RU2804754C2 - Иммобилизация в проточных кюветах - Google Patents
Иммобилизация в проточных кюветах Download PDFInfo
- Publication number
- RU2804754C2 RU2804754C2 RU2021127094A RU2021127094A RU2804754C2 RU 2804754 C2 RU2804754 C2 RU 2804754C2 RU 2021127094 A RU2021127094 A RU 2021127094A RU 2021127094 A RU2021127094 A RU 2021127094A RU 2804754 C2 RU2804754 C2 RU 2804754C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- density
- fluid
- sequencing
- flow cell
- opposing
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан способ для иммобилизации исследуемого материала на каждой из двух противоположных поверхностей для секвенирования проточной кюветы. Также описаны набор для иммобилизации исследуемого материала, способы для иммобилизации исследуемого материала на каждой из двух противоположных поверхностей для секвенирования проточной кюветы, способ получения темплатных цепей и исследуемая текучая среда для иммобилизации исследуемого материала. Технический результат заключается в более сбалансированном распределении исследуемого материала на противоположных поверхностях для секвенирования, что приводит к улучшению показателей эффективности секвенирования. 7 н. и 37 з.п. ф-лы, 31 ил., 2 табл., 2 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
[0001] Настоящая заявка испрашивает преимущество по предварительной заявке США№62/946,717, поданной 11 декабря 2019 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ путем ссылки.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Проточные кюветы используют в различных способах и сферах применения, таких как геномное секвенирование, генотипирование и т.д. В некоторых способах и приложениях желательно генерировать библиотеку фрагментированных и меченых молекул ДНК из целевых молекул двухцепочечной ДНК (дцДНК). Часто целью является получение меньших молекул ДНК (например, фрагментов ДНК) из более крупных молекул дцДНК для применения в качестве темплатов в реакциях секвенирования ДНК. Темплаты могут обеспечивать получение более коротких чтений. В процессе анализа данных перекрывающиеся короткие чтения последовательностей можно выравнивать для реконструкции более длинных нуклеотидных последовательностей. В некоторых случаях для упрощения анализа данных можно использовать стадии предварительного секвенирования (такие как штрихкодирование конкретных молекул нуклеиновой кислоты).
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Некоторые из предложенных в настоящем документе примеров наборов и способов можно использовать для иммобилизации одного или более целевых материалов на противоположных поверхностях проточной кюветы. Некоторые примеры способов обеспечивают последовательную иммобилизацию, а другие примеры способов - одновременную иммобилизацию.
[0004] Первый описываемый в настоящем документе аспект представляет собой способ, включающий иммобилизацию целевого материала на каждой из двух противоположных поверхностей для секвенирования проточной кюветы, причем иммобилизация включает в себя: введение первой текучей среды, включающей в себя первую часть целевого материала, в проточную кювету, причем по меньшей мере часть целевого материала становится иммобилизованной на захватных сайтах на одной из двух противоположных поверхностей для секвенирования; удаление первой текучей среды и любого неиммобилизованного целевого материала из проточной кюветы; и введение второй текучей среды, включающей в себя вторую часть целевого материала, в проточную кювету, причем по меньшей мере часть целевого материала становится иммобилизованной на захватных сайтах на другой из двух противоположных поверхностей для секвенирования; при этом выполняется одно из следующих двух условий: первая текучая среда имеет плотность ниже плотности целевого материала, а вторая текучая среда имеет плотность выше плотности целевого материала; или вторая текучая среда имеет плотность ниже плотности целевого материала, а первая текучая среда имеет плотность выше плотности целевого материала.
[0005] Второй описываемый в настоящем документе аспект представляет собой набор, содержащий препарационную текучую среду, включающую в себя целевой материал; первую вводимую текучую среду с плотностью ниже плотности целевого материала; и вторую вводимую текучую среду с плотностью выше плотности целевого материала.
[0006] Третий описываемый в настоящем документе аспект представляет собой способ, включающий иммобилизацию целевого материала на каждой из двух противоположных поверхностей для секвенирования проточной кюветы путем: введения текучей среды, включающей целевой материал, в проточную кювету, причем целевой материал включает в себя: магнитную твердую подложку; и готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот или темплатные цепи, прикрепленные к магнитной твердой подложке; и текучая среда имеет плотность, по меньшей мере приблизительно эквивалентную плотности магнитной твердой подложки; выдерживание, что позволяет части целевого материала стать иммобилизованной на захватных сайтах на одной из двух противоположных поверхностей для секвенирования; и приложение магнитной силы к другой из двух противоположных поверхностей для секвенирования с вытягиванием тем самым некоторой другой части целевого материала к другой из двух противоположных поверхностей для секвенирования, где она становится иммобилизованной на захватных сайтах на другой из двух противоположных поверхностей для секвенирования.
[0007] Четвертый описываемый в настоящем документе аспект представляет собой способ, включающий одновременную иммобилизацию первых целевых материалов на первой из двух противоположных поверхностей для секвенирования проточной кюветы и вторых целевых материалов на другой из двух противоположных поверхностей для секвенирования проточной кюветы путем введения в проточную кювету целевой текучей среды, содержащей первые целевые материалы и вторые целевые материалы, причем несущая текучая среда целевой текучей среды имеет плотность текучей среды; первый целевой материал имеет первую плотность ниже плотности текучей среды; а второй целевой материал имеет вторую плотность выше плотности текучей среды.
[0008] Пятый описываемый в настоящем документе аспект представляет собой целевую текучую среду, содержащую несущую текучую среду, имеющую плотность текучей среды; первый целевой материал, имеющий первую плотность ниже плотности текучей среды; и второй целевой материал, имеющий вторую плотность выше плотности текучей среды.
[0009] Шестой описываемый в настоящем документе аспект представляет собой способ, включающий введение первого и второго целевых материалов в проточную кювету, имеющую две противоположные поверхности для секвенирования, причем первый целевой материал имеет по меньшей мере одно свойство, которое отличается от свойств второго целевого материала, при этом по меньшей мере одно свойство выбрано из группы, состоящей из плотности, заряда, магнитности и их комбинаций; и воздействие на первый и второй целевые материалы по меньшей мере одним условием, в результате чего первый целевой материал становится иммобилизованным на захватном сайте на первой из двух противоположных поверхностей для секвенирования, а второй целевой материал становится иммобилизованным на захватном сайте на второй из двух противоположных поверхностей для секвенирования.
[0010] Следует понимать, что любые элементы любого из аспектов можно комбинировать любым желаемым образом. Кроме того, следует понимать, что любые комбинации элементов первого аспекта и/или второго аспекта и/или третьего аспекта и/или четвертого аспекта и/или пятого аспекта и/или шестого аспекта можно комбинировать с любыми из описываемых в настоящем документе примерами для достижения описываемых в настоящем описании преимуществ, включая, например, более равномерное распределение целевого материала по поверхностям для секвенирования в проточной кювете.
[0011] Другой представленный в настоящем документе пример позволяет уменьшить или не допустить миграцию темплатных цепей в процессе протекающей в проточной кювете амплификации.
[0012] Таким образом, седьмой описываемый в настоящем документе аспект представляет собой способ, включающий введение готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот в проточную кювету, таким образом высеивая по меньшей мере часть готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот на соответствующие праймеры на поверхности для секвенирования проточной кюветы; удаление невысеянных готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот из проточной кюветы; введение амплификационной смеси, включающей жидкую форму термочувствительного материала, в проточную кювету; инициирование гелеобразования жидкой формы термочувствительного материала; инициирование амплификации высеянных готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот для получения темплатных цепей, при этом гелеобразная форма термочувствительного материала уменьшает диффузию темплатных цепей; инициирование разжижения гелеобразной формы термочувствительного материала; и удаление жидкой формы термочувствительного материала из проточной кюветы.
[0013] Следует понимать, что любые элементы седьмого аспекта можно комбинировать любым желаемым образом. Кроме того, следует понимать, что любые комбинации элементов седьмого аспекта можно комбинировать с любыми остальными аспектами и/или любыми из описываемых в настоящем документе примерами для достижения описываемых в настоящем описании преимуществ, включая, например, более равномерное распределение целевого материала по поверхностям для секвенирования в проточной кювете и уменьшение миграции темплатных цепей в процессе протекающей в проточной кювете амплификации.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0014] Признаки согласно примерам настоящего описания станут очевидными после ознакомления с нижеследующим подробным описанием и графическими материалами, на которых одинаковые номера позиций соответствуют подобным, хотя, возможно, неидентичным компонентам. Для краткости изложения номера позиций или признаки, имеющие ранее описанную функцию, могут быть описаны или могут не быть описаны применительно к другим графическим материалам, на которых они встречаются.
[0015] На Фиг. 1А-1С представлены схематические иллюстрации различных примеров целевых материалов, описываемых в настоящем документе;
[0016] на Фиг. 2А представлен вид сверху примера проточной кюветы;
[0017] на Фиг. 2В представлен увеличенный вид в сечении вдоль линии 2В-2В на Фиг. 2А примера проточного канала и непрофилированных поверхностей для секвенирования;
[0018] на Фиг. 2С представлен увеличенный вид в сечении вдоль линии 2С-2С на Фиг. 2А примера проточного канала и профилированных поверхностей для секвенирования;
[0019] на Фиг. 2D представлен увеличенный вид в сечении вдоль линии 2D-2D на Фиг. 2А другого примера проточного канала и профилированных поверхностей для секвенирования;
[0020] на Фиг. 3А и 3В совместно представлен один пример способа, описываемого в настоящем документе;
[0021] на Фиг. 4А и 4В совместно представлен другой пример способа, описываемого в настоящем документе;
[0022] на Фиг. 5А и 5В совместно представлен еще один пример способа, описываемого в настоящем документе;
[0023] на Фиг. 6А и 6В совместно представлен другой возможный пример способа, описываемого в настоящем документе;
[0024] на Фиг. 7А и 7В совместно представлен дополнительный пример способа, описываемого в настоящем документе;
[0025] на Фиг. 8А и 8В совместно представлен еще один пример способа, описываемого в настоящем документе;
[0026] на Фиг. 9А-9С совместно представлен пример способа для уменьшения диффузии и конвекции темплатных цепей в процессе амплификации;
[0027] на Фиг. 10А и 10В представлены изображения в светлом поле комплексов, иммобилизованных на верхней поверхности для секвенирования (Фиг. 10А) и нижней поверхности для секвенирования (Фиг. 10В) проточной кюветы, содержащей профилированные поверхности для секвенирования;
[0028] на Фиг. 11А представлена гистограмма молекулярного покрытия для верхней и нижней поверхностей для секвенирования одной дорожки проточной кюветы после выполнения секвенирования;
[0029] на Фиг. 11В представлен график, показывающий долю показателей качества распознавания оснований (Q score) выше Q30 (ось Y) в зависимости от номера цикла секвенирования (ось X) для верхней и нижней поверхностей для секвенирования одной дорожки после выполнения секвенирования;
[0030] на Фиг. 12А и 12В представлены гистограммы, показывающие загрузку комплексом (число гранул /мм2, ось Y) на нижних поверхностях (Фиг. 12А) и верхних поверхностях (Фиг. 12В) проточных кювет, обработанных различными концентрациями (мкМ, ось X) алкин-биотина, где загрузку комплексом производили с использованием двух разных жидкостей для введения;
[0031] на Фиг. 13А и 13В представлены графики, показывающие целевую загрузку комплексом и реально полученную загрузку комплексом (число гранул /мм2, ось Y) на нижней поверхности и верхней поверхности в зависимости от расстояния (ось X) для двух разных каналов проточной кюветы; и
[0032] на Фиг. 14 представлен график, показывающий целевую/ожидаемую загрузку комплексом и реально полученную загрузку комплексом (число гранул/мм2, ось Y) на нижней поверхности и верхней поверхности в зависимости от расстояния (ось X) для одного канала проточной кюветы и линейную аппроксимацию для каждой поверхности.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0033] В некоторых методиках секвенирования используют готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот. В некоторых примерах каждый готовый к секвенированию фрагмент нуклеиновых кислот включает в себя часть (фрагмент) генетического материала, а также адаптеры на 3' и 5'-концах. Готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот могут связываться с твердой подложкой с образованием комплекса. В таких примерах использование твердой подложки может оказаться желательным, поскольку позволяет сохранить информацию о непрерывности расположения фрагментов в генетическом материале большей длины, из которого генерируются такие фрагменты. В других методиках секвенирования используют кластеризованную твердую подложку, которая включает в себя кластер темплатных цепей, прикрепленных к твердой подложке. В таких примерах использование твердой подложки может оказаться желательным, поскольку можно проводить амплификацию (формирование темплатных цепей) независимо от проточной кюветы и тем самым упростить химическую подготовку проточной кюветы в том смысле, что она не должна включать в себя праймеры для амплификации. Однако при использовании таких целевых материалов (например, комплексов или кластеризованных твердых подложек) в проточных кюветах, имеющих две поверхности для секвенирования, расположенных напротив друг друга (например, верхнюю и нижнюю поверхность), было обнаружено, что целевые материалы имеют тенденцию к оседанию на поверхность для секвенирования, находящуюся в нижней части проточной кюветы. Аналогичные трудности могут возникать при использовании других целевых материалов, таких как белковые биомаркеры, микробиомы, лизаты и т.п., в проточных кюветах с противоположными поверхностями.
[0034] Некоторые примеры описываемого в настоящем документе способа позволяют обеспечить более сбалансированную иммобилизацию целевого материала по двум противоположным поверхностям для секвенирования. В некоторых примерах по двум противоположным поверхностям для секвенирования иммобилизуют один и тот же тип целевого материала. В других примерах по двум противоположным поверхностям для секвенирования соответственно иммобилизуют два разных целевых материала (с различием в по меньшей мере одном свойстве).
[0035] В одном примере описываемого в настоящем документе способа используют комбинацию текучих сред, имеющих разные плотности. Одна плотность текучей среды позволяет целевому материалу (например, комплексам, кластеризованным твердым подложкам) мигрировать к одной из поверхностей для секвенирования и становиться иммобилизованным на ней, а вторая плотность текучей среды позволяет целевому материалу мигрировать к другой из поверхностей для секвенирования и становиться иммобилизованным на ней.
[0036] В одном примере способа используют комбинацию текучей среды, по существу однородной магнитной силы, и магнитно-восприимчивый целевой материал (например, твердую подложку). В этом примере текучую среду выбирают для получения плотности, которая приблизительно равна плотности магнитно-восприимчивого целевого материала. В такой текучей среде часть целевого материала оседает (и становится иммобилизованной на одной из поверхностей для секвенирования), а другая часть целевого материала остается на плаву. При приложении по существу однородной магнитной силы к другой из поверхностей для секвенирования плавающий целевой материал мигрирует к другой из поверхностей для секвенирования и становится иммобилизованным на ней.
[0037] В еще одном примере описываемого в настоящем документе способа используют два различных целевых материала с разными плотностями. Оба целевых материала содержатся в одной текучей среде. Плотность одного из целевых материалов (относительно текучей среды) позволяет целевому материалу (например, комплексам, кластеризованным твердым подложкам) мигрировать к одной из поверхностей для секвенирования и становиться иммобилизованным на ней, а плотность второго из целевых материалов (относительно текучей среды) позволяет целевому материалу мигрировать к другой из поверхностей для секвенирования и становиться иммобилизованным на ней.
[0038] В другом примере описываемого в настоящем документе способа используют два различных целевых материала с различием в по меньшей мере одном свойстве, таком как плотность, заряд, магнитность или их комбинации. Воздействие по меньшей мере одним условием приводит к миграции разных целевых материалов к одной из соответствующих противоположных поверхностей для секвенирования.
[0039] Иммобилизация целевого (-ых) материала (-ов) (например, комплексов, кластеризованных твердых подложек) на обеих поверхностях для секвенирования улучшает общее использование проточной кюветы.
[0040] Более сбалансированное распределение иммобилизованного (-ых) целевого (-ых) материала (-ов) по двум поверхностям для секвенирования может привести к улучшению показателей эффективности на последующих стадиях при использовании проточной кюветы. В одном примере такое более сбалансированное распределение иммобилизованного целевого материала по двум поверхностям для секвенирования может привести к улучшению показателей эффективности секвенирования. В одном примере целевой материал может включать в себя комплексы, и при более равномерном распределении комплексов по двум поверхностям для секвенирования проточной кюветы высвобождаемые из комплексов фрагменты из библиотеки также высеваются более равномерно по соответствующим поверхностям для секвенирования. Это приводит к образованию индивидуальных кластеров, которые относительно локализованы по отношению к положению комплексов, из которых данные кластеры формируются. В другом примере целевой материал может включать в себя кластеризованные твердые подложки. При более равномерном распределении кластеризованных твердых подложек по двум поверхностям для секвенирования проточной кюветы кластеризованные темплатные цепи также оказываются распределены более равномерно. Во время секвенирования индивидуальные кластеры генерируют “пространственные облака” сигналов флуоресценции по мере встраивания нуклеотидов в соответствующие цепи шаблонов в кластерах. Более равномерное распределение может улучшить читаемость таких пространственных облаков.
[0041] Кроме того, загрузка материала на обе поверхности для секвенирования порождает больше площади для формирования таких пространственных облаков.
[0042] Определения
[0043] Если не указано иное, следует понимать, что термины, используемые в настоящем документе, имеют свое обычное значение в соответствующей области. Ниже приведен ряд терминов, используемых в настоящем документе, и их значения.
[0044] Используемые в настоящем документе формы единственного числа подразумевают как единственные, так и множественные формы, если из контекста явно не следует иное. Используемый в настоящем документе термин “содержащий” представляет собой синоним терминов “включая”, “включающий” или “характеризуется” и является включающим или не имеющим ограничительного характера, и он не исключает дополнительных неуказанных элементов или стадий способа.
[0045] Указание в настоящем описании на “один пример”, “другой пример”, “пример” и т.п. означает, что конкретный элемент (например, признак, конструкция, композиция, конфигурация и/или характеристика), описанный в отношении примера, включен по меньшей мере в один пример, описанный в настоящем документе, и может присутствовать или может отсутствовать в других примерах. Кроме того, следует понимать, что описанные элементы любого примера можно комбинировать любым подходящим способом с разными примерами, если из контекста явно не следует иное.
[0046] Термины “по существу” и “около”, используемые по всему тексту данного описания, включая формулу изобретения, используют для описания и учета небольших колебаний, например из-за вариаций при обработке. Например, эти термины могут относиться к равным ±10% или менее от указанного значения, например равным ±5% или менее от указанного значения, например равным ±2% или менее от указанного значения, например равным ±1% или менее от указанного значения, например равным ±0,5% или менее от указанного значения, например равным ±0,2% или менее от указанного значения, например равным ±0,1% или менее, например равным ±0,05% или менее от указанного значения.
[0047] Адаптер. Линейная олигонуклеотидная последовательность, которая может быть слита с молекулой нуклеиновой кислоты, например, посредством лигирования или тагментации. Длины адаптеров могут находиться в диапазоне от около 10 нуклеотидов до около 100 нуклеотидов, или от около 12 нуклеотидов до около 60 нуклеотидов, или от около 15 нуклеотидов до около 50 нуклеотидов. Адаптер может включать любую комбинацию нуклеотидов и/или нуклеиновых кислот. В некоторых примерах адаптер может включать последовательность, комплементарную по меньшей мере части праймера, например праймера, включающего универсальную нуклеотидную последовательность (такую как последовательность Р5 или Р7). Например, адаптер на одном конце фрагмента включает последовательность, комплементарную по меньшей мере части первого праймера проточной кюветы или твердой подложки, а адаптер на другом конце фрагмента включает последовательность, идентичную по меньшей мере части второго праймера проточной кюветы или твердой подложки. Комплементарный адаптер может гибридизироваться с первым праймером проточной кюветы или твердой подложки, а идентичный адаптер является темплатом для его комплементарной копии, которая может гибридизироваться со вторым праймером проточной кюветы или твердой подложки в процессе кластеризации. В некоторых примерах адаптер может включать последовательность праймера для секвенирования или сайт связывания для секвенирования. Комбинации различных адаптеров могут быть встроены в молекулу нуклеиновой кислоты, например фрагмент ДНК.
[0048] Приблизительно эквивалентный. “По меньшей мере приблизительно эквивалентный” означает, что плотность одного компонента (например, текучей среды) отличается не более чем на 0,08 г/см3 от плотности другого компонента (например, твердой подложки). В некоторых случаях плотности двух компонентов являются эквивалентными.
[0049] Захватный сайт или сайт химического захвата. Часть поверхности проточной кюветы, которая была модифицирована с приданием ей химического свойства, позволяющего локализовать целевой материал (например, комплексы, кластеризованные твердые подложки, белковые биомаркеры и т.д.). В одном примере захватный сайт может включать захватный химический агент (т.е. материал, молекулу или функциональную группу, которая способна присоединяться к, удерживать или связываться с целевой молекулой (например, комплексом, кластеризованной твердой подложкой, белковым биомаркером и т.д.)). Одним примером захватного химического агента является элемент связывающейся пары рецептор-лиганд (например, авидин, стрептавидин, биотин, лектин, углевод, связывающийся с нуклеиновой кислотой белок, эпитоп, антитело и т.д.), способный связываться с целевой молекулой (или с линкерной функциональной группой, присоединенной к целевому материалу). Еще одним примером захватного химического агента является химический реагент, способный образовывать электростатическое взаимодействие, водородную связь или ковалентную связь (например, по механизму тиол-дисульфидного обмена, клик-химии, реакции Дильса-Альдера и т.д.) с целевым материалом.
[0050] Комплекс. Носитель, такой как твердая подложка, и готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот, прикрепленные к носителю. Носитель может также включать один элемент связывающейся пары, другой элемент которой является частью захватного сайта.
[0051] Кластеризованная твердая подложка. Носитель, такой как твердая подложка, с прикрепленным к нему множеством амплифицированных темплатных цепей. Такое множество амплифицированных темплатных цепей может называться “кластером”.
[0052] Нанесение. Любая соответствующая методика нанесения, которая может быть ручной или автоматизированной и в некоторых случаях приводит к модификации свойств поверхности. В общем нанесение можно выполнять с использованием методик осаждения из паровой фазы, методик нанесения покрытий, методик прививки к поверхности и т.д. Некоторые конкретные примеры включают химическое осаждение из паровой фазы (CVD), нанесение распылением (например, нанесение ультразвуковым распылением), нанесение покрытия методом центрифугирования, окунания или погружения, нанесение покрытия ножевым устройством, нанесение наливом, проточное нанесение покрытия, аэрозольную печать, трафаретную печать, микроконтактную печать, струйную печать или т.п.
[0053] Углубление. Дискретный вогнутый элемент на субстрате или профилированной смоле, имеющий входное отверстие на поверхности, которое по меньшей мере частично окружено промежуточными областями субстрата или профилированной смолы. Углубления могут иметь любую из множества различных форм входного отверстия на поверхности, включая, например, круглую, эллиптическую, квадратную, многоугольную, звездообразную форму (с любым числом вершин) и т.д. Сечение углубления в перпендикулярной поверхности плоскости может быть криволинейным, квадратным, многоугольным, гиперболическим, коническим, угловым и т.д. В качестве примеров углубление может представлять собой лунку или две соединенные друг с другом лунки. Углубление может также иметь и более сложную архитектуру, включая ребра, ступенчатые элементы и т.д.
[0054] Каждый. Используемый в настоящем документе термин “каждый” применительно к совокупности элементов предназначен для обозначения отдельного элемента в данной совокупности, но не обязательно относится к каждому элементу в данной совокупности. Исключения могут возникать, если явное описание или контекст однозначно определяет иное.
[0055] Внешний иммобилизующий агент. Газообразная, жидкая или вязкая среда, которая не смешивается с комплексом, введенным в проточную кювету. Газообразный внешний иммобилизующий агент можно использовать для создания капли вокруг комплекса или образца. Примером газообразного внешнего иммобилизующего агента является воздух, который с приемлемой скоростью потока направляется через проточную кювету. Например, воздух можно использовать для аспирации текучей среды из проточной кюветы, что приводит к образованию капель жидкости вокруг комплексов, иммобилизованных внутри проточной кюветы. Сформированная капля действует как диффузионный барьер. Жидкую или вязкую среду используют для сведения к минимуму диффузии библиотеки секвенирования, высвобожденной из комплекса. Внешний иммобилизующий агент может образовывать диффузионный барьер, поскольку библиотеки секвенирования или любые другие полинуклеотиды практически не сольватируются во внешнем иммобилизующем агенте. Примеры внешних иммобилизующих агентов в жидкой форме включают гидрофобные масла, такие как минеральное масло, силиконовое масло, перфторированное масло, фторуглеродное масло (например, FC40) или их комбинация. Примеры внешних иммобилизующих агентов в форме вязкой среды включают буферы, содержащие полимеры (например, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон и т.п.), декстран, сахарозу, глицерин и т.п. В некоторых примерах вязкая среда представляет собой термочувствительный гель. Термочувствительный гель является невязким при температурах, не используемых при посеве, и превращается в вязкую среду при температурах посева. Примеры термочувствительных гелей включают поли(N-изопропилакриламид) и композиты-наночастицы из полиэтиленоксид-полипропиленоксид-полиэтиленоксида (ПЭО-ППО-ПЭО)/лапонита.
[0056] Проточная кювета. Сосуд, имеющий камеру (например, проточный канал), в котором может осуществляться реакция, входное отверстие для подачи реагента (-ов) в камеру и выходное отверстие для удаления реагента (-ов) из камеры. В некоторых примерах камера позволяет вести детекцию реакции, которая протекает в камере. Например, камера может включать одну или более прозрачных поверхностей, позволяющих вести оптическую детекцию массивов, оптически меченых молекул или т.п.
[0057] Проточный канал. Область, созданная между двумя склеенными или иным образом скрепленными компонентами, в которую может селективно поступать жидкий образец. В некоторых примерах проточный канал может быть создан между двумя профилированными или непрофилированными поверхностями для секвенирования и, таким образом, может находиться в соединении по текучей среде с одним или более компонентами поверхностей для секвенирования.
[0058] Фрагмент. Участок или часть генетического материала (например, ДНК, РНК и т.д.). Фрагменты из библиотеки с сохраненной непрерывностью представляют собой более мелкие части образца нуклеиновой кислоты большей длины, который был фрагментирован, где информация о смежности расположения фрагментов в нуклеиновой кислоте большей длины была сохранена во фрагментах.
[0059] Молекула или образец нуклеиновой кислоты. Представляет собой полимерную форму нуклеотидов любой длины и может включать рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, их аналоги или их смеси. Термин может относиться к одноцепочечным или двухцепочечным полинуклеотидам.
[0060] Термин “матричная” молекула (или цепь) нуклеиновой кислоты может относиться к анализируемой последовательности. Кластер темплатных цепей включает ампликоны фрагмента из библиотеки.
[0061] Нуклеотиды в образце нуклеиновой кислоты могут включать нуклеиновые кислоты природного происхождения и их функциональные аналоги. Примеры функциональных аналогов способны гибридизироваться с нуклеиновой кислотой специфичным для последовательности образом, или их можно использовать в качестве темплата для репликации конкретной нуклеотидной последовательности. Нуклеотиды природного происхождения обычно имеют каркас, содержащий фосфодиэфирные связи. Структура аналога может иметь альтернативную каркасную связь, в том числе любую из множества известных в данной области. Нуклеотиды природного происхождения обычно содержат сахар дезоксирибозу (например, присутствующую в ДНК) или сахар рибозу (например, присутствующую в РНК). Структура аналога может иметь альтернативную сахарную функциональную группу, в том числе любую из множества известных в данной области. Нуклеотиды могут включать природные или неприродные основания. Природная ДНК может включать один или более из аденина, тимина, цитозина и/или гуанина, а природная РНК может включать один или более из аденина, урацила, цитозина и/или гуанина. Можно использовать любое неприродное основание, такое как запертая нуклеиновая кислота (ЗНК) и мостиковая нуклеиновая кислота (МНК).
[0062] Праймер. Молекула нуклеиновой кислоты, которая может гибридизироваться с целевой последовательностью, такой как адаптер, присоединенный к фрагменту из библиотеки. Например, праймер для амплификации может служить отправной точкой для амплификации темплата и генерации кластеров. В другом примере синтезированная цепь нуклеиновой кислоты (темплат) может включать сайт, с которым может гибридизироваться праймер (например, праймер для секвенирования), чтобы праймировать синтез новой цепи, комплементарной к синтезированной цепи нуклеиновой кислоты. Любой праймер может включать любую комбинацию нуклеотидов или их аналогов. В некоторых примерах праймер представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид или полинуклеотид. Длина праймера может иметь любое число оснований и может включать различные неприродные нуклеотиды. В примере праймер для секвенирования представляет собой короткую цепь, имеющую длину в диапазоне от 10 до 60 оснований или от 20 до 40 оснований.
[0063] Готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот. Участок генетического материала, имеющий адаптеры на 3'- и 5'-концах. В готовом к секвенированию фрагменте нуклеиновой кислоты каждый адаптер включает известную универсальную последовательность (например, комплементарную к или идентичную по меньшей мере участку праймера на проточной кювете) и последовательность праймера для секвенирования. Оба адаптера могут также включать индексную последовательность (штрихкод или метку). В одном примере одна сторона (например, включающая последовательность Р5' или Р5) может содержать индекс гранулы, а другая сторона (включающая последовательность Р7 или Р7') может содержать индекс образца. Готовый к секвенированию фрагмент нуклеиновых кислот может быть связан с твердой подложкой путем вставки транспозонов, где вставленные молекулы ДНК иммобилизируются на поверхность твердой подложки (например, гранулы); или непосредственно иммобилизован через связывающуюся пару или иной расщепляемый линкер; или связан путем гибридизации, где на поверхности твердой подложки присутствуют комплементарные адаптеру поверхности.
[0064] Поверхность для секвенирования. Поверхность проточной кюветы, где происходит секвенирование. В некоторых примерах поверхность для секвенирования включает полимерный гидрогель, на который привит один или более типов праймеров для амплификации. В таких примерах поверхность для секвенирования может также включать захватный сайт для иммобилизации комплексов у или вблизи праймеров для амплификации. В других примерах поверхность для секвенирования включает захватные сайты для иммобилизации кластеризованных твердых подложек.
[0065] Твердая подложка. Небольшой объект, имеющий форму, описываемую, например, как сфера, овал, микросфера, или другую принятую форму частиц с симметричными или несимметричными размерами. В некоторых примерах твердая подложка может иметь прикрепленную к ней библиотеку секвенирования. В других примерах твердая подложка может иметь прикрепленный к ней кластер темплатных цепей.
[0066] Целевой материал. Любое вещество, которое следует иммобилизировать на поверхности проточной кюветы.
[0067] Транспосома. Комплекс, образованный из интегрирующего фермента (например, интегразы или транспозазы) и нуклеиновой кислоты, включая сайт распознавания интеграции (например, сайт распознавания транспозазы).
[0068] В описываемых в настоящем документе примерах целевые материалы вводят в проточную кювету, которая содержит две противоположные поверхности для секвенирования. Ниже будут описаны целевые материалы и проточная кювета, с последующим приведением различных примеров способов для иммобилизации целевых материалов на каждой из двух противоположных поверхностей для секвенирования
[0069] Целевые материалы
[0070] Примеры целевых материалов 11 представлены на Фиг. 1А-1С. В описываемых в настоящем документе примерах можно использовать любой целевой материал 11, который требуется иммобилизовать на поверхности проточной кюветы. В качестве примеров целевой материал 11 может представлять собой комплекс 10А, 10В согласно приведенному в настоящем документе определению (см. Фиг. 1А и Фиг. 1В), кластеризованную твердую подложку 13 согласно приведенному в настоящем документе определению (см. Фиг. 1С), другие библиотеки ДНК из конкретного образца, клетки, конъюгированные с олигонуклеотидом белки, связанные с твердыми подложками, белковый биомаркер, микробному или т.п. В приведенном ниже описании представлены некоторые примеры комплексов 10А, 10В и кластеризованной твердой подложки 13.
[0071] Комплексы
[0072] Некоторые примеры комплексов 10А и 10В представлены на Фиг. 1А и Фиг. 1В соответственно. В примерах описываемого в настоящем документе способа комплексы 10А, 10В включают твердую подложку 12, 12' и готовые к секвенированию фрагменты 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот, прикрепленные к твердой подложке 12, 12'.
[0073] В тех примерах способа, где используют комбинацию текучих сред, имеющих разные плотности, или целевых материалов 11 с разными плотностями, или незаряженные целевые материалы 11, твердая подложка 12, без ограничений, может представлять собой гидрогели; стекло (например, стеклянные гранулы с контролируемой пористостью); пластик, такой как акрил, полистирол или сополимер стирола и другого материала, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретан или политетрафторэтилен (TEFLON® производства The Chemours Со); полисахариды или сшитые полисахариды, такие как агароза, гранулы SEPHAROSE® (гранулированная сшитая форма агарозы, поставляемая компанией Cytivia) или гранулы SEPHADEX® (гранулированная сшитая форма декстрана, поставляемая компанией Cytivia); нейлон; нитроцеллюлозу; смолу; кремнезем или материалы на основе кремнезема, включая кремний и модифицированный кремний; углеродное волокно; металл; неорганическое стекло; волоконно-оптический жгут; или множество иных полимеров. Некоторые примеры твердой подложки 12 могут иметь форму сплошных гранул, пористых гранул или пустотелых гранул.
[0074] В тех примерах способа, где используют комбинацию текучей среды и магнитной силы, твердая подложка 12' представляет собой магнитно-восприимчивый материал. ''Магнитно-восприимчивый материал'' восприимчив к магнитному полю. Примеры магнитно-восприимчивых твердых подложек включают в себя или состоят из магнитно-восприимчивых материалов. Примеры магнитно-восприимчивых материалов включают в себя парамагнитные материалы, ферромагнитные материалы, ферримагнитные материалы и метамагнитные материалы. Примеры соответствующих парамагнитных материалов включают в себя железо, никель и кобальт, а также оксиды металлов, такие как Fe3O4, BaFe12O19, СоО, NiO, Mn2O3, Cr2O3 и CoMnP. Один доступный в продаже пример включает DYNABEADS™ М-280 Streptavidin (суперпарамагнитные гранулы, покрытые стрептавидином) от компании Thermo Fisher Scientific. В некоторых примерах магнитно-восприимчивый материал помещен в оболочку полимерной гранулы. В других примерах магнитно-восприимчивый материал находится в форме гранулы и покрыт пассивирующим материалом, таким как оксид кремния или нитрит кремния. В тех примерах способа, где используют два различных целевых материала 11, один из целевых материалов 11 может включать в себя любую из описываемых в настоящем документе магнитно-восприимчивых твердых подложек 12'.
[0075] В тех примерах способа, где для иммобилизации используют электрическое поле, твердая подложка 12 целевого материала 11 может быть положительно заряжена или отрицательно заряжена. В таких примерах можно использовать любые из описанных примеров твердых подложек 12, которые могут быть покрыты или функционализированы для придания им требуемого заряда. Для придания заряда твердой подложке 12 можно использовать либо малые молекулы, либо полимеры. Например, любую из твердых подложек 12 (например, полистирол, кремнезем и т.д.) можно функционализировать аминами для придания им положительного заряда. Можно использовать любой первичный, вторичный или третичный амин. Примеры соответствующих аминов включают в себя аминосилан, полилизин и хитозан. В качестве другого примера любую из твердых подложек 12 (например, полистирол, кремнезем, SEPHADEX® и т.д.) можно функционализировать карбоксильными группами или сульфатными группами для придания ей отрицательного заряда. В качестве еще одного примера любую из твердых подложек 12 (например, полистирол, кремнезем, SEPHADEX® и т.д.) можно покрыть полиглутаминовой кислотой для придания ей отрицательного заряда.
[0076] Хотя это не показано на Фиг. 1А и Фиг. 1В, твердую подложку 12, 12' можно функционализировать одним элементом связывающейся пары. “Связывающаяся пара” означает два агента (например, материалы, молекулы, фрагменты), которые способны присоединяться друг к другу. В данном примере элемент на твердой подложке 12, 12' образует связывающуюся пару с другим элементом, который находится на поверхности для секвенирования проточной кюветы. В других примерах твердая подложка 12, 12' может позволять химическое конъюгирование с поверхностью для секвенирования проточной кюветы.
[0077] Функционализация твердой подложки 12, 12' может включать покрытие твердой подложки 12, 12' элементом связывающейся пары или образование связи между элементом связывающейся пары и функциональной группой на поверхности твердой подложки 12, 12'. Одним примером элемента связывающейся пары является элемент связывающейся пары рецептор-лиганд (например, авидин, стрептавидин, биотин, лектин, углевод, связывающийся с нуклеиновой кислотой белок, эпитоп, антитело и т.д.), способный связываться с другим элементом связывающейся пары, который находится на поверхности для секвенирования проточной кюветы. Элементами связывающейся пары также могут быть химические реагенты, которые способны образовывать электростатическое взаимодействие, водородную связь или ковалентную связь (например, по механизму тиол-дисульфидного обмена, клик-химии, реакции Дильса-Альдера и т.д.). Твердая подложка 12, 12' также может прикрепляться к поверхности для секвенирования проточной кюветы с использованием любой формы химического связывания. Во многих случаях желательно иметь обратимое или расщепляемое взаимодействие, чтобы твердую подложку 12, 12' можно было удалить перед секвенированием.
[0078] В примерах комплекса 10А, 10В готовые к секвенированию фрагменты 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот прикреплены к твердой подложке 12, 12'. Каждый готовый к секвенированию фрагмент 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот включает часть (например, фрагмент 16, 16', 16'') более длинного участка генетического материала, которая имеет адаптеры (например, 18, 18', 18'', 22, 22', 22'') на своих 3'-и 5'-концах. Готовые к секвенированию фрагменты 14, 14', 14'' можно приготовить с использованием любой методики подготовки библиотеки, в которой производят фрагментирование генетического материала более длинного участка и введение требуемых адаптеров 18, 18', 18'', 22, 22', 22'' на концах фрагментов 16, 16', 16''. Некоторые соответствующие методики подготовки библиотек описаны с отсылкой к Фиг. 1А и Фиг. 1В. Однако следует понимать, что можно также использовать и другие методики подготовки библиотек.
[0079] На Фиг. 1А изображен пример комплекса 10А, включающего готовые к секвенированию фрагменты 14, 14' нуклеиновых кислот, которые включают фрагменты 16, 16' из образца большей нуклеиновой кислоты, непрерывность которого сохраняется на твердой подложке 12, 12'. Хотя в настоящем документе описан пример способа получения комплекса 10А, следует понимать, что могут применяться и другие способы, при условии, что готовые к секвенированию фрагменты 14, 14' нуклеиновых кислот прикреплены к твердой подложке 12, 12'.
[0080] В одном примере способа для образования комплекса 10А, показанного на Фиг. 1, последовательность 18, 18' адаптера связывается с твердой подложкой 12, 12' через один элемент 20 связывающейся пары. В примере данная последовательность 18, 18' адаптера может включать первую последовательность праймера для секвенирования (например, последовательность праймера для секвенирования чтения 1) и первую последовательность (Р5'), которая комплементарна по меньшей мере части одного из праймеров для амплификации (например, Р5) на проточной кювете (показано на Фиг. 2А, Фиг. 2В и Фиг. 2С). Эта последовательность 18, 18' адаптера может также включать индексную или штрихкодовую последовательность. Последовательность 18, 18' адаптера связана с одним элементом 20 связывающейся пары (например, биотином), так что она может связываться с поверхностью твердой подложки 12, 12', которая содержит второй другой элемент (например, авидин, стрептавидин и т.д.) связывающейся пары. В данном примере элемент связывающейся пары на твердой подложке 12, 12' может быть многофункциональным в том отношении, что он может i) связываться с элементом 20, используемым для присоединения готовых к секвенированию фрагментов 14, 14' нуклеиновых кислот, и ii) связываться с поверхностью для секвенирования проточной кюветы. В других примерах твердая подложка 12, 12' может быть функционализирована двумя разными элементами связывающейся пары, например, i) один из них может связываться с элементом 20, используемым для присоединения готовых к секвенированию фрагментов 14, 14' нуклеиновых кислот, а ii) второй из них может связываться с поверхностью для секвенирования проточной кюветы.
[0081] В данном примере на начальной стадии способа подготовки библиотеки с твердой подложкой 12, 12' также может быть связан транспосомный комплекс (не показан). Перед загрузкой транспосомного комплекса на твердую подложку 12, 12', частичный Y-адаптер можно смешать с ферментом транспозазы (например, включая две молекулы Tn5) с образованием транспосомного комплекса. Частичный Y-адаптер может включать две мозаичные концевые последовательности, которые гибридизируются друг с другом. Одна из мозаичных концевых последовательностей называется свободной мозаичной концевой последовательностью, поскольку она имеет два свободных конца, например, один конец, способный присоединиться к адаптеру 18, 18', и второй, способный присоединиться к фрагментированным цепям 16, 16' ДНК в процессе тагментирования. Другая из мозаичных концевых последовательностей может быть присоединена к другому адаптеру (например, 22, 22'), который включает вторую последовательность праймера для секвенирования (например, последовательность праймера для секвенирования чтения 2) и вторую последовательность (Р7), которая комплементарна по меньшей мере части другого из праймеров для амплификации (Р7) на проточной кювете. В процессе амплификации идентичная последовательность позволяет формировать копию, которая комплементарна по меньшей мере части другого из праймеров для амплификации (Р7) на проточной кювете. Последовательности 22, 22' адаптера не присоединяются в фрагментированным цепям 16, 16' ДНК в процессе тагментации.
[0082] Загрузка транспосомного комплекса на твердую подложку 12, 12' может включать смешивание транспосомного комплекса с твердой подложкой 12, 12' и воздействие на смесь соответствующих условий для лигирования одного из свободных концов свободного мозаичного конца с 3'-концом последовательности 18, 18' адаптера. К каждой из последовательностей 18, 18' адаптера на твердой подложке 12, 12' может быть присоединен отдельный транспосомный комплекс.
[0083] В этом примере способа образования комплекса 10А затем может быть выполнен процесс тагментации. Текучую среду (например, буфер для тагментации), включающую образец нуклеиновой кислоты большей длины (например, ДНК), можно добавить к твердой подложке 12, 12', с которой связаны последовательность 18, 18' адаптера и транспосомные комплексы. При контактировании образца с транспосомными комплексами образец нуклеиновой кислоты большей длины тагментируется. Образец нуклеиновой кислоты большей длины фрагментируется на фрагменты 16, 16', каждый из которых снабжен меткой на своем 5'-конце, частичным Y-адаптером (например, путем лигирования другого свободного конца свободной мозаичной концевой последовательности). Последовательная тагментация образца нуклеиновой кислоты большей длины приводит к образованию множества мостиковых молекул между транспосомными комплексами. Мостиковые молекулы охватывают твердую подложку 12, 12'. Транспосомные комплексы поддерживают непрерывность образца нуклеиновой кислоты большей длины в виде мостиковых молекул.
[0084] Затем фермент транспозазы можно удалять посредством обработки додецил сульфатом натрия (SDS) или нагреванием или расщеплением протеиназой K. После удаления ферментов транспозазы остаются фрагменты 16, 16' из библиотеки с сохраненной непрерывностью, прикрепленные к твердой подложке 12, 12'.
[0085] Для получения готовых к секвенированию фрагментов 14, 14' выполняют дополнительное удлинение и лигирование, чтобы присоединить фрагменты 16, 16' образца к последовательностям 22 и 22'. Полученный комплекс 10А показан на Фиг. 1А.
[0086] Каждый готовый к секвенированию фрагмент 14, 14' нуклеиновых кислот включает фрагмент 16, 16' из библиотеки с сохраненной непрерывностью, к каждому концу которого присоединены соответствующие последовательности 18 и 22 или 18' и 22' адаптера. Последовательности 18, 18' адаптера являются последовательностями, изначально связанными с твердой подложкой 12, 12', и включают первую последовательность праймера для секвенирования и первую последовательность, комплементарную одному из праймеров проточной кюветы. Последовательности 18, 18' адаптера присоединены к одному элементу 20 связывающейся пары. Последовательности 22, 22' адаптера получены от частичного Y-адаптера и включают вторую последовательность, идентичную другому праймеру проточной кюветы и второй последовательности праймера для секвенирования. Поскольку каждый готовый к секвенированию фрагмент 14, 14' нуклеиновых кислот включает соответствующие адаптеры для амплификации (например, мостиковой амплификации) и секвенирования, ПЦР-амплификация не выполняется. Таким образом, эти фрагменты 14, 14' готовы к секвенированию. Более того, поскольку фрагменты 16, 16' из библиотеки с сохраненной непрерывностью получены из одного и того же образца нуклеиновой кислоты большей длины, непрерывность исходного образца сохраняется, и фрагменты 14, 14' из библиотеки можно использовать для приложений со связанными длинными чтениями.
[0087] На Фиг. 1В проиллюстрирован другой комплекс 10В, который включает твердую подложку 12, 12' и готовые к секвенированию фрагменты 14'' нуклеиновых кислот, прикрепленные к твердой подложке 12, 12'. В одном примере в пробирке создают нуклеотидную библиотеку без ПЦР, а затем библиотеку гибридизируют в пробирке с твердой подложкой 12, 12'. В показанном на Фиг. 1В примере адаптеры 18'', 22'' добавляют к фрагментам 16'' из библиотеки в пробирке, имеющие один элемент 20 связывающейся пары праймеры гибридизируют с адаптерами 18'' в пробирке, а затем готовые к секвенированию фрагменты 14'' нуклеиновых кислот связывают с твердой подложкой 12, 12' через элемент 20 связывающейся пары. В другом примере твердая подложка 12, 12' может иметь праймеры, прикрепленные к ней через связывающуюся пару (например, авидин на подложке 12, 12' и биотин, присоединенный к праймеру). Эти праймеры гибридизируют с адаптерами 18'', присоединенными к фрагментам 16'' из библиотеки (и, таким образом, праймер и элемент связывающейся пары находятся на одном конце фрагментов, а не на другом). В другом примере удлинение может быть выполнено с использованием замещающего цепь фермента. Это приведет к получению полностью двухцепочечной библиотеки (например, без вилки или Y-адаптера, как показано на Фиг. 1В).
[0088] Как отмечалось, можно также использовать и другие методики подготовки библиотеки. Например, можно использовать методики подготовки библиотеки на основе лигирования, где на проточной кювете иммобилизируют комплементарные адаптеру поверхности. В другом примере на твердой подложке 12, 12' можно иммобилизовать мРНК через гибридизацию поли-А хвоста.
[0089] Кластеризованные твердые подложки
[0090] Пример кластеризованной твердой подложки 13 показан на Фиг. 1С. Кластеризованная твердая подложка 13 включает твердую подложку 12, 12' и темплатные цепи 64, прикрепленные к твердой подложке 12, 12' через праймер 42 или 42'.
[0091] Любой пример твердой подложки 12, 12' можно использовать в качестве ядра кластеризованной твердой подложки 13. Тип твердой подложки 12, 12' и ее свойство/свойства (например, плотность, заряд, магнитность и т.д.) могут зависеть от выбранного для использования способа иммобилизации.
[0092] Хотя это не показано на Фиг. 1С, и аналогично комплексам 10А и 10В, показанным на Фиг. 1А и Фиг. 1В, твердая подложка 12, 12' может быть функционализирована одним элементом связывающейся пары для прикрепления к захватному сайту проточной кюветы.
[0093] Как показано на Фиг. 1С, данный пример твердой подложки 12, 12' функуионализирован праймерами 42, 42'. Праймеры 42, 42' могут представлять собой праймеры 42, 42' для амплификации, которые могут быть иммобилизованы на твердой подложке 12, 12' одноточечным ковалентным прикреплением или сильным нековалентным взаимодействием на или вблизи 5'-конца праймеров 42, 42'. Данное прикрепление оставляет i) специфичный для адаптера участок праймеров 42, 42' свободным для отжига с распознаваемым им готовым к секвенированию фрагментом нуклеиновых кислот и ii) 3'-гидроксильную группу свободной для удлинения праймера. На 5'-конце или вблизи него праймер 42, 42' включает химически модифицируемую функциональную группу, которая способна к ковалентному прикреплению или сильному нековалентному взаимодействию. Примеры химически модифицируемых функциональных групп включают в себя тиол, азидо, алкин, амино, биотин и т.д.
[0094] Конкретные примеры соответствующих праймеров 42, 42 включают праймеры Р5 и Р7, используемые на поверхности доступных в продаже проточных кювет, продаваемых компанией Illumina Inc., для секвенирования на приборах HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NEXTSEQ™, NEXTSEQDX™, NOVASEQ™, GENOME ANALYZER™, ISEQ™ и других инструментальных платформах. Оба праймера Р5 и Р7 могут быть привиты на каждую из твердых подложек 12, 12'.
[0095] В одном примере прививка праймеров 42, 42' на твердую подложку 12, 12' может включать нанесение окунанием, что включает погружение твердой подложки 12, 12' в раствор праймера или смесь, которая может включать праймеры 42, 42', воду, буфер и катализатор. Другие методики прививки могут включать нанесение распылением, нанесение наливом или иной соответствующий способ, который обеспечит прикрепление праймера (-ов) 42, 42' к твердой подложке 12, 12'. При любом способе прививки праймеры 42, 42' реагируют с реакционной группой твердой подложки 12, 12'.
[0096] В процессе прививки химически модифицируемая функциональная группа праймеров 42, 42' реагирует или взаимодействует с реакционной группой твердой подложки 12, 12'. Ниже приведены примеры реакций или взаимодействий, которые могут происходить в процессе прививки: реакция праймера с терминальной азидо-группой (например, сукцинимидиловый (NHS) эфир) с гидразином на поверхности твердой подложки 12, 12', или реакция праймера с терминальной алкино-группой с азидом на поверхности твердой подложки 12, 12', или реакция праймера с терминальной амино-группой с активированной карбоксилатной группой или NHS эфиром на поверхности твердой подложки 12, 12', или реакция праймера с терминальной тиольной группой с алкилирующим реагентом (например, иодоацетамином или мелеимидом) на поверхности твердой подложки 12, 12', или реакция праймера с терминальной фосфорамидитной группой с тиоэфиром на поверхности твердой подложки 12, 12', или взаимодействие модифицированного биотином праймера со стрептавидином на поверхности твердой подложки 12, 12'. Некоторые нуклеотидные праймеры 42, 42' могут быть захвачены на гранулы из кремнезема в присутствии хаотропного агента (KI, NI или NaSCN). В качестве одного конкретного примера праймер с терминальным дибензоциклооктином (DBCO, который включает алкин) можно использовать для не требующей меди клик-химической прививки.
[0097] Для получения темплатных цепей 64 на твердой подложке 12, 12' сначала могут быть приготовлены библиотечные темплаты из любого образца нуклеиновой кислоты (например, образца ДНК или образца РНК). При использовании образца РНК его сначала конвертируют в образец комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК). Это можно сделать с использованием обратной транскрипции, при которой используют фермент обратной транскриптазы. В некоторых примерах используют набор для обратной транскрипции и синтеза второй цепи. В таких примерах можно использовать набор для высокопроизводительной обратной транскрипции кДНК от компании ThermoFisher Scientific. В других примерах используют набор для обратной транскрипции и темплатного переключения (для второй цепи). В таких примерах можно использовать смесь ферментов для обратной транскрипции с темплатным переключением от компании New England Biolabs.
[0098] Образец ДНК или кДНК затем можно фрагментировать в одноцепочечные фрагменты близкой длины (например, <1000 п.о.). В процессе подготовки к концам этих фрагментов могут быть добавлены адаптеры. Используя амплификацию с уменьшенным циклом, в адаптеры можно ввести различные мотивы, такие как сайты связывания для секвенирования, индексы и области, которые комплементарны или идентичны праймерам 42, 42' на твердой подложке 12, 12'. Готовые библиотечные темплаты включают фрагменты ДНК или кДНК и адаптеры на обоих концах. В некоторых примерах к фрагментам одного образца нуклеиновой кислоты добавляют одни и те же адаптеры.
[0099] Множество библиотечных темплатов можно добавить к множеству твердых подложек 12, 12'. Библиотечный темплат гибридизируется с одним из двух типов праймеров 42, 42', иммобилизованных на соответствующей твердой подложке 12, 12'. Затем можно выполнить генерирование кластеров. В одном примере генерирования кластеров библиотечный темплат на твердой подложке 12, 12' копируется, начиная с гибридизированного праймера путем удлинения с 3'-конца с использованием высокоточной ДНК-полимеразы. Исходный библиотечный темплат денатурируют, оставляя копию (например, темплатную цепь 64) иммобилизованной на твердой подложке 12, 12', например, через праймер 42, как показано на Фиг. 1С. Для амплификации иммобилизованных копий можно использовать изотермическую мостиковую амплификацию или некоторую другую форму амплификации. Например, скопированный темплат образует петлю и гибридизируется со смежным комплементарным праймером (например, праймером 42'), и полимераза копирует скопированный темплат с образованием двухцепочечного мостика, который денатурируют с образованием двух одноцепочечных цепей. Эти две цепи образуют петли и гибридизируются со смежными комплементарными праймерами 42, 42, а затем снова удлиняются с образованием двух новых двухцепочечных петель. Процесс повторяют на каждой копии темплата в циклах изотермической денатурации и амплификации с получением плотных клональных кластеров. Каждый кластер двухцепочечных мостиков денатурируют. В примере обратную цепь удаляют посредством специфического расщепления оснований, в результате чего остаются шаблонные полинуклеотидные цепи прямого направления. Кластеризация приводит к образованию нескольких темплатных полинуклеотидных цепей 64 на твердой подложке 12, 12'. Данный пример кластеризации является мостиковой амплификацией и представляет собой один из примеров проводимой амплификации.
[0100] Проточная кювета
[0101] На Фиг. 2А показан вид сверху примера проточной кюветы 24. Как отмечалось в настоящем документе, проточная кювета 24 включает две противоположные поверхности для секвенирования. Пример непрофилированных поверхностей 30, 30' для секвенирования показан на Фиг. 2В, пример профилированных поверхностей 32, 32' для секвенирования показан на Фиг. 2С, и другой пример профилированных поверхностей 31, 31' для секвенирования показан на Фиг. 2D. Непрофилированные поверхности 30, 30' для секвенирования и профилированные поверхности 32, 32' для секвенирования включают праймеры 42, 42', и тем самым их можно использовать с целевыми материалами 11, которые вводят фрагменты из библиотеки, которые для амплификации на проточной кювете 24. Другие поверхности для секвенирования, такие как профилированные поверхности 31, 31' для секвенирования, не включают праймеры 42, 42', и тем самым их можно использовать с кластеризованными твердыми подложками 13.
[0102] Каждая поверхность 30, 30' или 32, 32' или 31, 31' для секвенирования поддерживается субстратом (показан в общем виде как 26 на Фиг. 2А), а между поверхностями 30, 30' или 32, 32' или 31, 31' для секвенирования создан проточный канал (показан в общем виде как 28 на Фиг. 2А)
[0103] Субстрат 26 может представлять собой один слой/материал. Примеры однослойного субстрата показаны на Фиг. 2В под порядковыми номерами 26А и 26А'. Примеры соответствующих однослойных субстратов 26А, 26А' включают эпоксисилоксан, стекло, модифицированное или функционализированное стекло, пластмассы (включая акрилы, полистирол и сополимеры стирола и других материалов, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, политетрафторэтилен (например, TEFLON® производства компании Chemours), циклические олефины/циклоолефиновые полимеры (СОР) (например, ZEONOR® производства компании Zeon), полиимиды и т.п.), нейлон (полиамиды), керамику/оксидную керамику, кварц, плавленый кварц или материалы на основе кварца, силикат алюминия, кремний и модифицированный кремний (например, легированный бором кремний р+), нитрид кремния (Si3N4), оксид кремния (SiO2), пентоксид тантала (Ta2O5) или другой (-ие) оксид (-ы) тантала (ТаОх), оксид гафния (НаО2), углерод, металлы, неорганические стекла или т.п.
[0104] Субстрат 26 может также представлять собой многослойную структуру. Примеры многослойного субстрата показаны под порядковыми номерами 26В и 26В' на Фиг. 2С и Фиг. 2D. Некоторые примеры многослойной структуры 26В, 26В' включают стекло или кремний со слоем покрытия из оксида тантала или другого керамического оксида на поверхности. Как показано конкретно на Фиг. 2С и Фиг. 2D, другие примеры многослойной структуры 26В, 26В' включают несущую подложку 34, 34', на которую нанесен профилированный слой смолы 36, 36'. Другие примеры многослойного субстрата 26В, 26В' могут включать субстрат типа “кремний на изоляторе” (SOI).
[0105] В одном примере субстрат 26 (однослойный или многослойный) может иметь диаметр в диапазоне от около 2 мм до около 300 мм или представлять собой прямоугольный лист или панель, наибольший размер которой составляет до около 10 футов (~ 3 метра). В одном примере субстрат 26 представляет собой пластину с диаметром в диапазоне от около 200 мм до около 300 мм. В качестве другого примера субстрат 26 представляет собой кристалл с шириной в диапазоне от около 0,1 мм до около 10 мм. Хотя приведены примеры размеров, следует понимать, что можно использовать субстрат 26 любых приемлемых размеров. В другом примере можно использовать панель, представляющую собой прямоугольную подложку, имеющую большую площадь поверхности, чем круглая пластина диаметром 300 мм.
[0106] В примере, показанном на Фиг. 2А, проточная кювета 24 включает проточные каналы 28. Хотя показано несколько проточных каналов 28, следует понимать, что в проточную кювету 24 может быть включено любое количество каналов 28 (например, один канал 28, четыре канала 28 и т.д.). В описываемых в настоящем документе примерах каждый проточный канал 28 представляет собой область, ограниченную двумя поверхностями для секвенирования (например, 30 и 30' или 32 и 32' или 31 и 31') и двумя прикрепленными субстратами (например, 26А и 26А' или 26В и 26В'). Описываемые в настоящем документе текучие среды могут вводиться и выводиться из проточного (-ых) канала (-ов) 28 через входные и выходные отверстия соответственно. Каждый проточный канал 28 может быть изолирован от другого проточного канала 28 в проточной кювете 24 таким образом, что текучая среда, введенная в любой конкретный проточный канал 28, не протекает в любой смежный проточный канал 28.
[0107] Часть проточного канала 28 может быть образована в субстрате 26 с использованием любого соответствующего способа, который частично зависит от материала (-ов) субстрата 26. В одном примере проточный канал 28 вытравлен в стеклянном субстрате 26. В другом примере часть проточного канала 28 может быть создана профилированием в слое смолы 36, 36' многослойного субстрата 26В, 26В' с использованием фотолитографии, наноимпринтной литографии и т.д. В еще одном примере на субстрат 26 можно нанести отдельный материал (например, материал 50 на Фиг. 2В и Фиг. 2С и Фиг. 2D) таким образом, чтобы отдельный материал задавал по меньшей мере часть стенок проточного канала 28.
[0108] В одном примере проточный канал 28 имеет прямоугольную конфигурацию. Длина и ширина проточного канала 28 могут быть соответственно меньше длины и ширины субстрата 26 так, что часть поверхности субстрата, окружающая проточный канал 28, доступна для прикрепления к другому субстрату 26. В некоторых случаях ширина каждого проточного канала 28 может составлять по меньшей мере около 1 мм, по меньшей мере около 2,5 мм, по меньшей мере около 5 мм, по меньшей мере около 7 мм, по меньшей мере около 10 мм или более. В некоторых случаях длина каждого проточного канала 28 может составлять по меньшей мере около 10 мм, по меньшей мере около 25 мм, по меньшей мере около 50 мм, по меньшей мере около 100 мм или более. Ширина и/или длина каждого проточного канала 28 может быть больше, меньше вышеуказанных значений или может иметь промежуточное значение. В другом примере проточный канал 28 имеет квадратную форму (например, 10 мм × 10 мм).
[0109] Глубина каждого проточного канала 28 может составлять всего несколько монослоев, например, при использовании микроконтактной, аэрозольной или струйной печати для нанесения отдельного материала (например, материала 50), который образует стенки проточного канала. В других примерах глубина каждого проточного канала 28 может составлять около 1 мкм, около 10 мкм, около 50 мкм, около 100 мкм или более. В примере глубина может находиться в диапазоне от около 10 мкм до около 100 мкм. В другом примере глубина составляет около 5 мкм или менее. Следует понимать, что глубина каждого проточного канала 28 может быть больше, меньше вышеуказанных значений или может иметь промежуточное значение. Глубина проточного канала 28 также может варьироваться по длине и ширине проточной кюветы 24, например, при использовании профилированной поверхности 32, 32' или 31, 31' для секвенирования.
[0110] На Фиг. 2В показан вид в сечении проточной кюветы 24, включающей непрофилированные противоположные поверхности 30, 30' для секвенирования. В одном примере каждая из данных поверхностей 30, 30' может быть получена на субстрате 26А, 26А', а затем субстраты 26А, 26А' могут быть скреплены друг с другом с получением примера проточной кюветы 24. Для соединения вместе субстратов 26А, 26В можно использовать любое соответствующее связующее вещество 50, такое как адгезив, поглощающий излучение материал, способствующий соединению, и т.д.
[0111] В показанном на Фиг. 2В примере часть проточного канала 28 образована в каждом из однослойных субстратов 26А, 26А'. Например, каждый субстрат 26А, 26А' может иметь созданную в нем вогнутую область 38, 38', куда могут вводиться компоненты поверхности 30, 30' для секвенирования. Следует понимать, что любое пространство внутри вогнутой области 38, 38', не занятое компонентами поверхности 30, 30' для секвенирования, можно считать частью проточного канала 28.
[0112] Поверхности 30, 30' для секвенирования включают полимерный гидрогель 40, 40', праймеры 42, 42' для амплификации, прикрепленные к полимерному гидрогелю 40, 40', и сайты 44, 44' химического захвата.
[0113] Пример полимерного гидрогеля 40, 40' включает акриламидный сополимер, такой как сополимер N-(5-азидощетамидилпентил)акриламида и акриламида, PAZAM. PAZAM и некоторые другие формы акриламидного сополимера представлены следующей структурой (I):
где:
RA выбран из группы, состоящей из азидо, необязательно замещенного амино, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного алкина, галогена, необязательно замещенного гидразона, необязательно замещенного гидразина, карбоксила, гидрокси, необязательно замещенного тетразола, необязательно замещенного тетразина, нитрилоксида, нитрона, сульфата и тиола;
RB представляет собой Н или необязательно замещенный алкил;
каждый из RC, RD и RE независимо выбран из группы, состоящей из Н и необязательно замещенного алкила;
каждый из -(СН2)p- может быть необязательно замещенным;
р представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 50;
n представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 50 000; и
m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 100 000.
[0114] Специалисту в данной области будет понятно, что конфигурация повторяющихся элементов n и m в структуре (I) является типичной, а мономерные субъединицы могут присутствовать в любом порядке в структуре полимера (например, случайная, блочная, структурированная форма или их комбинация).
[0115] Молекулярная масса PAZAM и других форм акриламидного сополимера может находиться в диапазоне от около 5 кДа до около 1500 кДа или от около 10 кДа до около 1000 кДа, или может составлять в конкретном примере около 312 кДа.
[0116] В некоторых примерах PAZAM и другие формы акриламидного сополимера являются линейными полимерами. В некоторых других примерах PAZAM и другие формы акриламидного сополимера представляют собой слабо сшитые полимеры.
[0117] В других примерах полимерный гидрогель 40, 40' может представлять собой вариант структуры (I). В одном примере акриламидное звено может быть заменено N,N-диметилакриламидом (). В этом примере акриламидное звено в структуре (I) может быть заменено , где каждый из RD, RE и RF представляет собой Н или алкил C1-С6 алкил, а каждый из RG и RH представляет собой С1-С6 алкил (вместо Н, как в случае с акриламидом). В этом примере q может представлять собой целое число в диапазоне от 1 до 100 000. В другом примере N,N-диметилакриламид можно использовать в дополнение к акриламидному звену. В данном примере структура (I) может включать в дополнение к повторяющимся элементам пит, причем каждый из RD, RE и RF представляет собой Н или С1-С6 алкил, а каждый из RG и RH представляет собой С1-С6 алкил. В этом примере q может представлять собой целое число в диапазоне от 1 до 100 000.
[0118] В качестве другого примера полимерного гидрогеля 40, 40' повторяющийся элемент n в структуре (I) может быть заменен мономером, включающим гетероциклическую азидную группу, имеющую структуру (II):
где R1 представляет собой Н или С1-С6 алкил; R2 представляет собой Н или С1-С6 алкил; L представляет собой линкер, включающий линейную цепь из 2-20 атомов, выбранных из группы, состоящей из углерода, кислорода и азота и 10 необязательных заместителей у углерода и любых атомов азота в цепи; Е представляет собой линейную цепь, включающую от 1 до 4 атомов, выбранных из группы, состоящей из углерода, кислорода и азота и необязательных заместителей у углерода и любых атомов азота в цепи; А представляет собой N-замещенный амид, у которого к N присоединены Н или С1-С4 алкил; и Z представляет собой азотсодержащий гетероцикл. Примеры Z включают 5-10 членов кольца, присутствующих в виде одной циклической структуры или слитой структуры. Некоторые конкретные примеры Z включают пирролидинил, пиридинил или пиримидинил.
[0119] В качестве еще одного примера полимерный гидрогель 40, 40' может включать повторяющееся звено каждой из структур (III) и (IV):
где каждый из R1a, R2a, R1b и R2b независимо выбран из водорода, необязательно замещенного алкила или необязательно замещенного фенила; каждый из R3a и R3b независимо выбран из водорода, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного фенила или необязательно замещенного С7-С14 аралкила; и каждый из L1 и L2 независимо выбран из необязательно замещенного алкиленового линкера или необязательно замещенного гетероалкиленового линкера.
[0120] Следует понимать, что для образования полимерного гидрогеля 40, 40' можно использовать и другие молекулы, при условии, что они функционализированы для прививки к ним олигонуклеотидных праймеров 42, 42'. Другие примеры подходящих полимерных слоев включают слои, имеющие коллоидную структуру, например агароза; или полимерную сетчатую структуру, например желатин; или сшитую полимерную структуру, например полиакриламидные полимеры и сополимеры, не содержащий силанов акриламид (SFA) или азидолизированный вариант SFA. Примеры подходящих полиакриламидных полимеров можно синтезировать из акриламида и акриловой кислоты или акриловой кислоты, содержащей винильную группу, или из мономеров, которые вступают в реакции фотоциклоприсоединения [2+2]. Другие примеры подходящих полимерных гидрогелей 42 включают смешанные сополимеры акриламидов и акрилатов. В описанных в настоящем документе примерах можно использовать различные архитектуры полимеров, содержащие акриловые мономеры (например, акриламиды, акрилаты и т.п.), такие как разветвленные полимеры, включая звездчатые полимеры, звездообразные или звездчатые блок-полимеры, дендримеры и т.п. Например, мономеры (например, акриламид и т.д.) могут быть встроены, либо случайным образом, либо блоком, в ветви (фрагменты) звездообразного полимера.
[0121] Для введения полимерного гидрогеля 40, 40' в вогнутые области 38, 38' можно получить смесь полимерного гидрогеля 40, 40' и затем нанести ее на соответствующие субстраты 26А, 26А' (с созданными в них вогнутыми областями 38, 38'). В одном примере полимерный гидрогель 40, 40' может присутствовать в смеси (например, с водой или с этанолом и водой). Затем смесь можно нанести на соответствующие поверхности субстрата (включая вогнутые области 38, 38') при нанесении центрифугированием, или нанесении погружением, или с потоком материала при положительном или отрицательном давлении, или с использованием другой соответствующей методики. Эти типы методик неселективно наносят полимерный гидрогель 40, 40' на соответствующие субстраты 26А, 26А' (например, в вогнутые области 38, 38' и на смежные с ними промежуточные области 46, 46'). Для специфического нанесения полимерного гидрогеля в вогнутые области 38, 38', а не на промежуточные области 46, 46', можно использовать другие способы селективного осаждения (например, с использованием маски, методик управляемой печати и т.п.).
[0122] В некоторых примерах поверхность субстрата (включая вогнутые области 38, 38') можно активировать, а затем наносить на нее смесь (включающую полимерный гидрогель 40, 40'). В одном примере силан или производное силана (например, норборненсилан) можно наносить на поверхность субстрата с помощью осаждения из паровой фазы, нанесения методом центрифугирования или других методов осаждения. В другом примере поверхность субстрата можно подвергать плазменному озолению с образованием активирующего (-их) поверхность агента (-ов) (например, групп ОН), который (-ые) можно присоединять к полимерному гидрогелю 40, 40'.
[0123] В зависимости от химической природы полимерного гидрогеля 40, 40' нанесенную смесь можно подвергнуть процессу отверждения. В примере отверждение может происходить при температуре в диапазоне от комнатной температуры (например, около 25°С) до около 95°С в течение времени в диапазоне от около 1 миллисекунды до около нескольких дней.
[0124] Затем можно выполнять полировку, чтобы удалить полимерный гидрогель 40, 40' с промежуточных областей 46, 46' по периметру вогнутых областей 38, 38', при этом полимерный гидрогель 40, 40' можно оставить на поверхности в вогнутых областях 38, 38' по меньшей мере по существу нетронутым.
[0125] Поверхности 30, 30' для секвенирования также включают праймеры 42, 42' для амплификации, прикрепленные к полимерному гидрогелю 40, 40'.
[0126] Для прививки праймеров 42, 42' для амплификации на полимерный гидрогель 40, 40' в вогнутых областях 38, 38' можно выполнить процесс прививки. В одном примере праймеры 42, 42' для амплификации можно иммобилизовать на полимерном гидрогеле 40, 40' с помощью одноточечного ковалентного прикрепления или сильного нековалентного взаимодействия на 5'-конце праймеров 42, 42' или вблизи него. Данное прикрепление оставляет i) специфичный для адаптера участок праймеров 42, 42' свободным для отжига с распознаваемым им готовым к секвенированию фрагментом нуклеиновых кислот и ii) 3'-гидроксильную группу свободной для удлинения праймера. Для этой цели можно использовать любое соответствующее ковалентное прикрепление или сильное нековалентное взаимодействие. Примеры праймеров с терминальными группами, которые можно использовать, включают праймеры с терминальным алкином (например, которые могут прикрепиться к азидному поверхностному фрагменту полимерного гидрогеля 40, 40'), или праймеры с терминальной азидной группой (например, которые могут прикрепиться к алкиновому поверхностному фрагменту полимерного гидрогеля 40, 40'), или любой из других праймеров с терминальной группой, описанных в контексте кластеризованной твердой подложки 13.
[0127] Конкретные примеры соответствующих праймеров 42, 42' включают праймеры Р5 и Р7. Оба праймера Р5 и Р7 могут быть привиты на каждый из полимерных гидрогелей 40, 40'.
[0128] В одном примере прививка может включать проточное нанесение (например, с использованием временно связанной крышки), нанесение покрытия окунанием, нанесение распылением, нанесение наливом или другим соответствующим способом, при котором праймеры 42, 42' будут прикреплены к полимерному гидрогелю 40, 40'. В каждом из данных примеров методик можно использовать раствор праймера или смесь праймера, которая может включать праймер (-ы) 42, 42', воду, буфер и катализатор. При любом из способов прививки праймеры 42, 42' реагируют с реакционноспособными группами полимерного гидрогеля 40, 40' в вогнутой области 38, 38' и не имеют аффинности к окружающему субстрату 26А, 26А'. Таким образом, праймеры 42, 42' селективно прививаются на полимерный гидрогель 40, 40'.
[0129] В показанном на Фиг. 2В примере сайт 44, 44' химического захвата включает захватный химический агент, который прикреплен к по меньшей мере части полимерного гидрогеля 40, 40' или нанесен на нее. Можно использовать любые примеры захватных химических агентов, описанных в настоящем документе. Например, захватный химический агент может быть элементом связывающейся пары, где другой элемент связывающейся пары прикреплен к твердой подложке 12, 12'.
[0130] В некоторых примерах свободные функциональные группы (например, те группы, которые не присоединены к праймерам 42, 42') полимерного гидрогеля 40, 40' можно функционализировать захватным химическим агентом таким образом, что на поверхности полимерного гидрогеля 40, 40' будут сформированы несколько сайтов 44, 44' химического захвата. В одном примере с помощью клик-химии можно ковалентно присоединить алкин-ПЭГ-биотиновые линкеры или не содержащие алкин-биотина азидные группы к свободным азидам на полимерном гидрогеле 40, 40'. В другом примере праймеры, комплементарные праймерам 42, 42' для амплификации, могут нести присоединенные к ним захватные химические агенты. Такие комплементарные праймеры можно гибридизировать с некоторыми из праймеров 42, 42' для амплификации с образованием сайта 44, 44' химического захвата.
[0131] В другом примере захватный химический агент можно нанести в требуемое место с использованием микроконтактной печати, аэрозольной печати и т.д. с образованием сайта (-ов) 44, 44' химического захвата. В еще одном примере для задания пространства/местоположения для нанесения захватного химического агента и, таким образом, места формирования сайта 44, 44' химического захвата можно использовать маску (например, фоторезист). Затем можно нанести захватный химический агент и удалить маску (например, с использованием отслаивания, растворения или иной соответствующей методики). В данном примере сайт 44, 44' химического захвата может включать монослой или тонкий слой захватного химического агента.
[0132] На Фиг. 2С показан вид в сечении проточной кюветы 24, включающей профилированные противоположные поверхности 32, 32' для секвенирования. В одном примере каждая из данных поверхностей 32, 32' может быть получена на субстрате 26В, 26В', а затем субстраты 26В, 26В' могут быть скреплены друг с другом (например, с помощью материала 50) с получением примера проточной кюветы 24.
[0133] В показанном на Фиг. 2С примере проточная кювета 24 включает многослойный субстрат 26В, 26В', причем каждый слой включает подложку 34, 34' и профилированный материал 36, 36', расположенный на подложке 34, 34'. Профилированный материал 36, 36' образует углубления 48, 48', разделенные промежуточными областями 46, 46'.
[0134] В показанном на Фиг. 2С примере профилированный материал 36, 36' расположен соответственно на подложке 34, 34'. Следует понимать, что в качестве профилированного материала 36, 36' можно использовать любой материал, который можно селективно наносить или наносить и профилировать с образованием углублений 48, 48' и промежуточных областей 46, 46'.
[0135] В качестве одного из примеров на подложку 34, 34' можно избирательно наносить неорганический оксид путем осаждения из паровой фазы, аэрозольной печати или струйной печати. Примеры подходящих неорганических оксидов включают оксид тантала (например, Ta2O5), оксид алюминия (например, Al2O3), оксид кремния (например, SiO2), оксид гафния (например, HfO2) и т.д.
[0136] В качестве другого примера на подложку 34, 34' можно наносить и затем профилировать смолу. К подходящим методикам нанесения относятся химическое осаждение из паровой фазы, нанесение окунанием, нанесение обмакиванием, нанесение центрифугированием, нанесение распылением, нанесение с использованием лопастей, нанесение методом ультразвукового распыления, нанесение с использованием ракельного ножа, аэрозольная печать, трафаретная печать, микроконтактная печать и т.д. Подходящие технологии профилирования включают фотолитографию, наноимпринтную литографию (NIL), методики штамповки, методики тиснения, методики литья, методики микротравления, методики печати и т.п. Некоторые примеры подходящих смол включают смолу на основе многогранной олигомерной силсесквиокеановой смолы (POSS), не содержащую POSS эпоксидную смолу, полиэтиленгликолевую смолу, полиэфирную смолу (например, эпоксидные смолы с открытым кольцом), акриловую смолу, акрилатную смолу, метакрилатную смолу, аморфную фторполимерную смолу (например, CYTOP® производства Bellex) и их комбинации.
[0137] Используемый в настоящем документе термин ''многогранный олигомерный силсесквиоксан'' (доступный в продаже как POSS® от компании Hybrid Plastics) относится к химической композиции, которая представляет собой гибридное промежуточное соединение (например, RSiO1,5) между соединением кремнезема (SiO2) и силикона (R2SiO). Пример многогранного олигомерного силсесквиоксана описан в публикации Kehagias et al., Microelectronics Engineering 86 (2009), pp. 776-778, которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки. В примере композиция представляет собой кремнийорганическое соединение с химической формулой [RSiO3/2]n, в которой группы R могут быть одинаковыми или разными. Примеры групп R для многогранного олигомерного силсесквиоксана включают эпокси-, азид/азидо-, тиол, поли(этиленгликоль), норборнен, тетразин, акрилаты и/или метакрилаты или дополнительно, например, алкильную, арильную, алкоксильную и/или галогеналкильную группу. Композиция смолы, описанная в настоящем документе, может содержать одну или более других каркасных или сердцевинных структур по сравнению с мономерными звеньями. Многогранная структура может представлять собой структуру Т8, такую как:
и представленную в виде: . Это мономерное звено обычно имеет восемь плеч из функциональных групп R1-R8.
[0138] Мономерное звено может иметь каркасную структуру с 10 атомами кремния и 10 R-группами, обозначаемыми как Т10, такую как: , или может иметь каркасную структуру с 12 атомами кремния и 12 R-группами,
обозначенными как Т12, такую как: . Материал на основе многогранного олигомерного силсесквиоксана может в альтернативном варианте осуществления включать каркасные структуры Т6, Т14 или Т16. Среднее содержание “клетки” можно регулировать во время синтеза и/или контролировать с помощью способов очистки, а в описанных в настоящем документе примерах можно использовать распределение размеров “клетки” мономерных звеньев.
[0139] В некоторых из описываемых в настоящем документе примерах многогранного олигомерного силсесквиоксана по меньшей мере одна из групп R1-R8 или R10 или R12 включает эпокси-группу. Группы R1-R8 или R10 или R12 могут быть или не быть одинаковыми, и в некоторых примерах по меньшей мере одна из групп R1-R8 или R10 или R12 включает эпокси-группу, и по меньшей мере одна из групп R1-R8 или R10 или R12 представляет собой отличную от эпокси-группы функциональную группу. Такая отличная от эпокси-группы функциональная группа может представлять собой (а) реакционноспособную группу, реакционная способность которой ортогональна эпокси-группе (т.е. она реагирует в условиях, отличных от условий реакции для эпокси-группы), которая выступает в роли рукоятки для связывания смолы с праймером для амплификации, полимером или агентом полимеризации; или (b) группу, которая корректирует механические или функциональные свойства смолы, например, корректирует ее поверхностную энергию. В некоторых примерах отличная от эпокси-группы функциональная группа выбрана из группы, состоящей из азид/азидо-, тиола, поли(этиленгликоля), норборнена, тетразина, амино-, гидроксила, алкинила, кетона, альдегида, эфирной группы, алкильной, арильной, алкоксильной и галогеналкильной группы.
[0140] Как показано на Фиг. 2С, профилированный материал 36, 36' включает соответственно образованные в нем углубления 48, 48' и промежуточные области 46, 46', разделяющие смежные углубления 48, 48'. Может быть предусмотрено множество различных схем размещения углублений 48, 48', включая правильные, повторяющиеся и неправильные структуры. В одном примере углубления 48, 48' расположены шестиугольной сеткой для обеспечения плотной упаковки и повышения плотности. Другие схемы размещения могут включать, например, прямолинейные (прямоугольные) схемы размещения, треугольные схемы размещения и т.п. В некоторых примерах схема размещения или структура может иметь координатный формат х-у из углублений 48, 48', расположенных в виде строк и столбцов. В некоторых других примерах схема размещения или структура может иметь повторяющееся расположение углублений 48, 48' и/или промежуточных областей 46, 46'. В других примерах схема размещения или структура может представлять собой случайное расположение углублений 48, 48' и/или промежуточных областей 46, 46'. Структура может включать пятна, полосы, завитки, линии, треугольники, прямоугольники, круги, дуги, галочки, клетки, диагональные линии, стрелки, квадраты и/или перекрестные штриховки.
[0141] Схема размещения или структура углублений 48, 48'может характеризоваться с точки зрения плотности углублений 48, 48' (например, количества углублений 48, 48') в определенной области. Например, углубления 48, 48' могут присутствовать с плотностью приблизительно 2 миллиона на мм2. Плотность может быть скорректирована до различных плотностей, включая, например, плотность около 100 на мм2, около 1000 на мм2, около 0,1 миллиона на мм2, около 1 миллиона на мм2, около 2 миллионов на мм2, около 5 миллионов на мм2, около 10 миллионов на мм, около 50 миллионов на мм2 или более, или менее. Дополнительно следует понимать, что плотность углублений 48, 48' в профилированном материале 36, 36' может находиться в диапазоне от одного из нижних значений до одного из верхних значений, выбранных из приведенных выше диапазонов. Например, массив высокой плотности может характеризоваться наличием углублений 48, 48', разделенных менее чем около 100 нм, массив средней плотности может характеризоваться наличием углублений 48, 48', разделенных расстоянием от около 400 нм до около 1 мкм, а массив низкой плотности может характеризоваться наличием углублений 48, 48', разделенных более чем около 1 мкм. Хотя приведены примеры плотностей, следует понимать, что можно использовать любые подходящие значения плотности. Плотность углублений 48, 48' может частично зависеть от глубины углублений 48, 48'. В некоторых случаях может быть желательно, чтобы расстояние между углублениями 48, 48' было еще больше, чем в примерах, перечисленных в настоящем документе.
[0142] Схема размещения или структура углублений 48, 48' может также или альтернативно характеризоваться по среднему шагу или расстоянию от центра одного углубления 48, 48' до центра смежного углубления 48, 48' (расстояние между центрами) или расстоянию от левого края одного углубления 48, 48' до правого края смежного углубления 48, 48' (расстояние между краями). Узор может быть правильным, так что коэффициент вариации относительно среднего шага является небольшим, или узор могут быть неправильным, и в этом случае коэффициент вариации может быть относительно большим. В любом случае средний шаг может составлять, например, около 50 нм, около 0,1 мкм, около 0,5 мкм, около 1 мкм, около 5 мкм, около 10 мкм, около 100 мкм или более, или менее. Средний шаг для конкретного расположения углублений 48, 48' может находиться в диапазоне от одного из нижних значений до одного из верхних значений, выбранных из приведенных выше диапазонов. В одном примере углубления 48, 48' имеют шаг (расстояние между центрами) около 1,5 мкм. Хотя предоставлены примеры средних значений шага следует понимать, что можно использовать другие средние значения шага.
[0143] Размер каждого углубления 48, 48' может характеризоваться объемом, площадью его отверстия, глубиной и/или диаметром.
[0144] Каждое углубление 48, 48' может иметь объем, который позволяет разместить в нем по меньшей мере часть текучей среды, которая вводится в проточную кювету 24. Минимальный или максимальный объем может быть выбран, например, таким образом, чтобы соответствовать пропускной способности (например, мультиплексность), разрешению, нуклеотидам или реакционной способности аналита, ожидаемой при последующих применениях проточной кюветы 24. Например, объем может составлять по меньшей мере около 1×10-3 мкм3, по меньшей мере около 1×10-2 мкм3, по меньшей мере около 0,1 мкм, по меньшей мере около 1 мкм3, по меньшей мере около 10 мкм3, по меньшей мере около 100 мкм3 или более. В альтернативном или дополнительном варианте осуществления объем может составлять не более около 1×104 мкм3, не более около 1×103 мкм3, не более около 100 мкм3, не более около 10 мкм3, не более около 1 мкм3, не более около 0,1 мкм3 или менее.
[0145] Площадь, занимаемая каждым отверстием углубления, может быть выбрана на основании критериев, аналогичных описанным выше для объема. Например, площадь для каждого отверстия углубления может составлять по меньшей мере около 1×10-3 мкм2, по меньшей мере около 1×10-2 мкм2, по меньшей мере около 0,1 мкм2, по меньшей мере около 1 мкм2, по меньшей мере около 10 мкм2, по меньшей мере около 100 мкм или более. В альтернативном или дополнительном варианте осуществления площадь может составлять не более около 1×103 мкм2, не более около 100 мкм2, не более около 10 мкм2, не более около 1 мкм2, не более около 0,1 мкм2, не более около 1×10-2 мкм2 или менее. Площадь, занимаемая каждым отверстием углубления, может быть больше или меньше указанных значений или находиться в промежутке между указанными выше значениями.
[0146] Глубина каждого углубления 48, 48' может быть достаточно большой для размещения части полимерного гидрогеля 40, 40'. В примере глубина может составлять по меньшей мере около 0,1 мкм, по меньшей мере около 0,5 мкм, по меньшей мере около 1 мкм, по меньшей мере около 10 мкм, по меньшей мере около 100 мкм или более. В альтернативном или дополнительном варианте осуществления глубина может составлять не более около 1×103 мкм, не более около 100 мкм, не более около 10 мкм или менее. В некоторых примерах глубина составляет около 0,4 мкм. Глубина каждого углубления 48, 48' может быть больше, меньше или находится между указанными выше значениями.
[0147] В некоторых случаях диаметр или длина и ширина каждого углубления 48, 48' могут составлять по меньшей мере около 50 нм, по меньшей мере около 0,1 мкм, по меньшей мере около 0,5 мкм, по меньшей мере около 1 мкм, по меньшей мере около 10 мкм, по меньшей мере около 100 мкм или более. В альтернативном или дополнительном варианте осуществления диаметр или длина и ширина могут составлять не более около 1×103 мкм, не более около 100 мкм, не более около 10 мкм, не более около 1 мкм, не более около 0,5 мкм, не более около 0,1 мкм или менее (например, около 50 нм). В некоторых примерах диаметр или длина и ширина составляют около 0,4 мкм. Диаметр или длина и ширина каждого углубления 48, 48' может быть больше, меньше вышеуказанных значений или может иметь промежуточное значение.
[0148] В данном примере в углубления 48, 48' можно ввести по меньшей мере некоторые из компонентов поверхности 32, 32' для секвенирования. Следует понимать, что любое пространство внутри углублений 48, 48', не занятое компонентами поверхности 32, 32' для секвенирования, можно считать частью проточного канала 28.
[0149] В показанном на Фиг. 2С примере полимерный гидрогель 40, 40' расположен внутри каждого из углублений 48, 48'. Полимерный гидрогель 40, 40' можно наносить так, как описано со ссылкой на Фиг. 2В, чтобы полимерный гидрогель 40, 40' находился в углублениях 48, 48' и не находился на окружающих промежуточных областях 46, 46'.
[0150] В показанном на Фиг. 2С примере праймеры 42, 42' могут быть привиты на полимерный гидрогель 40, 40' внутри каждого из углублений 48, 48'. Праймеры 42, 42' можно наносить так, как описано со ссылкой на Фиг. 2В, и таким образом привить их на полимерный гидрогель 40, 40' и не на окружающие промежуточные области 46, 46'.
[0151] В показанном на Фиг. 2С примере сайт 44, 44' химического захвата включает захватный химический агент, который нанесен на по меньшей мере некоторые из окружающих промежуточных областей 46, 46'. Например, захватный химический агент можно нанести на по меньшей мере некоторые из окружающих промежуточных областей 46, 46' с использованием микроконтактной печати, аэрозольной печати и т.д. с образованием сайта (-ов) 44, 44' химического захвата. В еще одном примере для задания пространства/местоположения для нанесения захватного химического агента и, таким образом, места формирования сайта 44, 44' химического захвата можно использовать маску (например, фоторезист). Затем можно нанести захватный химический агент и удалить маску (например, с использованием отслаивания, растворения или иной соответствующей методики).
[0152] В других примерах сайт 44, 44' химического захвата включает захватный химический агент, который присоединен к свободным функциональным группам (например, тем группам, которые не присоединены к праймерам 42, 42') полимерного гидрогеля 40, 40'. В дополнительных примерах сайт 44, 44' химического захвата включает захватный химический агент, который присоединен к праймерам, которые гибридизированы с некоторыми из праймеров 42, 42' для амплификации. В данных примерах сайт 44, 44' химического захвата будет находиться в углублениях 48, 48' и не на окружающих промежуточных областях 46, 46'.
[0153] В показанном на Фиг. 2С примере можно использовать любые примеры захватных химических агентов, описанных в настоящем документе.
[0154] На Фиг. 2D показан вид в сечении проточной кюветы 24, включающей профилированные противоположные поверхности 31, 31' для секвенирования. В одном примере каждая из данных поверхностей 31, 31' может быть получена на субстрате 26В, 26В', а затем субстраты 26В, 26В' можно скрепить друг с другом (например, с помощью материала 50) с получением примера проточной кюветы 24. Каждый из многослойных субстратов 26В, 26В' включает подложку 34, 34' и профилированный материал 36, 36' расположенный на подложке 34, 34'. Профилированный материал 36, 36' образует углубления 48, 48', разделенные промежуточными областями 46, 46'.
[0155] Противоположные поверхности 31, 31' для секвенирования не включают полимерный гидрогель 40, 40' или праймеры 42, 42'. Вместо этого противоположные поверхности 31, 31' для секвенирования включают сайт 44, 44' химического захвата, расположенный в каждом из углублений 48, 48'. Соответствующие сайты 44, 44' химического захвата способны обеспечить иммобилизацию соответствующих кластеризованных твердых подложек 13. Каждая из кластеризованных твердых подложек вводит соответствующий кластер темплатных цепей 64 в каждое из углублений 48, 48'.
[0156] Сайт 44, 44' химического захвата на Фиг. 2D включает любой из описанных в настоящем документе примеров захватного химического агента. В данном примере захватный химический агент может быть нанесен в углубления 48, 48' с использованием микроконтактной печати, аэрозольной печати и т.д. с образованием сайта (-ов) 44, 44'. В еще одном примере для блокирования промежуточных областей 46, 46' можно использовать маску (например, фоторезист), чтобы наносить захватный химический агент в углубления 48, 48', а не на промежуточные области 46, 46'. В данном примере затем можно нанести захватный химический агент и удалить маску (например, с использованием отслаивания, растворения или иной соответствующей методики).
[0157] Хотя это не показано, в другом примере проточной кюветы 24 комбинируют непрофилированную поверхность по Фиг. 2В и сайты 44, 44' захвата по Фиг. 2D. В данном примере вогнутые области 38, 38' (аналогично областям, показанным на Фиг. 2В) могут быть покрыты захватным химическим агентом, а не полимерным гидрогелем 40, 40' и праймерами 42, 42'. Таким образом можно сформировать сайты 44, 44' химического захвата вдоль всего канала 28 в вогнутых областях 38, 38'. В данном примере соответствующие сайты 44, 44' химического захвата способны обеспечить иммобилизацию кластеризованных твердых подложек 13 со случайным распределением по противоположным поверхностям для секвенирования.
[0158] Как показано на Фиг. 2B-2D, субстраты 26А и 26А' или 26В и 26В' прикреплены друг к другу, так что поверхности 30 и 30' или 32 и 32' или 31 и 31' для секвенирования оказываются обращены друг к другу в образованном между ними проточном канале 28.
[0159] Субстраты 26А и 26А' или 26В и 26В' могут быть соединены друг с другом в некоторых или всех промежуточных областях 46, 46'. Соединение, образованное между субстратами 26А и 26А' или 26В и 26В', может представлять собой химическое соединение или механическое соединение (например, с применением крепежного элемента и т.д.).
[0160] Для соединения друг с другом субстратов 26А и 26А' или 26В и 26В' можно использовать любой соответствующий способ, такой как лазерная сварка, диффузионная сварка, анодная сварка, сварка эвтектическим сплавом, плазмоактивированная сварка, пайка стеклокристаллическим припоем или иные известные в данной области способы. В одном примере для соединения субстратов 26А и 26А' или 26В и 26В' можно использовать разделительный слой (например, материал 50). Разделительный слой может быть выполнен из любого материала 50, который будет герметично соединять друг с другом по меньшей мере какую-то часть субстратов 26А и 26А' или 26В и 26В'. В некоторых примерах разделительный слой может представлять собой поглощающий излучение материал, способствующий соединению.
[0161] Способ и набор с множеством текучих сред
[0162] Пример способа, в котором используют комбинацию текучих сред с разными плотностями, показан на Фиг. 3А и Фиг. 3В.
[0163] Способ в общем включает иммобилизацию целевого материала 11 (такого как комплексы 10А, 10В, кластеризованные твердые подложки 13) на каждой из двух противоположных поверхностей 30, 30' или 32, 32' или 31, 31' для секвенирования проточной кюветы 24 путем введения первой текучей среды 52 (Фиг. 3А), включающей в себя первую часть целевого материала 11, в проточную кювету 24, при этом по меньшей мере часть целевого материала 11 становится иммобилизованной на захватных сайтах 44, 44' на одной из 30 или 30', или из 32 или 32', или из 31 или 31' из двух противоположных поверхностей 30, 32, или 30', 32', или 31, 31' для секвенирования; удаление первой текучей среды и любого неиммобилизованного целевого материала из проточной кюветы 24; и введение второй текучей среды 54 (Фиг. 3В), включающей в себя вторую часть целевого материала 11, в проточную кювету 24, при этом по меньшей мере часть целевого материала 11 становится иммобилизованной на захватных сайтах 44, 44' на другой из 30 или 30', или из 32 или 32', или из 31 или 31' из двух противоположных поверхностей 30, 32, или 30', 32', или 31, 31' для секвенирования; причем выполняется одно из следующих двух условий: первая текучая среда 52 имеет плотность ниже плотности целевого материала 11, а вторая текучая среда 54 имеет плотность выше плотности целевого материала 11; или вторая текучая среда 54 имеет плотность ниже плотности целевого материала 11, а первая текучая среда 52 имеет плотность выше плотности целевого материала 11.
[0164] Перед выполнением способа, показанного на Фиг. 3А и Фиг. 3В, целевой материал 11 можно подготовить или получить.
[0165] В одном примере могут быть подготовлены комплексы 10А или 10В с использованием образца нуклеиновой кислоты и текучей среды для подготовки библиотек, включающей в себя множество твердых подложек 12, 12'. В некоторых примерах каждая из твердых подложек 12, 12' в текучей среде для подготовки библиотек может иметь, например, прикрепленные к ней адаптеры (например, адаптеры 18) и транспосомные комплексы, как описано со ссылкой на Фиг. 1А. Тагментацию и подготовку библиотеки можно провести, как определено на Фиг. 1А, и получить комплексы 10А. Образец нуклеиновой кислоты, твердые подложки 12, 12', частичные Y-адаптеры и фермент транспозаза могут содержаться в отдельных текучих средах до того момента, когда потребуется получить комплексы 10А. В других примерах каждая из твердых подложек 12, 12' в текучей среде для подготовки библиотек может иметь, например, прикрепленные к ней олигонуклеотиды. В некоторых примерах подготовка нуклеотидной библиотеки без ПЦР может происходить отдельно от твердых подложек 12, 12', а затем фрагменты из подготовленной библиотеки можно гибридизировать с олигонуклеотидами на поверхности твердых подложек 12, 12', как описано со ссылкой на Фиг. 1В. Можно использовать и другие примеры подготовки библиотек (например, включая ПЦР), при условии, что фрагменты денатурируют до одноцепочечных фрагментов перед гибридизацией с олигонуклеотидами на твердых подложках 12, 12'.
[0166] В другом примере можно приготовить кластеризованные твердые подложки 13 путем амплификации фрагмента из библиотеки в присутствии множества твердых подложек 12, 12', функционализированных праймерами 42, 42'.
[0167] Целевой материал 11 (например, комплексы 10А или 10В, или любые иные твердые подложки 12, 12' с прикрепленными к ним готовыми к секвенированию фрагментами 14, 14', или кластеризованные твердые подложки 13) можно разделить на первую и вторую части. Первую часть целевого материала 11 можно добавить в состав первой текучей среды 52, а вторую часть целевого материала 11 можно ввести во вторую текучую среду 54.
[0168] Первая и вторая текучие среды 52, 54 имеют разные плотности. В одном примере первая текучая среда 52 имеет плотность ниже плотности целевого материала 11, а вторая текучая среда 54 имеет плотность выше плотности целевого материала 11. В одном конкретном примере первая текучая среда 52 имеет плотность ниже плотности твердой подложки 12, 12' комплексов 10А или 10В или кластеризованной твердой подложки 13, а вторая текучая среда 54 имеет плотность выше плотности твердой подложки 12, 12' комплексов 10А или 10В или кластеризованной твердой подложки 13. В другом примере вторая текучая среда 54 имеет плотность ниже плотности целевого материала 11, а первая текучая среда 52 имеет плотность выше плотности целевого материала 11. В другом конкретном примере вторая текучая среда 54 имеет плотность ниже плотности твердой подложки 12, 12' комплексов 10А или 10В или кластеризованной твердой подложки 13, а первая текучая среда 52 имеет плотность выше плотности твердой подложки 12, 12' комплексов 10А или 10В или кластеризованной твердой подложки 13. Таким образом, плотность каждой из текучих сред 52, 54 зависит от используемого целевого материала 11. В некоторых примерах плотность комплексов 10А или 10В или кластеризованной твердой подложки 13 приблизительно равна плотности твердой подложки 12, 12', используемой в комплексе 10А или 10В или в кластеризованной твердой подложке 13, и, таким образом, в приведенных конкретных примерах плотность каждой из текучих сред 52, 54 зависит от твердой подложки 12, 12', используемой в целевом материале 11.
[0169] Плотности текучих сред 52, 54 можно измерять при температуре захвата целевого материала 11 (например, комплекса 10А, 10В или кластеризованной твердой подложки 13), который вводят в проточную кювету 24. В одном примере температура захвата составляет от около 18°С до около 40°С.
[0170] В одном примере плотность одной из текучих сред 52 или 54 при температуре захвата на по меньшей мере 0,1 г/см3 ниже, чем плотность целевого материала 11 (например, твердой подложки 12, 12' комплексов 10А или 10В или кластеризованной твердой подложки 13) при температуре захвата, а плотность другой из текучих сред 54 или 52 при температуре захвата на по меньшей мере 0,1 г/см выше, чем плотность целевого материала 11 (например, твердой подложки 12, 12' комплексов 10А или 10В или кластеризованной твердой подложки 13) при температуре захвата. В одном конкретном примере при плотности целевого материала (например, твердой подложки 12, 12') X г/см3 плотность одной из текучих сред 52 или 54 при температуре захвата равна X г/см3 - 0,1 г/см3, а плотность второй из текучих сред 54 или 52 при температуре захвата равна X г/см3 + 0,1 г/см3.
[0171] Помимо соответствующих плотностей текучие среды 52, 54 также должны быть совместимы с целевым материалом 11. При использовании комплексов 10А, 10В текучие среды 52, 54 должны быть совместимы с комплексами 10А, 10В и поверхностями 30, 30' или 32, 32' или 31, 31' для секвенирования, чтобы на фрагменты 14, 14', 14'' и праймеры 42, 42' не оказывалось отрицательного влияния. При использовании кластеризованных твердых подложек 13 текучие среды 52, 54 должны быть совместимы с кластеризованной твердой подложкой 13 без отрицательного влияния на темплатные цепи 64.
[0172] Текучая среда 52 или 54 меньшей плотности может представлять собой водный буферный раствор (например, раствор слабой кислоты и одной из ее солей (сопряженного основания) или слабого основания и одной из его солей (сопряженной кислоты)). Концентрацию соли в водном буферном растворе можно довести до такого уровня, чтобы плотность текучей среды 52 или 54 меньшей плотности была ниже плотности целевого материала 11 (например, плотности твердой подложки 12, 12' комплексов 10А, 10В или кластеризованных твердых подложек 13). Чем больше будет разница плотностей между целевым материалом 11 и текучей средой 52 или 54 меньшей плотности, тем короче будет время оседания целевого материала 11 (например, комплексов 10А, 10В или кластеризованных твердых подложек 13) в текучей среде 52 или 54 меньшей плотности. В качестве примеров текучая среда 52 или 54 меньшей плотности может представлять собой Tris-HCl буфер или 0,5х солевой натрий-цитратный (SSC) буфер. В одном примере текучая среда 52 или 54 меньшей плотности представляет собой водный буферный раствор с плотностью около 1 г/см3. Такая текучая среда 52 или 54 меньшей плотности может быть особенно удобной для использования с целевым материалом 11, имеющим плотность около 1,18 г/см3.
[0173] Текучая среда 54 или 52 большей плотности может представлять собой водный солевой раствор. Выбранная соль должны сделать текучую среду 52 или 54 «тяжелой» и также не должна оказывать отрицательного влияния на целевой материал. При использовании комплексов 10А, 10В соль не должна оказывать отрицательного влияния на комплексы 10А, 10В или праймеры 42, 42'. При использовании кластеризованных твердых подложек 13 соль не должна оказывать отрицательного влияния на темплатные цепи 64. Концентрацию соли в водном буферном растворе можно довести до такого уровня, чтобы плотность текучей среды 54 или 52 большей плотности была выше плотности целевого материала 11. Примеры текучей среды 54 или 52 большей плотности включают растворы поливольфрамата натрия и растворы хлорида натрия. В одном примере текучая среда 54 или 52 большей плотности представляет собой раствор поливольфрамата натрия с плотностью в дипазоне от около 2 г/см3 до около 3 г/см3. Такие текучие среды 54 или 52 меньшей плотности могут быть особенно удобны для использования с целевым материалом 11, имеющим плотность около 1,18 г/см3. В данных примерах раствор поливольфрамата натрия имеет концентрацию в диапазоне от около 1 грамма поливольфрамата натрия на 1 миллилитр воды до около 2,52 грамма поливольфрамата натрия на 1 миллилитр воды. В другом примере 25% (мас./об.) раствор хлорида натрия имеет плотность около 1,2 г/см3.
[0174] В одном примере первая или вторая текучая среда 52 или 54 с плотностью ниже плотности целевого материала представляет собой водный буферный раствор, а вторая или первая текучая среда 54 или 52 с плотностью выше плотности целевого материала представляет собой раствор поливольфрамата натрия или раствор хлорида натрия. В другом примере плотность первой или второй текучей среды 52 или 54 с плотностью ниже плотности целевого материала равна около 1 г/см3 при температуре захвата, а плотность второй или первой текучей среды 54 или 52 с плотностью выше плотности целевого материала равна около 2 г/см3 при температуре захвата.
[0175] Как показано на Фиг. 3А, один пример способа включает введение первой текучей среды 52, содержащей часть целевого материала 11 (например, комплексов 10А на Фиг. 3А), в проточную кювету 24. В данном примере первая текучая среда 52 имеет плотность ниже плотности твердой подложки 12, 12' комплексов 10А, и, таким образом, комплексы 10А мигрируют к нижней поверхности 30' для секвенирования или оседают на ней. Захватные сайты 44' (не показаны на Фиг. 3А) обеспечивают иммобилизацию по меньшей мере части комплексов 10А на нижней поверхности 30' для секвенирования.
[0176] Следует понимать, что некоторые комплексы 10А (или иной целевой материал 11) в первой текучей среде 52 могут не осесть, и эти комплексы 10А (или иной целевой материал) будут удалены из проточной кюветы 24 перед дальнейшей обработкой. Перед удалением первой текучей среды 52 и любого неиммобилизованного целевого материала (например, комплексов 10А) из проточной кюветы 24 может выжидаться заданное время. В одном примере заданное время может составлять от около 5 минут до около 30 минут для получения требуемого количества иммобилизованных комплексов 10А или иного целевого материала 11. Можно также использовать и более продолжительные времена инкубации.
[0177] Данный пример способа затем включает смывание первой текучей среды 52 и неиммобилизованного целевого материала 11 (например, комплексов 10А) из проточной кюветы 24. Смывание может включать введение смывающей текучей среды в проточную кювету 24. Поток может вытолкнуть любые комплексы 10А (или иной целевой материал 11), которые не осели и стали иммобилизованными на поверхности 30' для секвенирования, наружу через выходной порт проточной кюветы 24. Механизм иммобилизации (например, связывающиеся пары, гибридизация, ковалентное связывание и т.д.) между комплексами 10А (или иным целевым материалом 11) и захватными сайтами 44' поверхности 30' для секвенирования может не давать любым осевшим и ставшим иммобилизованными комплексам 10А (или иным иммобилизованным целевым материалам 11) становиться частью выходного потока. Кроме того, целевой материал 11 (например, комплексы 10А на Фиг. 3А), иммобилизованный на одной из двух противоположных поверхностей для секвенирования (например, поверхности 30' для секвенирования на Фиг. 3А), остается иммобилизованным на данной поверхности для секвенирования при введении второй текучей среды 54.
[0178] Как показано на Фиг. 3В, данный пример способа включает введение второй текучей среды 54, содержащей некоторую другую часть целевого материала 11 (например, комплексов 10А) в проточную кювету 24. В данном примере вторая текучая среда 54 имеет плотность выше плотности твердой подложки 12, 12' комплексов 10А (или иного целевого материала 11), и таким образом комплексы 10А мигрирую к верхней поверхности 30 для секвенирования. Захватные сайты 44 (не показаны на Фиг. 3В) обеспечивают иммобилизацию по меньшей мере части комплексов 10А на верхней поверхности 30 для секвенирования.
[0179] Перед проведением посева, амплификации и секвенирования или секвенирования (как описано ниже) данный пример способа может дополнительно включать удаление второй текучей среды 54 и неиммобилизованного целевого материала 11 из проточной кюветы 24. Таким образом, данный пример способа может затем включать смывание второй текучей среды 54 и незахваченного целевого материала 11 (например, неиммобилизованных комплексов 10А) из проточной кюветы 24. Смывание можно проводить согласно приведенному в настоящем документе описанию. Поток может вытолкнуть любые комплексы 10А (или иные целевые материалы 11), которые не стали иммобилизованными на верхней поверхности 30 для секвенирования, наружу через выходной порт проточной кюветы 24. Следует понимать, что механизм иммобилизации (например, связывающиеся пары, гибридизация, ковалентное связывание и т.д.) между комплексами 10А (или иными целевыми материалами 11) и соответствующими захватными сайтами 44, 44' поверхностей 30, 30' для секвенирования может мешать любым ставшим иммобилизованными комплексам 10А (или иным иммобилизованным целевым материалам 11) становиться частью выходного потока.
[0180] При использовании комплексов 10А или 10В за данной стадией промывки может следовать высвобождение и амплификация фрагмента из библиотеки (например, пример описан со ссылкой на Фиг. 9А-9С). При использовании кластеризованных твердых подложек 13 за данной стадией промывки может следовать секвенирование.
[0181] Хотя показанные на Фиг. 3А и Фиг. 3В примеры иллюстрируют введение текучей среды меньшей плотности и затем текучей среды большей плотности, следует понимать, что первой можно ввести текучую среду большей плотности для иммобилизации целевого материала 11 на верхней поверхности 30 для секвенирования, а затем ввести текучую среду меньшей плотности для иммобилизации целевого материала 11 на нижней поверхности 30' для секвенирования. Кроме того, следует понимать, что данный способ можно выполнять с любым описываемым в настоящем документе примером проточной кюветы 24, включая кюветы с профилированными поверхностями 32, 32'. При использовании кластеризованных твердых подложек 13 можно использовать проточную кювету 24 без праймеров 42, 42' для амплификации, такую как показанная и описанная со ссылкой на Фиг. 2D.
[0182] Набор для выполнения способа, описанного со ссылкой на Фиг. 3А и 3В, может включать препарационную текучую среду, включающую в себя целевой материал 11; первую вводимую текучую среду (например, текучую среду 52 или 54), имеющую плотность ниже плотности целевого материала 11; и вторую вводимую текучую среду (текучую среду 54 или 52), имеющую плотность выше плотности целевого материала 11. В одном примере набора первая вводимая текучая среда представляет собой водный буферный раствор, а вторая вводимая текучая представляет собой раствор поливольфрамата натрия или раствор хлорида натрия. В одном примере, когда вторая вводимая текучая среда представляет собой раствор поливольфрамата натрия, раствор поливольфрамата натрия имеет концентрацию около 1 грамма поливольфрамата натрия на 1 миллилитр воды. В другом примере набора плотность первой вводимой текучей среды при температуре захвата на по меньшей мере 0,1 г/см3 ниже, чем плотность целевого материала 11 при температуре захвата, а плотность второй вводимой текучей среды при температуре захвата на по меньшей мере 0,1 г/см3 выше, чем плотность целевого материала 11 при температуре захвата. В еще одном примере плотность первой вводимой текучей среды равна около 1 г/см3 при температуре захвата, а плотность второй вводимой текучей среды равна около 2 г/см3 при температуре захвата.
[0183] В некоторый примерах препарационная текучая среда, содержащая целевой материал 11, включает твердые подложки 12, 12', а набор может также включать другие компоненты для подготовки библиотек, такие как образец нуклеиновой кислоты, частичные Y-адаптеры, ферменты транспозазы и т.д; каждый из них может содержаться в отдельных текучих средах до того момента, когда потребуется получить целевой материал 11, такой как комплекс 10А, 10В, кластеризованную твердую подложку 13 и т.д. Некоторые примеры набора могут также включать проточную кювету 24. Другие примеры набора могут включать препарационные текучие среды, которые содержат в себя любые примеры описываемого в настоящем документе целевого материала 11.
[0184] Способы и наборы с одной текучей средой
[0185] В других примерах описываемого в настоящем документе способа в процессе иммобилизации целевого материала 11 используют одну текучую среду. В некоторых способах используют один целевой материал 11 и различные подходы для достижения иммобилизации на противоположных поверхностях 30, 30' или 32, 32' или 31, 31' для секвенирования. В других способах используют два разных целевых материала 11 (с различием в по меньшей мере одном свойстве) и одинаковый или различные подходы для достижения иммобилизации на противоположных поверхностях 30, 30' или 32, 32' или 31, 31' для секвенирования. Различные примеры этого описаны в настоящем документе со ссылками на фигуры с Фиг. 4А и Фиг. 4В по Фиг. 8А и Фиг. 8В.
[0186] Перед выполнением любого из способов, показанного на фигурах с Фиг. 4А и Фиг. 4В по Фиг. 8А и Фиг. 8В, комплексы 10А или 10В или кластеризованные подложки 13 могут быть подготовлены согласно приведенному в настоящем документе описанию.
[0187] Комплексы 10А или 10В можно подготовить с использованием образца нуклеиновой кислоты и текучей среды для подготовки библиотек, включающей в себя множество магнитных твердых подложек 12'. В некоторых примерах каждая из магнитных твердых подложек 12' в текучей среде для подготовки библиотек может иметь, например, прикрепленные к ней адаптеры (например, адаптеры 18) и транспосомные комплексы, как описано со ссылкой на Фиг. 1А. Тагментацию и подготовку библиотеки можно провести, как определено на Фиг. 1А, и получить комплексы 10А. Образец нуклеиновой кислоты, магнитные твердые подложки 12', частичные Y-адаптеры и фермент транспозаза могут содержаться в отдельных текучих средах до того момента, когда потребуется получить комплексы 10А. В других примерах каждая из магнитных твердых подложек 12' в текучей среде для подготовки библиотек может иметь, например, прикрепленные к ней олигонуклеотиды. В некоторых примерах подготовка нуклеотидной библиотеки без ПЦР может происходить отдельно от магнитных твердых подложек 12', а затем фрагменты из подготовленной библиотеки можно гибридизировать с олигонуклеотидами на поверхности твердых подложек 12', как описано со ссылкой на Фиг. 1В. Можно использовать и другие примеры подготовки библиотек (например, включая ПЦР), при условии, что фрагменты денатурируют до одноцепочечных фрагментов перед гибридизацией с олигонуклеотидами на магнитных твердых подложках 12'.
[0188] Кластеризованные твердые подложки 13 можно обеспечить амплификацией фрагмента из библиотеки в присутствии множества твердых подложек 12, 12', функционализированных праймерами 42, 42'.
[0189] Пример способа, в котором используют текучую среду, по существу однородная магнитная сила и магнитно-восприимчивый целевой материал, такой как твердая подложка 12', показаны на Фиг. 4А и Фиг. 4В. Способ в общем включает иммобилизацию целевого материала 11 на каждой из двух противоположных поверхностей 30, 30' или 32, 32' для секвенирования проточной кюветы 24 путем введения текучей среды 56, включающей в себя целевой материал 11, в проточную кювету 24, при этом текучая среда 56 имеет плотность, приблизительно эквивалентную плотности магнитной твердой подложки 12'; выдерживание, что позволяет части целевого материала 11 становиться иммобилизованной на захватных сайтах 44 или 44' (не показано на Фиг. 4А) на одной из 30 или 30', или из 32 или 32', или из 31 или 31' из двух противоположных поверхностей 30, 32 или 30', 32' или 31, 31' для секвенирования; и приложение магнитной силы к другой из 30 или 30', или из 32 или 32', или из 31 или 31' из двух противоположных поверхностей 30, 32, или 30', 32', или 31, 31' для секвенирования, тем самым вытягивается некоторая другая часть целевого материала 11 ко второй из 30 или 30', или из 32 или 32', или из 31 или 31' из двух противоположных поверхностей 30, 32, или 30', 32', или 31, 31' для секвенирования, где она становится иммобилизованной на захватных сайтах 44' или 44 (не показано на Фиг. 4В) другой из двух противоположных поверхностей 30, 32, или 30', 32', или 31, 31' для секвенирования. При использовании комплексов 10А, 10В и перед проведением посева и амплификации (как описано ниже) данный пример способа может дополнительно включать прекращение приложения магнитной силы и удаление текучей среды и неиммобилизованного целевого материала из проточной кюветы 24. За данными стадиями может следовать высвобождение и амплификация фрагмента из библиотеки (например, как описано со ссылкой на Фиг. 9А-9С).
[0190] В состав текучей среды 56 можно добавить целевой материал 11 (например, комплексы 10А, 10В, или любую иную магнитную твердую подложку 12' с прикрепленными к ней готовыми к секвенированию фрагментами 14, 14', 14'', или кластеризованные твердые подложки 13). В качестве одного примера в одном микролитре текучей среды могут находиться от около 25 000 единиц целевых материалов 11 (например, комплексов 10А, 10В или кластеризованных твердых подложек 13) до около 500 000 единиц целевых материалов 11. В качестве другого примера в одном микролитре текучей среды могут находиться от около 100 000 единиц целевых материалов 11 до около 500 000 единиц целевых материалов 11. Можно использовать и другие концентрации в зависимости от размера проточной кюветы 24.
[0191] Плотность текучей среды 56 можно измерять при температуре захвата целевых материалов 11, которые вводят в проточную кювету 24. В одном примере температура захвата составляет от около 18°С до около 40°С.
[0192] Текучую среды 56 выбирают с плотностью, по меньшей мере приблизительно эквивалентной плотности магнитной твердой подложки 12' целевого материала 11. В данных примерах «по меньшей мере приблизительно эквивалентная» означает, что плотность текучей среды 56 отличается от плотности магнитной твердой подложки 12' не более чем на 0,08 г/см3. В некоторых случаях плотности текучей среды 56 и магнитной твердой подложки 12' одинаковы. За счет по меньшей мере приблизительно эквивалентной плотности с магнитной твердой подложкой 12' текучая среда 56 выступает в роли мягкого плавающего агента. Используемый в настоящем документе термин «мягкий плавающий агент» относится к текучей среде, в которой целевой материал 11 (например, комплексы 10А, 10В, кластеризованные твердые подложки 13 и т.д.) способны оставаться на плаву в течение по меньшей мере некоторого периода времени, прежде чем утонуть или осесть. В текучей среде 56 часть целевого материала 11 начинает тонуть и становится иммобилизованной на нижней поверхности 30', 32', 31' для секвенирования в проточной кювете 24, а другая часть целевого материала 11 остается на плаву (по меньшей мере в течение некоторого периода времени).
[0193] Текучая среда 56 может представлять собой водный буферный раствор. Концентрацию соли в водном буферном растворе можно довести до такого уровня, чтобы плотность текучей среды 56 была по меньшей мере приблизительно эквивалентной плотности магнитной твердой подложки 12'. Иными словами, концентрацию соли в водном буферном растворе можно довести до такого уровня, чтобы плотность текучей среды 56 отличалась не более чем на +/-0,08 г/см3 от плотности магнитной твердой подложки 12'. В качестве примеров текучая среда 56 может представлять собой Tris-HCl буфер, или 0,5х солевой натрий-цитратный (SSC) буфер, или 75 мМ раствор цитрата натрия (рН=7), содержащий около 750 мМ NaCl. В одном примере плотность каждой из магнитной твердой подложки 12' и текучей среды 56 составляет около 1,1 г/см3.
[0194] После введения текучей среды 56 и целевого материала 11 в проточную кювету 24 целевой материал 11 сначала плавает в текучей среды 56. Со временем часть целевого материала 11 оседает на нижнюю поверхность 30', 32', 31' для секвенирования, где он становится иммобилизованным на захватном (-ых) сайте (-ах) 44'. Пример показан на Фиг. 4А, где часть комплексов 10А осела на нижнюю поверхность 30' для секвенирования. Текучая среда 56 помогает не допустить слишком быстрого оседание всего целевого материала 11 на нижнюю поверхность 30', 32', 31' для секвенирования.
[0195] Таким образом, после введения текучей среды 56 и иммобилизации части целевого материала 11 есть время для приложения внешней магнитной силы к другой поверхности 30, 32, 31 для секвенирования в проточной кювете 24. Магнитная сила притягивает плавающий целевой материал 11 к верхней поверхности 30, 32, 31 для секвенирования в проточной кювете 24. Пример показан на Фиг. 4В, где часть комплексов 10А мигрировала к верхней поверхности 30 для секвенирования.
[0196] В данном примере способа между введением текучей среды 56 и приложением магнитной силы может пройти заданное время. Это может быть желательно для того, что дать части целевого материала 11 осесть и стать иммобилизованной на одной поверхности 30', 32', 31' для секвенирования, при этом остальной целевой материал 11 остается на плаву в текучей среде 56. В одном примере данное заданное время находится в диапазоне от около 5 минут до около 30 минут. В некоторых примерах заданное время есть между введением текучей среды 56 и приложением магнитной силы, и данное заданное время находится в диапазоне от около 5 секунд до около 2 минут.
[0197] Как показано на Фиг. 4В, затем прикладывают магнитную силу путем помещения магнита 58 на внешнюю поверхность 60 проточной кюветы 24, смежную с поверхностью 30, 32 для секвенирования. Магнит 58 должен создавать силу магнитного поля, достаточную для притяжения плавающего целевого материала 11 (например, комплексов 10А, 10В, кластеризованных твердых подложек 13 и т.д.) без притяжения целевого материала 11, который уже иммобилизован на нижней поверхности 30', 32', 31' для секвенирования. Сила магнитного поля относительно невелика, но ее прикладывают по меньшей мере по существу однородно по всей длине и ширине проточного канала 28. Сила относительно слабого магнитного поля может находиться в диапазоне от около 1 мТл (миллиТесла) до около 100 мТл. В некоторых примерах сила относительно слабого магнитного поля может находиться в диапазоне от около 1 мТл до около 10 мТл, или от около 10 мТл до около 100 мТл. Это позволяет плавающему целевому материалу 11 стать иммобилизованным на захватных сайтах 44 верхней поверхности 30, 32, 31 для секвенирования. В некоторых случаях можно использовать и более сильные магниты, такие как неодимовые магниты, и такие магниты имеют силу поля около 1 Тл (Тесла).
[0198] В одном примере магнит 58 имеет такие же длину и ширину, как и проточный канал 28 и/или проточная кювета 24. В одном примере магнит 58 аналогичен магниту для холодильников и имеет силу магнитного поля около 5 мТл. В другом примере магнит 58 представляет собой полоску из эластомера, в которую включены маленькие магнитные частицы. Такие типы гибких магнитов доступны в продаже, например, от компаний Uline, Arnold Magnetic Technologies (FLEXMAG™) и т.д. В одном примере приложение магнитной силы включает помещение полоски из эластомера с включенными магнитными частицами на внешнюю поверхность 60 проточной кюветы 24, смежную с другой из двух противоположных поверхностей для секвенирования (т.е. поверхностью 30 для секвенирования, на которой нет иммобилизованного целевого материала 11). В некоторых примерах магнит можно применять вручную. В других примерах приложение магнитной силы можно автоматизировать, например, когда с интеграцией в систему секвенирования.
[0199] Временные рамки для наложения магнита 58 (и тем самым приложения магнитной силы) частично зависят от силы магнита и концентрации комплексов 10А, 10В в текучей среде 56. В качестве примера магнит 58 можно накладывать на время от 5 секунд до около 2 минут. Примеры способа затем включают прекращение приложения магнитной силы. Для этого магнит 58 удаляют.
[0200] Следует понимать, что некоторая часть целевого материала 11 (например, комплексов 10А, 10В, кластеризованных твердых подложек 13) в текуче среде 56 может остаться не иммобилизованной на одной из поверхностей 30, 30' или 32, 32' или 31, 31' для секвенирования, и такой целевой материал 11 можно удалить из проточной кюветы 24 перед дальнейшей обработкой. Таким образом, данный пример способа может включать смывание текучей среды 56 и неиммобилизованного целевого материала 11 из проточной кюветы 24. Смывание может включать введение смывающей текучей среды в проточную кювету 24. Поток может вытолкнуть любой целевой материал 11, который не стал иммобилизованным на поверхностях 30, 30' или 32, 32' или 31, 31' для секвенирования, наружу через выходной порт проточной кюветы 24. Механизм иммобилизации (например, связывающиеся пары, гибридизация, ковалентное связывание и т.д.) между целевым материалом 11 и захватными сайтами 44, 44' на поверхностях 30, 30' или 32, 32' или 31, 31' для секвенирования может не давать любому ставшему иммобилизованным целевому материалу 11 становиться частью выходного потока.
[0201] Хотя показанный на Фиг. 4А и Фиг. 4В пример иллюстрирует проточную кювету 24 с поверхностями 30 и 30' для секвенирования, следует понимать, что данный способ можно выполнять с любым описываемым в настоящем документе примером проточной кюветы 24, включая кюветы с профилированными поверхностями 32, 32' для секвенирования. При использовании кластеризованных твердых подложек 13, включающих магнитно-восприимчивые твердые подложки 12', можно использовать проточную кювету 24 без праймеров 42, 42' для амплификации, такую как показанная и описанная со ссылкой на Фиг. 2D. Кроме того, в данном примере способа можно использовать любой магнитно-восприимчивый целевой материал.
[0202] Набор для выполнения способа, описанного со ссылкой на Фиг. 4А и 4В, может включать препарационную текучую среду, включающую в себя множество магнитных твердых подложек 12'; и вводимую текучую среду (например, текучую среду 56), имеющую плотность, приблизительно эквивалентную плотности магнитной твердой подложки 12'. Набор может также включать другие компоненты для подготовки библиотек, такие как образец нуклеиновой кислоты, частичные Y-адаптеры, ферменты транспозазы и т.д; каждый из них может содержаться в отдельной текучей среде до того момента, когда потребуется получить целевой материал 11, такой как комплекс 10А, 10В, кластеризованная твердая подложка 13 и т.д. Некоторые примеры набора могут также включать проточную кювету 24. Другие набора могут включать амплификационную смесь, включающую жидкую форму термочувствительного материала.
[0203] Далее будут описаны способы, показанные на Фиг. 5А и Фиг. 5В, Фиг. 6А и Фиг. 6В, Фиг. 7А и Фиг. 7В и Фиг. 8А и Фиг. 8В. В каждом из этих способов используют комбинацию целевых материалов (например, 11А и 11В, или 11С и 11D, и т.д.), и разные комбинации целевых материалов описаны более подробно со ссылкой на каждый набор фигур. На каждом наборе фигур представлен способ, выполняемый с проточной кюветой 24, имеющей непрофилированные поверхности 30, 30' для секвенирования. Однако следует понимать, что любой из данных способов можно выполнять с любым описываемым в настоящем документе примером проточной кюветы 24, включая кюветы с профилированными поверхностями 32, 32' для секвенирования. Кроме того, при использовании кластеризованных твердых подложек 13 (например, 11А и 11В и т.д.) в качестве целевых материалов можно использовать проточную кювету 24 без праймеров 42, 42' для амплификации, такую как показанная и описанная со ссылкой на Фиг. 2D.
[0204] Один пример способа, в котором используют комбинацию целевых материалов 11А, 11В, показан на Фиг. 5А и Фиг. 5В. В данном примере целевые материалы 11А, 11В имеют плотности, которые отличаются друг от друга и от плотности несущей текучей среды.
[0205] Данный пример способа в общем включает одновременную иммобилизацию первого целевого материала 11А на первой 30 или 32 или 31 из двух противоположных поверхностей 30, 30', или 32, 32' или 31, 31' для секвенирования проточной кюветы 24 и второго целевого материала 11В на второй 30' или 32' или 31' из двух противоположных поверхностей 30, 30' или 32, 32' или 31, 31' для секвенирования путем введения в проточную кювету 24 целевой текучей среды 56', включающей в себя первый целевой материал 11А и второй целевой материал 11В, где несущая текучая среда целевой текучей среды 56' имеет некоторую плотность текучей среды; первый целевой материал 11А имеет первую плотность ниже плотности текучей среды; а второй целевой материал 11В имеет вторую плотность выше плотности текучей среды.
[0206] Плотность несущей текучей среды целевой текучей среды 56' можно измерять при температуре захвата целевых материалов 11А, 11В, которые вводят в проточную кювету 24. В одном примере температура захвата составляет от около 18°С до около 40°С.
[0207] В одном примере плотность одного из целевых материалов 11А на по меньшей мере 0,1 г/см3 ниже, чем плотность несущей текучей среды при температуре захвата, а плотность второго из целевых материалов 11В на по меньшей мере 0,1 г/см3 выше, чем плотность несущей текучей среды при температуре захвата. В одном конкретном примере при плотности несущей текучей среды X г/см3 при температуре захвата плотность одного из целевых материалов 11А или 11В равна X г/см3 - 0,1 г/см3, а плотность второго из целевых материалов 11А или 11В равна X г/см3 + 0,1 г/см3.
[0208] Несущая текучая среда целевой текучей среды 56' может представлять собой любой из водных буферных растворов или водных солевых растворов, описанных в настоящем документе. Концентрацию соли в водном буферном растворе или водном солевом растворе можно довести до такого уровня, чтобы плотность несущей текучей среды при температуре захвата находилась между соответствующими плотностями целевых материалов 11А, 11В. В другом примере несущая текучая среда целевой текучей среды 56' представляет собой ионную жидкость.
[0209] Целевые материалы 11А, 11В могут представлять собой комплексы 10А, 10В или кластеризованные твердые подложки 13. В роли подложки 12 для целевых материалов 11А, 11В может выступать любой из описанных в настоящем документе примеров, при условии, что плотности соответствующих целевых материалов 11А, 11В отличаются от плотности несущей текучей среды, как описано в данном примере способа. Плотность твердой подложки 12 в каждом из целевых материалов 11А, 11В по меньшей мере приблизительно равна плотности соответствующего целевого материала 11А, 11В. Таким образом, твердая подложка 12 целевого материала 11А выбрана для получения плотности ниже плотности несущей текучей среды целевой текучей среды 56' при температуре захвата, а твердая подложка 12 целевого материала 11В выбрана для получения плотности выше плотности несущей текучей среды целевой текучей среды 56' при температуре захвата.
[0210] Как показано на Фиг. 5А, данный способ включает введение целевой текучей среды 56', содержащей целевые материалы 11А, 11В, в проточную кювету 24. Целевую текучую среду 56' можно оставить инкубироваться в проточной кювете 24 в течение заданного времени. В одном примере заданное время может составлять от около 5 минут до около 30 минут для получения требуемого количества иммобилизованных единиц целевых материалов 11А, 11В на поверхностях 30, 30' для секвенирования. Можно также использовать и более продолжительные времена инкубации.
[0211] Как отмечалось, твердая подложка 12 целевого материала 11А имеет плотность ниже плотности несущей текучей среды при температуре захвата, и, таким образом, целевой материал 11А мигрирует или всплывает к верхней поверхности 30 для секвенирования, как показано на Фиг. 5В. Захватные сайты 44 (не показаны на Фиг. 5В) обеспечивают иммобилизацию по меньшей мере части целевого материала 11А на верхней поверхности 30 для секвенирования. Как также отмечалось, твердая подложка 12 целевого материала 11В имеет плотность выше плотности несущей текучей среды при температуре захвата, и, таким образом, целевой материал 11В мигрирует к нижней поверхности 30' для секвенирования или оседает на ней, как показано на Фиг. 5В. Захватные сайты 44 (также не показаны на Фиг. 5В) обеспечивают иммобилизацию по меньшей мере части целевого материала 11В на нижней поверхности 30' для секвенирования.
[0212] Иммобилизация целевых материалов 11А, 11В при введении целевой несущей среды 56' в проточную кювету 24 происходит одновременно в силу разных плотностей целевых материалов 11А, 11В относительно несущей текучей среды. Таким образом, в способе по Фиг. 5А и Фиг. 5В по меньшей мере часть первого целевого материала 11А становится иммобилизированной на соответствующих захватных сайтах 44 первой из двух противоположных поверхностей 30 для секвенирования и по меньшей мере часть второго целевого материала 11В становится иммобилизированной на соответствующих захватных сайтах 44' второй из двух противоположных поверхностей 30' для секвенирования.
[0213] Следует понимать, что некоторая часть целевых материалов 11А, 11В может остаться не иммобилизованной, и такие целевые материалы 11А, 11В будут удалены из проточной кюветы 24 перед дальнейшей обработкой. Таким образом, данный пример способа затем включает смывание несущей текучей среды целевой текучей среды 56' и неиммобилизованных целевых материалов 11А, 11В из проточной кюветы 24. Смывание может включать введение смывающей текучей среды в проточную кювету 24. Поток может вытолкнуть любые целевые материалы 11А, 11В, которые не стали иммобилизованным на поверхностях 30, 30' для секвенирования, наружу через выходной порт проточной кюветы 24. Механизм иммобилизации (например, связывающиеся пары, гибридизация, ковалентное связывание и т.д.) между соответствующими целевыми материалами 11А, 11В и захватными сайтами 44, 44' на поверхностях 30, 30' для секвенирования может не давать любым ставшим иммобилизованными целевым материалам 11А, 11В становиться частью выходного потока.
[0214] При использовании комплексов 10А или 10В в качестве целевых материалов 11А, 11В за данной стадией промывки может следовать высвобождение и амплификация фрагмента из библиотеки (например, пример описан со ссылкой на Фиг. 9А-9С). При использовании кластеризованных твердых подложек 13 за данной стадией промывки может следовать секвенирование.
[0215] Набор для выполнения способа, как описано со ссылкой на Фиг. 5А и 5В, может включать целевую текучую среду 56', включающую несущую текучую среду с некоторой плотностью текучей среды; первый целевой материал 11А с плотностью ниже плотности текучей среды; и второй целевой материал 11В с плотностью выше плотности текучей среды.
[0216] В некоторых примерах первый и второй целевые материалы 11А, 11В представляют собой комплексы 10А или 10В. В данных примерах первый целевой материал 11А включает первую твердую подложку 12, имеющую первую плотность твердой подложки, приблизительно равную первой плотности (т.е. ниже плотности текучей среды), и прикрепленные к первой твердой подложке 12 готовые к секвенированию фрагменты 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот; а второй целевой материал 11В включает вторую твердую подложку 12, имеющую вторую плотность твердой подложки, приблизительно равную второй плотности (т.е. выше плотности текучей среды), и прикрепленные ко второй твердой подложке 12 готовые к секвенированию фрагменты 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот.
[0217] В других примерах первый и второй целевые материалы 11А, 11В представляют собой кластеризованные твердые подложки 13. В данных примерах первый целевой материал 11А включает первую твердую подложку 12, имеющую первую плотность твердой подложки, приблизительно равную первой плотности (т.е. ниже плотности текучей среды), и прикрепленный к первой твердой подложке 12 первый кластер темплатных цепей 64; а второй целевой материал 11В включает вторую твердую подложку 12, имеющую вторую плотность твердой подложки, приблизительно равную второй плотности (т.е. выше плотности текучей среды), и прикрепленный ко второй твердой подложке 12 второй кластер темплатных цепей 64.
[0218] Альтернативно набор может включать несущую текучую среду, реагенты и материалы для обеспечения первого целевого материала 11А и реагенты и материалы для обеспечения второго целевого материала 11В. В данном примере соответствующие целевые материалы 11А, 11В можно подготовить с использованием соответствующих реагентов и материалов в соответствии с приведенным в настоящем документе описанием, и затем их можно добавить в несущую текучую среду с получением целевой текучей среды 56'.
[0219] В других примерах способа используют другие целевые материалы и другие подходы к иммобилизации целевых материалов. Такие примеры в общем включают введение первого и второго целевых материалов в проточную кювету 24, имеющую две противоположные поверхности 30, 30' или 32, 32' или 31, 31' для секвенирования, где первый целевой материал имеет по меньшей мере одно свойство, которое отличается от свойств второго целевого материала, причем указанное по меньшей мере одно свойство выбрано из группы, состоящей из плотности, заряда, магнитности и их комбинаций; и воздействие на первый и второй целевые материалы по меньшей мере одним условием, так что первый целевой материал становится иммобилизованным на захватном сайте 44 на первой из двух противоположных поверхностей 30, 32 или 31 для секвенирования, а второй целевой материал становится иммобилизованным на захватном сайте 44' на второй из двух противоположных поверхностей 30', 32', 31' для секвенирования.
[0220] Один пример способа показан на Фиг. 6А и Фиг. 6В. В данном примере целевые материалы 11С, 11D имеют противоположные заряды.
[0221] Как представлено на Фиг. 6А, первый целевой материал 11С имеет отрицательный заряд, а второй целевой материал 11D имеет положительный заряд. В данном примере можно использовать любые из описанных в настоящем документе заряженных твердых подложек 12. В одном примере отрицательно заряженный первый целевой материал 11С выбран из группы, состоящей из карбоксилированной твердой подложки, покрытой полиглутаминовой кислотой твердой подложки и сульфатно-функционализированной твердой подложки; а положительно заряженный второй целевой материал 11D выбран из группы, состоящей из функционализированной амином твердой подложки, такой как функционализированной хитозаном твердой подложки, а также функционализированной полилизином твердой подложки.
[0222] Целевые материалы 11С, 11D могут быть частью текучей среды 56'', которую вводят в проточную кювету 24. В данном примере текучая среда 56'', используемая для введения заряженных целевых материалов 11С, 11D в проточную кювету 24, может представлять собой электролит. В одном примере текучая среда 56'' может представлять собой комбинацию трис(гидроксиметиламинометана) и борной кислоты, которые присутствуют в одинаковой молярности (например, по 4,5 мМ каждого). При использовании комплексов 10А, 10В в качестве целевых материалов 11С, 11D можно использовать буфер с низким содержанием соли, такой как солевой натрий-цитратный (SSC) буфер (например, около 45 мМ) с добавкой около 4 мМ Mg2 +). Текучая среда 56'' такого типа позволяет получить максимальные заряды на заряженных целевых материалах 11С, 11D, при этом также сохраняется возможность гибридизации при высвобождении фрагментов 14, 14', 14'' из библиотеки. При использовании кластеризованных твердых подложек 13 в качестве целевых материалов 11С, 11D в качестве текучей среды 56'' можно использовать воду.
[0223] Кроме того, плотности текучей среды 56'' и целевых материалов 11С, 11D могут быть приблизительно одинаковы, чтобы плотность целевых материалов 11С, 11D не препятствовала электростатически индуцированной миграции целевых материалов 11С, 11D. В другом примере плотности текучей среды 56'' и целевых материалов 11С, 11D могут отличаться друг от друга. В таком примере величина силы, вызванной приложением электрического поля 62, превышает величину любой силы в связи с различием в плотностях.
[0224] В таком примере способа условие, которым воздействуют на заряженные целевые материалы 11С, 11D для инициирования одновременной миграции и иммобилизации, представляет собой электрическое поле 62, прикладываемое между двумя противоположными поверхностями 30 и 30', 32 и 32' или 31 и 31' для секвенирования для создания положительных зарядов 66 на первой из двух противоположных поверхностей 30, 32, 31 для секвенирования и отрицательных зарядов 68 на второй из двух противоположных поверхностей 30', 32', 31' для секвенирования.
[0225] Для создания электрического поля 62 на проточной кювете 24, каждую поверхность 30, 30' или 32, 32' или 31, 31' для секвенирования можно электрически соединить с источником питания для получения соответствующих электрических зарядов 66, 68, которые притягивают соответствующие целевые материалы 11С, 11D. В показанном на Фиг. 6А и Фиг. 6В примере электрическое поле 62 прикладывают в направлении нижней поверхности 30' для секвенирования, что приводит к появлению положительного заряда на верхней поверхности 30 для секвенирования и отрицательного заряда на нижней поверхности 30' для секвенирования.
[0226] Иммобилизация целевых материалов 11С, 11D при воздействии на текучую среду 56'' в проточной кювете 24 электрическим полем 62 происходит одновременно. Это обусловлено положительным и отрицательным зарядами целевых материалов 11С, 11D и их соответствующими реакциями на приложенное электрическое поле 62. Отрицательно заряженный целевой материал 11С мигрирует к уже имеющей положительный заряд поверхности 30 для секвенирования, где он становится иммобилизованным на захватных сайтах 44 (не показано на Фиг. 6В) верхней поверхности 30 для секвенирования. Положительно заряженный целевой материал 11D мигрирует к уже имеющей отрицательный заряд поверхности 30' для секвенирования, где он становится иммобилизованным на захватных сайтах 44 (не показано на Фиг. 6В) нижней поверхности 30' для секвенирования.
[0227] Электрическое поле 62 можно прикладывать в течение заданного времени. В одном примере заданное время может составлять от около 1 минуты до около 30 минут для получения требуемого количества иммобилизованных единиц целевых материалов 11С, 11D на соответствующих поверхностях 30, 30' для секвенирования. В других примерах электрическое поде 62 можно прикладывать в течение от около 1 минуты до около 2 минут или от около 1 минуты до около 5 минут, или от около 5 минут до около 30 минут и т.д.
[0228] Следует понимать, что некоторая часть целевых материалов 11С, 11D может остаться не иммобилизованной, и такие целевые материалы 11С, 11D будут удалены из проточной кюветы 24 перед дальнейшей обработкой. Перед удалением неиммобилизованных целевых материалов 11С, 11D приложение электрического поля 62 может быть прекращено. Таким образом, данный пример способа может включать снятие электрического поля 62 и затем смывание текучей среды 56'' и неиммобилизованного целевого материала 11С, 11D из проточной кюветы 24. Смывание может включать введение смывающей текучей среды в проточную кювету 24. Поток может вытолкнуть любые целевые материалы 11С, 11D, которые не стали иммобилизованным на поверхностях 30, 30' для секвенирования, наружу через выходной порт проточной кюветы 24. Механизм иммобилизации (например, связывающиеся пары, гибридизация, ковалентное связывание и т.д.) между соответствующими целевыми материалами 11С, 11D и захватными сайтами 44, 44' на поверхностях 30, 30' для секвенирования может не давать любым ставшим иммобилизованными целевым материалам 11С, 11D становиться частью выходного потока.
[0229] При использовании комплексов 10А или 10В в качестве целевых материалов 11С, 11D за данной стадией промывки может следовать высвобождение и амплификация фрагмента из библиотеки (например, пример описан со ссылкой на Фиг. 9А-9С). При использовании кластеризованных твердых подложек 13 за данной стадией промывки может следовать секвенирование.
[0230] Еще один пример способа показан на Фиг. 7А и Фиг. 7В. В данном примере целевые материалы 11Е, 11F различаются в отношении своих магнитных свойств и плотности.
[0231] В данном примере (как показано на Фиг. 7А) целевые материалы 11E, 11F вводят в проточную кювету 24 в текучей среде 56''', которая имеет первую плотность. Как более подробно описано ниже, плотность каждого из целевых материалов 11Е, 11F выбрана относительно указанной первой плотности, т.е. плотности текучей среды 56''' при температуре захвата целевых материалов 11Е, 11F. Температура захвата составляет от около 18°С до около 40°С.
[0232] В примере, показанном на Фиг. 7А и Фиг. 7В, первый целевой материал 11Е является магнитным, а второй целевой материал 11F является немагнитным и имеет плотность выше первой плотности (т.е. плотности текучей среды 56''' при температуре захвата).
[0233] В данном примере первый целевой материал 11Е включает любую из описываемых в настоящем документе магнитно-восприимчивых твердых подложек 12'. Кроме того, плотности текучей среды 56''' и целевого материала 11Е могут быть приблизительно одинаковы, чтобы плотность целевого материала 11Е не препятствовала магнитно индуцированной миграции целевого материала 11Е. В другом примере плотности текучей среды 56''' и целевого материала 11Е могут быть неодинаковы. В данном примере величина силы, вызванной приложением магнитного поля 70, превышает величину любой силы в связи с различием в плотностях.
[0234] Кроме того, в данном примере второй целевой материал 11F включает любую из описываемых в настоящем документе твердых подложек 12, которые не являются магнитно-восприимчивыми. Плотность твердой подложки 12 и тем самым целевого материала 11F превышает плотность текучей среды 56''' при температуре захвата. Таким образом, целевой материал 11F оказывается невосприимчивым к приложенному магнитному полю и способен мигрировать к нижней поверхности 30' для секвенирования или оседать на ней из-за того, что является более тяжелым, чем текучая среда 56'''.
[0235] В данном примере способа текучую среду 56''', содержащую целевые материалы 11Е, 11F, вводят в проточную кювету 24 (Фиг. 7А), а условие, которым воздействуют на целевые материалы 11Е, 11F для инициирования одновременной миграции и иммобилизации, представляет собой приложение магнитной силы 70 (Фиг. 7В). Плотность текучей среды 56''' также можно рассматривать как условие, которое влияет на миграцию и иммобилизацию.
[0236] Магнитную силу (или магнитное поле 70, как показано на Фиг. 7В) можно прикладывать, как описано со ссылкой на Фиг. 4А и Фиг. 4В. В показанном на Фиг. 7В примере магнитную силу/поле 70 прикладывают в направлении верхней поверхности 30 для секвенирования, так что магнитно-восприимчивый (первый) целевой материал 11Е мигрирует в том же направлении к верхней поверхности 30 для секвенирования. Захватные сайты 44 (не показаны на Фиг. 7А или Фиг. 7В) иммобилизируют по меньшей мере часть целевого материала 11Е на верхней поверхности 30 для секвенирования. В то же время твердая подложка 12 целевого материала 11F не является магнитно-восприимчивой, и она тяжелей, чем текучая среда 56''' при температуре захвата. Таким образом, целевой материал 11F мигрирует к нижней поверхности 30' для секвенирования или оседает на ней, как показано на Фиг. 7B. Захватные сайты 44' (не показаны на Фиг. 7А или Фиг. 7В) иммобилизируют по меньшей мере часть целевого материала 11F на нижней поверхности 30' для секвенирования.
[0237] Магнитную силу/поле 70 можно прикладывать в течение заданного времени. В одном примере заданное время может составлять от около 5 минут до около 30 минут для получения требуемого количества иммобилизованных единиц целевого материала 11Е на поверхностях 30 для секвенирования.
[0238] Иммобилизация целевых материалов 11E, 11F при введении целевой несущей среды 56''' в проточную кювету 24 и при воздействии магнитным полем 70 происходит одновременно в силу свойств (как плотности, так и магнитности) целевых материалов 11E, 11F. В способе по Фиг. 7А и Фиг. 7В по меньшей мере часть первого целевого материала 11Е становится иммобилизированной на соответствующих захватных сайтах 44 первой из двух противоположных поверхностей 30 для секвенирования, и по меньшей мере часть второго целевого материала 11F становится иммобилизированной на соответствующих захватных сайтах 44' второй из двух противоположных поверхностей 30 для секвенирования'.
[0239] Следует понимать, что некоторая часть целевых материалов 11Е, 11F может остаться не иммобилизованной, и такие целевые материалы 11E, 11F будут удалены из проточной кюветы 24 перед дальнейшей обработкой. Перед удалением неиммобилизованных целевых материалов 11Е, 11F приложение магнитной силы/поля 70 может быть прекращено. Таким образом, данный пример способа может включать снятие магнитной силы/поля 70 и затем смывание текучей среды 56''' и неиммобилизованного целевого материала 11Е, 11F из проточной кюветы 24. Смывание может включать введение смывающей текучей среды в проточную кювету 24. Поток может вытолкнуть любые целевые материалы 11E, 11F, которые не стали иммобилизованным на поверхностях 30, 30' для секвенирования, наружу через выходной порт проточной кюветы 24. Механизм иммобилизации (например, связывающиеся пары, гибридизация, ковалентное связывание и т.д.) между соответствующими целевыми материалами 11Е, 11F и захватными сайтами 44, 44' на поверхностях 30, 30' для секвенирования может не давать любым ставшим иммобилизованными целевым материалам 11Е, 11F становиться частью выходного потока.
[0240] При использовании комплексов 10А или 10В в качестве целевых материалов 11Е, 11F за данной стадией промывки может следовать высвобождение и амплификация фрагмента из библиотеки (например, пример описан со ссылкой на Фиг. 9А-9С). При использовании кластеризованных твердых подложек 13 в качестве целевых материалов 11E, 11F за данной стадией промывки может следовать секвенирование.
[0241] Показанный на Фиг. 7А и Фиг. 7В пример способа также можно выполнять таким образом, что целевой материал 11Е, который является магнитно-восприимчивым, становится иммобилизованным на нижней поверхности 30' для секвенирования, а целевой материал 11F, который является не магнитно-восприимчивым, становится иммобилизованным на верхней поверхности 30 для секвенирования. В данном примере не магнитно-восприимчивый целевой материал 11F включает твердую подложку 12, которая выбрана таким образом, чтобы иметь плотность ниже плотности текучей среды 56''' при температуре захвата. В данном примере целевой материал 11Е является восприимчивым к магнитной силе/полю (приложенному в направлении нижней поверхности 30' для секвенирования) и притягивается к нижней поверхности 30' для секвенирования, а целевой материал 11F не является восприимчивым к приложенному магнитному полю и способен плавать или мигрировать к верхней поверхности 30 для секвенирования, т.к. он является более легким, чем текучая среда 56'''.
[0242] Еще один пример способа показан на Фиг. 8А и Фиг. 8В. В данном примере целевые материалы 11G, 11Н различаются в отношении заряда и плотности.
[0243] В данном примере целевые материалы 11G, 11Н вводят в проточную кювету 24 в текучей среде 56'''', которая имеет первую плотность. Как более подробно описано ниже, плотность каждого из целевых материалов 11G, 11Н выбрана относительно указанной первой плотности, т.е. плотности текучей среды 56'''' при температуре захвата целевых материалов 11G, 11Н. Температура захвата составляет от около 18°С до около 40°С.
[0244] В данных примерах текучая среда 56'''' представляет собой электролит.
[0245] В показанном на Фиг. 8А и Фиг. 8В примере первый целевой материал 11G заряжен отрицательно, а второй целевой материал 11H является нейтральным (не заряжен) и имеет плотность выше первой плотности (т.е. плотности текучей среды 56'''' при температуре захвата). В данном примере первый целевой материал 11G включает любую из описываемых в настоящем документе отрицательно заряженных твердых подложек, таких как карбоксилированная твердая подложка, покрытая полиглутаминовой кислотой твердая подложка или сульфатно-функционализированная твердая подложка. Кроме того, плотность текучей среды 56'''' и плотность целевого материала 11G могут быть приблизительно одинаковы, чтобы плотность целевого материала 11G не препятствовала электростатически индуцированной миграции отрицательно заряженного целевого материала 11G. Альтернативно плотность целевого материала 11G может быть ниже плотности текучей среды 56'''', и как плотность, так и заряд могут способствовать миграции целевого материала 11G.
[0246] В других примерах представленного на Фиг. 8А и Фиг. 8В способа первый целевой материал 11G заряжен положительно, а второй целевой материал 11Н является нейтральным (не заряжен) и имеет плотность выше первой плотности (т.е. плотности текучей среды 56'''' при температуре захвата). В данном примере первый целевой материал 11G включает любую из описываемых в настоящем документе положительно заряженных твердых подложек, таких как функционализированная амином твердая подложка (например, функционализированная хитозаном или полилизином твердая подложка). Кроме того, плотность текучей среды 56'''' и плотность целевого материала 11G могут быть приблизительно одинаковы, чтобы плотность целевого материала 11G не препятствовала электростатически индуцированной миграции положительно заряженного целевого материала 11G. Альтернативно плотность целевого материала 11G может быть ниже плотности текучей среды 56'''', и как плотность, так и заряд могут способствовать миграции целевого материала 11G.
[0247] В показанном на Фиг. 8А и Фиг. 8В примере второй целевой материал 11Н включает любую из описываемых в настоящем документе твердых подложек 12, которые не заряжены. Плотность твердой подложки 12 и тем самым целевого материал 11H превышает плотность текучей среды 56'''' при температуре захвата. Таким образом, целевой материал 11Н оказывается невосприимчивым к приложенному электрическому полю 62 и способен мигрировать к нижней поверхности 30' для секвенирования или оседать на ней, т.к. он является более тяжелым, чем текучая среда 56''''.
[0248] Текучую среду 56'' '', содержащую целевые материалы 11G, 11Н, вводят в проточную кювету 24, а условие, которым воздействуют на целевые материалы 11G, 11H для инициирования одновременной миграции и иммобилизации, представляет собой приложение электрического поля 62. Плотность текучей среды 56'''' также можно рассматривать как условие, которое влияет на миграцию и иммобилизацию.
[0249] Электрическое поле 62 можно прикладывать, как описано со ссылкой на Фиг. 6А и Фиг. 6В. В показанном на Фиг. 8А примере (когда целевой материал 11G заряжен отрицательно) электрическое поле 62 прикладывается в направлении нижней поверхности 30' для секвенирования. Это приводит к появлению положительного заряда на верхней 30 поверхности для секвенирования и отрицательного заряда на нижней поверхности 30' для секвенирования. В данном примере отрицательно заряженный целевой материал 11G мигрирует к уже имеющей положительный заряд поверхности 30 для секвенирования, где он становится иммобилизованным на захватных сайтах 44 (не показано на Фиг. 8А или Фиг. 8В) верхней поверхности 30 для секвенирования. В то же время твердая подложка 12 целевого материала 11H не заряжена, и она тяжелей текучей среды 56'''' при температуре захвата. Таким образом, целевой материал 11Н мигрирует к нижней поверхности 30' для секвенирования или оседает на ней, как показано на Фиг. 8В. Захватные сайты 44' (не показаны на Фиг. 8А или Фиг. 8В) иммобилизируют по меньшей мере часть целевого материала 11Н на нижней поверхности 30' для секвенирования.
[0250] Как отмечалось выше, в других примерах представленного на Фиг. 8А и Фиг. 8В способа целевой материал 11G заряжен положительно. В таком примере электрическое поле 62 прикладывают в направлении верхней поверхности 30 для секвенирования (т.е. в направлении, противоположном показанному на Фиг. 8А и Фиг. 8В). Это приводит к появлению положительного заряда на нижней поверхности 30' для секвенирования и отрицательного заряда на верхней поверхности 30 для секвенирования. В данном примере положительно заряженный целевой материал 11G мигрирует к уже имеющей отрицательный заряд поверхности 30 для секвенирования, где он становится иммобилизованным на захватных сайтах 44 верхней поверхности 30 для секвенирования. В то же время твердая подложка 12 целевого материала 11Н не заряжена, и она тяжелей текучей среды 56'''' при температуре захвата. Таким образом, целевой материал 11Н мигрирует к нижней поверхности 30' для секвенирования или оседает на ней аналогично Фиг. 8В. Захватные сайты 44' (также не показаны на Фиг. 8В) иммобилизируют по меньшей мере часть целевого материала 11H на нижней поверхности 30' для секвенирования.
[0251] В любом из представленных на Фиг. 8А и Фиг. 8В примеров электрическое поле 62 можно прикладывать в течение заданного времени. В одном примере заданное время может составлять от около 1 минуты до около 30 минут для получения требуемого количества иммобилизованных единиц целевого материала 11G на противоположно заряженных поверхностях 30, 30' для секвенирования.
[0252] Иммобилизация целевых материалов 11G, 11H при введении целевой несущей среды 56'''' в проточную кювету 24 и при воздействии электрическим полем 62 происходит одновременно в силу свойств (как плотности, так и заряда) целевых материалов 11G, 11H. В способе по Фиг. 8А и Фиг. 8В по меньшей мере часть первого целевого материала 11G становится иммобилизированной на соответствующих захватных сайтах 44 первой из двух противоположных поверхностей 30 для секвенирования, и по меньшей мере часть второго целевого материала 11H становится иммобилизированной на соответствующих захватных сайтах 44' второй из двух противоположных поверхностей 30 для секвенирования'.
[0253] Следует понимать, что некоторая часть целевых материалов 11G, 11Н может остаться не иммобилизованной, и такие целевые материалы 11G, 11Н будут удалены из проточной кюветы 24 перед дальнейшей обработкой. Перед удалением неиммобилизованных целевых материалов 11G, 11Н приложение электрического поля 62 может быть прекращено. Таким образом, данный пример способа может включать снятие электрического поля 62 и затем смывание текучей среды 56'''' и неиммобилизованного целевого материала 11G, 11Н из проточной кюветы 24. Смывание может включать введение смывающей текучей среды в проточную кювету 24. Поток может вытолкнуть любые целевые материалы 11G, 11Н, которые не стали иммобилизованным на поверхностях 30, 30' для секвенирования, наружу через выходной порт проточной кюветы 24. Механизм иммобилизации (например, связывающиеся пары, гибридизация, ковалентное связывание и т.д.) между соответствующими целевыми материалами 11G, 11H и захватными сайтами 44, 44' на поверхностях 30, 30' для секвенирования может не давать любым ставшим иммобилизованными целевым материалам 11G, 11Н становиться частью выходного потока.
[0254] При использовании комплексов 10А или 10В в качестве целевых материалов 11G, 11Н за данной стадией промывки может следовать высвобождение и амплификация фрагмента из библиотеки (например, пример описан со ссылкой на Фиг. 9А-9С). При использовании кластеризованных твердых подложек 13 в качестве целевых материалов 11G, 11H за данной стадией промывки может следовать секвенирование.
[0255] Показанный на Фиг. 8А и Фиг. 8В пример способа также можно выполнять таким образом, что целевой материал 11G не заряжен и имеет плотность ниже плотности целевой текучей среды 56''''. В данном примере целевой материал 11H заряжен положительно. В данном примере положительно заряженный целевой материал 11H реагирует на электрическое поле 62 (приложенное в направлении нижней поверхности 30' для секвенирования) и притягивается к нижней поверхности 30' для секвенирования. Кроме того, в данном примере целевой материал 11G не является восприимчивым к приложенному магнитному полю и способен плавать или мигрировать к верхней поверхности 30 для секвенирования, т.к. он является более легким, чем текучая среда 56'''.
[0256] Следует понимать, что для иммобилизации двух разных целевых материалов 11 можно комбинировать и другие ортогональные подходы и воздействия. Каждый целевой материал 11 может быть восприимчивым к одному из ортогональных подходов/воздействий, но не к другому, что позволяет независимо воздействовать на один из целевых материалов 11. Например, незаряженный магнитно-восприимчивый целевой материал 11 можно комбинировать с заряженным не магнитно-восприимчивым целевым материалом 11. В данном примере магнитное поле 70 можно приложить в одном направлении для направления миграции незаряженного магнитно-восприимчивого целевого материала 11 к одной поверхности 30, 32, 31 из противоположных поверхностей 30, 30' или 32, 32' или 31, 31' для секвенирования, а электрическое поле 62 можно приложить в противоположном направлении для направления миграции заряженного не магнитно-восприимчивого целевого материала ко второй поверхности 30', 32', 31' из противоположных поверхностей 30, 30' или 32, 32' или 31, 31' для секвенирования. Хотя было приведено несколько примеров, возможно применение и других комбинаций целевых материалов и подходов/воздействий.
[0257] Высвобождение фрагментов из библиотеки из комплексов и секвенирование
[0258] После иммобилизации целевого материала 11 на обеих противоположных поверхностях 30 и 30' или 32 и 32' или 31 и 31' проточной кюветы 24 данная проточная кювета 24 готова к дальнейшему анализу.
[0259] В примерах с использованием комплексов 10А, 10В, иммобилизованных на обеих противоположных поверхностях 30 и 30' или 32 и 32', проточная кювета 24 готова высвобождению фрагментов из библиотеки, амплификации и секвенированию.
[0260] После иммобилизации и удаления неиммобилизованного целевого материала (например, комплексов 10А, 10В) примеры способов включают инициирование высвобождения готовых к секвенированию фрагментов 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот с твердых подложек 12 или 12' иммобилизованных комплексов 10А, 10В, таким образом высеивая по меньшей мере часть готовых к секвенированию фрагментов 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот на соответствующие праймеры 42, 42' двух противоположных поверхностей 30, 30' или 32, 32' для секвенирования; и удаление твердых подложек 12 или 12' и невысеянных готовых к секвенированию фрагментов 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот. За этими стадиями может следовать любая из описанных в настоящем документе методик амплификации, включая описанную со ссылкой на Фиг. 9А-9С.
[0261] Перед высвобождением фрагментов 14, 14', 14'' в проточную кювету 24 можно добавить внешний иммобилизующий агент. В одном примере внешний иммобилизующий агент представляет собой воздух или жидкую среду или вязкую среду, которая не смешивается с целевым материалом 11 (более конкретно, комплексами 10А, 10В), который был введен в проточную кювету 24. Воздух можно использовать для аспирации промывочной текучей среды из проточной кюветы 24, что может привести к созданию капли жидкости, которая окружает комплексы 10А, 10В и формирует диффузионный барьер вокруг каждого из комплексов 10А, 10В. Жидкий или вязкий иммобилизующий агент по меньшей мере частично окружает комплексы 10А, 10В, иммобилизованные внутри проточной кюветы 24. Внешний иммобилизующий агент может помочь свести к минимуму диффузию готовых к секвенированию фрагментов 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот при высвобождении фрагментов 14, 14', 14'' с твердых подложек 12 или 12'. Когда внешний иммобилизующий агент представляет собой термочувствительный материал, поднятие температуры до температуры посева может сделать агент более вязким и перевести его в форму, которая еще больше сводит к минимуму диффузию библиотеки.
[0262] Затем можно инициировать высвобождение готовых к секвенированию фрагментов 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот с твердых подложек 12 или 12'. В одном примере в проточную кювету 24 можно ввести расщепляющий агент и создать стимул для запуска работы расщепляющего агента по высвобождению готовых к секвенированию фрагментов 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот с твердых подложек 12 или 12'. В других примерах высвобождение готовых к секвенированию фрагментов 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот может включать нагрев проточной кюветы 24 выше температуры плавления праймера, который гибридизируется с фрагментами 14, 14', 14''.
[0263] При высвобождении транспорт и посев готовых к секвенированию фрагментов 14, 14' или 14'' нуклеиновых кислот могут быть ограничены внешним иммобилизующим агентом. Таким образом, фрагменты 14, 14' или 14'' любого конкретного комплекса 10А, 10В могут быть ограничены в пространстве областью поверхности 30, 30' или 32, 32' для секвенирования вблизи того конкретного комплекса 10А, 10В, из которого высвобождаются фрагменты 14, 14' или 14''.
[0264] Праймеры 42, 42' соответствующих поверхностей 30, 30' или 32, 32' для секвенирования проточной кюветы 24 могут связать высвобожденные готовые к секвенированию фрагменты 14, 14' или 14'' нуклеиновых кислот. Посев осуществляют путем гибридизации между первой или второй последовательностями фрагмента 14, 14' или 14'' и комплементарной последовательностью праймеров 42, 42' на соответствующих поверхностях 30, 30' или 32, 32' для секвенирования. Посев можно проводить при соответствующей температуре гибридизации фрагмента 14, 14' или 14'' и праймера (-ов) 42, 42'. В одном примере посев происходит при температуре около 80°С, после этого происходит снижение температуры до комнатной (например, 25°С).
[0265] Местоположение посева готовых к секвенированию фрагментов 14, 14' или 14'' нуклеиновых кислот внутри проточной кюветы 24 частично зависит от того, как прикреплены праймеры 42, 42'. В примерах проточной кюветы 24 с непрофилированными поверхностями 30, 30' для секвенирования высвобожденные готовые к секвенированию фрагменты 14, 14' или 14'' нуклеиновых кислот будут связаны на полимерных гидрогелях 40, 40' в вогнутых областях 38, 38'. В примерах проточной кюветы 24 с профилированными поверхностями 32, 32' для секвенирования высвобожденные готовые к секвенированию фрагменты 14, 14' или 14'' нуклеиновых кислот будут связаны на полимерных гидрогелях 40, 40' внутри каждого из углублений 48, 48'.
[0266] Пример высеянных готовых к секвенированию фрагментов 14, 14' или 14'' нуклеиновых кислот в различных углублениях 48, 48' вдоль профилированных поверхностей 32, 32' для секвенирования проточной кюветы 24 показан на Фиг. 9А.
[0267] Твердые подложки 12, 12' затем можно удалить из проточной кюветы 24. Удаление твердых подложек 12, 12' может включать любую соответствующую методику, которая зависит от механизма прикрепления твердых подложек 12, 12' к захватным сайтам 44, 44'. В качестве примеров можно использовать денатурирование, расщепление связей и т.д. Удаление твердых подложек 12, 12' может также привести к удалению невысеянных готовых к секвенированию фрагментов 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот. Удаление твердых подложек 12, 12' может также привести к удалению жидких или вязких форм внешнего иммобилизующего агента.
[0268] Высеянные фрагменты 14, 14', 14'' из библиотеки для секвенирования затем можно амплифицировать путем образования кластеров.
[0269] В одном примере образования кластеров готовые к секвенированию фрагменты 14, 14' или 14'' нуклеиновых кислот копируются из гибридизированных праймеров 42, 42' путем удлинения с 3'-конца с использованием высокоточной ДНК-полимеразы. Высокоточная ДНК-полимераза может быть частью амплификационной смеси, которую вводят в проточную кювету 24. Амплификационная смесь может также включать другие соответствующие реагенты для полимеразной цепной реакции. Первоначальные готовые к секвенированию фрагменты 14, 14' или 14'' нуклеиновых кислот денатурируют, в результате чего копии остаются иммобилизованными на поверхностях 30, 30' или 32, 32' для секвенирования. Для амплификации иммобилизованных копий можно использовать изотермическую мостиковую амплификацию или некоторую другую форму амплификации. Например, скопированные темплаты образуют петлю и гибридизируются со смежным комплементарным праймером 42, 42', а полимераза копирует скопированные темплаты с образованием двухцепочечных мостиков, которые денатурируют с образованием двух одноцепочечных цепей. Эти две цепи образуют петли и гибридизируются со смежными комплементарными праймерами 42, 42', а затем снова удлиняются с образованием двух новых двухцепочечных петель. Процесс повторяют на каждой копии темплата в циклах изотермической денатурации и амплификации с получением плотных клональных кластеров. Каждый кластер двухцепочечных мостиков денатурируют. В примере обратную цепь удаляют посредством специфического расщепления оснований, в результате чего остаются шаблонные полинуклеотидные цепи прямого направления. Кластеризация приводит к образованию нескольких темплатных полинуклеотидных цепей вдоль поверхностей 30, 30' или 32, 32' для секвенирования. Данный пример кластеризации является мостиковой амплификацией и представляет собой один из примеров проводимой амплификации. Следует понимать, что можно использовать и другие методики амплификации, такие как протокол амплификации кинетического исключения (Examp, Illumina Inc.).
[0270] Другой пример амплификации и тем самым образования кластера включает использование термочувствительного материала. Данный пример схематически показан на Фиг. 9А-9С. Данный пример способа включает введение амплификационной смеси, содержащей жидкую форму 63 термочувствительного материала, в проточную кювету 24; инициирование гелеобразования жидкой формы 63 термочувствительного материала (что обеспечивает гелеобразную форму 63' термочувствительного материала); инициирование амплификации высеянных готовых к секвенированию фрагментов 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот для получения темплатных цепей 64, при этом гелеобразная форма 63' термочувствительного материала уменьшает диффузию темплатных цепей 64; инициирование разжижения гелеобразной формы 63' термочувствительного материала (что обеспечивает жидкую форму 63 термочувствительного материала); и удаление жидкой формы 63 термочувствительного материала из проточной кюветы 24.
[0271] Как показано на Фиг. 9А, амплификационную смесь, содержащую жидкую форму 63 термочувствительного материала, вводят в проточный канал 28, например, через входное отверстие. В дополнение к жидкой форме 63 термочувствительного материала данный пример амплификационной смеси также включает высокоточную ДНК-полимер азу и любые другие соответствующие реагенты для полимеразной цепной реакции.
[0272] Термочувствительный материал способен переходить из жидкой формы 63 в гелеобразную форму 63' при изменении температурных условий, в которых находится материал. В жидкой форме 63 молекулы термочувствительного материала не сцеплены друг с другом и поэтому способны течь. В гелеобразной форме 63' молекулы термочувствительного материала сшиты друг с другом и поэтому не способны течь. Гелеобразная форма 63' содержит поры, каналы или иные отверстия, которые могут i) облегчить диффузионный обмен малых молекул, белков и реагентов для доступа к высеянным готовым к секвенированию фрагментам 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот для амплификации, а также ii) затруднить или исключить перемещение высеянных готовых к секвенированию фрагментов 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот или темплатных цепей 64 из-за диффузии или конвекции. Таким образом, можно использовать любой термочувствительный материал, который i) облегчает амплификацию в геле, ii) ограничивает диффузию, конвекцию или иное перемещение высеянных готовых к секвенированию фрагментов 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот и темплатных цепей 64, iii) может быть закачан или иным образом напущен в форме жидкости до проведения сшивки, iv) допускает контролируемое проведение сшивки и гелеобразования, и v) допускает контролируемое снятие сшивки и разжижение.
[0273] Примеры термочувствительного материала включают дисульфидно-сшитый полиакриламид, агарозу, альгинат и сополимер поли(N-изопропилакриламида) (PNIPAAm) и полиэтиленгликоля (PEG). Для каждого из этих материалов амплификацию можно проводить при температурах, которые не приведут к плавлению гелеобразной формы 63'.
[0274] Сополимер PNIPAAm и PEG представляет собой жидкость при низких температурах и гель при высоких температурах. Один пример сополимера PNIPAAm и PEG представляет собой жидкость при температурах ниже 29°С и гель при температурах выше 32°С. Температуру гелеобразования сополимера PNIPAAm и PEG можно регулировать изменением соотношения поли(N-изопропилакриламида) и полиэтиленгликоля в сополимере.
[0275] Амплификационную смесь загружают в проточную кювету 24 при условиях, когда реакция амплификации не протекает. Например, амплификация не протекает при 4°С, и, таким образом, амплификационную смесь (содержащую жидкую форму 63 термочувствительного материала) можно вводить при данной температуре.
[0276] Инициирование гелеобразования жидкой формы 63 термочувствительного материала и тем самым получение его гелеобразной формы 63' можно выполнить путем доведения температуры проточной кюветы 24 и содержащегося в ней термочувствительного материала до температуры гелеобразования термочувствительного материала. Гелеобразная форма 63' показана на Фиг. 9В. Температура, до которой доводят проточную кювету 24, будет зависеть от используемого термочувствительного материала.
[0277] Инициирование амплификации высеянных готовых к секвенированию фрагментов 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот генерирует темплатные цепи 64, как показано на Фиг. 9В. Амплификацию можно запустить путем доведения температуры проточной кюветы 24 и содержащейся в ней амплификационной смеси до температуры, при которой ПЦР-реагенты становятся активными. В процессе амплификации гелеобразная форма 63' термочувствительного материала уменьшает перемещение высеянных готовых к секвенированию фрагментов 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот и темплатных цепей 64.
[0278] Инициирование разжижения гелеобразной формы 63' термочувствительного материала и тем самым получение его жидкой формы 63 можно выполнить путем повторного доведения температуры проточной кюветы 24 и содержащегося в ней термочувствительного материала до температуры разжижения термочувствительного материала. Температура, до которой доводят проточную кювету 24, также будет зависеть от температуры используемого термочувствительного материала.
[0279] Затем жидкую форму 63 можно выкачать из проточной кюветы 24 для подготовки проточной кюветы 24 к последующему секвенированию. Проточная кювета 24 после удаления жидкой формы 63 термочувствительного материала показана на Фиг. 9С.
[0280] А одном конкретном примере в амплификационной смеси используют сополимер PNIPAAm и PEG, причем его используют в сочетании с опосредуемой рекомбиназой полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Для управления амплификацией можно использовать температурную программу, т.к. типичный опосредуемый рекомбиназой изотермический ПЦР неактивен при 4°С и активен при 37°С или других высоких температурах, а сополимер PNIPAAm и PEG является жидкостью при температурах ниже 29°С и гелем при температурах выше 32°С. В данном примере амплификационную смесь можно вводить в проточную кювету 24 при температуре около 4°С в виде жидкой смеси. Затем температуру можно поднять до около 37°С для одновременного перевода сополимера в гелеобразное состояние и начала ПЦР амплификации. После завершения реакции гелеобразную форму 63' сополимера можно перевести в жидкую форму путем понижения температуры до менее 29°С, например до около 8°С (которая является соответствующей температурой для секвенирования). Затем жидкую форму 63 можно выкачать из проточной кюветы 24 для подготовки проточной кюветы 24 к последующему секвенированию.
[0281] Использование термочувствительного материала 63, 63' позволяет свести к минимуму диффузию высеянных готовых к секвенированию фрагментов 14, 14' или 14'' нуклеиновых кислот и амплифицированных темплатных цепей 64 и удержать их от перемещения (например, в результате диффузии или свободной конвекции) в соседнее углубление 48, 48' профилированных поверхностей 32, 32' для секвенирования или из первоначального местоположения посева на непрофилированных поверхностях 30, 30' для секвенирования. За счет ограничения или исключения такого перемещения образующиеся кластеры остаются в относительно изолированных областях проточной кюветы 24, что позволяет прочитывать каждый кластер индивидуально, без избыточности. Перемещения также могут приводить к образованию гибридных молекул, которые не присутствуют среди исходных фрагментов 14, 14', 14'' из библиотеки для секвенирования, что приводит к неточности данных секвенирования. За счет ограничения или исключения такого перемещения подобные гибридные молекулы не образуются, что повышает точность получаемых данных секвенирования.
[0282] Хотя на Фиг. 9А-9С представлена проточная кювета 24 с профилированными поверхностями 32, 32' для секвенирования, следует понимать, что способ также можно выполнять и с использованием непрофилированных поверхностей 30, 30' для секвенирования.
[0283] Кроме того, показанный на Фиг. 9А-9С способ можно выполнять с любыми готовыми к секвенированию фрагментами 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот, включая фрагменты, не привязанные к твердой подложке 12, 12'. В данном примере можно использовать любую соответствующую методику подготовки библиотек, которая обеспечивает добавление требуемых адаптеров к образцу фрагментированной ДНК. Готовые к секвенированию фрагменты 14, 14', 14'' нуклеиновых кислот можно ввести в проточную кювету и посеять на ее поверхность (-и) 30, 30' или 32, 32' для секвенирования. После посева фрагментов из библиотеки можно выполнить способ, описанный на Фиг. 9А-9С.
[0284] Следует также понимать, что показанный на Фиг. 9А-9С способ невозможно выполнять с кластеризованными твердыми подложками 13, поскольку такие целевые материалы 11 не открываются для амплификации на проточной кювете 24.
[0285] Затем можно ввести праймер для секвенирования, который гибридизируется с комплементарной последовательностью на темплатной полинуклеотидной цепи. Данный праймер для секвенирования подготавливает темплатную полинуклеотидную цепь 64 к секвенированию 3'-концы темплатов 64 и любые связанные с проточной кюветой праймеры 42, 42' (не прикрепленные к копиям) можно заблокировать для предотвращения помех реакции секвенирования и, в частности, для предотвращения нежелательного праймирования.
[0286] Для инициирования секвенирования в проточную кювету 24 можно добавить инкорпорационную смесь. В одном примере инкорпорационная смесь включает жидкий носитель, полимеразу и флуоресцентно-меченые нуклеотиды. Флуоресцентно-меченые нуклеотиды включают группу, блокирующую 3' ОН конец. При введении инкорпорационной смеси в проточную кювету 24 текучая среда поступает в проточный канал 28, а в некоторых примерах в углубления 48, 48' (где присутствуют темплатные полинуклеотидные цепи).
[0287] Флуоресцентно-меченые нуклеотиды добавляются к праймеру для секвенирования (с удлинением праймера) зависимым от матрицы образом, так что детекцию порядка и типа нуклеотидов, добавляемых к праймеру для секвенирования, можно использовать для определения последовательности темплата. Более конкретно, один из нуклеотидов встраивается соответствующей полимеразой в растущую цепь, которая удлиняет праймер для секвенирования и которая комплементарна темплатной полинуклеотидной цепи. Иными словами, в по меньшей мере некоторых из темплатных полинуклеотидных цепей на проточной кювете 24 соответствующая полимераза удлиняет гибридизированный праймер для секвенирования на один из нуклеотидов в инкорпорационной смеси.
[0288] Такое встраивание нуклеотидов можно обнаруживать с помощью события визуализации. Во время события визуализации система освещения (не показана) может подавать возбуждающий свет на соответствующие поверхности 30, 30' или 32, 32' для секвенирования.
[0289] В некоторых примерах нуклеотиды могут дополнительно обладать свойством обратимой терминации (например, содержать группу, блокирующую 3' ОН конец), которое прекращает дальнейшее удлинение праймера после добавления нуклеотида к праймеру для секвенирования. Например, к праймеру для секвенирования может быть добавлен нуклеотидный аналог, имеющий функциональную группу - обратимый терминатор, так что последующее удлинение не будет происходить до тех пор, пока для удаления функциональной группы не будет подан разблокирующий агент. Таким образом, для примеров с обратимой терминацией в проточную кювету 24 можно подавать разблокирующий реагент и т.п. (после детектирования).
[0290] Промывка (-и) может (могут) происходить между различными стадиями подачи текучей среды. Затем цикл SBS можно повторять n раз для удлинения праймера для секвенирования на n нуклеотидов и таким образом определять последовательность длиной n.
[0291] В некоторых примерах можно секвенировать и удалить прямые цепи, а затем можно сконструировать и секвенировать обратные цепи согласно приведенному в настоящем документе описанию.
[0292] Хотя подробно был описан метод SBS, следует понимать, что проточную кювету 24, описанную в настоящем документе, можно использовать и с другим протоколом секвенирования, для генотипирования или в других химических и/или биологических сферах применения. В некоторых случаях праймеры 42, 42' проточной кюветы 24 можно выбрать для проведения одновременного секвенирования парных прочтений, где на полимерном гидрогеле 40, 40' присутствуют как прямая, так и обратная цепи, что позволяет одновременно распознавать основания для каждого прочтения. Последовательное и одновременное секвенирование парных прочтений облегчает обнаружение геномных перестроек и повторяющихся элементов последовательностей, а также слияний генов и новых транскриптов.
[0293] Кластеризованные твердые подложки и секвенирование
[0294] Как отмечалось выше, после иммобилизации целевого материала 11 на обеих противоположных поверхностях 30 и 30' или 32 и 32' или 31 и 31' проточной кюветы 24 проточная кювета 24 готова к дальнейшему анализу. Когда кластеризованные твердые подложки 13 становятся иммобилизованными на обеих противоположных поверхностях 31 и 31' проточной кюветы 24, данная проточная кювета 24 готова к секвенированию. В данных примерах проточная кювета 24 готова к секвенированию, поскольку амплификация и образование кластеров уже было проведено на твердых подложках 12 или 12' за пределами проточной кюветы 24.
[0295] Секвенирование можно проводить согласно приведенному в настоящем документе описанию путем введения праймера для секвенирования и инкорпорационной смеси и выполнения последовательных циклов секвенирования.
[0296] Для дополнительной иллюстрации настоящего описания в настоящем документе приведены примеры. Следует понимать, что эти примеры приведены в целях иллюстрации и их не следует рассматривать как ограничивающий объем настоящего описания.
НЕ ИМЕЮЩИЕ ОГРАНИЧИТЕЛЬНОГО ХАРАКТЕРА РАБОЧИЕ ПРИМЕРЫ
[0297] Пример 1
[0298] Получили комплексы, аналогичные показанным на Фиг. 1А, со средним диаметром 3 мкм. В качестве твердых подложек в комплексах использовали покрытые стрептавидином гранулы DYNABEADS™ М-280 от компании ThermoFisher Scientific. Каждая из твердых подложек имеет плотность около 1,18 г/см3. Фрагменты на конкретной грануле были из одной и той же длинной молекулы ДНК (из генома бактериофага PhiX). Фрагменты из библиотеки были прикреплены к твердой подложке через олигонуклеотид дестиобиотина, который имеет меньшее сродство к стрептавидину на поверхности гранулы по сравнению с биотином. Фрагменты из библиотеки включали последовательности Р5' и Р7, а также индексные последовательности и последовательности чтения 1 и чтения 2.
[0299] Комплексы загружали в проточную кювету с противоположными профилированными поверхностями для секвенирования (содержащими праймеры Р5 и Р7) с использованием примера способа, аналогичного описанному на Фиг. 3А и Фиг. 3В.
[0300] Более конкретно, комплексы сначала разделили между двумя текучими средами, причем первая имела плотность около 2 г/см3, а вторая имела плотность около 1 г/см3. Первая текучая среда представляла собой раствор 1 г/мл поливольфрамата натрия (500 мг поливольфрамата натрия на 500 мкл солевого натрий-цитратного буфера с додецилсульфатом натрия) и содержала комплексы в концентрации 600 000 комплексов на 1 мкл. Вторая текучая среда представляла собой солевой натрий-цитратный буфер с додецилсульфатом натрия и содержала комплексы в концентрации 600 000 комплексов на 1 мкл.
[0301] Первую текучую среду ввели в проточную кювету и дали комплексам иммобилизоваться на верхней поверхности проточной кюветы. Затем проточную кювету промыли промывочным раствором. В проточную кювету ввели вторую текучую среду и дали комплексам иммобилизоваться на нижней поверхности проточной кюветы. Прикрепление комплексов к соответствующим поверхностям осуществлялось за счет якоря (например, комплементарные праймеры с биотином гибридизировали к праймерам Р5, прикрепленным к гелеобразному материалу, или линкеры алкин-PEG-биотин ковалентно присоединяли к свободным азидам на гелеобразном материале с использованием клик-химии).
[0302] На Фиг. 10А показано изображение в светлом поле верхней поверхности после иммобилизации комплексов, а на Фиг. 10В показано изображение в светлом поле нижней поверхности после иммобилизации комплексов. Темные участки на каждом изображении соответствуют иммобилизованным комплексам.
[0303] Затем ввели свободный биотин в солевом натрий-цитратном буфере с додецилсульфатом натрия и нагрели проточную кювету до около 80°С для высвобождения библиотек из соответствующих комплексов. Затем выполняли кластеризацию с применением изотермической амплификации. Кластеры окрасили красителем Sytox green, и полученные изображения (не представленные в настоящем документе) подтвердили образование кластеров темплатных цепей на каждой из поверхностей для секвенирования проточной кюветы.
[0304] Затем выполнили секвенирование на проточной кювете. Некоторые из данных секвенирования, полученных для верхней и нижней поверхностей проточной кюветы, показаны на Фиг. 11А и Фиг. 11В.
[0305] На Фиг. 11А представлена гистограмма молекулярного покрытия для одной дорожки проточной кюветы на верхней и нижней поверхностях. Эти данные демонстрируют диапазон и однородность секвенирующего покрытия для дорожки.
[0306] На Фиг. 11В представлена процентная доля показателей качества распознавания оснований (Qscore) выше Q30 для различных номеров цикла секвенирования в одной дорожке проточной кюветы для верхней и нижней поверхностей. Величина Qscore, равная 30 (Q30), эквивалентна вероятности неправильного распознавания основания 1 из 1000. Это значит, что точность распознавания основания (т.е. вероятность правильного распознавания основания) равна 99,9%. Меньшая точность распознавания основания в 99% (Q20) даст вероятность неправильного распознавания основания 1 из 100, это означает, что на каждые 100 прочтений пар оснований при секвенировании, вероятно, будет приходиться ошибка. Когда качество секвенирования достигает Q30, практически все прочтения будут идеальными, с нулевой ошибкой и неоднозначностью. Как показано на Фиг. 11В, доля показателей Qscore выше Q30 в целом находилась в диапазоне от 60% до 99% для всех циклов секвенирования.
[0307] Все полученные данные подтвердили, что более плотная текучая среда (в данном примере первая текучая среда) была совместима с поверхностью для секвенирования проточной кюветы.
[0308] Пример 2
[0309] Получили комплексы, аналогичные показанным на Фиг. 1А, со средним диаметром 3 мкм. В качестве твердых подложек в комплексах использовали покрытые стрептавидином гранулы DYNABEADS™ М-280 от компании ThermoFisher Scientific. Каждая из твердых подложек имеет плотность около 1,18 г/см3. Фрагменты на конкретной грануле были из одной и той же длинной молекулы ДНК (из генома бактериофага PhiX).
[0310] В данном примере дорожки проточной кюветы (причем противоположные поверхности покрыты гелеобразным материалом) подготовили с разными концентрациями захватных сайтов (а именно линкеров алкин-PEG-биотин). Эти линкеры были ковалентно присоединены к свободным азидам на гелеобразном материале в дорожках проточной кюветы с использованием клик-химии. Дорожки проточной кюветы промыли и обработали раствором алкин-PEG-биотина с концентрациями около 0,5 мкМ, около 5 мкМ или около 25 мкМ соответственно. Растворы инкубировали в течение около 30 минут при температуре около 60°С. Затем дорожки проточной кюветы снова промыли.
[0311] Комплексы сначала разделили между двумя текучими средами, причем первая имела плотность около 1 г/см3, а вторая имела плотность около 2 г/см3. Первая текучая среда представляла собой солевой натрий-цитратный буфер с додецилсульфатом натрия и содержала комплексы в концентрации 25 000 комплексов на мкл. Вторая текучая среда представляла собой раствор 2 г/мл поливольфрамата натрия и содержала комплексы в концентрации 25 000 комплексов на мкл.
[0312] Первую текучую среду ввели в соответствующие дорожки проточной кюветы и дали комплексам иммобилизоваться на нижних поверхностях дорожек проточной кюветы. Скорость аспирации составляла 100 мкл/мин, и первая текучая среда оставалась в проточных кюветах в течение 180 секунд. Затем проточные кюветы промыли промывочным раствором. В соответствующие дорожки проточной кюветы ввели вторую текучую среду и дали комплексам иммобилизоваться на верхних поверхностях дорожек проточной кюветы. Скорость аспирации составляла 100 мкл/мс, и вторая текучая среда оставалась в дорожках проточной кюветы в течение 450 секунд. Затем дорожки проточной кюветы промыли промывочным раствором.
[0313] Были получены изображения нижней и верхней поверхностей каждой из дорожек проточной кюветы, и иммобилизованные комплексы (гранулы) на каждой поверхности подсчитывали с использованием полученных с микроскопа изображений.
[0314] Количества гранул на мм2 для нижних поверхностей показаны на Фиг. 12А, а количества гранул на мм2 для верхних поверхностей - на Фиг. 12В. Концентрации для каждого столбика на Фиг. 12А и Фиг. 12В показывают концентрации алкин-PEG-биотина (около 0,5 мкМ, около 5 мкМ или около 25 мкМ), использованные при подготовке проточных кювет перед иммобилизацией комплексов. Как показано, концентрации алкин-PEG-биотина не оказывали влияния на иммобилизацию на нижних поверхностях, поскольку каждая из них имела от около 2100 гранул/мм2 до около 2300 гранул/мм2. Количество комплексов, иммобилизованных на нижних поверхностях, было не столь велико, как на нижних поверхностях, и оно находилось в диапазоне от около 550 гранул/мм2 до около 1150 гранул/мм2. Для верхних поверхностей дорожки, обработанные более высокой концентрацией алкин-PEG-биотинового линкера, имели большее число иммобилизованных на них комплексов/гранул.
[0315] Эти результаты показывают, что более тяжелая текучая среда действительно помогает иммобилизировать комплексы на верхних поверхностях и что увеличение концентрации захватных сайтов на верхней поверхности также может способствовать иммобилизации.
[0316] Пример 3
[0317] Получили комплексы, аналогичные показанным на Фиг. 1А, со средним диаметром 3 мкм. В качестве твердых подложек в комплексах использовали покрытые стрептавидином гранулы DYNABEADS™ М-280 от компании ThermoFisher Scientific. Каждая из твердых подложек имеет плотность около 1,18 г/см3. Фрагменты на конкретной грануле были из одной и той же длинной молекулы ДНК (из генома бактериофага PhiX).
[0318] В данном примере подготовили восемь дорожек проточной кюветы (причем противоположные поверхности покрыты гелеобразным материалом) с захватными сайтами (а именно линкерами алкин-PEG-биотин). Эти линкеры были ковалентно присоединены к свободным азидам на гелеобразном материале в дорожках проточной кюветы с использованием клик-химии. Дорожки проточной кюветы промыли и соответственно обработали раствором алкин-PEG-биотина с концентрациями около 5 мкМ. Раствор инкубировали в течение около 30 минут при температуре около 60°С. Затем дорожки проточной кюветы снова промыли.
[0319] Комплексы сначала разделили между двумя текучими средами, причем первая имела плотность около 1 г/см3, а вторая имела плотность около 2 г/см3. Первая текучая среда представляла собой натрий-цитратный буфер и содержала комплексы в концентрации 40 000 комплексов на мкл. Вторая текучая среда представляла собой раствор 2 г/мл поливольфрамата натрия и содержала комплексы в концентрации 40 000 комплексов на мкл.
[0320] Первую текучую среду ввели в семь дорожек проточной кюветы и дали комплексам иммобилизоваться на нижних поверхностях. Скорость аспирации составляла 100 мкл/мин, и первая текучая среда оставалась в проточных кюветах в течение 240 секунд. Затем дорожки проточной кюветы промыли промывочным раствором. В каждую из семи дорожек проточной кюветы ввели вторую текучую среду и дали комплексам иммобилизоваться на верхних поверхностях. Скорость аспирации находилась в диапазоне от 80 мкл/мс до 100 мкл/мс, и вторая текучая среда оставалась в дорожках проточной кюветы в течение 300 секунд. Затем дорожки проточной кюветы промыли промывочным раствором.
[0321] В восьмой дорожке текучие среды были разбавлены до 100 мкл каждая, и введение соответствующей текучей среды проводили дважды. Таким образом, дорожка 8 получила двойную загрузку.
[0322] Были получены изображения нижней и верхней поверхностей каждой из дорожек проточной кюветы, и иммобилизованные комплексы (гранулы) на каждой поверхности были подсчитаны. В таблице 1 представлены средние количества гранул на мм2 для каждой из дорожек проточной кюветы.
[0323] Целевое количество комплексов (гранул) для каждой из поверхностей составляло 4000 гранул/мм2. Хотя дорожки 1-7 оказались немного ниже целевого уровня, количество комплексов на верхней и нижней поверхностях для этих дорожек было относительно постоянным. Для дорожки 8 (получившей двойную загрузку) целевое количество комплексов оказалось превышенным на обеих поверхностях.
[0324] На Фиг. 13А показано целевое количество гранул и количество гранул на мм2 при измерении вдоль длины дорожки 1 проточной кюветы от входного отверстия (1) до выходного отверстия (5). На Фиг. 13В показано целевое количество гранул и количество гранул на мм2 при измерении вдоль длины дорожки 7 проточной кюветы от входного отверстия (1) до выходного отверстия (5). Измерения проводили через равные промежутки вдоль длины дорожки. Эти результаты демонстрируют, что иммобилизация происходит относительно равномерно вдоль длины дорожек проточного канала как на верхней, так и на нижней поверхностях.
[0325] Пример 4
[0326] Получили комплексы, аналогичные показанным на Фиг. 1А, со средним диаметром 3 мкм. В качестве твердых подложек в комплексах использовали покрытые стрептавидином гранулы DYNABEADS™ М-280 от компании ThermoFisher Scientific. Каждая из твердых подложек имеет плотность около 1,18 г/см3. Фрагменты на конкретной грануле были из одной и той же длинной молекулы ДНК (из генома бактериофага PhiX).
[0327] В данном примере подготовили десять дорожек проточной кюветы (причем противоположные поверхности покрыты гелеобразным материалом) с захватными сайтами (а именно линкерами алкин-PEG-биотин). Эти линкеры были ковалентно присоединены к свободным азидам на гелеобразном материале в дорожках проточной кюветы с использованием клик-химии. Дорожки проточной кюветы промыли и соответственно обработали раствором алкин-PEG-биотина с концентрациями около 5 мкМ. Раствор инкубировали в течение около 30 минут при температуре около 60°С. Затем дорожки проточной кюветы снова промыли.
[0328] Комплексы сначала разделили между двумя текучими средами, причем первая имела плотность около 1 г/см3, а вторая имела плотность около 2 г/см3. Первая текучая среда представляла собой натрий-цитратный буфер и содержала комплексы в концентрации 10 мкг на 50 мкл. Вторая текучая среда представляла собой раствор 2 г/мл поливольфрамата натрия и содержала комплексы в концентрации 12,5 мкг на 50 мкл.
[0329] Первую текучую среду ввели в десять дорожек проточной кюветы и дали комплексам иммобилизоваться на нижних поверхностях. Скорость аспирации составляла 100 мкл/мин, и первая текучая среда оставалась в проточных кюветах в течение 300 секунд. Затем дорожки проточной кюветы промыли промывочным раствором. В каждую из десяти дорожек проточной кюветы ввели вторую текучую среду и дали комплексам иммобилизоваться на верхних поверхностях. Скорость аспирации составляла 80 мкл/мин, и вторая текучая среда оставалась в проточных кюветах в течение 360 секунд. Затем дорожки проточной кюветы промыли промывочным раствором.
[0330] Были получены изображения нижней и верхней поверхностей каждой из дорожек проточной кюветы, и иммобилизованные комплексы (гранулы) на каждой поверхности были подсчитаны.
[0331] На Фиг. 14 показано целевое количество гранул и количество гранул на мм2 при измерении вдоль длины одной дорожки проточной кюветы от входного отверстия (1) до выходного отверстия (10). На Фиг. 14 также показана линейная аппроксимация для данных верхней поверхности и нижней поверхности. Эти результаты показывают, что иммобилизация происходит относительно равномерно вдоль длин верхней и нижней поверхностей проточного канала, если комплексы вводятся в соответствии с примером способа согласно приведенному в настоящем документе описанию.
[0332] Пример 5
[0333] Получили комплексы, аналогичные показанным на Фиг. 1А, со средним диаметром 3 мкм. В качестве твердых подложек в комплексах использовали покрытые стрептавидином гранулы DYNABEADS™ М-280 от компании ThermoFisher Scientific. Каждая из твердых подложек имеет плотность около 1,18 г/см3. Фрагменты на конкретной грануле были из одной и той же длинной молекулы ДНК (из генома бактериофага PhiX). Фрагменты из библиотеки были прикреплены к твердой подложке через олигонуклеотид дестиобиотина, который имеет меньшее сродство к стрептавидину на поверхности гранулы по сравнению с биотином.
[0334] В данном примере подготовили восемь дорожек проточной кюветы (причем противоположные поверхности покрыты гелеобразным материалом) с захватными сайтами (а именно линкерами алкин-PEG-биотин). Эти линкеры были ковалентно присоединены к свободным азидам на гелеобразном материале в дорожках проточной кюветы с использованием клик-химии. Дорожки проточной кюветы промыли и соответственно обработали раствором алкин-PEG-биотина с концентрациями около 5 мкМ. Раствор инкубировали в течение около 30 минут при температуре около 60°С. Затем дорожки проточной кюветы снова промыли.
[0335] Комплексы сначала разделили между двумя текучими средами, причем первая имела плотность около 1 г/см3, а вторая имела плотность около 2 г/см3. Первая текучая среда представляла собой натрий-цитратный буфер и содержала комплексы в концентрации 10 мкг на 50 мкл. Вторая текучая среда представляла собой раствор 2 г/мл поливольфрамата натрия и содержала комплексы в концентрации 12,5 мкг на 50 мкл.
[0336] Первую текучую среду ввели в восемь дорожек проточной кюветы и дали комплексам иммобилизоваться на нижних поверхностях. Скорость аспирации составляла 100 мкл/мин, и первая текучая среда оставалась в проточных кюветах в течение 240 секунд. Затем дорожки проточной кюветы промыли промывочным раствором. В каждую из восьми дорожек проточной кюветы ввели вторую текучую среду и дали комплексам иммобилизоваться на верхних поверхностях. Скорость аспирации находилась в диапазоне от 80 мкл/мс до 100 мкл/мс, и вторая текучая среда оставалась в дорожках проточной кюветы в течение 300 секунд. Затем дорожки проточной кюветы промыли промывочным раствором.
[0337] Были получены изображения нижней и верхней поверхностей каждой из дорожек проточной кюветы, и иммобилизованные комплексы (гранулы) на каждой поверхности были подсчитаны.
[0338] Затем ввели свободный биотин в солевом натрий-цитратном буфере и нагрели проточную кювету до около 80°С для высвобождения библиотек из соответствующих комплексов. Затем выполнили кластеризацию с применением мостиковой амплификации. Затем выполнили секвенирование на проточной кювете. Полученные данные секвенирования включали процентную величину прохождения фильтра (%PF). Прохождение фильтра (passing filter, PF) представляет собой метрику, используемую для описания кластеров, которые проходят порог по надежности будущего анализа с использованием в последующей обработке и анализе данных секвенирования. Более высокая процентная величина прохождения фильтра указывает на увеличенный выход уникальных кластеров, используемых для извлечения данных секвенирования.
[0339] В таблице 2 представлены средние количества гранул на мм2 для каждой из дорожек проточной кюветы, а также данные PF для каждой дорожки.
[0340] Целевое количество комплексов (гранул) для каждой из поверхностей дорожек 1-7 составляло 4000 гранул/мм2 (суммарно 8000 гранул/мм2). Целевое количество комплексов (гранул) для каждой из поверхностей дорожки 8 составляло 5500 гранул/мм2 (суммарно 11 000 гранул/мм2). Хотя дорожки 1-8 оказались немного ниже целевого уровня, общее количество комплексов на верхней и нижней поверхностях для этих дорожек было относительно постоянным. Данные по величине прохождения фильтра указывают, что большая часть нанолунок была занята моноклональными кластерами.
[0341] Дополнительные примечания
[0342] Кроме того, следует понимать, что диапазоны, приведенные в настоящем документе, включают указанный диапазон и любое значение или поддиапазон в пределах указанного диапазона, как если бы эти диапазоны были указаны явным образом. Например, диапазон, представленный границами от около 2 мм до около 300 мм, следует интерпретировать как включающий не только явно перечисленные пределы от около 2 мм до около 300 мм, но также включающий индивидуальные значения, такие как около 15 мм, 22,5 мм, 245 мм и т.д., и поддиапазоны, такие как от около 20 мм до около 225 мм и т.д.
[0343] Следует понимать, что все комбинации вышеуказанных концепций и дополнительных концепций, более подробно описанных ниже (при условии, что такие концепции не являются взаимно противоречащими), рассматриваются как часть обладающего признаками изобретения объекта изобретения, описанного в настоящем документе. В частности, все комбинации заявленного объекта изобретения, появляющиеся в конце данного описания, считаются частью обладающего признаками изобретения объекта изобретения, описанного в настоящем документе. Следует также понимать, что терминология, явно используемая в настоящем документе, которая также может присутствовать в любом описании, включенном в настоящий документ посредством ссылки, должна иметь значение, наиболее соответствующее конкретным концепциям, описанным в настоящем документе.
[0344] Хотя подробно описано несколько примеров, следует понимать, что описанные примеры могут быть изменены. Таким образом, представленное выше описание следует рассматривать как не имеющее ограничительного характера.
Claims (144)
1. Способ для иммобилизации исследуемого материала на каждой из двух противоположных поверхностей для секвенирования проточной кюветы, включающий:
введение первой текучей среды, включающей в себя первую часть исследуемого материала, в проточную кювету, при этом по меньшей мере часть исследуемого материала становится иммобилизованной на захватных сайтах на одной из двух противоположных поверхностей для секвенирования;
удаление первой текучей среды и любого неиммобилизованного исследуемого материала из проточной кюветы; и
введение второй текучей среды, включающей в себя вторую часть исследуемого материала, в проточную кювету, причем по меньшей мере часть исследуемого материала становится иммобилизованной на захватных сайтах на другой из двух противоположных поверхностей для секвенирования;
при этом выполняется одно из следующих двух условий:
первая текучая среда имеет плотность ниже плотности исследуемого материала, а вторая текучая среда имеет плотность выше плотности исследуемого материала; или
вторая текучая среда имеет плотность ниже плотности исследуемого материала, а первая текучая среда имеет плотность выше плотности исследуемого материала.
2. Способ по п. 1, в котором первая или вторая текучая среда, имеющая плотность ниже плотности исследуемого материала, представляет собой водный буферный раствор, и при этом вторая или первая текучая среда, имеющая плотность выше плотности исследуемого материала, представляет собой раствор поливольфрамата натрия или раствор хлорида натрия.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором плотность первой или второй текучей среды при температуре захвата на по меньшей мере 0,1 г/см3 ниже, чем плотность исследуемого материала при температуре захвата, и при этом плотность второй или первой текучей среды при температуре захвата на по меньшей мере 0,1 г/см3 выше, чем плотность исследуемого материала при температуре захвата.
4. Способ по п. 1 или 2, в котором плотность первой или второй текучей среды, которая ниже плотности исследуемого материала, составляет около 1 г/см3 при температуре захвата, и при этом плотность второй или первой текучей среды, которая выше плотности исследуемого материала, составляет около 2 г/см3 при температуре захвата.
5. Способ по одному из пп. 1-4, дополнительно включающий выжидание заданного времени перед удалением первой текучей среды и любого неиммобилизованного исследуемого материала из проточной кюветы.
6. Способ по одному из пп. 1-5, в котором исследуемый материал, иммобилизованный на одной из двух противоположных поверхностей для секвенирования, остается иммобилизованным на одной из двух противоположных поверхностей для секвенирования при введении второй текучей среды.
7. Способ по одному из пп. 1-6, в котором исследуемый материал представляет собой комплекс, включающий:
твердую подложку; и
готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот, прикрепленные к твердой подложке.
8. Способ по п. 7, дополнительно включающий:
удаление второй текучей среды и неиммобилизованных комплексов из проточной кюветы;
инициирование высвобождения готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот с твердой подложки иммобилизованных комплексов, таким образом высеивая по меньшей мере часть готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот на соответствующие праймеры двух противоположных поверхностей для секвенирования;
удаление твердой подложки и невысеянных готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот;
введение амплификационной смеси, включающей жидкую форму термочувствительного материала, в проточную кювету;
инициирование гелеобразования жидкой формы термочувствительного материала;
инициирование амплификации высеянных готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот для получения темплатных цепей, причем гелеобразная форма термочувствительного материала уменьшает диффузию темплатных цепей;
инициирование разжижения гелеобразной формы термочувствительного материала; и
удаление жидкой формы термочувствительного материала из проточной кюветы.
9. Способ по п. 8, в котором термочувствительный материал представляет собой сополимер поли(N-изопропилакриламида) и полиэтиленгликоля.
10. Способ по п. 1, в котором исследуемый материал представляет собой кластеризованную твердую подложку, включающую:
твердую подложку; и
кластер темплатных цепей, прикрепленных к твердой подложке.
11. Набор для иммобилизации исследуемого материала, содержащий:
препарационную текучую среду, содержащую исследуемый материал;
первую вводимую текучую среду с плотностью ниже плотности исследуемого материала; и
вторую вводимую текучую среду с плотностью выше плотности исследуемого материала.
12. Набор по п. 11, в котором первая вводимая текучая среда представляет собой водный буферный раствор, и при этом вторая вводимая текучая среда представляет собой раствор поливольфрамата натрия или раствор хлорида натрия.
13. Набор по п. 12, в котором вторая вводимая текучая среда представляет собой раствор поливольфрамата натрия, причем раствор поливольфрамата натрия имеет концентрацию около 1 грамма поливольфрамата натрия на 1 миллилитр воды.
14. Набор по одному из пп. 11-13, в котором плотность первой вводимой текучей среды при температуре захвата на по меньшей мере 0,1 г/см3 ниже, чем плотность исследуемого материала при температуре захвата, и при этом плотность второй вводимой текучей среды при температуре захвата на по меньшей мере 0,1 г/см3 выше, чем плотность исследуемого материала при температуре захвата.
15. Набор по одному из пп. 11-14, в котором плотность первой вводимой текучей среды составляет около 1 г/см3 при температуре захвата, а плотность второй вводимой текучей среды составляет около 2 г/см3 при температуре захвата.
16. Набор по одному из пп. 11-15, дополнительно содержащий проточную кювету, имеющую две противоположные поверхности для секвенирования.
17. Набор по п. 16, в котором каждая из противоположных поверхностей для секвенирования содержит:
полимерный гидрогель;
праймеры для амплификации, прикрепленные к полимерному гидрогелю; и
сайты химического захвата.
18. Набор по п. 17, в котором:
сайты химического захвата представляют собой один элемент связывающейся пары; и
исследуемый материал представляет собой твердую подложку, покрытую другим элементом связывающейся пары.
19. Набор по одному из пп. 11-18, в котором исследуемый материал представляет собой комплекс, содержащий:
твердую подложку; и
готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот, прикрепленные к твердой подложке.
20. Набор по одному из пп. 11-18, в котором исследуемый материал представляет собой кластеризованную твердую подложку, содержащую:
твердую подложку; и
кластер темплатных цепей, прикрепленных к твердой подложке.
21. Набор по одному из пп. 11-19, дополнительно содержащий амплификационную смесь, включающую жидкую форму термочувствительного материала.
22. Способ для иммобилизации исследуемого материала на каждой из двух противоположных поверхностей для секвенирования проточной кюветы, включающий:
введение текучей среды, включающей исследуемый материал, в проточную кювету, причем:
исследуемый материал включает в себя:
магнитную твердую подложку; и
готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот или темплатные цепи, прикрепленные к магнитной твердой подложке; и
при этом текучая среда имеет плотность, по меньшей мере приблизительно эквивалентную плотности магнитной твердой подложки;
обеспечение иммобилизации части исследуемого материала на захватных сайтах на одной из двух противоположных поверхностей для секвенирования; и
приложение магнитной силы к другой из двух противоположных поверхностей для секвенирования с вытягиванием тем самым некоторой другой части исследуемого материала к другой из двух противоположных поверхностей для секвенирования, где она становится иммобилизованной на захватных сайтах на другой из двух противоположных поверхностей для секвенирования.
23. Способ по п. 22, в котором плотность текучей среды отличается не более чем на 0,08 г/см3 от плотности магнитной твердой подложки.
24. Способ по одному из п. 22 или 23, в котором текучая среда представляет собой водный буферный раствор.
25. Способ по одному из пп. 22-24, в котором выжидают заданное время между введением текучей среды и приложением магнитной силы, причем заданное время находится в диапазоне от около 5 секунд до около 2 минут.
26. Способ по одному из пп. 22-23, в котором приложение магнитной силы включает помещение полоски из эластомера с включенными магнитными частицами на внешнюю поверхность проточной кюветы, смежную с другой из двух противоположных поверхностей для секвенирования.
27. Способ по одному из пп. 22-24, дополнительно включающий:
прекращение приложения магнитной силы;
удаление текучей среды и неиммобилизованных комплексов из проточной кюветы;
инициирование высвобождения готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот с твердой подложки иммобилизованных комплексов, таким образом высеивая по меньшей мере часть готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот на соответствующие праймеры двух противоположных поверхностей для секвенирования;
удаление твердой подложки и невысеянных готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот;
введение амплификационной смеси, включающей жидкую форму термочувствительного материала, в проточную кювету;
инициирование гелеобразования жидкой формы термочувствительного материала;
инициирование амплификации высеянных готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот для получения темплатных цепей, причем гелеобразная форма термочувствительного материала уменьшает диффузию темплатных цепей;
инициирование разжижения гелеобразной формы термочувствительного материала; и
удаление жидкой формы термочувствительного материала из проточной кюветы.
28. Способ по п. 27, в котором термочувствительный материал представляет собой сополимер поли(N-изопропилакриламида) и полиэтиленгликоля.
29. Способ получения темплатных цепей, включающий:
введение готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот в проточную кювету, таким образом высеивая по меньшей мере часть готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот на соответствующие праймеры на поверхности для секвенирования проточной кюветы;
удаление невысеянных готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот из проточной кюветы;
введение амплификационной смеси, включающей жидкую форму термочувствительного материала, в проточную кювету;
инициирование гелеобразования жидкой формы термочувствительного материала;
инициирование амплификации высеянных готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот для получения указанных темплатных цепей, причем гелеобразная форма термочувствительного материала уменьшает диффузию темплатных цепей;
инициирование разжижения гелеобразной формы термочувствительного материала; и
удаление жидкой формы термочувствительного материала из проточной кюветы.
30. Способ по п. 29, в котором термочувствительный материал представляет собой сополимер поли(N-изопропилакриламида) и полиэтиленгликоля.
31. Способ по п. 29 или 30, в котором готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот прикреплены к твердой подложке при введении в проточную кювету, причем способ дополнительно включает высвобождение готовых к секвенированию фрагментов нуклеиновых кислот с твердой подложки.
32. Способ для иммобилизации исследуемого материала на двух противоположных поверхностях для секвенирования проточной кюветы, включающий:
одновременную иммобилизацию первого исследуемого материала на первой из указанных двух противоположных поверхностей для секвенирования указанной проточной кюветы и второго исследуемого материала на второй из двух противоположных поверхностей для секвенирования проточной кюветы путем введения в проточную кювету исследуемой текучей среды, включающей первый исследуемый материал и второй исследуемый материал, причем:
несущая текучая среда исследуемой текучей среды имеет некоторую плотность текучей среды;
первый исследуемый материал имеет первую плотность ниже плотности текучей среды; и
второй исследуемый материал имеет вторую плотность выше плотности текучей среды.
33. Способ по п. 32, в котором:
по меньшей мере часть первого исследуемого материала иммобилизуется на соответствующих захватных сайтах первой из двух противоположных поверхностей для секвенирования; и
по меньшей мере часть второго исследуемого материала иммобилизуется на соответствующих захватных сайтах второй из двух противоположных поверхностей для секвенирования.
34. Исследуемая текучая среда для иммобилизации исследуемого материала на двух противоположных поверхностях для секвенирования проточной кюветы, содержащая:
несущую текучую среду, имеющую плотность текучей среды;
первый исследуемый материал, имеющий первую плотность ниже плотности текучей среды; и
второй исследуемый материал, имеющий вторую плотность выше плотности текучей среды.
35. Исследуемая текучая среда по п. 34, в которой:
первый исследуемый материал включает:
первую твердую подложку, имеющую первую плотность твердой подложки, приблизительно равную первой плотности; и
прикрепленные к первой твердой подложке готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот; и второй исследуемый материал включает:
вторую твердую подложку, имеющую вторую плотность твердой подложки, приблизительно равную второй плотности; и
прикрепленные ко второй твердой подложке готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот.
36. Исследуемая текучая среда по п. 34, в которой:
первый исследуемый материал включает:
первую твердую подложку, имеющую первую плотность твердой подложки, приблизительно равную первой плотности; и
прикрепленный к первой твердой подложке первый кластер темплатных цепей; и
второй исследуемый материал включает:
вторую твердую подложку, имеющую вторую плотность твердой подложки, приблизительно равную второй плотности; и
прикрепленный ко второй твердой подложке второй кластер темплатных цепей.
37. Способ для иммобилизации исследуемого материала на двух противоположных поверхностях для секвенирования проточной кюветы, включающий:
введение первого и второго исследуемых материалов в проточную кювету, имеющую две противоположные поверхности для секвенирования, причем первый исследуемый материал имеет по меньшей мере одно свойство, которое отличается от свойств второго исследуемого материала, при этом по меньшей мере одно свойство выбрано из группы, состоящей из плотности, заряда, магнитности и их комбинаций; и
воздействие на первый и второй исследуемые материалы по меньшей мере одним условием, в результате чего первый исследуемый материал становится иммобилизованным на захватном сайте на первой из двух противоположных поверхностей для секвенирования, а второй исследуемый материал становится иммобилизованным на захватном сайте на второй из двух противоположных поверхностей для секвенирования.
38. Способ по п. 37, в котором:
первый исследуемый материал имеет отрицательный заряд;
второй исследуемый материал имеет положительный заряд; и
по меньшей мере одно условие представляет собой электрическое поле, прикладываемое между двумя противоположными поверхностями для секвенирования для создания положительных зарядов на первой из двух противоположных поверхностей для секвенирования и отрицательных зарядов на второй из двух противоположных поверхностей для секвенирования.
39. Способ по п. 38, в котором:
первый исследуемый материал выбран из группы, состоящей из карбоксилированной твердой подложки, покрытой полиглутаминовой кислотой твердой подложки и сульфатно-функционализированной твердой подложки; и
второй исследуемый материал представляет собой функционализированную амином твердую подложку.
40. Способ по п. 37, в котором:
первый и второй исследуемые материалы вводят в проточную кювету в текучей среде, которая имеет первую плотность;
первый исследуемый материал является магнитным;
второй исследуемый материал является немагнитным и имеет плотность выше первой плотности; и
по меньшей мере одно условие представляет собой магнитное поле, прикладываемое для притягивания первого исследуемого материала к первой из двух противоположных поверхностей для секвенирования.
41. Способ по п. 37, в котором:
первый и второй исследуемые материалы вводят в проточную кювету в текучей среде, которая имеет первую плотность;
первый исследуемый материал является немагнитным и имеет плотность ниже первой плотности;
второй исследуемый материал является магнитным; и
по меньшей мере одно условие представляет собой магнитное поле, прикладываемое для притягивания второго исследуемого материала ко второй из двух противоположных поверхностей для секвенирования.
42. Способ по п. 37, в котором:
первый и второй исследуемые материалы вводят в проточную кювету в текучей среде, которая имеет первую плотность;
первый исследуемый материал заряжен отрицательно;
второй исследуемый материал не заряжен и имеет плотность выше первой плотности; и
по меньшей мере одно условие представляет собой электрическое поле, прикладываемое между двумя противоположными поверхностями для секвенирования для создания положительных зарядов на первой из двух противоположных поверхностей для секвенирования и отрицательных зарядов на второй из двух противоположных поверхностей для секвенирования.
43. Способ по п. 37, в котором:
первый и второй исследуемые материалы вводят в проточную кювету в текучей среде, которая имеет первую плотность;
первый исследуемый материал заряжен положительно;
второй исследуемый материал не заряжен и имеет плотность выше первой плотности; и
по меньшей мере одно условие представляет собой электрическое поле, прикладываемое между двумя противоположными поверхностями для секвенирования для создания отрицательных зарядов на первой из двух противоположных поверхностей для секвенирования и положительных зарядов на второй из двух противоположных поверхностей для секвенирования.
44. Способ по п. 37, в котором:
первый и второй исследуемые материалы вводят в проточную кювету в текучей среде, которая имеет первую плотность;
первый исследуемый материал не заряжен и имеет плотность ниже первой плотности;
второй исследуемый материал заряжен положительно; и
по меньшей мере одно условие представляет собой электрическое поле, прикладываемое между двумя противоположными поверхностями для секвенирования для создания положительных зарядов на первой из двух противоположных поверхностей для секвенирования и отрицательных зарядов на второй из двух противоположных поверхностей для секвенирования.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/946,717 | 2019-12-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021127094A RU2021127094A (ru) | 2023-03-15 |
| RU2804754C2 true RU2804754C2 (ru) | 2023-10-05 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2008144969A (ru) * | 2006-04-14 | 2010-05-20 | Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. (Nl) | Подавляющая пену мембрана для проточной ячейки |
| RU152297U1 (ru) * | 2012-10-15 | 2015-05-20 | Сергей Петрович СИДОРЕНКО | Проточная магнитная ячейка и устройство для магнитной обработки текучих сред на её основе |
| WO2019028047A1 (en) * | 2017-08-01 | 2019-02-07 | Illumina, Inc | SPATIAL INDEXING OF GENETIC MATERIAL AND PREPARATION OF PHARMACOTOQUE USING HYDROGEL BALLS AND FLOW CELLS |
| WO2019089581A1 (en) * | 2017-10-30 | 2019-05-09 | Corning Incorporated | Nucleic acid immobilization article and methods thereof |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2008144969A (ru) * | 2006-04-14 | 2010-05-20 | Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. (Nl) | Подавляющая пену мембрана для проточной ячейки |
| RU152297U1 (ru) * | 2012-10-15 | 2015-05-20 | Сергей Петрович СИДОРЕНКО | Проточная магнитная ячейка и устройство для магнитной обработки текучих сред на её основе |
| WO2019028047A1 (en) * | 2017-08-01 | 2019-02-07 | Illumina, Inc | SPATIAL INDEXING OF GENETIC MATERIAL AND PREPARATION OF PHARMACOTOQUE USING HYDROGEL BALLS AND FLOW CELLS |
| WO2019089581A1 (en) * | 2017-10-30 | 2019-05-09 | Corning Incorporated | Nucleic acid immobilization article and methods thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LAN FREEMAN et al. "Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding. (includes Online Methods)", NATURE BIOTECHNOLOGY,Vol. 35, No. 7, 01 July 2017 (2017-07-01), page 640-646, 4pp. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11779897B2 (en) | Flow cells using sequencing-ready nucleic acid fragments attached to carrier beads immobilized at capture sites of a plurality of chambers | |
| EP3568234A1 (en) | Hydrophilic coating of fluidic channels | |
| US20210230585A1 (en) | Kit, system, and flow cell | |
| WO2021154648A2 (en) | Kit, system, and flow cell | |
| US20210238589A1 (en) | Biotin-streptavidin cleavage composition and library fragment cleavage | |
| US20220080415A1 (en) | Flow cells | |
| RU2804754C2 (ru) | Иммобилизация в проточных кюветах | |
| US20220195519A1 (en) | Immobilization in flow cells | |
| US20220154273A1 (en) | Incorporation and imaging mixes | |
| US11535890B2 (en) | Sequencing kits |