JP4215308B2 - 複合キトサン化合物及びその用途 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、複合キトサン化合物及びその用途に関し、より詳細には、キトサン中のD−グルコサミンのアミノ基と、カルボキシル基を有する単糖のカルボキシル基とが結合してなる複合キトサン化合物及びその用途に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
蟹等の甲殻類や昆虫類等の節足動物の外骨格、菌類等の細胞壁には、キチンが多く含まれていることが知られている。キチンは、N−アセチル−D−グルコサミンがβ(1→4)結合で数多く結合した高分子多糖であり、セルロースと同様に、生物構造を支持したり、保護する多糖として、自然界にも多く存在している(阿武喜美子・長谷川栄一編、ムコ多糖実験法〔I〕、p5、南光堂(1972))。
【0003】
このように自然界に多く存在するキチンを有効利用する目的で、従来から種々の研究がなされ、その過程で、キチンをアルカリ加水分解によって部分的もしくは完全に脱アセチル化して、キトサンが創り出された。
一般に、キトサンは、キチンのアセチル基の約80%以上が脱アセチル化されたものを意味し(木船紘爾、キチン、キトサンのメディカルへの応用、p11、技報堂出版(1994))、部分的にN−アセチル−D−グルコサミンを含んだD−グルコサミンがβ(1→4)結合した高分子多糖である。特に、α型のキトサンは、水には溶解しないが、構造中にD−グルコサミン由来の遊離のアミノ基が存在するために、キチンと異なり希塩酸、有機酸水溶液等に溶解するとともに、高分子電解質となり得ることから生物資源としてはキチンより有望視されている。そのため、キチンの年間消費量の8割以上は、キトサンを生産するための原料として使用されている(キチン、キトサン研究会編、キチン、キトサンの応用、p8、技報堂出版(1990))。
【0004】
しかし、α型のキトサンは水や多くの有機溶媒に不溶であること、酸溶液には溶解するが塩基性になると不溶化し、析出すること等から、溶液状態での利用はあまり研究されておらず、低分子化処理したキトサンを除けば、溶液状態で利用されていないのが現状である。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、以上のことから、キトサンの構成糖であるD−グルコサミンのアミノ基に着目して、キトサンの水への親和性を高めるべく鋭意研究を進めた結果、D−グルコサミンのアミノ基をカルボキシル基を有する単糖と結合させることにより、カルボキシル基を有する単糖の水酸基をはじめとする極性基の影響によってキトサンと単糖との複合体が、優れた親水性を示すことを見出し、本発明の完成に至った。
【0006】
すなわち、本発明によれば、繰り返し単位が、式(I)
【0007】
【化2】
【0008】
(式中、グリコシド単位の間の結合はβ(1→4)であり、Rは−NH2 ・COOH−R’又は−NHCO−R’(ここで、COOH−R’は少なくとも1つのカルボキシル基を有する単糖を示し、CO−R’は、該単糖のカルボキシル基からOHを除いた残基を示す))
で表される複合キトサン化合物が提供される。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明の複合キトサン化合物は、繰り返し単位が、式(I)
【0010】
【化3】
【0011】
(式中、グリコシド単位の間の結合はβ(1→4)であり、Rは−NH2 ・COOH−R’又は−NHCO−R’(ここで、COOH−R’は少なくとも1つのカルボキシル基を有する単糖を示し、CO−R’は、該単糖のカルボキシル基からOHを除いた残基を示す))
で表されるように、キトサンの遊離のアミノ基に、少なくとも1つのカルボキシル基を有する単糖が共有結合又はイオン結合した化学構造を有し、優れた親水性を示す化合物である。
【0012】
本発明の複合キトサン化合物におけるキトサンは、キチンのアセチル基の約80%程度以上が脱アセチル化された遊離のアミノ基を有する化合物である。キトサンとしては、天然品(α型及びβ型)又は合成品のいずれも使用することができるが、なかでも、市販されているα型のキトサンが粘度やアセチル化度が既知であるため好ましい。本発明においては、キトサンのアミノ基のうちの10〜80%、好ましくは10〜60%程度が、単糖のカルボキシ基と、アミド結合等の共有結合及び/又はイオン結合を構成する。なお、単糖のカルボキシル基と結合を形成していないアミノ基は、酸、例えば塩酸、臭酸、硫酸、酢酸、蟻酸等と塩を形成していてもよい。
【0013】
上記の式(I)における「少なくとも1つのカルボキシル基を有する単糖」は、その構造中に1つ以上のカルボキシル基を有するものであれば特に限定されず、例えば、D−グルクロン酸、D−ガラクツロン酸、L−イズロン酸、D−マンヌロン酸等の各種ウロン酸;N−アセチルノイラミン酸、N−グリコリルノイラミン酸、N、O−ジアセチルノイラミン酸等の各種シアル酸等が挙げられる。なかでも、D−グルクロン酸、D−ガラクツロン酸が好ましい。
【0014】
本発明の複合キトサン化合物は、例えば、以下のような方法で製造することができる。
例えば、キトサンのアミノ基と単糖のカルボキシル基とが共有結合した複合キトサン化合物を得るために、まず、カルボキシル基を有する単糖の水溶液(0.1〜2%(w/v)程度)中に、単糖に対してキトサン(10〜30%(w/w))を溶解し、その後、水溶性の縮合剤(例えば、N−シクロヘキシル−N’−(2−モルホリノエチル)カルボジイミド、メト−p−トルエンスルホン酸塩等)を加えて反応させ、続いて、透析等で精製を行い、さらに、有機溶媒(例えば、メタノール、エタノール等の低級アルコール等)で複合キトサン化合物を不溶化させる。また、単糖のカルボキシル基を、アミノ基と反応しうる活性誘導体とした後、反応させてもよい。
【0015】
さらに、キトサンのアミノ基と単糖のカルボキシル基とがイオン結合した複合キトサン化合物を得るために、まず、カルボキシル基を有する単糖の水溶液(0.1〜2%(w/v)程度)中に、単糖に対して当量もしくはそれ以下の量(w/w)のキトサンを溶解することにより両者を反応させ、その後、透析等で精製を行い、さらに、有機溶媒(例えば、メタノール、エタノール等の低級アルコール等)で複合キトサン化合物を不溶化させる。
【0016】
なお、本発明の複合キトサン化合物は、上述したように、キトサンのアミノ基と単糖のカルボキシル基とが共有結合するか、イオン結合するか、あるいは両方の結合が同じ分子内に存在しているものでもよく、いずれにしても、水に不溶性であるキトサンと単糖とが複合化合物を形成することにより、親水性を発揮し得るものである。
【0017】
本発明の複合キトサン化合物は、一般に保湿作用を有するヒアルロン酸と同等の保湿作用を有する。また、一般にキトサンには殺菌作用のあることが知られており(キチン、キトサン研究会編、キチン、キトサンの応用、p71、技報堂出版(1990))、本発明の複合キトサン化合物も、その基本構造がキトサンであることから、同様の活性を有している。さらに、本発明の複合キトサン化合物は、水との親和性が非常に高く、水を骨格中に取り込んで容易にゲルを形成し、水に溶けている物質も水と共に骨格中に取り込む性質を有している。
【0018】
しかも、キトサン自体はマウスに1日体重1kgあたり18gを19日間連続投与してもほぼ無害なほど毒性が低いことも知られており(荒井ら、キトサンの毒性について、東海水研報、56、p89−94(1986))、複合キトサン化合物を形成する単糖もそれ自体、生体内に多く存在しているものであることから、本発明の複合キトサン化合物も無害である。
【0019】
よって、本発明の複合キトサン化合物は、高い安全性を有し、医薬品、化粧品、衛生用品、食品等の種々の分野で、例えば、創傷治療剤、創傷保護剤、保湿剤、種々のゲル製剤調製のための基剤、水分吸収体(例えば、流せるオムツ)、健康食品、ダイエット食品あるいはこれら食品への添加物等として使用することができる。
【0020】
本発明の複合キトサン化合物を保湿剤として使用する場合には、本発明の複合キトサン化合物は、0.5〜10%(w/v)程度の割合で、水に溶解して使用することが好ましい。ここで水とは、水道水、イオン交換水、精製水、蒸留水等いずれでもよい。
以下に本発明の複合キトサン化合物の実施例及び試験例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0021】
なお、実施例において、D−グルクロン酸の結合率は、以下のようにして算出した。
D−グルクロン酸の分子量を194.14、D−グルコサミン酸の分子量を179.17とし、脱アセチル化度A%のキトサン1gにD−グルクロン酸を最大限結合させた場合、D−グルクロン酸の含量(%)は、
【0022】
【数1】
【0023】
となる。
そして、実際に得られた複合キトサン化合物についてD−グルクロン酸の定量を行って、その含量(%)を求め、上記のD−グルクロン酸を最大限結合させたときのD−グルクロン酸の含量(%)は、D−グルクロン酸の含量で割ることにより、遊離アミノ基に対するD−グルクロン酸の結合率%(mol/mol)を得ることができる。
【0024】
実施例1
キトサン(和光純薬製、キトサン1000:0.5%酢酸水溶液に0.5%(w/v)の濃度で溶解させた場合に991センチポアズの粘度を示す脱アセチル化度85.9%のキトサン)0.4gとD−グルクロン酸2.4gとを、水200mlに溶解し、この溶液を水酸化ナトリウム水溶液でpH4.5に調整した。次いで、この溶液に1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩1.2gを加え、塩酸でpH4〜5に調整した後、室温で48時間攪拌した。
【0025】
反応混合物を、100倍量の水で3回透析し、5倍量のメタノール中で3回透析した後、析出した複合キトサン化合物をろ取し、メタノールで洗浄し、乾燥し、D−グルクロン酸との共有結合を有する複合キトサン化合物0.57gを得た。
得られた複合キトサン化合物について、以下の方法でD−グルクロン酸の定量を行った。
【0026】
まず、キトサンに結合しているD−グルクロン酸をはずすために、得られた複合キトサン化合物に1M硫酸を加え、100℃で2時間加熱し(阿武喜美子・長谷川栄一編、ムコ多糖実験法[I]、p96、南光堂(1972))、ろ過した。ろ液を、ウロン酸として4〜40μg/mlになるように希釈し、カルバゾール硫酸法(Bitter−Muirの改良法)によりD−グルクロン酸を呈色した。なお、対照として、濃度が既知のD−グルクロン酸についても同様の操作を行った。
【0027】
上記定量の結果、キトサンの遊離のアミノ基のうち、29.6%(mol/mol )にD−グルクロン酸が結合していることがわかった。
また、得られた複合キトサン化合物のIRスペクトルを図1に示す。なお、参考のために、図4に原料として使用したキトサン(和光純薬製、キトサン1000)のIRスペクトルを示す。
【0028】
実施例2
キトサン(和光純薬製、キトサン1000)0.5gとD−グルクロン酸0.5gとを水250mlに溶解した。得られた溶液を、100倍量の水で3回透析し、5倍量のメタノール中で3回透析した後、析出した複合キトサン化合物をろ取し、メタノールで洗浄して乾燥し、D−グルクロン酸とのイオン結合を有する複合キトサン化合物0.72gを得た。
【0029】
得られた複合キトサン化合物について、実施例1と同様にD−グルクロン酸を定量したところ、キトサンの遊離のアミノ基に対し、35.1%(mol/mol )のD−グルクロン酸が結合していた。
また、得られた複合キトサン化合物のIRスペクトルを図2に示す。
【0030】
実施例3
キトサン(和光純薬製、キトサン1000)0.2gとD−ガラクツロン酸1.2gとを、水100mlに溶解し、この溶液を水酸化ナトリウム水溶液でpH4.5に調整した。次いで、この溶液に1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩0.6gを加え、塩酸でpH4〜5に調整した後、室温で48時間攪拌した。
【0031】
反応溶液を、100倍量の水で3回透析し、5倍量のメタノール中で3回透析した後、析出した複合キトサン化合物をろ取し、メタノールで洗浄し、乾燥し、D−ガラクツロン酸との共有結合を有する複合キトサン化合物0.27gを得た。
得られた複合キトサン化合物について実施例1と同様にD−グルクロン酸を定量したところ、遊離のアミノ基に対し、46.9%(mol/mol )のD−ガラクツロン酸が結合していた。
【0032】
実施例4
キトサン(和光純薬製、キトサン10:0.5%酢酸水溶液に0.5%(w/v)の濃度で溶解させた場合に6.0センチポアズの粘度を示す脱アセチル化度84.8%のキトサン)1.0gとD−グルクロン酸6.0gとを水500mlに溶解し、この溶液を、水酸化ナトリウム水溶液でpH4.5に調整した。次いで、この溶液に1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩3.0gを加え、塩酸でpH4〜5に調整した後、室温で96時間攪拌した。
【0033】
反応溶液を、100倍量の水で3回透析し、5倍量のメタノール中で3回透析した後、析出した複合キトサン化合物をろ取し、メタノールで洗浄し、乾燥し、D−グルクロン酸との共有結合を有する複合キトサン化合物1.8gを得た。
得られた複合キトサン化合物について実施例1と同様にD−グルクロン酸を定量したところ、遊離のアミノ基に対し、61.2%(mol/mol )のD−グルクロン酸が結合していた。
【0034】
実施例5
キトサン(和光純薬製、キトサン1000)1gとD−グルクロン酸6gとを、水500mlに溶解し、この溶液を水酸化ナトリウム水溶液でpH4.5に調整した。次いで、この溶液に1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩3gを加え、塩酸でpH4〜5に調整した後、室温で72時間攪拌した。その後、反応液の半量をとり、塩酸を加えてpH1とした後、100倍量の水で3回透析し、5倍量のメタノール中で3回透析した後、析出した複合キトサン化合物をろ取し、メタノールで洗浄し、乾燥し、D−グルクロン酸との共有結合を有する複合キトサン化合物0.52gを得た。また、残りの反応液をさらに60時間反応させ、(合計132時間)、上記と同様の操作を行い、D−グルクロン酸との共有結合を有する複合キトサン化合物0.67gを得た。
【0035】
得られた複合キトサン化合物について実施例1と同様にD−グルクロン酸を定量したところ、それぞれ、キトサンの遊離のアミノ基のうち、13.0%(mol/mol )又は36.0%(mol/mol )にD−グルクロン酸が共有結合していた。 また、得られた複合キトサン化合物のIRスペクトルを図3に示す。
【0036】
試験例1:ゲル化試験
実施例1及び実施例2の複合キトサン化合物各10mgを試験管にとり、1mlの水又は1N塩酸をそれぞれ各1mlを加えたところ、いずれの溶液においても良好なゲルを形成した。そのまま試験管を倒立し、室温で24時間静置したが、ゲルの形状はほとんど変化しなかった。
【0037】
また、実施例1及び実施例2で得られた複合キトサン化合物各10mgを試験管にとり、1N水酸化ナトリウム0.5mlを加えたところ、いずれの複合キトサン化合物も良好なゲルを形成した。そのまま室温で72時間静置したが変化は認められなかった。
一般に、水溶性の有機化合物等において1N塩酸より強い酸性物質や1N水酸化ナトリウムより強い塩基性物質はほとんど存在しない。したがって、これらの複合キトサン化合物は、酸性から塩基性を示すいずれの物質の存在下においても、良好なゲルを形成することがわかった。
【0038】
試験例2:保湿性試験
文献(松井健次、フラグランスジャーナル、56、32〜38(1982):酸性ムコ多糖体の保湿性について)に準じて保湿性試験を行った。
【0039】
実施例1及び実施例2の複合キトサン化合物及び対照としてのヒアルロン酸ナトリウムの10%水溶液をそれぞれ調製し、25℃でシリカゲルデシケーター中及び25℃、30%相対湿度下の双方で放置し、経時的な重量変化を調べた。
この試験は、低湿度下における水分の蒸発を調べる試験で、水分の蒸発は重量減少率として表される。したがって、重量減少率が小さいものほど、水分をよく保持し、水分が蒸発しにくい物質、すなわち保湿能の高い物質であるということができる。
【0040】
試験結果をそれぞれ表1及び表2に示す。
【0041】
【表1】
【0042】
【表2】
【0043】
表1及び2から、いずれの複合キトサン化合物もヒアルロン酸ナトリウムと同等の保湿能を示し、優れた保湿効果を示すことが確認された。
【0044】
試験例3:タンパク質の影響
キトサンは、タンパク質等の高分子物質に添加すると凝集することが知られている(キチン、キトサン研究会編、キチン、キトサンの応用、p89、技報堂出版(1990))。そこで、本発明の複合キトサン化合物のタンパク質共存下でのゲル化について調べた。
【0045】
実施例2の複合キトサン化合物5mgをとり、水又は1%ウシ血清アルブミン溶液をそれぞれ0.5mlずつ加えたところ、いずれの溶液においても良好なゲルを形成した。そのまま試験管を倒立し、室温で24時間静置したが、ゲルの形状はほとんど変化しなかった。
したがって、本発明の複合キトサン化合物は、タンパク質のような高分子の存在下でも良好なゲルを形成することがわかった。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の実施例1で得られたD−グルクロン酸とキトサンとが結合した複合キトサン化合物のIRスペクトルを示す図である。
【図2】本発明の実施例2で得られたD−グルクロン酸とキトサンとが結合した複合キトサン化合物のIRスペクトルを示す図である。
【図3】本発明の実施例5で得られたD−グルクロン酸とキトサンとが結合した複合キトサン化合物のIRスペクトルを示す図である。
【図4】本発明の実施例1で使用したキトサンのIRスペクトルを示す図である。
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