JPWO2003090765A1 - 光架橋性キトサン誘導体を含有する医療用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、光架橋性キトサン誘導体と創傷治癒促進剤とで構成される医療用組成物、特に、糖尿病性皮膚潰瘍や褥創といった難治性皮膚疾患又は創傷に密着し、創傷治癒促進剤を適切に徐放して治癒することのできる、接着作用と創傷治癒促進作用とを兼ね備えた組成物、並びに、光架橋性キトサン誘導体を主剤とする当該組成物の製造方法及び当該組成物の用途に関する。
背景技術
皮膚等の創傷は、主として、正常皮膚・粘膜組織が離開した解放性創傷、熱や放射線による熱傷、潰瘍(限局性(circumscribed)の組織欠損)、あるいはそれらの複合創傷などに分類される。特に、面積が広く深度が深い重度の創傷では、感染による外来性の炎症を防いで肉芽組織の誘導を促進する治療が必須となる。
このような創傷の治療には、ガーゼ等の創傷被覆材を用いることが古くから行われているが、被覆材自体に治癒効果は無いため、抗生剤などの薬剤を併用して治癒効果を上げる工夫がなされている。近年、材料化学の進歩によって、ガス透過性を持ちながら水分の浸入を防ぐような透明粘着フィルムやゼリー状のハイドロゲル、さらには動物の生体膜などを利用した人工皮膚的被覆材も用いられるようになってきた。しかし、創傷の保護や感染防御などのプロテクション機能と治癒を促進するヒーリング機能とを同時に具備するものは未だ提供されるに至っていない。
特に、褥創や糖尿病に由来する皮膚潰瘍といった難治性の創傷では欠損組織の血液循環が阻害されるために欠損組織の再生が著しく遅延する。現状では、治癒を促進するために有効な治療薬や被覆剤などが提供されていないので、治癒に要する長期間の間に外来性の重篤な感染症を合併する危険があり、感染症を合併した場合には、それらを治療するために壊死した組織を根こそぎ切除するといった患者負担の大きな外科的処置を施さざるを得ない。
このような難治性の創傷治療のために、組織細胞を体外で培養した再生組織を用いることが検討されているが、簡便性、コスト、時間、安全性などの問題を残している。最近では、組織再生を誘導するための血管新生を促す遺伝子を用いた治療法に関する研究も進められているが、遺伝子を導入するための方法論や導入遺伝子によって産生されるタンパク質が臨床効果を有するかなどの多くの課題が未解決である。
また、上記以外の創傷として、胃や肺などの臓器治療における外科的切除創があるが、これらの創傷に対して、組織の吻合部の空気や体液の漏れを防ぐシーラントとして接着性の高い被覆剤が使用されている。例えば、生体由来のタンパク質やシアノアクリレート系の合成接着剤、さらには、血液凝固因子などのヒト由来血漿製剤などが用いられているが、現状では、接着性、安全性、生分解性などの点で十分ではない。特に、切開創の組織再生を誘導して積極的な治癒促進効果を持たせることは、患者の予後に大きく貢献するために重要であるが、そのような機能を有する実用的なシーラントは未だ提供されるには至っていない。
一方、細胞増殖因子(GF)は、細胞の増殖や分化を制御し、組織再生に寄与することが知られている。特に、繊維芽細胞増殖因子であるFGF−1とFGF−2の研究が進んでおり、これらが細胞の増殖、移動、分化、寿命などを制御し、胎児の発生、血管新生、骨形成、神経形成や創傷修復に寄与することが明らかとなった。しかしながらGFは、その活性の維持や保存が困難であり、通常、細胞外基質を構成するプロテオグリカン中のヘパリン分子と相互作用して、酸化に対する劣化のプロテクションや機能調節がなされている。また、一時期に高濃度のGFが作用した場合、癌的な要素を惹起する危険もあるので、その使用法には注意が必要である。即ち、GFの組織再生機能を創傷治療に利用することが期待されていながら、GF自身の高い拡散性や機能劣化の早さという問題が実際の臨床応用を妨げていた。
本発明者らは、多糖類であるキトサンを応用した創傷治療剤の開発を進めてきた(WO00/27889参照)。キトサンは創傷治癒効果と抗菌性を兼ね備えた素材として知られていたが、水溶性とゲル化の制御が困難であったため、従来は汎用的で機能的な接着剤や被覆材として製品化することが困難であった。我々は、酸性領域でしか可溶化しないキトサンの物性を、化学修飾によって、中性からアルカリ性においても易溶性に改良すると同時に、分子間架橋を機能的に行う光反応性基を導入した。このようにして得られた光架橋性キトサン誘導体は、生理的pHにおいて粘稠な水溶液を形成し、当該水溶液は光照射によって密着型の不溶性ゲルとなる。よって、開発された光架橋性キトサン誘導体の水溶液は、あらゆる患部に塗布でき、当該部位での光反応により即座に接着性のゲルとなるため、創傷部位の接着剤として有効に使用できることが明らかになった。
発明の開示
本発明は、我々が開発した光架橋性キトサン誘導体が有する(1)強くて早い接着性、(2)治癒性、(3)安全性、及び(4)適度な生分解性といった傷口のシーラントとしての有利な機能に加えて、当該キトサン誘導体を含む組成物に難治性創傷や手術切開創の治癒を積極的に促進する機能を付加することにより、組織再生を促進すると同時に癌化などの副作用を生じる危険のない医療用組成物を提供することを目的とする。
よって本発明は、光架橋性キトサン誘導体及び創傷治癒促進剤を含有することを特徴とする医療用組成物を提供する。
この組成物は、上記(1)〜(4)に挙げたような創傷部位のシーラント(医療用接着剤)としての有利な特性を具備するとともに、生理的pHで調製されるので、GFといった生理的活性を有する創傷治癒促進薬を変性させることなく良好に混和させることができる。得られた組成物は、あらゆる創傷部位に適用可能であり、当該部位で光照射するだけで閉塞性の不溶性ゲルマトリクスとなる。当該光架橋性キトサン誘導体から得られる架橋ゲルマトリクスは、単に増殖因子等の創傷治療促進薬を強固に担持するだけでなく、担持されたGF等を適度な速度で徐放することができる。この適度な徐放性により、増殖因子の大量投与による組織の癌化を起こすことなく血管新生誘導効果を長期間に渡って発揮することができ、その結果、難治性の創傷や切開創の治癒を促進できる。
また、本発明では、GFの機能制御にとって重要なヘパリン等のグリコサミノグリカン類を同時に担持させた組成物も提供する。本発明で用いる光架橋性キトサン誘導体は、酸性ヘパリン類とのポリイオンコンプレックス形成の制御が困難であった従来の塩基性キトサンとは異なり、ヘパリン類を容易に担持でき、患部におけるGF機能をヘパリンとの相互作用で増強させることも可能となった。
よって本発明は、光架橋性キトサン誘導体及び創傷治癒促進薬、そして任意にグリコサミノグリカン類を含有する組成物に光照射することにより製造される架橋キトサンマトリクスも提供する。このマトリクスは、内部に担持した増殖因子等の創傷治癒促進薬やヘパリン類等を最適な速度で徐放する薬物徐放体として使用できる。特に、増殖因子を担持したマトリクスは、徐放される増殖因子の作用により、組織再生用の細胞培養基材としても使用できる。
好ましい実施態様の説明
本発明の医療用組成物で使用される光架橋性キトサン誘導体は、一般にキチン・キトサン類と呼ばれている高分子骨格に光反応性基と糖鎖とを導入した構造を有しており、中でも、少なくとも一部が脱アセチル化されたキチン・キトサン類を構成するグルコサミン単位の2位アミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有する糖鎖を導入し、他の少なくとも一部に光反応性基を導入してなるものであるのが好ましい。
通常、キチン・キトサン類は、カニ殻由来のキチン質(ポリ−N−アセチルグルコサミン)をアルカリ処理することによって得られる脱アセチル化した酸可溶性画分であって、一般に下記式(1)、(2)で示される構成単位を有するものである。
これらキチン・キトサン類のうち脱アセチル化度の低いもの(通常40%未満のもの)を「キチン」、そして脱アセチル化度の高いもの(通常40%以上のもの)を「キトサン」と呼ぶこともあるが、以下、本明細書では、少なくとも一部が脱アセチル化されたキチン・キトサン類を総称して「キトサン」という。なお、本発明におけるキトサンは天然由来のものに限らず、化学的または遺伝子工学的に合成された類似構造を有する化学修飾糖鎖であってもよい。
ここで、「脱アセチル化度」とは、キトサン(あるいは、ポリ−N−アセチルグルコサミン)を構成する糖単位の2位のアセチルアミノ基が脱アセチル化によって遊離アミノ基に変換されている割合である。本明細書では、脱アセチル化度は、「健康食品規格規準集(その4)」財団法人日本健康・栄養食品協会(1996年)第55頁に記載の「コロイド滴定法」によって定量した。
本発明のキトサン誘導体は、このキトサンをさらに化学的に修飾することにより機能化したものであり、原料として使用されるキトサンとしては、脱アセチル化度が少なくとも40%、特に60〜100%、さらに特に65〜95%の範囲にあるものが好適である。なお、脱アセチル化度が100%のキトサンは、上記式(1)の構成単位のみからなり、式(2)の構成単位は含まない。
また、該キトサンの分子量には特に制限はなく、最終的なキトサン誘導体の使用目的に応じて広い範囲で変えることができるが、一般には、数平均分子量が5,000〜2,000,000、好ましくは10,000〜から1,800,000、より好ましくは40,000〜1,500,000の範囲のものが適している。
本発明で好ましいキトサン誘導体は、上記キトサンを構成する式(1)のグルコサミン単位における2位のアミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有する糖鎖を導入し、他の一部に光反応性基を導入したものである。このようなキトサン誘導体の詳細については、国際出願WO00/27889号パンフレットを参照されたい。
キトサン誘導体に導入される還元性末端を有する糖鎖としては、アルドース類、ケトース類に由来するものが包含され、中でも、構成糖単位の数が20個以下、特に1〜7個のものが好適に使用される。具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、フコース、マンノース、アラビノース、キシロース、エリトロース、ヘプツロース、ヘキシロース等のペンタオースやヘキサオース;グルコサミン、N−アセチルグルコサミン、ガラクサミン等のアミノ糖類;ウロン酸類やデオキシ糖類等の糖誘導体;これらの単糖類を組み合わせた糖鎖からなる、マルトース、イソマルトース、ラクトース、メリビオース、マルトトリオース等の二もしくは三糖類;及び各種オリゴ糖類等が挙げられるが、中でもマルトース、ラクトース、メリビオースなどの中性二糖類が好適である。
上記糖鎖に換えて、ポリエーテル、多価アルコールなどの有機化合物をキトサンに誘導することもできるが、生体適合性などの面で天然の糖鎖を利用するのが好ましい。
キトサンの前記式(1)のグルコサミン単位における2位アミノ基への糖鎖の導入は、それ自体既知の方法を用いて行うことができる。例えば、糖類の還元性末端をカルボキシル化した後、グルコサミン単位の2位アミノ基にアミド結合を介して結合させる方法(例えば、特開平10−120705号公報参照)や、糖類の還元性末端をアルデヒド化またはカルボニル化した後、それをグルコサミン単位の2位アミノ基に、シッフ塩基を経由する還元アルキル化法により結合させる方法(例えば、キチン・キトサン研究会編「キチン・キトサンの応用」53−56頁、1990年2月20日、技法堂出版(株)発行参照)などが含まれる。
本発明でキトサンに導入される糖類は1種のみに限定されるものではなく、2種以上を組み合わせて使用することもできる。
本発明のキトサン誘導体を構成する糖側鎖の具体例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
(i) ラクトースから誘導される糖鎖:
(ii) マルトースから誘導される糖鎖:
(iii) メリビオースから誘導される糖鎖:
(iv) セロビオースから誘導される糖鎖:
(v) ラミナリビオースから誘導される糖鎖:
(vi) マンノビオースから誘導される糖鎖:
(vii) N−アセチルキトビオースから誘導される糖鎖:
上記(i)〜(vii)の糖側鎖のうち、左側に記載したものは糖のカルボキシル基とキトサンの2位アミノ基との縮合によって導入される残基を表し、右側に記載したものはシッフ塩基を介して結合させた残基を表す。
このようにして、キトサンのグルコサミン単位の2位アミノ基を糖類で置換することにより、キトサンの酸依存的溶解性が緩和され、中性領域での可溶化が達成される。
キトサンのグルコサミン単位における2位アミノ基の糖側鎖による置換度は、最終的なキトサン誘導体に望まれる物性などに応じて変えることができるが、置換度が、一般的には0.1〜80%、特に0.5〜60%、さらに特に1〜40%の範囲内にあるのが好適である。ここで、糖側鎖の「置換度」は、キトサンを構成する糖単位の2位のアミノ基が糖側鎖で置換されている程度であり、キトサンを構成する糖単位の2位の遊離アミノ基と置換アミノ基の合計に対する置換アミノ基の割合として示す。本明細書では、糖側鎖の置換度は、硫酸中で糖鎖がフェノールと反応することに基づく特徴的な発色を490nmの吸光度で検知する「フェノール−硫酸法」によって測定される(J.E.Hodge,B.T.Hofreiter,″Methods in Carbohydrate Chemistry″,ed.by R.L.Whistler,M.L.Wolfrom,vol.1,p388,Academic Press,New York(1962)参照)。
本発明のキトサン誘導体は、キトサンを構成する前記式(1)のグルコサミン単位の2位アミノ基の少なくとも一部に光反応性基を導入することにより、光照射による自己架橋性が付与されている。
本発明に従ってキトサンの化学修飾に使用される光反応性基は、紫外線、特に約200〜380nmの近紫外領域を含む紫外線の照射によって該光反応性基同志で及び/又はキトサン中に存在するアミノ基あるいは水酸基等と反応して架橋結合を形成するような基を含む。例えば、ベンゾフェノン類、ケイ皮酸類、アジド類、ジオレフィン類、ビスアントラセンのような環状不飽和化合物等から誘導されるものが挙げられ、中でも、カルボニルアジド基、スルホニルアジド基、芳香族アジド基を有するものが好適である。
また、本発明における光反応性基は、約400〜500nm程度の可視光の照射で反応する置換基であってもよい。このような可視光反応性基としては、例えば、下記式で表されるような、Journal of Polymer Science:Polymer Chemistry Edition,Vol.20,1419−1432(1982)に記載されたホルミルスチリル化合物等が挙げられる。
(上記式中、Arは、ピリジン、アルキルピリジニウム塩、キノリン、アルキルキノリニウム塩等の複素環を表す。)
キトサンのグルコサミン単位における2位アミノ基へのかかる光反応性基の導入は、それ自体既知の方法により行うことができ、例えば、カルボキシル基を有するアジド化合物を縮合剤の存在下に該2位のアミノ基に結合させる方法(特開平10−120705号公報参照);酸クロリド基、アルデヒド基、N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル基又はエポキシ基を介してアジド化合物を該2位のアミノ基と反応させる方法(キチン・キトサン研究会編「キチン、キトサンの応用」第45〜65頁、1990年2月20、技報堂出版(株)発行、参照)等の方法により行うことができきる。上記のホルミルスチリル化合物のホルミル基をキトサンのアミノ基とカップリングさせることによっても好適に導入できる。
なお、従来、アジド基の架橋反応において、ビスアジド以上の多官能性化合物が有効であるとされているが(特開平9−103481号公報参照)、本発明ではその必要はなく、モノアジド化合物の導入によっても、十分に自己架橋性を有するキトサン誘導体が得られる。
しかして、本発明のキトサン誘導体を構成する光反応性基の具体例としては、例えば、紫外線の場合は、下記式(A)から(D)で表されるものが挙げられる。式(A)の基は、p−アジド安息香酸から誘導されるものであり、式(B)の基は、p−アジドベンズアルデヒドから誘導されるものであり、式(C)の基は、p−ベンゾイル安息香酸から誘導されるものであり、式(D)の基は、ケイ皮酸から誘導されるものであり、そして式(E)は、1−メチル−4−[2−(ホルミルフェニル)エテニル]ピリジニウムから誘導されるものである。
これらの光反応性基の導入の程度は、最終のキトサン誘導体に望まれる架橋反応に基づくゲル化(不溶化)の程度等に応じて変えることができるが、光反応性基の置換度が0.1%〜80%、特に0.5〜50%、さらに特に1〜30%の範囲内にすることが望ましい。ここで、光反応性基の「置換度」は、キトサンを構成する糖単位の2位のアミノ基が光反応性感応基で置換されている程度であり、キトサンを構成する糖単位の2位の遊離アミノ基と置換アミノ基の合計に対する置換アミノ基の割合である。本明細書では、光反応性基、例えばアジド基の置換度は、4−アジド安息香酸の270nmにおける特性吸収から得られる検量線に基づいて決定することができる。
本発明のキトサン誘導体における糖側鎖と光反応性基の合計の置換度は、特に制限されるものではなく、広い範囲に渡って変えることができるが、一般には0.2〜80%、好ましくは1.5〜65%、さらに好ましくは3〜50%の範囲内とすることができる。
また、本発明のキトサン誘導体では、キトサンを構成する前記式(1)の糖単位の2位のアミノ基や、式(1)又は(2)の糖単位の3位あるいは6位の水酸基の少なくとも一部に、両親媒性基を導入してもよく、それにより架橋後のマトリクスに飛躍的に向上した含水性を付加することができる。この両親媒性基は、疎水性基を具備する疎水ブロックと親水基を具備する親水ブロックとを有する基であり、一般に界面活性剤機能を有する場合が多い。中でも、疎水ブロック(X)と親水ブロック(Y)の分子量の割合が、X:Y=1:5〜5:1のものが好適に用いられ、解離性のイオン基を持たない非イオン性の基がより好適に使用できる。特に、疎水性のアルキルブロックと親水性のポリオキシアルキレンブロックから構成される分子量が少なくとも90以上、より好ましくは500〜10,000のポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。疎水ブロックを持たないポリエーテル類も使用できるが、疎水ブロックと親水ブロックの両方を有するポリオキシアルキレンアルキルエーテルが含水性向上の点から好ましい。
かかる両親媒性基のキトサンへの導入は、例えば、両親媒性基の親水ブロック又は疎水ブロックのいずれか一方の末端に、アミノ基と反応して共有結合を形成しうる基、例えば、アルデヒド基やエポキシ基などを持つ化合物を導入した後、キトサンのグルコサミンの2位アミノ基と反応させる方法や、カルボキシル基を有するポリオキシアルキレンアルキルエーテル誘導体とキトサンを縮合剤の存在下で反応させる方法、さらには酸クロリド基を有するポリオキシアルキレンアルキルエーテル誘導体とキトサンの水酸基やアミノ基と反応させる方法などを用いて行うことができる。
例えば、末端にエポキシ基を誘導したポリオキシアルキレンアルキルエーテル基あるいは末端にアルデヒド基を誘導したポリオキシアルキレンアルキルエーテル基をキトサンのアミノ基に導入した場合、キトサン骨格に結合した側鎖は下記式(a)あるいは(b)で表される。また、末端に酸クロリド基を誘導したポリオキシアルキレンアルキルエーテル基をキトサンの3位または6位の水酸基に結合させた場合、キトサン骨格に結合した側鎖は、下記式(c)で表される。ただし、下記式(a)〜(c)におけるn及びmは1以上の繰返し単位数である。
本発明のキトサン誘導体における両親媒性基の導入の程度は、特に制限されるものではないが、導入後のキトサン誘導体の重量変化に基づいて、通常5〜70%、好ましくは15〜55%の範囲内とすることができる。
以上詳細に述べたように、本発明の医療用組成物に使用される光架橋性キトサン誘導体にあっては、キトサン骨格に還元性末端を有する糖類及び光反応性基が導入され、任意に両親媒性基が導入されていてもよい。糖類を導入することにより、キトサン誘導体は中性領域での可溶性に優れており、生理的緩衝液や培地などで溶液化することができ、タンパク質等の酸やアルカリで変性する可能性のある薬物の活性を失うことなく混合できる。さらに、光反応性基を導入することにより、任意の部位に適用した後に光照射することによって即時に不溶性ゲル体を形成して組織と密着するとともに、内部に創傷治癒促進薬を封入して、後に徐放することができる。
なお、本発明の光架橋性キトサン誘導体の骨格をなす高分子として、キトサンに代えてヒアルロン酸等の多糖類やコラーゲン等のタンパク質、その他の合成高分子などいかなるものを使用してもよいが、創傷や組織を密閉することができて薬物保持性や適度な生分解性を有し、速すぎない速度で薬物のコントロールドリリースができる糖類が好適であり、中でも、それ自体が創傷治癒特性や抗菌性を有するキトサンあるいはヒアルロン酸等の糖類、特に原材料の供給やコストなどの点からキトサンが好ましい。
また、光反応性基に代えて化学的架橋性を有する基を導入してもよいが、速やかな分子内架橋が可能でそのスイッチングが容易なものであるのが好ましく、スイッチングが容易で反応性も高く未反応の活性部位が残ることも少ないことから、光反応性基が好適に使用されうる。また、2位にアミノ基を有するキトサンは、光反応性基の導入反応にとっても有利であるため、この点からも好適に使用されうる。
本発明の医療用組成物は、上述した光架橋性キトサン誘導体に加えて、少なくとも1つの創傷治癒促進薬を含有する。本発明における創傷治癒促進薬は、あらゆる意味で当該組成物が適用された部位の創傷の治癒効果を促進する物質であればよい。これには、「医薬品要覧第5版」(大阪府病院薬剤師会著、薬業時報社、1992年)及びその追補版(1992年)に記載された創傷治癒効果を有する薬物などが含まれ、例えば、創傷部位の感染や炎症を防ぐことにより治癒を促進する抗菌剤、抗生物質、あるいは創傷による痛みを緩和する鎮痛剤や麻酔薬なども含まれるものとする。特に、褥創や糖尿病性皮膚潰瘍といった血液循環が阻害された難治性皮膚創傷に適用する場合には、血管新生を誘導する物質、例えば増殖因子、血管新生因子などが好ましい。ここで使用される増殖因子は、血管新生を誘導し、肉芽形成を促進する機能を有する細胞増殖因子であれば特に限定されるものではなく、例えば、FGF−1、FGF−2、HB−EGF、HGF及びVEGF165及びHGF等を挙げることができる。また、本発明の薬物徐放体は組織密着性が極めて高いので、上記増殖因子を発現する遺伝子を組み込んだプラスミドを包含させて創傷部位での自発的な増殖因子供給を行うこともできる。
さらに本発明の医療用組成物は、上記の光架橋性キトサン誘導体及び創傷治癒促進薬に加えて、任意にヘパリン又はヘパラン硫酸などのグリコサミノグリカン類を更に含有していてもよい。例えば増殖因子は、創傷組織近傍に存在する細胞外基質を構成するプロテオグリカン中のヘパリン分子と相互作用して機能調節がなされるとされている。よって、ヘパリン等のグリコサミノグリカン類を含有せしめることにより、本発明の組成物にグリコサミノグリカン類の供給源としての機能も付与することができる。このグリコサミノグリカン類は、単に組成物に混合するだけでもよいが、例えばWO00/27889に記載されているようにキトサン骨格に共有結合させてもよい。
さらに、本発明の組成物は、医療用として許容される他の添加剤を任意に含有していてもよい。例としては、インターロイキン、白血病抑制因子、インターフェロン、TGF−β、エリスロポエチン及びトロンボポエチン等が含まれる。また、哺乳動物においてアポトーシスを誘発することが知られている他の薬剤もまた使用することができ、それら薬剤には、TNF−α、TNF−β、CD30リガンド及び4−1BBリガンドが含まれる。また、癌の治療に有用な化学治療薬を使用してもよく、その例には、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の代謝産物、抗生物質、ピリミジン類似物、5−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン類、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシド、又はコルチコステロイド類、あるいはタモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように機能するホルモン薬も含まれる。
本発明の医療用組成物は、光架橋性キトサン誘導体及び創傷治癒促進薬並びに他の任意成分を、溶媒、好ましくは水性媒体に、好ましくは中性のpHで溶解せしめることにより調製することができる。
このようにして調製される組成物は、創傷部位に塗布されることを考慮すると、適度な粘性を有しているのが好ましい。例えば、一般に市販されている回転粘度計(例えば、B型粘度計、TOKIMEC INC.(Tokyo Japan))によれば、約100〜10,000cps(センチポアズ(mPa・s))、好ましくは約150〜8,000、より好ましくは約200〜6,500cpsの粘度とすると垂直な創傷や組織面への塗布が容易になり、さらに約250〜5,000cps、好ましくは約300〜2,000cpsとすると、あらゆる創傷や組織面での垂れ落ちがなくなって塗布しやすく保持時間も適度な長さとなり、続く光照射などの作業にゆとりができる。但し、水平な創傷面への塗布又は凹部への充填等では、約300cps未満、さらには約200cps未満、さらには約100cps未満の低粘度の組成物も使用できる。また、例えば純水と同程度の低粘度の組成物は、スプレー装置などを用いて水平な創傷面以外にも適用でき、カテーテル等を介した内視鏡治療においては、管内での流動性や内視鏡手術による切除創での保持性などを考慮して適当な粘度を採用しうる。
即ち本発明の医療用組成物における光架橋性キトサン誘導体の含有量は、適用部位での保持性を確保し、架橋後のマトリクスによる内包薬物を確実に担持するためには、少なくとも3mg/ml、より好ましくは少なくとも5mg/ml、少なくとも7.5mg/ml、より好ましくは少なくとも10mg/ml、更に好ましくは少なくとも15mg/ml程度とする。
創傷治癒促進薬の含有量は、適用部位において必要とされる量が徐放されるように適宜決定される。例えば、皮膚創傷部位に適用される場合の増殖因子は、約1〜1000μg/ml、より好ましくは約5〜500μg/ml、更に好ましくは約10〜200μg/mlの含有量とする。
ヘパリン等のグリコサミノグリカン類は、同時に包含される増殖因子の量にもよるが、好ましくは約10〜5000μg/ml、より好ましくは約50〜1000μg/ml、更に好ましくは約100〜500μg/mlの含有量とする。その他の任意成分の含有量は、医療の分野で通常使用されている程度の含有量とし、最適な量は当業者が容易に決定することができる。
本発明の医療用組成物は、光架橋性キトサン誘導体を含有しているため、所定強度の光(紫外線及び可視光など)を所定時間照射することにより、短時間で架橋して不溶性のマトリクスを形成する。形成された架橋キトサンマトリクスは、内部に創傷治癒促進薬などの添加成分を担持し、それらを適当な速度で徐放することができる。
光による架橋条件は、使用する光架橋性キトサン誘導体に導入した光反応性基の種類や置換度、組成物に含有されるキトサン誘導体の量や担持すべき薬物の量、使用する組成物の量及び望ましい徐放速度等に応じて変化しうる。通常は、少なくとも7.5mg/ml程度の光架橋性キトサン誘導体を含有する組成物を100μl程度使用する場合、約2cm程度離間した光源からの光を、約0.01〜300秒、好ましくは約0.05〜120秒、さらに好ましくは0.1〜60秒程度照射するのが好ましく、これにより光反応性基が約100%の架橋度となる。
光照射することにより、光架橋性キトサン誘導体が架橋して不溶性のマトリクスが形成される。形成された架橋キトサンマトリクスは、増殖因子等の創傷治癒促進薬及びヘパリン等の他の添加剤を内包している。これらの薬物は薬物自身の拡散性により或る程度初期放出される場合もあるが、その大部分は架橋キトサンマトリクス内に強固に担持される。その後、架橋キトサンマトリクスが生分解されると、担持されていた薬物が適度な速度で徐放される。
キトサンマトリクスの光反応性基の架橋反応度は特に限られないが、一般に、架橋反応度が高いと薬物の初期放出が少なく、薬物放出体として好適に機能する傾向があるように思われる。よって、本発明の架橋キトサンマトリクスは、少なくとも30%、好ましくは40〜100%、より好ましくは50〜100%、より好ましくは60〜100%、さらに好ましくは70〜100%の架橋反応度を有する。ここで、本発明でいう「架橋反応度(又は架橋度)」は、光架橋性キトサン誘導体に存在する光反応性基の中で他の基等と結合したものの割合を指すものとする。
より具体的な使用形態としては、本発明の医療用組成物は、例えば皮膚潰瘍を有する組織に適用されて光照射される。当該組成物は適度な粘性を有しているので、損傷部位から流れ落ちることなく保持され、光照射による分子間架橋によって速やかな接着性の不溶性ゲル体(マトリクス)となり、損傷組織を密閉すると同時に内包する薬剤を徐放して、創傷の保護と治癒を促進する。また、胃壁や癌組織などではそれらを治療する薬剤を包含させることによって胃潰瘍や腫瘍組織被覆剤として治療効果を誘導することもできる。
よって、本発明の医療用組成物に光照射して形成される架橋キトサンマトリクスは、特に創傷治癒に適した極めて優れた薬物徐放体を構成する。
なお、従来は塩基性のキトサン骨格には担持されないと考えられてきた塩基性の増殖因子(FGF−2)が、本発明の光架橋性キトサン誘導体から形成されたマトリクス内には酸性の増殖因子(FGF−1)と同等以上に担持され徐放されたことは驚くべきことである。
また、光架橋性キトサン誘導体にポリオキシアルキレンアルキルエーテル等の両親媒性基を更に導入した場合は、光照射後の架橋キトサンマトリクスは、例えば自重の100倍に近い水分を迅速に吸収できる程度の高含水性となり、創傷部位や外科処置部位から出血を吸収して止血を促進することもできる。
さらに本発明の架橋キトサンマトリクスは、内部に細胞増殖因子を包含し、それを徐々に放出するという特性を有するため、組織再生用細胞培養基材として使用することもできる。例えば、細胞培養プレート等の表面に本発明の医療用組成物を塗布し、光照射して膜状の架橋キトサンマトリクスを形成する。当該細胞培養プレートの被覆部分に目的とする細胞培地を配置してインキュベートすると、当該細胞の増殖が刺激される。よって本発明は、上記の架橋キトサンマトリクス、中でも増殖因子を内包するマトリクスは組織再生用細胞培養基材として有効に使用できる。
本発明の組成物は、一般的には上述したように粘性を持つ水溶液として提供されるが、例えば、当該水溶液を凍結乾燥させた固体(例えば粉体)として提供してもよい。固体状の組成物は、水性媒体で溶解又は膨潤させることにより即座に使用に供することができる。
実施例
以下、本発明を具体例を用いて更に詳細に説明するが、これらの具体例は本発明の範囲を限定するものではない。
(合成例1)
光(紫外線)架橋性キトサン誘導体(UV−RC)の合成
キトサン骨格に紫外線反応性基及び糖鎖を導入したUV−RCを、WO00/27889に記載された方法に準じて合成した。具体的には、カニ由来の800〜1000kDaの分子量及び80%の脱アセチル化度を持つキトサン(焼津水産工業(株)製)のアミノ基に、アジド(p−アジド安息香酸)及びラクトース(ラクトビオン酸)を縮合反応により導入した。ラクトースの導入により中性pHで可溶性であり、p−アジド安息香酸及びラクトビオン酸の置換度が、各々約2.5%及び2.0%であることが確認された。
また、エビ殻及びイカ軟骨由来のキトサン素材を使用した場合にも、同様の誘導体が合成できた。
(合成例2)
光(可視光)架橋性キトサン誘導体(VL−RC)の合成
下記式で表されるメチル−4−[2−(4−ホルミルフェニル)エテニル]ピリジンメトスルホネート(FPP)を、Journal of Polymer Science:Polymer Chemistry Edition,Vol.20,1419−1432(1982)記載の方法に準じて合成した。
具体的には、γ−ピコリン(3.07g,33mmol)のメタノール(8.3ml)溶液を氷冷下、硫酸ジメチル(4.16g,33mmol)に加えた。溶液を室温で1時間放置した後、テレフタルアルデヒド(13.4g,100mmol)を加え、加熱して溶解させた。続いてピペリジン(0.47ml)を加え、5時間還流した。析出物を熱時ロ過により除いた。温濾液はエタノール(50ml)とアセトン(16.7ml)の混合溶媒と合わせ、室温で一晩放置した。黄色析出物をろ過により分取し、エタノール及びアセトンで洗浄後、減圧乾燥をしてFPPを得た。収量4.81g(46%)、融点210〜213℃であった。
上記合成例1記載のキトサンにラクトースを導入した誘導体(CH−LA)(1g)を蒸留水(100ml)に溶解し、上記で得たFPP(368mg,1.15mmol)を加えて30分間撹拌した。1N NaOHにてpHを4.75に調製し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(112mg,1.73mmol)の注射用水(8ml)溶液を加えた。室温、遮光状態で24時間撹拌した。アセトン(360ml)に注いで沈殿させた。沈殿物を十分にメタノール及びアセトンで洗浄して減圧乾燥をし、VL−RCを得た。収量728mg、置換度1.55%であった。
合成例2で得たCH−LA、FPP及びVL−RCを各々0.01wt%、0.001wt%及び0.01wt%含有する水溶液を調製し、各水溶液について蛍光分光光度計で吸収特性を測定した。それらの結果の一部を比較して図1に示す。
図1に示したスペクトルに示されるように、VL−RCはFPPと同様に340〜350nm付近に極大吸収が見られ、可視光反応性のFPPが導入されていることが確認された。また、エビ殻及びイカ軟骨由来のキトサン素材を使用した場合も、同様に可視領域に吸収を示す誘導体が合成できた。
(実施例1)
上記合成例1及び2で得たUV−RC及びVL−RCの2%水溶液を調製し、各溶液にウシオ電機製の照射装置で各種波長の光を照射し、WO00/27889の実施例4に記載の要領で架橋キトサンマトリクスによる接着の強度試験を行った。
具体的には、2×3cmに裁断した厚さ2mmの食用ハム2枚を2×6cmになるように並べ、2枚のハムの境目を中心に2×2cm、厚さ2mmになるように、前記各溶液を塗布した。
この後直ちに、塗布した溶液に30秒間光照射して2枚のハムを接着させた。接着した2枚のハムの一方をクリップでスタンドに固定し、もう片方のハムの末端に漸次加重をかけ、断裂する加重量を測定した。ハムを接着している架橋キトサンゲルが断裂したときの、ゲルの断面積当たりにかかった重量(102kg/m2)で評価し、各誘導体についての結果を、UV−RC(カニ)の断裂時の3×102Kg/m2を基準にして相対的に表示した(表1)。
(実施例2)高分子物質の担持性
調製されたカニ由来のUV−RCを用いて高分子物質(タンパク質)の担持特性を調べた。水溶性及び高分子物質の担持特性を変化させる目的で、ラクトースの導入率を0、2、5、10、及び20%としたUV−RCを調製し、各UV−RCの1wt%溶液と10wt%ウシ血清アルブミン溶液とを4:1の割合で混合してpHを6.0又は7.0に調整した。その際に混合液中に発生した不溶化物の量及び混合液の粘度を比較した。混合液の粘度は、ガラス管内での混合溶液の移動速度から見積もった。その結果を下記の表2に示す。
上記に示されるように、ラクトースを導入しない場合には何れのpHでも不溶物質が発生したのに対し、ラクトースの導入によって生理的条件(pH6及び/又は7)で可溶化できた。さらに、タンパク質(アルブミン)のような高分子物質を取り込む場合には、ラクトースの導入率を上げた方が不溶性の沈殿物が発生し難く、薬物などを担持させる光架橋性キトサン誘導体として有利であることも解った。また、生理的条件又はその近傍(pH6又は7)において、ラクトース導入率を約5%以上、好ましくは約10%以上とすれば、大量のタンパク質などの高分子物質を好適に担持させることができることが示された。
(実施例3)
架橋キトサンマトリクスからの薬物放出(1)
リン酸塩緩衝液(PBS)に溶解させた1mg/mlのトリパンブルー(酸性低分子モデル)あるいはトルイジンブルー(塩基性低分子モデル)をカニ由来キトサンから合成されたUV−RCの2wt%水溶液と1:3の割合で混合した。調製された混合溶液50μlをポリスチレン製24穴組織培養用マルチウエルに添加し、UV照射してウェル底面に低分子色素を含有した架橋キトサンマトリクス層を形成した。このマトリクスをPBSで洗浄し、1mlのPBSを加えてロータリシェーカーで室温において穏やかに揺動しながらインキュベートした。PBSは毎日交換した。
所定時間間隔でPBSを回収し、PBS中に溶出した色素の量を吸光度(OD640)から見積もった。架橋キトサンマトリクスに残留した色素量の時間変化を図2に示す。
図2に示されるように、塩基性のアミノ基を有する架橋キトサンマトリクス(UV−RC)に担持させた低分子色素は、酸性のトリパンブルーの場合はイオン的相互作用により長期間に渡って完全にゲル内に保持されたが、塩基性であるトルイジンブルーは1日で殆ど全てがPBS中に溶出した。
(実施例4)
架橋キトサンマトリクスからの薬物放出(2)
低分子色素を多糖類であるヘパリン、タンパク質であるアルブミン及びプロタミンに換えた以外は実施例3と同様の条件で試験し、高分子物質の溶出性を比較した。溶出したヘパリン量はカルバゾールアッセイ(Guo,Y.,Conrad及びH.E.,Anal.Biochem.,176,96−104(1989))、タンパク質量はプロテイン・アッセイ・キットを用いて測定した。その結果を図3に示す。
図3に示されるように、高分子物質であるヘパリン等は架橋キトサンマトリクス内に効率よく捕捉され、長期間に渡って溶出が抑制された。保持性は、酸性多糖類であるヘパリンが最も高く、塩基性タンパク質であるプロタミンは最初の1日で30%程度溶出した後に溶出が抑制された。中性タンパク質のアルブミンは両者の中間に相当する挙動を示した。いずれにしても、2日目からは担持された高分子物質の有意な溶出は無く、架橋キトサンマトリクスは酸性、中性、塩基性等の性質によらず、多糖類やタンパク質といった高分子物質を長期間にわたり強固に担持することがわかった。
(実施例5)
架橋キトサンマトリクスからの薬物放出(3)
担持される物質を増殖因子であるFGF−1、FGF−2、ヘパリン結合性EGF(HB−EGF)、及びVEGF165に換えた以外は、実施例3及び4と同様にして溶出試験を行った。各増殖因子の溶出量は、市販のヘパリン化ビーズを用いたELISA法(Sigma Aldrich)で見積もった。
その結果、全ての増殖因子について実施例4のアルブミンとほぼ一致した溶出プロフィールが観察された。各増殖因子の間では、1日目の初期溶出に若干の違いが認められ、その溶出量は、FGF−1が最も少なく、次いでFGF−2、HB−EGF、VEGF165の順に増加したが有意な差異は見られなかった。何れの増殖因子においても、1日目の初期溶出量が20%を超えることは無かった。代表例として、FGF−2を嘆じさせた場合の結果を図4に示す。
(実施例6)
架橋キトサンマトリクスからの薬物放出(4)
担持させる薬物としてアルブミンを使用し、UV−RCの濃度を0.5〜1.5wt%の範囲で変化させて実施例4と同様の試験を行った。第1日目の経過時に架橋キトサンマトリクスに保持されていたアルブミン量をUV−RC濃度に対してプロットした結果が図5である。薬物、特に高分子物質の初期溶出性は、図5に示されるように、UV−RCの含有量、即ちキトサン分子密度に依存することは明らかである。
実施例3〜6の結果から、糖類、タンパク質又は増殖因子といった高分子物質は本発明の架橋キトサンマトリクスに効率よく担持され、特に2日目以降の溶出がほぼ完全に抑制されて安定に保持されることが実証された。また、これらの高分子物質は、低分子物質とは異なり、酸性、中性、塩基性といった分子の性質によらず良好に保持されるが、中でも酸性基を多く有する薬物は保持安定性が高いことが示された。また、溶出抑制効果は上記タンパク質や細胞増殖因子で7日以上に渡って維持された。一方、7日目にキトサンハイドロゲルを分解するキチナーゼ/キトサナーゼ混合酵素を添加したPBSに置換したところ、徐々に高分子物質の溶出が開始された。このようなキトサンマトリクスの生分解による徐放性は少なくとも1週間以上継続した。
(実施例7)
架橋キトサンマトリクス上でのHUVECの培養
実施例4で調製した増殖因子(FGF−1、FGF−2、HB−EGF及びVEGF165)を担持させた架橋キトサンマトリクスを細胞培養デイッシュ上で形成し、当該マトリクスを1、3、7日間PBSで洗浄した。その後HUVECを播種して3日間培養した後、各増殖因子を担持したマトリクス上での増殖性を評価した。また、7日間洗浄したマトリクスを含むディッシュにキチナーゼ/キトサナーゼ酵素を添加した培地でも同様に評価した。結果を表3に示す。表中の数値は、UV−RCのみ(増殖因子無し)のマトリクス上で培養した場合の増殖性を100とした相対値である。
洗浄日数0日とは、架橋キトサンマトリクスを洗浄することなくHUVECを播種したことを意味する。表3から明らかなように、マトリクスからの増殖因子の初期放出がある未洗浄の場合に最も高い細胞増殖性が認められ、1日以上洗浄して増殖因子の放出がほぼ完全に抑制された場合には増殖因子を含まないマトリクス(数値100)と同等の増殖性しか示さない場合も見られた。しかしながら、酵素を添加した場合、架橋キトサンマトリクスの分解に伴う各増殖因子の再放出により、未洗浄マトリクスに匹敵する増殖性を回復した。代表例として、FGF−2を担持させた場合の結果を図6に示す。図6のグラフ縦軸は増殖性(増殖率)の相対値であり、増殖細胞数と相関している。また、図6中の点線は、数値100のベースラインである。
(実施例8)
架橋キトサンマトリクスからのトリパンブルーのインビボでの放出
実施例3に従って、トリパンブルーを担持させた架橋キトサンマトリクスを調製し、それをマウスの背中の尾の付け根2cmの位置に100μl埋入した。所定期間経過後に、マトリクスを取り出して洗浄し、100mMの硝酸ナトリウムでキトサンを分解して残存しているトリパンブルーの量を測定した。その結果を図7に示す。
実施例3の結果では、トリパンブルーは架橋キトサンマトリクスからPBS中に殆ど放出されなかったのに対し(図2)、インビボでは、図7に示されるように、生体内に存在する酵素によってキトサンマトリクスが分解され、約2週間に渡ってトリパンブルーが徐々に放出され、マトリクスに残存する色素量が減少した。
(実施例9)
架橋キトサンマトリクスからの増殖因子のインビボでの放出
実施例5に従って、FGF−1あるいはFGF−2を含む組成物を調製し、各100μlにUV照射して架橋キトサンマトリクスとした。さらに、増殖因子を安定化させる目的で最終濃度20μg/mlのヘパリンを共存させたものも調製した。これらを、実施例8と同様にマウスの背中に埋入して4日間放置した。その後、埋入したマトリクス周辺の皮膚1×1cmを剥離し、皮膚組織を細かく裁断し、溶血剤(Sigma Aldrich)で組織中の赤血球ヘモグロビンを抽出した。ヘモグロビンアッセイキット(Sigma Aldrich)で検出したヘモグロビン量から、当該部位における毛細血管誘導性を見積もった。結果を図8に示す。なお、組成物への増殖因子の添加量は1、4、15μg/100μgで変化させた。
図8に示されるように、架橋キトサンマトリクスに4μg以上のFGFを保持させることによって、ゲル埋入部位付近での血管形成に伴う著しいヘモグロビン(Hb)増加が認められた。このような効果は、FGFの機能を増強させてイオン的相互作用で増殖因子を滞留させる効果が期待できるヘパリンの添加によって更に強化された。
対照として、増殖因子は含むが光架橋させていないキトサン誘導体の埋入も同時に行ったが、ヘモグロビンの増加は認められなかった。これは、増殖因子が短時間で拡散放出されてしまい、徐放効果が得られなかったためと考えられる。また、架橋キトサンマトリクスにヘパリンのみを保持させた場合にはFGFを添加しない場合と同じ程度のHb量であった。
さらに、FGF濃度を4μgに固定し、同様の試験を15日間継続したが、ヘモグロビンの増加傾向は維持された。図9(B)に示すように、特にFGF−2を使用した場合にHb増加傾向の維持効果が顕著であり、15日後においても1mg以上のレベルであった。なお、埋入部位付近での癌化の徴候は全く観察されなかった。
(実施例10)
創傷モデルにおける治癒促進効果
(1)マウスにおける皮膚創傷モデルの形成
この実験においては、雌の糖尿病変異体マウスであるC57BL/ksj db/db及びその正常な同腹子(db/+)(CREA Japan社)を使用した。全てのマウスは、標準的な実験室食餌及び水を与え、10週齢を越えたときに実験に供した。実験に先立って、マウスの尿をグルコース及びタンパク質について試験片(Uro−Labstrix:Bayer Medical社)を用いてチェックした。その結果、db/dbマウスは重篤な糖尿病であり、db/+マウスは正常である診断された。
各マウスをジエチルエーテルで麻酔し、背面の毛を完全に剃り落とした後、鋭利な鋏及びメスを用いて各マウスの背面上部に皮膚全厚に渡る円形創傷(約100mm2)を形成した。
(2)創傷治癒促進効果
20mg/mlのUV−RC水溶液にヒト組換えFGF−2(Pepro Tech EC社)添加した組成物あるいはFGF−2を添加しない組成物を、各マウスの創傷に100μl塗布し、2cmの距離から紫外光を20秒間照射して架橋キトサンマトリクスとした。同様の創傷(約100mm2)を形成し、何も処理しないマウスをコントロールとした。各マウスの創傷面積の変化を2日毎にカリパスを用いて測定した。目視観察によると、架橋キトサンマトリクスは、治癒プロセスを通して水和したハイドロゲルを形成していた。
db/dbマウスについて、創傷形成から2、4、8、及び14日目における創傷の写真を図10に示す。さらに、創傷閉塞速度を、非閉塞面積の創傷形成時の面積に対する割合(%)を時間の関数として評価し、その結果を図11にプロットした。
図10及び11から明らかなように、コントロール創傷(A)では、14日目においても、創傷面積の約50%しか閉塞されておらず、約80%の創傷閉塞が達成されたのは20日以後であった。これに対し、FGF−2を担持した架橋キトサンマトリクスで被覆した創傷(C)の面積は極めて迅速に縮小し、およそ6〜10日目に創傷の約80%が閉塞され、14日目には殆ど完全に治癒した。また、(FGF−2を含まない)架橋キトサンマトリクスのみで被覆した創傷(B)は両者の中間に相当する結果を示した。本発明の光架橋性キトサン誘導体を含む組成物による治癒効果は、特に初期2日間に顕著に発揮され、その効果が治癒の達成まで継続することが確認された。
一方、db/+マウスについて、創傷形成から2、4、及び10日目における創傷の写真を図12に示し、創傷治癒速度のグラフを図13に示す。
正常なdb/+マウスの場合は、全ての条件において、治癒障害を持つdb/dbマウスより創傷治癒が速いが、本発明の架橋キトサンマトリクスで被覆した場合は、未処理のコントロールに比較して治癒が有意に促進された。より詳細に言えば、コントロール(A)では10日目に約70%の創傷閉塞が見られたのに対し、架橋キトサンマトリクスで被覆した場合((B)及び(C))では、8日以内に約80%の創傷閉塞が達成された。また、FGF−2を添加することによる治癒促進効果は、治癒プロセスの初期(約6日以内)に顕著であり、その後はFGF−2添加の有無による有意な相違は見られなかった。これは、正常なdb/+マウスにおいては、治癒に必要とされる増殖因子等が生体内からも供給されるためと考えられる。即ち、FGF−2等の増殖因子を適切かつ長期に渡って徐放できる本発明の架橋キトサンマトリクスは、糖尿病性皮膚潰瘍等の難治性外傷の治療に特に適している。
なお、ヘパリン(ブタ小腸由来、Scientific Protein Laboratories社)を更に添加した場合にも、上記と同等以上の治癒促進効果が認められた。
(実施例11)
db/dbマウスにおける創傷モデルの組織学的観察
実施例10における各測定日に創傷組織を含む皮膚の一部を採取し、それを10%ホルムアルデヒド溶液中で固定し、パラフィンに包埋し、創傷表面に垂直な断面で4μmの厚さにスライスした(Yamato Kohki社)。スライスした断片をガラススライドに置き、ヘマトキシリン−エオシン(HE)試薬で染色した。
図14は、2、4、8及び16日目における各断片を示す写真である。図中に付した矢印は上皮化組織の端部を示している。未処理のコントロール(A)では、16日目においても上皮化が進んでいないが、FGF−2担持キトサンマトリクスで被覆した創傷(C)では上皮化が急速に進み、16日目には殆ど完全に上皮化されている。FGF−2を含まないキトサンマトリクスの場合(B)は両者の中間に相当する上皮化が観察された。
創傷形成から4日目の断片の顕微鏡写真を図15に示す。図中に付した▼印は形成された肉芽組織の端部、白矢印は血管形成部位、そして黒矢印は残っているキトサンマトリクスを表す。FGF−2担持キトサンマトリクスで被覆した創傷(C)においては、血管形成及び肉芽組織形成が進んでいる。FGF−2を含まないキトサンマトリクス被覆した場合(B)においても、若干の血管形成が観察される。しかしながら、未処理のコントロール(A)では血管形成及び肉芽組織形成のいずれも観察されない。
例えば、FGF−2の水溶液を1日に1回、db/dbマウスの創傷開口部に添加した場合、再上皮化の促進に対しては僅かな効果しか示さなかったとの報告がある(Tsuboi,R.and Rifkin,D.B.,J.Exp.Med.,1990:172,245−251)。本発明者等は、FGF−2溶液を使用した場合には、創傷開口部に大きな瘡蓋が形成され、それがケラチノサイトの遊走に悪影響を与えたのであろうと推察する。本発明によれば、キトサンマトリクス(ハイドロゲル)が創傷開口部を被覆しているので、大きな瘡蓋が形成されず、マトリクス中のFGF−2が再上皮化を促進したものと考えられる。
また、図16は、創傷形成から4日目の断片にCD34による免疫染色を施したサンプルの顕微鏡写真である。未処理のサンプル(A)に比較してFGF−2担持キトサンマトリクスで被覆したサンプルでは血管新生が有意に増加していることが観察された。顕微鏡の1視野当たりに存在する平均血管数を数えた結果を下記の表4に示す。
(実施例12)
ラットを開腹して胃壁面にレーザーメスによる潰瘍モデルを形成した。上記と同様の治癒促進効果が病理組織観察によって確認された。具体的には、治癒速度が架橋キトサンマトリクス(GF無し)、架橋キトサンマトリクス+GFの順で向上した。このことは、胃酸による非生理的環境(pH2程度)でも、キトサンゲルがGFなどの薬物を或る程度保護し、治癒に寄与したことを示唆するものである。結局、数例の動物実験では、被覆しない場合に比較すると、最大約1/2の期間で治癒が確認された。但し、実用的には、胃酸により低pH環境となっている胃壁で使用する場合には、緩衝剤やH2ブロッカー等の胃酸の作用や分泌を抑制する物質の共存下で使用するのが好ましい。しかしながら、十二指腸以降の消化器では、そのような物質を共存させなくても良好にGF等が保護され、優れた創傷治癒促進効果が発揮される。
なお、上記の効果は、紫外線架橋型(UV−RC)のみならず、可視光架橋型のVL−RCを使用した場合でも同様に認められた。
産業上の利用可能性
本発明で使用する架橋性キトサン誘導体は、ラクトース部分と光反応性基の両方を有しておいるため、中性付近の生理的pHで水に可溶であり、その水溶液を光(UV又は可視光)照射することにより、通常は10秒以内に、軟質ゴムに匹敵する強度の不溶性ハイドロゲルとなる。形成された架橋キトサンマトリクスは、創傷を良好に閉塞し、適切な加湿治癒環境において創傷を保護し、収縮させる。
また、本発明の架橋キトサンマトリクスは、糖類やタンパク質、増殖因子等の高分子物質を特に良好に担持することができ、インビボにおけるマトリクスの生分解に伴い、担持された物質を徐放する能力を有する。特に、FGF等の拡散性の高い増殖因子を含む創傷治療剤を担持させた架橋キトサンマトリクスで創傷を被覆した場合、増殖因子等を適切に徐放することによって創傷治癒を促進し、癌化を誘発することもない。よって、本発明の組成物は、糖尿病性皮膚潰瘍等の組織が壊死した難治性創傷の治癒を促進させるのに特に有用である。
本発明の架橋キトサンマトリクスは、FGF以外の創傷治癒に関連する増殖因子、例えば血小板由来成長因子(PDGF)、トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)、血管内皮細胞成長因子(VFGF)又は上皮成長因子(EGF)などを担持し、徐放するキャリアとして使用することもできる。
さらに、本発明の架橋キトサンマトリクスは、細胞培養又は組織再生のための培養基材としても使用できる。
【図面の簡単な説明】
図1は、合成例1及び2で調製したラクトース導入キトサン誘導体(CH−LA)、可視光反応性化合物(FPP)及び可視光架橋型キトサン誘導体(VL−RC)の各水溶液の光吸収スペクトルを示すグラフである。
図2は、インビトロにおける、本発明の架橋キトサンマトリクスからPBSへの低分子色素(トリパンブルー及びトルイジンブルー)の放出を示すグラフである。
図3は、インビトロにおける、本発明の架橋キトサンマトリクスからPBSへの高分子物質(糖類、タンパク質)の放出を示すグラフである。
図4は、インビトロにおける、本発明の架橋キトサンマトリクスからPBSへの高分子物質(FGF−2)の放出を示すグラフである。
図5は、インビトロにおける、本発明の架橋キトサンマトリクスの分子密度(キトサン誘導体濃度)と内部に担持された物質の残存率との関係を示すグラフである。
図6は、本発明の架橋キトサンマトリクス上でのHUVEC細胞増殖性とマトリクスからのFGF−2放出との関係を示すグラフである。
図7は、インビボにおける、本発明の架橋キトサンマトリクスからの低分子色素(トリパンブルー)の放出を示すグラフである。
図8は、本発明の架橋キトサンマトリクスからの増殖因子(FGF)の徐放による血管新生効果を示すグラフである。担持させるFGF濃度とヘモグロビン量との関係を示す。○はFGF担持キトサンマトリクスを示し、●は更にヘパリンを添加したものを示す。
図9は、本発明の架橋キトサンマトリクスからの増殖因子(FGF)の徐放による血管新生効果を示すグラフである。ヘモグロビン量の時間変化を示す。○はFGF担持キトサンマトリクスを示し、●は更にヘパリンを添加したものを示す。◆はヘパリンのみを担持させた比較例、△はFGFを添加したUV−RC水溶液を示す。
図10は、db/dbマウスの創傷モデルにおける本発明の架橋キトサンマトリクスの治癒効果を示す写真である。(A)は未処理のコントロール、(B)はFGFを含まない架橋キトサンマトリクス被覆創傷、(C)はFGFを含む本発明の架橋キトサンマトリクス被覆創傷である。
図11は、db/dbマウスの創傷モデルにおける本発明の架橋キトサンマトリクスの治癒効果を示すグラフである。(A)は未処理のコントロール、(B)はFGFを含まない架橋キトサンマトリクス被覆創傷、(C)はFGFを含む本発明の架橋キトサンマトリクス被覆創傷である。
図12は、db/+マウスの創傷モデルにおける本発明の架橋キトサンマトリクスの治癒効果を示す写真である。(A)は未処理のコントロール、(B)はFGFを含まない架橋キトサンマトリクス被覆創傷、(C)はFGFを含む本発明の架橋キトサンマトリクス被覆創傷である。
図13は、db/+マウスの創傷モデルにおける本発明の架橋キトサンマトリクスの治癒効果を示すグラフである。(A)は未処理のコントロール、(B)はFGFを含まない架橋キトサンマトリクス被覆創傷、(C)はFGFを含む本発明の架橋キトサンマトリクス被覆創傷である。
図14は、db/dbマウスの創傷モデルにおける創傷断面の時間変化を示す写真である。(A)は未処理のコントロール、(B)はFGFを含まない架橋キトサンマトリクス被覆創傷、(C)はFGFを含む本発明の架橋キトサンマトリクス被覆創傷である。
図15は、db/dbマウスの創傷モデルにおける4日目の創傷断面をHE染色したサンプルの顕微鏡写真である。(A)は未処理のコントロール、(B)はFGFを含まない架橋キトサンマトリクス被覆創傷、(C)はFGFを含む本発明の架橋キトサンマトリクス被覆創傷である。
図16は、db/dbマウスの創傷モデルにおける4日目の創傷断面をCD34により免疫染色したサンプルの顕微鏡写真である。(A)は未処理のコントロール、(B)はFGFを含む本発明の架橋キトサンマトリクス被覆創傷である。
Claims (13)
- 光架橋性キトサン誘導体と創傷治癒促進薬とを含有することを特徴とする医療用組成物。
- 光架橋性キトサン誘導体を、少なくとも3mg/ml含有することを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 創傷治癒促進薬が増殖因子であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 増殖因子がFGF−1、FGF−2、HB−EGF、VEGF165又はHGFであることを特徴とする、請求項4に記載の組成物。
- グリコサミノグリカン類を更に含有することを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- グリコサミノグリカン類がヘパリン又はヘパラン硫酸であることを特徴とする、請求項6に記載の組成物。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物に光を照射することによって得られる、創傷治癒促進薬及び任意にグリコサミノグリカン類を担持した架橋キトサン誘導体マトリクス。
- 光反応性基による架橋度が30〜100%であることを特徴とする、請求項8に記載の架橋キトサン誘導体マトリクス。
- 創傷治癒促進薬が増殖因子であることを特徴とする、請求項8又は9に記載の架橋キトサン誘導体マトリクス。
- 請求項8から10のいずれか一項に記載の架橋キトサン誘導体マトリクスからなることを特徴とする薬物徐放体。
- 請求項10に記載の架橋キトサン誘導体マトリクスを含んでなることを特徴とする組織再生用又は細胞培養用基材。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物を含んでなる、難治性皮膚創傷治療用の創傷被覆材。
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