KR102004679B1

KR102004679B1 - 키토산을 포함하는 고분자 전해질 복합체 및 이를 포함하는 화장품 조성물

Info

Publication number: KR102004679B1
Application number: KR1020190077061A
Authority: KR
Inventors: 손태원; 성효린; 장재윤
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2019-06-27
Filing date: 2019-06-27
Publication date: 2019-07-26
Also published as: KR20190080845A

Abstract

본 출원의 키토산을 포함하는 고분자 전해질 복합체 및 이를 포함하는 화장품 조성물은 키토산의 수용성을 증가시키고, 약산인 당산(Sugar acids)를 키토산에 접목시켜 그 활용 범위를 넓힐 수 있다. 또한, 종래의 키토산의 낮은 수용성 문제점을 극복함으로써, 기능성을 향상시켜 그 활용 범위를 넓힐 수 있다.

Description

키토산을 포함하는 고분자 전해질 복합체 및 이를 포함하는 화장품 조성물 {Polyelectrolyte complexes comprising chitosan and Cosmetic Composition for using thereby}

본 출원은 키토산을 포함하는 고분자 전해질 복합체 및 이를 포함하는 화장품 조성물에 관한 것이다.

최근 의학기술이 발전하고 삶의 질이 향상되면서 평균 수명이 늘어나고 생활이 여유로워짐에 따라 사람들은 외적인 면에 대해 많은 관심을 가지게 되었다. 그 중에서도 피부와 노화에 대한 관심이 지속적으로 증가하고 있다. 피부 노화의 원인은 여러 가지 환경적 요인과 심리적인 스트레스나 호르몬의 변화 등 여러 가지가 있다. 노화의 종류는 자연 노화 (내인성 노화)와 광 노화로 나누어진다. 자연 노화는 시간이 흐르면서 자연스럽게 생기는 노화이고 광 노화는 생활 속에서 햇빛에 노출되어 생기는 노화로서 자외선 노출을 피하면 막을 수 있는 노화이다.

이러한 피부 노화에 대한 관심으로 최근 생체 적합성을 가지는 기능성 고분자에 대한 수요가 증가함에 따라 인체에 무해한 천연 고분자에 대한 기능성 연구가 활발히 이루어지고 있다.

대표적인 생체 적합성을 갖는 천연 고분자인 키틴(Chitin)은 자연계에서 가장 풍부한 천연 다당류 중의 하나이다. 키틴은 새우나 게 등의 갑각류의 외골격 또는 곰팡이와 효모의 세포벽 구조를 형성하는 성분으로 산 처리에 의해 추출된다. 키틴은 대부분의 유기용매에 불용성이기 때문에 그 용도가 매우 제한되어 있어 탈아세틸화 과정을 거쳐 유도체 형태인 키토산(Chitosan)으로서 사용되고 있다. 그러나 키토산 또한 물과 유기용매에 용해성이 좋지 않기 때문에 이를 산이나 효소로 분해하여 저분자 형태로 사용하거나 키토산 염의 형태로 사용하고 있다. 이들 방법 중 산 분해법이나 효소법보다는 키토산 염의 형태로 주로 사용되고 있다.

키토산의 주성분은 폴리글루코사민(polyglucosamine)으로 고분자 구조의 무색 비결정성 분말이다. 글루코사민(Glucosamine) 결합으로 되어 있는 키토산은 그 분자구조가 우리 인체조직과 비슷한 구조를 이루고 있고 인체에 친화성이 우수하여 면역반응이 일어나지 않기 때문에 화장품, 식품, 의약품, 및 섬유 등의 산업분야에서 사용되는 매우 귀중한 생체재료이다. 그러나 키토산 염을 만드는 방법은 대부분 초산(Acetic acid)이나 젖산(Lactic acid)과 같은 강산을 첨가하여 키토산 염을 만들어 용해시킨다는 단점을 가지고 있어, 활용범위에 제한을 가지고 있다.

키토산이 가진 이러한 단점을 보완하기 위해 비타민C(Ascorbic acid), 사과산(Malic acid), 글리콜산(Glycolic acid), 또는 구연산(Citric acid)등을 이용하여 키토산의 수용성을 증가시키려는 연구가 이루어졌다. 그러나 더욱 다양한 산업분야에서 기능성 향상에 사용하기 위해 기존에 연구되어지지 않은 종류의 산을 사용하여 새로운 개념의 고분자 전해질 복합체를 제조하고 이로써 그 활용 범위를 넓힐 필요가 있다.

본 출원은 키토산의 수용성을 증가시키고, 더욱 다양한 산업분야에서 기능성 향상에 사용하기 위해 기존에 연구되어지지 않은 당산(Sugar acids)를 키토산에 접목시켜 그 활용 범위를 넓힐 수 있는 키토산을 포함하는 고분자 전해질 복합체 및 이를 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.

본 출원은 키토산을 포함하는 고분자 전해질 복합체에 관한 것이다. 예시적인 본 출원의 전해질 복합체에 의하면, 키토산; 및 상기 키토산과 이온결합 되어있는 당산을 포함한다.

본 출원은 고분자 전해질 복합체의 제조방법에 관한 것이다. 예시적인 본 출원의 고분자 전해질 복합체의 제조방법에 의하면, 물, 당산 및 키토산을 혼합하여 용액을 형성하는 단계, 상기 용액을 여과하는 단계 및 상기 여과물을 동결건조하는 단계를 포함한다.

본 출원은 화장료 조성물에 관한 것이다. 예시적인 본 출원의 화장료 조성물에 의하면, 키토산, 상기 키토산과 이온결합 되어있는 당산을 포함하는 고분자 전해질 복합체를 포함한다.

본 출원은 항산화, 보습 또는 항염증용 화장품에 관한 것이다. 예시적인 본 출원의 항산화, 보습 또는 항염증용 화장품은 고분자 전해질 복합체를 포함하고, 액정 에멀전 제형을 가진다.

본 출원은 항산화, 보습 또는 항염증용 화장품에 관한 것이다. 예시적인 본 출원의 항산화, 보습 또는 항염증용 화장품은 고분자 전해질 복합체를 포함하고, 하이드로겔 제형을 가진다.

본 출원은 항산화, 보습 또는 항염증용 화장품에 관한 것이다. 예시적인 본 출원의 항산화, 보습 또는 항염증용 화장품은 액정 에멀젼 및 상기 액정 에멀젼을 함유하는 하이드로겔을 포함하고, 상기 액정 에멀젼 또는 하이드로겔 중 하나 이상은 고분자 전해질 복합체를 포함한다.

도 1은 키토산-글루콘산 복합체의 합성의 구체 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 합성된 키토산-글루콘산 복합체(CG1), 키토산-갈락트론산 복합체(CG2) 및 키토산-글루크론산 복합체(CG3)의 화학구조를 도시한 구조식이다.
도 3은 키토산-글루콘산 복합체(CG1)의 퓨리에 변환 적외선 분광법(FT-IR)의 분석 결과이다.
도 4는 키토산-갈락트론산 복합체(CG2)의 퓨리에 변환 적외선 분광법(FT-IR)의 분석 결과이다.
도 5는 키토산-글루크론산 복합체(CG3)의 퓨리에 변환 적외선 분광법(FT-IR)의 분석 결과이다.
도 6은 키토산-글루콘산 복합체(CG1)의 퓨리에 변환 핵자기공명(FT-NMR)의 분석 결과이다.
도 7은 키토산-갈락트론산 복합체(CG2)의 퓨리에 변환 핵자기공명(FT-NMR)의 분석 결과이다.
도 8은 키토산-글루크론산 복합체(CG3)의 퓨리에 변환 핵자기공명(FT-NMR)의 분석 결과이다.
도 9는 키토산-글루콘산염 복합체의 용매 분획물의 경피 수분 손실 차이를 나타낸 그래프이다.
도 10은 키토산-글루콘산 복합체(CG1)의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 11은 키토산-갈락트론산 복합체(CG2)의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 12는 키토산-글루크론산 복합체(CG3)의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 13은 키토산-글루콘산 복합체(CG1)의 ABTS⁺ 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 14는 키토산-갈락트론산 복합체(CG2)의 ABTS⁺ 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 15는 키토산-글루크론산 복합체(CG3)의 ABTS⁺ 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 16은 키토산-글루콘산 복합체(CG1)의 초과산화물 음이온 라디칼(Superoxide anion radical) 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 17는 키토산-갈락트론산 복합체(CG2)의 초과산화물 음이온 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 18는 키토산-글루크론산 복합체(CG3)의 초과산화물 음이온 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 19는 키토산-글루콘산 복합체(CG1)의 초과산화물제거효소(Superoxide Dismutase; SOD) 활성을 나타낸 그래프이다.
도 20는 키토산-갈락트론산 복합체(CG2)의 초과산화물제거효소(Superoxide Dismutase; SOD)의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 21는 키토산-글루크론산 복합체(CG3)의 초과산화물제거효소(Superoxide Dismutase; SOD)의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 22는 키토산-글루콘산 복합체(CG1)에서 대식세포(RAW 264.7)에서 세포 생존도를 나타낸 그래프이다.
도 23은 키토산-글루콘산 복합체(CG1)의 농도별 NO 수준을 나타낸 그래프이다.
도 24는 키토산-글루콘산 복합체(CG1)에 대한 LPS- 자극 IL-1β 및 PGE₂ 생산 RAW 264.7 세포를 억제한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 25는 대식세포(RAW 264.7)에서 키토산-글루콘산 복합체(CG1)의 물의 iNOS 단백질 및 COX-2 단백질 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 26은 키토산-글루콘산 복합체(CG1) iNOS에 미치는 영향 및 대 식세포에서 COX-2 mRNA 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 27은 보습제에 따른 보습력 변화를 나타낸 그래프이다.
도 28은 보습제에 따른 제형 변화를 나타낸 사진이다.
도 29는 에멀젼(Emulsion) 함유량에 따른 제형 변화를 나타낸 사진이다.

본 발명은 키토산을 포함하는 고분자 전해질 복합체에 관한 것이다. 상기 고분자 전해질 복합체는 키토산의 수용성을 증가시키고, 약산인 당산(Sugar acids)을 키토산에 접목시켜 그 활용 범위를 넓힐 수 있다. 또한, 종래의 키토산의 낮은 수용성 문제점을 극복함으로써, 기능성을 향상시켜 그 활용 범위를 넓일 수 있다.

본 발명의 고분자 전해질 복합체는 키토산; 및 상기 키토산과 이온결합 되어있는 당산을 포함한다.

상기 키토산은 50 내지 100 %의 탈아세틸화도를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "탈아세틸화"는 해당기술분야에서 공지된 것으로서, 일 예를 들어 키틴 표면에서 2번 위치의 N-아세틸기로부터 NH₂기로의 전환을 의미한다. 상기 "탈아세틸화도"는 탈아세틸화된 정도를 의미하며, 그 측정 방법 역시 공지되어 있다. 일 구체예에서, 탈아세틸화도는 FT-IR과 같은 장치를 사용하여 IR 스펙트럼을 측정하여 2878cm^-1과 1550cm^-1에서의 흡광도비를 구하여 검량선을 이용하여 계산하거나, 근적외선 분광분석기 등을 통하여 계산할 수 있다. 본 발명에 따른 키토산이 상기 범위의 탈아세틸화도를 가지는 경우, 당산과 이온 결합할 수 있는 아미노기(NH₂)를 충분하게 가져서 안정적으로 고분자 전해질 복합체를 제조할 수 있다.

상기 키토산은 예를 들어 1 내지 1100 cps, 구체적으로 1 내지 500cps, 또는 1 내지 100cps의 점도를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 키토산이 상기 점도를 가지는 경우 적절한 점성과 피부친화적 효과를 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "당산(Sugar Acid, SA)"은 카복실기를 갖는 다당류로서 포도당의 산화에 의하여 생기는 산이다. 본 발명에 따른 당산은 알돈산, 우론산, 알다린산 및 울로손산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 상기 알돈산(Aldonic acids)은 알도스(Aldose)의 알데히드 작용기가 산화된 것이고, 울로손산(Ulosonic acids)은 2-케토스(2-Ketose)의 첫 번째 수산기가 산화되어 α-케토에시드(α-Keto acid)를 생성하는 것이며, 우론산(Uronic acids)은 알도스(Aldose) 또는 케토스(Ketose)의 말단 수산기가 산화된 것이고, 알다린산(Aldaric acids)은 알도스(Aldose)의 양쪽 말단이 산화된 것이다.

상기 예시적인 알돈산은 글리세르산(glyceric acid), 자일론산(xylonic acid), 글루콘산(gluconic acid) 또는 아스코빅산(ascorbic acid)을 포함한다. 예시적인 울로손산은 뉴라민산(neuraminic acid), 또는 케토데옥시노뉴로손산(ketodeoxynonulosonic acid)을 포함한다. 예시적인 우론산은 글루크론산(Glucuronic acid), 갈락트론산(Galacturonic acid) 또는 이두론산(iduronic acid)을 포함한다. 예시적인 알다린산은 타르타르산(tartaric acid), 무크산(mucic acid), 또는 사카르산(saccharic acid )을 포함한다.

일 구체 예에서 본 발명에 따른 당산은 글루콘산, 갈락트론산, 및 글루크론산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

상기 글루코산(G1)은 알돈산의 일종으로 포도당의 최초의 산화 생성물에서 알데히드기가 산화되어 카르복시기와 치환된 형태를 가진 유기 화합물로 용해성이 좋고 비휘발성이며, 무독성이고 쉬운 생분해성을 갖는 장점을 가진다. 갈락트론산(G2)은 D-갈락토스(D- Galactose)의 산화 형태인 우론산의 일종으로 폴리갈락트론산(polygalacturonic acid)으로서 존재하는 펙틴의 주성분이며 글루크론산의 에피머(epimers)이다. 글루크론산(G3)은 포도당의 알코올잔기를 카르복시기로 산화된 우론산의 일종으로 아라비아 검(Gum arabic)과 잔탄(Xanthan) 등과 같은 많은 종류의 검(Gum)을 구성하고 있다

상기 당산의 함량은 키토산 1 중량부에 대하여 0.1 내지 5 중량부일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 당산이 함량이 상기 범위 이내일 때, 복합체의 우수한 수용성 및 고기능성을 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 고분자 전해질 복합체는 키토산과 당산이 이온결합되어 있다. 구체예에서 키토산의 아미노기(NH₃ ⁺)와 당산의 카르복실기(COO^-)가 이온결합을 통하여 결합되어 있어서, 물에 용해되는 경우 전기가 통할 수 있는 전해질의 특성을 가진다.

본 발명에 따른 고분자 전해질 복합체는 간단한 방법으로 제조될 수 있다. 하나의 구체 예에서, 상기 고분자 전해질 복합체의 제조방법은 물, 당산 및 키토산을 혼합하여 용액을 형성하는 단계; 상기 혼합물을 숙성하고 여과하는 단계; 및 상기 여과물을 동결건조하는 단계를 포함한다.

상기 물, 당산 및 키토산을 혼합하는 단계는, 예를 들어, 물 및 당산 수용액을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물에 키토산을 추가하고 용해하여 용액을 형성하는 단계를 포함한다. 상기 물과 당산 수용액을 혼합하는 단계는 1 내지 30분 동안 수행될 수 있다. 상기 혼합에 사용되는 물의 온도는 특별하게 제한되지 않으나, 당산의 용해도 등을 고려하여 20 내지 80℃의 물을 사용할 수 있다. 상기 혼합물에 키토산을 추가하고 용해아여 용액을 형성하는 단계는 1 시간 내지 72 시간 동안 수행될 수 있다. 상기 혼합 및 용해 단계에서 용액의 형성은 교반 하에 진행될 수 있다.

상기 혼합물을 여과하는 단계에서 여과 수단은 특별히 한정되지 않지만 유리필터(glass filter) 등을 사용할 수 있다.

상기 여과물을 동결건조하는 단계는, 예를 들어 여과물을 동결하는 단계; 및 동결된 여과물을 동결건조하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 동결하는 단계는 코니칼 튜브 등을 사용하여 약 -75℃이하의 온도에서 24시간 동안 수행될 수 있다. 상기 동결건조하는 단계는 약 -75℃이하의 온도에서 4~8일 동안 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 화장료 조성물에 관한 것이다. 예시적인 본 출원의 화장료 조성물은 키토산; 및 상기 키토산과 이온결합 되어있는 당산을 포함하는 고분자 전해질 복합체를 유효성분으로 포함한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 고분자 전해질 복합체를 0.1 내지 10 중량부로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 고분자 전해질 복합체를 상기 함량으로 포함하는 경우 항산화, 보습 또는 항염증 기능성을 가질 수 있다. 상기 화장료 조성물은 본 발명에 따른 고분자 전해질 복합체를 유효성분으로 포함하기 때문에 상술한 항산화, 보습 및 항염증 기능성을 가질 수 있다.

상기 화장료 조성물은 공지의 다른 성분, 예를 들어, 보습제, 오일, 방부제, 컨디셔닝제, 또는 계면활성제등을 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으며, 스킨로션, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 전해질 복합체를 포함하고, 액정 에멀젼 제형 또는 하이드로겔 제형을 가지는 항산화, 보습 또는 항염증용 화장품에 관한 것이다.

하나의 실시예에서 액정 에멀젼 제형은 수상 계면활성제 및 보습제를 포함하는 수상; 유상 계면활성제 및 오일을 포함하는 유상; 증점제; 및 고분자 전해질 복합체를 포함할 수 있다.

상기 수상 계면활성제는 수소화된 레시틴, 솔루빌라이저, 일킬 글루코사이드 또는 폴리 글리세릴을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 보습제는 글리세린, 부틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜 또는 트리프로필렌 글리콜 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 수상은 추가적으로 아르기닌과 같은 컨티셔닝제 또는 헥산디올과 같은 방부제를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

하나의 구체 예에서 수상 계면활성제의 함량은 액정 에멀젼 제형 100 중량부에 대하여 0.01 내지 1 중량부이다. 수상 계면활성제의 함량이 상기 범위를 가지는 경우 액정 에멀젼이 안정적으로 형성될 수 있다.

다른 구체 예에서, 유상 계면활성제의 함량은 액정 에멀젼 제형 100 중량부에 대하여 2 내지 8 중량부이다. 유상 계면활성제의 함량이 상기 범위를 가지는 경우 액정 에멀젼이 안정적으로 형성될 수 있다. 유상 계면활성제는 아라치딜 알코올, 베헤닐 알코올 또는 아라치딜 글로코사이드를 사용할 수 있다.

또 다른 구체예에서 오일의 함량은 액정 에멀젼 제형 100 중량부에 대하여 1 내지 5 중량부이다. 오일의 함량이 상기 범위를 가지는 경우 액정 에멀젼이 안정적으로 형성될 수 있다. 오일은 스쿠알렌, 카프릴릭 크리글리세라이드, 폴리클리세릴-2디폴리하이드록시스테아레이트, 올리브유화왁스, 글리세릴스테아레이트 또는 코코넛오일을 사용할 수 있다.

상기 유상은 세아 버터, 사이클로메티콘, 이소프로필미스티에이트, 호호바유 또는 디메치콘과 같은 유연제를 추가로 포함할 수 있다.

다른 실시예에서 하이드로겔 제형은 물, 증점제 및 보습제를 포함하는 수상; 및 고분자 전해질 복합체를 포함한다.

하나의 구체예에서 보습제의 함량은 하이드로겔 제형 100 중량부에 대하여 5 내지 50 중량부이다. 보습제의 함량이 상기 범위를 가지는 경우 하이드로겔의 보습력이 우수하다.

다른 구체예에서 보습제는 글리세린 또는 부티렌글리콜이다. 이와 같은 보습제를 사용하는 경우 투명도가 높고 안정된 상태로 점도를 형성할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 증점제는 카라지난과 같은 황화 폴리사카라이드, 및 로커스트 빈 검과 같은 폴리사카라이드를 포함하고, 상기 황화 폴리사카라이드 및 폴리사카라이드의 중량비는 10: 1 내지 1: 10이다. 증점제의 종류 및 중량비가 상기와 같은 범위를 가질 경우 하이드로겔은 적절한 강도와 경도를 가질 수 있다.

본 발명은 또한 액정 에멀젼; 및 상기 액정 에멀젼을 함유하는 하이드로겔을 포함하고, 상기 액정 에멀젼 또는 하이드로겔 중 하나 이상은 제 1 항의 고분자 전해질 복합체를 포함하는 항산화, 보습 또는 항염증용 화장품에 관한 것이다.

일 구체 예에서, 전체 조성물 중 액정 에멀젼의 함량은 10 내지 60 중량부이다. 에멀젼의 함량이 상기와 같은 경우 하이드로겔은 적절한 강도와 경도를 가질 수 있다.

이하 실시예, 참고예 및 비교예를 통하여 상기 기술한 내용을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 출원의 범위가 하기 제시된 내용에 의해 제한되는 것은 아니다.

<키토산-당산 전해질 복합체( CSA )의 제조 및 이의 성능 시험 >

실시예 1. 키토산-글루콘산 전해질 복합체의 제조

키토산은 ㈜태훈바이오(Uljin, Korea)로부터 점도 12.6cps, 탈아세틸화도 96.5%인 제품을 구입하여 사용하였다. 글루콘산은 sigma chemical Co. Ltd.(St. Louis, USA)의 49~53wt%의 D-글루콘산 수용액을 사용하였으며, 용매는 2차 정제된 증류수를 사용하였다.

50-60℃를 유지한 수조에 플라스크를 고정한 후 증류수, 글루콘산, 및 키토산을 순서대로 넣어주었다. 이 상태로 48시간 이상 교반하여 키토산과 글루콘산이 완전히 용해되는 적정비율을 찾았다. 이에 따라 키토산-글루콘산 복합체(CG1)는 3.6:8.5의 중량비(wt%)로 당량비가 1:1인 용액을 제조하였다. 제조된 용액을 1일 동안 상온에서 유지한 후, 글라스필터를 사용하여 필터과정을 거쳐 키토산-글루콘산 복합체(CG1) 용액을 제조하였다.

합성된 키토산-글루콘산 복합체(CG1) 용액을 15ml 코니칼튜브에 나누어 담아 24시간 이상 -80℃에서 동결 과정을 거치고 4~7일 동결건조를 진행하여 용매로 사용된 증류수를 증발시켜 파우더 형태의 물질로 제조하였다.

키토산-글루콘산염 복합체의 합성의 구체 과정을 도 1에 도시하였고, 합성된 키토산-글루콘산 복합체(CG1)의 구조를 도 2(a)에 도시하였다.

실시예 2. 키토산- 갈락트론산 전해질 복합체의 제조

sigma chemical Co. Ltd.(St. Louis, USA)의 D-(+)-갈락트론산 일수화물을 구입하여 키토산과 갈락트론산의 중량비(wt%)가 3.2:4.2이고 당량비가 1:1인 용액을 제조 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 키토산-갈락트론산 복합체(CG2)를 제조하였다.

제조된 키토산-갈락트론산 복합체(CG2)의 구조를 도 2(b) 에 도시하였다.

실시예 3. 키토산 글루크론산 전해질 복합체의 제조

Alfa-Aesar사의 D-글루크론산을 사용하여, 키토산과 글루크론산의 중량비(wt%)가 9:1.2의 중량비(wt%)이고 당량비가 1:1인 용액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 키토산-글루크론산 복합체(CG3)를 제조하였다.

제조된 키토산-글루크론산 복합체(CG3)의 구조를 도 2(c)에 도시하였다.

키토산-당산 전해질 복합체 합성 시 키토산, 글루콘산, 갈락트론산 및 글루크론산을 약 3~10 wt% 농도 구간에서 합성을 진행해본 결과, 키토산, 글루콘산, 갈락트론산 및 글루크론산이 약 2~9 wt% 구간의 농도로 제조된 용액에서 용해가 가장 잘 되었음을 확인하였다. 즉, 키토산-글루콘산(CG1) 복합체는 6 wt%, 키토산-갈락트론산(CG2) 복합체는 7 wt%, 키토산-글루크론산(CG3) 복합체는 3.5 wt%의 농도에서 동결건조 시 복합체 파우더 제조에 가장 적합한 농도임을 유추하였다.

시험예 1. 키토산-당산 전해질 복합체( CSA )의 화학적 분석

(1) FT-IR 분석

동결건조로 제조된 키토산-당산 전해질 복합체(CSA) 파우더를 적외선 분광분석기인 FT-IR(Fourier Transform Infrared Spectroscope, Spectrum 100/Perkin Elmer co., Korea)을 사용하여 키토산-당산 전해질 복합체(CSA) 파우도의 화학구조를 측정하였다. 시료 CG1, CG2, CG3은 반사법(ATR모드)으로 4000 cm^-1~ 600 cm^- ¹ 파장 범위에서 화학구조를 분석하였다.

순수한 키토산 및 당산 파우더와 키토산-당산 전해질 복합체(CG1, CG2, CG3) 파우더의 화학 구조적 특성을 확인하기 위하여 적외선 분광 분석기를 사용하여 4000 cm^-1~ 600 cm^- ¹ 파장 범위에서 분석한 결과를 도 3, 4, 및 5에 나타내었다.

도 3에서 보여지는 바와 같이, 키토산 파우더에서 3357 cm^-1에서 O-H 스트레칭과 N-H 스트레칭 피크가 중첩되어 나타났고, 1588 cm^-1에서 N-H 벤딩, 1027 cm^-1에서 C-O 벤딩과 C-N 스트레칭 피크를 확인하였다. 글루콘산염의 경우, 3458 cm^-1 내지 3207 cm^-1 사이에서 O-H 스트레칭 피크를 볼 수 있고, 2966 cm^-1 내지 2859 cm^-1 에서 C-H 스트레칭이 나타났고, 1723 cm^-1에서 C=O 스트레칭 피크가 샤프하게 나타났다. 키토산-글루콘산 복합체(CG1)에서는 카복실기 특유피크인 C=O 스트레칭이 1720 cm^-1에서 나타났고, N-H 벤딩 피크가 1579 cm^-1에서 나타나는 것을 확인 할 수 있었다.

다음 도 4의 키토산-갈락트론산 그래프를 보면 3352 cm^-1~ 3314 cm^-1, 2983 cm^-1~ 2917 cm^- ¹근처에서 O-H 스트레칭, 2955 cm^-1에서 C-H 스트레칭 피크가 나타났고, 1708 cm^-1에서 C=O 스트레칭 피크가 관찰되었다. 키토산-갈락트론산(CG2) 복합체 파우더에서는 3239 cm^- ¹근처에서 폭넓은 O-H 스트레칭 피크가 나타났고, 1733 cm^-1에서 C=O 스트레칭 피크가 나타났고, N-H 벤딩 피크가 1582 cm^-1에서 나타나는 것을 확인하였다.

도 5의 키토산-글루크론산 그래프를 보면, 3378 cm^-1에서 O-H 스트레칭, 1703 cm^-1에서 카복실기 특유의 C=O 스트레칭 피크가 관찰되었다. 키토산-글루크론산(CG3) 복합체 파우더의 경우에는 3232 cm^-1근처에서 폭넓은 O-H 스트레칭이 나타났고, 2884 cm^-1근처에서 C-H 스트레칭 피크가 나타났고, 1720 cm^-1에서 카복실기 특유의 C=O 스트레칭, 1586 cm^-1에서 N-H 벤딩 피크를 관찰하였다.

FT-IR 분석을 통해 키토산 분자 구조와 당산의 분자구조에서 나타나는 작용기들의 특성 피크가 제대로 나타났는지 확인할 수 있었으며, 이를 통해 키토산-당산 전해질 복합체의 합성이 잘 이루어져 있음을 짐작할 수 있다.

(2) FT-NMR 분석

또한 동결건조로 제조된 키토산-당산 전해질 복합체 (CG1, CG2, CG3) 파우더의 화학구조 및 형태를 분석하고자 키토산-당산 전해질 복합체 (CG1, CG2, CG3) 파우더를 용매 D₂O에 녹인 후 샘플링하여 핵자기 공명분광계 FT-NMR(Fourier Transform Nuclear Magnetic Resonance, VNS600/Varian Inc.)을 사용하여 25℃에서 양성자(proton)를 측정하여 분석하였고 이를 도 6 내지 8에 도시하였다.

도 6에 도시된 바와 같이, 키토산-글루콘산 복합체(CG1)의 구조 내에서의 주요 작용기인 하이드록실기와 카복실기와 아민기의 양성자의 화학적 이동이 각각 4.7 ppm, 3.6 내지 4.1 ppm, 3.1 ppm 구간에서 나타난 것을 확인할 수 있었다. 도 7의 키토산-갈락트론산 복합체(CG2) 구조에서 하이드록실기는 4.6~4.8 ppm, 카복실기는 3.5~4.2 ppm, 아민기의 양성자는 3.1ppm에서 관찰되었고, 아노머의 양성자가 5.3 ppm에서 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 도 8의 키토산-글루크론산 복합체(CG3)를 분석한 결과, 아노머의 양성자와 하이드록실기, 카복실기, 아민기의 양성자가 각각 5.2 ppm, 4.5~4.9 ppm, 3.5~4.1 ppm, 3.1 ppm 구간에서 나타난 것을 확인할 수 있었다.

FT-NMR 분석을 통해 키토산 분자 구조와 당산의 분자 구조에서 나타나는 주요 작용기의 고유한 스펙트럼 번호가 키토산-당산 전해질 복합체에도 나타나는 것을 확인할 수 있었고, 복합체가 구조적으로 잘 만들어졌음을 유추할 수 있었다.

(3) 원소 분석

동결건조로 제조된 키토산-당산 전해질 복합체(CSA)의 합성이 제대로 진행되었는지 확인하기 위하여, 원소분석기 (Elemental Analyzer, FLASH 1112/Thermo Fisher Scientific)로 원소 C, H, O, N의 함량을 측정하여 원소의 이론값과 분석값을 하기 표 1에 나타내었다.

		C (%)	H (%)	N (%)	O (%)	Total (%)	오차 (%)
실시예 1	이론값	40.3	6.5	3.9	49.3	100	0.1
실시예 1	측정값	38.8	6.8	3.3	51.0	99.9	0.1
실시예 2	이론값	38.6	6.2	3.8	51.4	100	0.1
실시예 2	측정값	41.0	6.5	3.4	48.9	99.9	0.1
실시예 3	이론값	40.6	6.0	3.9	49.5	100	0.2
실시예 3	측정값	40.2	6.5	3.4	49.7	99.8	0.2

시료의 원소함량 이론값과 분석값을 비교해 보았을 때, C, H, N, O 원소 함량 비율의 차이가 오차범위 3 %미만으로 나타났으므로, 이를 통해 키토산-당산 전해질 복합체 모두 구조적으로 합성이 잘 이루어졌음을 알 수 있었다.

시험예 2. 키토산-글루콘산 복합체(CG1)에 대한 보습 효능 측정

경피 수분 손실(Transepidermal water loss; TEWL) 차이는 Dermalab® USB(Cortex technology, Hadsund Denmark)를 이용하여 측정하였다. 실내 온도는 24±3℃, 실내습도는 20 내지 40%로 유지시킨 항온항습 환경 조건에서 20대의 남녀 20명을 대상으로 6시간동안 측정하였다. TEWL은 실시예 1과 비교예(증류수)의 표면적당 증발량의 값 차이의 절대값으로 나타내었다.

도 9는 키토산-글루콘산 복합체(CG1)의 용매 분획물의 경피 수분 손실 차이를 나타낸 그래프이다. 그래프는 3번 반복 측정한 결과의 평균값±D로 표시하였다.

도 9에 도시된 바와 같이, TEWL는 대조군으로 사용된 물보다 사용직후 11 g/m²/h로 낮은 손실량을 나타내었고, 이후 5시간 동안 낮게 유지된 것을 확인할 수 있었다. 이는 실시예 1이 고분자 합성물로서, 피부 표피에서의 수분 증발을 막아주는 역할을 하여 수분증발량이 낮게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 3. 키토산-당산 전해질 복합체( CSA )에 대한 항산화 효능 측정

항산화 효과를 측정하기 위하여 진행한 생리활성 측정의 대조군(control), 즉 시료 무첨가군은 항산화능에 뛰어난 아스코빅산(Ascorbic acid), 즉 비타민C(Vit-C)를 사용하였다. 실험은 키토산-당산 전해질 복합체(CSA) 및 비타민C를 2:1, 3:1, 5:1, 10:1의 비율로 혼합한 시료 첨가군인 키토산-당산 전해질 복합체(CSA)+비타민C와 시료 무첨가군인 비타민C를 각각 1, 10, 100ppm의 농도에서 생리활성 실험을 진행하였고, 각 실험은 흡광도 측정기(Spectrophotometer UV/Spectra Max 190/molecular devices USA)를 통해 3회 반복 실험 하여 흡광도를 측정하여 그 평균값을 도출하였다.

(1) 전자공여능의 측정

전자 공여능(EDA, Electron Donating Ability)은 Blois의 방법을 변형하여 DPPH 라디칼의 소거능을 측정하여 분석하였다. 시료 첨가군과 무첨가군 각각의 시료용액과 기질인 0.45mM의 1,1-diphenyl-2-prcrylhydrazyl(DPPH)를 2:1 비율의 각각의 농도별로 제조하여 교반한 후, 96well 한 칸에 120μL:60μL(시료:기질) 용량으로 517nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 전자 공여능은 시료용액의 첨가 전과 후의 흡광도 감소율을 하기 일반식 1에 따라 계산하였다.

[일반식 1]

DPPH는 짙은 자색을 띄는 안정한 자유라디칼로서, 517 nm의 파장에서 특징적인 광흡수를 나타내는 화합물이다. 따라서, 517nm에서의 시료용액 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율을 도 10 내지 12에 나타내었다. 시료 첨가군과 무첨가군 모두 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능이 증가하는 것으로 나타났으며, 3가지 키토산-당산 전해질 복합체(CG1, CG2, CG3) 모두 비타민C보다 높은 활성을 보였다. 최고 농도인 100ppm일 때, 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 2:1의 비율에서 비타민C는 72.8%, CG1은 83.1%, CG2는 78.3%, CG3는 79.9%로 CG1이 가장 활성을 많이 보였고, 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 3:1의 비율에서는 78.3%, 83.5%, 75.9%로 CG2가 높은 소거능을 보였으며, 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 5:1의 비율에서는 86.7%, 86.3%, 80.3%로 CG1이, 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 10:1의 비율에서는 88.8%, 88.9%, 82.0%로 나타나 CG2가 가장 높은 활성을 보였다. 따라서 DPPH 라디탈 소거능은 키토산-글루콘산(CG1)와 키토산-갈락트론산(CG2) 복합체에서 높은 활성이 나타났다.

전자공여능 측정 결과, 비타민C와 3가지 키토산-당산 전해질 복합체의 활성은 모든 농도에 의존적으로 높아지는 것을 확인할 수 있었고, 대부분의 농도에서 시료 무첨가군보다 시료 첨가군의 샘플이 DPPH 라디칼 소거능의 활성이 뛰어나다는 점을 알 수 있었다.

(2) ABTS + Radical Scavenging Activity 측정

ABTS⁺(2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 라디컬을 이용한 항산화능 측정은 Pellegrini 등의 ABTS⁺·탈색 분석 방법을 사용하였다

2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS)는 DPPH와 비슷한 원리로 항산화 활성을 측정할 수 있는 방법으로서, ABTS와 과황산칼륨(Potassium persulfate)을 각각 증류수에 용해시켜 14.8 mM, 4.8 mM의 농도로 용액을 제조하였다. 제조된 두 용액을 1:1로 혼합하여 차광된 실온에서 24시간 동안 방치하여 ABTS⁺을 형성시켰고, 이를 O.D(Optical density)값이 0.70±0.05의 흡광도를 갖도록 99% 에탄올로 희석하였다. 증류수에 용해된 실시예 1 내지 3을 녹인 용액의 시료 첨가군과 시료 무첨가군 각각 100 ㎕를 만들어진 ABTS⁺ 100 ㎕에 첨가하여 7분 동안 방치한 후, 734 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 하기 일반식 2에 따라 계산하였고, 이를 도 13 내지 15에 도시하였다.

[일반식 2]

시료 첨가군과 무첨가군의 ABTS⁺ 라디칼 소거능 모두 농도 의존적으로 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 가장 높은 농도인 100ppm에서 비타민C는 99.5%의 활성을 나타냈고, 시료 첨가군과 무첨가군의 모든 비율에서 CG1, CG2, CG3 모두 100%의 라디칼 소거능을 나타냈다. 10ppm의 농도에서 활성을 측정해본 결과, 비타민C는 64.2%의 소거능을 보였으며, 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 2:1의 비율에서 CG1과 CG2는 68.5%, CG3는 65.8%로 CG1,2가 높은 활성을 보였다. 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 3:1의 비율에서는 각각 66.5%, 64.9%, 69.7%로 CG3가, 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 5:1의 비율에서는 70.2%, 67.5%, 70.4%로 역시 CG3가 가장 높았다. 마지막으로 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 10:1의 비율에서 70.4%, 68.5%, 72.3%으로 CG3가 높은 활성을 띈 것을 보아 키토산-글루크론산 복합체(CG3)가 가장 높은 ABTS⁺ 라디칼 소거능을 가진 것으로 나타났고, 모든 시료 첨가군이 무첨가군인 비타민C보다 활성이 뛰어난 것을 확인하였다.

(3) Superoxide Anion radical Scavenging Activity 측정

초과산화물 음이온 라디칼(Superoxide anion radical)은 호기성 세포의 효소 및 비효소적 단계에서 생성되는 독성이 매우 강한 라디칼로서, 노화와 관련된 산화반응의 개시단계에 관여하고 있다. Superoxide anion radical 소거능은 니트라블루테트라졸륨(Nitroblue tetrazolium; NBT) 환원방법을 이용하여 측정하였다. 각각의 시료 첨가군과 무첨가군의 용액 10μL에 제1인산칼륨(Potassium phosphate monobasic; KH₂PO₄)과 제2인산칼륨(Potassium phosphate dibasic; K₂HPO₄)을 4:6의 비율로 혼합한 인산칼륨 버퍼(Potassium phosphate buffer; 0.1M, pH7.0) 40μL 및 0.8mM 크산틴(Xanthine)과 0.48mM NBT을 1:1 비율로 녹여 각각 0.4mM과 0.24mM의 농도를 가진 기질액 100μL를 첨가한다. 크산틴 산화효소(Xanthine oxidase) (0.049U/ml) 100μL를 더하여 37℃의 암실에서 20분간 반응시킨 다음 반응액 중에 생성된 superoxide anion radical의 양을 410nm의 파장에서 흡광도를 측정하였고, 측정된 일반식 2의 소거율을 도 16 내지 18에 도시하였다.

시료 첨가군과 무첨가군의 Superoxide anion radical 소거능 모두 농도 의존적으로 높아지는 것을 확인할 수 있었으며, 가장 높은 농도인 100ppm에서 비타민C는 64.0%의 활성을 나타냈고, 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 2:1의 비율에서 CG1는 68.3%, CG2는 71.1%, CG3는 68.4%로 CG2가 가장 높은 활성을 보였다. 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 3:1의 비율에서는 각각 63.0%, 70.4%, 71.2%로 CG3가, 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 5:1의 비율에서는 66.7%, 71.0%, 70.2%로 CG2가 가장 높았다. 마지막으로 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 10:1의 비율에서 64.8%, 71.0%, 71.0%로 CG2, CG3가 높게 나온 것을 보아 키토산-갈락트론산(CG2) 복합체가 가장 높은 Superoxide anion radical 소거능을 가진 것으로 나타났다.

(4) Superoxide Dismutase Like Activity 측정

대표적인 항산화 효소 중 하나인 초과산화물제거효소(Superoxide Dismutase; SOD)는 생물체에 유해한 과산화물 음이온 라디칼(·O₂ ^-)과 반응하여 과산화수소(H₂O₂)를 생성하는 효소로, 산소를 사용하는 생물에 존재하며 생체 내에서 활성산소에 방어 작용을 하는 대표적인 활성산소 저해제이다. 또한, SOD는 산소가 환원되어 생기는 과산화물 음이온 라디칼(·O₂ ^- ·2O₂ ^- + 2e^- → 2 · O₂ ^-)을 제거하는 첫 번째 방어 메카니즘에 관여하는 효소(2O₂ ^- + 2H⁺ → H₂O₂ + O₂ ^-)이다. 또한, SOD는 독성이 강한 수산기의 생성을 막아주는 작용을 하여 항염증 또는 피부 노화방지를 위한 화장품 등의 첨가제로서 사용하고 있다.

Marklund의 방법에 따라 산소를 과산화수소(H₂O₂)로 전환시키는 반응을 일으키는 촉매인 피로갈롤(Pyrogallol)의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성을 나타내었다. 실시예 1 내지 3을 녹인 용액의 시료 첨가군과 무첨가군 0.2mL에 Tris-HCl의 완충용액(50mM Tris + 10mM EDTA, pH 8.5) 2.6mL와 7.2mM 피로갈롤 0.2mL을 첨가하여 37℃의 암실에서 10분간 반응시킨다. 1M 염산 0.1mL를 첨가하여 반응을 정지시킨 다음 420nm의 파장에서 피로갈롤의 양을 측정하였다. SOD유사활성은 실시예 1 내지 3을 녹인 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 저해율을 하기 일반식 3에 따라 계산하였다.

[일반식 3]

SOD는 세포에 존재하여 초과산화물(superoxide)을 과산화수소 및 산소로 전화 반응으로 유도하여 활성산소로부터 세포를 방어하는 중요한 인자로, 키토산-당산 전해질 복합체의 SOD 유사활성을 측정하여 도 19 내지 21에 나타내었다.

시료 첨가군과 무첨가군 모두는 농도가 높아짐에 따라 SOD 유사활성도가 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 가장 높은 농도인 100ppm에서 비타민C는 68.2%의 활성을 보였으며, 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 2:1의 비율에서 CG1은 73.3%, CG2는 59.8%, CG3는 67.4%로 CG1의 유사활성도가 높게 관찰되었다. 그리고 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 3:1의 비율에서는 67.6%, 54.7%, 68.0%로 CG3가 가장 높았고, 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 5:1의 비율에서는 70.9%, 57.3%, 66.3%로 CG1이, 키토산-당산 전해질 복합체 및 비타민C가 10:1의 비율에서는 71.4%, 59.4%, 68.3%로 역시 CG1이 높은 활성도가 측정되어 SOD유사활성도는 키토산-글루콘산(CG1) 복합체가 가장 높게 나타났다. 하지만 시료 무첨가군인 비타민C의 활성도가 대부분의 시료 첨가군보다 활성이 높게 나타났다.

키토산-당산 전해질 복합체의 항산화 활성을 측정한 결과, 대부분의 분석에서 비타민C 단독보다 비타민C에 키토산-당산 전해질 복합체가 혼합된 시료의 항산화 활성이 높게 나타나므로, 키토산을 항산화 기능성 물질에 첨가하게 되면 그 기능의 효과가 증가한다는 특성을 보여준다.

시험예 4. 키토산-글루콘산 복합체(CG1)에 대한 항염증 효능 측정

항염증 측정 실험에 사용된 시약인 아질산나트륨(sodium nitrite), 그리스 시약(griess reagent), p-디메틸아미노벤즈알데하이드(p-dimethylaminobenzaldehyde), 프로테아제 억제제(protease inhibitor), 지질다당류(lipopolysaccharide), 및 방사 면역 침전 분석 완충액(Radioimmunoprecipitation assay buffer; ripa buffer)은 sigma chemical Co. Ltd.(St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다. PGE₂와 cytokine 측정을 위한 효소면역분석법 키트(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay kit; ELISA kit)는 R&D systems Inc.에서 구입하였으며, COX-2, iNOS, 및 겨자무과산화효소가 포함된 2차 항체는 santa cruz (Biotech, USA)에서 구입하였다.

(1) 대식세포 (RAW 264. 7)의 세포 독성 확인

RAW 264.7 세포의 배양은 10 % FBS과 1 % penicillin/streptomycin(100 U/ml)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5 % CO₂인큐베이터에 적용하여 거대 배양하였다.

키토산-글루콘산 복합체(CG1)에 의한 대식세포의 세포 생존율을 MTT(-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromid)를 이용하여 Carmichael의 방법에 따라 측정하였다. RAW 264.7는 96 well plate에 5×10⁴ cells/well이 되도록 0.18 mL 준비하고, 시료를 1000 ㎍/mL의 농도로 조제하여 0.02 mL 첨가한 후, 5% CO₂ 인큐베이터에서 37℃로 24시간 배양하였다. 여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02 mL 첨가하여 5시간 배양한 후 배양액을 제거하고, 각 well당 DMSO 0.2 mL를 첨가하여 실온에서 15분간 반응시킨 뒤 ELISA reader를 사용하여 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 하기 일반식 4에 따라 계산하였고, 이를 도 22에 도시하였다.

[일반식 4]

도 22는 키토산-글루콘산 복합체(CG1) 수용액의 농도에 따른 대식세포 (RAW 264.7)의 세포 생존도를 나타낸 그래프이다. 그래프는 3번 반복 측정한 결과의 평균값±D로 표시하였다. *p < 0.01는 LPS로 처리한 대조군과 유의한 차이가 있음을 나타낸다.

도 22에 도시된 바와 같이, 농도별로 측정한 결과, 키토산-글루콘산 복합체(CG1) 수용액의 농도 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250 ㎍/mL에서 모두 90% 이상의 생존율을 보였다.

(2) Nitric oxide 저해활성 측정 결과

산화질소(Nitric oxide; NO) 측정은 cell의 상층액에서 NO의 양을 아질산염(nitrite)과 질산염(nitrate)로서 측정을 하였다. 아질산염에 대한 질산염으로 환원된 안전한 형태인 그리스 시약(griess reagent, Sigma, Darmstadt, Germany)을 사용하였고, 6 well plate에 2×10⁶개의 cell을 교차지점이 75%일 때, 인산완충액(PBS)으로 3번 세척한 후 무혈청 배지를 사용하여 10시간 이상 배양시킨 다음 지질다당류(lipopolysaccharide) 10 ㎍/mL를 비교예를 제외한 모든 well에 넣어서 자극시켰다. 2시간 후에 측정하고자 하는 농도별로 시료를 처리하여 측정하였다. NO 생성량은 24시간 후 상층액을 모아 그리스 시약으로 12분간 반응시킨 후에 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

도 23은 키토산-글루콘산 복합체(CG1)의 농도별 NO 수준을 나타낸 그래프이다. 그래프는 3번 반복 측정한 결과의 평균값±D로 표시하였다.

도 23에 도시된 바와 같이, 대식세포인 RAW 264.7에서 실시예 1의 NO의 억제 정도를 측정하기 위하여 용매별, 농도별로 샘플을 처리하여 NO의 양을 측정하였다. 최고 농도 250 ㎍/mL에서 실시예 1은 12.4%의 저해효과를 보였다.

(3) PGE ₂ 와 cytokine 저해활성 측정 결과

Macrophage cell인 RAW 264.7에서 키토산-글루콘산 복합체(CG1)의 프로스타글란딘 E₂(prostaglandin E_2;PGE₂)와 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 형성을 억제하는지 확인하기 위해 IL-1β 및 PGE₂를 ELISA kit를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 24에 나타내었다.

세포를 24 시간 동안 1 ㎍/mL LPS의 부재 또는 존재 하에 상이한 농도의 키토산-글루콘산 복합체(CG1)와 함께 배양하였다. 배양 상등액 중의 IL-1β, PGE2의 상태를 ELISA kit(R&D systems Inc. Minnesota, USA)로 측정하였다.

도 24는 키토산-글루콘산 복합체(CG1)에 대한 LPS- 자극 IL-1β 및 PGE₂ 생산 RAW 264.7 세포를 억제한 결과를 나타낸 그래프이다. 그래프는 3번 반복 측정한 결과의 평균값±D로 표시하였다. *p < 0.01는 LPS로 처리한 대조군과 유의한 차이가 있음을 나타낸다.

CG1을 처리한 결과, IL-1β의 경우 CG1의 농도 250 μg/mL에서 61.5%의 저해율을 보여주었고, PGE₂는 51.1%억제 활성을 확인하였다.

(4) Western blot을 통한 iNOS 및 COX-2 발현 억제 확인

웨스턴블롯을 이용하여 CG1에 의한 NO의 저해 기전을 보기 위해 iNOS의 단백질 발현을 측정하였고, PGE₂의 저해 경로를 보기 위해 COX-2의 발현을 측정하였다.

웨스턴블롯은 cell을 인산완충액(PBS)으로 3회 세척 후, RIPA 버퍼 10 mL에 complete mini 1 tab을 가한 것으로 용해하여 -4℃ 15,000 rpm에서 15분간 원심 분리하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 브래드포드 시약을 정량하여 25 ㎕의 단백질을 10 %의 SDS-PAGE에 전기 영동해서 분리하였다. 분리된 단백을 PVDF 멤브레인에 옮긴 다음, 실온에서 50분간 blocking 버퍼(5% skim milk in TBST)에서 인큐베이션시켰다. 1차 항체를 희석하여 3시간 30분 동안 반응한 후, 10분 간격으로 TBST로 3회 세척하고 멤브레인을 겨자무과산화수소(horseradish peroxidase; HRP)가 중합된 각각의 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 1시간 반응시켰다. 3회 세척한 뒤 davinch-k western imaging system 기기를 사용하여 밴드 확인 및 정량하였다.

도 25는 대식세포(RAW 264.7)에서 키토산-글루콘산 복합체(CG1) 수용액의 농도별 iNOS 단백질 및 COX-2 단백질 발현율을 나타낸 그래프이다. 그래프는 3번 반복 측정한 결과의 평균값±D로 표시하였다. *p < 0.01는 LPS로 처리한 대조군과 유의한 차이가 있음을 나타낸다.

실시예 1의 iNOS 발현 억제를 보았을 때, CG1의 250 ㎍/mL 농도에서 19.7%, COX-2의 발현 억제률은 3.1% 활성을 확인하였다.

(5) Real-time PCR을 통한 iNOS 및 COX-2 발현 억제 확인

실시예 1에 의한 NO의 저해 기전을 보기 위해 iNOS의 발현을 확인하고, PGE₂의 저해 경로를 보기 위해 COX-2의 발현을 mRNA 수준에서 실시간 PCR을 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 26에 나타내었다.

-Cell lysis 및 cDNA 합성

100 mm 디쉬에 세포 파종(cell seeding)을 하고 24시간 배양한 후, 샘플을 실험하고자 하는 농도별로 처리하여 cell의 종류에 따라 24~48시간 동안 유지시켰다. 상등액을 최대한 제거한 후 trizol lysis buffer 각각의 디쉬에 1 mL씩 분주하여 세포를 용균시킨 후 상온에서 5분 동안 방치하였다. Trizol buffer를 각각 클로로포름(chloroform) 500 μL를 첨가하여 약 30초 동안 vortexing한 후 상온에서 10분간 방치하였다. 원심분리기를 이용하여 -4℃에서 15,000 rpm으로 15분간 원심분리를 한 후 상등액 400 μL를 새 튜브로 옮겨서 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol) 400 μL와 천천히 섞어준 뒤 상온에서 10분간 두었다. 앞의 과정과 동일하게 원심분리 하고 튜브의 바닥에 있는 RNA pellet을 확인한 후 상층액을 제거하며, 70% 에탄올로 RNA pellet을 세척하고 남은 용매를 증발시킨 다음 RNase free water에 RNA pellet을 녹여주었다. cDNA로의 증폭과 역전사는 TOPscript™ RT DryMIX(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 시행하였다.

- RT- PCR

대식세포를 키토산-글루콘산 복합체(CG1)로 24시간 처리하였다. 대식세포로부터 추출한 총 RNA를 실시간 PCR로 분석하였다. 실시간 PCR은 SYBR Green PCR Mastet Mix(applied biosystems, UK)를 사용하여 cDNA, TOPreal™ qPCR 2X PreMIX(Enzynomics, Daejeon, Korea) 및 primer(표 2)를 넣고, ABI step one plus(Applied biosystem, California, USA) 기기를 이용하여 실시간 정량 분석을 하였다. stepone Software(Applied biosystem, California, USA)를 사용하여 95℃에서 2분간 변성시킨 후 95℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 20초간 반응하는 온도순환조건을 40회 반복한 결과를 분석하였다.

유전자	프라이머	시퀀스(5'→3')
iNOS	정방향	ACA TCG ACC CGT CCA CAG TAT
iNOS	역방향	CAGAGG GGT AGG CTT GTC TC
COX-2	정방향	TCC CTA AAG GAA AAG TGG GAC
COX-2	역방향	GAG CGC ATT AAC CTC AGG ACC

도 26은 키토산-글루콘산 복합체(CG1)가 대식세포에서 iNOS 및 COX-2 mRNA 발현율에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 그래프는 3번 반복 측정한 결과의 평균값±D로 표시하였다. *p < 0.01는 LPS로 처리한 대조군과 유의한 차이가 있음을 나타낸다.

도 26에 도시된 바와 같이 iNOS 발현 억제 효과는 CG1의 최고 농도인 250 μg/mL에서 21.7%를 나타내었고, COX-2 발현 억제 효과는 약 5.4%의 억제효과를 확인할 수 있었다.

<키토산-당산 전해질 복합체( CSA )를 포함하는 화장품 제형>

액정 에멀젼 실험에 사용된 원료들은 화장품 제조 시 사용되는 원료들을 사용하였으며, 계면활성제로 몬타노브 202(아라키딜 알코올, 베헤닐 알코올 및 아라키딜 클루코사이드, Seppic) 및 lecinol S-10(하이드로제네이티드 레시틴, Nokko)를 사용하였다. 오일은 스쿠알렌(Squalane, Kishimoto), TCG-M(카프릭/카프릴릭트리글리세라이드, Kokyu) 및 silicone DC-345(사이클로메티콘, dow Cornong)를 사용하였다. 수용성 점증제의 경우에는 carbopol 941(카보머, Noveon) 및 natrasol 250HR(하이드록시에틸셀룰로스, Noveon)을 사용하였다. 기타 원료로는 보습제로 1,3-BG(뷰틸렌 글라이콜, Daucel) 및 글리세린(glycerin, LG), ognis), 방부제로 1,2-헥산디올(1,2-Hexanediol, Chung-do), 중화제로 L-아르기닌(Arginine, Ajinomoto)를 사용하였다.

하이드로젤 패치 실험에 사용된 원료들 역시 화장품 제조 시 사용되는 원료들을 사용하였으며, 수용성 점증제의 경우에 카라지난 wg-3, 로커스트 빈 검은 sigma chemical Co.(St, Louis, USA)을 사용하였다. 기타 원료로는 방부제로 1,2-헥산디올(1,2-Hexanediol, Chung-do), 보습제로 1,3-BG(뷰틸렌 글라이콜, Daucel) 및 글리세린(glycerin, LG)를 사용하였다.

실시예 4. 액정 에멀젼 (Liquid Crystal Emulsion)의 제조

하기 표 3에 도시된 바와 같은 성분 및 함량을 사용하여 액정 에멀젼을 제조하였다.

	성분	종류	함량
수상(A)	물	증류수	74.4 ~ 73.8
	계면활성제	하이드로제네이티드 레시틴	0.1 ~ 0.5
	보습제	글리세린	3.0
	보습제	뷰틸렌 글라이콜	2.0
	방부제1,2-헥디올	1,2-헥산디올	2.0
	컨디셔닝제	L-아르기닌	0.1
	수상 소계(A)		82.0 ~ 81.0
유상(B)	계면활성제	아라키딜알코올/ 베헤닐알코올/ 아라키딜글루코사이드	4.0
	유연제	시어버터	1.5
	유연제	사이클로메티콘	2.0
	오일	스쿠알란	2.0
	오일	카프릭/카프릴릭트리글리세라이드	1.0
	유상 소계(B)		10.5
증점제(C)		카보머 (2%)	5.0
		하이드록시에틸셀룰로스	3.0
		증점제 소계(C)	8.0
CSA(D)			0.1~20
Total			100

수상부 A상 81.0g ~ 82.0g, CSA(D) 및 유상부 B상 10.5 g을 각각 75 내지 80 ℃로 가열한 후 완전히 용해시킨다. 용해시킨 B상에 A상을 서서 혼합시키면서 유화를 진행시킨다. 이 때, 증점안정제 C를 첨가하여 3000 rpm으로 3분간 교반시킨다. 상기 혼합한 용액을 냉각 및 탈포과정을 거쳐 안정한 액정 형태의 에멀젼(Liquid crystal emulsion; LCE)를 제조하였다.

하이드로제네이티드 레시틴, 아라키딜알코올/ 베헤닐알코올/ 아라키딜글루코사이드, 시어버터, 스쿠알란, 및 카프릭/카프릴릭트리글리세라이드 각각의 함유량에 따른 액정 형성을 확인하기 위해 각각의 임의의 양을 정하여 최적의 액정 입자가 형성되는 조건을 확인하였다. 이때 LCE의 액정 형성 확인은 편광현미경을 이용하여 400배의 배율로 관찰하였으며, 시료가 골고루 퍼지도록 희석하여 입자를 관찰하였다. 시료의 양과 희석시킨 물의 양은 동일한 조건으로 하였다.

하기 표 2와 같이 하이드로제네이트 레시틴 함량을 0.10%부터 0.50%까지 0.10%씩 증가시켜 가며 측정한 조건 중에서 가장 적은 양으로 액정이 잘 형성되는 함량인 0.30%인 것을 확인하였다.

상	종류	농도 (wt%)
상	종류	A	B	C	D	E
수상(A)	증류수	74.3	74.2	74.1	74.0	73.9
	하이드로제네이티드 레시틴	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
	글리세린	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
	뷰틸렌 글라이콜	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	1,2-헥산디올	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	L-아르기닌	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
유상(B)	아라키딜알코올/ 베헤닐알코올/ 아라키딜글루코사이드	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
	시어버터	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
	사이클로메티콘	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	스쿠알란	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	카프릭/카프릴릭트리글리세라이드	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
증점제 (C)	카보머 (2%)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
증점제 (C)	하이드록시에틸셀룰로스	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
	소계	100	100	100	100	100

계면 활성제로 사용된 아라키딜알코올/ 베헤닐알코올/ 아라키딜글루코사이드 의 함량에 따른 액정 형성을 확인해 보았다. 하기 표 5와 같이 아라키딜알코올/ 베헤닐알코올/ 아라키딜글루코사이드 함량을 0.00%, 2.00%, 4.00%, 6.00%, 8.00%의 조건 중에서 가장 적은 양으로 액정이 잘 형성되는 함량은 4.00%인 것을 확인하였다.

상	종류	농도 (wt%)
상	종류	A	B	C	D	E
수상(A)	증류수	74.3	74.2	74.1	74.0	73.9
	하이드로제네이티드 레시틴	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
	글리세린	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
	뷰틸렌 글라이콜	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	1,2-헥산디올	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	L-아르기닌	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
유상(B)	아라키딜알코올/ 베헤닐알코올/ 아라키딜글루코사이드	0.0	2.0	4.0	6.0	8.0
	시어버터	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
	사이클로메티콘	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	스쿠알란	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	카프릭/카프릴릭트리글리세라이드	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
증점제 (C)	카보머 (2%)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
증점제 (C)	하이드록시에틸셀룰로스	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
	소계	100	100	100	100	100

유연제로 사용된 시어버터의 함량에 따른 액정 형성을 확인해 보았다. 하기 표 6과 같이 3.00%, 1.50%, 0.00%의 조건 중에서 시어버터 함량은 액정 형성에 크게 영향을 끼치지 않음을 확인할 수 있었다.

상	종류	농도 (wt%)
상	종류	A	B	C
수상(A)	증류수	72.6	74.1	75.6
	하이드로제네이티드 레시틴	0.3	0.3	0.3
	글리세린	3.0	3.0	3.0
	뷰틸렌 글라이콜	2.0	2.0	2.0
	1,2-헥산디올	2.0	2.0	2.0
	L-아르기닌	0.1	0.1	0.1
유상(B)	아라키딜알코올/ 베헤닐알코올/ 아라키딜글루코사이드	4.0	4.0	4.0
	시어버터	3.0	1.5	0.0
	사이클로메티콘	2.0	2.0	2.0
	스쿠알란	2.0	2.0	2.0
	카프릭/카프릴릭트리글리세라이드	1.0	1.0	1.0
증점제 (C)	카보머 (2%)	5.0	5.0	5.0
증점제 (C)	하이드록시에틸셀룰로스	3.0	3.0	3.0
	소계	100	100	100

오일로 사용된 스쿠알렌의 함량에 따른 액정 형성을 확인해 보았다. 스쿠알렌 함량을 하기 표 7과 같이 5.00%, 3.00%, 1.00%의 조건 중에서 가장 적은 양으로 액정이 잘 형성되는 함량은 3.00%인 것을 확인하였다.

상	종류	농도 (wt%)
상	종류	A	B	C
수상(A)	증류수	73.6	75.6	77.6
	하이드로제네이티드 레시틴	0.3	0.3	0.3
	글리세린	3.0	3.0	3.0
	뷰틸렌 글라이콜	2.0	2.0	2.0
	1,2-헥산디올	2.0	2.0	2.0
	L-아르기닌	0.1	0.1	0.1
유상(B)	아라키딜알코올/ 베헤닐알코올/ 아라키딜글루코사이드	4.0	4.0	4.0
	사이클로메티콘	2.0	2.0	2.0
	스쿠알란	5.0	3.0	1.0
증점제 (C)	카보머 (2%)	5.0	5.0	5.0
증점제 (C)	하이드록시에틸셀룰로스	3.0	3.0	3.0
	소계	100	100	100

오일로 사용된 카프릭/카프릴릭트리글리세라이드의 함량에 따른 액정 형성을 확인해 보았다. 하기 표 8과 같이 카프릭/카프릴릭트리글리세라이드 함량을 5.00%, 3.00%, 1.00%의 조건 중에서 가장 적은 양으로 액정이 잘 형성되는 함량은 3.00%인 것을 확인하였다.

상	종류	농도 (wt%)
상	종류	A	B	C
수상(A)	증류수	73.6	75.6	77.6
	하이드로제네이티드 레시틴	0.3	0.3	0.3
	글리세린	3.0	3.0	3.0
	뷰틸렌 글라이콜	2.0	2.0	2.0
	1,2-헥산디올	2.0	2.0	2.0
	L-아르기닌	0.1	0.1	0.1
유상(B)	아라키딜알코올/ 베헤닐알코올/ 아라키딜글루코사이드	4.0	4.0	4.0
	사이클로메티콘	2.0	2.0	2.0
	카프릭/카프릴릭트리글리세라이드	5.0	3.0	1.0
증점제 (C)	카보머 (2%)	5.0	5.0	5.0
증점제 (C)	하이드록시에틸셀룰로스	3.0	3.0	3.0
	소계	100	100	100

실시예 5. 하이드로겔 패치

하기 표 9에 도시된 바와 같은 성분 및 함량을 사용하여 하이드로겔 패치를 제조하였다.

상	성분	종류	함량
수상(A)	물	증류수	60.0
	증점제	카라지난 wg-3	1.0
	증점제	로커스트 빈 검	1.0
	보습제	뷰틸렌 글라이콜	5.0
	보습제	글리세린	30.0
	방부제	1,2-헥산디올	2.0
CSA(D)			1.0
소계		100	100

보습제로 사용된 글리세린의 함량에 따른 하이드로겔 패치을 확인해 보았다. 글리세린 함량을 5.00%(A), 30.00%(B)의 조건에서 하이드로겔 패치에서 나오는 액체의 보습력을 확인하기 위하여 TEWL을 측정하였다.

도 27은 보습제의 함량(하기 표 10의 A 및 B)에 따른 TEWL 차의 변화를 나타낸 그래프이다. 그래프는 3번 반복 측정한 결과의 평균값±D로 표시하였다.

도 27에 도시된 바와 같이 보습제가 30%가 들어간 경우가 5%보다 7시간 동안 높게 나타났었다. 이는 폴리올류의 보습제 함량이 많아질수록 수소 결합이 많아져 물을 오래 붙잡고 있으며 물을 서서히 증발시키는 것을 확인할 수 있었다.

상	종류	농도 (wt%)
상	종류	A	B
수상(A)	증류수	86.0	61.0
	카라지난 wg-3	1.0	1.0
	로커스트 빈 검	1.0	1.0
	뷰틸렌 글라이콜	5.0	5.0
	글리세린	5.0	30.0
	1,2-헥산디올	2.0	2.0
	소계	100	100

도 28은 보습제에 따른 제형 변화를 나타낸 사진이다. 일반적으로 보습제로 사용되는 글리세린, 뷰틸렌 글라이콜, 디프로필렌 글라이콜 및 트리프로필렌 글라이콜의 함유에 따른 하이드로겔 패치 제형적 특성을 확인하였다. 하기 표 11과 같이 각각의 보습제 함량을 30.00%의 조건에서 완성되는 제형의 투명성, 제형의 완성도를 육안으로 확인하였다. 그 결과를 도 28에 나타내었고, 글리세린과 뷰틸렌 글라이콜은 투명도가 높고 안정된 상태로 점도가 형성되었다. 그러나, 디프로필렌 글라이콜은 투명도가 낮았고, 트리프로필렌 글라이콜은 점도가 생성되지 않음을 확인할 수 있었다.

상	종류	농도 (wt%)
상	종류	A	B	C	D
수상(A)	증류수	61.0	61.0	61.0	61.0
	카라지난 wg-3	1.0	1.0	1.0	1.0
	로커스트 빈 검	1.0	1.0	1.0	1.0
	뷰틸렌 글라이콜	30.0	0.0	0.0	0.0
	글리세린	0.0	30.0	0.0	0.0
	디프로필렌 글라이콜	0.0	0.0	30.0	0.0
	트리프로필렌 글라이콜	0.0	0.0	0.0	30.0
	1,2-헥산디올	2.0	2.0	2.0	2.0
	소계	100	100	100	100

점증제에 따른 제형 변화를 측정하였다. 하이드로겔 패치의 점도, 탄성을 형성하는 원료의 비율에 따른 제형적 완성도를 확인하였다. 하기 표 12와 같이 Carrageenan wg-3, Locust Bean Gum의 비율을 1:7, 1:3, 1:1, 3:1, 7:1의 조건에서 완성되는 제형의 최대응력, 강도와 경도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다. 그 결과 1:1에서 경도와 강도가 다른 비율보다 안정한 것을 비교할 수 있었다.

상	종류	농도 (wt%)
상	종류	A	B	C	D	E
수상(A)	증류수	61.0	61.0	61.0	61.0	61.0
	카라지난 wg-3	0.25	0.50	1.0	1.5	1.75
	로커스트 빈 검	1.75	1.5	1.0	0.5	0.25
	뷰틸렌 글라이콜	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
	글리세린	30.0	30.0	30.0	30.0	30.0
	1,2-헥산디올	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	소계	100	100	100	100	100

		최대응력 (g)	강도 (g/cm²)	경도 (g/cm²)
에멀전 (%)	A	625.0	1050.e+003	1812e+003
	B	770.0	1180e+003	1811e+003
	C	811.0	1300e+003	1850e+003
	D	842.0	1405e+003	1535e+003
	E	925.0	1420e+003	1482e+005

실시예 6. 액정 형태의 에멀젼을 함유한 하이드로겔 패치

상기 표 13에 기재된 바와 같은 하이드로겔 조성(E)을 75 내지 80 ℃로 가열한 후 완전히 용해시키고, 1500 rpm으로 3분간 교반시킨다. 하기 표 14에 기재된 조성으로 제조된 LCE를 혼합시키면서 1500 rpm으로 3분간 교반시킨다. 이 후 냉각과정을 거쳐 LCE를 함유한 하이드로겔 패치를 제조하였다.

	상	종류	함량
액정 에멀젼	수상(A)	증류수	72.6
		하이드로제네이티드 레시틴	0.3
		글리세린	3.0
		뷰틸렌 글라이콜	2.0
		1,2-헥산디올	2.0
		L-아르기닌	0.1
	유상(B)	아라키딜알코올/ 베헤닐알코올/ 아라키딜글루코사이드	4.0
		시어버터	1.5
		사이클로메티콘	2.0
		스쿠알란	2.0
		카프릭/카프릴릭트리글리세라이드	2.0
	증점제(C)	카보머 (2%)	5.0
	증점제(C)	하이드록시에틸셀룰로스	3.0
	CSA(D)		0.5
	액정 에멀젼 소계		100
하이드로겔	수상(E)	증류수	61.0
		카라지난 wg-3	1.0
		로커스트 빈 검	1.0
		뷰틸렌 글라이콜	5.0
		글리세린	30.0
		1,2-헥산디올	2.0
	하이드로겔 소계		100

도 29는 에멀젼(Emulsion) 함유량에 따른 제형 변화를 나타낸 사진이다. 에멀젼의 함유량을 하기 표 15와 같이 60%, 50%, 40%, 30%, 20%로 변화를 주어 따라 하이드로겔 패치의 투명도를 육안으로 확인하여 도 29와 같이 나타났다. 에멀젼의 함유량 60%, 50%, 40%, 30%, 20%의 조건에서 완성되는 제형의 최대응력, 강도와 경도를 측정하였다. 그 결과 하기 표 16에서 볼 수 있듯이 60%의 경우 강도와 경도가 급격하게 떨어지는 것을 확인 할 수 있었고, 50%까지는 강도와 경도, 최대 응력, 투명도의 차이가 적었다. 그리하여 하기 표 17의 최종 처방을 결정하게 되었다.

상	종류	농도 (wt%)
상	종류	A	B	C	D	E
수상(A)	증류수	0.0	10.	20.0	30.0	40.0
	카라지난 wg-3	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
	로커스트 빈 검	1.75	1.5	1.0	0.5	0.25
	뷰틸렌 글라이콜	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
	글리세린	31.0	31.0	31.0	31.0	31.0
	1,2-헥산디올	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	에멀젼	60.0	50.0	40.0	30.0	20.0
	소계	100	100	100	100	100

		최대응력 (g)	강도 (g/cm²)	경도 (g/cm²)
에멀전 (%)	A	528.0	1031.e+003	1412e+003
	B	770.0	1280e+003	1842e+003
	C	790.0	1305e+003	1881e+003
	D	802.0	1401e+003	1949e+003
	E	925.0	1420e+003	2012e+005

상	종류	농도 (wt%)
수상(A)	증류수	11.0
	카라지난 wg-3	1.0
	로커스트 빈 검	1.0
	뷰틸렌 글라이콜	5.0
	글리세린	30.0
	1,2-헥산디올	2.0
	에멀젼	50.0
	소계	100

시험예 5. LCE , 하이드로겔 패치 및 LCE를 함유한 하이드로겔 패치에 대한 안정성 측정

(1) LCE 안정성 측정

실시예 4의 액정 에멀젼의 안정성을 확인하기 위해 2개월간 0℃, 25℃와 45℃의 조건에서 pH의 변화와 점도를 측정하였고 시료 첨가에 따른 액정의 유지 상태를 관찰하였다.

온도와 시간에 따른 pH 측정을 하였다. 피부에서 pH는 피부의 피지막을 측정하여 나타내는데 대체적으로 약산성의 범위에 있다. 이러한 범위를 벗어나게 되면 피부에 미생물 증식이 활발해지고 감염, 자극, 가려움 등을 유발하게 된다. 따라서, 화장품의 pH는 이러한 범위 내에서 제조하고 또한 유지되어야 할 필요가 있다. LCE의 pH 변화를 측정하기 위해 60일 동안 25℃와 암실의 조건을 유지시키면서 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 18에 나타내었다.

액정 형태의 에멀젼(LCE)	pH
0 일	6.50
3 일	6.53
7 일	6.54
14 일	6.48
21 일	6.52
28 일	6.53
1 개월	6.50
2 개월	6.55

또한, 온도와 시간에 따른 LCE의 상변이를 측정하였다. LCE의 상변이, 변질 및 분리등 안정성을 측정하기 위해 60일 동안 0℃, 25℃와 45℃의 조건을 유지시키면서 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 19에 나타내었다.

액정 형태의 에멀젼(LCE)	0 ℃	25 ℃	45 ℃
0 일	O	O	O
3 일	O	O	O
7 일	O	O	O
14 일	O	O	O
21 일	O	O	O
28 일	O	O	O
1 개월	O	O	O
2 개월	O	O	O

(2) 하이드로패치 안정성 측정

온도와 시간에 따른 하이드로겔 패치의 상변이를 측정하였다. 하이드로겔 패치의 상변이, 변질 및 분리 등 안정성을 측정하기 위해 60일 동안 0℃, 25℃와 45℃의 조건을 유지시키면서 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 20에 나타내었다.

(3) 액정 에멀젼이 함유된 하이드로겔 패치 안정성 측정

에멀젼의 함유된 하이드로겔 패치의 상변이, 변질 및 분리 등 안정성을 측정하기 위해 60일 동안 0℃, 25℃와 45℃의 조건을 유지시키면서 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 21에 나타내었다.

Claims

키토산; 및 상기 키토산과 이온결합 되어있는 당산을 포함하는 고분자 전해질 복합체를 포함하며,
상기 고분자 전해질 복합체는 물, 당산 및 키토산을 혼합하여 용액을 형성하는 단계;
상기 용액을 여과하여 복합체의 농도가 2 내지 9 wt%인 복합체 용액을 제조하는 단계; 및
상기 복합체 용액을 동결건조하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 키토산은 50 내지 100 %의 탈아세틸화도를 가지는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 당산은 알돈산, 우론산, 알다린산 및 울로손산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 화장료 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 당산은 글루콘산, 갈락트론산 및 글루크론산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 당산의 함량은 키토산 1 중량부에 대하여 0.1 내지 5 중량부인 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 물, 당산 및 키토산을 혼합하는 단계는
물 및 당산 수용액을 혼합하는 단계; 및
상기 혼합물에 키토산을 추가하고 용해하여 용액을 형성하는 단계를 포함하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 상기 고분자 전해질 복합체를 0.1 내지 10 중량부로 포함하는 화장료 조성물.
키토산; 및 상기 키토산과 이온결합 되어있는 당산을 포함하는 고분자 전해질 복합체를 포함하며,
상기 고분자 전해질 복합체는 물, 당산 및 키토산을 혼합하여 용액을 형성하는 단계;
상기 용액을 여과하여 복합체의 농도가 2 내지 9 wt%인 복합체 용액을 제조하는 단계; 및
상기 복합체 용액을 동결건조하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되고,
액정 에멀젼 제형을 가지는 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물.
제 8 항에 있어서, 액정 에멀젼 제형은
수상 계면활성제 및 보습제를 포함하는 수상;
유상 계면활성제 및 오일을 포함하는 유상;
증점제; 및
고분자 전해질 복합체를 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장품.
키토산; 및 상기 키토산과 이온결합 되어있는 당산을 포함하는 고분자 전해질 복합체를 포함하며,
상기 고분자 전해질 복합체는 물, 당산 및 키토산을 혼합하여 용액을 형성하는 단계;
상기 용액을 여과하여 복합체의 농도가 2 내지 9 wt%인 복합체 용액을 제조하는 단계; 및
상기 복합체 용액을 동결건조하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되고,
하이드로겔 제형을 가지는 항산화 또는 항염증용 화장품.
제 10 항에 있어서, 하이드로겔 제형은
물, 증점제 및 보습제를 포함하는 수상; 및
고분자 전해질 복합체를 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장품.
액정 에멀젼; 및
상기 액정 에멀젼을 함유하는 하이드로겔을 포함하고,
상기 액정 에멀젼 또는 하이드로겔 중 하나 이상은 키토산; 및 상기 키토산과 이온결합 되어있는 당산을 포함하는 고분자 전해질 복합체를 포함하며,
상기 고분자 전해질 복합체는 물, 당산 및 키토산을 혼합하여 용액을 형성하는 단계;
상기 용액을 여과하여 복합체의 농도가 2 내지 9 wt%인 복합체 용액을 제조하는 단계; 및
상기 복합체 용액을 동결건조하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 고분자 전해질 복합체를 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장품.
제 12 항에 있어서, 전체 조성물 중 액정 에멀젼의 함량은 10 내지 70 중량부인 항산화 또는 항염증용 화장품.