KR101277286B1 - 트리스(2-카복시에틸)포스핀이 결합된 고분자 화합물 - Google Patents

트리스(2-카복시에틸)포스핀이 결합된 고분자 화합물 Download PDF

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Abstract

TCEP가 결합된 고분자 화합물 및 이것과 아크릴 작용기를 가지는 고분자 화합물이 마이클 형 첨가반응에 의하여 서로 결합하여 가교화된 가교화 고분자 화합물이 개시된다. 본 발명에 따른 가교화 고분자 화합물은 하이드로젤로 제조되어 약물전달체, 조직공학 지지체, 또는 세포치료제로 사용된다.

Description

트리스(2-카복시에틸)포스핀이 결합된 고분자 화합물 {Polymer compound connected with tris(2-carboxyethyl)phosphine}
본 발명은 트리스(2-카복시에틸)포스핀[tris(2-carboxyethyl)phosphine: 이하 TCEP]이 결합된 고분자 화합물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 측쇄 또는 말단에 TCEP가 결합된 고분자 화합물 및 이것과 아크릴 작용기를 가지는 고분자 화합물 사이에 마이클 형 첨가반응에 의하여 서로 결합하여 가교화된 가교화 고분자 화합물에 관한 것이고, 또한 그것의 용도에 관한 것이다.
TCEP는 무색, 무취의 수용성으로 비휘발성이며, 단백질에 존재하는 작용기에 대하여 반응성이 없고, 산화저항성이 우수한 환원제로서, 단백질에 존재하는 이황화 결합을 보통 5분 이내에 환원시키는 특성을 가진다. DTT(DiThioThreitol) 환원제와 비교하여 더욱 안정하며 효과적이고 산성에서 이황화 결합을 환원시킬 수 있는 특성으로 인하여 생화학 및 분자생물학에서 환원제로 활용된다. 이러한 TCEP는 지금까지 환원제로 사용되었을 뿐이고 고분자의 작용기에 도입되어 가교화 고분자를 형성하는데 사용된 적은 없었으며, 고분자-TCEP 화합물을 하이드로젤, 필름 등으로 제조하는 데에 사용한 적이 없다.
본 발명의 목적은 TCEP가 결합된 고분자 화합물 및 이것과 아크릴 작용기를 가지는 고분자 화합물이 마이클 형 첨가반응에 의하여 서로 결합하여 가교화된 가교화 고분자 화합물을 제공하는 것이다. 이러한 가교화 고분자 화합물은 하이드로젤이나 지지체의 형태로 제조되는데, 세포, 성장인자, 호르몬, 및 의약적 치료기능을 가지는 약물과 같은 생체활성물질을 생체 내의 필요한 곳에 전달하는 역할을 하는 의료용 소재, 약물전달체, 조직공학 지지체, 또는 세포치료제로 사용하고자 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TCEP가 결합된 고분자 화합물을 제공한다.
상기에서, 본 발명의 한 양태에 따르면, 상기 고분자 화합물은, 측쇄에 아민 작용기를 가지는 생체적합성 고분자 화합물의 상기 아민 작용기와 TCEP의 카복실 작용기 간의 화학반응에 의하여 결합이 형성되거나, 측쇄에 카복실 작용기를 가지는 생체적합성 고분자 화합물의 상기 카복실 작용기와 아민 작용기를 가진 링커의 상기 아민 작용기 사이의 화학반응에 의하여 결합을 형성하고, TCEP의 카복실 작용기와 아민 작용기를 가진 링커의 다른 상기 아민 작용기 사이의 화학반응에 의하여 결합을 형성하여, TCEP가 링커를 통하여 결합하는 것이다.
상기 생체적합성 고분자 화합물은 콘드로이틴 설페이트, 카복시메틸셀룰로오스, 히알루론산, 헤파린, 키토산, 덱스트란, 더마탄 설페이트 및 알지네이트로 이루어진 다당류 그룹; 펩타이드, 콜라겐, 아텔로 콜라겐, 젤라틴, 단백질, 호르몬 및 성장인자로 이루어진 단백질류 그룹; 및 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리락티드, 폴리글리콜리드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 링커는 최소한 하나 이상의 아민기를 가지는 화합물인 것이 바람직하고, 특히 상기 링커는 디카복실산 디하이드라자이드인 것이 바람직하며, 특정적으로 상기 링커는 아디프산 디하이드라자이드 또는 헥사메틸렌디아민일 수 있다.
삭제
상기에서, 상기 고분자 화합물에 결합되는 상기 TCEP는 상기 고분자 화합물의 반복단위 당 0.01 ~ 1 개로 결합되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기에서 언급한 상기 고분자 화합물과 아크릴 작용기를 가지는 고분자 화합물이 마이클 형 첨가반응에 의하여 서로 결합하여 가교화된 가교화 고분자 화합물을 제공하는데, 상기 아크릴 작용기를 가지는 고분자 화합물은, 측쇄에 아민 작용기를 가지는 생체적합성 고분자 화합물의 상기 아민 작용기와 아크릴 작용기를 가진 산의 카복실 작용기 간의 화학반응에 의하여 형성되거나, 측쇄에 카복실 작용기를 가지는 생체적합성 고분자 화합물의 상기 카복실 작용기와 아민 작용기를 가진 링커의 상기 아민 작용기 사이의 화학반응에 의하여 결합하고, 아크릴 작용기를 가진 산의 카복실 작용기와 아민 작용기를 가진 링커의 다른 상기 아민 작용기 사이의 화학반응에 의하여 결합함으로써 형성되는 것이다.
상기 가교화 고분자 화합물은 하이드로젤, 필름, 입자 또는 튜브 형태로 형성될 수 있다.
상기 아크릴 작용기는 아크릴레이트 또는 메타아크릴레이트인 것이 바람직하다.
상기 가교화 고분자 화합물은 약물전달체, 조직공학 지지체, 또는 세포전달제로 사용되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기에서 언급한 상기 가교화 고분자 화합물로 된 하이드로젤이고, 생체활성물질을 포함하는 하이드로젤을 제공한다.
상기 생체활성물질은 세포, 약물, 성장인자, 호르몬, 핵산, 단백질, RNA, 세포외기질 물질 및 의약적 치료기능을 가지는 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 고분자 화합물 및 가교화 고분자 화합물은 TCEP를 고분자의 측쇄에 도입하는 것에 의하여, 그리고 그것을 측쇄에 아크릴 작용기를 가지는 고분자 화합물과 반응시킴에 의하여 간편하게 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 가교화 고분자 화합물은 하이드로젤, 지지체, 필름으로 제조되어 조직공학용 인공장기 재생을 위한 소재, 주름개선제, 신경, 골 및 연골재생제 및 치료제, 화상치료 혹은 미용을 위한 드레싱제, 혹은 관절염 치료제, 관절염 및 암 치료용의 약물전달체로 사용하면, 약물과 세포의 효율적 전달과 하이드로젤의 생분해에 따른 조직재생을 촉진할 수 있을 것으로 예측된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트, 콘드로이틴 설페이트-TCEP의 합성방법이다.
도 2는 도 1의 방법에 따라 제조된 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트와 콘드로이틴 설페이트-TCEP의 반응에 의하여 생성된 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤(A) 그리고 그것의 주사형(B), 스캐폴드형(D), 필름형(C), 입자형(F) 및 튜브형(E) 지지체의 디지털 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트와 콘드로이틴 설페이트-TCEP의 FTIR 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤, 젤라틴이 포함된 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤 및 히알루론산 하이드로젤의 표면에서 7일간 세포 배양 평가를 진행한 결과이다(A, B: 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤, C: 젤라틴이 포함된 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤, D: 히알루론산 하이드로젤).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤에서 로다민의 방출 평가를 진행한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 키토산-TCEP의 FTIR 분석 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 젤라틴-TCEP의 FTIR 분석 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 아텔로 콜라겐-TCEP의 FTIR 분석 결과이다.
본 발명은 우선적으로, TCEP가 결합된 고분자 화합물에 관한 것이다. 이러한 고분자 화합물은 그 자체로 독자적인 용도를 가진다기보다는 아래에서 설명하는 바와 같은 가교화된 고분자 화합물을 제조하기 위한 원료로 사용되는 것이다.
본 발명에서 사용되는 고분자 화합물은 생체적합성 고분자 화합물로서, 그것에 TCEP가 결합되는 형태는 특별히 한정되지는 않지만, 특히 바람직한 한 양태는 측쇄에 카복실 작용기 혹은 아민 작용기를 가지는 생체적합성 고분자 화합물을 사용하는 것이다.
그러한 생체적합성 고분자 화합물의 예로는 콘드로이틴 설페이트, 카복시메틸셀룰로오스, 히알루론산, 덱스트란, 키토산, 헤파린, 더마탄 설페이트 및 알지네이트와 같은 다당류 화합물, 펩타이드, 콜라겐, RNA, DNA, 단백질, 호르몬 및 성장인자와 같은 핵산과 단백질류, 및 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리락티드, 폴리글리콜리드와 같은 합성 고분자 화합물이 포함될 수 있다.
측쇄에 카복실기를 가지는 이러한 생체적합성 고분자 화합물의 측쇄에 TCEP를 도입하기 위해서는 링커가 필요하다. 그러한 링커는 고분자 화합물의 카복실기와의 화학반응에 의하여 결합을 형성하고, 또한 TCEP의 카복실기와의 화학반응에 의하여 결합을 형성할 수 있는 것이어야 한다. 그러한 링커의 대표적인 예는 최소한 하나 이상의 아민기를 가지는 화합물이다. 이러한 링커에 속하는 대표적인 화합물로는 디카복실산 디하이드라자이드가 있으며, 그 예로는 아디프산 디하이드라자이드를 들 수 있다.
도 1에는 콘드로이틴 설페이트의 측쇄에 있는 카복실기가 아디프산 디하이드라자이드의 한 1차 아민기와 결합한 다음에 아디프산 디하이드라자이드의 나머지 1차 아민기가 TCEP의 한 카복실기와 결합함으로써 콘드로이틴 설페이트-아디프산 디하이드라자이드-TCEP(CS-ADH-TCEP)가 형성되는 반응의 예가 도시되어 있다. 이때, 콘드로이틴 설페이트의 카복실기와 아디프산 디하이드라자이드의 1차 아민기 간의 반응을 유도하기 위하여, 그리고 아디프산 디하이드라자이드의 나머지 1차 아민기와 TCEP의 한 카복실기 간의 반응을 유도하기 위하여 EDC[1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide]가 사용된다.
본 발명에서 사용되는 고분자 화합물은 생체적합성 고분자 화합물로서, 다른 한 양태는 측쇄에 아민기를 가지는 생체적합성 고분자 화합물을 사용하는 것이다. 고분자 화합물의 측쇄에 아민기가 있는 경우에 그 아민기는 TCEP의 카복실기와 직접 결합할 수 있으므로 링커가 필요 없다. 물론 측쇄의 유연성을 높이기 위하여 링커를 통하여 TCEP와 연결시킬 수도 있을 것이다. 이러한 생체적합성 고분자 화합물의 예로는 키토산을 들 수 있다.
이와 같이 형성된 TCEP가 측쇄에 결합된 고분자 화합물은 측쇄에 아크릴 작용기를 가지는 고분자 화합물과 가교결합하여 가교화 고분자 화합물을 형성함으로써 하이드로젤을 형성하기 위한 것이다. 따라서, TCEP가 측쇄에 결합된 고분자 화합물에서 측쇄에 결합되는 TCEP의 개수는 그러한 가교화 반응이 충분히 일어나서 실질적인 가교화 고분자 화합물이 형성될 수 있을 정도이어야 한다. 이를 위하여 고분자 화합물의 측쇄에 결합되는 TCEP는 고분자 화합물의 반복단위 당 0.01 ~ 1 개의 범위로 결합되는 것이 바람직하다. 측쇄에 결합되는 TCEP의 개수가 너무 적은 경우에는 하이드로젤이 형성될 수 있을 정도의 가교화를 달성하지 못한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 고분자 화합물은 1 내지 8,000 kDa의 크기, 더욱 바람직하게는 3 kDa 내지 700 kDa의 크기를 가지는 것이 좋다.
본 발명은 또한 TCEP가 측쇄에 결합된 고분자 화합물과 측쇄에 아크릴 작용기를 가지는 고분자 화합물이 마이클 형 첨가반응에 의하여 서로 결합하여 가교화된 가교화 고분자 화합물을 제공하는 것이다. 이때, 아크릴 작용기와 TCEP 작용기의 비율은 용도에 따라 다양하게 조절가능하다. 상기 아크릴 작용기와 TCEP 작용기의 몰 비는 10:1 내지 1:10, 바람직하게는 3:1 내지 1:2이고, 더욱 바람직하게는 1:1이다. 상기 아크릴 작용기는 아크릴레이트 또는 메타아크릴레이트인 것이 바람직하다.
아크릴 작용기를 가지는 고분자 화합물은 위에서 언급한 생체적합성 고분자일 수 있다. 이때, 위에서 설명한 바와 마찬가지로 고분자 화합물이 카복실기를 가지는 경우에는 그것이 아크릴레이트와 연결되기 위해 링커가 필요하다. 링커는 위에서 설명한 것을 사용할 수 있다. 도 1에는 아디프산 디하이드라자이드를 링커로 사용한 예가 도시되어 있다. 또한, 콘드로이틴 설페이트의 카복실기와 아디프산 디하이드라자이드의 1차 아민기 간의 반응을 유도하기 위하여, 그리고 아디프산 디하이드라자이드의 나머지 1차 아민기와 아크릴산 간의 반응을 유도하기 위하여 EDC[1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide]가 사용된다.
본 발명의 가교화 고분자 화합물은 TCEP가 측쇄에 결합된 고분자 화합물의 용액, 예를 들어 PBS 용액과 아크릴 작용기를 가지는 고분자 화합물의 용액, 예를 들어 PBS 용액을 단순히 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 가교화 고분자 화합물은 기본적으로 하이드로젤 형태로 제조된다. 하이드로젤은 충분한 양의 수분을 보유하고 있는 친수성 고분자의 3차원 구조를 의미하는 것이다. 따라서, 이러한 3차원 가교 구조를 가지는 고분자 화합물은 수분이 있는 조건에서는 그 수분을 흡수하여 팽창한 하이드로젤 형태가 된다.
이러한 하이드로젤은 생체활성물질을 포함할 수 있다. 이러한 생체활성물질은 질병의 치료, 치유, 예방 또는 진단 등에 사용되는 물질을 의미하고, 그 예로는 세포, 성장인자 및 호르몬과 같은 단백질 또는 펩타이드, 핵산, 세포외기질 물질 및 의약적 치료기능을 가지는 약물 등을 들 수 있다. 하이드로젤이 생체활성물질을 포함하도록 제조하기 위하여, 생체활성물질은 어떤 한 용액에 포함되도록 용액을 제조하고, 다른 한 용액과 혼합하여 하이드로젤을 합성하도록 진행할 수 있다. 이 경우 생체활성물질은 형성되는 가교화 고분자 하이드로젤에 담지된 형태가 된다. 또한, 생체활성물질이 포함된 두 가지 용액을 주사기에 혼합시켜, 주사기를 사용하여 질병, 상처부위에 전달함으로써, 시간에 따라 생체활성물질이 포함된 하이드로젤 제조를 유도할 수 있다. 그러므로 본 발명의 하이드로젤은 생체활성물질 전달체, 세포전달체 또는 약물전달체로 사용할 수 있다. 또한, 조직공학 지지체 또는 세포치료제로 사용될 수 있다.
본 발명의 하이드로젤에 담지되는 생체활성물질로서 약물의 예는 항생제, 항암제, 소염진통제, 항바이러스제, 항균제 등을 들 수 있다. 항생제로는 테트라사이클린, 미노사이클린, 독시사이클린, 오플록사신, 레보플록사신, 시프로플록사신, 클라리스로마이신, 에리쓰로마이신, 세파클러, 세포탁심, 이미페넴, 페니실린, 겐타마이신, 스트렙토마이신, 반코마이신 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항생제를 예시할 수 있다. 항암제로는 메토트렉세이트, 카보플라틴, 탁솔, 시스-플라틴, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 에트포사이드, 파클리탁셀, 캄토테신, 사이토신 아라비노스 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항암제를 예시할 수 있다. 소염제로는 인도메타신, 이부프로펜, 케토프로펜, 피록시캄, 플루비프로펜, 디클로페낙 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 소염제를 예시할 수 있다. 항바이러스제로는 아시콜로버, 로바빈 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항바이러스제를 예시할 수 있다. 항균제로는 케토코나졸, 이트라코나졸, 플루코나졸, 암포테리신-B, 그리세오 풀빈 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항균제를 예시할 수 있다.
본 발명의 하이드로젤에 담지하여 생체 내로 전달할 수 있는 단백질, 펩타이드에는 질병을 치료 또는 예방할 목적으로 사용되는 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질, 다당류 및 수용체, 세포표면항원, 수용체 길항물질과 같은 다양한 생리활성 펩타이드, 이들의 유도체 및 유사체를 예시할 수 있다. 구체적으로, 골 성장인자, 간 성장호르몬, 성장호르몬 방출 호르몬과 펩타이드, 인터페론류와 인터페론 수용체류(예: 인터페론-알파, -베타 및 -감마, 수용성 타입 I 인터페론 수용체 등), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 글루카콘-유사 펩타이드류(GLP-1 등), 지프로테인 관련된 수용체(G-protein-coupled receptor), 인터루킨류(예: 인터루킨-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9 등)와 인터루킨 수용체류(예: IL-1 수용체, IL-4 수용체 등), 효소류(예: 글루코세레브로시데이즈(glucocerebrosidase), 이두로네이트-2-설파테이즈(iduronate-2-sulfatase), 알파-갈락토시데이즈-A, 아갈시데이즈-알파(agalsidase alpha), -베타, 알파-L-이두로니데이즈(alpha-L-iduronidase), 키티네이즈(chitinase), 뷰티릴콜린에스터데이즈(butyrylcholinesterase), 리페이즈(lipase), 글루타메이트 디카르복실레이즈(glutamate decarboxylase), 이미글루세레이즈(imiglucerase), 유리케이즈(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤레이즈(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티데이즈(neutralendopeptidase), 마이엘로퍼옥시데이즈(myeloperoxidase) 등), 인터루킨 및 사이토카인 결합 단백질류(예: IL-18bp, TNF-결합 단백질 등), 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 종양괴사인자(TNF, Tumor Necrosis Factor) 알파 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin), 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포이에틴류(angiopoietin), 헤모글로빈, 트롬빈(thrombin), 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린(thrombomodulin), 혈액인자, 혈액인자 a, 혈액인자 XIII, 플라즈미노겐 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키네이즈, 스트렙토키네이즈, 히루딘(hirudin), 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게네이즈 억제제, 수퍼옥사이드 디스 뮤테이즈, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴(angiostatin), 안지오텐신(angiotensin), 골 형성 성장인자(bonemorphogenic protein), 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌(elcatonin), 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor), 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류(예: 신경 성장인자, 모양체 신경영양인자(cilliary neurotrophic factor), 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1), 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide), 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor), 네트린(netrin), 중성구 억제인자(neurophil inhibitor factor), 신경영양인자, 뉴트린(neuturin) 등), 부갑상선호르몬, 릴랙신, 시크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신(autotaxin), 락토페린(lactoferrin), 미오스타틴(myostatin), 수용체류(예: TNFR(P75), TNFR(P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, B 세포 활성인자 수용체 등), 수용체 길항물질(예: IL1-Ra 등), 세포표면항원(예: CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69등), 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편류(예: scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd), 바이러스 유래 백신 항원 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 하이드로젤에 물리적으로 담지 혹은 화학적으로 결합하여 생체 내로 전달할 수 있는 핵산으로는 DNA, RNA, PNA, 올리고뉴클레오티드 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 하이드로젤에 물리적으로 담지 혹은 화학적으로 결합하여 생체 내로 전달할 수 있는 세포외기질 물질에는 콜라겐, 피브로넥틴, 젤라틴, 라미닌, 비트로넥틴 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 하이드로젤에 물리적으로 담지하여 생체 내로 전달할 수 있는 세포에는 줄기세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포, 연골세포, 골세포, 피부세포, 슈반세포 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 가교화 고분자 화합물은 하이드로젤 형태 이외에도 그것을 건조, 특히 동결건조하여 필름, 입자 또는 튜브 형태로 형성될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 구체적으로 설명한다.
실시예 1: TCEP를 이용한 콘드로이틴 설페이트 수화젤의 제조
1 단계 과정 : 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트 제조
0.4 g의 콘드로이틴 설페이트를 80 ml 증류수에 용해하여 콘드로이틴 설페이트 수용액(0.5 %; w/v)을 제조하고, 제조된 콘드로이틴 설페이트 수용액에 가교결합제 EDC 0.3 ml 및 아디프산 디하이드라자이드(adipic dihydrazide, ADH) 0.3 g 을 첨가하여 콘드로이틴 설페이트의 고분자 측쇄에 하이드라자이드 작용기를 유도하였다. 콘드로이틴 설페이트-ADH에 EDC를 다시 0.6 ml를 첨가하고, 아크릴산(acrylic acid) 0.2 ml를 추가로 반응을 유도하여 콘드로이틴 설페이트-ADH-아크릴레이트를 합성하고, 반응 잔여물 제거, 침전 유도 및 동결건조 하여 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트 분말을 제조하였다.
2 단계 과정 : 콘드로이틴 설페이트-TCEP 제조
1단계와 동일한 방법으로 0.4 g 콘드로이틴 설페이트의 카복실 작용기에 0.3 ml EDC 및 0.3 g ADH를 첨가하여 콘드로이틴 설페이트의 고분자 측쇄에 하이드라자이드 작용기를 유도한 다음, 다시 0.6 ml EDC 및 1.0 g TCEP를 첨가하여 반응을 유도하고, 동결건조시켜 콘드로이틴 설페이트-TCEP 분말을 제조하였다(도 1).
3 단계 과정 : 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤 제조
1 단계에서 제조된 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트와 2단계에서 제조된 콘드로이틴 설페이트-TCEP를 각각 PBS 용액에 용해하여 5 % 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트 용액과 5 % 콘드로이틴 설페이트-TCEP 용액을 제조하였다. 두 용액을 1:1 비율로 혼합하여 젤화(gelation)를 진행하여 1분 이내에 젤이 되는 것(콘드로이틴 설페이트 하이드로젤)을 틸팅 방법(tilting method)으로 확인하였다(도 2의 A).
실시예 1-1
분석 1
실시예 1에서 제조한 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트 샘플과 콘드로이틴 설페이트-TCEP의 FTIR 스펙트럼을 확인한 결과, 콘드로이틴 설페이트와 비교하여 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트의 3200, 814 cm- 1 에서 CH=CH2, C=C에 의한 피크, 콘드로이틴 설페이트-TCEP의 860, 910 cm-1에서 P-C에 의한 피크를 관찰함으로써, 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트 및 콘드로이틴 설페이트-TCEP 합성을 확인하였다(도 3).
실시예 1-2
분석 2
실시예 1에서 제조한 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤 표면에 104 cells/cm2의 섬유아세포(fibroblast)를 접종하고 7일간 in vitro 배양하여 live & dead 평가한 결과, 모든 세포들이 생존(청색)되었음을 확인하였다(도 4의 A, B).
실시예 2: 콘드로이틴 설페이트-TECP를 이용한 다양한 형태의 샘플 제조
실시예 1의 1단계 및 2단계 과정에서 얻어진 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트 용액과 콘드로이틴 설페이트-TCEP 용액을 주사기에 넣어 혼합하여 주사한 젤 샘플을 얻어 주사형 젤로 제조 가능함을 확인하였다(도 1의 B). 또한, 혼합용액을 필름, 튜브 등의 일정한 형태를 지닌 몰드에 넣어 젤화를 유도하여 지지체, 필름 형태 및 튜브 형태의 지지체로 제조하였다(도 2의 C, D, E).
실시예 3
콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트, 콘드로이틴 설페이트-TCEP 혼합용액 200 ㎕를 계면활성제 Triton X100이 포함된 100 mL 분산매(DCM)에 넣고, 초음파 분산기로 3분 동안 초음파를 제공한 다음, 계면활성제 및 분산매를 제거하고, 하루 동안 동결건조를 진행하여 입자형태의 젤을 제조하였다(도 2의 F).
실시예 4: 세포가 포함된 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤의 제조
실시예 1의 1단계 및 2단계 과정에서 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트 분말 및 콘드로이틴 설페이트-TCEP 분말을 각각 버퍼에 용해하여 섬유아세포(fibroblast)를 105 cells/cm3로 포함시켜 제조된 5% 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트 용액(100 uL)과 5% 콘드로이틴 설페이트-TCEP 용액(100 uL)을 혼합하여 섬유아세포가 포함된 콘드로이틴 설페이트 수화젤을 제조하였다.
실시예 4-1
분석 3
실시예 4의 섬유아세포가 포함된 콘드로이틴 설페이트 수화젤을 7일간 in vitro 배양하여 live & dead 방법으로 염색하고 형광현미경으로 관찰한 결과, 젤 내부에 모든 세포들이 생존(청색)해 있음을 확인하였다.
실시예 5: 모델약물이 포함된 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤 제조
실시예 1의 5% 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트 용액(95 uL)에 모델약물인 0.1% 로다민(rhodamine B)을 10 uL를 포함하여 용액을 제조하고, 5% 콘드로이틴 설페이트-TCEP 용액(95 uL)과 혼합하여 로다민이 포함된 200 uL 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤을 제조하였다.
실시예 5-1
분석 4
실시예 5에서 제조한 로다민이 담지된 콘드로이틴 설페이트 수화젤을 PBS 버퍼에서 로다민의 방출을 유도한 결과, 콘드로이틴 설페이트 수화젤로부터 로다민이 시간에 따라 방출되고, 10시간에 걸쳐 86 % 정도로 방출됨을 확인하였다(도 5).
실시예 6: 성장인자가 포함된 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤 제조
실시예 1의 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트 용액 95 uL에 신경성장인자(800 ng/ml; NGF)를 포함시켜 용액을 제조하고, 콘드로이틴 설페이트-TCEP 용액 95 uL와 혼합하여 NGF가 포함된 상태에서 젤화를 유도하여 NGF가 포함된 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤을 제조하였다.
실시예 6-1
분석 5
신경세포(PC-12)가 배양되고 있는 폴리스티렌 배양플라스크에 실시예 6에서 제조한 NGF를 포함하는 콘드로이틴 설페이트 수화젤을 담지하고 7일간 in vitro 세포배양과정에서 NGF의 방출과 세포거동을 관찰하였다. 성장인자가 포함되지 않은 배양 플라스크 상에서는 세포의 신경돌기가 관찰되지 않았던 반면에, 성장인자가 포함된 하이드로젤로부터 성장인자가 방출되면서 신경세포의 신경돌기의 뻗는 현상을 유도하는 것을 광학현미경으로 관찰하였다.
실시예 7: 젤라틴, 세포가 포함된 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤의 제조
실시예 1의 샘플을 버퍼용액에 용해하여 6.67 % 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트 용액(75 uL)과 6.67% 콘드로이틴 설페이트-TCEP 용액(75 uL)을 준비한 다음, 1% 젤라틴 용액(50 ul)에 105 cells/cm3의 섬유아세포를 포함시켜 젤라틴-세포 용액을 준비하였다. 상기 용액을 혼합하여 젤라틴-세포가 포함된 5% 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤을 제조하였다.
실시예 7-1
분석 6
실시예 7에서 제조된 젤라틴, 세포가 포함된 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤을 7일간 in vitro 배양하여 live & dead 방법으로 염색하고 형광현미경으로 관찰한 결과, 젤 내부에 모든 세포들이 생존(청색)해 있음을 확인하였다(도 4의 C).
실시예 8: TCEP를 이용한 히알루론산 하이드로젤의 제조
1 단계 : 히알루론산-아크릴레이트 제조
실시예 1의 콘드로이틴 설페이트 대신에 히알루론산 0.4 g을 120 ml 증류수에 용해하여 히알루론산 수용액을 제조하고 0.4 ml EDC 및 0.3 g ADH를 첨가하여 히알루론산-하이드라자이드 샘플을 제조한 다음, 다시 0.7 ml EDC 및 0.3 mL 아크릴산을 첨가한 다음, 하루 동안 동결건조시켜 히알루론산-아크릴레이트를 제조하였다.
2 단계 : 히알루론산-TCEP 제조
1 단계와 동일한 방법으로 0.4 g 히알루론산의 카복실 작용기에 0.4 ml EDC 및 0.4 g ADH를 첨가하여 결합시킨 다음, 다시 0.7 ml EDC 및 1.2 g TCEP를 첨가한 다음, 동결건조시켜 히알루론산-TCEP 분말을 제조하였다.
3 단계 : 히알루론산 하이드로젤 제조
제조된 0.01 g 히알루론산-아크릴레이트와 0.005 g 히알루론산-TCEP를 각각 100 uL 버퍼용액에 용해시켜 5 % 히알루론산-아크릴레이트 용액과 5 % 히알루론산-TCEP 용액을 제조한 다음, 두 용액을 1:1 비율로 혼합하여 히알루론산 하이드로젤을 제조하였다.
실시예 8-1
분석 7
실시예 8의 히알루론산-아크릴레이트와 히알루론산-TCEP 샘플에 대하여 FTIR 로 분석한 결과, 히알루론산과 비교하여 히알루론산-아크릴레이트의 1380 cm-1 CH=CH2 피크, 885 cm-1에서 히알루론산-TCEP의 P-C 피크가 관철되어 히알루론산-아크릴레이트 및 히알루론산-TCEP가 합성되었음을 확인하였다.
실시예 8-2
분석 8
실시예 8의 히알루론산 수화젤 표면에 104 cells/cm3 섬유아세포(fibroblast)를 접종하고 7일간 in vitro 배양하여 live & dead 평가한 결과, 모든 세포들이 생존(청색)해 있음을 형광현미경으로 확인하였다(도 4의 D).
실시예 9: TCEP를 이용한 카복시메틸셀룰로오스 하이드로젤 제조
1 단계 : 카복시메틸셀룰로오스-아크릴레이트 제조
실시예 1의 콘드로이틴 설페이트 대신에 카복시메틸셀룰로오스를 이용하여 카복시메틸셀룰로오스-하이드라자이드 화합물을 제조한 다음, 추가적으로 0.4 ml EDC 및 0.1 mL 아크릴산을 첨가한 다음, 동결건조시켜 카복시메틸셀룰로오스-아크릴레이트를 제조하였다.
2 단계 : 카복시메틸셀룰로오스-TCEP 제조
1단계와 동일한 방법으로 0.6 g 카복시메틸셀룰로오스의 카복실 작용기에 0.4 ml EDC 및 0.6 g ADH를 첨가하여 결합시킨 다음, 다시 0.6 g TCEP를 반응시키고, 동결건조시켜 카복시메틸셀룰로오스-TCEP 분말을 제조하였다.
3 단계 : 카복시메틸셀룰로오스 하이드로젤 제조
1 단계에서 제조된 0.01 g 카복시메틸셀룰로오스-아크릴레이트와 2단계에서 제조된 0.01 g 카복시메틸 셀룰로오스-TCEP를 각각 100 uL PBS에 용해하여 5 % 카복시메틸셀룰로오스-아크릴레이트 용액과 5 % 카복시메틸셀룰로오스-TCEP 용액을 제조한 다음, 두 용액을 1:1 비율로 혼합하여 카복시메틸셀룰로오스 하이드로젤을 합성하였다.
실시예 9-1
분석 9
실시예 9에서 제조한 건조된 카복시메틸셀룰로오스-아크릴레이트와 카복시메틸셀룰로오스-TCEP 샘플에 대하여 FTIR로 분석한 결과, 카복시메틸셀룰로오스와 비교하여 카복시메틸셀룰로오스-아크릴레이트의 1380 cm-1 =CH 피크, 카복시메틸셀룰로오스-TCEP의 1230 cm-1 (P-)CH2 피크가 관찰되어 카복시메틸셀룰로오스-아크릴레이트 및 카복시메틸셀룰로오스-TCEP가 합성되었음을 확인하였다.
실시예 9-2
분석 10
실시예 9에서 제조한 카복시메틸셀룰로오스 하이드로젤 표면에 104 cells/cm3의 섬유아세포(fibroblast)를 접종하고 7일간 in vitro 배양하여 live & dead 평가한 결과, 모든 세포들이 생존(청색)해 있음을 확인하였다.
실시예 10: 키토산-TCEP의 제조
실시예 1의 2단계 과정의 콘드로이틴 설페이트-ADH 대신에 키토산 0.4 g을 80 ml 증류수에 용해하여 키토산 수용액을 제조하고 0.3 ml EDC 및 0.5 g TCEP를 첨가하여 키토산-TCEP를 합성한 다음, 동결건조시켜 키토산-TCEP를 제조하였다.
실시예 10-1
분석 11
실시예 10에서 제조한 키토산-TCEP에 대하여 FTIR 분석한 결과, 키토산과 비교하여 키토산-TCEP 샘플은 835 cm-1 P-C 피크가 관철되어 키토산-TCEP가 합성되었음을 확인하였다(도 6).
실시예 11: TCEP를 이용한 젤라틴 하이드로젤 제조
1 단계 : 젤라틴-아크릴레이트 제조
실시예 1의 콘드로이틴 설페이트 대신에 젤라틴을 이용하여 0.5% 젤라틴 용액을 제조한 다음, 0.3 m EDC 및 0.1 mL 아크릴산을 첨가한 다음, 동결건조시켜 젤라틴-아크릴레이트를 제조하였다.
2 단계 : 젤라틴-TCEP 제조
1단계와 동일한 방법으로 0.4 g 젤라틴의 카복실 작용기에 0.2 ml EDC 및 0.3 g TCEP를 반응시키고, 동결건조시켜 젤라틴-TCEP 분말을 제조하였다.
3 단계 : 젤라틴 하이드로젤 제조
1단계에서 제조된 0.02 g 젤라틴-아크릴레이트와 2단계에서 제조된 0.02 g 젤라틴-TCEP를 각각 100 uL PBS에 용해하여 20 % 젤라틴-아크릴레이트 용액과 20 % 젤라틴-TCEP 용액을 제조한 다음, 두 용액을 1:1 비율로 혼합하여 젤라틴 하이드로젤을 합성하였다.
실시예 11-1
분석 12
실시예 11의 젤라틴-TCEP 샘플에 대하여 FTIR로 분석한 결과, 젤라틴과 비교하여 젤라틴-TCEP 샘플은 835 cm-1 P-C 피크가 관찰되어 젤라틴-TCEP가 합성되었음을 확인하였다(도 7).
실시예 12: 콜라겐-TCEP 제조
실시예 1의 2단계 과정의 콘드로이틴 설페이트 대신에 젤라틴 0.1 g을 80 ml 용매에 용해시켜 콜라겐 용액을 제조하고 0.2 ml EDC 및 0.2 g ADH를 첨가하여 결합시킨 다음, 다시 0.2 ml EDC 및 0.3 g의 TCEP를 반응시키고, 동결건조시켜 콜라겐-TCEP 분말을 제조하였다.
실시예 12-1
분석 13
실시예 12의 콜라겐-TCEP 샘플에 대하여 FTIR로 분석한 결과, 콜라겐과 비교하여 콜라겐-TCEP 샘플은 848 cm-1 P-C 피크가 관찰되어 콜라겐-TCEP가 합성되었음을 확인하였다.
실시예 13: 아텔로 콜라겐(atelocollagen)-TCEP 제조
실시예 1의 2단계 과정의 콘드로이틴 설페이트 대신에 아텔로 콜라겐 0.05 g을 40 ml 용매에 용해시켜 아텔로 콜라겐 용액을 제조하고, 0.02 ml EDC 및 0.02 g ADH를 첨가하여 키토산-하이드라자이드를 합성한 다음, 추가적으로 0.02 ml EDC 및 0.03 g의 TCEP를 첨가한 후, 동결 건조시켜 아텔로 콜라겐-TCEP를 제조하였다.
실시예 13-1
분석 14
실시예 13의 아텔로 콜라겐-TCEP 샘플에 대하여 FTIR로 분석한 결과, 아텔로 콜라겐과 비교하여 아텔로 콜라겐-TCEP 샘플은 1380 cm-1 파장에서 P-CH2 피크가 관찰되어 아텔로 콜라겐-TCEP가 합성되었음을 확인하였다(도 8).

Claims (14)

  1. 측쇄에 아민 작용기를 가지는 생체적합성 고분자 화합물의 상기 아민 작용기와 TCEP[tris(2-carboxyethyl)phosphine]의 카복실 작용기 간의 화학반응에 의하여 결합이 형성되거나,
    측쇄에 카복실 작용기를 가지는 생체적합성 고분자 화합물의 상기 카복실 작용기와 아민 작용기를 가진 링커의 상기 아민 작용기 사이의 화학반응에 의하여 결합을 형성하고, TCEP의 카복실 작용기와 상기 아민 작용기를 가진 링커의 다른 상기 아민 작용기 사이의 화학반응에 의하여 결합을 형성하여, 상기 TCEP가 상기 링커를 통하여 결합하는,
    TCEP가 결합된 고분자 화합물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 생체적합성 고분자 화합물은 콘드로이틴 설페이트, 카복시메틸셀룰로오스, 히알루론산, 헤파린, 키토산, 덱스트란, 더마탄 설페이트 및 알지네이트로 이루어진 다당류 그룹; 펩타이드, 콜라겐, 아텔로 콜라겐, 젤라틴, 단백질, 호르몬 및 성장인자로 이루어진 단백질류 그룹; 및 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리락티드, 폴리글리콜리드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 고분자 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 링커는 최소한 둘 이상의 아민기를 가지는 화합물인 것을 특징으로 하는 고분자 화합물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 링커는 디카복실산 디하이드라자이드, 아디프산 디하이드라자이드 또는 헥사메틸렌디아민인 것을 특징으로 하는 고분자 화합물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고분자 화합물에 결합되는 상기 TCEP는 상기 고분자 화합물의 반복단위 당 0.01 ~ 1 개로 결합되는 것임을 특징으로 하는 고분자 화합물.
  9. 제8항에 따른 상기 TCEP 작용기를 가진 고분자 화합물과 아크릴 작용기를 가지는 고분자 화합물이 마이클 형 첨가반응에 의하여 서로 결합하여 가교화된 가교화 고분자 화합물이고,
    상기 아크릴 작용기를 가지는 고분자 화합물은,
    측쇄에 아민 작용기를 가지는 생체적합성 고분자 화합물의 상기 아민 작용기와 아크릴 작용기를 가진 산의 카복실 작용기 간의 화학반응에 의하여 형성되거나,
    측쇄에 카복실 작용기를 가지는 생체적합성 고분자 화합물의 상기 카복실 작용기와 아민 작용기를 가진 링커의 상기 아민 작용기 사이의 화학반응에 의하여 결합하고, 아크릴 작용기를 가진 산의 카복실 작용기와 상기 아민 작용기를 가진 링커의 다른 상기 아민 작용기 사이의 화학반응에 의하여 결합함으로써 형성되는,
    가교화 고분자 화합물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 가교화 고분자 화합물은 하이드로젤, 필름, 다공성 지지체, 입자 또는 튜브 형태로 형성된 것임을 특징으로 하는 가교화 고분자 화합물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 아크릴 작용기는 아크릴레이트 또는 메타아크릴레이트인 것을 특징으로 하는 가교화 고분자 화합물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 가교화 고분자 화합물은 약물전달체, 조직공학 지지체 또는 세포치료제로 사용되는 것임을 특징으로 하는 가교화 고분자 화합물.
  13. 제9항에 따른 상기 가교화 고분자 화합물로 된 하이드로젤이고, 생체활성물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로젤.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 생체활성물질은 세포, 성장인자, 호르몬, 핵산, 세포외기질 물질 및 의약적 치료기능을 가지는 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 하이드로젤.
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