KR101161640B1 - 리포산이 결합된 화합물과 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 리포산 및 리포산 유도체를 콘드로이틴 설페이트, 카복시메틸 셀룰로오스, 헤파린 및 히알루론산과 같은 카복시기를 가지는 다당화합물, 일차아민 작용기를 갖는 키토산과 키토산 유도체, 티라민과 티라민 유도체에 화학적으로 결합시켜 제조되는 리포산-다당의 생성물 및 이의 제조방법과 이를 이용한 하이드로젤에 관한 것이다.
리포산, 항산화제, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산, 카복시메틸 셀룰로오스, 하이드로젤, 생체활성 물질 전달체, 조직재생 지지체

Description

리포산이 결합된 화합물과 이의 제조방법{Synthesis of lipoic acid-grafted compound and method therefor}
본 발명은 리포산 및 리포산 유도체를 콘드로이틴 설페이트, 카복시메틸 셀룰로오스, 헤파린 및 히알루론산과 같은 카복시기를 가지는 다당화합물, 일차아민 작용기를 갖는 키토산과 키토산 유도체, 티라민과 티라민 유도체에 화학적으로 결합시켜 제조되는 리포산-다당의 생성물 및 이의 제조방법과 이를 이용한 하이드로젤에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 리포산의 카복시 작용기와 아민 작용기를 가진 생체적합성 고분자 화합물의 결합에 의하여 생성된 제1 생체적합성 고분자 화합물과 불포화 탄화수소 작용기를 가지는 제2 생체적합성 고분자 화합물 사이의 마이클 형(Michael type) 첨가반응에 의하여 생성된 고분자 화합물에 관한 것이다.
리포산은 6,8-dithiooctanoic acid에 대한 일반명이며, 유기황 화합물인 입체이성질체(enantiomer)로 많은 효소 복합체에서 필수적인 공인자(cofactor)이다. 황색의 고체이며 카복시산과 이황화 작용기를 가진 항산화 물질이다. R-입체이성질체는 생합성되고, 환원된 형태인 디하이드로리포산(dihydrolipoic acid)으로 세포 내에 존재하는 형태이다. "Lipoate"는 리포산의 콘쥬게이트 염기이고, 이것의 카복시산 형태가 물리적인 상태를 결정한다. 따라서 리포산은 리포산을 사용하는 효소 복합체에 부착되어 있기 때문에, 세포 안에 있는 자유 리포산, 정확히 dihydrolipoate는 대부분의 세포 내에서 자유롭지 않다. 공인자로서 공유결합과 아마이드 결합은 카복시 작용기가 라이신(lysine)의 아미노기에 아마이드 결합을 유도하여 단백질과 결합하는 6,8-dithiooctanoic acid의 작용기 형태이다. 리포산은 아세트알데하이드 작용기를 CoA로 전달하여 TCA 사이클을 계속할 수 있다. 또한, 알파-리포산은 그 자체로서, 또는 체내에서 디하이드로리포산으로 전환된 후, 미생물에서 사람에 이르기까지 에너지 대사과정 및 세포호흡에서 필수적으로 작용하는 조효소이다(Packer, L. et al., Free Radic. Biol. Med., 19: 227-250, 1995). 알파-리포산 또는 체내에서 전환된 디하이드로리포산 자체가 항산화제로 작용하기도 하고, 체내의 또 다른 항산화 물질인 글루타치온의 생성을 촉진시켜주거나, 비타민 E 및 비타민 C의 기능과 재생을 도와 체내의 항산화 작용을 강화시키는 역할을 한다. 이러한 알파-리포산의 효능을 이용하여 현재 당뇨병, 신경질환, 백내장, 심장발작, 죽상동맥 경화증 등의 치료에 사용되고 있다.
본 발명에서 이용하고자 하는 리포산은 리포산을 다양한 화합물에 직접 공유결합을 유도하여 리포산이 결합된 화합물 합성을 하거나, 리포산 유도체가 결합된 새로운 화합물을 합성하고자 한다. 일례로, 리포산과 티라민의 -OH 기를 이용한 화학반응으로 리포산-티라민 화합물을 합성하였다, 또한 합성된 리포산-티라민 화합물의 자유 아민기와 히알루론산의 카복시산 사이의 반응을 유도하여 리포산-티라민-히알루론산 화합물을 합성하였다.
티라민은 티라민의 알코올 작용기를 결합시켜 티라민 유도체를 합성 및 하이드로젤로 응용하고자 하는 내용인데 반하여, "새로운 티라민 유도체, 그 유도체의 제조 방법 및 그 유도체를 포함하는 화장용 또는 피부의약 조성"의 공개발명은 과색소침착(hyper pigmentation)을 감소시키기 위한 목적을 가지고 있으나, 그 내용은 티라민의 아민 작용기에 여러 가지 화합물을 결합시켜 티라민 유도체를 합성하는 내용이어서 차이점이 있으며, 리포산-티라민 합성에 대한 보고는 알려져 있지 않다.
리포산과 함께 이용하고자 하는 콘드로이틴 설페이트 및 히알루론산과 같은 당화합물은 미생물로부터 발효 혹은 동물로부터 추출되는 당화합물로서 분자 내 유리 카복시 작용기를 가지고 있다. 이들은 현재 생체재료, 화학, 의학, 생명공학 및 화장품 산업분야 등에 다양하게 이용되고 있다. 의학, 생명소재, 의공학 분야에서는 약물 혹은 세포전달 담체와 관절염 치료제, 인공연골, 인공골 등과 같은 조직재생 지지체 소재 및 화장품의 보습제 소재로 적용된다.
리포산과 당화합물을 결합시켜 조직재생을 위한 생체재료로의 개발은 현재 알려진 바가 없다. 리포산을 이용한 특허는 "간세포 암 진단용 조성물, 이를 포함하는 간세포 암 진단키트 및 간세포 암 진단방법", "알부민 함유 제제를 살균하는 방법", "히드록심산 유도체를 함유하는 약제학적 조성물", "생물학적 성분의 살균방법"이 현재 등록 및 출원되고 있으나, 본 발명과는 차이가 있는 것으로 조사되고 있다.
히알루론산과 콘드로이틴 설페이트 당화합물을 이용한 경우에는, "생분해성 온도 감응성 폴리포스파젠계 하이드로젤, 그의 제조방법 및 그의 용도", "생체적합성의 주사형 하이드로젤을 이용한 신경 재생용 조직공학 이식체", "연골 및 다른 조직의 복구 및 재생용 조성물 및 방법", "간세포 암 진단용 조성물, 이를 포함하는 간세포 암 진단키트 및 간세포 암 진단방법", "조직유착 방지액 및 조직유착 방지방법", "알칸올 아민을 이용하는 모발 및 네일의 치료방법" 등의 특허가 보고된다. 특히, 최근에는 지혈작용(올리고당의 혈액응고 방지특성), 생체활성 물질 전달체(하이드로젤 소재 및 DNA-콘드로이틴 설페이트와 히알루론산 결합체로서 약물전달시스템으로 사용특성), 조직공학용 지지체(피부재생용 지지체) 등과 같은 콘드로이틴 설페이트와 히알루론산 고유의 다양한 생물학적 특성으로 인해 생체재료로의 응용가능성에 대하여 보고되고 있다.
카복시메틸 셀룰로오스는 셀룰로오스의 골격을 구성하는 글루코피라노오스 단량체(glucopyranose monomer)의 알코올 작용기에 카복시메틸 그룹을 결합시킨 당화합물로 무독성이고, 알러지 반응이 없으며 우수한 생체적합성으로 인하여 유착방지제와 같은 의료기기의 생체재료로 사용되고 있다. 또한, 높은 점성과 윤활성 등과 같은 특성 및 카복시메틸 그룹의 결합유도를 이용하여 화합물의 특성을 조절함으로써 점안제, 식품소재, 페인트소재 및 점증제 등으로 활용되고 있다. 카복시메틸 셀룰로오스를 이용한 경우에는, "카복시메틸 셀룰로오스계 결합제 및 이를 채용한 리튬전지", "인간성장호르몬의 지속적인 방출이 가능한 생분해성 약학적 조성물 및 미립구 제형", "점막 부착형 이온토포레시스 장치", "나트륨 카복시메틸 셀룰로스 및 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스를 포함하는 안과 용액", "카르복시 다당류 폴리에테르 고분자 간 복합체의 생체흡수가능한 조성물 및 외과 수술적인 유착을 감소시키는데 있어서의 이들의 이용방법", "신생골 형성과 조기 골경화를 촉진시키는 골충진용 조성물", "양친성 헤파린 유도체의 점막 흡수를 증가시키기 위한 제조방법" 등과 같은 특허가 보고되고 있어 의료용으로의 활용이 입증되고 있다.
헤파린은 "다관능성 양친매성 고분자 공중합체 및 이의 제조방법", "양친성 헤파린 유도체의 점막 흡수를 증가시키기 위한 제조방법", "생체활성 물질 고정화 인공혈관", "혈관신생 헤파린 결합 펩티드 양친매성 화합물" 등과 같은 다양한 특허들이 보고되고 있으나, 헤파린과 리포산을 함께 이용하는 특허는 리포산에 보고된 내용들에 포함되지 않고 있다.
또한, 키토산은 "키토산으로 표면 코팅된 조직재생용 생분해성 고분자제제 및 그 제조방법", "조직공학용 다공성 고분자 지지체의 제조방법", "키토산-히알루론산으로 이루어진 이온성 복합 지지체", "세포에 부착하는 올리고펩타이드" 등과 같은 다양한 특허들이 보고되고 있으나, 키토산과 리포산을 함께 이용한 특허는 보고되지 않고 있다.
이러한 결과들을 종합해 보면, 리포산과 당화합물 각각에 대한 생물학적 우수성에도 불구하고 이들이 결합된 형태의 생성물에 대한 산업적 응용연구는 상대적으로 활발하지 않은 것으로 분석된다.
따라서 리포산의 특성을 이용하여 고기능성, 고부가가치 소재(예컨대 의약품 소재)의 콘드로이틴 설페이트, 헤파린, 카복시메틸 셀룰로오스와 히알루론산의 유도체로 전환하여 상품화를 유도할 수 있는 기술을 개발할 필요성이 있으며, 이들과 리포산과의 결합을 이용하여 다당화합물의 생물학적 기능을 최대한 살릴 수 있는 리포산 유도체의 제조 및 이를 이용한 하이드로젤 및 필름을 개발하기 위한 노력으로 본 발명을 완성하였다.
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본 발명의 목적은, 리포산의 특성을 이용하여 고기능성, 고부가가치 소재(예컨대 의약품 소재)의 콘드로이틴 설페이트, 헤파린, 카복시메틸 셀룰로오스와 히알루론산의 유도체로 전환하여 상품화를 유도할 수 있는 기술을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 이들과 리포산과의 결합을 이용하여 다당화합물의 생물학적 기능을 최대한 살릴 수 있는 리포산 유도체의 제조 및 이를 이용한 하이드로젤 및 필름을 제공하는 것이다.
일측면에서, 본 발명은 리포산을 케나마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 네오마이신, 파로모마이신, 아프라마이신, 젠타마이신, 네틸마이신, 키토산, 아미카신과 같은 아민 작용기를 가지는 당화합물 혹은 가교결합제로 아민 작용기를 가진 당화합물 유도체; 혹은 아민 작용기를 가진 아미노살리실산, 펩타이드, 단백질, 성장인자; 혹은 아민 작용기를 가지는 약물; 혹은 아민 작용기를 가지는 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐리돈)과 같은 생체적합성 고분자와의 반응에 의하여 생성된 리포산-고분자 화합물 및 이의 합성방법과 이들을 이용한 하이드로젤 및 필름과 같은 생성물 및 이의 제조방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 리포산과 결합된 콘드로이틴 설페이트, 카복시메틸 셀룰로오스, 헤파린, 히알루론산을 이용하여 합성된 하이드로젤 및 필름에 세포, 성장인자, 호르몬, 약물 등과 같은 생체활성 물질을 담지시켜 사용함으로써 생체활성 물질 전달체 혹은 조직공학용 지지체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 리포산의 카복시 작용기와 아민 작용기를 가진 생체적합성 고분자 화합물의 결합에 의하여 생성된 제1 생체적합성 고분자 화합물과 불포화 탄화수소 작용기를 가지는 제2 생체적합성 고분자 화합물 사이의 마이클 형 첨가반응에 의하여 생성된 고분자 화합물을 제공하는 것이다. 여기에서, 마이클 형 첨가반응에 의하여 생성된 상기 고분자 화합물은 하이드로젤 또는 필름 형태일 수 있다. 아민 작용기를 가진 상기 생체적합성 고분자 화합물은 화합물 자체에 아민 작용기를 가지는 화합물과 아민 작용기를 화합물에 화학적으로 결합시켜 생성된 아민 화합물로 구성된 그룹 중 적어도 하나일 수 있고, 상기 불포화 탄화수소 작용기는 메타아크릴레이트, 아크릴레이트 혹은 탄화수소 중간에 하나 혹은 여러 개의 불포화기를 갖는 것일 수 있다. 특히, 아민 작용기를 가진 상기 생체적합성 고분자 화합물은 펩타이드, 단백질, 키토산, 아미노 당, 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol))로 구성된 그룹 중 적어도 하나일 수 있고, 또한 아민 작용기의 화합물을 화학적으로 결합시켜 생성된 콘드로이틴 설페이트, 헤파린, 알긴산, 덱스트란, 더마탄 설페이트, 히알루론산, 카복시메틸 셀룰로오스, 글루카곤으로 구성된 천연고분자 및 폴리에틸렌옥사이드, 플루로닉 화합물, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리비닐알코올 및 폴리비닐리돈으로 구성된 아민 작용기를 가지는 합성 고분자로 구성된 그룹 중 적어도 하나일 수 있다. 상기 고분자 화합물은 상기 제1 생체적합성 고분자 화합물 용액 혹은 상기 제2 생체적합성 고분자 화합물 용액 중 적어도 하나의 용액에 세포, 약물, 성장인자, 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 생체활성 물질을 추가한 다음, 상기 두 용액을 혼합함으로써 마이클 형 첨가반응에 의하여 생성되는 것일 수 있다. 상기 생성된 고분자 화합물은 하이드로젤 또는 필름 형태로서, 생체활성 물질을 서방출시키는 것일 수 있다.
본 발명은 리포산의 특성을 이용하여 고기능성, 고부가가치 소재(예컨대 의약품 소재)의 콘드로이틴 설페이트, 헤파린, 카복시메틸 셀룰로오스와 히알루론산의 유도체로 전환하여 상품화를 유도할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 이들과 리포산과의 결합을 이용하여 다당화합물의 생물학적 기능을 최대한 살릴 수 있는 리포산 유도체의 제조 및 이를 이용한 하이드로젤 및 필름을 제공할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 하이드로젤은 리포산이 결합된 콘드로이틴 설페이트, 키토산, 카복시메틸 셀룰로오스, 헤파린 및 히알루론산 유도체를 이용하여 콘드로이틴 설페이트, 카복시메틸 셀룰로오스, 헤파린 및 히알루론산 또는 생체적합성 고분자의 (메타)아크릴레이트 혹은 고분자 사슬에 불포화 작용기를 가진 화합물과 리포산 유도체 간에 형성된 하이드로젤이다.
본 발명에서 용어, "필름"이란 상기의 하이드로젤에 비하여 형태를 유지하는 고체상(solid phase)으로, 그 성분은 상기 하이드로젤의 구성성분과 동일하나 농도가 높도록 제조된 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "생체활성 물질"이란 질병의 치료, 치유, 예방 또는 진단 등에 사용되는 물질을 의미하나, 특정 물질이나 분류에 제한되지 않는다. 이런 생체활성 물질에는 유기 합성 화합물, 추출물, 단백질, 펩타이드, 핵산, 지질, 탄수화물, 스테로이드, 세포외기질 물질 및 세포 등을 포함한다. 본 발명에서 사용하고 있는 용어 "약물"도 상기 생체활성 물질에 포함될 수 있다. 또한, 희석제, 방출 지연제, 비활성 오일, 결합제 등의 해당 기술 분야에서 다양한 부형제가 선택적으로 혼합될 수 있다.
본 발명에서 용어, "생체활성 물질 전달체"는 생체활성 물질을 이화학적으로 결합시켜 생체 내로 전달할 수 있는 장치를 의미한다.
본 발명에서 용어, "조직재생 유도용 생체활성 지지체"는 조직재생의 유도기능을 가진 펩타이드를 콘드로이틴 설페이트 혹은 히알루론산의 네트워크에 화학적으로 결합시켜 새로운 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산-펩타이드로 구성되는 하이드로젤 물질을 의미한다.
일 양태로서, 본 발명은 콘드로이틴 설페이트 싸이올 유도체와 분자구조의 중간에 불포화 작용기를 가지는 분자와 공유결합된 콘드로이틴 설페이트 및 히알루론산 유도체가 가교결합으로 형성된 콘드로이틴 설페이트 및 히알루론산 하이드로젤과 필름 등에 관한 것이다.
다른 형태로서는, 불포화 작용기를 가진 화합물에 광 개시제를 첨가하여 광에 의한 가교결합을 유도하여 생성되는 하이드로젤 및 필름에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 콘드로이틴 설페이트는 수용성으로서, 1 내지 1,000 kDa의 크기를 갖는 콘드로이틴 설페이트이고, 보다 바람직하게는 3 kDa 내지 300 kDa의 크기를 갖는 콘드로이틴 설페이트이다. 콘드로이틴 설페이트는 생체친화성이 우수하고, 항원성이 낮으며 생체 내에서 분해 및 흡수되는 특징을 가지므로 의료용 재료로 바람직하다.
본 발명의 하이드로젤에 사용되는 콘드로이틴 설페이트 유도체는, 예를 들어 분자구조의 중간에 불포화 탄화수소 작용기를 가지는 분자가 불포화지방산(unsaturated lipid)인 경우에, 불포화지방산 말단의 카복시산 작용기와 콘드로이틴 설페이트 리포산 유도체에 유도된 아민 작용기가 공유결합 함으로써 합성될 수 있다. 즉, 상기 결합에 의해 불포화 탄화수소 분자를 함유하는 콘드로이틴 설페이트 유도체가 형성되는 것이다.
이와 같이, 콘드로이틴 설페이트-리포산 유도체의 싸이올 작용기와 수용성 콘드로이틴 설페이트의 불포화 작용기를 가지는 불포화 탄화수소 분자를 화학적 결합에 의해 합성된 콘드로이틴 설페이트-불포화 탄화수소 화합물의 불포화 탄화수소 그룹(작용기) 사이의 마이클 형 반응을 이용하여 젤이나 필름을 합성한다.
콘드로이틴 설페이트와 히알루론산과 공유결합될 수 있는 분자구조에 불포화 탄화수소 작용기를 갖는 분자에는 불포화지방산, 대사물질 및 페로몬 등이 있다.
구체적으로 예를 들면, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산, 팔미틱산, 팔미톨레산, 미드산, 아라키돈산, 시스-에이코사-펜타에노산(cis-eicosa-pentaenoic acid), 시스-도코사-테트라엔산(cis-docosa-tetraenlic acid), 시스-도코사-펜타엔산(cis-docosa-pentaenoic acid), 옥타-트리에노산(octa-trienoic acid), 메틸-하이드록시에코산-테트라에노에이트(methyl-hydroxy-tetraenoate), 로렌센나인(laurencenynes), 운데카-테트라센(undeca-tetracenes), 하이드록시에이코사펜타엔산(hydoxyeicosapentaenic acid), 하이드로퍼옥시에이코사테트로에논산(hydroperoxyeicostetraenic acid), 포스포티딜에타놀아민(phosphatidylethanolamine; 18:2, 18:3, 20:4, 22:6 등), 포스파티딕산(phohspatidic acid; 18:2, 22:6 등), 포스파디딜글라이세롤(phosphatidylglycerols; 18:2, 18:3, 22:6 등), 포스포티딜세린(phosphatidylserines; 22:6 등), 이노시톨(Inositol; 20:4 등) 등과 같은 불포화 작용기를 가지는 생물분자들이 포함된다.
본 발명의 구체적인 양태로서, 하이드로젤 제조를 위한 리포산이 포함된 콘드로이틴 설페이트와 히알루론산 유도체로서 리포산을 콘드로이틴 설페이트와 공유결합시켜 콘드로이틴 설페이트-리포산을 합성할 수 있고, 또는 불포화지방산을 콘드로이틴 설페이트, 키토산, 히알루론산 등과 공유결합시켜 콘드로이틴 설페이트-, 키토산-, 히알루론산-불포화지방산으로 합성할 수 있다. 이때, 불포화 작용기와 싸이올 작용기 비율은 용도에 따라 다양하게 조절가능하다. 상기 불포화 작용기와 싸이올 작용기의 몰 비는 10:1 내지 1:10, 바람직하게는 3:1 내지 1:2이고, 보다 바람직하게는 1:1이다.
반응식 1은 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법으로, 당화합물 유도체의 카복시기에 가교결합제를 결합한 후(반응식 1-1) 가교결합제의 아민 작용기와 리포산의 카복시기 사이의 합성 메커니즘을 나타낸다(반응식 1-2-1). 가교결합제로 키토산 같은 아민 작용기를 가진 고분자 물질을 사용할 경우 당화합물 없이 리포산의 카복시기와 키토산의 아민 작용기 간의 합성을 유도할 수 있다(반응식 2).
R1은 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 헤파린, 카복시 셀룰로오스 및 히알루론산 등과 같은 당화합물에 아민기를 가진 화합물과 결합시켜 형성된 유도체를 나타내며 R2는 ADH(Adipic dihydrazide), 아미노살리실산 및 키토산 같은 아민 작용기를 직접적으로 제공해줄 수 있는 물질을 나타낸다.
[반응식 1-1]
Figure 112009051989612-pat00001
아민 작용기 유도물질의 예로 화학식 1의 ADH와 화학식 2의 키토산이 있을 수 있다.
[화학식 1]
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[화학식 2]
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[반응식 1-2-1]
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[반응식 1-2-2-1]
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[반응식 1-2-2-2]
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[반응식 1-2-2-3]
Figure 112009051989612-pat00007
카복시산 작용기를 갖는 아크릴레이트 물질의 예로 화학식 3-1 내지 3-4의 화합물들이 있을 수 있고, 아미노 작용기를 갖는 아크릴레이트 물질의 예로 화학식 4의 화합물이 있을 수 있고, 카복시산 작용기 화합물의 예로 화학식 5-1 내지 5-6의 화합물들이 있을 수 있다.
[화학식 3-1]
Figure 112009051989612-pat00008
[화학식 3-2]
Figure 112009051989612-pat00009
[화학식 3-3]
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[화학식 3-4]
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[화학식 4
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[화학식 5-1]
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[화학식 5-2]
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[화학식 5-3]
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[화학식 5-4]
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[화학식 5-5]
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[화학식 5-6]
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[반응식 2]
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R2(아미노 작용기) 물질의 예로 다음 화학식 6-1 내지 6-5의 화합물들이 있을 수 있다.
[화학식 6-1]
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[화학식 6-2]
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[화학식 6-3]
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[화학식 6-4]
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[화학식 6-5]
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상기 반응식을 사용하면, 카복시 작용기를 가진 당화합물 및 키토산에 아크릴레이트, 메타아크릴레이트 및 불포화 탄화수소 작용기가 화학적으로 결합된 당 유도체를 제조할 수 있다(반응식 1-2-2-1, 1-2-2-2, 1-2-2-3).
이러한 유도체를 이용하여 제조되는 젤 혹은 필름합성의 일례로, 리포산-당화합물의 이황화 작용기를 환원시켜 생성된 싸이올 작용기와 불포화 탄화수소의 작용기를 가진 당 유도체인 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산의 불포화화합물 사이의 반응에 의해 콘드로이틴 설페이트, 셀룰로오스와 히알루론산과 같은 당 하이드로젤 및 필름을 합성할 수 있다. 아크릴 작용기와 싸이올 작용기 몰 비는 10:1 내지 1:10, 바람직하게는 4:1 내지 1:3, 더욱 바람직하게는 3:1 내지 1:2이고, 가장 바람직하게는 1:1이며, 분자의 불포화 작용기와 싸이올 작용기의 몰 비는 10:1 내지 1:10, 바람직하게는 3:1 내지 1:2이고, 보다 바람직하게는 1:1이다. 그리고 분자의 불포화 탄화수소 작용기와 아크릴 작용기와의 몰 비는 100:1 내지 1:1, 바람직하게는 20:1이다.
본 발명의 하이드로젤과 필름은 생물분자로 구성되어 안전성이 매우 높은 화합물로 구성되었기에, 상처치유 패치, 주름개선 등의 성형재료, 미용재료, 관절염 치료제, 신경, 피부, 골 및 연골재생 등과 같은 조직재생용 지지체 등의 다양한 용도로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 하이드로젤과 필름은 생체활성 물질 전달체로 사용할 수 있다. 상기 당화합물은 생체적합성을 지닌 물질로 공지되어 있고, 본 발명의 하이드로젤 및 필름 제조방법은 용액상태의 두 가지 물질을 단순히 혼합함으로써 가능하므로, 준비된 두 가지의 용액에 생체활성 물질을 포함시켜 하이드로젤을 제조할 수 있다. 생체활성 물질이 포함된 두 가지 용액을 주사기를 사용하여 질병이나 상처부위에 전달함으로써, 시간에 따라 생체활성 물질이 포함된 하이드로젤 제조를 유도할 수 있으므로, 본 발명의 하이드로젤은 생체활성 물질 전달체로의 이용은 더욱 바람직하다. 이는 생체활성 물질을 담지 혹은 화학적으로 결합시켜 생체 내로 전달할 수 있는 장치로서, 본 발명의 일 구체예에서는 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 하이드로젤에 생체활성 물질이 담지되어 생체 내로 주사(injection) 방법으로 전달될 수 있다. 목적에 따라서는 생체활성 물질은 예정된 부위에서 예정된 시간에 걸쳐서 일정하게 서방출되도록 할 수 있다. 일 구체예로 상기 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 유도체에 생체활성을 조절할 수 있는 목적하는 약물을 결합시킨 다음, 하이드로젤 혹은 필름으로 형성시켜 약물 전달체의 역할도 할 수 있다. 이때 추가로 다른 생체활성 물질을 하이드로젤 및 필름에 함께 담지시켜 사용할 수 있다.
이런 주사 가능한(injectable) 전달체는, 환자 질병부위로의 전달률이 낮거나, 투여된 고가(high price)의 약물이 체외로 지나치게 빨리 소실되는 경우 혹은 복용에 따른 부작용이 큰 약물을 사용하는 경우에 유용하다. 즉, 약물을 질병부위에 직접 전달함으로써, 약물이 환부에 천천히 방출되도록 속도를 조절함으로써 약물의 농도를 오랫동안 치료 영역에 유지시키거나, 주사 방법에 의하여 국소적으로 약물을 환부에 전달시킬 수 있는 장점과 함께, 화학적으로 결합된 약물의 종류와 농도, 젤의 물리적 강도, 화학적 특징 및 젤의 분해속도 등에 따라서 생체활성 물질의 전달속도 등을 조절할 수 있다.
본 발명의 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 하이드로젤에 물리적으로 담지 혹은 화학적으로 결합하여 생체 내로 전달할 수 있는 유기합성화합물에는 일반적으로 사용되는 항생제, 항암제, 소염진통제, 항바이러스제, 항균제 등이 있다.
항생제로는 테트라사이클린, 미노사이클린, 독시사이클린, 오플록사신, 레보플록사신, 시프로플록사신, 클라리스로마이신, 에리쓰로마이신, 세파클러, 세포탁심, 이미페넴, 페니실린, 겐타마이신, 스트렙토마이신, 반코마이신 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항생제를 예시할 수 있다.
항암제로는 메토트렉세이트, 카보플라틴, 탁솔, 시스-플라틴, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 에트포사이드, 파클리탁셀, 캄토테신, 사이토신 아라비노스 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항암제를 예시할 수 있다.
소염제로는 인도메타신, 이부프로펜, 케토프로펜, 피록시캄, 플루비프로펜, 디클로페낙 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 소염제를 예시할 수 있다. 항바이러스제로는 아시콜로버, 로바빈 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항바이러스제를 예시할 수 있다. 항균제로는 케토코나졸, 이트라코나졸, 플루코나졸, 암포테리신-B, 그리세오 풀빈 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항균제를 예시할 수 있다.
본 발명의 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 하이드로젤 및 필름에 담지하여 생체 내로 전달할 수 있는 단백질 및 펩타이드에는 질병을 치료 또는 예방할 목적으로 사용되는 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질, 다당류 및 수용체, 세포표면항원, 수용체 길항물질과 같은 다양한 생체활성 펩타이드, 이들의 유도체 및 유사체를 예시할 수 있다.
구체적으로, 골 성장인자, 간 성장호르몬, 성장호르몬 방출 호르몬과 펩타이드, 인터페론류와 인터페론 수용체류, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 글루카콘-유사 펩타이드류(GLP-1등), G 단백질 연결 수용체(G-protein-coupled receptor), 인터루킨류와 인터루킨 수용체류(예컨대 IL-1 수용체), 효소류(예컨대 glucocerebrosidase, iduronate-2-sulfatase, 알파-갈락토시데이즈-A, 아갈시데이즈 알파(agalsidase alpha), 베타, 알파-L-이두로니데이즈(alpha-L-iduronidase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티네이즈(chitinase), 글루타메이트 디카르복실레이즈(glutamate decarboxylase), 이미글루세레이즈(imiglucerase), 리페이즈(lipase), 유리케이즈(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤레이즈(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티데이즈(neutralendopeptidase), 마이엘로퍼옥시데이즈(myeloperoxidase) 등), 인터루킨 및 사이토카인 결합 단백질류(예컨대 IL-18, TNF-결합 단백질 등), 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor) 알파 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin), 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포이에틴류(angiopoietin), 헤모글로빈, 트롬빈(thrombin), 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린(thrombomodulin), 혈액인자, 혈액인자 a, 혈액인자 XIII, 플라즈미노겐 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키네이즈, 스트렙토키네이즈, 히루딘(hirudin), 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게네이즈 억제제, 수퍼옥사이드 디스 뮤테이즈, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴(angiostatin), 안지오텐신(angiotensin), 골 형성 성장인자(bonemorphogenic protein), 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌(elcatonin), 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor), 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류(예컨대 신경 성장인자, 모양체 신경영양인자(cilliary neurotrophic factor), 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1), 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide), 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor), 네트린(netrin), 중성구 억제인자(neurophil inhibitor factor), 신경영양인자, 뉴트린(neuturin) 등), 부갑상선호르몬, 릴랙신, 시크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신(autotaxin), 락토페린(lactoferrin), 미오스타틴(myostatin), 수용체류(예컨대 TNFR(P75), TNFR(P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, B 세포 활성인자 수용체 등), 수용체 길항물질(예컨대 IL1-Ra 등), 세포표면항원(예컨대 CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 등), 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편류(예컨대 scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd), 바이러스 유래 백신 항원 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 하이드로젤 및 필름에 물리적으로 담지 혹은 화학적으로 결합하여 생체 내로 전달할 수 있는 핵산으로는 DNA, RNA, PNA, 올리고뉴클레오티드 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 하이드로젤 및 필름에 물리적으로 담지 혹은 화학적으로 결합하여 생체 내로 전달할 수 있는 세포외기질 물질에는 콜라겐, 피브로넥틴, 젤라틴, 라미닌, 비트로넥틴 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 하이드로젤에 물리적으로 담지하여 생체 내로 전달할 수 있는 세포에는 줄기세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포, 연골세포, 골세포, 피부세포, 슈반세포 등을 예시할 수 있다.
실제 본 발명의 방법으로 제조된 하이드로젤을 세포전달체로 이용하였을 때, 하이드로젤에 담지된 세포들이 증식하여 약 2-8주 후에는, 합성조건에 따라 하이드로젤이 분해된 후에 세포들이 세포배양 플라스크 표면에 부착됨을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 하이드로젤에 담지되는 생체활성 물질의 잔존수율과 활성이 안정적임을 시사한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 수용성 용액을 제조하는 단계; (b) 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 등을 분자구조에 불포화 작용기를 갖는 분자와 공유결합시켜 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 아크릴레이트 유도체를 제조하는 단계; (c) 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산을 리포산과 공유결합시켜 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 리포산 유도체 제조 및 다이설파이드(disulfide)를 싸이올 작용기로 환원시키는 단계; (d) 상기 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 등의 아크릴레이트 유도체를 콘드로이틴 설페이트 또는 히알루론산 싸이올 유도체와 가교결합시키는 단계를 포함하는 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 하이드로젤 및 필름을 제조하는 방법에 관한 것이다.
(a) 단계는 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산을 물에 녹여서 수용성 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 용액을 제조하는 단계이다. (b) 단계에서는 분자구조에 존재하는 불포화 작용기를 갖는 분자와 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산을 반응유도물질을 이용하여 공유결합시킬 수 있으며, 반응유도물질로서 N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide(EDC) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, EDC를 반응유도물질로 사용하였으며, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산: 리놀레산: EDC의 몰 반응비는 다양하게 조절될 수 있다. 실제로 1: 2: 4, 1: 4: 2 또는 1: 5: 5 등으로 다양하게 변화시켜 콘드로이틴 설페이트와 히알루론산 아크릴레이트 유도체를 합성할 수 있다. (c) 단계에서는 분자구조의 말단에 싸이올 작용기를 갖는 리포산과 같은 생물분자와 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산을, 반응유도물질을 이용하여 공유결합시킬 수 있으며, 반응유도물질로서 EDC 등을 사용할 수 있다.
상기 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 하이드로젤을 제조하는 방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산을, 분자구조의 아크릴레이트 작용기를 갖는 당 유도체와 공유결합시켜 하이드로젤 합성시간 단축 및 특성을 조절할 수 있다. 상기 불포화 작용기와 싸이올 작용기의 몰 비율은 용도에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 상기 아크릴 작용기와 싸이올 작용기 몰 비는 10:1 내지 1:10, 바람직하게는 4:1 내지 1:3, 더욱 바람직하게는 3:1 내지 1:2이고, 가장 바람직하게는 1:1이며, 상기 불포화 작용기와 싸이올 작용기의 몰 비는 20:1 내지 1:20, 바람직하게는 3:1 내지 1:2이고, 보다 바람직하게는 1:1이다. 그리고 불포화 작용기와 아크릴 작용기와의 몰 비는 100:1 내지 1:1, 바람직하게는 20:1 이다. 이러한 몰 비는 제조하고자 하는 하이드로젤의 특성 및 용도에 따라 조절가능 하다.
상기 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 하이드로젤을 제조하는 방법에 있어서, 사용되는 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산의 분자량, 결합된 리포산 몰 수, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 농도와 사용하는 반응유도물질의 종류, 농도 및 pH, 반응시키는 불포화 작용기와 싸이올 작용기의 몰 비율 등 매우 다양한 요소에 따라 하이드로젤의 생물학적 특성, 물리적 강도 및 화학적 특성 조절이 가능하다.
상기 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 하이드로젤을 제조하는 방법에 있어서, 목적에 따라 생체활성 물질을 물리적으로 담지 혹은 화학적으로 결합시키는 단계를 추가할 수 있다.
구체적인 예로서, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 하이드로젤을 제조하는 하나의 방법은 수용성 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 용액을 제조하는 단계; 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산을 리포산 분자와 공유결합시켜 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산-리포산 화합물을 제조하는 단계; 생체활성 물질(약물)을 화학결합시키는 단계; 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산-리포산 화합물로부터 미반응 분자 반응물을 제거하는 단계; 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산-리포산을 건조시키는 단계; 및 상기 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산-리포산을 콘드로이틴 설페이트-아크릴레이트 또는 히알루론산-아크릴레이트와 가교결합시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태로서 본 발명은 (a) 수용성 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 용액을 제조하는 단계; (b) 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산을, 리포산 분자와 공유결합시켜 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산-리포산 화합물을 제조하는 단계; (c) 생체활성 물질을 상기 콘드로이틴 설페이트-, 히알루론산-리포산 화합물 또는 콘드로이틴 설페이트-, 히알루론산-아크릴레이트 화합물과 혼합하는 단계; 및 (d) 생체활성 물질을 화학적으로 결합시키거나 물리적으로 담지한 채 상기 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산-리포산 화합물을 콘드로이틴 설페이트 또는 히알루론산-아크릴레이트 작용기와 가교결합시키는 단계를 포함하는 생체활성 물질 전달체를 제조하는 방법에 대한 것이다. 각 단계에 대한 구체적인 설명은 상기와 같다.
본 발명의 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 하이드로젤에 생체활성 물질의 담지는 젤 및 필름 제조과정 또는 젤 및 필름 제조 후 사용 전에 할 수 있지만, 젤 제조과정 중 (c) 단계에서 생체활성 물질을, 젤 또는 필름을 유도하는 용액과의 물리적 담지 혹은 화학적 결합으로 유도하는 것이 바람직하다. 콘드로이틴 설페이트-, 히알루론산-리포산 용액 또는 콘드로이틴 설페이트- 또는 히알루론산-아크릴레이트를 녹인 용액에 생체활성 물질을 혼합한 다음 하이드로젤 제조를 유도함으로써, 생체활성 물질이 물리적으로 하이드로젤에 담지되도록 유도하거나, 공유결합시켜 젤 및 필름 네트워크의 일부가 되도록 한다.
일 구체예로서, 생체활성 물질 전달체를 제조하는 방법은 수용성 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 용액을 제조하는 단계; 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산과 리포산 분자와 공유결합시켜 콘드로이틴 설페이트-, 히알루론산-리포산을 제조하는 단계; 콘드로이틴 설페이트-, 히알루론산-리포산을 건조시키는 단계; 생체활성 물질을 콘드로이틴 설페이트-, 히알루론산-아크릴레이트 화합물과 혼합하는 단계; 및 상기 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산-리포산을 콘드로이틴 설페이트 또는 히알루론산-아크릴레이트 화합물과 가교결합시키는 단계를 포함한다.
이하, 구체적인 실시예 및 비교예를 가지고 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명하지만, 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 명확하게 이해시키기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 또는 키토산에 리포산을 화학적으로 결합하는 방법과 분석 및 세포배양 결과에 대한 실시예이다. 본 발명의 하이드로젤의 세포적합성 평가를 위하여 사용한 세포들은 동물로부터 수확한 세포이다. 골세포(MC3T3)는 쥐의 두개골에서 분리 및 in vitro 확장한 세포들을 사용하였다.
실시예 1: 키토산 하이드로젤 합성
1 단계 과정: 키토산 용액(20 ml)에 리포산 용액(30 mL)을 첨가한다. 키토산이 포함된 리포산 혼합용액에 일정량의 가교결합제를 첨가하여 상온에서 교반하면서 24시간 동안 반응을 진행하였다. 생성용액을 동결 건조하여 키토산-리포산 파우더를 획득하였다. 동일한 메커니즘으로 키토산 용액과 아크릴레이트 용액을 혼합하고, 가교결합제를 첨가하여 반응을 진행하였다. 생성용액을 동결 건조하여 키토산-아크릴레이트 파우더를 획득하였다.
2 단계 과정: 1 단계에서 제조한 키토산-리포산과 키토산-아크릴레이트를 해당 용매에 녹여 각각의 용액을 제조하였다.
3 단계 과정: 2 단계에서 제조된 두 가지 용액을 일정비율로 혼합시킴으로써 하이드로젤을 제조하였다. 이때 키토산-리포산 및 키토산-아크릴레이트의 농도를 다양하게 조절하여 용액을 일차적으로 제조하였다.
분석 1.
두 용액을 혼합한 후 일정 시간 뒤 젤을 형성함을 육안으로 확인할 수 있었으며, 상온의 수용액에 100일 동안 침지한 이 후에도 젤이 분해되지 않고 형태를 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.
분석 2.
키토산-리포산 샘플을 푸리에 변환 적외선 분광기(Fourier transformed infrared spectroscopy: FTIR)로 평가한 결과, 키토산-리포산의 샘플에서
Figure 112011043255555-pat00025
2925(S-CH2),
Figure 112011043255555-pat00026
1550(N-H),
Figure 112011043255555-pat00027
950(S-H) 그리고
Figure 112011043255555-pat00028
710(C-S) 파장(cm-1)에서 각각 피크 변화 및 새로운 피크 생성을 확인함으로써 키토산과 리포산이 화학적으로 공유결합을 형성하고 있음을 관찰할 수 있었다(도 1a).
분석 3.
키토산-리포산을 이용하여 제조된 하이드로젤을 동결 건조한 다음 증류수에서 중량변화를 시간당 측정하여 2일 정도 지속한 결과, 제조된 하이드로젤이 약 6시간까지 중량이 증가하다가 10시간 이후부터는 더 이상 증가하지 않음을 확인함으로써, 초기에 생성물이 물을 흡수하여 하이드로젤로 전환되어 평형을 이루고 있음을 확인하였다. 제조된 샘플이 수용액에서 1주일 동안 분해되지 않음을 육안으로 확인함으로써 안정한 하이드로젤을 형성하고 있음을 알 수 있었다.
분석 4.
실시예 1에서 합성한 키토산-리포산과 키토산을 화학원소분석기(XPS)로 분석한 결과 키토산-리포산의 C1s를 관찰하여 키토산에 리포산이 화학적으로 결합하여 새로운 탄소결합이 생성되었음을 확인하였고, 키토산-리포산에서는 새로이 S2p peak가 생성되어 황 결합의 존재를 확인함으로써 키토산에 리포산이 화학적으로 결합되어 있음을 확인하였다(도 2).
분석 5.
실시예 1에서 키토산, 리포산 및 키토산-리포산을 용매에 녹여 1H-NMR을 분석한 결과
Figure 112011105529479-pat00029
2.7(CH2-S),
Figure 112011105529479-pat00030
2,215 그리고
Figure 112011105529479-pat00031
1.16(CH2-SH) ppm에서 피크 변화 및 새로운 피크 생성의 확인을 통하여 히알루론산에 리포산이 화학적으로 결합되어 있음을 알 수 있었다(도 3).
실시예 2: 히알루론산-키토산 하이드로젤 합성
1 단계 과정: 히알루론산 용액(20 ml)에 키토산 용액(30 mL)을 첨가한다. 히알루론산이 포함된 키토산 혼합용액에 일정량의 EDC를 첨가하여 상온에서 교반하면서 24시간 동안 반응을 진행하였다. 생성용액을 동결 건조하여 히알루론산-키토산 생성물을 획득하였다. 히알루론산-키토산 용액(20 mL)에 리포산 용액(30 mL)을 첨가한 다음, 일정량의 EDC를 첨가 및 상온에서 교반하면서 24시간 동안 반응을 진행한 다음 환원반응을 진행하였다. 생성용액을 동결 건조하여 히알루론산-키토산-리포산 생성물을 획득하였다. 동일한 메커니즘으로 히알루론산-키토산 용액과 아크릴레이트 용액을 혼합하고, 가교결합제를 첨가하여 반응을 진행한 다음, 동결 건조하여 키토산-아크릴레이트 생성물을 획득하였다.
2 단계 과정: 1 단계에서 제조한 히알루론산-키토산-리포산과 히알루론산-키토산-아크릴레이트를 해당 용매에 녹여 각각의 용액을 제조하였다.
3 단계 과정: 2 단계에서 제조된 두 가지 용액을 일정비율로 혼합시킴으로써 하이드로젤을 제조하였다. 이때 히알루론산-키토산-리포산 및 히알루론산-키토산-아크릴레이트의 농도를 다양하게 조절하여 용액을 일차적으로 제조하였다.
분석 1.
두 용액을 혼합한 후 일정한 시간 뒤 젤을 형성함을 육안으로 확인할 수 있었으며, 상온의 수용액에 100일 동안 침지한 이 후에도 젤이 분해되지 않고 형태를 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.
분석 2.
히알루론산-키토산-리포산 샘플을 FTIR로 평가한 결과, 히알루론산-키토산-리포산의 샘플에서
Figure 112011043255555-pat00032
2920(S-CH2),
Figure 112011043255555-pat00033
1650(C=O),
Figure 112011043255555-pat00034
1550(N-H), 그리고
Figure 112011043255555-pat00035
760(C-S) 파장(cm-1)에서 각각 피크 변화 및 새로운 피크 생성을 확인함으로써 히알루론산 및 키토산과 리포산의 화학적 결합을 관찰하였다(도 1b).
분석 3.
히알루론산-키토산-리포산 하이드로젤을 동결 건조한 다음, 증류수에서 중량변화를 시간당 측정하여 2일 정도 지속한 결과, 실시예 1의 분석 3과 유사한 결과를 보임으로써 안정한 하이드로젤을 형성하고 있음을 알 수 있었다.
분석 4.
실시예 1에서 합성한 히알루론산-키토산-리포산과 히알루론산을 화학원소분석기(XPS)로 분석한 결과 히알루론산-키토산-리포산의 C1s를 통하여 히알루론산에 키토산 및 리포산이 화학적으로 결합하여 새로운 탄소결합이 생성되었음을 확인하였고, 히알루론산-키토산-리포산에서는 새로이 S2p peak가 생성되어 황 결합의 존재를 확인함으로써 키토산에 리포산이 화학적으로 결합되어 있음을 확인하였다(도 4).
분석 5.
실시예 1에서 합성한 키토산, 리포산 및 키토산-리포산을 용매에 녹여 1H-NMR을 분석한 결과
Figure 112011105529479-pat00036
2.7(CH2-S),
Figure 112011105529479-pat00037
2,219() 그리고
Figure 112011105529479-pat00038
1.17(CH2-SH) ppm에서 피크 변화 및 새로운 피크 생성의 확인을 통하여 새로운 화학구조의 존재를 확인함으로써, 히알루론산에 리포산이 화학적으로 결합되어 있음을 알 수 있었다(도 5a).
실시예 3: 히알루론산-ADH 하이드로젤 합성
1 단계 과정: 히알루론산 용액(20 mL)에 아디픽 다이하이드라자이드(adpic acid dihydrazide이하 "ADH"이라 함) 용액(20 mL)을 첨가한다. 히알루론산이 포함된 ADH 혼합용액에 일정량의 가교결합제를 첨가하여 상온에서 교반하면서 7시간 동안 반응을 진행하였다. 반응용액에 리포산 용액(30 mL)을 첨가하여 히알루론산 및 ADH이 포함된 리포산 혼합용액에 일정량의 가교결합제를 첨가하여 상온에서 교반하면서 17시간 동안 반응을 진행하였다. 생성용액을 동결 건조하여 히알루론산-ADH-리포산 생성물을 획득하였다. 동일한 메커니즘으로 히알루론산 및 ADH 용액과 아크릴레이트 용액을 혼합하고, 가교결합제를 첨가하여 반응을 진행하였다. 생성용액을 동결 건조하여 히알루론산-ADH-아크릴레이트 생성물을 획득하였다.
2 단계 과정: 1 단계에서 제조한 히알루론산-ADH-리포산과 히알루론산-ADH-아크릴레이트를 해당 용매에 녹여 각각의 용액을 제조하였다.
3 단계 과정: 2 단계에서 제조된 두 가지 용액을 일정비율로 혼합시킴으로써 하이드로젤을 제조하였다. 이때 히알루론산-ADH-리포산 및 히알루론산-ADH-아크릴레이트의 농도를 다양하게 조절하여 용액을 일차적으로 제조하였다.
분석 1.
두 용액을 혼합한 후 일정한 시간 뒤 젤을 형성함을 육안으로 확인할 수 있었으며, 상온의 수용액에 100일 동안 침지한 이 후에도 젤이 분해되지 않고 형태를 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.
분석 2.
히알루론산-ADH-리포산 샘플을 FTIR로 평가한 결과, 키토산-리포산의 샘플에서
Figure 112011043255555-pat00073
2920(S-CH2),
Figure 112011043255555-pat00040
1660(C=O), 그리고
Figure 112011043255555-pat00041
700(C-S) 파장(cm-1)에서 각각 피크 변화 및 새로운 피크 생성을 확인함으로써 히알루론산 및 ADH가 리포산과 화학적으로 공유결합을 형성하고 있음을 관찰할 수 있었다(도 1c).
분석 3.
히알루론산-ADH-리포산 하이드로젤을 동결 건조한 다음 증류수에서 중량변화를 시간당 측정하여 2일 정도 지속한 결과, 실시예 2의 분석 3과 유사한 결과를 보임으로써 안정한 하이드로젤을 형성하고 있음을 알 수 있었다.
분석 4.
실시예 1에서 합성한 히알루론산-ADH-리포산과 히알루론산을 화학원소분석기(XPS)로 분석한 결과 히알루론산-ADH-리포산의 C1s를 통하여 히알루론산에 ADH 및 리포산이 화학적으로 결합하여 새로운 탄소결합이 생성되었음을 확인하였고, 히알루론산-ADH-리포산에서는 새로이 S2p peak가 생성되어 황 결합의 존재를 확인함으로써 히알루론산에 리포산이 화학적으로 결합되어 있음을 확인하였다(도 4).
분석 5.
실시예 1에서 합성한 히알루론산-ADH-리포산, 히알루론산, 리포산을 용매에 녹여 1H-NMR을 분석한 결과
Figure 112011105529479-pat00074
2.7(CH2-S),
Figure 112011105529479-pat00075
2,215 그리고
Figure 112011105529479-pat00076
1.17(CH2-SH) ppm에서 피크 변화 및 새로운 피크 생성의 확인을 통하여 새로운 화학구조의 존재를 확인함으로써, 히알루론산에 리포산이 화학적으로 결합되어 있음을 알 수 있었다(도 5b).
실시예 4: 콘드로이틴 설페이트-키토산 하이드로젤
실시예 2의 히알루론산 대신에 콘드로이틴 설페이트를 사용하여 반응을 진행한 결과, 콘드로이틴 설페이트-키토산-리포산 생성물을 확인하였다. 실시예 1의 단계별 실험방법처럼, 합성된 콘드로이틴 설페이트-키토산-리포산과 콘드로이틴 설페이트-키토산-아크릴레이트와의 반응을 통하여 콘드로이틴 설페이트-키토산 하이드로젤을 합성하였다.
분석 1.
두 용액을 혼합한 후 일정한 시간 뒤 젤을 형성함을 육안으로 확인할 수 있었으며, 상온의 수용액에 100일 동안 침지한 이 후에도 젤이 분해되지 않고 형태를 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.
분석 2.
콘드로이틴 설페이트-키토산-리포산 샘플을 FTIR로 평가한 결과, 히알루론산-키토산-리포산의 샘플에서
Figure 112011043255555-pat00042
2930(S-CH2),
Figure 112011043255555-pat00043
1650(C=O),
Figure 112011043255555-pat00044
1550(N-H), 그리고
Figure 112011043255555-pat00045
710(C-S) 파장(cm-1)에서 각각 피크 변화 및 새로운 피크 생성을 확인함으로써 히알루론산 및 키토산과 리포산이 화학적으로 공유결합을 형성하고 있음을 관찰할 수 있었다(도 6a).
분석 3.
콘드로이틴 설페이트-키토산-리포산 하이드로젤을 동결 건조한 다음 증류수에서 중량변화를 시간당 측정하여 2일 정도 지속한 결과, 실시예 3의 분석 3과 유사한 결과를 보임으로써 안정한 하이드로젤을 형성하고 있음을 알 수 있었다.
분석 4.
실시예 1에서 합성한 콘드로이틴 설페이트-키토산-리포산과 콘드로이틴 설페이트를 화학원소분석기(XPS)로 분석한 결과, 콘드로이틴 설페이트-키토산-리포산의 C1s 및 S2p peak 변화를 통하여 콘드로이틴 설페이트에 키토산 및 리포산이 화학적으로 결합하여 새로운 탄소 및 황 결합이 생성되었음을 확인함으로써 콘드로이틴 설페이트에 키토산 및 리포산이 화학적으로 결합되어 있음을 확인하였다(도 7).
분석 5.
실시예 1에서 합성한 콘드로이틴 설페이트-키토산-리포산, 콘드로이틴 설페이트, 리포산을 용매에 녹여 1H-NMR을 분석한 결과
Figure 112011105529479-pat00046
2.7(CH2-S),
Figure 112011105529479-pat00047
2.22 그리고
Figure 112011105529479-pat00048
1.2(CH2-SH) ppm에서 피크 변화 및 새로운 피크 생성의 확인을 통하여 새로운 화학구조의 존재를 확인함으로써, 히알루론산에 리포산이 화학적으로 결합되어 있음을 알 수 있었다(도 8a).
실시예 5: 콘드로이틴 설페이트-ADH 하이드로젤
실시예 3의 히알루론산 대신에 콘드로이틴 설페이트를 사용하여 반응을 진행한 결과, 콘드로이틴 설페이트-ADH-리포산 생성물을 확인하였다. 실시예 1의 단계별 실험방법처럼, 합성된 콘드로이틴 설페이트-ADH-리포산과 콘드로이틴 설페이트-ADH-아크릴레이트와의 반응을 통하여 콘드로이틴 설페이트-ADH 하이드로젤을 합성하였다.
분석 1.
두 용액을 혼합한 후 일정한 시간 뒤 젤을 형성함을 육안으로 확인할 수 있었으며, 상온의 수용액에 100일 동안 침지한 이 후에도 젤이 분해되지 않고 형태를 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.
분석 2.
콘드로이틴 설페이트-ADH-리포산 샘플을 FTIR로 평가한 결과, 히알루론산-키토산-리포산의 샘플에서
Figure 112011043255555-pat00049
2940(S-CH2),
Figure 112011043255555-pat00050
1650(C=O), 그리고
Figure 112011043255555-pat00051
715(C-S) 파장(cm-1)에서 각각 피크 변화 및 새로운 피크 생성을 확인함으로써 히알루론산 및 ADH과 리포산이 화학적으로 공유결합을 형성하고 있음을 관찰할 수 있었다(도 6 b).
분석 3.
콘드로이틴 설페이트-ADH-리포산 하이드로젤을 동결 건조한 다음 증류수에서 중량변화를 시간당 측정하여 2일 정도 지속한 결과, 실시예 3의 분석 3과 유사한 결과를 보임으로써 안정한 하이드로젤을 형성하고 있음을 알 수 있었다.
분석 4.
실시예 1에서 합성한 콘드로이틴 설페이트-ADH-리포산과 콘드로이틴 설페이트를 화학원소분석기(XPS)로 분석한 결과 콘드로이틴 설페이트-ADH-리포산의 C1s peak 및 S2p peak 변화를 통하여 콘드로이틴 설페이트에 ADH 및 리포산이 화학적으로 결합하여 새로운 탄소 및 황 결합이 생성되었음을 확인함으로써 콘드로이틴 설페이트에 ADH 및 리포산이 화학적으로 결합되어 있음을 확인하였다(도 7).
분석 5.
실시예 1에서 합성한 콘드로이틴 설페이트-ADH-리포산, 콘드로이틴 설페이트, 리포산을 용매에 녹여 1H-NMR을 분석한 결과
Figure 112011105529479-pat00052
2.7(CH2-S),
Figure 112011105529479-pat00053
2,218 그리고
Figure 112011105529479-pat00054
1.17(CH2-SH) ppm에서 피크 변화 및 새로운 피크 생성의 확인을 통하여 새로운 화학구조의 존재를 확인함으로써, 콘드로이틴 설페이트에 ADH과 리포산이 화학적으로 결합되어 있음을 알 수 있었다(도 8b).
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의하여 제조된 아크릴레이트 화합물의 FT-IR 결과들을 나타낸다((a) 키토산-아크릴레이트 화합물, (b) 카복시메틸 셀룰로오스-아크릴레이트, (c) 히알루론산 및 콘드로이틴 설페이트-메타아크릴레이트).
실시예 6: 히알루론산 하이드로젤의 세포적합성 평가
실시예 2에서 합성한 히알루론산 하이드로젤 표면 위에 골세포를 in vitro 배양하여 3일 동안 관찰한 결과, 세포의 부착과 뻗음이 진행되고 세포증식성이 활발하게 진행되고 있음을 광학 현미경으로 확인할 수 있었다(도 10).
실시예 7: 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤의 세포적합성 평가
실시예 4에서 합성한 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤 표면 위에 골세포를 in vitro 배양하여 3일 동안 관찰한 결과, 세포의 부착과 뻗음이 진행되고 세포증식성이 활발하게 진행되고 있음을 광학 현미경으로 확인할 수 있었다(도 11).
이상의 설명은 본 발명을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 사상 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의하여 제조된 리포산이 결합된 키토산 및 히알루론산 화합물의 FT-IR 결과들을 나타낸다((a) 키토산-리포산, (b) 히알루론산-키토산-리포산, (c) 히알루론산-ADH-리포산).
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의하여 제조된 리포산이 결합된 키토산 화합물의 XPS 결과들을 나타낸다((a) C1s, (b) S2p).
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의하여 제조된 리포산이 결합된 키토산 화합물의 1H-NMR 결과들을 나타낸다(키토산, 리포산, 키토산-리포산).
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의하여 제조된 리포산이 결합된 히알루론산 화합물의 히알루론산의 XPS 결과들을 나타낸다((a) C1s, (b) S2p).
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의하여 제조된 리포산이 결합된 히알루론산 화합물의 1H-NMR 결과들을 나타낸다((a) 히알루론산, 키토산, 리포산, 히알루론산-키토산-리포산, (b) 히알루론산, ADH, 리포산, 히알루론산-ADH-리포산).
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의하여 제조된 리포산이 결합된 콘드로이틴 설페이트 화합물의 FT-IR 결과들을 나타낸다((a) 콘드로이틴 설페이트-키토산-리포산, (b) 콘드로이틴 설페이트-ADH-리포산).
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의하여 제조된 리포산이 결합된 콘드로이틴 설페이트 화합물 XPS 결과들을 나타낸다((a) C1s, (b) S2p).
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의하여 제조된 리포산이 결합된 콘드로이틴 설페이트 화합물의 1H-NMR 결과들을 나타낸다((a) 콘드로이틴 설페이트-키토산-리포산, (b) 콘드로이틴 설페이트-ADH-리포산).
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의하여 제조된 아크릴레이트 화합물의 FT-IR 결과들을 나타낸다((a) 키토산-아크릴레이트 화합물, (b) 카복시메틸 셀룰로오스-아크릴레이트, (c) 히알루론산 및 콘드로이틴 설페이트-메타아크릴레이트).
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의하여 제조된 히알루론산-키토산 하이드로젤의 표면에 골세포를 배양한 결과의 광학현미경 이미지이다((a) 1일째 40배율, (b) 1일째 100배율, (c) 7일째 100배율, (d) 7일째 200배율).
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의하여 제조된 콘드로이틴 설페이트 하이드로젤의 표면에 골세포를 배양한 결과의 광학현미경 이미지이다((a) 1일째 40배율, (b) 1일째 100배율, (c) 7일째 100배율, (d) 7일째 200배율).

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 리포산의 카복시 작용기와 아민 작용기를 가진 생체적합성 고분자 화합물의 결합에 의하여 생성된 제1 생체적합성 고분자 화합물과, 불포화 탄화수소 작용기를 가지는 제2 생체적합성 고분자 화합물 사이의 마이클 형(Michael type) 첨가반응에 의하여 생성된 고분자 화합물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 마이클 형 첨가반응에 의하여 생성된 고분자 화합물은 하이드로젤 또는 필름인 것을 특징으로 하는 고분자 화합물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 아민 작용기를 가진 생체적합성 고분자 화합물은 화합물 자체에 아민 작용기를 가지는 화합물과 아민 작용기를 화합물에 화학적으로 결합시켜 생성된 아민 화합물로 구성된 그룹 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 고분자 화합물.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 불포화 탄화수소 작용기는 메타아크릴레이트, 아크릴레이트 혹은 탄화수소 중간에 하나 혹은 여러 개의 불포화기를 갖는 것을 특징으로 하는 고분자 화합물.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 아민 작용기를 가진 생체적합성 고분자 화합물은 펩타이드, 단백질, 키토산, 아미노 당, 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol))로 구성된 그룹 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 고분자 화합물.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 아민 작용기를 가지는 생체적합성 고분자 화합물은 아민 작용기의 화합물을 화학적으로 결합시켜 생성된 콘드로이틴 설페이트, 헤파린, 알긴산, 덱스트란, 더마탄 설페이트, 히알루론산, 카복시메틸 셀룰로오스, 글루카곤으로 구성된 천연고분자 및 폴리에틸렌옥사이드, 플루로닉 화합물, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리비닐알코올 및 폴리비닐리돈으로 구성된 아민 작용기를 가지는 합성 고분자로 구성된 그룹 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 고분자 화합물.
  8. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 제1 생체적합성 고분자 화합물의 용액 혹은 상기 제2 생체적합성 고분자 화합물의 용액 중 적어도 하나의 용액에 세포, 약물, 성장인자, 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 생체활성 물질을 추가한 다음, 상기 두 용액을 혼합함으로써 마이클 형(Michael type) 첨가반응에 의하여 생성된 고분자 화합물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 생성된 고분자 화합물은 하이드로젤 또는 필름 형태로서, 상기 생체활성 물질을 서방출시키는 것을 특징으로 하는 고분자 화합물.
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