TWI802810B - 流體槽、用於製備帶正電荷的流體槽表面之方法、及包含流體槽之套組 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種流體槽之實例,該流體槽包括基板及該基板上之陽離子聚合水凝膠。該陽離子聚合水凝膠包括陽離子部分,該陽離子部分i)整合於初始聚合水凝膠之單體單元中或ii)經由連接子附著於該初始聚合水凝膠之單體單元。該流體槽進一步包括附著於該陽離子聚合水凝膠之擴增引子。
Description
本發明係關於一種流體槽,其包括基板及該基板上之陽離子聚合水凝膠且進一步包括附著於該陽離子聚合水凝膠之擴增引子。
本申請案主張2019年8月1日申請之美國臨時申請案第62/881,597號之權益,該申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。
存在多種方法及應用,其期望由雙股DNA(double-stranded DNA;dsDNA)目標分子產生片段化及附籤(tagged)去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid;DNA)分子之庫(library)。通常,目的為由較大dsDNA分子產生較小DNA分子(例如DNA片段)以用作DNA定序反應中之模板。模板可使得能夠獲得短讀段長度(read length)。在資料分析期間,可比對重疊短序列讀段以重構較長核酸序列。在一些情況下,預定序步驟(諸如特定核酸分子之條碼)可用於簡化資料分析。
本文所揭示之第一態樣為一種流體槽,其包含基板;該基板上之陽離子聚合水凝膠,該陽離子聚合水凝膠包括陽離子部分,該陽離子部分i)整合於初始聚合水凝膠之單體單元中或ii)經由連接子附著於初始聚合水凝膠之單體單元;及附著於該陽離子聚合水凝膠之擴增引子。
在第一態樣之一實例中,單體單元為N-(5-溴乙醯胺基戊基)丙烯醯胺;陽離子部分為鏻陽離子;且鏻陽離子取代N-(5溴乙醯胺基戊基)丙烯醯胺之溴。在一實例中,鏻陽離子係選自由以下組成之群:參(羥甲基)鏻陽離子、參(羥丙基)鏻陽離子、肆(羥甲基)鏻陽離子及參(2-羧乙基)鏻陽離子。
在第一態樣之另一實例中,i)單體單元包括末端疊氮基且連接子包括炔基;或ii)單體單元包括末端炔基且連接子包括疊氮基。在一實例中,陽離子部分包括質子化胺基、鋶離子、四級銨陽離子或其組合。在另一實例中,單體單元為N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺;且陽離子部分為N,N,N-三甲基乙醇銨陽離子。在再另一實例中,連接子進一步包括可裂解雙硫鍵、光可裂解鍵、可裂解磷酸二酯鍵或其組合。
在第一態樣之又另一實例中,單體單元為N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺;連接子包括末端炔基及末端溴;且陽離子部分為取代末端溴之鏻陽離子。
在第一態樣之一實例中,基板包括藉由間隙區域(interstitial region)分隔開之複數個凹陷部,且其中陽離子聚合水凝膠定位於凹陷部中之每一者內。在一實例中,基板進一步包含複數個腔室,且其中該等複數個凹陷部之子集位於該等複數個腔室中之每一者的周界內。
應理解,本文所揭示之流體槽之任何特徵可以任何期望的方式及/或組態組合在一起以獲得如本發明中所描述之益處,包括例如用以吸引且空間
上限制庫片段之正電荷。
本文所揭示之第二態樣為一種方法,其包含將包括可帶正電荷之部分之流體引入至包括初始聚合水凝膠之流體槽,該初始聚合水凝膠具有選自由以下組成之群的表面部分:可帶負電荷之原子、疊氮基或炔基;及附著於初始聚合水凝膠之擴增引子;且在流體中在一定溫度下培育該初始聚合水凝膠且持續一定時間,由此形成包括陽離子部分之陽離子聚合水凝膠。
在第二態樣之一實例中,可帶正電荷之部分取代初始聚合水凝膠之可帶負電荷之原子。在一實例中,表面部分為可帶負電荷之原子;該可帶負電荷之原子為溴;且可帶正電荷之部分係選自由以下組成之群:參(羥甲基)膦、參(羥丙基)膦、肆(羥甲基)膦及參(2-羧乙基)膦。在一實例中,流體進一步包括pH在6至12範圍內之緩衝液。在一實例中,溫度在約18℃至約65℃範圍內且時間在約1.5分鐘至約5分鐘範圍內。
在第二態樣之另一實例中,表面部分為疊氮基或炔基;且可帶正電荷之部分經由連接子共價附著於該表面部分。在一實例中,表面部分為疊氮基;連接子為炔基;且陽離子部分包括質子化胺基、鋶離子、四級銨陽離子或其組合。在一實例中,表面部分為炔基;連接子為疊氮基;且陽離子部分包括質子化胺基、鋶離子、四級銨陽離子或其組合。在一實例中,化合物包括附著於連接子之可帶正電荷之部分,且其中化合物為丙炔基溴化膽鹼。在一實例中,流體包括水。在一實例中,溫度在約18℃至約60℃範圍內且時間在約30分鐘至約12小時範圍內。在一實例中,該方法進一步包含將催化劑、配位體及還原劑添加至具有該流體之流體槽中。
應理解,此方法之任何特徵可以任何期望的方式組合在一起。此外,應理解,此方法及/或流體槽之特徵之任何組合可一起使用及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合以達成如本發明中所描述之益處,包括例如用以吸引
且空間上限制庫片段之正電荷。
本文所揭示之第三態樣為一種套組,其包含流體槽,該流體槽包括:基板;定位於基板上且具有選自由以下組成之群的表面部分之初始聚合水凝膠:可帶負電荷之原子、疊氮基及炔基;及附著於初始聚合水凝膠之擴增引子;以及包括可帶正電荷之部分之流體,該可帶正電荷之部分與表面部分相互作用或反應以形成包括陽離子部分之陽離子聚合水凝膠。
應理解,套組之任何特徵可以任何期望的方式組合在一起。此外,應理解,套組及/或方法及/或流體槽中之任一者之特徵之任何組合可一起使用及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合以達成如本發明中所描述之益處,包括例如用以吸引且空間上限制庫片段之正電荷。
100:方法
102:聚合水凝膠
104:陽離子部分
10P:流體槽
10:流體槽
10':流體槽
10":流體槽
12:基板
14:聚合水凝膠
14':聚合水凝膠
14":聚合水凝膠
16:陽離子部分
18:引子
20:通道
22:基板表面
24:流體
26:可帶正電荷之部分
28:連接子
28':連接子
30:化合物
32:凹陷部
34:間隙區域
36:額外材料
38:腔室
38':腔室
40A:複合物
40B:複合物
40C:複合物
42:支撐物
44:核酸片段
44':核酸片段
44":核酸片段
46:成員
48:轉接子
48':轉接子
48":轉接子
50:庫片段
50':庫片段
50":庫片段
52:轉接子
52':轉接子
52":轉接子
54:支撐物
M1:單體單元
M1':單體單元
M1":單體單元
M2:單體單元
參考以下實施方式及圖式,本發明之實例之特徵將變得顯而易見,在以下實施方式及圖式中,類似的圖式元件符號對應於類似但或許不相同的組件。出於簡潔起見,具有先前所描述功能之圖式元件符號或特徵可或可不結合出現該等圖式元件符號或特徵之其他附圖來描述。
[圖1]為說明本文所揭示之方法之實例的流程圖;[圖2A]及[圖2B]為一起說明圖1之方法之半示意性透視圖,其中圖2A展示包括初始聚合水凝膠之流體槽之一部分,且圖2B展示包括帶正電荷(陽離子)之聚合水凝膠之流體槽之一部分;[圖3]為說明陽離子聚合水凝膠之一個實例之形成的化學式;[圖4]為說明陽離子聚合水凝膠之另一實例之形成的化學式;[圖5A]及[圖5B]一起描繪說明陽離子聚合水凝膠之再另一實例之形成的化學式;
[圖6]為本文所揭示之流體槽之另一實例之一部分的半示意性透視圖;[圖7]為本文所揭示之流體槽之再另一實例之一部分的半示意性透視圖;及[圖8A]至[圖8C]為本文所揭示之複合物之不同實例的示意圖;[圖9A]為在玻璃基板之單向通道中包括未經處理之水凝膠的比較流體槽上所釋放之DNA庫片段的反轉顯微照片影像(其中影像之原始深色部分已反轉成白色且影像之原始淺色部分已反轉成黑色);[圖9B]為圖9A之比較流體槽所釋放之DNA庫片段與未經處理之水凝膠之相互作用的示意圖。
[圖10A]為在玻璃基板之單向通道中包括經參(羥丙基)-膦處理之例示性流體槽上所釋放之DNA庫片段的反轉顯微照片影像(其中影像之原始深色部分已反轉成白色且影像之原始淺色部分已反轉成黑色);及[圖10B]為圖10A之實施例流體槽所釋放之DNA庫片段與經處理之水凝膠之相互作用的示意圖。
本文所揭示之流體槽之實例包括聚合水凝膠表面處之正電荷及擴增引子。聚合水凝膠表面處之正電荷有助於吸引且空間上限制庫片段,該等庫片段係自隨後引入至流體槽中之載體釋放。
庫片段為較大核酸樣品之單股、尺寸類似(例如<1000bp)的去氧核糖核酸(DNA)碎片或由較大核酸樣品之核糖核酸(ribonucleic acid;RNA)碎片產生之互補去氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid;cDNA)碎片,且片段具有附著於各別末端處之轉接子。帶正電荷之水凝膠表面將吸引自個
別載體釋放之帶負電荷之庫片段。此將減少庫片段在流體槽表面上之隨機結合且將減少或防止庫片段接種(seeding)於流體槽之側壁上。因此,庫接種效率得以改良。
經改良之接種效率可具有許多優勢及益處。舉例而言,當接種效率得到改良時,可減少庫輸入需求。對於另一實例,經改良之接種效率可產生至少實質上均勻化之叢集密度。在定序期間,當核苷酸併入至叢集之各別模板股中時,個別叢集產生螢光信號之「空間雲(spatial cloud)」。叢集之約束可至少減少空間雲串擾及/或重疊,且亦可改良空間雲之鑑別。再此外,因為由任何個別叢集獲得之讀段可由相同樣品產生,所以其可用於藉由以生物資訊學方式將短讀段拼接在一起而重構樣品。
本文所揭示之方法之實例將正電荷引入至初始聚合水凝膠之表面,同時維持表面之定序相容性。
定義
除非另外規定,否則本文所用之術語應理解為採用其在相關技術領域中之普通含義。本文所用之若干術語及其含義闡述於下文中。
如本文所用,除非上下文明確另外指示,否則單數形式「一(a/an)」及「該(等)(the)」係指單數以及複數兩者。如本文所用之術語「包含(comprising)」與「包括(including)」、「含有(containing)」或「特徵界定(characterized by)」同義,且為包括性的或開放性的且不排除未敍述之額外要素或方法步驟。
貫穿本說明書對「一個實例(one example)」、「另一實例(another example)」、「一實例(an example)」等等之提及意謂結合實例所描述之特定要素(例如,特徵、結構、組成、組態及/或特性)包括於本文所描述之至少一個實例中,且可存在或可不存在於其他實例中。此外應理解,除非上下文另外明確規
定,否則關於任何實例所描述之要素可在各種實例中以任何適合方式組合。
貫穿包括申請專利範圍之本發明所使用之術語「實質上(substantially)」及「約(about)」用以描述及解釋諸如歸因於處理中之變化的較小波動。舉例而言,此等術語可指小於或等於所述值±5%,諸如小於或等於所述值±2%、諸如小於或等於所述值±1%、諸如小於或等於所述值±0.5%、諸如小於或等於所述值±0.2%、諸如小於或等於所述值±0.1%、諸如小於或等於所述值±0.05%。
轉接子(adapter):可例如藉由接合或標籤化融合至核酸分子之線性寡核苷酸序列。在一些實例中,轉接子與引入至流體槽之任何目標序列之3'端或5'端至少實質上非互補。適合的轉接子長度可在約10個核苷酸至約100個核苷酸、或約12個核苷酸至約60個核苷酸、或約15個核苷酸至約50個核苷酸之範圍內。轉接子可包括核苷酸及/或核酸之任何組合。在一些實例中,轉接子在一或多個位置處包括一或多個可裂解基團。在一些實例中,轉接子可包括與引子之至少一部分互補之序列,例如包括通用核苷酸序列(諸如P5或P7序列)之引子。在一些實例中,轉接子可包括輔助下游誤差校正、鑑別及定序之索引或條碼序列。索引對於核酸分子之樣品或來源(例如片段)可為獨特的。在一些實例中,轉接子可包括定序引子序列或定序結合位點。不同轉接子之組合可併入至核酸分子,諸如DNA片段中。
捕獲位點(capture site):已經物理改性及/或經改性而具有允許複合物或樣品定位之化學性質的流體槽表面之一部分。在一實例中,捕獲位點可包括化學捕獲劑。
載體(carrier):能夠具有其中所含之定序庫之水凝膠支撐物或能夠具有附著於其表面之定序就緒核酸片段的固體支撐物。
化學捕獲劑(chemical capture agent):能夠附著、保留或結合至
目標分子(亦即複合物或樣品)之材料、分子或部分。一個實例化學捕獲劑包括與目標核酸之至少一部分互補或附著於目標分子之捕獲核酸(例如捕獲寡核苷酸)。另一實例化學捕獲劑為連接分子。對於原生DNA或RNA樣品,連接分子可包括一個末端上之核酸結合部分,諸如經由電荷或疏水相互作用結合之嵌入劑。對於細胞樣品,連接分子可包括細胞膜結合部分(例如,針對表面蛋白質之抗原)或膜穿透部分(例如,一個末端上之磷脂)。另一實例化學捕獲劑包括能夠結合至目標分子(或附著於目標分子之連接部分)之受體-配位體結合對(例如抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸結合蛋白、抗原決定基、抗體等)之成員。化學捕獲劑之又另一實例為能夠與目標分子形成靜電相互作用、氫鍵或共價鍵(例如硫醇-二硫化物交換、點擊化學(click chemistry)、狄耳士-阿德爾(Diels-Alder)等)的化學試劑。
複合物(complex):諸如水凝膠支撐物或固體支撐物之載體,及附著於或含於載體內之定序就緒核酸片段。載體亦可包括結合對之一個成員,其另一成員為捕獲位點之一部分。
外部固定劑(external immobilizing agent):與已引入至流體槽一或多個通道或腔室之複合物或樣品不可混溶的氣態、液態或黏性介質。氣態外部固定劑可用以產生包圍複合物或樣品之小液滴。氣態外部固定劑之實例為以適合流動速率引導通過流體槽之空氣。舉例而言,空氣可用以自流體槽抽出含有複合物或樣品之流體,該流體形成含有複合物或樣品之液態的小液滴。所形成之小液滴充當擴散障壁。液態或黏性介質用於防止定序庫自複合物釋放或形成於流體槽表面上之腔室內的擴散。外部固定劑可形成擴散障壁,因為定序庫或任何其他多核苷酸在外部固定劑中具有極少甚至無溶合作用。呈液態形式之實施外部固定劑包括疏水性油,諸如礦物油、聚矽氧油、全氟化油、氟化碳油(例如來自3M之FLUORINERTTM電子液體FC40)或其組合。呈黏性介質形式之實例外部固
定劑包括含有聚合物(例如,聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮等)、聚葡萄糖、蔗糖、甘油及其類似者之緩衝液。在一些實例中,黏性介質為溫度反應性凝膠。溫度反應性凝膠在非接種溫度下為非黏性的,且在接種溫度下轉變成黏性介質。溫度反應性凝膠之實例包括聚(N-異丙基丙烯醯胺)及聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯(polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide;PEO-PPO-PEO)/合成鋰皂石奈米粒子複合材料。
片段(fragment):遺傳物質(例如DNA、RNA等)之一部分或碎片。
水凝膠或水凝膠基質(hydrogel or hydrogel matrix):液體及氣體可透過之半剛性聚合材料。形成水凝膠之聚合材料可經由共價鍵、離子鍵或氫鍵而為線性或輕度交聯的。在一實例中,水凝膠包括約60%至約90%流體,諸如水及約10%至約30%聚合物。水凝膠可為多孔的,亦即包括開放/空隙空間。孔隙度為水凝膠之分率體積(無因次),亦即量測材料中之空隙空間且為總體積上空隙體積之分率,其為0與100%之間的百分比(或0與1之間的分率)。在一實例中,水凝膠之孔隙度可在約50%(0.5)至約99%(0.99)範圍內。孔隙度可足夠允許試劑(例如酶、化學物質及尺寸較小之寡核苷酸(小於50個鹼基對,例如引子))擴散,但禁止較大尺寸核酸分子(例如樣品、片段等)擴散。
如本文所用之術語「陽離子聚合水凝膠(cationic polymeric hydrogel)」係指具有陽離子部分之初始聚合水凝膠,該陽離子部分i)整合於單體單元中之一者中或ii)經由連接子附著於單體單元中之一者。如本文所用之術語「初始聚合水凝膠(initial polymeric hydrogel)」係指進行任何反應/相互作用以引入陽離子部分之前的聚合水凝膠。陽離子聚合水凝膠在本文中亦可稱為帶正電荷之水凝膠。
凝膠支撐物(hydrogel support):具有至少實質上球形形狀之水
凝膠(例如,水凝膠珠粒),其可在其中含有定序庫。
核酸分子(nucleic acid molecule):任何長度之核苷酸之聚合形式,且可包括核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、其類似物或其混合物。該術語可指單股或雙股多核苷酸。
「目標(target)」或「模板(template)」核酸分子可指待分析之序列。
核酸分子中之核苷酸可包括天然存在之核酸及其功能類似物。功能類似物之實例能夠以序列特異性方式與核酸雜交或能夠用作用於複製特定核苷酸序列之模板。天然存在之核苷酸通常具有含有磷酸二酯鍵之主鏈。類似物結構可具有包括所屬技術領域中已知之變體中之任一者的替代性主鏈鍵聯。天然存在之核苷酸通常具有去氧核糖(例如發現於DNA中)或核糖(例如發現於RNA中)。類似物結構可具有包括所屬技術領域中已知之變體中之任一者的替代性糖部分。核苷酸可包括原生或非原生鹼基。原生DNA可包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及/或鳥嘌呤中之一或多者,且原生RNA可包括腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶及/或鳥嘌呤中之一或多者。可使用任何非原生鹼基,諸如鎖核酸(locked nucleic acid;LNA)及橋聯核酸(bridged nucleic acid;BNA)。
可帶正電荷之部分(positively Chargeable Moiety):可帶正電荷之部分可為攜帶或可攜帶正電荷之任何官能基。在一實例中,可經由取代反應將正電荷引入至可帶電荷之部分。在其他實例中,可帶正電荷之部分在特定pH(例如,生理pH)下攜帶正電荷。
引子(primer):可與相關目標序列雜交之核酸分子。在一實例中,引子充當核苷酸可藉由聚合酶聚合於其上之基質。舉例而言,擴增或捕獲引子充當用於模板擴增及叢集產生之起始點。在另一實例中,合成之核酸股可包括引子(例如定序引子)可雜交之位點以便對與合成之核酸股互補的新股進行引子合
成。任何引子可包括核苷酸或其類似物之任何組合。在一些實例中,引子為單股寡核苷酸或多核苷酸。引子長度可為長度呈任何數目之鹼基且可包括多種非天然核苷酸。在一實例中,定序引子為短股,其在10至60個鹼基或20至40個鹼基範圍內。
樣品(sample):遺傳物質之任何來源,諸如細胞、微生物群落或核酸。在一些實例中,細胞為包括原核細胞或真核細胞之單細胞。在一些實例中,細胞為哺乳動物細胞、人類細胞或細菌細胞。在一些實例中,核酸為長DNA分子,包括病毒核酸、細菌核酸或哺乳動物核酸。在一些實例中,樣品經由插入結合至固體支撐物(例如珠粒)表面之轉座子而結合(作為片段)。
定序就緒核酸片段(sequencing-ready nucleic acid fragment):在3'及5'端處具有轉接子之遺傳物質之一部分(片段)。在定序就緒核酸片段中,各轉接子包括已知通用序列(例如,其與流體槽上引子之至少一部分互補)及定序引子序列。兩種轉接子亦可包括索引(條碼或標籤)序列。在一實例中,一側(例如P5側)可含有珠粒(或其他固體支撐物)索引且另一側(例如P7側)可含有樣品索引。定序就緒核酸片段可經由插入至固體支撐物(例如珠粒)表面之轉座子而結合,或經由結合對或其他可裂解連接子直接固定。定序就緒核酸片段亦可含於水凝膠支撐物內。
接種(seeding):本文所揭示之流體槽之實例的水凝膠上所轉接之片段(例如,定序就緒核酸片段)之固定。
定序庫(sequencing library):一或多個目標核酸分子之核酸片段或該等片段之擴增子的集合。在一些實例中,片段在其3'及5'端處連接至一或多個轉接子。在一些實例中,定序庫係由一或多個目標核酸分子製備且為複合物之一部分。
固體支撐物(solid support):具有特徵界定為例如球形、橢圓形、
微球形或具有規則或不規則尺寸的其他可識別粒子形狀的形狀的由剛性或半剛性材料製成的較小物體。固體支撐物可具有附著於其上之定序庫。適用於固體支撐物之實例材料包括但不限於玻璃;塑膠,諸如丙烯酸、聚苯乙烯或苯乙烯與另一材料之共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚胺脂或聚四氟乙烯(來自Chemours公司之TEFLON®);多醣或交聯多醣,諸如瓊脂糖或瓊脂糖凝膠(Sepharose);耐綸;硝化纖維;樹脂;二氧化矽或基於二氧化矽之材料,包括矽及經改性之矽;碳纖維、金屬;無機玻璃;光纖束或多種其他聚合物。實例固體支撐物包括受控微孔玻璃珠粒、順磁性珠粒、氧化釷溶膠、瓊脂糖凝膠珠粒、奈米晶體及如描述於例如來自Fishers Ind.之Bangs Laboratories之微球體偵測指南(Microsphere Detection Guide)之所屬技術領域中已知之其他材料。
標籤化(tagmentation):藉由轉座體(transposome)修飾核酸分子(例如DNA或RNA樣品)以將核酸分子片段化且在單一步驟中將轉接子接合至片段之5'及3'端。標籤化反應可用於製備定序庫,尤其包括固體支撐物之複合物。標籤化反應將隨機樣品片段化與轉接子接合組合至單一步驟中,其增加定序庫製備製程之效率。
轉座體(transposome):整合酶(integration enzyme)(例如整合酶(integrase)或轉座酶)及包括整合識別位點(例如轉座酶識別位點)之核酸。
通用核苷酸序列(universal nucleotide sequence):兩個或更多個核酸分子共有之序列區域,其中該等分子亦具有彼此不同之區域。存在於分子集合之不同成員中的通用序列可允許使用通用捕獲核酸(亦即,具有與引子之至少一部分互補之序列的轉接子)之群體捕獲若干不同核酸。類似地,存在於分子集合之不同成員中之通用序列可允許使用通用定序結合位點(定序引子序列)之群體擴增或複製若干不同核酸。
用於製備帶正電荷之流體槽表面之方法
用於形成流體槽之實例之方法100的實例展示於圖1中。如所描繪,方法100之一個實例包括將包括可帶正電荷之部分之流體引入至包括初始聚合水凝膠之流體槽,該初始聚合水凝膠具有選自由以下組成之群的表面部分:可帶負電荷之原子、疊氮基及炔基,以及附著於初始聚合水凝膠(元件符號102)之擴增引子;及在流體中在一定溫度下培育初始聚合水凝膠且持續一定時間,由此形成包括陽離子部分(元件符號104)之陽離子聚合水凝膠。
方法100亦示意性地展示於圖2A及圖2B中。
如圖2A中所示,在方法100開始時,流體槽10P(其為圖2B中所示之流體槽10之前驅體)包括基板12、基板12上之初始聚合水凝膠14'及附著於初始聚合水凝膠14'之擴增引子18。
基板12通常為剛性的且不可溶於水性液體中。適合的基板12之實例包括環氧矽氧烷、多面體寡聚倍半矽氧烷(polyhedral oligomeric silsequioxanes;POSS)或其衍生物、玻璃、經改性之玻璃、塑膠、耐綸、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化矽(氧化矽(SiO2))、熔融二氧化矽、基於二氧化矽之材料、矽酸鋁、矽、經改性之矽(例如摻雜硼之p+矽)、氮化矽(Si3N4)、五氧化鉭(TaO5)或一或多種其他氧化鉭(TaOx)、氧化鉿(HfO2)、無機玻璃或類似者。POSS之實例可為Kehagias等人,Microelectronic Engineering 86(2009),第776-778頁中所描述之POSS,該參考文獻以全文引用之方式併入。用於基板12之適合的塑膠之一些實例包括丙烯酸聚合物、聚苯乙烯、苯乙烯與其他材料之共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚胺脂、聚四氟乙烯(諸如,來自Chemours公司之TEFLON®)、環狀烯烴/環烯烴聚合物(cyclo-olefin polymer;COP)(諸如來自Zeon之ZEONOR®)、聚醯亞胺等。基板12亦可為玻璃或矽或POSS,其在表面具有氧化鉭或另一陶瓷氧化物之塗層。適合的基板12之另一實例為絕緣層上矽基板。
基板12之形式可為晶圓、面板、矩形薄片、晶粒或任何其他適合
的組態。在一實例中,基板12可為直徑在約2mm至約300mm範圍內之圓形晶圓或面板。作為一更特定實例,基板12為直徑在約200mm至約300mm範圍內之晶圓。在另一實例中,基板12可為其最大尺寸至多約10尺(約3公尺)之矩形薄片或面板。作為一特定實例,基板12為寬度在約0.1mm至約10mm範圍內之晶粒。儘管已提供實例尺寸,但應理解,亦可使用具有任何適合尺寸之基板12。
圖2A中所展示之基板12具有界定於其中之通道20。可使用部分取決於基板12之一或多種材料的任何合適的技術通道20界定於基板12中。在一個實例中,通道20蝕刻於玻璃基板12中。在另一實例中,可使用光微影、奈米壓模微影等將單向通道20圖案化於樹脂基板12中。在再另一實例中,可將分隔(separate)材料(圖中未示)施加至基板12,使得分隔材料界定通道20之壁,且基板12界定通道20之底部。
在一實例中,通道20具有直線組態。通道20之長度及寬度可分別小於基板12之長度及寬度,使得環繞通道20之基板表面22之部分可供用於與蓋子(圖中未示)黏結。在一些情況下,各通道20之寬度可為至少約1mm、至少約2.5mm、至少約5mm、至少約7mm、至少約10mm或更大。在一些情況下,各通道20之長度可為至少約10mm、至少約25mm、至少約50mm、至少約100mm或更大。各通道20之寬度及/或長度可大於上文所指定之值、小於上文所指定之值或介於該等值之間。在一實例中,通道20為正方形(例如,10mm×10mm)。
當微接觸、氣溶膠或噴墨列印用於沈積界定通道壁之分隔材料時,各通道20之深度可為單層厚。對於其他實例,各通道20之深度可為約1μm、約10μm、約50μm或更大。在一實例中,深度可在約10μm至約30μm之範圍內。除吸引所釋放之庫片段之帶正電荷之聚合水凝膠以外,此深度可有助於阻斷所釋放之庫片段在相鄰通道20之間之側向擴散,例如當使用多個通道20時。在另一實例中,深度為約5μm或更小。應理解,各通道20之深度大於上文所指定之值、
小於上文所指定之值或介於該等值之間。
儘管單一通道20展示於圖2A中,應理解,基板12亦可包括彼此流體分隔之多個通道(例如,2、3、4、8個等)。
在圖2A中所展示之實例中,通道20在其中具有初始聚合水凝膠14'。在整合或附著陽離子部分16之前(圖2B),水凝膠可稱為初始聚合水凝膠14'(參見圖2A)。在整合或附著陽離子部分16之後,水凝膠可稱為陽離子聚合水凝膠14(參見圖2B)。
初始聚合水凝膠14'可為至少兩個不同單體單元之共聚物。初始聚合水凝膠14'可由以下表示:(M1)n(M2)m,其中M1為第一單體單元,M2為第二單體單元,n為1至50,000範圍內之整數且m為1至100,000範圍內之整數。在陽離子聚合水凝膠14中,M1可經M1'(參考圖3所描述)或M1"(參考圖4所描述)置換,但M2、n及m與關於初始聚合水凝膠14'所描述相同。現將更詳細地描述單體單元M1、M2中之每一者之實例。
單體單元M1中之一者包括選自由以下組成之群的表面部分:可帶負電荷之原子、疊氮基及炔基。可帶負電荷之原子可為易於取代之任何基團,諸如相對較弱的親核試劑。可帶負電荷之原子之一些特定實例包括鹵素,諸如溴、碘等。
單體單元M1之此等表面部分中之每一者能夠由擴增引子18取代或共價附著於擴增引子18。舉例而言,溴能夠由引子18之5'端上之硫代磷酸酯基團取代。對於另一實例,疊氮基能夠共價連接至引子18之5'端上之炔基。對於再另一實例,炔基能夠共價連接至引子18之5'端上之疊氮基。
單體單元M1之此等表面部分中之每一者亦可使得陽離子部分16能夠附著於初始聚合水凝膠14'以產生陽離子聚合水凝膠14。
在一些實例中,單體單元M1之表面部分係由陽離子部分16取代,
且因此陽離子部分16變為整合於單體單元M1中。換言之,陽離子部分16附著於單體單元M1之位置與表面部分已附著之位置相同。舉例而言,表面部分可為比陽離子部分16更弱的氧化還原物種,且可發生取代反應,其中表面部分替換為陽離子部分16。可取代之表面部分之實例為可帶負電荷之原子,諸如溴。
在其他實例中,表面部分與連接子反應以將陽離子部分16附著於單體單元M1。舉例而言,疊氮基能夠共價連接至連接子之末端炔基。對於再另一實例,炔基能夠共價連接至連接子之末端疊氮基。
由於單體單元M1之表面部分之多官能度,應理解單體單元M1之一些表面部分將附著擴增引子18且一些表面部分將由陽離子部分16取代或將附著於陽離子部分16。在一些情況下,所附著之擴增引子18之量在所附著之陽離子部分16之量的約10倍至約50倍之範圍內。
包括本文所揭示之表面部分且可與一或多個其他單體單元M2共聚合之任何單體單元M1可用於形成初始聚合水凝膠14'。在一實例中,單體單元M1(包括表面部分)亦包括丙烯醯胺單元:。亦可使用丙烯醯胺單元之變化形式,例如烯烴中之碳可視情況經取代或N可視情況經取代。其他丙烯醯胺單元之實例包括甲基丙烯醯胺、N,N-二甲基丙烯醯胺、乙基丙烯醯胺等。
包括丙烯醯胺單元及作為可帶負電荷之原子之溴兩者之單體單元M1之一個特定實例為N-(5-溴乙醯胺基戊基)丙烯醯胺(N-(5-bromoacetamidylpentyl)acrylamide;brapa):
亦可使用N-(5-溴乙醯胺基戊基)丙烯醯胺之變化形式,例如烷基鏈-(CH2)-可在1至50範圍內,及/或-(CH2)-中之每一者可視情況經取代。
亦可使用N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺之變化形式,例如烷基鏈-(CH2)-可在1至50範圍內,及/或-(CH2)-中之每一者可視情況經取代。包括丙烯醯胺單元及疊氮基兩者之單體單元M1之另一實例由以下表示:
其中R1為H或C1-C4烷基;R2為H或C1-C4烷基;L為連接基團,該連接基團包括具有2至20個選自由以下組成之群的原子之直鏈:碳、氧及氮,及碳上視情況存在之取代基以及鏈中之任何氮原子;E為直鏈,該直鏈包括1至4選自由以下組成之群的原子:碳、氧及氮,及碳上視情況存在之取代基以及鏈中之任何氮原子;A為經N取代之醯胺,其中H或C1-C4烷基附著於N;且Z為含氮雜環。Z之實例包括以單一環狀結構或稠合結構存在之5至10個環成員。包括丙烯醯胺單元及疊氮基兩者之單體單元M1之再另一實例由以下表示:
其中R3a係選自氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之苯基或視情況經取代之C7-C14芳烷基;R3b係選自氫、視情況經取代之烷基或視情況經取代之苯基;且L1係選自視情況經取代之伸烷基連接基團或視情況經取代之伸雜烷基連接基團。
應理解,亦可使用其他單體單元M1形成初始聚合水凝膠14',只要其經本文所揭示之一個表面部分官能化即可。
單體單元M1中之任一者可與第二單體單元M2共聚合以形成初始聚合水凝膠14'。第二單體單元M2之實例包括丙烯醯胺單元、N,N-二甲基丙烯
醯胺單元:或,其中R4a係選自氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之苯基或視情況經取代之C7-C14芳烷基;R4b係選自氫、視情況經取代之烷基或視情況經取代之苯基;且L2係選自視情況經取代之伸烷基連接基團或視情況經取代之伸雜烷基連接基團。第二單體單元M2不包括第一單
體單元M1之表面部分(例如可帶負電荷之原子、疊氮基或炔基)。
在再其他實例中,單體單元M1可與丙烯醯胺單元(例如單體單元M2)及N,N-二甲基丙烯醯胺(例如單體單元M3)兩者共聚合以形成初始聚合水凝膠14'。在此等實例中,初始聚合水凝膠14'可由(M1)n(M2)m(M3)q表示,其中n為1至50,000範圍內之整數,m為1至100,000範圍內之整數,且q為1至100,000範圍內之整數。在對應陽離子聚合水凝膠14中,M1可經M1'(參考圖3所描述)或M1"(參考圖4所描述)置換,但M2、M3、n、m及q與關於初始聚合水凝膠14'所描述相同。
在一些實例中,初始聚合水凝膠14'((M1)n(M2)m或(M1)n(M2)m(M3)q)(及對應陽離子聚合水凝膠14)可為線性共聚物或輕度交聯共聚物。初始聚合水凝膠14'之分子量可在約10kDa至約1500kDa之範圍內,或在特定實例中可為約312kDa或約500kDa。視整合於初始聚合水凝膠中之陽離子部分16或附著於初始聚合水凝膠之陽離子部分16及連接子而定,陽離子聚合水凝膠14之分子量可高於其對應的初始聚合水凝膠14'。
所屬技術領域中具有通常知識者將認識到,重複「n」及「m」或「n」、「m」及「q」特徵之配置為代表性的,且單體子單元可以任何次序存在於初始聚合水凝膠14'及陽離子聚合水凝膠14結構(例如隨機、嵌段、圖案化或其組合)中。
為將初始聚合水凝膠14'引入至通道20中,可產生共聚物((M1)n(M2)m或(M1)n(M2)m(M3)q)之混合物且隨後施加至基板12。在一個實例中,共聚物可存在於混合物(例如,與水或與乙醇及水)中。隨後可使用旋塗或浸漬或浸塗或材料在正壓或負壓下之流動或另一適合的技術將共聚物混合物施加至一或多個基板表面22。
在一些實例中,可活化基板表面22(包括暴露於通道20中之部
分),且隨後可將共聚物混合物施加至其。在一個實例中,矽烷或矽烷衍生物(例如降冰片烯矽烷)可使用氣相沈積、旋塗或其他沈積方法沈積於基板表面22上。在另一實例中,基板表面22可暴露於電漿灰化以產生可黏附於共聚物之表面活化劑(例如,-OH基團)。在再其他實例中,電漿灰化繼之以矽烷化可用以活化基板表面22。
視共聚物而定,所施加之混合物可暴露於固化製程以在表面22上形成初始(共價鍵結)聚合水凝膠14'。在一實例中,固化可在室溫(例如約25℃)至約95℃範圍內之溫度下進行約1毫秒至約若干天範圍內之時間。可隨後進行拋光以便自基板12之周界處之表面22移除初始聚合水凝膠14',同時使通道20中之表面22上的初始聚合水凝膠14'至少實質上完整。
流體槽10P亦包括擴增引子18。
可進行接枝方法以將擴增引子18接枝於通道20中之初始聚合水凝膠14'。在一實例中,可藉由在引子18之5'端處或附近之單點共價附著將擴增引子18固定至初始聚合水凝膠14'。此附著使得i)引子18之轉接子特異性部分不黏合其同源定序就緒核酸片段及ii)不含引子延伸之3'羥基。出於此目的,可使用任何適合的共價附著。可使用之封端引子之實例包括炔烴封端之引子(例如,其可附著於初始聚合水凝膠14'之疊氮表面部分)、硫代磷酸酯封端之引子(例如,其可附著於初始聚合水凝膠14'之溴表面部分)或疊氮封端之引子(例如,其可附著於初始聚合水凝膠14'之炔烴表面部分)。適合的引子18之特定實例包括藉由Illumina公司出售之商業流體槽表面上所使用之P5及P7引子以用於在HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、NEXTSEQTM、NEXTSEQDXTM、NOVASEQTM、GENOME ANALYZERTM、ISEQTM及其他儀器平台上進行之定序。
在一實例中,接枝可涉及經由沈積(例如使用暫時黏結或永久性
黏結之蓋子)、浸塗、噴塗、覆液施配或藉由將一或多個引子18附著於通道20中之初始聚合水凝膠14'之另一適合的方法流動。此等實例技術中之每一者可利用引子溶液或混合物,其可包括一或多個引子、水、緩衝液及催化劑。藉由接枝方法中之任一者,引子18與通道20中之初始聚合水凝膠14'之反應基(例如,單體單元M1之表面部分)反應,且對周圍基板12無親和力。因此,引子20選擇性地接枝於通道20中之初始聚合水凝膠14'。
引子溶液或混合物中之引子18之濃度可使得初始聚合水凝膠14'之單體單元M1之一些表面部分保持可用於相互作用或反應以引入陽離子部分16(圖2B)。
如圖2A中所示,將包括可帶正電荷之部分26之流體24引入至流體槽10P。使初始聚合水凝膠14'在流體24中在足以形成包括陽離子部分16之陽離子聚合水凝膠14之溫度及時間下培育(圖2B中所示)。
所使用之流體24及可帶正電荷之部分26可取決於初始聚合水凝膠14',且特定言之,取決於初始聚合水凝膠14'中單體單元M1之表面部分。培育溫度及時間亦可取決於可帶正電荷之部分26及初始聚合水凝膠14'。
可帶正電荷之部分26之一些實例自身整合於初始聚合水凝膠14'之單體單元M1中以形成包括陽離子部分16之陽離子聚合水凝膠14。當陽離子部分16整合於初始聚合水凝膠之單體單元中時,意謂陽離子部分16已取代初始聚合水凝膠14'之單體單元M1之表面部分。在此實例中,表面部分為可帶負電荷之原子且可帶正電荷之部分26為比可帶負電荷之原子更強之氧化還原物種。作為實例,單體單元M1之可帶負電荷之原子為溴,且可帶正電荷之部分係選自由以下組成之群:參(羥甲基)膦、參(羥丙基)膦、肆(羥甲基)膦及參(2-羧乙基)膦。此等膦可帶正電荷之部分中之任一者可取代初始聚合水凝膠14'之單體單元M1之溴原子,使得對應鏻陽離子變為陽離子聚合水凝膠14之單體單元M1'(參見圖3)
之一部分。表1說明用於溴之取代反應中之可帶正電荷之部分26,及整合於陽離子聚合水凝膠14之單體單元M1'中之對應陽離子。在此等實例中之每一者中,相對離子為溴離子(Br-)。
取代反應之實例展示於圖3中。在此實例中,初始聚合水凝膠14'為包括N-(5-溴乙醯胺基戊基)丙烯醯胺作為第一單體單元M1且丙烯醯胺作為第二單體單元M2的無矽烷丙烯醯胺。當暴露於包括可帶正電荷之部分26(在此實例中,其為參(羥丙基)膦)之流體24時,可帶正電荷之部分26取代初始聚合水凝膠14'之可帶負電荷之原子。取代反應之結果為陽離子聚合水凝膠14,其包括附著於單體單元M1'之陽離子部分16(在此實例中,其為參(羥丙基)鏻陽離子),其中溴已附著於單體單元M1。
在圖3中所展示之實例中,流體24可包括pH在6至12範圍內之緩衝液。作為實例,緩衝液可為tris緩衝液或乙醇胺緩衝液。流體24中之可帶正電荷之部分26之濃度可在約1mM至約500mM之範圍內。在一實例中,流體24中之可帶正電荷之部分26之濃度可在約50mM至約400mM之範圍內。在另一實例中,流體24中之膦可帶正電荷之部分26中之任一者之濃度可為約100mM。
在此實例中,培育溫度在約18℃至約65℃範圍內且培育時間在約1.5分鐘至約5分鐘範圍內。
應理解,圖3中所展示之實例反應為取代反應之一個實例,且亦可使用其他單體單元M1(例如,包括另一可取代表面部分)、M2及/或其他可帶
正電荷之部分26。
可帶正電荷之部分26之其他實例經由連接子28(圖4)附著於初始聚合水凝膠14'之單體單元M1,以形成包括陽離子部分16之陽離子聚合水凝膠14。當陽離子部分16「經由連接子附著於聚合水凝膠之單體單元」時,意謂初始聚合水凝膠14'之單體單元M1之表面部分與連接子28反應以附著陽離子部分16。
在此實例中,表面部分為疊氮基或炔基,且可帶正電荷之部分26經由連接子28共價附著於表面部分。在一個實例中,(單體單元M1之)表面部分包括末端疊氮基且連接子28包括炔基。在另一實例中,(單體單元M1之)表面部分包括末端炔基且連接子28包括疊氮基。
除疊氮基或炔基以外,連接子28亦可包括可為單一-CH2-單元之鏈,該連接子亦可包括若干-CH2-單元、若干CH2CH2O-單元、寡核苷酸鏈或另一聚合鏈。在一個實例中,連接子28為雙官能DNA寡核苷酸。「雙官能(bi-functional)」意謂DNA寡核苷酸連接子之一端具有一個可附著於初始聚合水凝膠14'之端基及可附著於陽離子部分16之另一端基。
連接子28之任何實例亦可為可裂解的。「可裂解的(cleavable)」意謂連接子28包括可裂解鍵,且因此陽離子部分16可自流體槽表面移除。作為實例,連接子28可包括可裂解雙硫鍵、可光裂解鍵、可裂解磷酸二酯鍵或其組合。作為一個實例,DNA寡核苷酸之磷酸二酯鍵可經由酶裂解而裂解。作為其他實例,連接子28可包括可裂解雙硫鍵(S-S)或可光裂解鍵(例如,包括硝苄基之連接子,諸如可購自Integrated DNA Technologies之光可裂解間隔基:
在一實例中,可裂解鍵定位於末端疊氮基或炔基與可帶正電荷之部分26之間。連接子28中之可裂解鍵可為合乎需要的以使得陽離子部分16可自陽離子聚合水凝膠14移除,例如在接種庫片段之後、在自溶解產物提取DNA之後等。陽離子部分16之裂解將移除正電荷,且流體槽表面將恢復至其最初電荷狀態(例如引入陽離子部分16之前的電荷)。
在此實例中,可帶正電荷之部分26可為攜帶或可攜帶正電荷且可附著於連接子28之任何基團。作為實例,可帶正電荷之部分26可為胺基,諸如聚離胺酸、聚醯胺基胺等,其可在生理pH下攜帶正電荷(產生質子化胺基:R-NH3 +作為陽離子部分16),或四級銨鹽,其可在大多數pH下攜帶正電荷(產生四級銨陽離子:作為陽離子部分16),或鋶離子:。在一些實例中,初始聚合水凝膠14'可包括不同可帶正電荷之部分26之組合。
在一些實例中,可帶正電荷之部分26附著於連接子28,且所得化合物30(圖4)併入至流體24中,該流體引入至流體槽10P以產生陽離子聚合水凝膠14。此等化合物30可為可商購的或可為合成的。作為適合的化合物30之實例,含疊氮或含炔烴之連接子28可附著於胺基、四級銨基團或鋶離子之R基團中之任一者。化合物30之一個實例為丙炔基溴化膽鹼:
其包括附著於胺基(其可形成質子化胺)的含炔烴連接子28。此等兩個特定連接子28包括疊氮基(N3)或炔基(C≡C)以及烷基鏈中之可斷裂雙硫鍵(S-S)。
利用連接子28將可帶正電荷之部分26附著於初始聚合水凝膠14'之實例展示於圖4中。在此實例中,初始聚合水凝膠14'包括N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺作為第一單體單元M1且丙烯醯胺作為第二單體單元M2。當暴露於包括可帶正電荷之部分26(在此實例中,其為丙炔基溴化膽鹼)之流體24時,第一單體單元M1之疊氮基及化合物30之炔基經歷銅催化之疊氮-炔烴環加成(copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition;CuAAC)反應。CuAAC反應之結果為陽離子聚合水凝膠14,其包括附著於單體單元M1'之三唑的陽離子部分16(在此實例中,其為N,N,N-三甲基乙醇銨陽離子)。
在圖4中所展示之實例中,流體24可包括水。流體24中之化合物30之濃度可在約100nM至約100μM範圍內。因為連接反應為CuAAC反應,所以流體24亦可包括催化劑及配位體,或催化劑、配位體及還原劑。此等組分可添加至流體24,使得將其引入至流體槽10P。可使用產生銅(II)離子之任何銅催化劑,
諸如CuSO4。可使用任何配位體,諸如N,N,N',N",N"-五甲基二伸乙基三胺(PMDTA)。可使用任何還原劑,諸如抗壞血酸鈉。在一個實例中,流體24包括約0.25mol%至約2mol%銅催化劑及約5mol%至約10mol%還原劑。
在此實例中,培育溫度在約18℃至約60℃範圍內且培育時間在約30分鐘至約12小時範圍內。在另一實例中,CuAAC反應之培育溫度在約18℃至約22℃範圍內,且時間在約60分鐘(1小時)至約6小時或約6小時至約12小時範圍內。
應理解,圖4中所展示之實例反應為附著反應之一個實例,且亦可使用其他單體單元M1、M2,其他連接子28及/或其他可帶正電荷之部分26。
在再其他實例中,展示於圖3及圖4中之方法之組合可用於產生包括陽離子部分16之陽離子聚合水凝膠14。一個實例展示於圖5A及圖5B中。
在此實例中,將一端包括末端疊氮或炔烴及另一端包括末端可帶負電荷之原子(例如,溴、碘或另一弱親核試劑)之連接子28'附著於初始聚合水凝膠14'之單體單元M1之表面部分。當連接子28'包括末端疊氮時,單體單元M1之表面部分為炔烴,且當連接子28'包括末端炔烴時,單體單元M1之表面部分為疊氮。連接反應可以與參考圖4所描述類似之方式進行。此產生經改性之聚合水凝膠14",如圖5A中所示。
隨後可使經改性之聚合水凝膠14"暴露於如參考圖3所描述之取代反應。可將流體24引入至流體槽10P,該流體24包括比經改性之聚合水凝膠14"之可帶負電荷之原子(例如,溴)更強的可帶正電荷之部分26。如參考圖3所描述,可帶正電荷之部分26將取代且置換可帶負電荷之原子以形成陽離子聚合水凝膠14之另一實例。
當在一定溫度下進行培育且持續適合的時間時,形成陽離子聚合水凝膠14(如圖5B中所示),其表面處包括陽離子部分16及一或多個擴增引子18。
應理解,圖5A及圖5B中所展示之實例反應為取代及附著反應之一個實例,且亦可使用其他單體單元M1(例如,包括另一可取代表面部分)、M2、其他連接子28及/或其他可帶正電荷之部分26。
具有帶正電荷(陽離子)之聚合水凝膠14之流體槽10展示於圖2B中。圖2B中所示之流體槽10包括基板12;基板12上之陽離子聚合水凝膠14;陽離子部分16,該陽離子部分i)整合於陽離子聚合水凝膠14之單體單元M1'中或經由連接子28、28'附著於聚合水凝膠14之單體單元M1';以及附著於陽離子聚合水凝膠14之擴增引子18。
帶正電荷之聚合水凝膠14可吸引引入至流體槽10之帶負電荷之複合物或樣品,且因此可不利用額外捕獲位點。
額外流體槽架構
儘管在圖2B中展示流體槽架構之一個實例,但應理解,亦可使用其他流體槽架構。
流體槽10'之另一實例展示於圖6中。此實例類似於圖2B中所展示之實例,除基板12包括藉由間隙區域34分隔開之複數個凹陷部32,且陽離子聚合水凝膠14(包括陽離子部分16)及一或多個擴增引子18定位於凹陷部32中之每一者內以外。在圖6中所示之實例中,凹陷部32界定於通道20中。
在此實例中,凹陷部32可圖案化於基板12中。圖案化可涉及將凹陷部32蝕刻於基板12中及/或使用壓印微影。凹陷部32可隨後用如本文所描述之陽離子聚合水凝膠14(包括陽離子部分16)及一或多個擴增引子18官能化。凹陷部32之間的間隙區域34其上不具有陽離子聚合水凝膠14(包括陽離子部分16)或一或多個擴增引子18。此可歸因於自間隙區域34拋光之初始聚合水凝膠14'。在凹陷部32經官能化之後,額外材料36(例如,疏水性材料)可附著(例如,黏結、黏附等)至基板12(例如,周界處)以界定圍繞凹陷部32之通道20的壁。
凹陷部32可以任何適合之圖案或佈局跨越流體槽10'分佈。當流體槽10'包括多個通道20時,凹陷部32之圖案可為相同的,或凹陷部32之不同圖案可用於不同通道20中。可設想凹陷部32之多種不同圖案/佈局,包括規則、重複及不規則圖案。在一實例中,凹陷部32安置於六邊形網格中以用於緊密堆積及改良之密度。其他佈局可包括例如平行四邊形佈局(亦即,矩形、正方形等)、三角形佈局、圓形佈局等。
各凹陷部32可具有任何適合的形狀(及對應3維幾何形狀),諸如圓形(如圖6中所示)、橢圓形、多邊形(例如三角形、四邊形、五邊形等)等。
各凹陷部32之大小可藉由其開口面積、直徑及/或長度及寬度進行特徵界定。
可選擇由各凹陷部開口所佔據之面積以使得複合物無法進入凹陷部32。在一實例中,各凹陷部開口之面積可為至少可為至少約1×10-4μm2、至少1×10-3μm2、至少約1×10-2μm2、至少約0.1μm2、至少約0.5μm2、至少約1μm2或至少約4μm2。各凹陷部開口所佔據之面積可小於上文所指定之值或介於該等值之間。
在一些情況下,各凹陷部32之直徑或長度及寬度可為至少可為至少約1nm、至少約50nm、至少約100nm、至少約500nm或更大,只要尺寸小於通道直徑或長度及寬度即可。凹陷部直徑之實例在約1nm至約500nm範圍內。凹陷部直徑之另一實例在約300nm至約2μm範圍內。
凹陷部32亦可具有深度。作為實例,各凹陷部32之深度可為至少約10nm、至少約50nm、至少約1μm、至多約2μm。應理解,各凹陷部32之深度可大於上文所指定之值、小於上文所指定之值或介於該等值之間。
在一實例中,凹陷部32之縱橫比(直徑:深度)可在約1:1至約1:2或約1:1.25至約1:1.75範圍內。
在此實例中,相鄰凹陷部32可由給定通道20內之間隙區域34分隔開。平均凹陷部間距表示自一個凹陷部32之中心至相鄰凹陷部32之中心(中心間間距)或自一個凹陷部32之右邊緣至相鄰凹陷部32之左邊緣(邊緣間間距)之間距。凹陷部32之佈局或圖案可為規則的,使得圍繞平均間距之變異係數較小,或佈局或圖案可為不規則的,在此情況下,變異係數可相對較大。在任一情況下,取決於通道20之尺寸,平均間距可為例如至少約10nm、至少約0.1μm、至少約0.5μm或更大。替代地或另外,平均間距可為例如至多約0.5μm、至多約0.1μm或更小。凹陷部32之特定圖案的平均間距可在選自以上範圍的下限值中之一者與上限值中之一者之間。
流體槽10"之另一實例展示於圖7中。此實例類似於圖6中所展示之實例,不同之處在於基板12進一步包括複數個腔室38、38',且其中複數個凹陷部32之子集位於複數個腔室38、38'中之每一者之周界內。類似於圖6,陽離子聚合水凝膠14(包括陽離子部分16)及一或多個擴增引子18定位於凹陷部32中之每一者內。
在此實例中,凹陷部32可圖案化於基板12中。圖案化可涉及將凹陷部32蝕刻於基板12中及/或使用壓印微影。凹陷部32可隨後用如本文所描述之陽離子聚合水凝膠14(包括陽離子部分16)及一或多個擴增引子18官能化。凹陷部32之間的間隙區域34其上不具有陽離子聚合水凝膠14(包括陽離子部分16)或一或多個擴增引子18。在凹陷部32經官能化之後,額外材料36(例如,疏水性材料)可附著(例如,黏結、黏附等)至基板12(例如,周界處)以界定圍繞凹陷部32之子集之腔室38、38'的壁。
腔室38、38'可以任何適合之圖案或佈局跨越基板12分佈。可設想腔室38、38'之多種不同佈局,包括規則、重複及不規則圖案。在一實例中,腔室38、38'安置於六邊形網格中以用於緊密堆積及改良之密度。其他佈局可包括例
如平行四邊形佈局(亦即,矩形、正方形等)、三角形佈局、圓形佈局等。在一些實例中,佈局或圖案可為呈列及行之腔室38、38'的x-y格式。
腔室38、38'可具有任何適合的形狀,諸如正方形、圓形、橢圓形、多邊形(例如三角形、四邊形、五邊形等)等。
各腔室38、38'之大小可藉由其開口面積、直徑及/或長度及寬度進行特徵界定。如圖7中所示,流體槽10"具有位於腔室38、38'中之每一者內之複數個凹陷部32。因此,腔室38、38'之大小大於各凹陷部32之大小。換言之,腔室38、38'的一或多個尺寸大於各凹陷部32之一或多個尺寸。在此實例中,「尺寸(dimension)」係指由各腔室開口或凹陷部開口所佔據之面積,及/或腔室38、38'或凹陷部32之直徑,及/或各腔室38、38'或凹陷部32之長度及寬度。在圖7中所示之實例中,腔室38、38'中之每一者之開口面積及直徑大於凹陷部32中之每一者之開口面積及直徑。各腔室38、38'之開口面積及直徑或長度及寬度取決於待位於腔室38、38'內之凹陷部32之數目。
可選擇由各腔室開口所佔據之面積以使得複合物(其實例展示於圖8A至圖8C中)可進入腔室38、38'。在一實例中,各腔室開口之面積可為至少約1μm2、至少約10μm2、至少約100μm2或更大。由各腔室所佔據之面積可大於上文指定之值或介於該等值之間。
在一些情況下,各腔室38、38'之直徑或長度及寬度可為至少約1μm、至少約10μm、至少約20μm、至少約30μm、至少約40μm、至少約50μm、至少約100μm或更大。腔室直徑之實例在約1μm至約1000μm範圍內。腔室直徑之另一實例在約10μm至約50μm範圍內。當腔室38、38'具有長度及寬度時,應理解,長度與寬度可相同或不同。
腔室38、38'亦可具有深度,該深度取決於用以形成腔室38、38'之技術。舉例而言,當微接觸、氣溶膠或噴墨列印用於沈積界定腔室38、38'之額
外材料36時,各腔室38、38'之深度可為單層厚。對於其他實例,各腔室38、38'之深度可為約1μm、約10μm、約50μm或更大。在另一實例中,深度為待引入至腔室38、38'中之複合物之平均直徑的至少約50%。在一實例中,此深度可在約10μm至約30μm範圍內。除吸引所釋放之庫片段之帶正電荷之聚合水凝膠14以外,腔室38、38'之深度可幫助阻斷所釋放之庫片段在相鄰腔室38、38'之間的側向擴散。因此,在無任何外部固定劑之情況下,所釋放之庫片段可維持於腔室38、38'內。在另一實例中,深度為約5μm或更小。應理解,各腔室38、38'之深度可大於上文所指定之值、小於上文所指定之值或介於該等值之間。
相鄰腔室38、38'可藉由額外材料36之表面分隔開。平均腔室間距表示自一個腔室38、38'之中心至相鄰腔室38、38'之中心(中心間間距)或自一個腔室38、38'之右邊緣至相鄰腔室38、38'之左邊緣(邊緣間間距)之間距。腔室38、38'之佈局或圖案可為規則的,使得圍繞平均間距之變異係數較小,或佈局或圖案可為不規則的,在此情況下,變異係數可相對較大。在任一情況下,平均間距可為例如至少約1μm、至少約5μm、至少約10μm、至少約100μm或更大。在一個實例中,平均間距為腔室14之直徑的2倍。腔室38、38'之特定圖案的平均間距可在選自以上範圍的下限值中之一者與上限值中之一者之間。儘管已提供實例平均腔室間距值,但應理解,亦可使用其他平均腔室間距值。
凹陷部32之各子集為複數個腔室38、38'中之每一者之周界內的位置。
儘管圖6或圖7中未示出,但流體槽10'之通道20或流體槽10"之各腔室38、38'可包括可吸引引入至流體槽10'或10"中之複合物或樣品的捕獲位點。更特定言之,通道20或腔室38、38'內之間隙區域34之至少一部分可包括捕獲位點。
一或多個捕獲位點可在物理上及/或化學上能夠固定通道20或腔
室38、38'中之基板12上(例如間隙區域34上)之複合物或樣品。
一或多個捕獲位點可定位於任何適合的位置處。跨越基板12之一或多個捕獲位點之位置可為均一的或可為非均一的。捕獲位點可具有任何適合的形狀、幾何形狀及尺寸,其可至少部分地取決於捕獲位點之組態(例如貼片(patch)、孔、突起部(protrusion)等)及待由一或多個捕獲位點捕獲之複合物或樣品之類型。
在一些實例中,一或多個捕獲位點為施加於間隙區域34之一部分上的化學捕獲劑。可使用本文所揭示之化學捕獲劑之任何實例。在一個實例中,可使用微接觸印刷或另一適合的技術將各別化學捕獲劑沈積於所需位置中。
在其他實例中,一或多個捕獲位點包括界定於基板12之表面中之孔。孔可使用蝕刻或壓印(視所使用之基板12而定)形成。孔可具有任何適合的形狀及幾何形狀,諸如本文中針對凹陷部32所闡述之彼等形狀及幾何形狀。在一些實例中,孔不具有添加至其中之額外化學捕獲劑。在此等實例中,開口尺寸使得複合物或樣品能夠自組裝至對應孔(例如基於形狀)。在其他實例中,孔確實具有添加至其中之化學捕獲劑。
捕獲位點之其他實例包括在其表面上具有化學捕獲劑之孔及捕獲珠粒。捕獲珠粒可經尺寸化以剛好放入至孔中。在一些實例中,捕獲珠粒可與相鄰間隙區域34共平面或略微在相鄰間隙區域34上方延伸以使得最終附著於其上之複合物不限於孔內。在一實例中,捕獲珠粒係選自由以下組成之群:二氧化矽、超順磁材料、聚苯乙烯及丙烯酸酯。本文所揭示之化學捕獲劑之任何實例可用於捕獲珠粒之表面上,且可在將其引入孔中之前塗佈於捕獲珠粒上。
捕獲位點孔之深度可視是否將化學捕獲劑引入至其中及是否將捕獲珠粒引入至其中而變化。深度可經選擇以至少容納此等材料(亦即,材料含於孔內)。在一實例中,孔之深度在約1nm至約5微米範圍內。
作為另一實例,捕獲位點包括界定於基板12中之突起部。突起部為自相鄰表面朝外(朝上)延伸之三維結構。突起部可經由蝕刻、光微影、壓印等產生。儘管任何適合的三維幾何形狀可用於突起部捕獲位點,但具有至少實質上平坦頂表面之幾何形狀可為合乎需要的。實例突起部幾何形狀包括球體、圓柱體、立方體、多邊形稜柱(例如長方體稜柱、六邊形稜柱等)或類似形狀。
不同化學捕獲劑可施加於各別突起部捕獲位點之頂表面上。可使用本文所揭示之化學捕獲劑之任何實例,且可使用任何沈積技術將化學捕獲劑施加至突起部之頂表面。
應理解,捕獲位點之類型之任何組合可一起(例如捕獲劑與孔)用於流體槽10'、10"。
亦展示不具有黏結至基板12之蓋子的流體槽10、10'、10"。應理解,流體槽10、10'、10"之一些實例可具有黏結至基板12之至少一部分,例如表面22處之蓋子。蓋子可定位於表面22上,使得其界定單一流動通道20或多個流體分隔之流動通道20或可或可不流體分隔之多個腔室38、38'。
蓋子可為對朝向基板12導引之激勵光透明的任何材料。作為實例,蓋子可為玻璃(例如硼矽酸鹽、熔融二氧化矽等)、塑膠或其類似者。適合的硼矽酸鹽玻璃之市售實例為可購自Schott North America公司之D 263®。適合的塑膠材料(即環烯烴聚合物)之市售實例為可購自Zeon Chemicals有限公司之ZEONOR®產品。
可使用任何適合的技術將蓋子黏結至基板表面22,該等技術諸如雷射黏結、擴散黏結、陽極黏結、共晶黏結、電漿活化黏結、玻璃料黏結或其他所屬技術領域中已知之方法。在一實例中,間隔層可用於將蓋子黏結至基板表面22。間隔層可為將基板12中之至少一些與蓋子密封在一起之任何材料。
在其他實例中,流體槽10、10'、10"並不包括蓋子,而是包括黏
結在一起之兩個基板12。在此等實例中,基板12之反應性表面(例如,聚合水凝膠14、引子18)面向彼此。可使用針對蓋子及基板12所描述之類似技術及材料將基板12黏結在一起。
套組
流體槽10P可為套組之一部分,該套組可用於將正電荷引入至初始聚合水凝膠14'。在一實例中,該套組包括i)流體槽10P,其包括基板12;初始聚合水凝膠14',該初始聚合水凝膠定位於基板12上且具有選自由以下組成之群的表面部分:可帶負電荷之原子、疊氮基及炔基;及附著於初始聚合水凝膠14'之擴增引子18;及ii)流體24,其包括與表面部分相互作用或反應以形成包括陽離子部分16之陽離子聚合水凝膠14的可帶正電荷之部分26。
本文所揭示之流體槽架構之任何實例,包括用於流體槽10、10'、10'之彼等流體槽架構,均可用於套組中之流體槽10P中。此外,可使用基板12、初始聚合水凝膠14'及擴增引子18之任何實例。再此外,包括可帶正電荷之部分26之流體24之任何實例可用於套組中。
套組可用於執行如本文所描述之方法100。
用於流體槽之複合物
流體槽10、10'、10"之實例可特別適合於與本文所揭示之複合物之實例一起使用。複合物包括載體(例如水凝膠支撐物或固體支撐物)及附著於或含於載體內之定序就緒核酸片段。適合的複合物之實例展示於圖8A至圖8C中。儘管描述了用於製備複合物之一些實例方法,但應理解,亦可使用其他方法,只要定序就緒核酸片段附著於載體或含於載體內即可。
圖8A說明包括固體支撐物42及附著於固體支撐物42之定序就緒核酸片段44之複合物40A。
在一個實例中,為形成此複合物40A,使轉接子序列52、52'經由
結合對之一個成員46結合至固體支撐物42。在一實例中,此轉接子序列52、52'包括第一定序引子序列(例如,讀段1定序引子序列)及第一序列(例如,經尿嘧啶修飾之P5序列),其與流體槽10、10'、10"上之擴增引子18中之一者(例如P5)之至少一部分互補。此轉接子序列52、52'結合至結合對(例如生物素)之一個成員46,使得其可結合至固體支撐物42之表面,該固體支撐物包括結合對之另一成員(例如抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素等)。此轉接子序列亦可包括索引序列。
可將Y-轉接子與轉座酶(例如兩個Tn5分子)混合以形成轉座體。Y-轉接子可包括彼此雜交之兩個嵌合末端序列。嵌合末端序列中之一者可附著於另一轉接子48、48',該另一轉接子包括第二定序引子序列(例如,讀段2定序引子序列)、與流體槽10、10'、10"上之擴增引子18中之另一者(例如P7)之至少一部分互補的第二序列(例如經尿嘧啶修飾之P7序列),以及視情況存在之索引/條碼序列。
可隨後執行標籤化方法。可將包括樣品(例如DNA)之流體(例如標籤化緩衝液)添加至轉座體且添加至具有結合至其上之轉接子序列52、52'之固體支撐物42。當樣品接觸轉座體時,DNA標籤化(用固體支撐物42上之轉接子序列52、52'片段化且附籤)且結合至Y-轉接子(例如經由接合自由嵌合末端序列)。樣品之連續標籤化在轉座體之間產生複數個橋聯分子。橋聯分子纏繞固體支撐物42。轉座體維持橋聯分子之連續性。為完成定序就緒片段44,進行進一步延伸及接合以確保片段50、50'附著於序列48及48'。
轉座酶可隨後經由十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate;SDS)處理或熱或蛋白酶K消化來移除。移除轉座酶留下附著於固體支撐物42之定序就緒核酸片段44。
所得複合物40A展示於圖8A中。橋聯分子為定序就緒核酸片段
42,其中之每一者包括片段50、50'及轉接子序列48及52或在任一末端處附著之48'及50'。轉接子序列52、52'為最初結合至固體支撐物42之彼等轉接子序列,且包括第一定序引子序列及與流體槽引子互補之第一序列。轉接子序列52、52'附著於結合複合物/對之一個成員46。轉接子序列48、48'選自Y-轉接子,且包括與另一流體槽引子互補之第二序列及第二定序引子序列。因為各定序就緒核酸片段44包括用於擴增(例如橋式擴增)及定序之適合的轉接子,所以不進行PCR擴增。因此,此等片段44為定序就緒的。此外,因為庫片段44來自相同樣品,所以片段44可適用於鍵聯之長讀段應用。
圖8B說明包括固體支撐物42及附著於固體支撐物42之定序就緒核酸片段44'的另一複合物40B。在一個實例中,在管中產生無PCR核苷酸庫,且隨後使庫與管中之固體支撐物42雜交。在圖8B中所示之實例中,將具有結合對之一個成員46的引子(例如轉接子52"、48")添加至管中之庫片段50"中,且隨後將定序就緒核酸片段44'結合至固體支撐物42。在另一實例中,固體支撐物42可具有經由結合對(例如該支撐物42上之抗生物素蛋白及附著於引子之生物素)附著於其上之引子。此等引子與附著於庫片段50"之轉接子52"雜交(且因此引子及結合對成員處於片段之一端而非另一端)。在另一實例中,延伸可使用股取代酶進行。此將產生完全雙股庫(例如無叉形或Y轉接子,如圖8B中所示)。定序就緒核酸片段44'可經由變性釋放於流體槽上。
圖8C說明包括水凝膠支撐物54及含於水凝膠支撐物54內之定序就緒核酸片段44"之複合物40C之實例。
為形成此複合物40C,在樣品(例如遺傳物質)存在下,混合含有一或多種水凝膠單體及/或一或多種聚合物及一或多種交聯劑之流體。此流體可負載至礦物油或另一適合的疏水性流體中,且乳化以產生小液滴。可添加自由基引發劑以聚合及/或交聯一或多種水凝膠單體及/或一或多種聚合物且形成水
凝膠支撐物54。
當形成複合物40C時,流體可為水;單體可選自由以下組成之群:丙烯醯胺、N,N'-雙(丙烯醯基)胱胺、雙丙烯醯胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、雙乙烯碸、乙二醇二烯丙醚、乙二醇二丙烯酸酯、三甲基丙烯酸三羥甲基丙烷酯、乙氧基化三羥甲基二丙烯酸酯、乙氧基化季新戊四醇四丙烯酸酯、膠原蛋白單體及其組合;及/或聚合物可選自由以下組成之群:聚乙二醇-硫醇、聚乙二醇-丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇(例如,具有在約100至約200,000範圍內之重量平均分子量)、聚氧化丙烯、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-異丙基丙烯醯胺)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己內酯、聚(乙烯磺酸)、聚(L-天冬胺酸)、聚(L-麩胺酸)、聚離胺酸、瓊脂、瓊脂糖、海藻酸酯、肝素、硫酸海藻酸酯、硫酸葡聚糖、玻尿酸、果膠、角叉菜膠、明膠、聚葡萄胺糖、纖維素、膠原蛋白聚合物及其組合。交聯劑在水凝膠支撐物54之聚合物中形成鍵,例如雙硫鍵。交聯劑可為可逆的,因為其可視其暴露於之化學物質而交聯及非交聯。舉例而言,可逆交聯劑為含有雙硫鍵之雙丙烯醯胺交聯劑,其可用還原劑(諸如二硫蘇糖醇(dithiothreitol;DTT)、參-(2-羧乙基)膦(tris-(2-carboxyethyl)phosphine;TCEP)或參-(3-羥丙基)膦(tris-(3-hydroxypropyl)phosphine;THP))分解。在一實例中,交聯劑係選自由以下組成之群:丙烯醯胺、N,N'-雙(丙烯醯基)胱胺、雙丙烯醯胺、1,4-二丙烯醯哌、N-N'-二烯丙基L-酒石二醯胺及N-N'-(1,2-二羥基伸乙基)-雙丙烯醯胺。在一實例中,自由基引發劑可為光引發劑。光引發劑之實例包括偶氮二異丁腈、過氧化苯甲醯、曙紅-5-異硫氰酸酯。可使用此類型之自由基引發劑,因為其在暴露於適當波長之光之前將不引發交聯。在另一實例中,自由基引發劑可在暴露於自由基源時引發交聯。此類型之自由基引發劑之實例為四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine;TEMED)。
將樣品囊封於水凝膠支撐物54內,因為其大小足以使得其無法穿過水凝膠支撐物54之孔隙。在一些實例中,樣品為DNA或RNA且長度為至少約100個核苷酸(例如1,000個核苷酸或更多、10,000個核苷酸或更多、500,000個核苷酸或更多等)。在一些實例中,水凝膠支撐物54之孔隙大小係指基於複數個孔隙之量測,孔隙之截面之平均直徑或平均有效直徑。不為圓形之截面之有效直徑等於具有與非圓形截面之截面面積相同的截面面積之圓形截面之直徑。在一實例中,孔隙大小在約10nm至約100nm範圍內。
可隨後在水凝膠支撐物54內進行庫製備。多重試劑交換可經由水凝膠支撐物54之孔隙進行。樣品及由其產生之任何庫片段保持在水凝膠基質內。庫製備可涉及使樣品片段化且添加將產生序列就緒片段44"之轉接子。
在一實例中,庫製備可經由在水凝膠支撐物54內進行之標籤化來進行。所得複合物40C展示於圖8C中。轉接子序列包括用於擴增及定序之適合的轉接子,且因此所得片段44"係定序就緒的。在另一實例中,可使用產生雙股庫之聚合酶延伸來進行庫製備。此實例庫需要在釋放形成水凝膠支撐物54及接種之前變性。
涉及複合物之方法
本文所揭示之方法之一些實例使用本文所揭示之流體槽10、10'、10"之實例及複合物40A、40B或40C中之任一者。如上文所描述,複合物40A、40B或40C中之每一者包括由遺傳物質之相同樣品獲得之序列就緒片段。當複合物中之一者或幾個在通道20或腔室38、38'內分離時,獲得來自相同樣品之庫的空間共定位。
在一實例方法中,複合物40A、40B或40C例如通過一或多個輸入埠引入至流體槽10、10'、10"中。複合物40A、40B或40C可引入至流體,諸如Tris-HCl緩衝液或0.5×鹽水檸檬酸鈉(saline sodium citrate;SSC)緩衝液。來自流體
之至少一些複合物40A、40B或40C將沈降至一或多個通道20及/或腔室38、38'中之至少一些中。當使用流體槽10時,複合物40A、40B或40C之帶負電荷之定序就緒片段44、44'、44'可被吸引至通道20中之帶正電荷之聚合水凝膠14。當使用流體槽10'或10"時,帶正電荷之聚合水凝膠14被限於凹陷部32中。在此等實例中之一些中,複合物40A、40B或40C可部分歸因於通道20或腔室38、38'之深度而穩定且保持於通道20或腔室38、38'中。在此等實例中之一些其他實例中,通道20或腔室38、38'可包括捕獲位點,複合物40A、40B或40C黏附於該捕獲位點。
應理解,一些複合物40A、40B或40C可不沈降,且此等複合物40A、40B或40C將在執行進一步製程之前自流體槽10、10'、10"移除。亦應理解,一些通道20或腔室38、38'可接納複合物40A、40B或40C中之一或多者,而通道20或腔室38、38'中之其他者可不接納複合物40A、40B或40C。當不包括捕獲位點時,複合物40A、40B或40C分佈可為隨機的,或當包括捕獲位點時,複合物40A、40B或40C分佈可更受控。
此實例方法隨後包括自流體槽10、10'、10"洗掉未截留之複合物40A、40B或40C。洗滌可涉及將流體引入至流體槽10、10'、10"中。流動可推動未沈降出之任何複合物40A、40B或40C穿過流體槽10、10'、10"之出口。
此方法實例隨後包括使得經截留之複合物40A、40B或40C之載體(例如固體支撐物42或水凝膠支撐物54)將定序就緒核酸片段44、44'或44"釋放至各別通道20或腔室38、38',其中各複合物40A、40B或40C截留於該各別通道20或腔室38、38'中。
引起載體(亦即支撐物42或54)釋放定序就緒核酸片段44、44'或44"可能有所不同,其視所使用之複合物40A、40B或40C而定。在一個實例中,載體為固體支撐物42,且引起涉及將裂解劑引入至流體槽10、10'、10"。裂解劑可引發定序就緒核酸片段44、44'自固體支撐物42之發生化學、酶或光化學釋放。
在此等實例中,另一刺激,諸如熱或光可觸發裂解劑自固體支撐物42釋放庫片段44或44'。作為一個實例,自由生物素可作為裂解劑引入,且加熱至約92℃可用於誘導生物素-寡核苷酸自固體支撐物42釋放。
在其他實例中,使用複合物40C且因此載體為水凝膠支撐物54。在此等其他實例中,引起庫釋放(library release)可涉及加熱流體槽10、10'、10",將裂解劑引入流體槽10、10'、10"或其組合。加熱以自水凝膠支撐物54釋放庫片段44"可涉及加熱至約90℃之溫度。可加熱整個流體槽10、10'、10",且當加熱複合物40C時,水凝膠支撐物54可降解以釋放片段44"。在一些實例中,裂解劑可包括一或多種組分,該一或多種組分可使水凝膠支撐物54解聚合且自其釋放定序就緒片段44"。作為實例,裂解劑包括二硫蘇糖醇(DTT)、參-(2-羧乙基)膦(TCEP)或參-(3-羥丙基)膦(THP)。在其他實例中,裂解劑為光。在此等實例中,用於形成水凝膠支撐物54之交聯劑可包括光可裂解部分,且將複合物40C暴露於適當波長之光可裂解此部分且使水凝膠支撐物54降解。
定序就緒核酸片段44、44'或44"之轉運及接種部分藉由陽離子聚合水凝膠14之正電荷控制。定序就緒核酸片段44、44'、44"帶負電荷,且因此被吸引至帶正電荷之聚合水凝膠14。因此,任何特定複合物40A、40B或40C之片段44、44'或44"將被限於特定複合物40A、40B或40C所限之通道20或腔室38、38'。
除陽離子聚合水凝膠14之吸引力以外,通道20或腔室38、38'之深度亦可限制定序就緒核酸片段44、44'或44"之轉運及接種,且因此可不將外部固定劑引入至流體槽10、10'、10"。
在本文所揭示之流體槽10、10'、10"之情況下,陽離子聚合水凝膠14可緊接著在其釋放之後吸引定序就緒核酸片段44、44'或44",其使得擴增引子18能夠以相對受限方式接種所釋放之定序就緒核酸片段44、44'或44"。在一實例中,接種係經由在片段44、44'或44"之第一或第二序列與引子18中之互補者之
間雜交來實現。接種可在片段44、44'或44"及一或多個引子18之適合的雜交溫度下進行。
隨後可使用諸如叢集產生來擴增經接種之定序庫。
在叢集產生之一個實例中,使用高保真DNA聚合酶藉由3'延伸自雜交引子18複製定序就緒核酸片段44、44'或44"。使原始定序就緒核酸片段44、44'或44"變性,將複本固定於通道20或凹陷部32內。等溫橋式擴增可用於擴增經固定之複本。舉例而言,經複製之模板循環以與相鄰的互補引子18雜交,且聚合酶複製經複製之模板以形成雙股橋,其變性以形成兩個單股之股。此等兩股於相鄰互補引子18上方循環且與相鄰互補引子18雜交並且再次延伸以形成兩個新的雙股環。藉由等溫變性及擴增之循環在各模板複本上重複該方法以產生密集的純系叢集。使各雙股橋之叢集變性。在一實例中,藉由特異性鹼基裂解移除反向股,留下正向模板多核苷酸股。應理解,叢集使得在各通道20或凹陷部32中形成若干模板定序就緒核酸片段。
在叢集產生之後,陽離子部分16可自陽離子聚合水凝膠14裂解。因此,流體槽表面之電荷可視為可逆的。陽離子部分16之裂解可在陽離子部分16可裂解或經由可裂解連接子28、28'(如包括可裂解雙硫鍵或可光裂解鍵或可裂解核苷酸鍵)附著時進行。陽離子部分16之裂解可藉由光裂解、藉由暴露於酸性條件(例如,若連接子為酸不穩定的)或藉由酶裂解(例如,若雙官能DNA寡核苷酸用作連接子28、28'以附著陽離子部分16)實現。陽離子部分16之裂解可逆轉流體槽表面之電荷,部分因為附著於聚合水凝膠14之模板定序就緒核酸片段係帶負電荷。
在叢集產生之後(且在一些情況下,在陽離子部分16裂解之後),可進行定序。本文所揭示之流體槽10、10'、10"之任何實例可用於多種定序方法或技術中,包括常常被稱作合成定序(sequencing-by-synthesis;SBS)、循環陣列
定序、接合定序、焦磷酸定序等等之技術。
作為一個實例,藉由合成定序(SBS)反應可在諸如以下之系統上進行定序:HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、NOVASEQTM、NEXTSEQDXTM、ISEQTM、NEXTSEQTM或來自Illumina(San Diego,CA)的其他定序器系統。在SBS中,監測沿模板定序就緒核酸片段定序引子之延伸以確定模板中之核苷酸之序列。可阻斷模板之3'端及任何經流體槽結合之引子18(不附著於複本)以防止對定序反應造成干擾,且特定言之,防止發生非所期望之引發。基本化學方法可為聚合(例如,利用聚合酶之催化)或接合(例如,利用接合酶之催化)。在特定的基於聚合酶之SBS方法中,將經螢光標記之核苷酸以模板依賴性方式添加至定序引子中,以使得可使用添加至定序引子中之核苷酸的次序及類型之偵測來確定模板之序列。舉例而言,為引發第一SBS循環,可將一或多個經標記之核苷酸、DNA聚合酶等遞送至流體槽10等中/通過流體槽10等,其中定序引子延伸引起經標記之核苷酸被併入。此併入可經由成像事件偵測。在成像事件期間,照明系統(圖中未示)可將激勵光提供至流體槽10、10'、10"。
在一些實例中,經螢光標記之核苷酸可進一步包括可逆終止特性,一旦將核苷酸添加至模板,則該特性即終止進一步引子延伸。舉例而言,具有可逆終止子部分之核苷酸類似物可添加至模板,以使得後續延伸無法進行,直至遞送去阻斷劑以移除該部分。因此,對於使用可逆終止之實例,可將去阻斷試劑遞送至流體槽等(在偵測進行之後)。
在各種流體遞送步驟之間可進行一或多次洗滌。SBS循環隨後可重複n次以使模板延伸n個核苷酸,由此偵測長度n之序列。
儘管已詳細描述SBS,但應理解,本文所描述之流體槽10、10'、10"可與其他定序方案一起用於基因分型或用於其他化學及/或生物學應用中。
其他流體槽應用
雖然已詳細地描述定序,但應理解,本文所描述之流體槽10、10'、10"可用於需要帶正電荷之表面之其他應用中。作為一個實例,帶正電荷之聚合水凝膠14可適用於自引入至流體槽10、10'、10"之溶解產物中提取DNA。舉例而言,可將細胞引入一或多個通道20或腔室38、38'中,且隨後可引入溶解緩衝液。自細胞釋放之DNA可吸引至帶正電荷之表面。外部固定劑(例如,油、空氣)可用於或可不用於進一步輔助含有經提取之DNA。
作為另一實例,帶正電荷之聚合水凝膠14可用於在某些pH條件下排斥蛋白質,由此防止表面處發生不合需要之蛋白質結合。在此等實例中,帶正電荷之聚合水凝膠14可具有或可不具有附著於其之擴增引子18。
本文所描述之流體槽10、10'、10"可用於需要可逆帶電表面之其他應用中。當附著陽離子部分16時,可逆帶電表面可帶正電荷,且當陽離子部分16自其裂解時帶負電荷。帶正電荷之表面可有助於吸引DNA,且帶負電荷之表面可有助於洗提。帶負電荷之表面亦可為將帶正電荷之細胞(例如細菌)牽拉至流體槽表面所需的。
為進一步說明本發明,本文給出一實施例。應理解,提供此實施例以達成說明之目的,且不視為限制本發明之範圍。
利用具有兩個通道之玻璃基板製備實施例流體槽通道及比較實施例流體槽通道。使兩個通道矽烷化,且使PAZAM沈積於其上。隨後,將P5及P7引子接枝於通道中之PAZAM。使用UV可固化黏著劑將蓋子黏結至基板,以流體方式分離兩個通道。
在60℃下將參(羥丙基)-膦(於50mM Tris-HCl緩衝液(pH 9)中
之100mM THP)引入至實施例通道中持續約2分鐘。另一(比較)通道未經混合物處理。
用於此實施例中之複合物包括固體支撐物及經由抗生物素蛋白-生物素連接子附著於固體支撐物之定序就緒核酸片段。複合物之庫片段與圖8B中所示之彼等庫片段類似。遵循TruSeqTM平台(Illumina公司)方案在管中製備無PCR之庫。使該庫經由與P7引子雜交而結合至珠粒,該等引子經由生物素附著於珠粒。使該庫用Sytox綠染色。
藉由使含有複合物(200μL,於雜交緩衝液中)之雜交緩衝液流動通過通道中之每一者而將複合物引入至實施例及比較實施例流體槽通道。藉由自複合物釋放庫片段來引發接種。藉由將流體槽加熱高於P7引子之解鏈溫度來引發庫釋放。使片段雜交且進行第一股延伸。固體支撐物及未雜交之片段用0.2M NaOH溶液移除。隨後使用橋式擴增進行叢集。
在叢集之後,拍攝實施例及比較實施例通道之顯微照片,且出於明晰之目的使原始著色反轉。如圖9A中所示,未用參(羥丙基)-膦處理之比較通道在整個表面上具有相對較均勻的庫接種。此藉由反轉顯微照片中所散開的較暗點證明。圖9B為自比較流體槽通道上之複合物釋放之庫的示意圖。圖示描繪通道之寬度,且比例尺表示2D流體槽內表面之視場之實際尺寸。如圖9B之圖示中所示,庫片段轉運及接種不受限制。
對比而言,如圖10A中所示,實施例通道(其經參(羥丙基)-膦處理)具有DNA庫之富集區域。此藉由反轉顯微照片中富集的較暗點證明。圖10B為自實施例流體槽通道上之複合物所釋放之庫的示意圖。圖示描繪通道之寬度,且比例尺表示2D流體槽內表面之視場之實際尺寸。如圖10B中所示,因為帶負電荷之庫片段被吸引至帶正電荷之流體槽表面,所以庫片段轉運及接種受限。此等結果說明經參(羥丙基)-膦處理之表面帶正電荷,且因此能夠在DNA庫片段自複
合物釋放時吸引該等DNA庫片段。
額外注意事項
此外,應理解,本文所提供之範圍包括所陳述範圍及所陳述範圍內之任何值或子範圍,如同其明確敍述一般。舉例而言,由約2mm至約300mm表示之範圍應解釋為不僅包括約2mm至約300mm之明確敍述限值,且亦包括個別值,諸如約15mm、22.5mm、245mm等,及子範圍,諸如約20mm至約225mm等。
應瞭解,前述概念及下文更詳細地論述之額外概念之所有組合(限制條件為此等概念並未彼此不相容)均經審慎考慮作為本文所揭示之發明主題之一部分。特定言之,在本發明結尾處出現之所主張主題之所有組合均經審慎考慮作為本文所揭示之發明主題之一部分。亦應瞭解,亦可出現在以引用之方式併入之任何揭示內容中的本文明確採用之術語應符合與本文所揭示之特定概念一致程度最高的含義。
儘管已詳細地描述若干實例,但應理解,亦可對所揭示之實例加以修改。因此,前述描述應視為非限制性的。
10P:流體槽
10:流體槽
12:基板
14:聚合水凝膠
14':聚合水凝膠
16:陽離子部分
18:引子
20:通道
22:基板表面
24:流體
26:可帶正電荷之部分
Claims (23)
- 一種流體槽,其包含:基板;該基板上之陽離子聚合水凝膠,該陽離子聚合水凝膠包括陽離子部分,該陽離子部分i)整合於初始聚合水凝膠之單體單元中或ii)經由連接子附著於該初始聚合水凝膠之單體單元;及附著於該陽離子聚合水凝膠之擴增引子。
- 如請求項1之流體槽,其中:該單體單元為N-(5-溴乙醯胺基戊基)丙烯醯胺;該陽離子部分為鏻陽離子;及該鏻陽離子取代該N-(5-溴乙醯胺基戊基)丙烯醯胺之溴。
- 如請求項2之流體槽,其中該鏻陽離子係選自由以下組成之群:參(羥甲基)鏻陽離子、參(羥丙基)鏻陽離子、肆(羥甲基)鏻陽離子及參(2-羧乙基)鏻陽離子。
- 如請求項1之流體槽,其中:i)該單體單元包括末端疊氮基且該連接子包括炔基;或ii)該單體單元包括末端炔基且該連接子包括疊氮基。
- 如請求項4之流體槽,其中該陽離子部分包括質子化胺基、鋶離子、四級銨陽離子或其組合。
- 如請求項4之流體槽,其中:該單體單元為N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺;及該陽離子部分為N,N,N-三甲基乙醇銨陽離子。
- 如請求項4之流體槽,其中該連接子進一步包括可裂解雙硫鍵、光可裂解鍵、可裂解磷酸二酯鍵或其組合。
- 如請求項1之流體槽,其中:該單體單元為N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺;該連接子包括末端炔基及末端溴;及該陽離子部分為取代該末端溴之鏻陽離子。
- 如請求項1之流體槽,其中該基板包括藉由間隙區域分隔開之複數個凹陷部,且其中該陽離子聚合水凝膠定位於該等凹陷部中之每一者內。
- 如請求項9之流體槽,其中該基板進一步包含複數個腔室,且其中該等複數個凹陷部之子集位於該等複數個腔室中之每一者的周界內。
- 一種用於製備帶正電荷的流體槽表面之方法,其包含:將包括可帶正電荷之部分之流體引入至流體槽,該流體槽包括:初始聚合水凝膠,其具有選自由以下組成之群的表面部分:可帶負電荷之原子、疊氮基及炔基;及附著於該初始聚合水凝膠之擴增引子;及在該流體中在一定溫度下培育該初始聚合水凝膠且持續一定時間,由此形成包括陽離子部分之陽離子聚合水凝膠。
- 如請求項11之方法,其中該可帶正電荷之部分取代該初始聚合水凝膠之該可帶負電荷之原子。
- 如請求項12之方法,其中:該表面部分為該可帶負電荷之原子;該可帶負電荷之原子為溴;及該可帶正電荷之部分係選自由以下組成之群:參(羥甲基)膦、參(羥丙基)膦、肆(羥甲基)膦及參(2-羧乙基)膦。
- 如請求項12之方法,其中該流體進一步包括pH在6至12範圍內之緩衝液。
- 如請求項12之方法,其中該溫度在約18℃至約65℃範圍內且該時間在約1.5分鐘至約5分鐘範圍內。
- 如請求項11之方法,其中:該表面部分為該疊氮基或該炔基;及該可帶正電荷之部分經由連接子共價附著於該表面部分。
- 如請求項16之方法,其中:該表面部分為該疊氮基;該連接子為炔基;及該陽離子部分包括質子化胺基、鋶離子、四級銨陽離子或其組合。
- 如請求項16之方法,其中:該表面部分為該炔基;該連接子為疊氮基;及該陽離子部分包括質子化胺基、鋶離子、四級銨陽離子或其組合。
- 如請求項16之方法,其中化合物包括附著於該連接子之該可帶正電荷之部分,且其中該化合物為丙炔基溴化膽鹼。
- 如請求項16之方法,其中該流體包括水。
- 如請求項之16方法,其中該溫度在約18℃至約60℃範圍內且該時間在約30分鐘至約12小時範圍內。
- 如請求項16之方法,其進一步包含將催化劑、配位體及還原劑添加至具有該流體之該流體槽中。
- 一種套組,其包含:流體槽,該流體槽包括:基板;初始聚合水凝膠,其定位於該基板上且具有選自由以下組成之群的表面部 分:可帶負電荷之原子、疊氮基及炔基;及附著於該初始聚合水凝膠之擴增引子;以及包括可帶正電荷之部分之流體,該可帶正電荷之部分與該表面部分相互作用或反應以形成包括陽離子部分之陽離子聚合水凝膠。
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WO2024081563A1 (en) * | 2022-10-10 | 2024-04-18 | Illumina, Inc. | Photo-switchable chemistry for reversible hydrogels and reusable flow cells |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW200424519A (en) * | 2002-12-02 | 2004-11-16 | Epocal Inc | Heterogeneous membrane electrodes |
TWI271218B (en) * | 2002-10-31 | 2007-01-21 | Hewlett Packard Development Co | Microfluidic system for analyzing nucleic acids |
CN103443624A (zh) * | 2007-03-26 | 2013-12-11 | 纳米系统公司 | 形成受控单分子层的方法和装置 |
TW201441607A (zh) * | 2013-01-07 | 2014-11-01 | Anpac Bio Medical Science Lishui Co Ltd | 改良的疾病檢測儀 |
US20180045713A1 (en) * | 2013-03-14 | 2018-02-15 | Richard Antonius Jozef Janssen | Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of fibrotic diseases |
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Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2809729C (en) * | 2010-08-30 | 2019-01-29 | The Governors Of The University Of Alberta | Setting of multiple priming oligonucleotides for solid gel amplification in hydrogels |
US9012022B2 (en) * | 2012-06-08 | 2015-04-21 | Illumina, Inc. | Polymer coatings |
KR101420837B1 (ko) * | 2012-10-09 | 2014-07-17 | 재단법인대구경북과학기술원 | 수화겔 및 이의 제조 방법 |
WO2014059446A1 (en) * | 2012-10-12 | 2014-04-17 | Case Western Reserve University | Biodegradable hydrogel for polynucleotide delivery |
KR101492051B1 (ko) * | 2013-07-08 | 2015-02-16 | 아주대학교산학협력단 | 양이온성 물질과 음이온성 물질의 정전기적 인력에 의해 제조되는 하이드로겔 및 이의 제조방법 |
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Patent Citations (6)
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---|---|---|---|---|
TWI271218B (en) * | 2002-10-31 | 2007-01-21 | Hewlett Packard Development Co | Microfluidic system for analyzing nucleic acids |
TW200424519A (en) * | 2002-12-02 | 2004-11-16 | Epocal Inc | Heterogeneous membrane electrodes |
CN103443624A (zh) * | 2007-03-26 | 2013-12-11 | 纳米系统公司 | 形成受控单分子层的方法和装置 |
TW201441607A (zh) * | 2013-01-07 | 2014-11-01 | Anpac Bio Medical Science Lishui Co Ltd | 改良的疾病檢測儀 |
US20180045713A1 (en) * | 2013-03-14 | 2018-02-15 | Richard Antonius Jozef Janssen | Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of fibrotic diseases |
WO2019126040A1 (en) * | 2017-12-21 | 2019-06-27 | Illumina, Inc. | Flow cells with hydrogel coating |
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