KR101492051B1

KR101492051B1 - 양이온성 물질과 음이온성 물질의 정전기적 인력에 의해 제조되는 하이드로겔 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101492051B1
Application number: KR20130079743A
Authority: KR
Inventors: 김령미; 김다연; 김문석
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2013-07-08
Filing date: 2013-07-08
Publication date: 2015-02-16
Also published as: KR20150006223A

Abstract

본 발명은 양이온성 물질과 음이온성 물질을 정전기적 인력에 의해 혼합시켜 제조되는 하이드로겔 및 이의 제조방법과 이를 이용한 주사가능한 약물전달체에 관한 것이다. 본 발명의 하이드로겔은 체내에 세포 또는 약물 주사시 체내에서 세포 또는 약물이 겔 밖으로 빠져나가지 않고 머무는 시간을 연장시키며, 전달하고자 하는 세포와의 생체적합성을 향상시키는 효과를 나타냄으로써 세포 전달체 또는 약물전달체로서 기대되는 장점을 가진 물질이라 할 수 있다.

Description

양이온성 물질과 음이온성 물질의 정전기적 인력에 의해 제조되는 하이드로겔 및 이의 제조방법{hydrogel prepared by electrostatic attraction between cationic material and anionic material, and method for preparing the same}

본 발명은 양이온성 물질과 음이온성 물질의 정전기적 인력에 의해 제조되는 하이드로겔 및 이의 제조방법과, 이를 이용한 주사가능한 세포전달체 및 약물전달체에 관한 것이다.

최근 주입형 하이드로겔은 의료분야에서 많은 관심을 받고 있는데, 의료용 충진제로부터 생리활성 물질의 방출 시스템, 삼차원 구조를 이용한 기관/조직재생 등 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 주입형 하이드로겔은 외과적인 수술과정 없이 주사기 등을 사용하여 간단하게 생체 내에 주입될 수 있다는 장점을 가지고 있다. 일반적으로 주입형 하이드로겔의 경우 체외에서는 유체와 같은 특성을 가지고 있어 주사기를 사용하여 이식이 가능하여야 하고, 조작의 편리성을 위한 유동성을 지녀야 하며, 체내에 주입하고 난 뒤 화학적인 가교나 물리적인 가교를 통해 그 형태가 흐트러지지 않고, 한 곳에서 겔화(gelation) 되어야 한다. 즉, 이식 후에는 세포나 약물의 지속적인 방출을 위한 약물전달시스템 또는 세포의 성장을 유지할 수 있는 지지체로서의 역할을 할 수 있다.

현재 의학 분야에서는 세포 혹은 약물 전달 담체(drug or cell delivery carriers)와 인공피부, 인공연골, 인공골 등과 같은 인체조직 재생에 필요한 지지체(scaffolds for tissue engineering) 및 의약, 환경, 화장품 산업 등 전산업분야에서 용도가 매우 다양한 하이드로겔에 대한 연구가 상당히 진행되고 있다. 특히, 하이드로겔의 기계적 성질과 합성시간조절 및 하이드로겔에 고정된 세포 및 약물의 수율, 활성 및 효율이 높은 하이드로겔의 개발의 필요성이 요구되고 있다. 이러한 연구의 일 예로 불포화 생물분자를 이용한 하이드로겔(대한민국 특허출원번호 10-2007-0058822), 리포산이 결합된 하이드로겔(대한민국 특허출원번호 10-2009-0078659), 리피드가 코팅된 하이드로겔(대한민국 특허출원번호 10-2010-0100227) 등이 있다.

이런 배경 하에서, 본 발명자는 세포 및 약물의 수율, 활성 및 효율이 높은 고부가가치의 하이드로겔을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 양이온성 물질과 음이온성 물질의 정전기적 인력에 의하여 하이드로겔을 제조하였으며, 제조된 하이드로겔이 세포 및 약물을 효과적으로 담지할 수 있고, 세포 및 약물의 잔존수율과 활성이 높은 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 양이온성 물질과 음이온성 물질을 정전기적 인력에 의해 결합시켜 제조되는 하이드로겔 및 이의 제조방법을 제공함을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 하이드로겔을 이용한 주사가능한 세포전달체 및 약물전달체를 제공함을 목적으로 한다.

본 발명은 양이온성 물질과 음이온성 물질을 정전기적 인력에 의해 결합시켜 제조되는 하이드로겔 및 이의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 하이드로겔을 이용한 주사가능한 세포전달체 및 약물전달체를 제공한다.

본 발명의 하이드로겔은 체내에 세포 또는 약물 주사시 체내에서 세포 또는 약물이 겔 밖으로 빠져나가지 않고 머무는 시간을 연장시키며, 전달하고자 하는 세포와의 생체적합성을 향상시키는 효과를 나타냄으로써 세포전달체 및 약물 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 양이온성 물질과 음이온성 물질이 정전기적 인력으로 결합하여 겔을 형성하는 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 양이온성 물질과 음이온성 물질이 혼합 즉시 정전기적 인력으로 하이드로겔을 형성하는 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 용액상태의 양이온성 물질과 음이온성 물질을 나타낸 도이다.
도 4는 정전기적 인력에 의해 형성된 키토산/카복시메틸셀룰로오스 하이드로겔을 나타낸 도이다.
도 5는 정전기적 인력에 의해 형성된 수용성 키토산/카복시메틸셀룰로오스 하이드겔을 나타낸 도이다.
도 6은 정전기적 인력에 의해 형성된 혼합 키토산/카복시메틸셀룰로오스 하이드로겔을 나타낸 도이다.
도 7은 정전기적 인력에 의해 형성된 키토산/카복시메틸셀룰로오스-β-글리세로포스페이트 하이드로겔을 나타낸 도이다.
도 8은 정전기적 인력에 의해 형성된 키토산/히알루론산 하이드로겔을 나타낸 도이다.
도 9는 정전기적 인력에 의해 형성된 키토산/히알루론산-β-글리세로포스페이트 하이드로겔을 나타낸 도이다.
도 10은 키토산/히알루론산 하이드로겔의 형성 및 약물 방출 거동을 형광 이미지를 통해 나타낸 도이다.
도 11은 키토산/히알루론산-β-글리세로포스페이트 하이드로겔의 형성 및 약물 방출 거동을 형광 이미지를 통해 나타낸 도이다.
도 12는 키토산/히알루론산-β-글리세로포스페이트 하이드로겔의 세포와의 생체 적합성을 in vitro에서 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은

(a) 분말 형태의 양이온성 물질과 분말 형태의 음이온성 물질을 각각 용매에 첨가하고 교반시켜 용액 상태의 양이온성 물질과 용액 상태의 음이온성 물질을 각각 제조하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 제조된 용액 상태의 양이온성 물질 및 용액 상태의 음이온성 물질을 0~7℃에서 30~50시간 동안 방치하여 안정화 시키는 단계; 및

(c) 상기 (b)단계에서 안정화 된 용액 상태의 양이온성 물질과 용액 상태의 음이온성 물질을 혼합하여 정전기적 인력에 의해 가교결합시키는 단계;를 포함하는 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의하여 제조된 하이드로겔을 제공한다.

이하 본 발명에 대해서 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 하이드로겔은 양이온성 물질과 음이온성 물질이 정전기적 인력에 의하여 제조된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 하이드로겔의 제조방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

상기 (a)단계는 용액 상태의 양이온성 물질 및 용액 상태의 음이온성 물질을 제조하는 단계로서, 분말 형태의 양이온성 물질과 분말 형태의 음이온성 물질을 각각 용매에 첨가하여 교반시켜 용액 상태의 양이온성 물질 및 용액 상태의 음이온성 물질을 제조한다.

상기 양이온성 물질은 키토산(chitosan), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide, PAM), 및 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(poly(N-isopropylacrylamide, PNIPAAm)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 용매는 다양하게 사용될 수 있으나, 생체적합성을 고려하여 증류수가 바람직하며, 물에 잘 녹지 않는 키토산의 경우 아세트산과 같은 약산성 용매를 사용한다.

이렇게 제조된 양이온성 물질이 키토산인 경우 용액의 농도는 0.5~30 중량%로 한다.

상기 음이온성 물질은 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose, CMC), 히알루론산(hyaluronic acid, HA), β-글리세로포스페이트(β-glycerol phosphate, β-GP) 및 폴리아크릴산(polyacrylic acid, PAA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 용매는 다양하게 사용될 수 있으나, 생체적합성을 고려하여 증류수가 바람직하다.

이렇게 제조된 음이온성 물질의 농도는 상기 음이온성 물질이 카복시메틸셀룰로오스인 경우 5~15 중량%로 하며, 바람직하게는 8~10 중량%로 한다. 히알루론산인 경우 0.5~3 중량%로 하며, 바람직하게는 2 중량%로 한다. 또한, β-글리세로포스페이트인 경우 1~50 중량%로 하며, 바람직하게는 5 중량%로 한다.

상기 (a)단계에서 각각의 용액은 20~30℃, 바람직하게는 25℃에서 10~14시간, 바람직하게는 12시간 동안 교반된다.

상기 (b)단계는 (a)단계에서 제조된 용액 상태의 양이온성 물질과 용액 상태의 음이온성 물질을 안정화 시키는 단계로, 0~7℃하에서, 바람직하게는 4℃에서 30~50시간, 더 바람직하게는 48시간 동안 방치하여 안정화 시키는 것이다.

상기 (c)단계는 (b)단계에서 안정화 된 용액 상태의 양이온성 물질과 용액 상태의 음이온성 물질을 결합시키는 단계로, 1종 이상의 양이온성 물질로 구성된 용액과 1종 이상의 음이온성 물질로 구성된 용액을 99~1:1~99의 부피 비율로 혼합하고, 바람직하게는 동량의 부피로 혼합한다. 용액 상태의 양이온성 물질과 용액 상태의 음이온성 물질은 혼합 후 짧은 시간 안에 정전기적 인력에 의해 가교결합한다. 이의 메커니즘을 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1에서 나타낸 바와 같이, 양이온성 물질 및 음이온성 물질이 정전기적 인력으로 결합함을 알 수 있으며, 도 2에서 나타낸 바와 같이 용액 상태의 양이온성 물질과 용액 상태의 음이온성 물질은 혼합 후 짧은 시간 안에 겔을 형성함을 알 수 있다.

상기 방법으로 제조된 하이드로겔은 생물분자로 구성되어 안전성이 매우 높은 화합물로 구성되었기에, 상처치유 패치, 주름개선 등의 성형재료, 미용재료, 관절염 치료제, 신경, 피부, 골 및 연골재생 등과 같은 조직재생용 지지체 등의 다양한 용도로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 하이드로겔을 이용한 세포 또는 약물을 담지시킨 세포전달체 또는 약물전달체를 제공한다.

본 발명의 세포전달체 또는 약물전달체는 세포 또는 약물이 포함된 두 가지 용액을 양쪽 주사기를 사용하여 질병이나 상처부위에 전달함으로써, 세포 또는 약물이 포함된 하이드로겔 제조를 유도할 수 있다.

이의 일 예로, 키토산/히알루론산 하이드로겔에 세포 또는 약물이 담지되어 생체 내로 주사(injection)하는 방법으로 전달될 수 있다. 목적에 따라서는 세포 또는 약물은 예정된 부위에서 예정된 시간에 걸쳐서 일정하게 서방출되도록 할 수 있다. 이때 추가로 다른 생리활성 물질을 하이드로겔에 함께 담지시켜 사용할 수 있다.

이런 주사 가능한(injectable) 전달체는, 환자 질병부위로의 전달률이 낮거나, 투여된 고가(high price)의 약물이 체외로 지나치게 빨리 소실되는 경우 혹은 복용에 따른 부작용이 큰 약물을 사용하는 경우에 유용하다. 즉, 약물을 질병부위에 직접 전달함으로써, 약물이 환부에 천천히 방출되도록 속도를 조절함으로써 약물의 농도를 오랫동안 치료 영역에 유지시키거나, 주사 방법에 의하여 국소적으로 약물을 환부에 전달시킬 수 있는 장점과 함께, 화학적으로 결합된 약물의 종류와 농도, 겔의 물리적 강도, 화학적 특징 및 겔의 분해속도 등에 따라서 세포 또는 약물의 전달속도 등을 조절할 수 있다.

본 발명의 하이드로겔에 물리적으로 담지하여 생체 내로 전달할 수 있는 세포에는 줄기세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포, 연골세포, 골세포, 피부세포, 슈반세포 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 하이드로겔에 물리적으로 담지 혹은 화학적으로 결합하여 생체 내로 전달할 수 있는 약물에는 일반적으로 사용되는 항생제, 항암제, 소염진통제, 항바이러스제, 항균제, 단백질 및 펩타이드 등이 있다.

항생제로는 테트라사이클린, 미노사이클린, 독시사이클린, 오플록사신, 레보플록사신, 시프로플록사신, 클라리스로마이신, 에리쓰로마이신, 세파클러, 세포탁심, 이미페넴, 페니실린, 겐타마이신, 스트렙토마이신, 반코마이신 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항생제를 예시할 수 있다.

항암제로는 메토트렉세이트, 카보플라틴, 탁솔, 시스-플라틴, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 에트포사이드, 파클리탁셀, 캄토테신, 사이토신 아라비노스 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항암제를 예시할 수 있다.

소염제로는 인도메타신, 이부프로펜, 케토프로펜, 피록시캄, 플루비프로펜, 디클로페낙 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 소염제를 예시할 수 있다. 항바이러스제로는 아시콜로버, 로바빈 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항바이러스제를 예시할 수 있다. 항균제로는 케토코나졸, 이트라코나졸, 플루코나졸, 암포테리신-B, 그리세오 풀빈 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항균제를 예시할 수 있다.

단백질 및 펩타이드로는 질병을 치료 또는 예방할 목적으로 사용되는 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질, 다당류 및 수용체, 세포표면항원, 수용체 길항물질과 같은 다양한 생체활성 펩타이드, 이들의 유도체 및 유사체를 예시할 수 있다.

구체적으로, 단백질 및 펩타이드는 골 성장인자, 간 성장호르몬, 성장호르몬 방출 호르몬과 펩타이드, 인터페론류와 인터페론 수용체류, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 글루카콘-유사 펩타이드류(GLP-1등), G 단백질 연결 수용체(G-protein-coupled receptor), 인터루킨류와 인터루킨 수용체류(예컨대 IL-1 수용체), 효소류(예컨대 glucocerebrosidase, iduronate-2-sulfatase, 알파-갈락토시데이즈-A, 아갈시데이즈 알파(agalsidase alpha), 베타, 알파-L-이두로니데이즈(alpha-L-iduronidase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티네이즈(chitinase), 글루타메이트 디카르복실레이즈(glutamate decarboxylase), 이미글루세레이즈(imiglucerase), 리페이즈(lipase), 유리케이즈(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤레이즈(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티데이즈(neutralendopeptidase), 마이엘로퍼옥시데이즈(myeloperoxidase) 등), 인터루킨 및 사이토카인 결합 단백질류(예컨대 IL-18, TNF-결합 단백질 등), 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 종양괴사인자(tumor necrosis factor) 알파 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin), 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포이에틴류(angiopoietin), 헤모글로빈, 트롬빈(thrombin), 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린(thrombomodulin), 혈액인자, 혈액인자 a, 혈액인자 XIII, 플라즈미노겐 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키네이즈, 스트렙토키네이즈, 히루딘(hirudin), 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게네이즈 억제제, 수퍼옥사이드 디스 뮤테이즈, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴(angiostatin), 안지오텐신(angiotensin), 골 형성 성장인자(bonemorphogenic protein), 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌(elcatonin), 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor), 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류(예컨대 신경 성장인자, 모양체 신경영양인자(cilliary neurotrophic factor), 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1), 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide), 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor), 네트린(netrin), 중성구 억제인자(neurophil inhibitor factor), 신경영양인자, 뉴트린(neuturin) 등), 부갑상선호르몬, 릴랙신, 시크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신(autotaxin), 락토페린(lactoferrin), 미오스타틴(myostatin), 수용체류(예컨대 TNFR(P75), TNFR(P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, B 세포 활성인자 수용체 등), 수용체 길항물질(예컨대 IL1-Ra 등), 세포표면항원(예컨대 CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 등), 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편류(예컨대 scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd), 바이러스 유래 백신 항원 등을 예시할 수 있다.

두 가지 용액을 단순히 혼합함으로써 짧은 시간 안에 하이드로겔이 형성되므로, 각기 다른 용기에 용액을 담아 분사(spray)형태로 두 가지 용액을 혼합하여 상처부위 치료방법으로 응용이 가능하다. 제조된 하이드로겔은 생체적 합성이 우수하므로 성형용 필러(filler)로 적용 또한 가능하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 적용되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 키토산/카복시메틸셀룰로오스 하이드로겔의 제조

1-1. 키토산 용액 및 카복시메틸셀룰로오스 용액의 제조

키토산 용액은 키토산 분말을 0.1N의 아세트산에 첨가하여 상온에서 12시간 동안 교반시켜 2.5 중량%로 제조하였다.

카복시메틸셀룰로오스 용액은 카복시메틸셀룰로오스 분말을 3차 증류수를 이용하여 상온에서 12시간 교반시켜 8 중량%의 카복시메틸셀룰로오스 용액을 제조하였다. 이를 도 3에 나타내었다.

제조된 키토산 용액과 카복시메틸셀룰로오스 용액은 4℃에서 48시간 동안 안정화시켰다.

1-2. 정전기적 인력을 이용한 하이드로겔의 제조

상기 제조된 2.5 중량%의 키토산 용액과 8 중량%의 카복시메틸셀룰로오스 용액을 양쪽 주사기를 이용하여 혼합함으로써 정전기적 인력으로 인한 하이드로겔을 제조하였다. 제조된 하이드로겔을 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 양쪽 주사기를 통하여 혼합 즉시 상온에서 하이드로겔이 형성됨을 확인하였다.

실시예 2. 키토산(수용성)/카복시메틸셀룰로오스 하이드로겔의 제조

2-1. 수용성 키토산 용액 및 카복시메틸셀룰로오스 용액의 제조

수용성 키토산 용액은 실험 직전 키토산 분말을 상온에서 3차 증류수 첨가한 후 교반시켜 20 중량%로 제조하였다. 수용성 키토산 분말은 (주)키토라이프에서 생산되는 제품명 '키토올리고당에이치' 제품을 사용하였다.

제조된 카복시메틸셀룰로오스 용액은 4℃에서 48시간 동안 안정화시켰다.

2-2. 정전기적 인력을 이용한 하이드로겔의 제조

상기 제조된 20 중량%의 키토산 용액과 8 중량%의 카복시메틸셀룰로오스 용액을 양쪽 주사기를 이용하여 혼합함으로써 정전기적 인력으로 인한 하이드로겔을 제조하였다. 제조된 하이드로겔을 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 양쪽 주사기를 통하여 혼합 즉시 상온에서 하이드로겔이 형성됨을 확인하였다.

실시예 3. 키토산(혼합)/카복시메틸셀룰로오스 하이드로겔의 제조

3-1. 수용성 키토산 용액, 키토산 용액 및 카복시메틸셀룰로오스 용액의 제조

3-2. 키토산 혼합용액의 제조

상기 제조된 20 중량%의 키토산 용액과 2.5 중량%의 키토산 용액을 동량으로 혼합하여 키토산 혼합용액을 제조하였다.

3-3. 정전기적 인력을 이용한 하이드로겔의 제조

상기 제조된 키토산 혼합용액과 8 중량%의 카복시메틸셀룰로오스 용액을 양쪽 주사기를 이용하여 동량으로 혼합함으로써 정전기적 인력으로 인한 하이드로겔을 제조하였다. 제조된 하이드로겔을 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 양쪽 주사기를 통하여 혼합 즉시 상온에서 하이드로겔이 형성됨을 확인하였다.

실시예 4. 키토산/카복시메틸셀룰로오스-β-글리세로포스페이트 하이드로겔의 제조

4-1. 키토산 용액, 카복시메틸셀룰로오스 용액 및 β-글리세로포스페이트 용액의 제조

카복시메틸셀룰로오스 용액은 카복시메틸셀룰로오스 분말을 3차 증류수를 이용하여 상온에서 12시간 교반시켜 10 중량%의 카복시메틸셀룰로오스 용액을 제조하였다.

β-글리세로포스페이트 용액은 사용하기 직전 β-글리세로포스페이트 디소듐염 오수화물(β-glycerophosphate disodium salt pentahydrate (CHNaOP₅HO, β-GP))을 3차 증류수를 이용하여 상온에서 5 중량%로 제조하였다.

4-2. 카복시메틸셀룰로오스-β-글리세로포스페이트 혼합용액의 제조

상기 제조된 10 중량%의 카복시메틸셀룰로오스 용액과 5 중량%의 β-글리세로포스페이트 용액을 일정 비율(90:10)로 혼합하여 카복시메틸셀룰로오스-β-글리세로포스페이트 혼합용액을 제조하였다. 이를 도 3에 나타내었다.

4-3. 정전기적 인력을 이용한 하이드로겔의 제조

상기 제조된 카복시메틸셀룰로오스-β-글리세로포스페이트 혼합용액과 2.5 중량%의 키토산 용액을 양쪽 주사기를 이용하여 동량으로 혼합함으로써 정전기적 인력으로 인한 하이드로겔을 제조하였다. 제조된 하이드로겔을 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 양쪽 주사기를 통하여 혼합 즉시 상온에서 하이드로겔이 형성됨을 확인하였다.

실시예 5. 키토산/히알루론산 하이드로겔의 제조

5-1. 키토산 용액 및 히알루론산 용액의 제조

키토산 용액은 키토산 분말을 0.1N의 아세트산에 첨가하여 상온에서 12 시간 동안 교반시켜 2.5 중량%로 제조하였다.

히알루론산 용액은 히알루론산 분말을 3차 증류수를 이용하여 상온에서 교반시켜 2 중량%의 히알루론산 용액을 제조하였다. 이를 도 3에 나타내었다.

제조된 키토산 용액과 히알루론산 용액은 4℃에서 48시간 동안 안정화시켰다.

5-2. 정전기적 인력을 이용한 하이드로겔의 제조

상기 제조된 2.5 중량%의 키토산 용액과 2 중량%의 히알루론산 용액을 양쪽 주사기를 이용하여 동량으로 혼합함으로써 정전기적 인력으로 인한 하이드로겔을 제조하였다. 제조된 하이드로겔을 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 양쪽 주사기를 통하여 혼합 즉시 상온에서 하이드로겔이 형성됨을 확인하였다.

실시예 6. 키토산/히알루론산-β-글리세로포스페이트 하이드로겔의 제조

6-1. 키토산 용액, 히알루론산 용액 및 β-글리세로포스페이트 용액의 제조

히알루론산 용액은 히알루론산 분말을 3차 증류수를 이용하여 상온에서 교반시켜 2 중량%의 히알루론산 용액을 제조하였다.

6-2. 히알루론산-β-글리세로포스페이트 혼합용액의 제조

상기 제조된 2 중량%의 히알루론산 용액과 5 중량%의 β-글리세로포스페이트 용액을 일정 비율(90:10)로 혼합하여 히알루론산-β-글리세로포스페이트 혼합용액을 제조하였다.

6-3. 정전기적 인력을 이용한 하이드로겔의 형성

상기 제조된 히알루론산-β-글리세로포스페이트 혼합용액과 2.5 중량%의 키토산 용액을 양쪽 주사기를 이용하여 동량으로 혼합함으로써 정전기적 인력으로 인한 하이드로겔을 제조하였다. 제조된 하이드로겔을 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 양쪽 주사기를 통하여 혼합 즉시 상온에서 하이드로겔이 형성됨을 확인하였다.

실험예 1. 하이드로겔의 생체내 주입 후 형성 확인

1-1. 절개하여 육안으로 확인

상기 실시예 1~6에서 제조한 여러 가지 천연소재 용액을 멸균한 후 쥐의 피하에 주입하여 생체내에서 하이드로겔을 형성시켰다. 피하 주입 즉시 체내에서 하이드로겔이 형성됨을 확인하였으며, 1주 경과 후 용액을 주입한 쥐의 주사 부위를 절개하여 체내에서 형성된 하이드로겔의 모습을 확인하였다.

실험예 2. 하이드로겔의 생체 내 약물 방출 거동 관찰

2-1. 키토산/히알루론산 하이드로겔의 in vivo 형광 이미지를 통한 확인

키토산/히알루론산 하이드로겔의 생체 내에서의 약물 방출 거동을 관찰하기 위하여, 키토산 용액과 히알루론산 용액에 각각 수용성 단백질이며 형광물질인 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 결합된 소혈청알부민을 함유시켜 용액을 제조하였다. 이를 양쪽 주사기를 이용하여 쥐의 피하에 주입하였다. 용액을 주입한 쥐를 형광 이미지를 통하여 관찰하였다. 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 주입 즉시 생체 내에서 정전기적 인력으로 인해 단단한 겔이 형성됨을 확인하였으며 하이드로겔 내로부터 소혈청알부민이 8주까지 방출되는 것을 확인하였다.

2-2. 키토산/히알루론산-β-글리세로포스페이트 하이드로겔의 in vivo 형광 이미지를 통한 확인

키토산/히알루론산-β-글리세로포스페이트 하이드로겔의 생체 내에서의 약물 방출 거동을 관찰하기 위하여, 키토산 용액과 히알루론산-β-글리세로포스페이트 혼합 용액에 각각 수용성 단백질이며 형광물질인 FITC가 결합된 소혈청알부민을 함유시켜 용액을 제조하였다. 이를 양쪽 주사기를 이용하여 쥐의 피하에 주입하였다. 용액을 주입한 쥐를 형광 이미지를 통하여 관찰하였다. 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 하이드로겔 주입 즉시 생체 내에서 정전기적 인력으로 하여 단단한 겔이 형성됨을 확인하였으며 하이드로겔 내로부터 소혈청알부민이 6주까지 방출되는 것을 확인하였다.

실험예 3. 하이드로겔의 생체적합성 확인

3-1. 키토산/히알루론산-β-글리세로포스페이트 하이드로겔의 in vitro에서의 생체적합성 확인

키토산/히알루론산-β-글리세로포스페이트 하이드로겔이 생체적합성을 확인하기 위하여 키토산용액과 히알루론산-β-글리세로포스페이트 혼합용액에 각각 PKH-67을 이용하여 레이블링 한 근육유래줄기세포(muscle-derived stem cells, MDSCs)를 혼합하였다. 양쪽 주사기를 이용하여 두 가지 용액을 혼합하여 하이드로겔을 형성하고 24시간 경과 후 관찰하였다. 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 하이드로겔 내부에 균일하게 분포된 근육유래줄기세포가 잘 생존하고 있는 것을 확인하였다.

Claims

(a) 분말 형태로 된 키토산과 분말 형태의 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose, CMC), 히알루론산(hyaluronic acid, HA) 및 β-글리세로포스페이트(β-glycerol phosphate, β-GP)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 음이온성 물질을 각각 아세트산 및 증류수에 첨가하고 교반시켜 용액 상태의 키토산과 용액 상태의 음이온성 물질을 각각 제조하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 제조된 용액 상태의 키토산 및 용액 상태의 음이온성 물질을 0~7℃에서 30~50시간 동안 방치하여 안정화 시키는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계에서 안정화 된 용액 상태의 키토산과 용액 상태의 음이온성 물질을 혼합하여 정전기적 인력에 의해 가교결합시키는 단계;
를 포함하는 하이드로겔의 제조방법.
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제1항에 있어서, 상기 (a)단계의 용액 상태의 키토산의 농도는 0.5~30 중량%인 것을 특징으로 하는 하이드로겔의 제조방법.
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제1항에 있어서, 상기 음이온성 물질이 카복시메틸셀룰로오스인 경우 상기 (a)단계의 용액 상태의 음이온성 물질의 농도는 5~15 중량%인 것을 특징으로 하는 하이드로겔의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 음이온성 물질이 히알루론산인 경우 상기 (a)단계의 용액 상태의 음이온성 물질의 농도는 0.5~3 중량%인 것을 특징으로 하는 하이드로겔의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 음이온성 물질이 β-글리세로포스페이트인 경우 상기 (a)단계의 용액 상태의 음이온성 물질의 농도는 1~50 중량%인 것을 특징으로 하는 하이드로겔의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (c)단계의 정전기적 인력에 의한 가교결합은 용액 상태의 키토산과 용액 상태의 음이온성 물질이 99~1:1~99의 부피 비율로 혼합될 때 이루어지는 것을 특징으로 하는 하이드로겔의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (c)단계의 정전기적 인력에 의한 가교결합은 4~40℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔의 제조방법.
제1항의 제조방법에 의해 제조되는, 키토산과 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose, CMC), 히알루론산(hyaluronic acid, HA) 및 β-글리세로포스페이트(β-glycerol phosphate, β-GP)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 음이온성 물질이 정전기적 인력에 의해 가교결합된 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
제10항에 따른 하이드로겔을 포함하는 세포전달체.
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제10항에 따른 하이드로겔을 포함하는 약물전달체.
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