定（以下に記載される）を実行する前に、この例示的な方法は、フローセル２４から第２液体５４及び未固定化標的材料１１を除去するステップを更に含み得る。したがって、この例示的な方法は、次に、第２流体５４及び捕捉されていない標的材料１１（例えば、未固定化複合体１０Ａ）をフローセル２４から洗い流すステップを含み得る。洗浄は、本明細書に記載されるように実行され得る。フローは、上側配列決定表面３０で固定化されていない任意の複合体１０Ａ（又は他の標的材料１１）を、フローセル２４の出口ポートを通して押し出し得る。複合体１０Ａ（又は他の標的材料１１）と配列決定表面３０、３０’のそれぞれの捕捉部位４４、４４’との間の固定化メカニズム（例えば、結合ペア、ハイブリダイゼーション、共有結合など）は、固定化された複合体１０Ａ（又は他の固定化された標的材料１１）が出口フローの一部になることを防止し得ることを理解すべきである。
複合体１０Ａ又は１０Ｂが使用される場合、この洗浄ステップの後に、ライブラリ断片の放出及び増幅が続き得る（例えば、その例は、図９Ａから図９Ｃを参照して記載される）。クラスター化した固形支持体１３が使用される場合、この洗浄ステップの後に配列決定を行うことができる。
図３Ａ及び図３Ｂに示される例は、低密度流体、次に高密度流体の導入を示すが、高密度流体が最初に導入され、標的材料１１が上側配列決定表面３０上に固定化され得、次に、低密度流体が導入され、標的材料１１が下側／下部配列決定表面３０’上に固定化され得ることを理解すべきである。更に、この方法は、パターン化された表面３２、３２’を有するものを含む、本明細書に開示されるフローセル２４の任意の例について実行され得ることを理解すべきである。クラスター化した固形支持体１３が使用される場合、図２Ｄを参照して示され、説明されるような増幅プライマー４２、４２’を含まないフローセル２４が使用され得る。
図３Ａ及び３Ｂを参照して説明される方法を実行するためのキットは、標的材料１１を含む調製流体、標的材料１１の密度よりも低い密度を有する第１導入流体（例えば、流体５２又は５４）、及び標的材料１１の密度よりも高い密度を有する第２導入流体（流体５４又は５２）を含み得る。一例のキットでは、第１導入流体は緩衝水溶液であり、第２導入流体はポリタングステン酸ナトリウム溶液又は塩化ナトリウム溶液である。第２導入流体がポリタングステン酸ナトリウム溶液である一例では、ポリタングステン酸ナトリウム溶液は、１ミリリットルの水あたり約１グラムのポリタングステン酸ナトリウムである濃度を有する。別の例示的なキットでは、捕捉温度での第１導入流体の密度は、捕捉温度での標的材料１１の密度よりも少なくとも０．１ｇ／ｃｍ３低く、捕捉温度での第２導入流体の密度は、捕捉温度での標的材料１１の密度よりも少なくとも０．１ｇ／ｃｍ３高い。更に別の例では、第１導入流体の密度は、捕捉温度で約１ｇ／ｃｍ３であり、第２導入流体の密度は、捕捉温度で約２ｇ／ｃｍ３である。
いくつかの例では、標的材料１１を含む調製流体は、固形支持体１２、１２’を含み、キットはまた、核酸サンプル、部分的なＹアダプター、トランスポサーゼ酵素などのその他のライブラリ調製成分を含み得、それらのそれぞれは、複合体１０Ａ、１０Ｂ、クラスター化した固形支持体１３などのような標的材料１１を形成することが望まれるまで、別個の流体に含まれ得る。キットのいくつかの例はまた、フローセル２４を含み得る。キットの他の例は、本明細書に開示される標的材料１１の任意の例を含む調製流体を含み得る。
１つの流体を使用する方法とキット
本明細書に開示される方法の他の例は、標的材料１１の固定化中に１つの流体を利用する。いくつかの方法は、１つの標的材料１１及び異なるモダリティを利用し、対向する配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’又は３１、３１’にわたって固定化を達成する。他の方法は、２つの異なる標的材料１１（それぞれが互いに異なる少なくとも１つの特性を有する）、及び同じ又は異なるモダリティを利用し、対向する配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’又は３１、３１’にわたって固定化を達成する。本明細書では、図４Ａ及び図４Ｂから図８Ａ及び図８Ｂを参照し、異なる例を説明する。
図４Ａ及び図４Ｂから図８Ａ及び図８Ｂに示す方法のいずれかを実行する前に、複合体１０Ａ又は１０Ｂあるいはクラスター化した固形支持体１３は、本明細書に記載されるように調製され得る。
複合体１０Ａ又は１０Ｂは、核酸サンプルと、磁性を有する固形支持体１２’を複数含むライブラリ調製流体と、を使用して調製され得る。いくつかの例では、図１Ａを参照して説明するように、ライブラリ調製流体中の磁性を有する固形支持体１２’のそれぞれは、例えば、アダプター（アダプター１８など）及びアダプターに付着したトランスポソーム複合体を有し得る。タグ付け及びライブラリ調製は、複合体１０Ａを形成するために、図１Ａに定義されるように実行され得る。核酸サンプル、磁性を有する固形支持体１２’、部分的なＹアダプター、及びトランスポサーゼ酵素は、複合体１０Ａを形成することが望まれるまで、別々の流体に含まれ得る。他の例では、ライブラリ調製流体中の、磁性を有する固形支持体１２’のそれぞれは、例えば、それに付着したオリゴヌクレオチドを有し得る。いくつかの例では、ＰＣＲを含まないヌクレオチドライブラリ調製は、磁性を有する固形支持体１２’とは別に行われ得、その後、図１Ｂを参照して説明するように、調製したライブラリ断片は磁性を有する固形支持体１２’の表面でオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ得る。磁性を有する固形支持体１２’上のオリゴにハイブリダイズされる前に断片が一本鎖断片に変性されるものであるならば、ライブラリ調製のその他の例（例えば、ＰＣＲを含む）も使用され得る。
クラスター化した固形支持体１３は、プライマー４２、４２’で官能化した複数の固形支持体１２、１２’の存在下でライブラリ断片を増幅することによって調製され得る。
流体、実質的に均一な磁力、及び固形支持体１２’などの磁気応答性の標的材料を利用する方法の例が、図４Ａ及び図４Ｂに示される。この方法は、一般に、標的材料１１を含む流体５６をフローセル２４に導入することにより、フローセル２４の２つの対向する配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’のそれぞれに標的材料１１を固定化するステップであって、流体５６は、磁性を有する固形支持体１２’の密度とほぼ同等の密度を有するステップと、２つの対向する配列決定表面３０、３０’、又は３２、３２’、又は３１、３１’の一方の３０又は３０’、あるいは３２又は３２’、あるいは３１又は３１’上の捕捉部位４４又は４４’（図４Ａには示されない）によって標的材料１１の一部を固定化し得るステップと、２つの対向する配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’又は３１、３１’の他方の３０’又は３０、あるいは３２’又は３２、あるいは３１’又は３１に磁力を適用し、それによって標的材料１１の他のいくつかを２つの対向する配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’又は３１、３１’の他方の３０’又は３０、あるいは３２’又は３２、あるいは３１’又は３１に引っ張るステップであって、ここでそれらは、２つの対向する配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’又は３１、３１’の他方の１つの捕捉部位４４’又は４４（図４Ｂには示されない）によって固定化されるステップとを含む。複合体１０Ａ、１０Ｂが使用される場合、シーディング及び増幅を実行する前に（以下に記載されるように）、この例示的な方法は、磁力の印加を停止し、流体及び未固定化標的材料をフローセル２４から除去するステップを更に含み得る。（例えば、図９Ａから図９Ｃを参照して説明されるように）これらのステップの後に、ライブラリ断片の放出及び増幅が続く場合がある。
標的材料１１（例えば、複合体１０Ａ、１０Ｂ、又は配列決定可能な断片１４、１４’、１４’’を有し磁性を有する他の任意の固形支持体１２’、又はクラスター化した固形支持体１３）が流体５６に組み込まれ得る。一例として、約２５，０００の標的材料１１（例えば、複合体１０Ａ、１０Ｂ又はクラスター化した固形支持体１３）から約５００，０００の標的材料１１が、１マイクロリットルの流体に含まれ得る。別の例として、約１００，０００の標的材料１１から約５００，０００の標的材料１１が、１マイクロリットルの流体に含まれ得る。フローセル２４のサイズに応じて、他の濃度が使用され得る。
流体５６の密度は、フローセル２４に導入される標的材料１１の捕捉温度で測定され得る。一例では、捕捉温度は約１８℃から約４０℃の範囲である。
流体５６は、標的材料１１の、磁性を有する固形支持体１２’の密度と少なくともほぼ同等である密度を有するように選択される。これらの例では、「少なくともほぼ同等」とは、流体５６の密度が、磁性を有する固形支持体１２’の密度の０．０８ｇ／ｃｍ３以内であることを意味する。場合によっては、流体５６及び磁性を有する固形支持体１２’の密度は同じである。磁性を有する固形支持体１２’と少なくともほぼ同等の密度を有することにより、流体５６は、穏やかな浮遊剤として機能する。本明細書で使用される場合、「穏やかな浮遊剤」という用語は、標的材料１１（例えば、複合体１０Ａ、１０Ｂ、クラスター化した固形支持体１３など）が沈む又は沈降する前に少なくともある期間浮遊することができる流体を指す。流体５６では、標的材料１１の一部は沈み始め、フローセル２４内の下側／下部配列決定表面３０’、３２’、３１’に固定化される一方で、他の標的材料１１は浮いたままである（少なくともある程度の期間）。
流体５６は、任意の緩衝水溶液であり得る。緩衝水溶液中の塩濃度は、流体５６の密度が、磁性を有する固形支持体１２’の密度と少なくともほぼ同等になるように調整され得る。言い換えれば、緩衝水溶液中の塩濃度は、流体５６の密度が、磁性を有する固形支持体１２’の密度の＋／－０．０８ｇ／ｃｍ３以内になるように調整され得る。例として、流体５６は、トリス－ＨＣｌ緩衝液又は０．５×生理食塩水クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液、又は約７５０ｍＭのＮａＣｌを含有する７５ｍＭのクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ＝７）であり得る。一例では、磁性を有する固形支持体１２’及び流体５６のそれぞれの密度は、約１．１ｇ／ｃｍ３である。
流体５６及び標的材料１１がフローセル２４に導入された後、標的材料１１は、最初に流体５６内に浮く。時間の経過とともに、標的材料１１の一部は、下側／下部配列決定表面３０’、３２’、３１’に沈降し、そこで捕捉部位４４’に固定化される。例を図４Ａに示し、複合体１０Ａの一部が下側／下部配列決定表面３０’に沈降する。流体５６は、下側／下部配列決定表面３０’、３２’、３１’でのすべての標的材料１１の沈降が速すぎることを防止することに役立つ。
したがって、流体５６の導入及び標的材料１１の一部の固定化の後、外部から印加された磁力が、フローセル２４内の他の配列決定表面３０、３２、３１に印加される時間がある。磁力は、浮遊している標的材料１１をフローセル２４の上側／上部配列決定表面３０、３２、３１に引き付ける。複合体１０Ａの一部が上側／上部配列決定表面３０に移動する例を図４Ｂに示す。
この例示的な方法では、流体５６の導入から磁力の印加までの間に所定の時間を経過させてもよい。この時間経過は、標的材料１１の一部が沈降し、１つの配列決定表面３０’、３２’、３１’に固定化され、残りの標的材料１１が流体５６内に浮くようにするために望ましい場合がある。一例では、この所定の時間は、約５分間から約３０分間の範囲である。いくつかの例では、流体５６の導入から磁力の適用までの間に所定の時間が経過し、所定の時間は、約５秒間から約２分間の範囲である。
次に、図４Ｂに示すように、磁力は、配列決定表面３０、３２に隣接するフローセル２４の外面６０上に磁石５８を配置することによって印加される。磁石５８は、下側／下部配列決定表面３０’、３２’、３１’にすでに固定化した標的材料１１を引き付けることなく、浮遊している標的材料１１（例えば、複合体１０Ａ、１０Ｂ、クラスター化した固形支持体１３など）を引き付けるのに十分な磁場強度を有するべきである。磁場強度は比較的弱いが、フローチャネル２８の全長及び全幅にわたって少なくとも実質的に均一に印加される。比較的弱い磁場強度は、約１ｍＴ（ｍｉｌｌｉＴｅｓｌａ）から約１００ｍＴの範囲であり得る。いくつかの例では、比較的弱い磁場の強度は、約１ｍＴから約１０ｍＴ、又は約１０ｍＴから約１００ｍＴの範囲である。それにより、浮遊している標的材料１１が固定化され、上側／上部配列決定表面３０、３２、３１全体で（across）部位４４を捕捉し得る。ネオジム磁石などのより強力な磁石が使用され得、これらの磁石の磁界強度は約１Ｔ（テスラ）である。
一例では、磁石５８は、フローチャネル２８及び／又はフローセル２４と同じ長さ及び幅を有する。一例では、磁石５８は冷蔵庫の磁石に類似し、約５ｍＴの磁場強度を有する。別の例では、磁石５８は、埋め込まれた小さな磁性粒子を有するエラストマーストリップである。これらのタイプの可撓性磁石は、例えば、Ｕｌｉｎｅ、Ａｒｎｏｌｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＦＬＥＸＭＡＧ（商標））などから市販される。一例では、磁力の印加は、２つの対向する配列決定表面（即ち、標的材料１１が固定化されていない配列決定表面３０）のうち他方の表面に隣接する、フローセル２４の外面６０上に、磁性粒子が埋め込まれたエラストマーストリップを配置することを含む。いくつかの例では、磁石は手動で適用され得る。他の例では、磁力の印加は、例えば、それが配列決定システムに統合されるときに自動化され得る。
磁石５８を適用するための時間枠（したがって磁力）は、部分的に、磁石の強度及び流体５６中の複合体１０Ａ、１０Ｂの濃度に応じて異なる。一例として、磁石５８は、５秒間から約２分間適用され得る。次に、この方法の例は、磁力の印加を停止することを含む。これは、磁石５８を取り外すことによって達成され得る。
流体５６内のいくつかの標的材料１１（例えば、複合体１０Ａ、１０Ｂ、クラスター化した固形支持体１３）は、配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’又は３１、３１’のいずれにも固定化されない可能性があり、当該標的材料１１は、更なる処理の前にフローセル２４から除去され得ることを理解すべきである。したがって、この例示的な方法は、流体５６及び捕捉されない標的材料１１をフローセル２４から洗い流すステップを含み得る。洗浄は、洗浄流体をフローセル２４’’に導入するステップを含み得る。フローは、配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’又は３１、３１’で固定化されていない任意の標的材料１１を、フローセル２４の出口ポートを通して押し出し得る。ターゲット材料１１と配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’又は３１、３１’の捕捉部位４４、４４’との間の固定化メカニズム（例えば、結合ペア、ハイブリダイゼーション、共有結合など）は、固定化された標的材料１１が出口フローの一部になることを防止し得る。
図４Ａ及び図４Ｂに示す例は、配列決定表面３０及び３０’を有するフローセル２４を示す場合、この方法は、パターン化された配列決定表面３２、３２’を有するものを含む、本明細書に開示されるフローセル２４の任意の例を用いて実行され得ることを理解すべきである。磁気応答性固形支持体１２’を含むクラスター化した固形支持体１３が使用される場合、図２Ｄを参照して示されて説明されるものなどの、増幅プライマー４２、４２’を含まないフローセル２４が使用され得る。更に、この方法の例では、他の磁気応答性の標的材料が使用され得る。
図４Ａ及び４Ｂを参照して説明される方法を実行するためのキットは、磁性を有する固形支持体１２’を複数含む調製流体と、磁性を有する固形支持体１２’の密度とほぼ同等の密度を有する導入流体（例えば、流体５６）とを含み得る。キットは、核酸サンプル、部分的なＹアダプター、トランスポサーゼ酵素などの他のライブラリ調製成分も含み得、それらのそれぞれは、複合体１０Ａ、１０Ｂ、クラスター化した固形支持体１３などの標的材料１１を形成することが望まれるまで、別個の流体に含まれ得る。キットのいくつかの例はまた、フローセル２４を含み得る。キットの更に他の例は、液体形態の温度応答性材料を含む増幅混合物を含み得る。
次に、図５Ａ及び図５Ｂ、図６Ａ及び図６Ｂ、図７Ａ及び図７Ｂ、並びに図８Ａ及び図８Ｂに示す方法について説明する。これらの方法は、それぞれ標的材料の組み合わせ（例えば、１１Ａと１１Ｂ、又は１１Ｃと１１Ｄなど）を使用するものであり、図の各セットに関して、異なる標的材料の組み合わせがより詳細に説明される。図の各セットは、パターン化されていない配列決定表面３０、３０’を有するフローセル２４で実行される方法を示す。更に、これらの方法のいずれも、パターン化された表面３２、３２’を有するものを含む、本明細書に開示されるフローセル２４の任意の例を用いて実行され得ることを理解すべきである。更に、クラスター化した固形支持体１３が標的材料（例えば、１１Ａ及び１１Ｂなど）として使用される場合、図２Ｄを参照して示され、説明されるような増幅プライマー４２、４２’を含まないフローセル２４が使用され得る。
標的材料１１Ａ、１１Ｂの組み合わせを利用する方法の一例を図５Ａ及び図５Ｂに示す。この例では、標的材料１１Ａ、１１Ｂは、互いに異なりかつキャリア流体とも異なる密度を有する。
この例示的な方法は、一般に、フローセル２４に、第１標的材料１１Ａ及び第２標的材料１１Ｂを含む標的流体５６’を導入することにより、フローセル２４の２つの対向する配列決定表面３０、３０’、又は３２、３２’、又は３１、３１’の第１表面の３０又は３２又は３１に第１標的材料１１Ａ、及び２つの対向する配列決定表面３０、３０’、又は３２、３２’、又は３１、３１’の第２表面の３０’又は３２’又は３１’に第２標的材料１１Ｂを同時に固定化するステップを含み、ここで標的流体５６’のキャリア流体は流体密度を有し、第１標的材料１１Ａは、流体密度よりも低い第１密度を有し、かつ第２標的材料１１Ｂは、流体密度よりも大きい第２密度を有する。
標的流体５６’のキャリア流体の密度は、フローセル２４に導入される標的材料１１Ａ、１１Ｂの捕捉温度で測定され得る。一例では、捕捉温度は約１８℃から約４０℃の範囲である。
一例では、一方の標的材料１１Ａの１つの密度は、捕捉温度でのキャリア流体の密度よりも少なくとも０．１ｇ／ｃｍ３低く、他方の標的材料１１Ｂの密度は、捕捉温度でのキャリア流体の密度よりも少なくとも０．１ｇ／ｃｍ３高い。１つの特定の例では、捕捉温度でのキャリア流体の密度がＸｇ／ｃｍ３である場合、標的材料１１Ａ又は１１Ｂのうち一方の密度は、Ｘｇ／ｃｍ３～０．１ｇ／ｃｍ３であり、標的材料１１Ｂ又は１１Ａのうち他方の密度はＸｇ／ｃｍ３＋０．１ｇ／ｃｍ３である。
標的流体５６’のキャリア流体は、本明細書に記載の緩衝水溶液又は塩水溶液のいずれかであり得る。緩衝水溶液又は塩水溶液中の塩濃度は、捕捉温度でのキャリア流体の密度が標的材料１１Ａ、１１Ｂのそれぞれの密度の間にあるように調整され得る。別の例では、標的流体５６’のキャリア流体はイオン液体である。
標的材料１１Ａ、１１Ｂは、複合体１０Ａ、１０Ｂ又はクラスター化した固形支持体１３であり得る。標的材料１１Ａ、１１Ｂのための支持体１２は、この例示的な方法に記載されるように、それぞれの材料１１Ａ、１１Ｂの密度がキャリア流体に関して異なるものであるならば、本明細書に記載される実施例のいずれかであり得る。標的材料１１Ａ、１１Ｂのそれぞれにおける固形支持体１２の密度は、それぞれの標的材料１１Ａ、１１Ｂの密度に少なくともほぼ同等である。したがって、標的材料１１Ａの固形支持体１２は、捕捉温度での標的流体５６’のキャリア流体の密度よりも低い密度を有するように選択され、標的材料１１Ｂの固形支持体１２は、捕捉温度での標的流体５６’のキャリア流体の密度よりも高い密度を有するように選択される。
図５Ａに示すように、この方法は、標的材料１１Ａ、１１Ｂを含む標的流体５６’をフローセル２４に導入するステップを含む。標的流体５６’は、フローセル２４内で所定の時間インキュベートすることができる。一例では、所定の時間は、配列決定表面３０、３０’上に所望の数の固定化された標的材料１１Ａ、１１Ｂを得るために、約５分間から約３０分間の範囲であり得る。より長いインキュベーション時間も使用され得る。
前述のように、図５Ｂに示すように、標的材料１１Ａの固形支持体１２は、捕捉温度でのキャリア流体の密度よりも低い密度を有し、したがって、標的材料１１Ａは、上側配列決定表面３０に移動又は浮遊する。捕捉部位４４（図５Ｂには示されない）は、上側配列決定表面３０に標的材料１１Ａの少なくとも一部を固定化する。また、前述のように、図５Ｂに示すように、標的材料１１Ｂの固形支持体１２は、捕捉温度でのキャリア流体の密度よりも高い密度を有し、したがって、標的材料１１Ｂは、下部配列決定表面３０’に移動するか、又は沈降する。捕捉部位４４’（図５Ｂにも示されない）は、標的材料１１Ｂの少なくとも一部を下側／下部配列決定表面３０’に固定化する。
標的材料１１Ａ、１１Ｂの固定化は、キャリア流体に対し標的材料１１Ａ、１１Ｂの密度が異なるため、標的流体５６’がフローセル２４に導入されると同時に起こる。したがって、図５Ａ及び図５Ｂの方法では、第１標的材料１１Ａの少なくとも一部は、２つの対向する配列決定表面３０の第１表面上のそれぞれの捕捉部位４４によって固定化され、第２標的材料１１Ｂの少なくとも一部は、２つの対向する配列決定表面３０’の第２表面上のそれぞれの捕捉部位４４’によって固定化される。
いくつかの標的材料１１Ａ、１１Ｂは固定化されない可能性があり、当該標的材料１１Ａ、１１Ｂは、更なる処理の前にフローセル２４から除去されることを理解すべきである。したがって、この例示的な方法は、次に、標的流体５６’のキャリア流体及び未固定化標的材料１１Ａ、１１Ｂをフローセル２４から洗い流すステップを含む。洗浄は、洗浄流体をフローセル２４’’に導入するステップを含み得る。フローは、配列決定表面３０、３０’で固定化されていない任意の標的材料１１Ａ、１１Ｂを、フローセル２４の出口ポートを通して押し出し得る。それぞれの標的材料１１Ａ、１１Ｂと配列決定表面３０、３０’の捕捉部位４４、４４’との間の固定化メカニズム（例えば、結合ペア、ハイブリダイゼーション、共有結合など）は、固定化された標的材料１１Ａ、１１Ｂが出口フローの一部になることを防止し得る。
複合体１０Ａ又は１０Ｂが標的材料１１Ａ、１１Ｂとして使用される場合、この洗浄ステップの後に、ライブラリ断片の放出及び増幅が続く場合がある（例えば、その例は、図９Ａから図９Ｃを参照して記載される）。クラスター化した固形支持体１３が使用される場合、この洗浄ステップの後に配列決定を行うことができる。
図５Ａ及び５Ｂを参照して説明される方法を実行するためのキットは、流体密度を有するキャリア流体を含む標的流体５６’、流体密度よりも低い第１密度を有する第１標的材料１１Ａ、及び流体密度よりも高い第２密度を有する第２標的材料１１Ｂを含み得る。
いくつかの例では、第１及び第２標的材料１１Ａ、１１Ｂは、複合体１０Ａ又は１０Ｂである。これらの例では、第１標的材料１１Ａは、第１密度にほぼ同等（即ち、流体密度よりも低い）の第１固形支持体密度を有する第１固形支持体１２、及び第１固形支持体１２に付着した配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’を含み、第２標的材料１１Ｂは、第２密度にほぼ同等（即ち、流体密度よりも高い）の第２固形支持体密度を有する第２固形支持体１２、及び第２固形支持体１２に付着した配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’を含む。
他の例では、第１及び第２標的材料１１Ａ、１１Ｂは、クラスター化した固形支持体１３である。これらの例では、第１標的材料１１Ａは、第１密度にほぼ同等（即ち、流体密度よりも低い）の第１固形支持体密度を有する第１固形支持体１２、及び第１固形支持体１２に付着した鋳型鎖６４の第１のクラスターを含み、第２標的材料１１Ｂは、第２密度にほぼ同等（即ち、流体密度よりも高い）の第２固形支持体密度を有する第２固形支持体１２、及び第２固形支持体１２に付着した鋳型鎖６４の第２のクラスターを含む。
あるいは、キットは、標的材料１１Ａを調製するためのキャリア流体、試薬及び材料、並びに標的材料１１Ｂを調製するための試薬及び材料を含み得る。この例では、それぞれの標的材料１１Ａ、１１Ｂは、それぞれの試薬及び材料を使用し、本明細書に記載されるように調製され得、次に、当該材料は、標的流体５６’を形成するためにキャリア流体に加えられ得る。
この方法の他の例は、異なる標的材料及び異なるモダリティを利用し、標的材料を固定化する。これらの例は、一般に、２つの対向する配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’又は３１、３１’を含むフローセル２４に第１及び第２標的材料を導入することを含み、ここで第１標的材料は、第２標的材料とは異なる特性を少なくとも１つ有しており、少なくとも１つの特性は、密度、電荷、磁性、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されたものであり、第１及び第２標的材料を少なくとも１つの条件に露出し、したがって、第１標的材料を、２つの対向する配列決定表面３０、３２、又は３１の第１捕捉部位４４によって固定化させ、第２標的材料を、２つの対向する配列決定表面３０’、３２’、３１’の第２捕捉部位４４’によって固定化させる。
一例の方法が図６Ａ及び図６Ｂに示される。この例では、標的材料１１Ｃ、１１Ｄは反対の電荷を有する。
図６Ａに示すように、第１標的材料１１Ｃは負電荷を有し、第２標的材料１１Ｄは正電荷を有する。本明細書に記載の帯電した固形支持体１２の任意の例がこの実施例で使用され得る。一例では、負に帯電した第１標的材料１１Ｃは、カルボキシル化固形支持体、ポリグルタミン酸被覆固形支持体、及び硫酸塩官能化固形支持体からなる群から選択され、正に帯電した第２標的材料１１Ｄは、キトサン官能化固形支持体及びポリリジン官能化固形支持体などのアミン官能化固形支持体からなる群から選択される。
標的材料１１Ｃ、１１Ｄは、フローセル２４に導入される流体５６’’の一部であり得る。この例では、帯電した標的材料１１Ｃ、１１Ｄをフローセル２４に導入するために使用される流体５６’は、電解質であり得る。一例として、流体５６’’は、同じモル濃度（例えば、それぞれ４．５ｍＭ）で存在するトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）とホウ酸との組み合わせであり得る。複合体１０Ａ、１０Ｂが標的材料１１Ｃ、１１Ｄとして使用される場合、約４ｍＭのＭｇ２＋を含む生理食塩水－クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液（例えば、約４５ｍＭ）などの低塩緩衝液が使用され得る。このタイプの流体５６’’は、帯電した標的材料１１Ｃ、１１Ｄの電荷を最大化すると同時に、ライブラリ断片１４、１４’、１４’が放出されるときにハイブリダイゼーションさせることができる。クラスター化した固形支持体１３が標的材料１１Ｃ、１１Ｄとして使用される場合、水は流体５６’’として使用され得る。
更に、流体５６’’と標的材料１１Ｃ、１１Ｄの密度は、標的材料１１Ｃ、１１Ｄの密度が、静電的に誘発された標的材料１１Ｃ、１１Ｄの移動を妨害しないように、ほぼ同等であり得る。別の例では、流体５６’’と標的材料１１Ｃ、１１Ｄの密度が同等ではない場合がある。この例では、印加された電界６２による力の強さは、密度の違いによるいずれの力よりも大きい。
この例の方法では、帯電した標的材料１１Ｃ、１１Ｄが同時に移動及び固定化を開始するために露出される条件は、２つの対向する配列決定表面３０と３０’、３２と３２’、又は３１と３１’の間に印加され、２つの対向する配列決定表面３０、３２、３１の第１表面で正電荷６６を生成し、２つの対向する配列決定表面３０’、３２’、３１’の第２表面で負電荷６８を生成するための、電界６２である。
フローセル２４にわたって電界６２を生成するために、各配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’又は３１、３１’は、電源に電気的に接続され、それぞれの標的材料１１Ｃ、１１Ｄを引き付けるそれぞれの電荷６６、６８を製造し得る。図６Ａ及び図６Ｂに示す例では、電界６２は、下側／下部配列決定表面３０’に向かう方向に印加され、その結果、上側配列決定表面３０は正に帯電し、下側／下部配列決定表面３０’は負に帯電する。
標的材料１１Ｃ、１１Ｄの固定化は、フローセル２４内の流体５６’’が電界６２に露出されると同時に起こる。これは、標的材料１１Ｃ、１１Ｄの正電荷及び負電荷、並びに印加された電界６２に対するそれらのそれぞれの応答によるものである。負に帯電した標的材料１１Ｃは、今や正に帯電した配列決定表面３０に向かって移動し、そこで上側配列決定表面３０の捕捉部位４４（図６Ｂには示されない）によって固定化される。正に帯電した標的材料１１Ｄは、今や負に帯電した配列決定表面３０’に向かって移動し、そこで下側／下部配列決定表面３０’の捕捉部位４４（図６Ｂには示されない）によって固定化される。
電界６２は、所定の時間印加され得る。一例では、所定の時間は、それぞれの配列決定表面３０、３０’上に所望の数の固定化された標的材料１１Ｃ、１１Ｄを得るために、約１分間から約３０分間の範囲であり得る。他の例では、電界６２は、約１分間から約２分間、又は約１分間から約５分間、又は約５分間から約３０分間などの範囲の時間にわたって印加され得る。
いくつかの標的材料１１Ｃ、１１Ｄは固定化されない可能性があり、当該標的材料１１Ｃ、１１Ｄは、更なる処理の前にフローセル２４から除去されることを理解すべきである。電界６２は、未固定化標的材料１１Ｃ、１１Ｄを除去する前に停止され得る。したがって、この例示的な方法は、電界６２を除去し、次に、流体５６’’及び未固定化標的材料１１Ｃ、１１Ｄをフローセル２４から洗い流すステップを含み得る。洗浄は、洗浄流体をフローセル２４’’に導入するステップを含み得る。フローは、配列決定表面３０、３０’で固定化されていない任意の標的材料１１Ｃ、１１Ｄを、フローセル２４の出口ポートを通して押し出し得る。それぞれの標的材料１１Ｃ、１１Ｄと配列決定表面３０、３０’の捕捉部位４４、４４’との間の固定化メカニズム（例えば、結合ペア、ハイブリダイゼーション、共有結合など）は、固定化された標的材料１１Ｃ、１１Ｄが出口フローの一部になることを防止し得る。
複合体１０Ａ又は１０Ｂが標的材料１１Ｃ、１１Ｄとして使用される場合、この洗浄ステップの後に、ライブラリ断片の放出及び増幅が続く場合がある（例えば、その例は、図９Ａから図９Ｃを参照して記載される）。クラスター化した固形支持体１３が使用される場合、この洗浄ステップの後に配列決定を行うことができる。
別の例示的な方法が図７Ａ及び図７Ｂに示される。この例では、標的材料１１Ｅ、１１Ｆは磁性と密度が異なる。
この例（図７Ａに示すように）では、標的材料１１Ｅ、１１Ｆは、第１密度を有する流体５６’’’においてフローセル２４に導入される。以下でより詳細に説明するように、標的材料１１Ｅ、１１Ｆのそれぞれの密度は、この第１密度、即ち、標的材料１１Ｅ、１１Ｆの捕捉温度での流体５６’’’に関して選択される。捕捉温度の範囲は約１８℃から約４０℃である。
図７Ａ及び図７Ｂに示す例では、第１標的材料１１Ｅは磁性を有するものであり、第２標的材料１１Ｆは非磁性のものであり、第１密度（即ち、捕捉温度での流体５６’’’の密度）よりも高い密度を有する。
この例では、第１標的材料１１Ｅは、本明細書に開示される磁気応答性固形支持体１２’のいずれかを含む。更に、流体５６’’’と標的材料１１Ｅの密度は、標的材料１１Ｅの密度が、標的材料１１Ｅの磁気的に誘発された移動を妨害しないように、ほぼ同等であり得る。別の例では、流体５６’’’と標的材料１１Ｅの密度が同等ではない場合がある。この例では、印加された電界７０による力の強さは、密度の違いによるいずれの力よりも大きい。
また、この例では、第２標的材料１１Ｆは、磁気的に応答しない、本明細書に開示される固形支持体１２のいずれかを含む。固形支持体１２、したがって、標的材料１１Ｆの密度は、捕捉温度での流体５６’’’の密度よりも高い。したがって、標的材料１１Ｆは、印加された磁場に応答せず、流体５６’’’よりも重いため、下部配列決定表面３０’に移動又は沈降することができる。
この例の方法では、標的材料１１Ｅ、１１Ｆを含む流体５６’’’は、フローセル２４に導入され（図７Ａ）、及び標的材料１１Ｅ、１１Ｆが同時に移動及び固定化を開始するために露出される条件は、磁力７０の印加である（図７Ｂ）。流体５６’’’の密度も、移動と固定化に影響を与える条件と見なされ得る。
磁力（又は図７Ｂに示すような磁場７０）は、図４Ａ及び図４Ｂを参照して説明されるように印加され得る。図７Ｂに示す例では、磁力／磁場７０は、上側配列決定表面３０の方向に印加され、その結果、磁気応答性（第１）標的材料１１Ｅは、上側配列決定表面３０に向かって同じ方向に移動する。捕捉部位４４（図７Ａ又は図７Ｂには示されない）は、上側配列決定表面３０に標的材料１１Ｅの少なくとも一部を固定化する。同時に、標的材料１１Ｆの固形支持体１２は、磁気的に応答せず、捕捉温度で流体５６’’’よりも重い。したがって、図７Ｂに示すように、標的材料１１Ｆは、下部配列決定表面３０’に移動するか、又はその上に沈降する。捕捉部位４４’（図７Ａ又は図７Ｂにも示されない）は、標的材料１１Ｆの少なくとも一部を下側／下部配列決定表面３０’に固定化する。
磁力／磁場７０は、所定の時間印加され得る。一例では、所定の時間は、配列決定表面３０上に所望の数の固定化された標的材料１１Ｅを得るために、約５分間から約３０分間の範囲であり得る。
標的材料１１Ｅ、１１Ｆの固定化は、標的材料１１Ｅ、１１Ｆの特性（密度と磁性の両方）により、標的流体５６’’’がフローセル２４に導入された時点で、並びに磁場７０に露出された時点で起こる。図７Ａ及び図７Ｂの方法では、第１標的材料１１Ｅの少なくともいくつかは、２つの対向する配列決定表面３０の第１表面のそれぞれの捕捉部位４４によって固定化され、第２標的材料１１Ｆの少なくとも一部は、２つの対向する配列決定表面３０’の第２表面のそれぞれの捕捉部位４４’によって固定化される。
いくつかの標的材料１１Ｅ、１１Ｆは固定化されない可能性があり、当該標的材料１１Ｅ、１１Ｆは、更なる処理の前にフローセル２４から除去されることを理解すべきである。磁力／磁場７０は、未固定化標的材料１１Ｅ、１１Ｆを除去する前に停止され得る。したがって、この例示的な方法は、磁力／磁場７０を除去し、次に、流体５６’’’及び未固定化標的材料１１Ｅ、１１Ｆをフローセル２４から洗い流すステップを含み得る。洗浄は、洗浄流体をフローセル２４’’に導入するステップを含み得る。フローは、配列決定表面３０、３０’で固定化されていない任意の標的材料１１Ｅ、１１Ｆを、フローセル２４の出口ポートを通して押し出し得る。それぞれの標的材料１１Ｅ、１１Ｆと配列決定表面３０、３０’の捕捉部位４４、４４’との間の固定化メカニズム（例えば、結合ペア、ハイブリダイゼーション、共有結合など）は、固定化された標的材料１１Ｅ、１１Ｆが出口フローの一部になることを防止し得る。
複合体１０Ａ又は１０Ｂが標的材料１１Ｅ、１１Ｆとして使用される場合、この洗浄ステップの後に、ライブラリ断片の放出及び増幅が続く場合がある（例えば、その例は、図９Ａから図９Ｃを参照して記載される）。クラスター化した固形支持体１３が標的材料１１Ｅ、１１Ｆとして使用される場合、この洗浄ステップの後に配列決定を行うことができる。
図７Ａ及び図７Ｂに示す例示的な方法はまた、磁気応答性標的材料１１Ｅが下側／下部配列決定表面３０’上に固定化され、非磁気応答性標的材料１１Ｆは上側配列決定表面３０上に固定化されるように実行され得る。この例では、非磁気応答性標的材料１１Ｆは、捕捉温度での流体５６’’’の密度よりも低い密度を有するように選択された固形支持体１２を含む。この例では、標的材料１１Ｅは、磁力／磁場（下部配列決定表面３０’の方向に印加される）に応答し、下部配列決定表面３０’に引き付けられるが、標的材料１１Ｆは、印加された磁場に応答せず、流体５６’’’よりも軽いため、上側配列決定表面３０に浮く又は移動することができる。
別の例示的な方法が図８Ａ及び図８Ｂに示される。この例では、標的材料１１Ｇ、１１Ｈは電荷と密度が異なる。
この例では、標的材料１１Ｇ、１１Ｈは、第１密度を有する流体５６’’’’においてフローセル２４に導入される。以下でより詳細に説明するように、標的材料１１Ｇ、１１Ｈのそれぞれの密度は、この第１密度、即ち、標的材料１１Ｇ、１１Ｈの捕捉温度での流体５６’’’’の密度に関して選択される。捕捉温度の範囲は約１８℃から約４０℃である。
これらの例では、流体５６’’’’は電解質である。
図８Ａ及び図８Ｂに示す例では、第１標的材料１１Ｇは負に帯電しており、第２標的材料１１Ｈは中性（帯電しない）であり、第１密度（即ち、捕捉温度での流体５６’’’’の密度）よりも高い密度を有する。この例では、第１標的材料１１Ｇは、カルボキシル化固形支持体、ポリグルタミン酸被覆固形支持体、又は硫酸塩官能化固形支持体など、本明細書に開示される負に帯電した固形支持体のいずれかを含む。更に、流体５６’’’’の密度及び標的材料１１Ｇの密度は、標的材料１１Ｇの密度が、負に帯電した標的材料１１Ｇの静電的に誘発された移動を妨害しないように、ほぼ同等であり得る。代替的に、標的材料１１Ｇの密度は、流体５６’’’’の密度よりも低くてもよく、密度及び電荷の両方が、標的材料１１Ｇの移動を助けることができる。
図８Ａ及び図８Ｂによって表される方法の他の例では、第１標的材料１１Ｇは正に帯電しており、第２標的材料１１Ｈは中性（帯電しない）であり、第１密度（即ち、捕捉温度での流体５６’’’の密度）よりも高い密度を有する。この例では、第１標的材料１１Ｇは、アミン官能化固形支持体（例えば、キトサン又はポリリジン官能化固形支持体）などの、本明細書に開示される正に帯電した固形支持体のいずれかを含む。更に、流体５６’’’’の密度及び標的材料１１Ｇの密度は、標的材料１１Ｇの密度が、正に帯電した標的材料１１Ｇの静電的に誘発された移動を妨害しないように、ほぼ同等であり得る。代替的に、標的材料１１Ｇの密度は、流体５６’’’’の密度よりも低くてもよく、密度及び電荷の両方が、標的材料１１Ｇの移動を助けることができる。
図８Ａ及び図８Ｂに示す例示的な方法では、第２標的材料１１Ｈは、帯電しない、本明細書に開示される固形支持体１２のいずれかを含む。固形支持体１２、したがって、標的材料１１Ｈの密度は、捕捉温度での流体５６’’’’の密度よりも高い。したがって、標的材料１１Ｈは、印加された電界６２に応答せず、流体５６’’’よりも重いため、下部配列決定表面３０’に移動又は沈降することができる。
標的材料１１Ｇ、１１Ｈを含む流体５６’’’’は、フローセル２４に導入され、標的材料１１Ｇ、１１Ｈが同時に移動及び固定化を開始するために露出される条件は、電界６２の印加である。流体５６’’’’の密度も、移動と固定化に影響を与える条件と見なされ得る。
電界６２は、図６Ａ及び図６Ｂを参照して説明したように印加され得る。図８Ａに示す例（標的材料１１Ｇが負に帯電する場合）では、電界６２は、下側／下部配列決定表面３０’に向かう方向に印加される。それにより、上側配列決定表面３０が正に帯電し、下側／下部配列決定表面３０’が負に帯電する。この例では、負に帯電した標的材料１１Ｇは、今や正に帯電した配列決定表面３０に向かって移動し、そこで上側配列決定表面３０の捕捉部位４４（図８Ａ又は図８Ｂには示されない）によって固定化される。同時に、標的材料１１Ｈの固形支持体１２は帯電せず、捕捉温度で流体５６’’’’より重い。したがって、図８Ｂに示すように、標的材料１１Ｈは、下部配列決定表面３０’に移動するか、又はその上に沈降する。捕捉部位４４’（図８Ａ又は図８Ｂにも示されない）は、標的材料１１Ｈの少なくとも一部を下側／下部配列決定表面３０’に固定化する。
上記のように、図８Ａ及び図８Ｂによって表される方法の他の例では、標的材料１１Ｇは正に帯電している。この例では、電界６２は、上側配列決定表面３０に向かう方向に（即ち、図８Ａ及び図８Ｂに示す方向とは反対の方向に）印加される。それにより、下側配列決定表面３０’は正に帯電し、上側配列決定表面３０は負に帯電する。この例では、正に帯電した標的材料１１Ｇは、今や負に帯電した上側配列決定表面３０に向かって移動し、そこで上側配列決定表面３０の捕捉部位４４によって固定化される。同時に、標的材料１１Ｈの固形支持体１２は帯電せず、捕捉温度で流体５６’’’’より重い。したがって、図８Ｂと同様に、標的材料１１Ｈは、下部配列決定表面３０’に移動するか、又はその上に沈降する。捕捉部位４４’（図８Ｂにも示されない）は、標的材料１１Ｈの少なくとも一部を下側／下部配列決定表面３０’に固定化する。
図８Ａ及び図８Ｂによって表される例のいずれにおいても、電界６２は、所定の時間印加され得る。一例では、逆帯電した配列決定表面３０又は３０’上に所望の数の固定化された帯電した標的材料１１Ｇを得るために、所定の時間は約１分間から約３０分間の範囲であり得る。
標的材料１１Ｇ、１１Ｈの固定化は、標的材料１１Ｇ、１１Ｈの特性（密度と磁性の両方）により、標的流体５６’’’’がフローセル２４に導入された時点で、並びに電界６２に露出された時点で起こる。図８Ａ及び図８Ｂの方法では、第１標的材料１１Ｇの少なくともいくつかは、２つの対向する配列決定表面３０の第１表面のそれぞれの捕捉部位４４によって固定化され、第２標的材料１１Ｈの少なくとも一部は、２つの対向する配列決定表面３０’の第２表面のそれぞれの捕捉部位４４’によって固定化される。
いくつかの標的材料１１Ｇ、１１Ｈは固定化されない可能性があり、当該標的材料１１Ｇ、１１Ｈは、更なる処理の前にフローセル２４から除去されることを理解すべきである。電界６２は、未固定化標的材料１１Ｇ、１１Ｈを除去する前に停止され得る。したがって、この例示的な方法は、電界６２を除去し、次に、流体５６’’’’及び未固定化標的材料１１Ｇ、１１Ｈをフローセル２４から洗い流すステップを含み得る。洗浄は、洗浄流体をフローセル２４’’に導入するステップを含み得る。フローは、配列決定表面３０、３０’で固定化されていない任意の標的材料１１Ｇ、１１Ｈを、フローセル２４の出口ポートを通して押し出し得る。それぞれの標的材料１１Ｇ、１１Ｈと配列決定表面３０、３０’の捕捉部位４４、４４’との間の固定化メカニズム（例えば、結合ペア、ハイブリダイゼーション、共有結合など）は、固定化された標的材料１１Ｇ、１１Ｈが出口フローの一部になることを防止し得る。
複合体１０Ａ又は１０Ｂが標的材料１１Ｇ、１１Ｈとして使用される場合、この洗浄ステップの後に、ライブラリ断片の放出及び増幅が続く場合がある（例えば、その例は、図９Ａから図９Ｃを参照して記載される）。クラスター化した固形支持体１３が標的材料１１Ｇ、１１Ｈとして使用される場合、この洗浄ステップの後に配列決定を行うことができる。
図８Ａ及び図８Ｂに示す例示的な方法はまた、標的材料１１Ｇが帯電せず、標的流体５６’’’’の密度よりも低い密度を有するように実行され得る。この例では、標的材料１１Ｈは正に帯電している。この例では、正に帯電した標的材料１１Ｈは、電界６２（下部配列決定表面３０’の方向に印加される）に応答し、下部配列決定表面３０’に引き付けられる。また、この例では、標的材料１１Ｇは、印加された磁場に応答せず、流体５６’’’よりも軽いため、上側配列決定表面３０に浮くか、又は移動することができる。
２つの異なる標的材料１１を固定化するために、他の直交するモダリティを組み合わせることができることを理解すべきである。標的材料１１のそれぞれは、直交するモダリティの１つに応答するが、他のモダリティには応答しない場合があり、それにより、モダリティが標的材料１１のうちの１つに独立して影響を与えることができる。例えば、帯電しない磁気応答性の標的材料１１は、帯電した非磁性標的材料１１と組み合わせることができる。この例では、磁場７０を一方向に印加し、帯電しない磁気応答性標的材料１１の、対向する配列表面３０、３０’又は３２、３２’、又は３１、３１’のうちの一方の３０、３２、３１への移動を誘導し得、電界６２を反対方向に印加し、帯電した非磁性標的材料の、対向する配列表面３０、３０’又は３２、３２’又は３１、３１’の他方の３０’、３２’、３１’への移動を誘導し得る。いくつかの例が提供されるが、他の標的材料の組み合わせ及びモダリティを利用することもできると考えられる。
複合体からのライブラリ断片の放出及び配列決定
フローセル２４の対向する表面３０及び３０’又は３２及び３２’又は３１及び３１’の両方に標的材料１１が固定化された状態で、フローセル２４は下流分析の準備ができる。
対向する配列表面３０及び３０’又は３２及び３２’の両方に固定化された複合体１０Ａ、１０Ｂを利用する実施例では、フローセル２４は、ライブラリ断片の放出、増幅、及び配列決定の準備ができる。
方法の固定化及び未固定化標的材料（例えば、複合体１０Ａ、１０Ｂ）の除去後の例は、固定化された複合体１０Ａ、１０Ｂの固形支持体１２又は１２’からの配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’の放出を開始することにより、少なくともいくつかの配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’を、２つの対向する配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’のそれぞれのプライマー４２、４２’にシーディングするステップと、固形支持体１２又は１２’及び未シーディングの配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’を除去するステップとを含む。これらのステップの後に、図９Ａから図９Ｃを参照して説明されたものを含む、本明細書に記載された増幅技術のいずれかを続けることができる。
断片１４、１４’、１４’’の放出の前に、外部固定剤はフローセル２４に導入され得る。一例として、外部固定剤は、空気であり、又はフローセル２４に導入される標的材料１１（具体的には、複合体１０Ａ、１０Ｂ）と混和しない液体媒体又は粘性媒体である。空気を使用して、フローセル２４から洗浄流体を吸引することもでき、この吸引により、複合体１０Ａ、１０Ｂを取り囲みかつ複合体１０Ａ、１０Ｂのそれぞれの周りに拡散バリアを形成する液滴を作り出すことができる。液体又は粘性外部固定剤は、フローセル２４内に固定化される複合体１０Ａ、１０Ｂを少なくとも部分的に取り囲む。外部固定剤は、断片１４、１４’、１４’’が固形支持体１２又は１２’から放出されるとき、配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’の拡散を最小限に抑えるのに役立つ。外部固定剤が温度応答性材料である場合、温度をシーディング温度まで上げると、当該固定剤はより粘稠になり、ライブラリの拡散を更に最小限に抑えることができる形態になる可能性がある。
次に、固形支持体１２又は１２’からの配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’の放出が開始され得る。一例では、開裂剤（cleaving agent）がフローセル２４に導入されてもよく、並びに刺激が加えられて開裂剤がトリガーされ、固形支持体１２又は１２’から配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’が放出され得る。他の例では、配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’の放出は、断片１４、１４’、１４’’にハイブリダイズするプライマーの融解温度を超えてフローセル２４を加熱することを含み得る。
放出時に、配列決定可能な核酸断片１４、１４’、又は１４’’の輸送及びシーディングは、外部固定剤によって制限され得る。したがって、任意の特定の複合体１０Ａ、１０Ｂの断片１４、１４’又は１４’’は、断片１４、１４’又は１４’’が放出される特定の複合体１０Ａ、１０Ｂの近くの配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’の領域に隔離（confined）され得る。
フローセル２４のそれぞれの配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’のプライマー４２、４２’は、放出された配列決定可能な核酸断片１４、１４’、又は１４’をシーディングし得る。シーディングは、断片１４、１４’、又は１４’’の第１又は第２配列と、それぞれの配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’のプライマー４２、４２’の相補的な配列との間のハイブリダイゼーションによって達成される。シーディングは、断片１４、１４’、又は１４’’及びプライマー４２、４２’に適したハイブリダイゼーション温度で実行され得る。一例では、シーディングは約８０℃で行われ、その後、温度が室温（例えば、２５℃）まで低下する。
フローセル２４内の配列決定可能な核酸断片１４、１４’、又は１４’’のシーディングが位置する場所は、部分的に、プライマー４２、４２’がどのように付着するかに応じて異なる。パターン化されていない配列決定表面３０、３０’を有するフローセル２４の例では、放出された配列決定可能な核酸断片１４、１４’、又は１４’’を、凹状領域３８、３８’の高分子ヒドロゲル４０、４０’にわたってシーディングする。パターン化された配列決定表面３２、３２’を有するフローセル２４の例では、放出された配列決定可能な核酸断片１４、１４’、又は１４’’を、くぼみ４８、４８’のそれぞれの中の高分子ヒドロゲル４０、４０’にわたってシーディングする。
フローセル２４のパターン化された配列決定表面３２、３２’に沿った異なるくぼみ４８、４８’にシーディングされた配列決定可能な核酸断片１４、１４’、又は１４’’の例が図９Ａに示される。
次に、固形支持体１２、１２’がフローセル２４から除去され得る。固形支持体１２、１２’の除去は、固形支持体１２、１２’を捕捉部位４４、４４’に付着する機序に応じて異なる任意の適切な技術を含み得る。例として、変性、結合開裂などが使用され得る。固形支持体１２、１２’の除去はまた、未シーディングの配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’を除去し得る。固形支持体１２、１２’の除去はまた、液体又は粘性形態の外部固定剤を除去し得る。
シーディングされた配列決定ライブラリ断片１４、１４’、１４’’は、クラスター生成を使用して増幅できる。
クラスター生成の一例では、配列決定可能な核酸断片１４、１４’、又は１４’’は、ハイブリダイズしたプライマー４２、４２’から、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用する３’伸長によってコピーされる。高忠実度ＤＮＡポリメラーゼは、フローセル２４に導入される増幅混合物の一部であり得る。増幅混合物はまた、他の適切なポリメラーゼ連鎖反応試薬も含み得る。元の配列決定可能な核酸断片１４、１４’、又は１４’’は変性され、コピーは配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’に固定化されて残る。固定化されたコピーを増幅するために、等温ブリッジ増幅又は他の何らかの形態の増幅が使用され得る。例えば、コピーされた鋳型はループオーバーして隣接する相補的なプライマー４２、４２’にハイブリダイズし、ポリメラーゼはコピーされた鋳型をコピーして二本鎖ブリッジ構造を形成し、当該構造は変性して２本の一本鎖を形成する。これらの２本の鎖は、ループオーバーして隣接する相補的なプライマー４２、４２’にハイブリダイズし、再度伸長して、２つの新しい二本鎖ループを形成する。このプロセスを、等温変性及び増幅のサイクルによって各鋳型コピーに対して繰り返して、密集したクローンクラスターを作り出す。二本鎖ブリッジ構造の各クラスターが変性される。一例では、逆方向鎖は、特異的な塩基切断によって除去され、順方向鋳型ポリヌクレオチド鎖を残す。クラスター化により、配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’に沿っていくつかの鋳型ポリヌクレオチド鎖が形成される。このクラスター化の例にはブリッジ増幅があり、この増幅は実行できる増幅の一例である。排除増幅（Ｅｘａｍｐ）ワークフロー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）などの他の増幅技術が使用され得ることを理解すべきである。
増幅、したがって、クラスター生成の別の例は、温度応答性材料の使用を含む。この例は、図９Ａから図９Ｃに概略的に示される。この例示的な方法は、液体形態６３の温度応答性材料を含む増幅混合物をフローセル２４に導入するステップと、液体形態６３の温度応答性材料をゲル化させる（それにより、ゲル形態６３’の温度応答性材料が生成される）ステップと、シーディングされた配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’の増幅を開始して鋳型鎖６４を生成し、それによってゲル形態６３’の温度応答性材料が、鋳型鎖６４の拡散を低減するステップと、ゲル形態６３’の温度応答性材料を液化させる（それにより、液体形態６３の温度応答性材料が生成される）ステップと、フローセル２４から液体形態６３の温度応答性材料を除去するステップとを含む。
図９Ａに示すように、液体形態６３の温度応答性材料を含む増幅混合物は、例えば、入口を介してフローチャネル２８に導入される。液体形態６３の温度応答性材料に加えて、増幅混合物のこの例はまた、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ及び任意の他の適切なポリメラーゼ連鎖反応試薬を含む。
温度応答性材料は、材料が露出される温度条件を変更することにより、液体形態６３からゲル形態６３’に移行することができる。液体形態６３では、温度応答性材料の分子は連結されず、したがって流れることができる。ゲル形態６３’では、温度応答性材料の分子が架橋されるため、流れることができない。ゲル形態６３’は、ｉ）増幅のために、シーディングされた配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’にアクセスするための小分子、タンパク質、及び試薬の拡散交換を促進し、また、ｉｉ）拡散又は対流により、シーディングされた配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’又は鋳型鎖６４の移動を妨害又は防止することができる細孔、チャネル又は他の開口部を含む。したがって、任意の温度感受性材料は、ｉ）ゲル内増幅を促進し、ｉｉ）シーディングされた配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’及び鋳型鎖６４の拡散、対流、又は他の移動を制限し、ｉｉｉ）架橋する前に、送り出される（pumped）か、液体として流れ、ｉｖ）制御可能に架橋し、ゲル化し、並びにｖ）制御可能に連結を解除して液化することができる。
温度応答性材料の例としては、ジスルフィド架橋ポリアクリルアミド、アガロース、アルギン酸塩、及びポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのコポリマーが挙げられる。これらの材料のそれぞれについて、増幅は、ゲル形態６３’を融解しない温度で実行され得る。
ＰＮＩＰＡＡｍとＰＥＧのコポリマーは、低温では液体であり、高温ではゲルである。ＰＮＩＰＡＡｍとＰＥＧのコポリマーの一例は、２９℃未満の温度の液体と３２℃を超える温度のゲルである。ＰＮＩＰＡＡｍとＰＥＧとのコポリマーのゲル化温度は、コポリマー中のポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）とポリエチレングリコールとの比率を変えることで調整され得る。
増幅混合物は、増幅反応が起こらない条件でフローセル２４にロードされる。例えば、増幅は４℃では起こらないので、増幅混合物（液体形態６３の温度応答性材料を含む）は、この温度で導入され得る。
液体形態６３の温度応答性材料にゲル化を生じさせ、したがってゲル形態６３’を生成することは、フローセル２４及びそこに含まれる温度応答性材料の温度を、温度応答性材料のゲル化温度に調整することによって実行され得る。ゲル形態６３’を図９Ｂに示す。フローセル２４が調整される温度は、使用される温度応答性材料に依存する。
図９Ｂに示すように、シーディングされた配列決定な核酸断片１４、１４’、１４’’の増幅を開始すると、鋳型鎖６４が生成される。増幅は、フローセル２４及びそこに含まれる増幅混合物の温度を、ＰＣＲ試薬が活性である温度に調整することによって開始され得る。増幅期間、ゲル形態６３’の温度応答性材料は、シーディングされた配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’及び鋳型鎖６４の移動を低減する。
ゲル形態６３’の温度応答性材料を液化させ、液体形態６３を生成することは、フローセル２４及びそこに含まれる温度応答性材料の温度を、温度応答性材料の液化温度に再び調整することによって実行され得る。この場合も、フローセル２４が調整される温度は、使用される温度応答性材料に依存する。
次に、液体形態６３をフローセル２４から送り出し、フローセル２４はその後の配列決定のために準備され得る。液体形態６３の温度応答性材料が除去された後のフローセル２４が図９Ｃに示される。
ある特定の例では、ＰＮＩＰＡＡｍとＰＥＧのコポリマーが増幅混合物に使用され、リコンビナーゼを介在させたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせて使用される。典型的なリコンビナーゼを介在させた等温ＰＣＲは４℃では不活性であり、３７℃又は他の高温では活性であることから、温度プログラムを使用して増幅を制御でき、ＰＮＩＰＡＡｍとＰＥＧのコポリマーは、２９℃未満の温度では液体であり、３２℃を超える温度ではゲルである。この例では、増幅混合物は、液体混合物として約４℃でフローセル２４に導入され得る。次に、温度が約３７℃に上昇させて、コポリマーをゲル化し、ＰＣＲ増幅を開始することもできる。完了時に、ゲル形態６３’のコポリマーは、温度を２９℃未満、例えば、約８℃（これは適切な配列決定温度である）に下げることによって液化され得る。次に、液体形態６３をフローセル２４から送り出し、フローセル２４はその後の配列決定のために準備され得る。
温度応答性材料６３、６３’の使用により、シーディングされた配列決定可能な核酸断片１４、１４’、又は１４’’の拡散、及びパターン化された配列決定表面３２、３２’の近くのくぼみ４８、４８’に（例えば、拡散又は自然対流の結果として）移動するか、又はパターン化されていない配列決定表面３０、３０’の最初のシーディング位置から離れての、増幅された鋳型鎖６４の拡散を最小限に抑えることができる。この移動を制限又は防止することにより、クラスターはフローセル２４の比較的隔離された領域に留まり、それにより、冗長性なしに、クラスターのそれぞれを個別に読み取ることができる。移動はまた、元の配列決定ライブラリ断片１４、１４’、１４’’に存在しないハイブリッド分子を生成し得、その結果、配列決定データが不正確になり得る。この移動を制限又は防止することにより、それらのハイブリッド分子は生成されず、結果として得られる配列決定データの精度が向上する。
図９Ａから図９Ｃは、パターン化された配列決定表面３２、３２’を有するフローセル２４を示すが、この方法は、パターン化されていない配列決定表面３０、３０’も使用して実行され得ることを理解すべきである。
更に、図９Ａから図９Ｃに示す方法は、固形支持体１２、１２’につながれないものを含む、任意の配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’を用いて実行され得る。この例では、断片化されたＤＮＡサンプルに望ましいアダプターを追加する任意の適切なライブラリ調製技術が使用され得る。配列決定可能な核酸断片１４、１４’、１４’’は導入され得、フローセルの配列決定表面３０、３０’又は３２、３２上にシーディングされ得る。ライブラリ断片がシーディングされると、図９Ａから図９Ｃに記載される方法が実行され得る。
図９Ａから図９Ｃに示す方法は、これらの標的材料１１がフローセル２４上で増幅に露出されないので、クラスター化した固形支持体１３では実行されない可能性があることを更に理解すべきである。
次に、鋳型ポリヌクレオチド鎖上の相補的な配列にハイブリダイズする配列決定プライマーが導入され得る。この配列決定プライマーは、鋳型ポリヌクレオチド鎖６４を配列決定の準備ができた状態にする。鋳型６４の３’末端及びフローセル結合プライマー４２、４２’（コピーに付着されない）は、配列決定反応への干渉を防止するために、特に、望ましくないプライミングを防止するために、ブロッキングされ得る。
配列決定を開始するために、組み込み（incorporation）混合物がフローセル２４に加えられ得る。一例では、組み込み混合物は、液体キャリア、ポリメラーゼ、及び蛍光標識したヌクレオチドを含む。蛍光標識したヌクレオチドは、３’ＯＨブロッキング基を含み得る。組み込み混合物がフローセル２４に導入されると、流体はフローチャネル２８に入り、いくつかの例では、くぼみ４８、４８’（鋳型ポリヌクレオチド鎖が存在する）に入る。
蛍光標識したヌクレオチドが鋳型に依存する方法で配列決定プライマーに追加され（それにより、配列決定プライマーを伸長し）、配列決定プライマーに追加されたヌクレオチドの順序及びタイプの検出が、鋳型の配列決定に使用され得る。より具体的には、ヌクレオチドの１つは、それぞれのポリメラーゼにより、配列決定プライマーを伸長し鋳型ポリヌクレオチド鎖に相補的である新生鎖に組み込まれる。言い換えれば、フローセル２４にわたる鋳型ポリヌクレオチド鎖の少なくともいくつかにおいて、それぞれのポリメラーゼは、組み込み混合物中のヌクレオチドの１つによってハイブリダイズした配列決定プライマーを伸長する。
ヌクレオチドの組み込みは、画像化イベントを通じて検出され得る。画像化イベント中に、照明システム（図示せず）が、それぞれの配列決定表面３０、３０’又は３２、３２’に励起光を提供し得る。
いくつかの例では、ヌクレオチドは、ヌクレオチドが配列決定プライマーに加えられると、更なるプライマー伸長を終結させる可逆的終結特性（例えば、３’ＯＨブロッキング基）を更に含み得る。例えば、可逆的末端部分を有するヌクレオチド類似体が配列決定プライマーに加えられ、その結果、デブロッキング剤が送達されて当該部分を除去するまで、その後の伸長は起こり得ない。したがって、可逆的終端を使用する例の場合、検出が行われた後、デブロッキング試薬はフローセル２４に送達され得る。
洗浄（複数可）は、様々な流体送達ステップの間で行ってもよい。次に、ＳＢＳサイクルをｎ回繰り返し、配列決定プライマーをｎヌクレオチドによって伸長し、それによって長さｎの配列を検出することができる。
いくつかの例では、順方向鎖が、配列決定され、除去され、次に、逆方向鎖が、本明細書に記載されるように構築され、配列決定されてもよい。
ＳＢＳが詳細に説明されるが、本明細書に記載のフローセル２４は、遺伝子型決定のために、又は他の化学的及び／又は生物学的用途において、他の配列決定プロトコルと共に利用され得ることを理解すべきである。場合によっては、フローセル２４のプライマー４２、４２’は、同時ペアエンド配列決定を可能にするように選択されてよく、この場合、順方向鎖と逆方向鎖の両方が高分子ヒドロゲル４０、４０’上に存在し、各読み取りの同時塩基呼び出しを可能にする。順次及び同時ペアエンド配列決定により、ゲノム再配列及び反復配列要素、並びに遺伝子融合及び新規転写物の検出が容易になる。
クラスター化した固形支持体と配列決定
上記のように、フローセル２４の対向する表面３０及び３０’又は３２及び３２’又は３１及び３１’の両方に標的材料１１が固定化された状態でもって、フローセル２４は下流分析の準備が完了する。クラスター化した固形支持体１３がフローセル２４の対向する表面３１及び３１’の両方に固定化される場合、フローセル２４は配列決定の準備が完了する。これらの例では、増幅及びクラスター生成がフローセル２４から離れた固形支持体１２又は１２’で行われるため、フローセル２４は配列決定の準備が完了する。
配列決定は、配列決定プライマーと組み込み混合物を導入し、順次的な配列決定サイクルを実行することにより、本明細書に記載されるように実行され得る。
本開示を更に説明するために、本明細書に例を示す。これらの例は、例示の目的で提供され、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解すべきである。
非限定的な作業例
実施例１
図１Ａに示したものと同様の複合体を、平均直径３μｍで調製した。複合体の固形支持体は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＹＮＡＢＥＡＤ（商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジンビーズとした。固形支持体はそれぞれ約１．１８ｇ／ｃｍ３の密度をサポートする。特定のビーズ上の断片は、同じ長いＤＮＡ分子（ＰｈｉＸゲノムから）からのものであった。ライブラリ断片は、ビーズ表面のストレプトアビジンに対しビオチンよりも弱い親和性を有するデスチオビオチンオリゴを介して、固形支持体に付着させた。ライブラリ断片は、インデックス配列とともにＰ５’及びＰ７配列を含み、読み取り１及び読み取り２配列を含んだ。
複合体は、図３Ａ及び図３Ｂに記載されたものと同様の方法の例を使用し、対向するパターン化された配列決定表面（Ｐ５及びＰ７プライマーを含む）を含むフローセルにロードした。
より具体的には、複合体は最初に２つの流体に分割され、その第１流体は約２ｇ／ｃｍ３の密度を有し、第２流体は約１ｇ／ｃｍ３の密度を有した。第１流体は１ｇ／ｍｌポリタングステン酸ナトリウム溶液（ドデシル硫酸ナトリウムを含むクエン酸ナトリウム食塩水緩衝液５００μＬあたり５００ｍｇポリタングステン酸ナトリウム）とし、１μＬあたり６００，０００個の濃度で複合体を含めた。第２流体は、ドデシル硫酸ナトリウムを含む生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液とし、１μＬあたり６００，０００個の濃度で複合体を含めた。
第１流体がフローセルに導入され、複合体がフローセルの上面に固定化された。次に、フローセルは洗浄液で洗浄された。第２流体はフローセルに導入され、それによって複合体はフローセルの底面に固定化された。それぞれの表面への複合体の付着は、アンカー（例えば、ビオチンを含む相補的なプライマーを、ゲル材料に結合したＰ５プライマーにハイブリダイズさせた、あるいはクリックケミストリーを使用してアルキン－ＰＥＧ－ビオチンリンカーをゲル材料上の遊離アジドに共有結合させる）を用いて達成された。
図１０Ａは、複合体の固定化後の上面の明視野像を示し、図１０Ｂは、複合体の固定化後の底面の明視野像を示す。各画像の暗い領域は、固定化された複合体を表す。
ドデシル硫酸ナトリウムを含む生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液中の遊離ビオチンが導入され、フローセルは、それぞれの複合体からライブラリを放出させるため約８０℃に加熱した。クラスター化は、等温増幅を使用して実行した。クラスターはＳｙｔｏｘグリーンで染色され、得られた画像（ここでは再現されない）により、フローセルの各配列決定表面に鋳型鎖のクラスターが形成されたことが確認される。
次に、配列決定はフローセルで実行した。フローセルの上面と底面について収集された配列決定データの一部が図１１Ａと図１１Ｂに示される。
図１１Ａは、フローセルの１つのレーンの上面及び底面における分子被覆のヒストグラムを示す。このデータは、レーンの配列決定被覆の範囲と均一性とを示す。
図１１Ｂは、フローセルの１つのレーンの上面及び底面における、様々な配列決定サイクルについてのＱ３０より大きいＱスコアのパーセンテージを示す。Ｑスコアが３０（Ｑ３０）の場合、１０００回に１回の塩基呼び出しが正しくないという確率に相当する。これは、塩基呼び出しの精度（つまり、正しい塩基呼び出しの確率）が９９．９％であることを意味する。塩基呼び出しの精度が９９％（Ｑ２０）と低いと、１００分の１の誤った塩基呼び出し確率を有することになり、すなわち１００塩基対の配列決定読み取りごとにエラーが含まれ得ることを意味する。配列決定の品質がＱ３０に達する場合、事実上すべての読み取りが完全であり、エラーやあいまいさがなくなる。図１１Ｂに示すように、Ｑ３０よりも高いＱスコアのパーセンテージは、すべての配列決定サイクルで一般に６０％から９９％の範囲である。
収集されたすべてのデータにより、より密度の高い流体（この例では第１流体）がフローセルの配列決定表面と適合性があることが確認された。
実施例２
図１Ａに示したものと同様の複合体を、平均直径３μｍで調製した。複合体の固形支持体は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＹＮＡＢＥＡＤ（商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジンビーズとした。固形支持体はそれぞれ約１．１８ｇ／ｃｍ３の密度をサポートする。特定のビーズ上の断片は、同じ長いＤＮＡ分子（ＰｈｉＸゲノムから）からのものであった。
この例では、フローセルレーン（対向する表面がゲル材料でコーティングされている）を、捕捉部位（即ち、アルキン－ＰＥＧ－ビオチンリンカー）の濃度を様々にして調製した。これらのリンカーは、クリックケミストリーを使用し、フローセルレーンのゲル材料上の遊離アジドに共有結合させた。フローセルレーンを洗浄し、それぞれ、約０．５μＭ、約５μＭ、又は約２５μＭの濃度のアルキン－ＰＥＧ－ビオチン溶液に露出した。溶液は約６０℃で約３０分間インキュベートさせた。次に、フローセルレーンは再度洗浄した。
複合体は最初に２つの流体に分割され、第１流体は約１ｇ／ｃｍ３の密度を有し、第２流体は約２ｇ／ｃｍ３の密度を有した。第１流体は、塩化ナトリウムを含む生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液とし、１μＬあたり２５，０００の濃度で複合体を含めた。第２液体は２ｇ／ｍｌのポリタングステン酸ナトリウム溶液とし、１μＬあたり２５，０００の濃度の複合体を含めた。
第１流体はそれぞれのフローセルレーンに導入され、それによって複合体はフローセルレーンの底面に固定化された。吸引速度は１００μＬ／分間とし、第１流体はフローセルに１８０秒間留まらせた。次に、フローセルは洗浄液で洗浄した。第２流体はそれぞれのフローセルレーンに導入され、複合体はフローセルレーンの上面に固定化された。吸引速度は１００μＬ／ｍｓとし、第２流体はフローセルレーンに４５０秒間留まらせた。次に、フローセルレーンは洗浄液で洗浄した。
各フローセルレーンの底面と上面は画像化され、顕微鏡画像を使用して各表面に固定化された複合体（ビーズ）がカウントされた。
底面の１ｍｍ２あたりのビーズ数は図１２Ａに示され、上面の１ｍｍ２あたりのビーズ数は図１２Ｂに示される。図１２Ａ及び図１２Ｂの各バーの濃度は、複合体の固定化の前にフローセルを準備するために使用したアルキン－ＰＥＧ－ビオチン濃度（約０．５μＭ、約５μＭ、又は約２５μＭ）を表す。示されるように、アルキン－ＰＥＧ－ビオチン濃度は、これらのそれぞれが約２，１００ビーズ／ｍｍ２から約２，３００ビーズ／ｍｍ２であるため、底面の固定化に影響を与えなかった。上面に固定化された複合体の数は、約５５０ビーズ／ｍｍ２から約１，１５０ビーズ／ｍｍ２の範囲であるため、底面ほど多くはなかった。上面については、高濃度のアルキン－ＰＥＧ－ビオチンリンカーで処理されたレーンは、当該レーン上に固定化された複合体／ビーズの数が多かった。
これらの結果は、より重い流体が上面に複合体を固定化するのに役立ち、上面上の捕捉サイズの濃度を上げることも固定化に役立つ可能性があることを示す。
実施例３
図１Ａに示したものと同様の複合体を、平均直径３μｍで調製した。複合体の固形支持体は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＹＮＡＢＥＡＤ（商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジンビーズとした。固形支持体はそれぞれ約１．１８ｇ／ｃｍ３の密度をサポートする。特定のビーズ上の断片は、同じ長いＤＮＡ分子（ＰｈｉＸゲノムから）からのものであった。
この例では、８つのフローセルレーン（対向する表面がゲル材料でコーティングされる）を捕捉部位（つまり、アルキン－ＰＥＧ－ビオチンリンカー）により準備した。これらのリンカーは、クリックケミストリーを使用し、フローセルレーンのゲル材料上の遊離アジドに共有結合させた。フローセルレーンを洗浄し、それぞれ約５μＭの濃度のアルキン－ＰＥＧ－ビオチン溶液に露出した。溶液は約６０℃で約３０分間インキュベートした。次に、フローセルレーンは再度洗浄した。
複合体は最初に２つの流体に分割され、第１流体は約１ｇ／ｃｍ３の密度を有し、第２流体は約２ｇ／ｃｍ３の密度を有した。第１流体はクエン酸ナトリウム緩衝液とし、１μＬあたり４０，０００の濃度の複合体を含めた。第２液体は２ｇ／ｍｌのポリタングステン酸ナトリウム溶液とし、１μＬあたり４０，０００の濃度で複合体を含めた。
第１流体はフローセルレーンの７つに導入され、それによって複合体は底面に固定化された。吸引速度は１００μＬ／分間とし、第１流体は各レーンに２４０秒間留まらせた。次に、フローセルレーンは洗浄液で洗浄した。第２流体は７つのフローセルレーンのそれぞれに導入され、それによって複合体は上面に固定化された。吸引速度は８０μＬ／ｍｓから１００μＬ／ｍｓの範囲とし、第２流体はフローセル内に３００秒間留まらせた。次に、フローセルレーンは洗浄液で洗浄した。
第８レーンでは、流体をそれぞれ１００μＬに希釈し、それぞれの流体の導入は２回実行した。したがって、レーン８は二重のローディングを有した。
各フローセルレーンの底面と上面は画像化され、各表面に固定化された複合体（ビーズ）がカウントされた。表１に、各フローセルレーンの１ｍｍ２あたりの平均ビーズ数を示す。
Figure 2023506338000012
各表面の複合体（ビーズ）の目標数は４，０００ビーズ／ｍｍ２とした。レーン１～７は目標をわずかに下回るが、これらのレーンの上面と底面における複合体の数は比較的一貫する。レーン８（二重ローディングに露出される）は、両方の表面で複合体の目標数を超える。
図１３Ａは、入口（１）から出口（５）までのフローセルレーン１の長さに沿って測定された目標ビーズ数及び１ｍｍ２あたりのビーズ数を示す。図１３Ｂは、ビーズの目標数、及び入口（１）から出口（５）までのフローセルレーン７の長さに沿って測定された１ｍｍ２あたりのビーズの数を示す。測定は、長さに沿って等距離で行った。これらの結果は、固定化が上面と底面の両方のフローチャネルのレーンの長さに沿って比較的一貫することを示す。
実施例４
図１Ａに示したものと同様の複合体を、平均直径３μｍで調製した。複合体の固形支持体は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＹＮＡＢＥＡＤ（商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジンビーズとした。固形支持体はそれぞれ約１．１８ｇ／ｃｍ３の密度をサポートする。特定のビーズ上の断片は、同じ長いＤＮＡ分子（ＰｈｉＸゲノムから）からのものであった。
この例では、１０のフローセルレーン（対向する表面がゲル材料でコーティングされる）を捕捉部位（つまり、アルキン－ＰＥＧ－ビオチンリンカー）により準備した。これらのリンカーは、クリックケミストリーを使用し、フローセルレーンのゲル材料上の遊離アジドに共有結合させた。フローセルレーンを洗浄し、それぞれ約５μＭの濃度のアルキン－ＰＥＧ－ビオチン溶液に露出した。溶液は約６０℃で約３０分間インキュベートした。次に、フローセルレーンは再度洗浄した。
複合体は最初に２つの流体に分割され、第１流体は約１ｇ／ｃｍ３の密度を有し、第２流体は約２ｇ／ｃｍ３の密度を有した。第１流体はクエン酸ナトリウム緩衝液とし、５０μＬあたり１０μｇの濃度の複合体を含めた。第２流体は２ｇ／ｍｌのポリタングステン酸ナトリウム溶液とし、５０μＬあたり１２．５μｇの濃度の複合体を含めた。
第１流体は１０のフローセルレーンに導入され、複合体は底面に固定化された。吸引速度は１００μＬ／分間とし、第１流体は各レーンに３００秒間留まらせた。次に、フローセルレーンは洗浄液で洗浄した。第２流体は１０のフローセルレーンのそれぞれに導入され、複合体は上面に固定化された。吸引速度は８０μＬ／ｍｓとし、第２流体はフローセル内に３６０秒間留まらせた。次に、フローセルレーンは洗浄液で洗浄した。
各フローセルレーンの底面と上面は画像化され、各表面に固定化された複合体（ビーズ）がカウントされた。
図１４は、ビーズの目標数、及び入口（１）から出口（１０）までのフローセルの１つのレーンの長さに沿って測定された１ｍｍ２あたりのビーズの数を示す。図１４は、上面と底面のデータの直線あてはめも示す。これらの結果は、本明細書に開示される方法の例にしたがって複合体が導入される場合、固定化がフローチャネルの上面及び底面の長さに沿って比較的一貫することを示す。
実施例５
図１Ａに示したものと同様の複合体を、平均直径３μｍで調製した。複合体の固形支持体は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＹＮＡＢＥＡＤ（商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジンビーズとした。固形支持体はそれぞれ約１．１８ｇ／ｃｍ３の密度をサポートする。特定のビーズ上の断片は、同じ長いＤＮＡ分子（ＰｈｉＸゲノムから）からのものであった。ライブラリ断片は、ビーズ表面のストレプトアビジンに対しビオチンよりも弱い親和性を有するデスチオビオチンオリゴを介して固形支持体に付着させた。
この例では、８つのフローセルレーン（対向する表面がゲル材料でコーティングされる）を捕捉部位（つまり、アルキン－ＰＥＧ－ビオチンリンカー）により準備した。これらのリンカーは、クリックケミストリーを使用し、フローセルレーンのゲル材料上の遊離アジドに共有結合させた。フローセルレーンを洗浄し、それぞれ約５μＭの濃度のアルキン－ＰＥＧ－ビオチン溶液に露出した。溶液は約６０℃で約３０分間インキュベートした。次に、フローセルレーンは再度洗浄した。
複合体は最初に２つの流体に分割され、第１流体は約１ｇ／ｃｍ３の密度を有し、第２流体は約２ｇ／ｃｍ３の密度を有した。第１流体はクエン酸ナトリウム緩衝液とし、５０μＬあたり１０μｇの濃度の複合体を含めた。第２流体は２ｇ／ｍｌのポリタングステン酸ナトリウム溶液とし、５０μＬあたり１２．５μｇの濃度の複合体を含めた。
第１流体はフローセルレーンの８つに導入され、それによって複合体は底面に固定化された。吸引速度は１００μＬ／分間とし、第１流体は各レーンに２４０秒間留まらせた。次に、フローセルレーンは洗浄液で洗浄した。第２流体は８つのフローセルレーンのそれぞれに導入され、複合体は上面に固定化された。吸引速度は８０μＬ／ｍｓから１００μＬ／ｍｓの範囲とし、第２流体はフローセル内に３００秒間留まらせた。次に、フローセルレーンは洗浄液で洗浄した。
各フローセルレーンの底面と上面は画像化され、各表面に固定化された複合体（ビーズ）がカウントされた。
クエン酸ナトリウム緩衝液中の遊離ビオチンは導入され、フローセルは、それぞれの複合体からライブラリは放出させるため約８０℃に加熱した。クラスター化は、ブリッジ増幅を使用して実行した。次に、配列決定はフローセルで実行した。収集した配列決定データは、通過フィルター（％ＰＦ）（パーセンテージ）を含んだ。Ｐａｓｓｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ（ＰＦ）は、ｃｈａｓｔｉｔｙ閾値をパスするクラスターを記述するために使用されるメトリックであり、配列決定データの更なる処理と分析に使用される。Ｐａｓｓｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ（％）の結果が高くなるほど、配列決定データに使用される一意のクラスターの収量が増加したことを示す。
表２に、各フローセルレーンの１ｍｍ２あたりの平均ビーズ数と、各レーンのＰＦデータを示す。
Figure 2023506338000013
レーン１～７の各表面の複合体（ビーズ）の目標数は、４，０００ビーズ／ｍｍ２（合計８，０００ビーズ／ｍｍ２）であった。レーン８の各表面の複合体（ビーズ）の目標数は、５，５００ビーズ／ｍｍ２（合計１１，０００ビーズ／ｍｍ２）であった。レーン１～８は目標をわずかに下回るが、これらのレーンの上面と底面における複合体の総数は比較的一貫する。Ｐａｓｓｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒデータは、ナノウェルの大部分がモノクローナルクラスターによって占有されたことを示す。
追記事項
更に、本明細書で提供される範囲は、明示的に列挙されているかのように、表示範囲及び表示範囲内の任意の値又は部分範囲を含むことを理解すべきである。例えば、約２ｍｍ～約３００ｍｍによって表される範囲は、約２ｍｍ～約３００ｍｍの明示的に記載された限界だけでなく、約１５ｍｍ、２２．５ｍｍ、２４５ｍｍなどの個々の値、及び約２０ｍｍ～約２２５ｍｍなどの部分範囲も含むと解釈するべきである。
前述の概念及び更なる概念の全ての組み合わせが、以下でより詳細に考察される（かかる概念が相互に矛盾しないことを提供する）は、本明細書に開示される発明の主題の一部であると考えられることを理解されたい。具体的には、本開示の終わりに現れる特許請求される主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると考えられる。本明細書で明示的に用いられ、また参照により組み込まれる任意の開示においても出現し得る用語は、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味が与えられるべきであることも理解すべきである。
いくつかの実施例を詳細に説明してきたが、開示された例は修正され得ることを理解すべきである。したがって、これまでの説明は非限定的なものであると考えるべきである。

Claims (44)

  1. 方法であって、
    フローセルの２つの対向する配列決定表面のそれぞれに標的材料を固定化するステップを含み、固定化は、
    前記標的材料の第１部分を中に含む第１流体を前記フローセルに導入することにより、前記２つの対向する配列決定表面のうち一方の表面上の捕捉部位によって前記標的材料の少なくとも一部を固定化するステップと、
    前記フローセルから前記第１流体及び任意の未固定化標的材料を除去するステップと、
    前記標的材料の第２部分を中に含む第２流体を前記フローセルに導入することにより、前記２つの対向する配列決定表面のうち他の１つの表面上の捕捉部位によって前記標的材料の少なくとも一部を固定化するステップとを含み、
    ここで、
    前記第１流体は、前記標的材料の密度よりも低い密度を有し、かつ前記第２流体は、前記標的材料の密度よりも高い密度を有する、又は
    前記第２流体は、前記標的材料の密度よりも低い密度を有し、かつ前記第１流体は前記標的材料の密度よりも高い密度を有する、のいずれかである、方法。
  2. 前記標的材料の密度よりも低い密度を有する前記第１又は第２流体は、緩衝水溶液であり、前記標的材料の密度よりも高い密度を有する前記第２又は第１流体は、ポリタングステン酸ナトリウム溶液又は塩化ナトリウム溶液である、請求項１に記載の方法。
  3. 捕捉温度での前記第１又は第２流体の密度は、前記捕捉温度での前記標的材料の密度よりも少なくとも０．１ｇ／ｃｍ３低く、前記捕捉温度での前記第２又は第１流体の密度は、前記捕捉温度での前記標的材料の密度より少なくとも０．１ｇ／ｃｍ３高い、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 前記標的材料の密度よりも低い前記第１又は第２流体の密度は、捕捉温度で約１ｇ／ｃｍ３であり、前記標的材料の密度よりも高い前記第２又は第１流体の密度は、前記捕捉温度で約２ｇ／ｃｍ３である、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記フローセルから前記第１流体及び任意の未固定化標的材料を除去する前に、所定の時間を経過させるステップを更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記２つの対向する配列決定表面のうち１つの表面上に固定化された前記標的材料は、前記第２流体が導入されたとき、前記２つの対向する配列決定表面の１つの表面上に固定化されたままである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 複合体である前記標的材料は、
    固形支持体と、
    前記固形支持体に付着した配列決定可能な核酸断片とを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 方法であって、
    前記フローセルから前記第２流体及び未固定化複合体を除去するステップと、
    前記固定化された複合体の前記固形支持体からの前記配列決定可能な核酸断片の放出を開始し、それによって前記２つの対向する配列決定表面のそれぞれのプライマーに少なくともいくつかの前記配列決定可能な核酸断片をシーディングするステップと、
    前記固形支持体及び未シーディングの配列決定可能な核酸断片を除去するステップと、
    液体形態の温度応答性材料を含む増幅混合物を前記フローセルに導入するステップと、
    前記液体形態の前記温度応答性材料をゲル化させるステップと、
    前記シーディングされた配列決定可能な核酸断片の増幅を開始して鋳型鎖を生成し、それによって前記ゲル形態の前記温度応答性材料が前記鋳型鎖の拡散を低減するステップと、
    前記ゲル形態の前記温度応答性材料を液化させるステップと、
    前記フローセルから前記液体形態の前記温度応答性材料を除去するステップとを更に含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記温度応答性材料は、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）とポリエチレングリコールのコポリマーである、請求項８に記載の方法。
  10. クラスター化した固形支持体である前記標的材料は、
    固形支持体と、
    前記固形支持体に付着した鋳型鎖のクラスターとを含む、請求項１に記載の方法。
  11. キットであって、
    その中に標的材料を含む調製液流体と、
    前記標的材料の密度よりも低い密度を有する第１導入流体と、
    前記標的材料の密度よりも高い密度を有する第２導入流体とを含む、キット。
  12. 前記第１導入流体は緩衝水溶液であり、前記第２導入流体はポリタングステン酸ナトリウム溶液又は塩化ナトリウム溶液である、請求項１１に記載のキット。
  13. 前記第２導入流体は前記ポリタングステン酸ナトリウム溶液であり、前記ポリタングステン酸ナトリウム溶液は、１ミリリットルの水あたり約１グラムのポリタングステン酸ナトリウムである濃度を有する、請求項１２に記載のキット。
  14. 捕捉温度での前記第１導入流体の密度は、前記捕捉温度での前記標的材料の密度よりも少なくとも０．１ｇ／ｃｍ３低く、前記捕捉温度での前記第２導入流体の密度は、前記捕捉温度での前記標的材料の密度より少なくとも０．１ｇ／ｃｍ３高い、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のキット。
  15. 前記第１導入流体の密度は、捕捉温度で約１ｇ／ｃｍ３であり、前記第２導入流体の密度は、前記捕捉温度で約２ｇ／ｃｍ３である、請求項１１又は１４のいずれか一項に記載のキット。
  16. ２つの対向する配列決定表面を有するフローセルを更に含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載のキット。
  17. 対向する配列決定表面のそれぞれは、
    高分子ヒドロゲルと、
    前記高分子ヒドロゲルに付着した増幅プライマーと、
    化学的捕捉部位とを含む、請求項１６に記載のキット。
  18. キットであって、
    前記化学的捕捉部位は、結合ペアの一方のメンバーであり、
    前記標的材料は、前記結合ペアの他方のメンバーでコーティングされた固形支持体である、請求項１７に記載のキット。
  19. 複合体である前記標的材料は、
    固形支持体と、
    前記固形支持体に付着した配列決定可能な核酸断片とを含む、請求項１１～１８のいずれか一項に記載のキット。
  20. クラスター化した固形支持体である前記標的材料は、
    固形支持体と、
    前記固形支持体に付着した鋳型鎖のクラスターとを含む、請求項１１～１８のいずれか一項に記載のキット。
  21. 液体形態の温度応答性材料を含む増幅混合物を更に含む、請求項１１～１９のいずれか一項に記載のキット。
  22. 方法であって、
    以下の動作により、フローセルの２つの対向する配列決定表面のそれぞれに標的材料を固定化し、動作は、
    前記標的材料を含む流体を前記フローセルに導入するステップであって、
    前記標的材料は、
    磁性を有する固形支持体と、
    前記磁性を有する固形支持体に付着した配列決定可能な核酸断片又は鋳型鎖とを含み、
    前記流体は、前記磁性を有する固形支持体の密度と少なくともほぼ同等の密度を有するステップと、
    前記２つの対向する配列決定表面のうち一方の表面上にある捕捉部位によって前記標的材料の一部を固定化させるステップと、
    前記２つの対向する配列決定表面のうち他方の表面に磁力を印加し、それによって他のいくつかの前記標的材料を、前記２つの対向する配列決定表面のうち他方の表面上に引っ張り、前記２つの対向する配列決定表面のうち他方の表面上の捕捉部位によって前記標的材料が固定化されるステップとを含む、方法。
  23. 前記流体の密度は、前記磁性を有する固形支持体の密度の０．０８ｇ／ｃｍ３以内である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記流体は緩衝水溶液である、請求項２２又は２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記流体の導入から前記磁力の印加までの間に所定の時間が経過し、前記所定の時間は、約５秒間から約２分間の範囲である、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記磁力の印加は、磁性粒子が埋め込まれたエラストマーストリップを、前記２つの対向する配列決定表面のうち他方の表面に隣接する、前記フローセルの外面上に配置することを含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
  27. 方法であって、
    前記磁力の印加を停止するステップと、
    前記流体及び未固定化複合体を前記フローセルから除去するステップと、
    前記固定化された複合体の前記固形支持体からの前記配列決定可能な核酸断片の放出を開始し、それによって前記２つの対向する配列決定表面のそれぞれのプライマーに少なくともいくつかの前記配列決定可能な核酸断片をシーディングするステップと、
    前記固形支持体及び未シーディングの配列決定可能な核酸断片を除去するステップと、
    液体形態の温度応答性材料を含む増幅混合物を前記フローセルに導入するステップと、
    前記液体形態の前記温度応答性材料をゲル化させるステップと、
    前記シーディングされた配列決定可能な核酸断片の増幅を開始して鋳型鎖を生成し、それによって前記ゲル形態の前記温度応答性材料が前記鋳型鎖の拡散を低減するステップと、
    前記ゲル形態の前記温度応答性材料を液化させるステップと、
    前記フローセルから前記液体形態の前記温度応答性材料を除去するステップとを更に含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記温度応答性材料は、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）とポリエチレングリコールのコポリマーである、請求項２７に記載の方法。
  29. 方法であって、
    配列決定可能な核酸断片をフローセルに導入し、それによって前記フローセルの配列決定表面上のそれぞれのプライマーに、前記配列決定可能な核酸断片の少なくとも一部をシーディングするステップと、
    未シーディングの配列決定可能な核酸断片を前記フローセルから除去するステップと、
    液体形態の温度応答性材料を含む増幅混合物を前記フローセルに導入するステップと、
    前記液体形態の前記温度応答性材料をゲル化させるステップと、
    前記シーディングされた配列決定可能な核酸断片の増幅を開始して鋳型鎖を生成し、それによって前記ゲル形態の前記温度応答性材料が前記鋳型鎖の拡散を低減するステップと、
    前記ゲル形態の前記温度応答性材料を液化させるステップと、
    前記フローセルから前記液体形態の前記温度応答性材料を除去するステップとを含む、方法。
  30. 前記温度応答性材料は、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）とポリエチレングリコールのコポリマーである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記配列決定可能な核酸断片は、前記フローセルに導入されると固形支持体に付着し、前記方法は、前記固形支持体から前記配列決定可能な核酸断片を放出させるステップを更に含む、請求項２９又は３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 方法であって、
    フローセルに第１標的材料及び第２標的材料を含む標的流体を導入することにより、前記フローセルの２つの対向する配列決定表面の第１表面に前記第１標的材料を、前記２つの対向する配列決定表面の第２表面に前記第２標的材料を同時に固定化するステップを含み、ここで、
    標的流体のキャリア流体は流体密度を有し、
    第１標的材料は、流体密度よりも低い第１密度を有し、
    第２標的材料は、流体密度よりも高い第２密度を有する、方法。
  33. 方法であって、
    前記第１標的材料の少なくとも一部は、前記２つの対向する配列決定表面のうち前記第１表面上のそれぞれの捕捉部位によって固定化され、
    前記第２標的材料の少なくとも一部は、前記２つの対向する配列決定表面のうち前記第２表面上のそれぞれの捕捉部位によって固定化される、請求項３２に記載の方法。
  34. 標的流体であって、
    流体密度を有するキャリア流体と、
    前記流体密度よりも低い第１密度を有する第１標的材料と、
    前記流体密度よりも高い第２密度を有する第２標的材料とを含む、標的流体。
  35. 標的流体であって、
    前記第１標的材料は、
    前記第１密度とほぼ同等の第１固形支持体密度を有する第１固形支持体と、
    前記第１固形支持体に付着した配列決定可能な核酸断片とを含み、
    前記第２標的材料は、
    前記第２密度とほぼ同等の第２固形支持体密度を有する第２固形支持体と、
    前記第２固形支持体に付着した配列決定可能な核酸断片とを含む、請求項３４に記載の標的流体。
  36. 標的流体であって、
    前記第１標的材料は、
    前記第１密度とほぼ同等の第１固形支持体密度を有する第１固形支持体と、
    前記第１固形支持体に付着した鋳型鎖の第１クラスターとを含み、
    前記第２標的材料は、
    前記第２密度とほぼ同等の第２固形支持体密度を有する第２固形支持体と、
    前記第２固形支持体に付着した鋳型鎖の第２クラスターとを含む、請求項３４に記載の標的流体。
  37. 方法であって、
    ２つの対向する配列決定表面を含むフローセルに第１及び第２標的材料を導入するステップであって、前記第１標的材料は、前記第２標的材料とは異なる特性を少なくとも１つ有しており、前記少なくとも１つの特性は、密度、電荷、磁性、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるステップと、
    前記第１及び第２標的材料を少なくとも１つの条件に露出し、それによって前記第１標的材料を前記２つの対向する配列決定表面のうち第１表面上の捕捉部位によって固定化させ、前記第２標的材料を前記２つの対向する配列決定表面のうち第２表面上の捕捉部位によって固定化させるステップとを含む、方法。
  38. 方法であって、
    前記第１標的材料は負電荷を有し、
    前記第２標的材料は正電荷を有し、
    前記少なくとも１つの条件は、前記２つの対向する配列決定表面の間に印加される電界であり、前記２つの対向する配列決定表面の前記第１表面に正電荷を生成し、前記２つの対向する配列決定表面の前記第２表面に負電荷を生成する、請求項３７に記載の方法。
  39. 方法であって、
    前記第１標的材料は、カルボキシル化固形支持体、ポリグルタミン酸でコーティングされた固形支持体、及び硫酸塩官能化固形支持体からなる群から選択され、
    前記第２標的材料はアミン官能化固形支持体である、請求項３８に記載の方法。
  40. 方法であって、
    前記第１及び第２標的材料は、前記第１密度を有する流体において前記フローセルに導入され、
    前記第１標的材料は磁性を有するものであり、
    前記第２標的材料は非磁性のものであり、第１密度よりも高い密度を有し、
    前記少なくとも１つの条件は、前記第１標的材料を前記２つの対向する配列決定表面の第１表面に引き付けるために印加される磁場である、請求項３７に記載の方法。
  41. 方法であって、
    前記第１及び第２標的材料は、第１密度を有する流体において前記フローセルに導入され、
    前記第１標的材料は非磁性のものであり、前記第１密度よりも低い密度を有し、
    前記第２標的材料は磁性を有するものであり、
    前記少なくとも１つの条件は、前記第２標的材料を前記２つの対向する配列決定表面の第２表面に引き付けるために印加される磁場である、請求項３７に記載の方法。
  42. 方法であって、
    前記第１及び第２標的材料は、第１密度を有する流体において前記フローセルに導入され、
    前記第１標的材料は負に帯電しており、
    前記第２標的材料は帯電しておらず、前記第１密度よりも高い密度を有し、
    前記少なくとも１つの条件は、前記２つの対向する配列決定表面の間に印加される電界であり、前記２つの対向する配列決定表面の前記第１表面に正電荷を生成し、前記２つの対向する配列決定表面の前記第２表面に負電荷を生成する、請求項３７に記載の方法。
  43. 方法であって、
    前記第１及び第２標的材料は、第１密度を有する流体において前記フローセルに導入され、
    前記第１標的材料は正に帯電しており、
    前記第２標的材料は帯電しておらず、前記第１密度よりも高い密度を有し、
    前記少なくとも１つの条件は、前記２つの対向する配列決定表面の間に印加される電界であり、前記２つの対向する配列決定表面の前記第１表面に負電荷を生成し、前記２つの対向する配列決定表面の前記第２表面に正電荷を生成する、請求項３７に記載の方法。
  44. 方法であって、
    前記第１及び第２標的材料は、第１密度を有する流体において前記フローセルに導入され、
    前記第１標的材料は帯電しておらず、前記第１密度よりも低い密度を有し、
    前記第２標的材料は正に帯電しており、
    前記少なくとも１つの条件は、前記２つの対向する配列決定表面の間に印加される電界であり、前記２つの対向する配列決定表面の前記第１表面に正電荷を生成し、前記２つの対向する配列決定表面の前記第２表面に負電荷を生成する、請求項３７に記載の方法。
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