KR102437315B1

KR102437315B1 - 하이브리드 하이드로겔 및 이의 생의학적 용도

Info

Publication number: KR102437315B1
Application number: KR1020200144551A
Authority: KR
Inventors: 박기동; 황진영; 이시민; 티 프엉 레
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2020-11-02
Filing date: 2020-11-02
Publication date: 2022-08-30
Also published as: KR20220059217A; KR102437315B9

Abstract

본 발명은 기계적 물성이 우수한 하이브리드 하이드로겔 및 이의 생의학적 용도를 제공한다.

Description

하이브리드 하이드로겔 및 이의 생의학적 용도 {HYBRID HYDROGEL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS THEREOF}

본 발명은 하이브리드 하이드로겔 및 이의 생의학적 용도에 관한 것이다.

물리적 또는 화학적으로 가교 결합된 중합체 네트워크인 하이드로겔은 천연 세포 외 매트릭스를 모방할 수 있으며, 광범위한 생의학 응용을 위한 혁신적인 재료로 꾸준한 개발이 진행되고 있다. 특히, 인시튜(in situ) 형성 주입형 하이드로겔은 손쉬운 약물 및 세포를 담지하고, 최소 침습적 이식이 가능하며 불규칙한 상처부위를 충진 할 수 있다는 장점을 가진다. 물리적 가교 및 화학적 가교 등 in situ 형성을 위한 다양한 가교 전략 중에서, 효소 매개 가교는 온화한 반응 조건에서의 하이드로겔화를 위하여 큰 장점을 나타낸다. 특히 홀스래디쉬 과산화효소(HRP, Horseradish peroxidase)-매개 가교 결합 반응은 in situ에서 하이드로겔을 유도하기 위해 집중적으로 연구되었다. 트랜스글루타미나제, 티로시나제, 포스파타제, 라이실옥시다제와 같은 기존의 효소 가교 시스템과 비교하여, HRP는 빠른 젤화, 높은 가교 효율에서의 장점을 갖는다.

이와 같이 개발된 하이드로겔은 우수한 생체적합성으로 인해 조직 재생, 약물 전달 및 생체 접착제 등으로 광범위하게 응용된다. 효소 가교 시스템을 이용한 in situ 형성 하이드로겔은 끊임없이 개발되어 왔으나, 천연고분자만을 이용한 하이드로겔은 탄성, 인장력, 접착력과 같은 의료용 생체접착제로서 요구되는 인자들에 한계를 나타낸다. 이를 극복하기 위하여 우수한 생체적합성을 갖는 천연고분자(Gelatin, hyaluronic acid, alginate 등)와 탄성, 인장력, 접착력과 같은 인자들을 보완할 수 있는 합성고분자(Poly-ethyleneglycol, PEG 혹은 PEO-PPO-PEO, Tetronic)의 하이브리드를 통하여 생체접착제 개발이 진행되고 있다.

다양한 생체고분자와 합성고분자의 하이브리드화를 통한 개발이 이루어지고 있지만, 조절 가능한 합성고분자의 함량 및 분자량 조절에 대한 보다 세부적인 조건에서의 연구개발은 거의 이루어지지 않은 상황이다. 천연고분자와 합성고분자의 하이브리드를 통한 생체접착제 개발에서, 합성고분자의 다양한 조건 조정을 통해 재료의 우수한 특성을 연구개발 하는 것은 반드시 필요한 과정이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 기계적 물성이 우수한 하이브리드 하이드로겔 및 이의 생의학적 용도를 제공하는 것이다.

다만, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 2 이상의 제1 반응기를 함유하는 제1 고분자; 및 하기 화학식 1로 표시되는 반복단위를 포함하는 주쇄 및 상기 주쇄의 양 말단에 결합되는 제2 반응기를 함유하는 제2 고분자;를 포함하고, 상기 제1 반응기와 상기 제2 반응기의 반응에 의하여 상기 제1 고분자와 상기 제2 고분자가 가교되고, 상기 제2 고분자의 중량평균분자량은 1,000 이상 20,000 이하인 하이브리드 하이드로겔이 제공된다:

[화학식 1]

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 하이브리드 하이드로겔을 포함하는 조직 접착 및 지혈용 소재, 조직재생 및 충진용 임플란트 소재 또는 생리활성물질 또는 약물 전달체용 담체가 제공된다.

본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리드 하이드로겔은 탄성 계수, 압축 강도, 인장력 및 접착력이 높아, 기계적 강도 및 조직 접착력과 같은 물성이 우수할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리드 하이드로겔은 약물 및 단백질 방출능이 우수할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리드 하이드로겔은 세포 부착성 및 친화성이 우수하여 생체적합성이 우수할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리드 하이드로겔을 이용하여 조직 접착 또는 지혈용 소재; 조직공학용 주입형 골격; 단백질, DNA, 성장인자, 세포 등과 같은 약물의 서방형 약물 전달체; 조직충진제; 상처 치료; 또는 장유착 방지 등과 같이 다양한 생의학적 용도로 적용할 수 있다.

본 발명의 효과는 상술한 효과로 한정되는 것은 아니며, 언급되지 아니한 효과들은 본원 명세서 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리드 하이드로겔의 제조를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 주사기의 단면을 도식화한 본 발명의 하이드로겔 제조 모식도이다.
도 3은 실시예 1-1 내지 1-3, 비교예 1 및 비교예 2-1 내지 2-3의 하이드로겔의 물성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 1-1 내지 1-3 및 비교예 3-1 내지 3-3의 하이드로겔의 물성을 나타낸 그래프이다.
도 5은 실시예 2-2 및 비교예 4-1 내지 4-2의 하이드로겔의 물성을 나타낸 그래프이다.
도 6는 실시예 2-1 내지 2-3, 비교예 1 및 비교예 2-3의 하이드로겔의 물성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 3-1 내지 3-3의 하이드로겔의 물성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 4-1 내지 4-3의 하이드로겔의 물성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 실시예 5-1 내지 5-3의 하이드로겔의 물성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 실시예 6-1 내지 6-3의 하이드로겔의 물성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 실시예 7-1 내지 7-3의 하이드로겔의 물성을 나타낸 그래프이다.
도 12는 실시예 1-1 내지 1-3, 실시예 2-1 내지 2-3, 비교예 1 및 비교예 2-1 내지 2-3의 하이드로겔에서 배양된 C2C12의 WST-1 분석을 분석을 사용하여 측정한 세포 부착력 그래프이다.
도 13은 실시예 1-1 내지 1-3, 비교예 1 및 비교예 2-1 내지 2-3의 하이드로겔의 시간에 따른 약물 누적 방출 백분율 그래프이다.
도 14는 실시예 2-1 내지 2-3, 비교예 1 및 비교예 2-3의 하이드로겔의 시간에 따른 약물 누적 방출 백분율 그래프이다.
도 15는 실시예 2-3의 하이드로겔의 덱사메타손 또는 보빈 세럼 알부민의 시간에 따른 약물 누적 방출 백분율 그래프이다.

본 명세서에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "(메트)아크릴레이트"는 아크릴레이트 및 메타크릴레이트를 통칭하는 의미로 사용된다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"는 "A 및 B, 또는 A 또는 B"를 의미한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 화합물의 “중량평균분자량” 및 “수평균분자량”은 그 화합물의 분자량과 분자량 분포를 이용하여 계산될 수 있다. 구체적으로, 1 ml의 유리병에 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF)와 화합물을 넣어 화합물의 농도가 1 wt%인 샘플 시료를 준비하고, 표준 시료(폴리스티렌, polystyrene)와 샘플 시료를 필터(포어 크기가 0.45㎛)를 통해 여과시킨 후, GPC 인젝터(calibration) 곡선과 비교하여 화합물의 분자량 및 분자량 분포를 얻을 수 있다. 이 때, 측정 기기로 Infinity II 1260(Agilient 社)를 이용할 수 있고, 유속은 1.00 mL/min, 컬럼 온도는 40.0 ℃로 설정할 수 있다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 2 이상의 제1 반응기를 함유하는 제1 고분자; 및 하기 화학식 1로 표시되는 반복단위를 포함하는 주쇄 및 상기 주쇄의 양 말단에 결합되는 제2 반응기를 함유하는 제2 고분자;를 포함하고, 상기 제1 반응기와 상기 제2 반응기의 반응에 의하여 상기 제1 고분자와 상기 제2 고분자가 가교되고, 상기 제2 고분자의 중량평균분자량은 1,000 이상 20,000 이하인 하이브리드 하이드로겔이 제공된다.

[화학식 1]

본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리드 하이드로겔은 탄성 계수, 압축 강도, 인장력 및 접착력이 높아, 기계적 강도 및 조직 접착력과 같은 물성이 우수할 수 있고, 약물 및 단백질 방출능이 우수할 수 있고, 세포 부착성 및 친화성이 우수하여 생체적합성이 우수할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 하이브리드 하이드로겔은 2 이상의 제1 반응기를 함유하는 제1 고분자를 포함한다. 상기 제1 고분자는 젤라틴, 키토산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 알지네이트, 콜라겐, 알부민, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 비트로넥틴, 히알루론산, 피브리노겐, 카라기난, 아가로스 및 다지-고분자 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 하이드로겔을 형성할 수 있는 고분자로서 해당 기술분야에서 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않는다.

상기 젤라틴은 돼지 껍질 또는 냉수어종 껍질(cold water fish skin)로부터 유래한 것일 수 있다.

상기 제1 고분자는 2 이상의 제1 반응기를 함유하며, 제1 반응기는 다른 고분자의 반응기와 반응하여 결합하는 반응 사이트일 수 있다. 따라서, 제1 고분자에 포함된 제1 반응기의 수는 많을수록 가교도가 증가할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 반응기는 페놀 유도체, 티올, (메트)아크릴아미드, 시클로덱스트린, N-히드록시석신이미드, 퓨란 및 도파 중 어느 하나일 수 있다. 상기 페놀 유도체는 페놀, 티라민, 하이드록시페닐아세트산, 하이드록시페닐프로피온산 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 하이브리드 하이드로겔은 하기 화학식 1로 표시되는 반복단위를 포함하는 주쇄 및 상기 주쇄의 양 말단에 결합되는 제2 반응기를 함유하는 제2 고분자를 포함한다.

[화학식 1]

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제2 고분자는 선형 구조일 수 있다. 제2 고분자가 선형 구조인 경우, 하이브리드 하이드로겔의 탄성 계수, 압축 강도, 인장력 및 접착력이 높아 기계적 강도가 우수할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제2 고분자는 폴리에틸렌글리콜일 수 있다. 제2 고분자가 탄소 수 3개 이상의 반복단위를 포함하는 경우, 용해도가 낮아져 하이드로겔로 적합하지 않을 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제2 고분자의 중량평균분자량은 1,000 이상 20,000 이하, 4,000 이상 20,000 이하, 5,000 이상 20,000 이하, 8,000 이상 20,000 이하 또는 10,000 이상 20,000 이하일 수 있다. 상기 제2 고분자의 중량평군분자량을 조절함으로써, 제조되는 하이브리드 하이드로겔의 탄성 계수, 압축 강도, 인장력 및 접착력 등의 기계적 물성과 조직 접착력 등의 물성을 용이하게 제어할 수 있다. 또한, 상기 제2 고분자의 중량평균분자량을 1,000 이상 20,000 이하, 4,000 이상 20,000 이하, 5,000 이상 20,000 이하, 8,000 이상 20,000 이하 또는 10,000 이상 20,000 이하로 조절하는 경우, 하이브리드 하이드로겔의 탄성 계수, 압축 강도, 인장력 및 접착력이 높아, 기계적 강도 및 조직 접착력과 같은 물성이 우수할 수 있고, 생체 내에서 축적 없이 분해되며 무독성일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제2 고분자는 양 말단에 결합되는 제2 반응기를 포함할 수 있다. 즉, 제2 고분자는 2개의 제2 반응기를 포함할 수 있고, 각각의 제2 반응기는 다른 고분자의 반응기와 반응하여 결합하는 반응 사이트일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제2 반응기는 페놀 유도체, 바이닐 설폰, (메트)아크릴레이트, 말레이미드, 아다만테인, 아민, 도파 중 어느 하나일 수 있다. 상기 페놀 유도체는 페놀, 티라민, 하이드록시페닐아세트산, 하이드록시페닐프로피온산 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제2 반응기는 상기 제1 반응기와 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 반응기와 상기 제2 반응기의 반응에 의하여 상기 제1 고분자와 상기 제2 고분자가 가교된다. 상기 제1 반응기와 제2 반응기의 종류에 따라 상기 반응의 종류도 달라질 수 있으며, 반응의 조건 및 촉매와 같은 반응 환경도 달라질 수 있다. 반응의 예를 들면 다음과 같다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 반응기 및 상기 제2 반응기는 페놀 유도체이고, 상기 제1 고분자 및 상기 제2 고분자는 홀스래디쉬 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase) 및 과산화수소 첨가에 의하여 인시튜(in situ) 가교된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 반응기 및 제2 반응기가 페놀 유도체인 경우, 각 페놀 유도체의 벤젠 고리 간에 결합이 형성될 수 있다. 수성 매질에서, 과산화수소는 페놀이 풍부한 중합체 사이에 홀스래디쉬 퍼록시데이즈-매개 가교 반응을 유도하여 하이드로겔을 형성할 수 있다.

도 1에 본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리드 하이드로겔의 제조를 개략적으로 나타내었다.

도 1을 참조하면, 제1 고분자(파란색) 및 제2 고분자(주황색)는 각각 제1 반응기 및 제2 반응기로 페놀 유도체를 포함하고 있으며, 홀스래디쉬 퍼록시데이즈 및 과산화수소 첨가에 의하여 in situ 가교되고, 제1 반응기 및 제2 반응기의 벤젠 고리 간의 결합이 형성된 것을 확인할 수 있다.

상기 하이브리드 하이드로겔을 형성함에 있어, 첨가하는 홀스래디쉬 퍼록시데이즈 및 과산화수소의 농도를 조절하여 하이드로겔의 젤화 시간, 분해 시간, 기계적 강도, 팽윤도 또는 함수율과 같은 물리화학적 성질을 조절할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 반응기는 티올이고 상기 제2 반응기는 바이닐 설폰이고, 상기 제1 고분자 및 상기 제2 고분자는 상기 티올과 상기 바이닐 설폰의 반응에 의하여 가교된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 반응기가 티올이고, 상기 제2 반응기가 바이닐 설폰인 경우 제1 고분자와 제2 고분자는 단순 혼합으로 티올 및 바이닐 설폰의 마이클 첨가(Michael addition) 반응을 통해 가교될 수 있다.

상기 마이클 첨가 반응은 pH 6 내지 8의 조건에서 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 pH 7 의 중성 조건에서 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 반응기는 (메트)아크릴아미드이고 상기 제2 반응기는 (메트)아크릴레이트이고, 상기 제1 고분자 및 상기 제2 고분자는 상기 (메트)아크릴아미드와 상기 (메트)아크릴레이트의 반응에 의하여 가교된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 반응기가 (메트)아크릴아미드이고, 제2 반응기가 (메트)아크릴레이트인 경우, 제1 고분자와 제2 고분자는 광개시제의 존재 하에 광 조사로 (메트)아크릴아미드 및 (메트)아크릴레이트의 반응을 통해 광 가교될 수 있다.

상기 광개시제로는 벤조페논계 개시제, 아조계 개시제 등을 사용할 수 있으며, 상기 열거한 것으로 제한되지 않는다.

상기 광 조사는 자외선 조사, 적외선 조사, E-beam 조사 등일 수 있으며, 약 15 mW/cm² 미만의 광량을 갖는 광을 조사하는 것일 수 있다. 상기 범위 내의 광량으로 광을 조사하는 경우, 세포를 손상시키지 않고 가교가 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 반응기는 티올이고 상기 제2 반응기는 티올이고, 상기 제1 고분자 및 상기 제2 고분자는 상기 티올 간의 반응에 의하여 가교된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 반응기 및 상기 제2 반응기가 반응하여 이황 결합(S-S)을 형성함으로써 가교하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 반응기는 티올이고 상기 제2 반응기는 말레이미드이고, 상기 제1 고분자 및 상기 제2 고분자는 상기 티올과 상기 말레이미드의 반응에 의하여 가교된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 반응기는 시클로덱스트린이고 상기 제2 반응기는 아다만테인이고, 상기 제1 고분자 및 상기 제2 고분자는 상기 시클로덱스트린과 상기 아다만테인의 반응에 의하여 가교된 것일 수 있다. 구체적으로, 호스트-게스트 상호작용을 통해 결합을 형성함으로써 제1 고분자 및 제2 고분자가 가교된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 반응기는 N-히드록시석신이미드이고 상기 제2 반응기는 아민이고, 상기 제1 고분자 및 상기 제2 고분자는 상기 N-히드록시석신이미드와 상기 아민의 반응에 의하여 가교된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 반응기는 알데하이드이고 상기 제2 반응기는 아민이고, 상기 제1 고분자 및 상기 제2 고분자는 상기 알데하이드와 상기 아민의 반응에 의하여 가교된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 반응기는 퓨란이고 상기 제2 반응기는 말레이미드이고, 상기 제1 고분자 및 상기 제2 고분자는 상기 퓨란과 상기 말레이미드의 반응에 의하여 가교된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 반응기 및 상기 제2 반응기는 도파이고, 상기 제1 고분자 및 상기 제2 고분자는 상기 도파 간의 반응에 의하여 가교된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 고분자 및 상기 제2 고분자는 티로시나아제 존재 하에 상기 도파 간의 반응에 의하여 가교된 것일 수 있다.

상기 제1 반응기와 상기 제2 반응기의 반응은 체내에서 일어나는 반응일 수 있으며, 독성이 없는 생체적합성이 우수한 반응일 수 있다. 또한, 반응 완료 시간이 수초 내지 수분으로 반응 속도가 매우 빠를 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 고분자는 제1 반응기가 제1 고분자에 직접 연결된 것일 수 있다. 구체적으로, 제1 반응기가 제1 고분자의 주쇄에 직접 연결된 것일 수 있다. 즉, 별도의 링커(linker) 고분자로 제1 반응기가 제1 고분자에 연결된 것이 아닐 수 있다. 제1 반응기가 제1 고분자에 직접 연결되어 가교되는 경우, 하이브리드 하이드로겔의 탄성 계수, 압축 강도, 인장력 및 접착력이 높아, 기계적 강도 및 조직 접착력과 같은 물성이 우수할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 반응기 간의 반응에 의하여 상기 제1 고분자 간이 더 연결되고, 상기 제2 반응기 간의 반응에 의하여 상기 제2 고분자 간이 더 연결되는 것일 수 있다. 즉, 제1 고분자 간에도 결합이 형성될 수 있으며, 제2 고분자 간에도 결합이 형성되어 가교됨으로써 하이브리드 하이드로겔을 형성하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 고분자와 상기 제2 고분자의 중량비는 3:1 내지 1:3, 2:1 내지 1:3, 또는 1:1 내지 1:3일 수 있다. 상기 제1 고분자와 상기 제2 고분자의 중량비를 조절함으로써, 제조되는 하이브리드 하이드로겔의 탄성 계수, 압축 강도, 인장력 및 접착력 등의 기계적 물성과 조직 접착력 등의 물성을 용이하게 제어할 수 있다. 또한, 상기 제1 고분자와 상기 제2 고분자의 중량비를 상기 범위 내로 조절하는 경우, 하이브리드 하이드로겔의 탄성 계수, 압축 강도, 인장력 및 접착력이 높아, 기계적 강도 및 조직 접착력과 같은 물성이 우수할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리드 하이드로겔은 추가로 페놀, 아닐린, 아민 또는 티올 그룹을 지닌 생리활성 물질을 포함하여 in situ 가교 형성될 수 있고, 상기 생리활성 물질은 티로신(tyrosine)을 포함하는 펩타이드일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 효소가 고정화된 지지체를 제조하는 단계; 제1 고분자 및 제2 고분자를 과산화수소 존재 하에서 상기 지지체와 접촉시켜 가교시키는 단계; 및 상기 지지체를 분리하여 하이드로겔을 수득하는 단계를 포함하는 하이드로겔의 제조방법이 제공된다.

상기 제1 고분자 및 상기 제2 고분자에 관한 구체적인 내용은 전술한 바에 따를 수 있다.

효소는 특이적 반응성 및 높은 선택성, 그리고 우수한 반응효율로 인해 다양한 분야의 화학반응 촉매로서 이용되어 왔다. 하지만 효소의 대량합성 및 정제가 어렵고 가격이 비싸며, 반응조건과 보관에 따른 효소활성의 저하가 지적되어 왔다. 또한, 이러한 동식물 유래의 HRP와 같은 효소들을 함유하고 있어 체내에 주입되었을 때 면역 반응 등과 같은 생체 안전성과 관련된 의문점을 야기할 수 있다. 이를 개선하기 위해 효소를 나노/마이크로 미립구 등 다양한 형태 및 종류의 지지체 표면에 화학적으로 고정화하여 응용목적에 따른 화학반응에 이용하는 기술에 관한 연구가 많이 진행되었다. 효소의 표면 고정화를 통해 제조된 효소-지지체(enzyme immobilized substrates)는 화학반응 후 쉽게 분리가 가능하고 재활용이 가능하며, 효소의 활성을 유지하는 동시에 저장 안정성을 높일 수 있다고 보고되어 있다. 따라서 본 발명의 발명자들은 이러한 효소의 표면 고정화 기술을 통해 하이드로겔을 제조하는 방법에 대해 연구하던 중, 반응 대상인 고분자와 효소가 고정화된 지지체를 과산화수소 존재 하에서 반응시킨 후 지지체를 분리하면 효소가 포함되지 않은 in situ 형성 하이드로겔을 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 이를 통하여 효소로 인한 면역 반응과 같은 체내 안전성 문제점을 극복할 수 있어 하이드로젤의 생의학적 적용 범위를 확장시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 지지체에 고정화되는 효소는 홀스래디쉬 퍼록시데이즈일 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 지지체는 미세 입자, 다공성 스폰지 또는 다공성 시트 형태일 수 있으며, 미세 입자형 지지체는 비다공성 또는 다공성 형태이며, 유리입자, 금속입자, 고분자입자 및 이들의 혼합입자로 이루어진 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 혼합입자는 금속이 함유된 고분자입자일 수 있으며, 상기 금속이 함유된 고분자입자는 철을 함유할 수 있다.

또한, 상기 철이 함유된 고분자 입자는 에폭시기를 갖는 단량체와 철화합물을 공중합하여 제조한 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 효소는 크로마토그래피와 면역분석법 분야에서 알려진 기술을 이용하여 고상(solid phase)에 고정화될 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 효소가 고정화된 지지체를 제조하는 단계는, 지지체의 표면을 개질하여 관능기를 도입하는 표면개질 단계; 및 상기 관능기에 효소를 결합시키는 단계를 포함하며, 이때 상기 관능기는 카르복실기, 아민기, 하이드록실기, 알데히드기, 에폭시기, 티올기, 말레이미드기, 카보네이트 에스터기, 시아노기, 아크릴기, 아세틸렌기 또는 디아조기일 수 있다.

상기 표면개질은 3,4-디하이드록시 하이드로신남산, 도파민, 클로로아세틸카테콜, 아미노메틸카테콜, 디옥시에피네프린, 디하이드록시벤조히드라지드, 카페익산 펜에틸에스터 및 히루테논으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 카테콜 유도체를 사용하여 관능기를 도입할 수 있지만, 상기 열거된 카테콜 유도체와 구조적으로 유사한 화합물을 사용할 경우 화합적 결합의 동일함에 비춰볼 때 이에 한정하는 것은 아니다.

또한, 상기 표면개질은 3-아미노프로필 트리에톡시실란, 트리메톡(7-옥텐-1-일)실란, 비닐트리메톡시실란, 3-트리메톡시실릴-1-프로판티올, 3-아미노프로필 트리메톡시실란, 아미노에틸 트리메톡시실릴 프로필아민, 트리에톡시비닐실란, 이소시아네이토프로필 트리에톡시실란, 시아노에틸 트리에톡시실란, 머캡토프로필 트리에톡시실란 및 트리에톡시실릴프로필 디에탄올아민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 실란 유도체를 사용하여 관능기를 도입할 수 있지만, 상기 열거된 실란 유도체와 구조적으로 유사한 화합물을 사용할 경우 화합적 결합의 동일함에 비춰볼 때 이에 한정하는 것은 아니다.

그러나, 이미 표면에 상기 관능기를 포함하고 있는 고분자 비드인 폴리스티렌 비드, SiO₂ 비드 등의 미세 지지체를 사용하는 경우에는 상기 별도의 표면개질 단계 없이 효소의 결합이 가능함은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

상기 도입된 관능기는 EDC(N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), NHS(N-hydroxysuccinimide), 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 이소티오시아네이트(diisothiocyanate), 이소시아네이트(isocyanate), 디하이드록시숙시이미드(dihydoxysuccinimide) 및 아비딘/바이오틴(avidin/biotin)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 커플링제(coupling agent)를 사용하여 활성화될 수 있으며, 상기 활성화된 관능기에 효소가 결합하여 효소가 미세 입자형 지지체에 고정화된다.

또한 본 발명의 실시예에서, 철입자가 함유된 고분자입자의 경우 표면에 에폭시 관능기가 존재하여 추가적인 과정없이 효소를 바로 첨가함으로써 효소가 화학적으로 표면 고정화된 고분자입자가 제조된다.

본 발명의 다른 일실시예에서, 상기 고정화된 효소의 농도는 효소농도가 0.001 내지 10 mg/g, 0.1 내지 10 mg/g, 또는 0.5 내지 7 mg/g 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이때, 상기 결합한 효소의 활성을 높이기 위하여 다관능기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리비닐알콜(PVA) 또는 폴리아크릴산(PAA)이 스페이서(spacer)로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 고분자와 지지체를 접촉 및 분리시키는 공정은 효소가 고정화된 지지체 일방에 존재하는 고분자에 압력을 가하여 고분자를 지지체의 타방으로 통과시키는 방법으로 수행될 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 방법은 주사기 키트(syringe kit) 또는 상기 주사기 끝에 스프레이 가능하도록 한 스프레이 키트(spray kit)를 통해 수행될 수 있다. 보다 더 구체적으로, 상기 주사기 키트 또는 스프레이 키트 내부의 고분자가 효소가 고정화된 지지체를 통과하며 in situ 가교되어 압출되는 것일 수 있다.

도 2는 상기 주사기의 단면을 도식화한 본 발명의 하이드로겔 제조 모식도이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 과산화수소는 제1 고분자 및 제2 고분자와 함께 존재하거나, 이중 주입식 주사기 키트 또는 스프레이 키트를 사용하여 고분자와 별도로 존재할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 주사기 키트 또는 스프레이 키트와 테프론 성형(teflon mold)을 이용하여 쉬트 또는 디스크 형태의 하이드로겔을 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법을 위해, 내공간을 갖는 실린더에 피스톤이 내장되고 피스톤의 슬라이드 작동에 의하여 배출력을 발생시켜 주사바늘을 통하여 약액을 배출토록 되는 주사기에 있어서, 실린더의 주사바늘쪽 내부에 효소가 고정화된 지지체가 구비되며, 측쇄에 페놀 또는 아닐린 관능기를 갖는 고분자가 실린더에 충진된 것인 하이드로겔 제조용 주사기가 제공된다.

상기 방법에 의해 제조된 하이드로겔은 효소를 포함하지 않을 수 있고, 이에 따라 효소로 인한 면역 반응과 같은 체내 안전성 문제점을 극복할 수 있어 하이드로겔의 생의학적 적용 범위를 확장시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리드 하이드로겔은 우수한 조직 접착성을 가져 조직 접착제(bioadhesive) 또는 지혈제(hemostats); 조직공학용 주입형 골격; 단백질, DNA, 성장인자, 세포 등과 같은 약물의 서방형 약물 전달체; 조직충진제; 상처 치료; 또는 장유착 방지 등의 다양한 생의학적 응용이 가능하다.

보다 상세하게는, 본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리드 하이드로겔은 조직 실란트, 조직 접착 및 지혈용 소재에 포함될 수 있다. 조직 접착 및 지혈용 소재로 사용되기 위하여, i) 사용의 간편함, ii) 멸균 가능, iii) 적당한 점도, iv) 낮은 발열 특성, v) 짧은 세팅 시간, vi) 강한 접착력, vii) 낮은 독성, viii) 시스템의 무독성, ix) 적당한 분해 시간이 요구되며, 본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리드 하이드로겔은 이러한 조직 접착 소재로서의 요구 조건을 만족시킬 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리드 하이드로겔은 생체적합성이 우수하고 신속한 in situ 가교 반응을 통해 가교할 수 있으며, 물리적 가교가 아닌 화학적 가교로 인하여 하이드로겔이 형성되므로 기계적 강도가 우수하고 효소 또는 단백질에 의해 분해될 수 있는 고분자를 사용하므로 생분해성이 우수하고, 가교 농도 및 제1 고분자와 제2 고분자의 혼합 비율을 조절하여 분해 속도의 조절도 가능하다.

상기 조직 접착 및 지혈용 소재는 혈관 외과 영역을 포함한 뇌신경 외과수술; 뼈의 접착을 포함한 정형외과 수술; 열상 환자의 지혈; 대퇴동맥의 봉합; 백내장 절개 봉합, 연골 및 관절연골 치유; 피부 접합; 장기/분비선 절개면 지혈; 위장관 분합; 및 힘줄 및 인대 치유로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 적용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리드 하이드로겔은 조직공학용 유효 골격(scaffold)으로서의 인공 세포외 매트릭스로 사용될 수 있다. 이때, 하이드로겔의 분해 속도는 젤 내부에 있는 세포의 분화 및 성장에 매우 중요한 역할을 하므로, 적절한 분해 속도 조절이 필수적이다.

예를 들어, 젤라틴은 세포가 분비하는 매트릭스 메탈로프로테나제(MMP) 특히, MMP-2, MMP-9에 의하여 특이적으로 분해된다. 젤라틴을 함유하는 하이드로겔 매트릭스는 이러한 효소들에 의해 분해가 되고 다시 세포가 분비하는 세포외 매트릭스(ECM)로 재형성되면서 하이드로겔 내부의 세포들이 효과적으로 성장하고 분화하는데 효과적이다.

또한, 조직공학용 유효 골격으로 사용되는 하이드로겔의 매트릭스 경직도(stiffness) 역시 젤 내부에 있는 세포의 성장과 분화에 많은 영향을 미친다. 또한 각 세포마다 적절한 매트릭스 경직도가 요구된다. 예를 들어, 골세포는 경직도가 딱딱한 매트릭스에서 잘 성장하는 것으로 나타났으며, 연조직 세포 예를들어, 섬유아세포, 근육모세포 등은 부드러운 매트릭스에서 잘 성장하는 것으로 알려지고 있다. 효소 반응을 이용한 시스템에서는 과산화수소의 양을 조절함으로써 쉽게 하이드로겔의 가교를 조절할 수 있으며, 따라서 하이드로겔의 경직도를 쉽게 조절할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 하이브리드 하이드로겔을 포함하는 조직재생 및 충진용 임플란트 소재가 제공된다.

상기 임플란트 소재는 연골 재생(cartilage regeneration), 골 재생(bone regeneration), 치주골 재생, 피부 재생(skin regeneration), 심근 재생(cardiac tissue regeneration), 인공 수정체(artificial intraocular lens), 척수 신경 재생(spinal cord regeneration), 뇌신경 재생(cranial regeneration), 성대 재생 및 충진제(vocal regeneration and augmentation), 유착 방지막 (adhesion barrier), 요실금 치료제(urinary incontinence treatment), 주름 제거(wrinkles removal)용 충진제, 화상 치료제(wound dressing), 조직 충진제(tissue augmentation) 및 척추 추간판 치료제(intervertebral disc treatment)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 적용될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 하이브리드 하이드로겔을 포함하는 생리활성물질 또는 약물 전달체용 담체가 제공된다.

상기 생리활성물질 또는 약물은, 펩타이드 또는 단백질 의약품; 항균제; 항암제; 및 항염증제;로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

상기 펩타이드 또는 단백질 의약품으로는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 전환 성장인자(transforming growth factor; TGF), 골형성 성장인자(bone morphogenetic protein; BMP), 인간성장호르몬(hGH), 돼지성장호르몬(pGH), 백혈구성장인자(G-CSF), 적혈구성장인자(EPO), 대식세포성장인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 상피세포 성장인자(EGF), 혈소판유도성장인자(PDGF), 인터페론-α,β,γ, 인터루킨-2(IL-2), 칼시토닌, 신경성장인자(NGF), 성장호르몬 방출인자, 엔지오텐신, 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 작동약(LHRH agonist), 인슐린, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(TRH), 엔지오스태틴, 엔도스태틴, 소마토스타틴, 글루카곤, 엔도르핀, 바시트라신, 머게인, 콜리스틴, 단일 항체, 백신류 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 항균제로는 미노싸이클린, 테트라싸이클린, 오플록사신, 포스포마이신, 머게인, 프로플록사신, 암피실린, 페니실린, 독시싸이클린, 티에나마이신, 세팔로스포린, 노르카디신, 겐타마이신, 네오마이신, 가나마이신, 파로 모마이신, 미크로 노마이신, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 세포탁신, 세파클러, 에리스로마이신, 싸이프로플록사신, 레보플록사신, 엔옥사신, 반코마이신, 이미페넴, 후시딕산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 항암제로는 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 항염증제로는 아세트아미노펜, 아스피린, 이부프로펜, 디크로페낙, 인도메타신, 피록시캄, 페노프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 수프로펜, 록소프로펜, 시녹시캄, 테녹시캄 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리드 하이드로겔은 약물 전달용 유효 골격(scaffold)으로서의 인공세포외 매트릭스로 사용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 성장인자들과 물리적 결합을 잘하는 헤파린에 티라민을 도입하여 성장인자를 효과적으로 담지하고 서방형 방출 거동을 가능하게 할 수 있다(성장 인자 결합 사이트).

페놀이 결합되어 있는 세포 접착 펩타이드 또는 단백질 예들들어, RGDY 또는 YIGSR을 이용하여 하이드로겔 메트릭스 내부의 세포 접착력을 향상시킬 수 있다. 효과적인 세포의 성장과 분화에 필요한 이러한 성분들을 효소 기작을 이용하여 in situ 형태로 조직 접착성 인공 ECM을 만들 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 기술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

제조예 1: 제1 고분자의 제조

물 15 ㎖의 조용매(co-solvent)에 용해된 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC, 시그마 알드리치 社) 3.83 g (20 mmol) : 디메틸포름아미드(DMF, 준세이(Tokyo, Japan)) (3:2)를 조용매 125 ㎖ 중 3-(4-히드록시-페닐)프로피온산 (HPA, 시그마 알드리치 社) 3.32 g (20 mmol)가 포함된 용액에 투입하였다. 1 시간 활성화한 후, 상기 용액에 물 15 ㎖에 용해된 N-히드록시석신이미드(NHS, 시그마 알드리치 社) 3.45 g (30 mmol) : DMF (3:2) 조용매를 1시간 동안 교반 하에 투입하였다. 상기 활성화된 HPA 용액을, 탈이온수 150㎖ 중에 젤라틴 5 g (돼지피부타입 A; >300 블룸, 시그마 알드리치 社) 이 포함된 젤라틴 용액(40 ℃)에 투입하였다. 상기 활성화된 HPA 용액과 젤라틴 용액의 반응을 24시간 동안 수행하였으며, 젤라틴이 HPA 용액에 균질하게 용해되도록 40 ℃의 온도를 유지하였다. 상기 반응된 혼합물을 40 ℃의 증류수에서 3,500 kDa의 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 투석막(dialysis membrane, Spectrum laboratories, Inc. (CA., L.S., USA))으로부터 한외여과 하였고, 상기 배지를 3일 동안 하루에 3번씩 교체하였다. 제1 고분자로서 젤라틴-하이드록시페닐 프로피온산을 냉동 건조 후에 90.8%의 수율로 얻을 수 있었다.

제조예 2-1: 제2 고분자의 제조

질소 기체 조건 하에서 메틸렌 클로라이드(MC, J.T. Baker (PA, USA)) 20 ㎖에 용해된 p-니트로페닐 클로로포르메이트 (PNC, 시그마 알드리치 社) 1.21 g (6 mmol)에, 메틸렌 클로라이드에 용해된 N,N-다이메틸피리딘-4-아민 (DMAP, Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA)) 0.73 g (6 mmol) 용액을 첨가하였다. 10 kDa 선형 폴리에틸렌글리콜 (PEG; 시그마 알드리치 社) 10 g (1 mmol)를 MC 100 ㎖에 용해시키고 이를 PNC와 DMAP 이 혼합된 용액에 떨어뜨렸다. 혼합 용액을 질소 기체 조건 하에 24시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응액을 4L 에틸에테르에 적하하여 응축하고 석출시켰다. 이어서, 백색 침전물을 여과하고 3일 동안 진공 오븐에서 건조시켰다. PEG-PNC2는 백색 분말로서 얻어진다. 90 % 이상의 PNC로 개질된 백색 고체 PEG-PNC2를 질소 환경 하에서 N-다이메틸설폭사이드 (DMSO, 준세이(Tokyo, Japan)) 150 ㎖에 완전히 용해시켰다. 티라민 (0.69g, 5mmol)도 DMSO 30ml에 용해시키고 질소 조건 하에서 트리에틸아민(TEA, KANTO Chemical CO., INC., (Japan)) 0.70g (5 mmol)를 첨가하였다. 용해된 티라민 용액을 PEG-PNC2 용액에 적하하고 질소 조건 하에서 24시간 동안 실온에서 반응시켰다. 상기 반응된 혼합물을 메탈올 상에서 3,500 kDa의 MWCO를 갖는 투석막(dialysis membrane)으로부터 한외여과 하였고, 상기 배지를 3일 동안 하루에 3번씩 교체하였다. 3일 후, 투석된 용액을 증발시키고 4L 에틸에테르에 침전시켰다. 수득된 폴리에틸렌글리콜-티라민을 여과하고 진공 오븐에서 3 일 동안 건조시켰다. 완전히 건조된 폴리에틸렌글리콜-티라민은 백색 고체의 형성을 나타냈다.

제조예 2-2

PNC를 15 mmol, 4 kDa 선형 폴리에틸렌글리콜을 2.5 mmol, DMAP를 15 mmol로 사용한 것을 제외하고는 제조예 2-1과 동일한 방법으로 폴리에틸렌글리콜-티라민을 제조하였다.

제조예 2-3

PNC를 4 mmol, 20 kDa 선형 폴리에틸렌글리콜을 0.5 mmol, DMAP를 4 mmol로 사용한 것을 제외하고는 제조예 2-1과 동일한 방법으로 폴리에틸렌글리콜-티라민을 제조하였다.

제조예 3: 헤파린-페놀

증류수 100 mL에서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 (EDC, 8 mmol) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS, 5 mmol)을 헤파린(1 g)과 반응시켜 카르복실기가 활성화된 헤파린을 제조할 수 있으며, 아민기를 갖는 티라민(3 mmol)을 활성화된 카르복실기와 반응시켜 헤파린-페놀을 제조할 수 있다. 24시간 동안 상온에서 반응 후에 제조예 1과 같은 방식으로 헤파린-페놀을 수득하였다.

제조예 4: 히알루론산-페놀

히알루론산(1 g), EDC(15 mmol), NHS(15 mmol) 및 티라민(20 mmol)을 사용한 것을 제외하고 제조예 3과 동일한 방법으로 제조하였다.

제조예 5: 알지네이트-페놀

알지네이트(1 g), EDC(12 mmol), NHS(15 mmol) 및 티라민(15 mmol)을 사용한 것을 제외하고 제조예 3과 동일한 방법으로 제조하였다.

제조예 6-1: 젤라틴-티올

탈이온수 150 ㎖, 40 ℃에 젤라틴 5 g (돼지피부타입 A; >300 블룸)을 완전히 용해 후 시스타민 하이드로클로라이드 (20 mmol, 시그마 알드리치 社)를 추가하였다. 1몰의 염산 용액(HCl)을 이용하여 반응 용액의 pH를 4.5로 조절 후 EDC (20 mmol)과 NHS (20 mmol)을 바로 추가하여 용해시킨 후 반응시켰다. 24시간 반응 후, 4몰의 수산화나트륨(NaOH)을 이용해 반응용액의 pH를 8로 조정 후 과량의 디티오트레이톨 (DTT, 40 mmol, 시그마 알드리치 社)를 추가하여 시스타민의 이황화결합을 티올기로 환원시켰다. 추가적으로 24시간 반응 후 HCl을 이용하여 pH를 4로 조정 후 제조예 1과 같은 방법으로 수득하였다.

제조예 6-2 내지 6-4: PEG-VS

4 kDa 선형 폴리에틸렌글리콜 (PEG; 시그마 알드리치 社) 4 g (1 mmol)를 0.1 M NaOH 100 ㎖에 용해시키고, 디비닐설폰 (Divinyl sulfone, 10 mmol)을 추가하여 6시간동안 상온에서 반응시킨다. 반응 후 HCl을 이용하여 pH를 4로 조절 후 증류수에서 3.5 kDa의 MWCO를 갖는 투석막(dialysis membrane)을 통해 투석하였다. 3일간 증류수를 교체해주며 투석 후에 동결건조를 통해 제조예 6-2의 폴리에틸렌글리콜-비닐설폰을 수득하였다.

10 kDa 선형 PEG 10 g (1 mmol) 또는 20 kDa 선형 PEG 20 g (1 mmol)을 이용한 것을 제외하고 위와 동일한 방법으로 제조예 6-3 및 제조예 6-4의 폴리에틸렌글리콜-비닐설폰을 제조하였다.

제조예 7-1: 젤라틴-MA

탈이온수 100 ㎖, 60℃에 젤라틴 5 g (돼지피부타입 A; >300 블룸)을 완전히 용해 후 메타크릴아미드 (4 μmol)를 추가 후 1시간 반응시켰다. 반응 후 40℃의 DPBS 400 mL를 추가하여 반응 종결 후 12-14 kDa의 MWCO를 갖는 투석막(dialysis membrane)을 통해 투석하였다. 3일간 증류수를 교체해주며 투석 후에 동결건조를 통해 젤라틴-메타크릴아미드를 수득하였다.

제조예 7-2 내지 7-4: PEG-A

4 kDa PEG 2 g (0.5 mmol)과 트리에틸아민 (5 mmol)을 메틸렌클로라이드 (MC, 60 mL에 완전 용해 후, MC 5 ml에 용해된 아크릴로일 클로라이드 (시그마 알드리치 社, 1.2 mmol)를 천천히 추가하여 반응시킨다. 5 ℃에서 빛을 차단하고, 질소 분위기에서 12시간동안 반응시켰다. 반응 후 무색의 끈적한 액상의 반응물은 염화 암모늄으로 세척 후 건조하여 제조예 7-2의 폴리에틸렌글리콜-아크릴레이트를 제조하였다.

10 kDa PEG-DA 5 g (0.5 mmol) 또는 20 kDa PEG-DA 10 g (0.5 mmol)의 PEG를 이용한 것을 제외하고 위와 같은 방법으로 제조예 7-3 및 제조예 7-4의 폴리에틸렌글리콜-아크릴레이트를 제조하였다.

제조예 8-1 내지 8-3: 링커

제조예 2-1 내지 2-3에서 제조되는 PEG-PNC2를 용해시킨 DMSO 100 mL에 티라민을 용해킨 DMSO 50 mL을 첨가하여 질소 분위기에서 6시간 동안 반응을 진행하였다. 이 때, PEG의 분자량은 각각 4 kDa(제조예 8-1), 10 kDa(제조예 8-2), 20 kDa(제조예 8-3) 이며, PEG-PNC2 : 티라민의 몰비율은 1 : 1 이다. 6시간 후, Gelatin 용액(1 g/200 ml in DMSO)에 혼합하여 40

질소 분위기에서 24시간 동안 반응을 진행하였다. 반응 후 증류수 상에서 투석막(dialysis membrane)을 통해 투석하였다. 3일간 증류수를 교체해주며 투석 후에 동결건조를 통해 수득하였다. 용액을 동결 건조하여 분자량 별 PEG가 링커로 존재하는 백색의 분말 생성물인 ㅈ제젤라틴-폴리에틸렌글리콜-티라민(Gelatin-PEG-Tyramine, GPT)을 수득하였다.

제조예 9-1: 테트로닉-티라민

테트로닉 30 g(1.67 mmol)을 디옥산 300 mL에 용해시킨 후 이 용액에 N,N-다이메틸피리딘-4-아민 (DMAP, Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA)) 8.33 mmol과 트리에티아민(TEA) 8.33mmol을 디옥산 40 mL에 용해시킨 용액과 p-니트로페닐클로로메이트(PNC) 8.33 mmol을 디옥산 50 mL에 용해시킨 용액을 순차적으로 혼합하였다. 테트로닉 : PNC : DMAP : TEA 의 몰비율은 1:5:5:5이다. 이때 반응온도는 30 ℃이며, 질소 분위기에서 24 시간 반응을 진행하였다. 반응 종료 후 용액을 여과기를 이용하여 잔존하는 시약들을 제거한 후 회전식 증발 농축기를 이용하여 반응 용액을 농축시키고 차가운 에테르 2 L에 천천히 떨어뜨려 침전물을 생성시키고 이 침전물을 여과기를 이용하여 여과하여 생성물을 수득하였다. 잔여 유기용매를 제거하기 위해 진공 오븐에 24시간 건조 후 테트로닉-PNC를 제조하였다. 이후 테트로닉-PNC 20 g(1.11 mmol)을 테트라하이드로푸란(THF) 200 mL에 용해시킨 용액에 티라민 5.55 mmol을 THF 150 mL에 용해시킨 용액을 첨가하여 반응을 진행하였다. 테트로닉-PNC : 티라민의 몰비율은 1 : 5이다. 이 때 반응 온도는 30 ℃이며 질소분위기에서 24시간 반응하였다. 반응 종료 후 용액을 메탄올 상에서 3.5 kDa의 MWCO를 갖는 투석막(dialysis membrane)을 통해 투석하였다. 3일간 메탄올을 교체해주며 투석 후에 회전식 증발농축기를 이용하여 용액을 농축시킨 후 차가운 에테르 2 L에 천천히 떨어뜨려 침전물을 생성시키고 이 침전물을 여과기를 이용하여 여과하여 생성물을 수득하였다. 잔여 유기용매를 제거하기 위해 진공 오븐에 24시간 건조 후 테트로닉-티라민을 제조하였다.

제조예 9-2: 4-ARM PEG-티라민

테트로닉 대신 20 kDa의 4-ARM PEG 33.4 g (1.67 mmol)을 사용한 것을 제외하고 상기 제조예 9-1과 동일한 방법으로 제조하였다.

실시예 1-1: 하이브리드 하이드로겔의 제조

제조예 1에서 제조한 젤라틴-하이드록시페닐 프로피온산 111.1 mg/ml 및 제조예 2-1에서 제조한 폴리에틸렌글리콜-티라민 111.1 mg/ml 둘 베코의 인산염 완충 식염수(DPBS, Wisent(Saint-Bruno, Quebec, Canada))에 용해시켰다. 위에서 용해된 젤라틴-하이드록시페닐 프로피온산과 폴리에틸렌글리콜-티라민 용액을 1:1 의 부피비로 혼합함으로써 최종 고분자 용액을 제조하였다.

홀스래디쉬 산화효소 (HRP, VI 형, 250-330 U/mg 고체, 시그마 알드리치 社) 0.04 mg/㎖ 및 과산화수소 (물에서 30 중량%, 시그마 알드리치 社) 0.6 wt %를 둘 베코의 인산염 완충 식염수(DPBS, Wisent(Saint-Bruno, Quebec, Canada))에 용해시켰다.

하이드로겔은 고분자와 섞인 각각의 HRP 및 H₂O₂ 용액(고분자 : HRP 및 H₂O₂ = 9 : 1 의 부피비)을 동일한 부피비로 혼합함으로써 제조되었다(최종농도: GH 5 wt%, PT 5 wt%).

300 ul 용량의 하이드로겔을 1㎖ 바이알(vial)에서 형성하고, 겔화 가능성은 바이알 틸팅 방법(vial-tilting method)에 의해 바이알을 기울여가며 겔화에 따라 유동이 관찰되지 않는 시점까지의 시간을 측정하여 겔화 시간을 결정하였다.

실시예 1-2

제조예 2-2에서 제조한 폴리에틸렌글리콜-티라민 44.4 mg/ml (4 kDa)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 하이브리드 하이드로겔을 제조하였다.

실시예 1-3

제조예 2-3에서 제조한 폴리에틸렌글리콜-티라민 222.2 mg/ml (20 kDa)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 하이브리드 하이드로겔을 제조하였다.

상기 실시예 1-1, 1-2, 1-3의 폴리에틸렌글리콜-티라민의 몰 농도는 5 mM로 고정된 값이다.

실시예 2-1

제조예 1에서 제조한 젤라틴-하이드록시페닐 프로피온산 및 제조예 2-3에서 제조한 폴리에틸렌글리콜-티라민을 각각 166.6 mg/ml 둘 베코의 인산염 완충 식염수(DPBS, Wisent(Saint-Bruno, Quebec, Canada))에 용해시킨 용액의 중량비가 3:1이 되도록 혼합하여 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 하이브리드 하이드로겔을 제조하였다.

실시예 2-2

제조예 1에서 제조한 젤라틴-하이드록시페닐 프로피온산 및 제조예 2-3에서 제조한 폴리에틸렌글리콜-티라민을 각각 166.6 mg/ml 둘 베코의 인산염 완충 식염수(DPBS, Wisent(Saint-Bruno, Quebec, Canada))에 용해시킨 용액의 중량비가 1:1이 되도록 혼합하여 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 하이브리드 하이드로겔을 제조하였다.

실시예 2-3

제조예 1에서 제조한 젤라틴-하이드록시페닐 프로피온산 및 제조예 2-3에서 제조한 폴리에틸렌글리콜-티라민을 각각 166.6 mg/ml 둘 베코의 인산염 완충 식염수(DPBS, Wisent(Saint-Bruno, Quebec, Canada))에 용해시킨 용액의 중량비가 1:3이 되도록 혼합하여 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 하이브리드 하이드로겔을 제조하였다.

실시예 3-1 내지 5-3

하기 표 1에 표시한 바와 같이 제1 고분자와 제2 고분자를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2-3과 동일한 방법으로 하이브리드 하이드로겔을 제조하였다.
실시예 6-1 내지 6-3
하기 표 1에 표시한 바와 같이 제1고분자와 제2고분자를 단순 혼합으로 pH 7의 중성 조건에서 티올 및 바이닐 설폰의 마이클 첨가(Michael addition) 반응을 통해 가교하여 하이브리드 하이드로겔을 제조하였다.
실시예 7-1 내지 7-3
하기 표 1에 표시한 바와 같이 제1고분자와 제2고분자를 벤조페논계 개시제 존재 하에 15mW/cm² 미만의 광량을 갖는 자외선 광 조사로 메타크릴아미드 및 아크릴레이트의 반응을 통해 광 가교하여 하이브리드 하이드로겔을 제조하였다.

	제1 고분자	제2 고분자
실시예 3-1	제조예 3	제조예 2-1
실시예 3-2	제조예 3	제조예 2-2
실시예 3-3	제조예 3	제조예 2-3
실시예 4-1	제조예 4	제조예 2-1
실시예 4-2	제조예 4	제조예 2-2
실시예 4-3	제조예 4	제조예 2-3
실시예 5-1	제조예 5	제조예 2-1
실시예 5-2	제조예 5	제조예 2-2
실시예 5-3	제조예 5	제조예 2-3
실시예 6-1	제조예 6-1	제조예 6-2
실시예 6-2	제조예 6-1	제조예 6-3
실시예 6-3	제조예 6-1	제조예 6-4
실시예 7-1	제조예 7-1	제조예 7-2
실시예 7-2	제조예 7-1	제조예 7-3
실시예 7-3	제조예 7-1	제조예 7-4

비교예 1

제조예 1에서 제조한 젤라틴-하이드록시페닐 프로피온산 111.1 mg/ml을 둘 베코의 인산염 완충 식염수(DPBS, Wisent(Saint-Bruno, Quebec, Canada))에 용해시켰다. 위에서 용해된 젤라틴-하이드록시페닐 프로피온산과 둘 베코의 인산염 완충 식염수(DPBS, Wisent(Saint-Bruno, Quebec, Canada))을 1 : 1 의 부피비로 혼합함으로써 최종 고분자 용액을 제조한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 하이브리드 하이드로겔을 제조하였다.

비교예 2-1 내지 2-3

제조예 2-1 내지 2-3에서 제조한 폴리에틸렌글리콜-티라민을 각각 44.4 mg/ml (4 kDa, 비교예 2-1), 111 mg/ml (10 kDa, 비교예 2-2), 222.2 mg/ml (20 kDa, 비교예 2-3)로 둘 베코의 인산염 완충 식염수(DPBS, Wisent(Saint-Bruno, Quebec, Canada))에 용해시켰다. 위에서 용해된 폴리에틸렌글리콜-티라민과 둘 베코의 인산염 완충 식염수(DPBS, Wisent(Saint-Bruno, Quebec, Canada))을 1 : 1 의 부피비로 혼합함으로써 최종 고분자 용액을 제조한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 하이브리드 하이드로겔을 제조하였다.

비교예 3-1 내지 3-3

제조예 8-1 내지 8-3에서 제조한 젤라틴-폴리에틸렌글리콜-티라민을 각각 77.7 mg/ml, 111.1 mg/ml, 166.6 mg/ml로 둘 베코의 인산염 완충 식염수(DPBS, Wisent(Saint-Bruno, Quebec, Canada))에 용해시킨 것을 최종 고분자 용액으로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 하이브리드 하이드로겔을 제조하였다.

비교예 4-1 및 4-2

실시예 1-3에 있어 제조예 2-3에서 제조한 폴리에틸렌글리콜-티라민 대신, 제조예 9-1(비교예 4-1) 또는 제조예 9-2(비교예 4-2)에서 제조한 다지형 폴리에틸렌글리콜 유도체를 222.2 mg/ml을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 하이브리드 하이드로겔을 제조하였다.

참고예 1

피브린 글루(Fibrin glue, Greenplast®)를 Green Cross Co.에서 구입하여 준비하였다.

실험예 1: 기계적 물성 평가

하기 측정예 1 내지 4에 따라, 실시예 1-1 내지 1-3, 2-1 내지 2-3, 3-1 내지 3-3, 4-1 내지 4-3, 5-1 내지 5-3, 6-1 내지 6-3, 7-1 내지 7-3 및 비교예 1, 2-1 내지 2-3, 3-1 내지 3-3, 4-1 내지 4-2에서 제조한 하이드로겔의 물성을 측정하였다. 또한, 참고예 1의 피브린 글루의 접착력을 측정예 4에 따라 측정하고 도 3 내지 도 11의 접착력 그래프에 나타내었다.

측정예 1: 탄성 계수의 측정

하이드로겔의 탄성 계수는 진동 모드에서 레오 미터(GEM-150-050, Bohlin Instruments, USA)로 측정하였다. 플레이트 (직경 = 25 mm, 갭 = 0.5 mm)에서 PEG 분자량과 함량에 따라 300 ㎕ 하이드로겔을 제조하였다. 하이드로겔의 유변학적 분석을 동적 시간 스위프에서 수행하였고, 측정 10 분 후에 G' 값을 기록하였다.

측정예 2: 압축 강도의 측정

압축 강도는 universal testing machine(UTM) (H50K-T UTM, GEN-M-128, 노르웨이 Tinius Olsen)에 의해 측정되었다. 먼저, 하이드로겔 (600 ㎕, n = 3)을 정사각형 큐브 (10 Х 10 Х 10 mm)로 형성한 다음 5 ㎖의 0.01M PBS에서 24 시간 동안 배양하였다. 이어서, 제조된 하이드로겔 큐브를 UTM 플레이트 상에 놓고 10mm/분의 일정한 속도로 압력을 가하였다 (1000 N). 하이드로겔 큐브가 파단된 힘(N)이 압축강도로 기록되었다.

측정예 3: 인장 강도의 측정

인장 강도는 universal testing machine(UTM) (H50K-T UTM, GEN-M-128, 노르웨이 Tinius Olsen)에 의해 측정되었다. 먼저, 하이드로겔 (800 ㎕, n = 3)을 직사각형 막대 (10 Х 30 Х 1 mm)로 형성한 다음 5 ㎖의 0.01M PBS에서 24 시간 동안 배양하였다. 이어서, 제조된 하이드로겔 바를 UTM 플레이트 상에 놓고 50mm/분의 일정한 속도로 인장력을 가하였다(20 N). 하이드로겔 바가 파단된 힘(N)이 인장강도로 기록되었다.

측정예 4: 접착 강도의 측정

접착 강도는 universal testing machine(UTM) (H50K-T UTM, GEN-M-128, 노르웨이 Tinius Olsen)에 의해 측정되었다. ㈜한스바이오 매드에서 얻은 탈세포화 된 돼지 피부를 10 x 25 mm 직사각형 모양으로 절단하여, 0.01M DPBS에 30 분 동안 담궈 실제 돼지 피부와 같은 환경을 조성하였다. 에틸 시아노 아크릴 레이트를 사용하여 폴리 염화 비닐 (PVC) 기질 (60 x 25mm) 끝에 부착하였다. HRP (75ul)가 포함된 고분자 용액을 돼지 피부 부위에 도포하고, 다른 돼지 피부에는 H₂O₂ (75ul)가 포함된 고분자 용액을 도포한 후, 두 개의 표면을 겹쳐서 10 분 동안 100g 무게로 눌러주었다. 제조된 기판의 PVC 양끝을 UTM에 고정하고 5 mm/분의 일정한 속도로 일정한 힘을 주어 당겼다(20 N). 돼지껍질이 파단된 힘(N)이 접착 강도로 기록되었다.

결과 분석

도 3에는 실시예 1-1 내지 1-3, 비교예 1 및 비교예 2-1 내지 2-3의 하이드로겔의 물성을 나타내었다. 구체적으로, 실시예 1-1 내지 1-3, 비교예 1 및 비교예 2-1 내지 2-3의 하이드로겔의 탄성 계수(왼쪽 위), 압축 강도(오른쪽 위), 인장 강도(왼쪽 아래) 및 접착 강도(오른쪽 아래)를 나타내었다.

도 3을 참조하면, 실시예 1-1 내지 1-3에서 제조한 하이브리드 하이드로겔의 물성이 비교예 1 및 비교예 2-1 내지 2-3의 단일 고분자로 제조된 하이드로겔에 비하여 비교적 우수한 것을 확인할 수 있고, 특히 분자량이 큰 폴리에틸렌글리콜을 사용한 실시예 1-2 및 1-3의 하이브리드 하이드로겔의 물성이 우수한 것을 확인할 수 있다.

도 4에는 실시예 1-1 내지 1-3 및 비교예 3-1 내지 3-3의 하이드로겔의 물성을 나타내었다. 구체적으로, 실시예 1-1 내지 1-3 및 비교예 3-1 내지 3-3의 하이드로겔의 탄성 계수(왼쪽 위), 압축 강도(오른쪽 위), 인장 강도(왼쪽 아래) 및 접착 강도(오른쪽 아래)를 나타내었다.

도 4를 참조하면, 동일한 분자량의 폴리에틸렌글리콜을 사용한 경우라도 폴리에틸렌글리콜이 링커로 작용한 비교예 3-1 내지 3-3보다, 제1 반응기가 제1 고분자에 직접 결합되어 가교된 실시예 1-1 내지 1-3의 하이브리드 하이드로겔의 물성이 더 우수한 것을 확인할 수 있다.

도 5에는 실시예 2-2 및 비교예 4-1 내지 4-2의 하이드로겔의 물성을 나타내었다. 구체적으로, 실시예 2-2 및 비교예 4-1 내지 4-2의 하이드로겔의 탄성 계수(왼쪽 위), 압축 강도(오른쪽 위), 인장 강도(왼쪽 아래) 및 접착 강도(오른쪽 아래)를 나타내었다.

도 5을 참조하면, 선형 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 제조한 실시예 2-2의 하이드로겔의 물성이 다지형 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 제조한 비교예 4-1 내지 4-2의 하이드로겔보다 우수한 것을 확인할 수 있다.

도 6에는 실시예 2-1 내지 2-3, 비교예 1 및 비교예 2-3의 하이드로겔의 물성을 나타내었다. 구체적으로, 실시예 2-1 내지 2-3, 비교예 1 및 비교예 2-3의 하이드로겔의 탄성 계수(왼쪽 위), 압축 강도(오른쪽 위), 인장 강도(왼쪽 아래) 및 접착 강도(오른쪽 아래)를 나타내었다.

도 6를 참조하면, 실시예 2-1 내지 2-3에서 제조한 하이브리드 하이드로겔의 물성이 비교예 1 및 비교예 2-3의 단일 고분자로 제조된 하이드로겔에 비하여 우수한 것을 확인할 수 있고, 특히 제1 고분자와 제2 고분자의 중량비가 1:1 또는 1:3인 실시예 2-2 및 2-3의 물성이 우수한 것을 확인할 수 있다.

도 7에는 실시예 3-1 내지 3-3의 하이드로겔의 물성을 나타내었다. 구체적으로, 실시예 3-1 내지 3-3의 하이드로겔의 탄성 계수(왼쪽 위), 압축 강도(오른쪽 위), 인장 강도(왼쪽 아래) 및 접착 강도(오른쪽 아래)를 나타내었다.

도 8에는 실시예 4-1 내지 4-3의 하이드로겔의 물성을 나타내었다. 구체적으로, 실시예 4-1 내지 4-3의 하이드로겔의 탄성 계수(왼쪽 위), 압축 강도(오른쪽 위), 인장 강도(왼쪽 아래) 및 접착 강도(오른쪽 아래)를 나타내었다.

도 9에는 실시예 5-1 내지 5-3의 하이드로겔의 물성을 나타내었다. 구체적으로, 실시예 5-1 내지 5-3의 하이드로겔의 탄성 계수(왼쪽 위), 압축 강도(오른쪽 위), 인장 강도(왼쪽 아래) 및 접착 강도(오른쪽 아래)를 나타내었다.

도 10에는 실시예 6-1 내지 6-3의 하이드로겔의 물성을 나타내었다. 구체적으로, 실시예 7-1 내지 7-3의 하이드로겔의 탄성 계수(왼쪽 위), 압축 강도(오른쪽 위), 인장 강도(왼쪽 아래) 및 접착 강도(오른쪽 아래)를 나타내었다.

도 11에는 실시예 7-1 내지 7-3의 하이드로겔의 물성을 나타내었다. 구체적으로, 실시예 7-1 내지 7-3의 하이드로겔의 탄성 계수(왼쪽 위), 압축 강도(오른쪽 위), 인장 강도(왼쪽 아래) 및 접착 강도(오른쪽 아래)를 나타내었다.

도 7 내지 도 9를 참조하면, 제1 고분자가 각각 헤파린, 히알루론산 또는 알지네이트로 달라지더라도 우수한 물성을 달성할 수 있는 것을 확인할 수 있고, 도 10 내지 도 11을 참조하면 제1 반응기 및 제2 반응기가 달라지더라도 역시 하이드로겔의 우수한 물성이 확보되는 것을 확인할 수 있다.

상기 내용을 종합하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 하이브리드 하이드로겔은 탄성 계수, 압축 강도, 인장 강도 및 접착 강도가 높아 기계적 물성이 우수한 것을 확인할 수 있으며, 특히 제2 고분자의 분자량이 커질수록 기계적 물성이 우수한 것을 확인할 수 있다.

생체적합성 평가

실험예 2: 세포 생존율 평가

C2C12를 트립신 처리하고, 원심 분리하고, 계수하고, 10 % 소 태아 혈청(Wisent(Saint-Bruno, Quebec, Canada)) 및 1 % 페니실린-스트렙토마이신(P/S, Gibco BRL(Grand Island, NY, USA))가 보충된 DMEM 성장 배지에 조심스럽게 현탁하여 5 x 10³ 세포/ml의 밀도에서 균질한 세포 용액을 얻었다. 3 중의 하이드로겔은 하이드로겔 형성 부분의 방법에 따라 24-웰 플레이트에서 제작되었다. 그러나 둘 베코의 인산염 완충 식염수를 사용하여 폴리머, HRP 및 H₂O₂ 용액을 준비했으며, 멸균을 위해 주사기 필터 (구멍 크기 0.2m)를 사용하여 여과했다. 30 분 이내에 겔화 및 안정화 후, 하이드로겔은 표준 배양 조건 (37 ℃ 및 5 % CO₂)에서 준비된 1mL 세포 용액과 함께 배양하였다. 배지는 2 일마다 교체하였다. 세포 증식은 WST-1 분석 방법으로 정량화하였다. 각 하이드로겔 웰을 1 mL의 새로운 배지로 교체하고 100 μL WST-1 시약을 각 샘플 웰에 첨가했다. 플레이트를 5 % CO₂ 하에 37 ℃의 온도에서 1 시간 동안 배양한 후 반응액 100 μL를 96-웰 플레이트로 옮겼다. 광학 밀도(O.D)를 마이크로 플레이트 분광 광도계 (VersaMax Tunable Microplate reader, Molecular Devices, USA)를 사용하여 450nm에서 측정하였다. 상기 측정을 세번 수행하였다.

상기 하이드로겔을 각각 실시예 1-1 내지 1-3, 실시예 2-1 내지 2-3, 비교예 1 및 비교예 2-1 내지 2-3의 하이드로겔로 하여 상기와 동일하게 실험하고, 세포 부착력을 측정하였다.

도 12에 실시예 1-1 내지 1-3, 실시예 2-1 내지 2-3, 비교예 1 및 비교예 2-1 내지 2-3의 하이드로겔에서 배양된 C2C12의 WST-1 분석을 사용하여 측정한 세포 부착력 그래프를 나타내었다.

도 12를 참조하면, 실시예 1-1 내지 1-3에서 제조한 하이브리드 하이드로겔이 기존의 세포 친화성이 우수한 젤라틴 하이드로겔인 비교예 1과 유사한 수준의 세포 부착성 및 친화성을 보이는 것을 확인할 수 있으며, 실시예 2-1 내지 2-3에서 제조한 하이브리드 하이드로겔 또한 기존 세포 친화성이 우수한 젤라틴 하이드로겔인 비교예 1과 유사한 수준의 부착성 및 세포 친화성을 보이는 것을 확인할 수 있다.

실험예 3: 약물방출능 평가

실시예 1-1 내지 1-3, 실시예 2-1 내지 2-3, 비교예 1 및 비교예 2-1 내지 2-3의 하이드로겔의 전구체 용액을 PBS에 용해시키고 약물(덱사메타손(Dexamethasone, Dex): 10 mg/㎖)와 혼합한 혼합물을 2개의 분취량으로 나누었다. 하나의 분취액에 HRP (0.04 mg/㎖)를 첨가하고 다른 분취액에 H₂O₂ (0.6 wt%)를 첨가하였다 (polymer : Dex : HRP / H₂O₂ = 8 : 1 : 1의 부피비). 약물 담지된 하이드로겔은 2개의 분취량을 혼합함으로써 형성되었다. HRP, H₂O₂및 약물의 최종 실험 조건은 각각 0.004 mg/㎖, 0.01-0.03 wt%, 1 mg/㎖ (Dex)이었다. 이어서, 1 ㎖ PBS 완충액을 하이드로겔에 첨가하고 37 ℃에서 배양하였다. 미리 정해둔 시간 간격으로, 상층액을 수집하여 영하 20 ℃에 보관하고 새로운 PBS 완충액을 추가하였다. 수집된 완충액 속 Dex의 농도는 흡광도를 241 nm에서 측정하여 분석하였다. Dex의 누적 방출 백분율은 하기 수학식으로 계산되었다(C: 수입된 완충액 내의 Dex 방출 농도, Co: 초기 Dex의 농도).

[수학식]

Dex 방출 (%) = C / Co Х 100

상기 하이드로겔을 각각 실시예 1-1 내지 1-3, 비교예 1 및 비교예 2-1 내지 2-3의 하이드로겔로 하여 약물 방출능을 평가하고, 도 13에 실시예 1-1 내지 1-3, 비교예 1 및 비교예 2-1 내지 2-3의 하이드로겔, 도 14에 실시예 2-1 내지 2-3, 비교예 1 및 비교예 2-3의 하이드로겔의 시간에 따른 약물 누적 방출 백분율 그래프를 나타내었다.

도 13를 참조하면, PEG의 분자량이 증가할수록 약물 방출 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

도 14를 참고하면, PEG의 함량이 증가할수록 약물방출 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4: 약물의 분자량에 따른 방출능 평가

실시예 2-3의 하이드로겔을 사용하고, 392.464 g/mol의 분자량을 갖는 덱사메타손 또는 66.5 kg/mol의 분자량을 갖는 보빈 세럼 알부민을 사용한 것을 제외하고는 실험예 3과 동일한 방법으로 누적 방출 백분율을 도출하였다.

도 15에는 실시예 2-3의 하이드로겔의 덱사메타손 또는 보빈 세럼 알부민의 시간에 따른 약물 누적 방출 백분율을 나타내었다.

도 15를 참조하면, 덱사메타손과 같은 작은 분자량의 약물은 하이드로겔에서 비교적 더 쉽게 방출되어 보빈 세럼 알부민과 같은 거대분자 약물보다 빠른 방출 속도를 나타냈다.

Claims

2 이상의 제1 반응기를 함유하는 제1 고분자; 및
하기 화학식 1로 표시되는 반복단위를 포함하는 주쇄 및 상기 주쇄의 양 말단에 결합되는 제2 반응기를 함유하는 제2 고분자;의 가교로 제조되고,
상기 제1 반응기와 상기 제2 반응기의 반응에 의하여 상기 제1 고분자와 상기 제2 고분자가 가교되고,
상기 제1 고분자는 젤라틴, 헤파린, 알지네이트 및 히알루론산 중 적어도 하나를 포함하고,
상기 제1 반응기는 페놀, 하이드록시페닐프로피온산, (메트)아크릴아미드 및 티올 중 어느 하나이고,
상기 제2 반응기는 티라민, 바이닐 설폰 및 (메트)아크릴레이트 중 어느 하나이고,
상기 제2 고분자의 중량평균분자량은 10,000 이상 20,000 이하이고,
상기 제2 고분자는 선형 구조이고,
상기 제1 고분자와 상기 제2 고분자의 중량비는 3:1 내지 1:3인 것인 하이브리드 하이드로겔:
[화학식 1]
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제1항에 있어서,
상기 제1 반응기는 페놀 또는 하이드록시페닐프로피온산이고, 상기 제2 반응기는 티라민이고,
상기 제1 고분자 및 상기 제2 고분자는 홀스래디쉬 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase) 및 과산화수소 첨가에 의하여 인시튜(in situ) 가교된 것인 하이브리드 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 제1 반응기는 티올이고 상기 제2 반응기는 바이닐 설폰이고,
상기 제1 고분자 및 상기 제2 고분자는 상기 티올과 상기 바이닐 설폰의 반응에 의하여 가교된 것인 하이브리드 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 제1 반응기는 (메트)아크릴아미드이고 상기 제2 반응기는 (메트)아크릴레이트이고,
상기 제1 고분자 및 상기 제2 고분자는 상기 (메트)아크릴아미드와 상기 (메트)아크릴레이트의 반응에 의하여 가교된 것인 하이브리드 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 제1 반응기 간의 반응에 의하여 상기 제1 고분자 간이 더 연결되고, 상기 제2 반응기 간의 반응에 의하여 상기 제2 고분자 간이 더 연결되는 것인 하이브리드 하이드로겔.
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제1항 및 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 하이브리드 하이드로겔을 포함하는 조직 접착 및 지혈용 소재.
제13항에 있어서,
상기 소재는 혈관 외과 영역을 포함한 뇌신경 외과수술; 뼈의 접착을 포함한 정형외과 수술; 열상 환자의 지혈; 대퇴동맥의 봉합; 백내장 절개 봉합, 연골 및 관절연골 치유; 피부 접합; 장기/분비선 절개면 지혈; 위장관 분합; 및 힘줄 및 인대 치유로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 적용된 것인 조직 접착 및 지혈용 소재.
제1항 및 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 하이브리드 하이드로겔을 포함하는 조직재생 및 충진용 임플란트 소재.
제15항에 있어서,
상기 임플란트 소재는 연골 재생(cartilage regeneration), 골 재생(bone regeneration), 치주골 재생, 피부 재생(skin regeneration), 심근 재생(cardiac tissue regeneration), 인공 수정체(artificial intraocular lens), 척수 신경 재생(spinal cord regeneration), 뇌신경 재생(cranial regeneration), 성대 재생 및 충진제(vocal regeneration and augmentation), 유착 방지막 (adhesion barrier), 요실금 치료제(urinary incontinence treatment), 주름 제거(wrinkles removal)용 충진제, 화상 치료 제(wound dressing), 조직 충진제(tissue augmentation) 및 척추 추간판 치료제(intervertebral disc treatment)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 적용된 것인 조직재생 및 충진용 임플란트 소재.
제1항 및 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 하이브리드 하이드로겔을 포함하는 생리활성물질 또는 약물 전달체용 담체.
제17항에 있어서,
상기 생리활성물질 또는 약물은, 펩타이드 또는 단백질 의약품; 항균제; 항암제; 및 항염증제;로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 생리활성물질 또는 약물 전달체용 담체.
제18항에 있어서,
상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 전환 성장인자(transforming growth factor; TGF), 골형성 성장인자(bone morphogenetic protein; BMP), 인간성장호르몬(hGH), 돼지성장호르몬(pGH), 백혈구성장인자(G-CSF), 적혈구성장인자(EPO), 대식세포성장인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 상피세포 성장인자(EGF), 혈소판유도성장인자(PDGF), 인터페론-α,β,γ, 인터루킨-2(IL-2), 칼시토닌, 신경성장인자(NGF), 성장호르몬 방출인자, 엔지오텐신, 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 작동약(LHRH agonist), 인슐린, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(TRH), 엔지오 스태틴, 엔도스태틴, 소마토스타틴, 글루카곤, 엔도르핀, 바시트라신, 머게인, 콜리스틴, 단일 항체, 백신류 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 생리활성 물질 또는 약물 전달체용 담체.
제18항에 있어서,
상기 항균제는 미노싸이클린, 테트라싸이클린, 오플록사신, 포스포마이신, 머게인, 프로플록사신, 암피실린, 페니실린, 독시싸이클린, 티에나마이신, 세팔로스포린, 노르카디신, 겐타마이신, 네오마이신, 가나마이신, 파로모마이신, 미크로 노마이신, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 세포탁신, 세파클러, 에리스로마이신, 싸이프로플록사신, 레보플록사신, 엔옥사신, 반코마이신, 이미페넴, 후시딕산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 생리활성 물질 또는 약물 전달체용 담체.
제18항에 있어서,
상기 항암제는 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 생리활성 물질 또는 약물 전달체용 담체.
제18항에 있어서,
상기 항염증제는 아세토아미노펜, 아스피린, 이부프로펜, 디크로페낙, 인도메타신, 피록시캄, 페노프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 나프 록센, 수프로펜, 록소프로펜, 시녹시캄, 테녹시캄 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 생리활성 물질 또는 약물 전달체용 담체.