KR102075849B1 - 흑효모 균체 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 조성물 - Google Patents
흑효모 균체 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 흑효모 균체 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 조성물에 관한 것으로, 상기 흑효모 균체 추출물, 특히 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KCCM11373P 추출물은 아쿠아포린-3의 생성량을 증가시키고, NO의 생성을 저해하는 효과가 우수하였으며, 경피수분손실량 개선효과 또한 우수하므로, 흑효모 균체 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 보습, 항염 및 피부장벽강화용 화장품 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 흑효모(Aureobasidium pullulans) 균체 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 조성물에 관한 것이다.
피부의 수분균형은 표피(epidermis)에 의해 조절된다. 표피는 죽은 세포들이 쌓여 있는 것이지만 피부의 수분유지를 위해서 매우 중요한 역할을 한다. 사람의 생체는 생명체 유지에 중요한 역할을 하는 물로 대부분 구성되어 있다. 정상 피부에서의 수분은 체내에 70%, 각질층에 20%가 함유되어 있어 피부의 탄력성 및 유연성을 지탱해 준다. 각질층의 수분이 10% 이하일 경우, 피부는 건성화되고, 피부 트러블의 원인이 된다고 알려져 있다. 규칙적인 각질화(keratinization)로 생성된 각질층 안의 수분량은 항상 10~20%를 유지한다. 이것은 땀과 피지의 혼합으로 되어있는 피지 막 때문으로, 외부로부터 피부를 보호하고, 각질층에서 수분이 증발되는 것을 막고 있다. 이렇듯 피부는 인체 중 가장 큰 기관으로, 외부로부터의 인체의 다른 중요한 기관을 보호하고 내부의 유한 성분이 밖으로 빠져나가는 것을 방지하는 장벽기능, 온도조절기능, 배설기능, 호흡기능 등 다양한 역할을 담당하고 있는 아주 중요한 기관이다.
피부 및 다른 기관의 수분 보유율을 조절하는 단백질의 한 종류로 아쿠아포린(aquaporin, AQP)이 있다. AQP는 박테리아, 식물, 동물에서 광범위하게 발현되며, 세포막을 통과하는 6개의 α-헬릭스(helix)를 기본 구성단위로 하는 사량체로, 세포막에 존재하고 있으며, 현재까지 포유류에서 13종의 AQP 단백질들이 밝혀졌다.
이들 중 아쿠아포린-3(AQP-3)은 글리세롤이 세포막을 통과할 수 있도록 하며, 대장균(Escherichia coli)의 글리세롤 수송체인 GlpF와 비슷한 아미노산 배열과 단백질 구조를 가지고 있다. AQP-3은 쥐의 신장에서 처음으로 유전자 클로닝 되었으며, AQP-3이 결핍된 생쥐의 집합관에서 삼투에 의한 물 수송력이 3배 정도 감소하는 것을 통해, AQP-3이 물 수송에 관여함을 확인하였고, AQP-3 녹아웃 마우스를 이용한 표현형 분석결과, AQP-3 유전자가 결여된 생쥐는 소변 농축 기전의 결함으로 인한 다뇨증과 함께 피부 건조 및 상처치유 지연을 보이는 등 다양한 역할에 대하여 확인하였다.
최근 환경의 변화나 생활 패턴의 변화에 따른 냉/난방의 인위적인 온도 조절, 사회생활에서 발생되는 각종 스트레스와 환경오염으로 인한 피부 스트레스, 화장 습관에 따른 잦은 세안 및 연령 증가에 따른 자연적인 피부 노화 등의 여러 가지 원인으로 인하여 각질층의 수분이 감소하여 피부가 건조해지고 표면이 거칠게 되며 피부가 푸석거리고 촉촉함을 잃어 생기가 없어 보이는 등의 현상이 발생하기 때문에 피부 장벽 강화용 또는 피부 보습용 조성물의 필요가 증가하고 있다.
한편, 염증 반응은 외부 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로서 물리적 작용이나 유해물질, 화학적 자극, 세균 감염 등에 의한 손상을 수복 재생하려는 기전이며, 지속적인 염증반응은 오히려 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등 각종 질환을 유도한다. 특히, 피부염은 피부에 생긴 염증으로 발적, 종창, 열감 및 동통 증상을 동반한다. 자각증상으로 아픔보다 가려움을 더 느끼는 것이 보통이다. 일반적으로 피부염은 아토피성 피부염, 1차성 자극성 피부염, 접촉 피부염, 지루성 피부염과 같이 습진성 피부염 및 선상 피부염, 독나방 피부염 등 곤충이 원인인 피부염에 대해 사용한다.
이러한 피부염의 치료에는 스테로이드제제, 항히스타민제제를 처방하는 것이 일반적이다. 하지만, 국소 부신피질호르몬 같은 스테로이드제제를 장기간 사용하는 경우, 피부위축, 혈관확장 및 색소탈실 등의 문제가 발생될 수 있으며, 항히스타민제제의 경우 내성 및 과민반응이 나타날 수 있다. 따라서, 종래 피부염 치료제의 문제점을 보완할 안전한 물질로 천연 유래 물질을 이용한 새로운 피부염 치료제 개발이 요구되고 있다.
한편, 흑효모(Aureobasidium pullulans)는 습기가 가득찬 창문 등에서 쉽게 찾아볼 수 있는 균으로 식물의 잎이나 꽃에서 분리되기도 한다. 이들이 주로 생산하는 풀루란(Pullulan)은 식품공업에서 젤리 등의 물성의 부여에 쓰이고 있다. 또한 액상식품을 풀루란의 필름 속에 넣는 새로운 식품이 개발되고 있다.
풀루란은 흑효모 균주로 발효하고 α-(1,6) 연결된 말토트리오스로부터 생산된 포도당을 분리해 정제과정을 거쳐 얻어지는 선형 다당류이며, 글루칸 합성체이다. 특징으로 물에 잘 녹으며 알코올류와 유류에는 녹지 않는다.
한편, 한국등록특허 제1788530호에는 다양한 허브 식물에 흑효모 및 리조비움을 접종 및 발효시킨 발효 조성물의 항산화 및 항노화 효과가 개시되어 있지만, 본 발명의 흑효모 균체 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 조성물에 관해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 흑효모 균체 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 조성물을 제공하고, 상기 흑효모 균체의 추출 용매별 보습, 항염 및 피부장벽강화 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 흑효모(Aureobasidium pullulans) 균체 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 흑효모(Aureobasidium pullulans) 균체 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 흑효모 균체 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 조성물에 관한 것으로, 상기 흑효모 균체 추출물, 특히 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KCCM11373P 에틸아세테이트 추출물은 사카로마이세스 세레비지애(Sacharomyces cerevisiae) 추출물, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 추출물, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 추출물 및 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 추출물뿐만 아니라 흑효모 배양액에 비해 아쿠아포린-3의 생성량을 증가시키고, NO 생성을 저해하는 활성이 우수하였다. 또한, 흑효모 균체 추출물은 보습 효과를 증진시켜 경피수분손실량 개선효과가 우수하므로, 흑효모 균체 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 보습, 항염 및 피부장벽강화용 화장료 조성물 또는 건강기능식품 조성물로 사용할 수 있다.
본 발명은 흑효모(Aureobasidium pullulans) 균체 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 화장료 조성물에 관한 것이다.
상기 '피부장벽강화'는 피부의 촉촉함을 유지하고 외부 자극으로부터 보호하는 역할을 하는 피부장벽을 강화하는 것을 의미한다.
상기 흑효모는 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KCCM12017, 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KCCM60122 또는 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KCCM11373P일 수 있으며, 바람직하게는 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KCCM11373P(한국등록특허 제1365711호 참고)인 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 흑효모 균체 추출물의 추출 용매는 C1~C3의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 헥산 또는 부탄올일 수 있으며, 바람직하게는 에틸아세테이트 또는 헥산을 추출 용매로 사용하는 것이고, 더 바람직하게는 에틸아세테이트를 용매로 사용하여 흑효모 균체 추출물을 제조하는 것이지만, 이에 한정하지 않는다.
상기 흑효모 균체는 포도당, 펩톤, 효모 추출물(Yeast extract) 및 정제수를 혼합한 배지를 이용하여 32~38℃에서 24~72시간 동안 배양한 후 여과하여 분리한 균체를 동결건조한 것일 수 있고, 바람직하게는 4~8 중량%의 포도당, 0.1~1 중량%의 펩톤, 0.1~1 중량%의 효모 추출물 및 90~95 중량%의 정제수를 혼합한 배지를 이용하여 32~38℃에서 24~72시간 동안 배양한 후 여과하여 분리한 균체를 동결건조한 것일 수 있으며, 더 바람직하게는 6 중량%의 포도당, 0.5 중량%의 펩톤, 0.5 중량%의 효모 추출물 및 93 중량%의 정제수를 혼합한 배지를 이용하여 35℃에서 48시간 동안 배양한 후 여과하여 분리한 균체를 -45℃에서 48시간 동안 동결건조한 것일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 흑효모 균체 추출물은 6 중량%의 포도당, 0.5 중량%의 펩톤, 0.5 중량%의 효모 추출물 및 93 중량%의 정제수를 혼합한 배지를 이용하여 35℃에서 48시간 동안 배양한 후 여과하여 분리한 균체를 -45℃에서 48시간 동안 동결건조한 후 유기용제인 에틸아세테이트를 용매로 사용하여 추출함으로써 획득될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 흑효모 균체 추출물은 아쿠아포린-3의 생성을 증가시키고, NO(Nitric Oxide)의 생성을 억제하며, 피부 장벽손상 후 회복력을 증가시키는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 흑효모(Aureobasidium pullulans) 균체 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예
1. 균체 동결건조물의 제조
하기 표 1에 개시된 각각의 균주를 일정조건으로 배양하기 위한 배양액은 정제수(93 중량%) 2790g에 펩톤(0.5 중량%) 15g, 효모 추출물(0.5 중량%) 15g 및 탄소원으로 포도당(6 중량%) 180g을 첨가하여 혼합하여 제조하였고, 121℃에서 30분 동안 멸균시켰다. 그 후 표 1에 개시된 종균 배양액으로 배양된 각각의 균주 배양액 150g을 상기 멸균된 배양액에 접종하여 35℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 여과지(현대 마이크로 HM20)를 이용하여 배양액을 제거한 후 균체를 분리하였고, 영하 45℃에서 48시간 동안 동결건조하여 각각의 균체를 획득하였다.
| 시료 | 균주 | 종균배양액 | 종균 배양조건(℃) | 균체 수득량 (g) |
| 1 | Sacharomyces cerevisiae | YM BROTH (DIFCO 271120) |
26 | 41 |
| 2 | Aspergillus oryzae | POTATO DEXTROSE BROTH (DIFCO 254920) |
26 | 34 |
| 3 | Lactobacillus plantarum | MRS BROTH (DIFCO 288130) |
37 | 32 |
| 4 | Lactobacillus fermentum | MRS BROTH (DIFCO 288130) |
37 | 30 |
| 5 | Aureobasidium pullulans (KCCM 12017) |
POTATO DEXTROSE AGAR (DIFCO 254920) |
26 | 55 |
| 6 | Aureobasidium pullulans (KCCM 60122) |
POTATO DEXTROSE AGAR (DIFCO 254920) |
26 | 58 |
| 7 | Aureobasidium pullulans (KCCM 11373P) |
POTATO DEXTROSE AGAR (DIFCO 254920) |
26 | 62 |
제조예
2. 균체 추출물의 제조
상기 제조예 1에서 획득한 각각의 균체 30g에 대하여 에틸아세테이트 300g을 사용하여 2회 추출하였다. 추출 후 종이 여과지로 여과하였으며, 여과된 여액을 65℃에서 감압건조하여 하기 표 2에 개시된 바와 같이 각각의 균체 에틸아세테이트 추출물을 획득하였다.
| 시료 | 균주 | 균체 추출물 수득량 (g) |
| 1 | Sacharomyces cerevisiae | 0.6 |
| 2 | Aspergillus oryzae | 0.4 |
| 3 | Lactobacillus plantarum | 0.5 |
| 4 | Lactobacillus fermentum | 0.6 |
| 5 | Aureobasidium pullulans(KCCM 12017) | 1.8 |
| 6 | Aureobasidium pullulans(KCCM 60122) | 1.3 |
| 7 | Aureobasidium pullulans(KCCM 11373P) | 2.3 |
에틸아세테이트 추출결과, 흑효모에서 획득한 균체 추출물의 수득량이 타 균주들에 비해 2~5배 정도 많았으며, 흑효모 균체 추출물 중에서는 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KCCM11373P 균체에서 가장 많은 양의 균체 추출물이 획득되었다.
제조예
3. 추출 용매에 따른 균체 추출물의 제조
추출 용매에 따른 추출량 및 효능 비교평가를 위해, 제조예 1의 방법으로 획득한 표 2의 시료 7의 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KCCM11373P 균체 30g에 대하여 하기 표 3에 개시된 다양한 용매 300g을 사용하여 2회 추출을 진행하였다. 그 후, 추출물을 종이 여과지로 여과하였으며, 여과된 여액을 65℃에서 감압건조한 후 0.45㎛ 여과지로 여과하여 하기 표 3에 개시된 바와 같이 각각의 균체 용매별 추출물을 획득하였다.
실험 결과, 정제수에서는 균체 추출물의 수득량이 측정되지 않았으며, 에탄올, 부탄올 및 메탄올의 수용성 용매를 사용하여 얻어진 추출물의 수득량에 비해 헥산을 이용하여 추출한 경우 수득량 1.8g으로 우수하였다. 하지만, 제조예 2의 표 2의 에틸아세테이트 추출물(시료 7)의 수득량인 2.3g 보다는 적게 추출되었다.
| 시료 | 추출용매 | 균체 추출물 수득량 (g) |
| 1 | 정제수 | 0.0 |
| 2 | 95%(v/v) 에탄올 | 0.3 |
| 3 | 70%(v/v) 에탄올 | 0.2 |
| 4 | 헥산 | 1.8 |
| 5 | 포화 부탄올 | 0.4 |
| 6 | 메탄올 | 0.1 |
제조예
4. 균주 배양액의
분획물
제조
균체 추출물과 배양액 추출물의 추출량 및 효능 비교평가를 위해, 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KCCM11373P를 제조예 1과 동일한 방법으로 배양하여 총 3kg의 배양액을 획득하였다. 그 후 제조예 2의 방법으로 균체를 제거하여 얻어진 여과액을 85℃에서 배양액 양이 300g이 되도록 감압농축한 후, 헥산 300g을 혼합하여 2회 추출한 후 분획물을 획득하고, 그 후 에틸아세테이트 300g을 혼합하여 2회 추출한 후 분획물을 획득하였다. 그 후 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 잔류물을 종이여과지로 여과하였으며, 여과된 여액을 65℃에서 감압건조하여 각각의 분획물의 수득량을 확인하였다. 그 결과, 배양액 헥산 또는 에틸아세테이트 분획물로부터는 0.1 또는 0.2g의 건조물을 수득한 반면, 잔류물로부터는 72.2g의 건조물을 수득하였다.
상기 실험 결과, 헥산 또는 에틸아세테이트를 이용한 배양액 분획물로부터 0.1, 0.2g의 건조물을 획득하였다. 동량의 용매를 사용하여 획득한 균체 추출물은 1.8g(표 3의 시료 4), 2.3g(표 2의 시료 7)으로 균체 추출물에 비해 균체 배양액의 분획물의 수득량이 미미하였다. 이를 통해 균주 배양액에는 포함되지 않은 다량의 유효성분이 균체에 함유되어 있다는 것을 확인하였다.
| 시료 | 분획용매 | 배양액 분획물 수득량 (g) |
| 1 | 헥산 | 0.1 |
| 2 | 에틸아세테이트 | 0.2 |
| 3 | 잔류물 | 72.2 |
제조예
5.
흑효모
균체 추출물 함유 로션의 제조
흑효모 균체 추출물을 함유하는 로션의 처방예는 하기 표 5와 같다. 흑효모균체 추출물 제형예는 상기 표 2의 시료 7의 흑효모 균체 에틸아세테이트 추출물을 함유하는 로션(제형예 1)이고, 비교 제형예는 흑효모 균체를 함유하지 않는 로션(비교예)이다.
표 5의 수상 원료물질 1, 2, 4, 6을 80℃로 가온하여 용해한 후 균질화하였고, 유상 원료물질들은 80℃로 가온하여 용해한 후 균질화하였다. 이후 수상원료에 유상 원료를 투입하여 10분 동안 80℃에서 유화한 후, 서서히 균질화하여 40℃로 냉각하였으며, 그 후 나머지 미용 원료성분들을 투입하고 교반한 후 상온으로 냉각시켜 균질화한 후 안정화하고 숙성시켜 제조하였다.
| NO | 성분명 | 함량(%, w/v) | |
| 제형예1 | 비교예1 | ||
| 1 | 정제수 | 71.745 | 71.75 |
| 2 | 프로필렌글라이콜 | 8 | 8 |
| 3 | 흑효모 균체 추출물 | 0.005 | - |
| 4 | 글리세린 | 5 | 5 |
| 5 | 미네랄오일 | 5 | 5 |
| 6 | 부틸렌글라이콜 | 3 | 3 |
| 7 | 카프릴릭·카프릭트리글리세라이드 | 2 | 2 |
| 8 | 디메치콘 | 1 | 1 |
| 9 | 1,2-헥산디올, 카프릴릴글라이콜 | 1 | 1 |
| 10 | 팔미틱애씨드 | 0.8 | 0.8 |
| 11 | 스테아릭애씨드 | 0.75 | 0.75 |
| 12 | 세틸알코올 | 0.5 | 0.5 |
| 13 | 글리세릴 스테아레이트/피이지-100스테아레이트 | 0.5 | 0.5 |
| 14 | 폴리아크릴레이트-13,폴리이소부텐, 폴리소르베이트20 |
0.6 | 0.6 |
| 15 | 잔탄검 | 0.1 | 0.1 |
| 합 계 | 100 | 100 | |
실시예
1.
아쿠아포린
-3 발현량 측정
아쿠아포린-3의 생성 촉진 여부를 측정하기 위해 인체 유래 각질형성세포(keratinocyte)를 24 웰 플레이트의 각 웰에 1×104개씩 접종한 후 하루 동안 배양하여 세포를 안정화시켰다. 그 후 제조예 2~4의 시료를 20㎍/㎖의 농도로 각각 처리하여 2일 동안 무혈청 배지에서 배양하였다. 배양 후 상등액을 취해 아쿠아포린-3 측정용 키트(Aquaporin 3 ELISA KIT, Gill Blood Group, USA)를 이용하여 450nm에서의 흡광도를 비교하여 아쿠아포린-3의 생성 정도를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 6에 개시된 바와 같이 제조예 2의 균주별 에틸아세테이트 추출물 비교에서, 흑효모 균체 추출물은 사카로마이세스 세레비지애 추출물, 아스퍼질러스 오리재 추출물, 락토바실러스 플란타룸 추출물 및 락토바실러스 퍼멘텀 추출물에 비해 아쿠아포린-3의 생성을 현저히 증가시켰으며, 특히 흑효모 중 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KCCM11373P의 아쿠아포린-3 생성량이 가장 우수하였다.
또한, 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KCCM11373P의 용매별 비교에서, 에틸아세테이트(제조예 2의 시료 7) 및 헥산(제조예 3의 시료 4)을 이용하여 추출한 경우 에탄올, 부탄올 및 메탄올을 이용하여 추출한 추출물에 비해 현저한 아쿠아포린-3 생성 증가를 확인할 수 있었다.
한편, 흑효모 배양액 분획물 및 잔류물(제조예 4의 시료 1~3)은 흑효모 균체 추출물에 비해 아쿠아포린-3의 생성량이 현저히 감소하였다.
| 제조방법 | 시료 | 처리 고형분 농도 (㎍/㎖) |
아쿠아포린-3 생성 (450nm 흡광도) |
|
| 무첨가 | - | 0.132 | ||
| 제조예 2 (에틸아세테이트 추출물) (표 2) |
1 | 사카로마이세스 세레비지애 | 20 | 0.143 |
| 2 | 아스퍼질러스 오리재 | 20 | 0.127 | |
| 3 | 락토바실러스 플란타룸 | 20 | 0.163 | |
| 4 | 락토바실러스 퍼멘텀 | 20 | 0.198 | |
| 5 | 오레오바시디움 풀루란스 KCCM12017 | 20 | 0.335 | |
| 6 | 오레오바시디움 풀루란스 KCCM60122 | 20 | 0.320 | |
| 7 | 오레오바시디움 풀루란스 KCCM11373P | 20 | 0.510 | |
| 제조예 3 (오레오바시디움 풀루란스 KCCM11373P) (표 3) |
1 | 정제수 | - | - |
| 2 | 95% 에탄올 | 20 | 0.186 | |
| 3 | 70% 에탄올 | 20 | 0.165 | |
| 4 | 헥산 | 20 | 0.440 | |
| 5 | 포화 부탄올 | 20 | 0.168 | |
| 6 | 메탄올 | 20 | 0.140 | |
| 제조예 4 (배양액) (표 4) |
1 | 헥산 분획 | 20 | 0.144 |
| 2 | 에틸아세테이트 분획 | 20 | 0.158 | |
| 3 | 잔류물 | 20 | 0.176 | |
실시예
2.
NO
(
Nitric
Oxide
) 생성 저해활성 측정
RAW 264.7 대식 세포주(ATCC, Rockville, MD, USA)를 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum), 2mM L-아르기닌과 100㎍/㎖의 페니실린 및 스트렙토마이신(Life technologies, Frederick, MD, USA)이 포함된 DMEM 배지로 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다. RAW 264.7 세포를 1.5×105 cells/㎖의 농도로 48 웰 플레이트에 분주하여 12시간 동안 부착시키고, 새로운 배지로 교환한 다음 LPS를 1㎍/㎖가 되도록 가하였다. 제조예 2~4의 시료는 DMSO(dimethylsulfoxide)에 용해시켜 보관하였고, 세포에 처리시 최종농도가 0.1%(w/v) DMSO 용액이 되도록 LPS와 동시에 배양액에 가한 다음 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 각 웰의 배양액으로 유리된 NO 생성 정도를 측정하였다.
NO 생성 정도는 그리스 반응(Griess reaction)에 기초한 NO 검출 키트(iNtron)를 사용하여 측정하였으며, 세포 배양 상등액에 그리스 시약을 넣고 혼합한 다음 10분 동안 상온에서 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)로 520nm 흡광도에서 측정하였다. NO의 농도는 아질산나트룸(Sodium nitrite)의 농도별 표준곡선을 바탕으로 결정하였다.
그 결과, 하기 표 7에 개시된 바와 같이 LPS의 첨가에 의해 NO의 생성이 증가되는 것을 확인하였고, 제조예 2의 균주별 에틸아세테이트 추출물 비교에서, 흑효모 균체 추출물은 사카로마이세스 세레비지애 추출물, 아스퍼질러스 오리재 추출물, 락토바실러스 플란타룸 추출물 및 락토바실러스 퍼멘텀 추출물에 비해 LPS에 의해 증가된 NO의 생성정도를 현저히 감소시켰으며, 특히 흑효모 중 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KCCM11373P의 NO 생성량 감소효과가 가장 우수하였다.
또한, 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KCCM11373P의 용매별 비교에서, 에틸아세테이트 및 헥산을 이용하여 추출한 경우 에탄올, 부탄올을 이용하여 추출한 추출물에 비해 현저한 NO 생성 저해효과를 확인할 수 있었다.
한편, 흑효모 배양액 분획물 및 잔류물은 흑효모 균체 추출물에 비해 NO 생성 저해효과가 현저히 감소하였다.
| 시료 | 처리 고형분 농도 (㎍/㎖) |
NO 생성량 (%) |
|||
| 무첨가 | - | 34.2 | |||
| LPS 단독 처리 | - | 100.0 | |||
| LPS 처리 | 제조예 2 (에틸아세테이트 추출물) (표 2) |
1 | 사카로마이세스 세레비지애 | 0.05 | 95.6 |
| 2 | 아스퍼질러스 오리재 | 0.05 | 103.8 | ||
| 3 | 락토바실러스 플란타룸 | 0.05 | 99.7 | ||
| 4 | 락토바실러스 퍼멘텀 | 0.05 | 103.4 | ||
| 5 | 오레오바시디움 풀루란스 KCCM12017 | 0.05 | 79.0 | ||
| 6 | 오레오바시디움 풀루란스 KCCM60122 | 0.05 | 81.5 | ||
| 7 | 오레오바시디움 풀루란스 KCCM11373P | 0.05 | 44.1 | ||
| 무첨가 | - | 36.0 | |||
| LPS 단독 처리 | - | 100.0 | |||
| LPS 처리 | 제조예 3 (오레오바시디움 풀루란스 KCCM11373P) (표 3) |
1 | 정제수 | - | - |
| 2 | 95% 에탄올 | 0.05 | 83.8 | ||
| 3 | 70% 에탄올 | 0.05 | 89.6 | ||
| 4 | 헥산 | 0.05 | 64.7 | ||
| 5 | 포화 부탄올 | 0.05 | 90.0 | ||
| 6 | 메탄올 | 0.05 | 87.4 | ||
| 무첨가 | - | 32.5 | |||
| LPS 단독 처리 | - | 100.0 | |||
| LPS 처리 | 제조예 4 (배양액) (표 4) |
1 | 헥산 분획 | 0.05 | 101.6 |
| 2 | 에틸아세테이트 분획 | 0.05 | 94.3 | ||
| 3 | 잔류물 | 0.05 | 96.3 | ||
실시예
3.
흑효모
균체 추출물의 농도별 세포독성 및
NO
생성량 측정
상기 실시예 2에서 우수한 NO 생성 억제효과를 나타낸 제조예 2의 시료 7(오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KCCM11373P 에틸아세테이트 추출물)의 항염효과 및 세포독성을 다양한 농도에서 확인하였다.
세포 독성은 MTT 분석에 의한 세포 독성을 측정하였으며, RAW 264.7 세포를 1.5×105 cells/㎖의 농도로 48 웰 플레이트에 분주하여 12시간 동안 부착한 후 실험을 시행하였다. 상기 제조예 2의 시료 7의 균체 추출물은 최종 처리농도가 0.01, 0.05, 0.5, 5㎍/㎖이 되도록 배양액에 희석하여 세포 주에 처리하였고, 처리 후 24시간 동안 배양하여 MTT 분석을 시행하였다. 또한, 상기 제조예 2의 시료 7의 균체 추출물 각각의 농도에 따른 NO 생성량 측정은 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과, 하기 표 8에 개시된 바와 같이 모든 시료 처리농도에서 세포독성은 나타나지 않았고, 0.01㎍/㎖ 농도에서도 약 18.4%의 NO 생성 저해율을 나타냈다.
| 처리 고형분 농도(㎍/㎖) | 세포독성 (%) |
NO 생성량 (%) |
NO 생성억제율 (%) | |
| 무첨가 | - | 100 ± 10 | 37.8 ± 3.5 | - |
| LPS 첨가 | - | 80 ± 2 | 100.0 ± 0.8 | - |
| 제조예 2-시료 7 오레오바시디움 풀루란스 KCCM11373P 에틸아세테이트 추출물(표 2) |
0.01 | 86 ± 1 | 81.6 ± 5.1 | 18.4 ± 5.1 |
| 0.05 | 80 ± 4 | 44.4 ± 4.0 | 55.6 ± 4.0 | |
| 0.5 | 98 ± 2 | 46.2 ± 4.6 | 53.8 ± 4.6 | |
| 5 | 90 ± 7 | 54.4 ± 3.9 | 45.6 ± 3.9 |
실시예
4.
피부장벽손상
후 회복력 측정
실제 사람 피부에서도 본 발명의 흑효모 균체 추출물이 피부장벽손상 후 지질장벽회복을 강화시키는지 확인하였다.
피험자로는 건강이 양호하고 어떠한 피부과적 장애가 없는 정상적인 피부의 지원자 20명을 선정하였다. 시험은 시험 부위 세정 후 30분 동안 피부 안정을 취한 다음 Tewameter TM300(Courage+Khazaka electronic GmbH, Germany)을 이용하여 시험 부위의 경피수분손실량(TEWL)을 측정하였다. 측정 후 SLS(Sodium Lauryl Sulfate) 1%(w/v)를 함침한 챔버(Chamber)를 시험 부위에 24시간 동안 부착하였다. 24시간 후, 시험 부위에 부착된 챔버를 제거한 후 Tewameter를 이용하여 시험 부위 경피수분손실량(TEWL)을 측정하였다. 측정을 끝낸 피험자들은 제조예 5의 로션을 하루에 2회씩 피부에 도포하여 사용하였다. 시험시작 1주 및 2주 후 로션을 사용한 피험자를 대상으로 경피수분손실량(TEWL) 측정을 하여 피부장벽강화 효과를 평가하였다.
통계분석은 제형예 1 사용 부위와 비교예 1 사용 부위의 차이 비교를 위해 독립검정(Independent t-test)법으로 분석하였다. 모든 통계 결과는 생물학적 통계분석에서 가장 많이 사용하는 유의차 5%( p <0.05)일 때 통계적 유의성이 있다고 간주하였으며, 통계분석은 SPSS 18.0 software를 사용하였다.
경피수분손실량(TEWL) 개선율의 계산식은 하기 식 1과 같다.
[식 1]
TEWL 개선율(%)=[(0주 손상 후 TEWL 측정결과-로션 도포 1주 또는 2주 후 TEWL 측정결과)/(0주 손상 후 TEWL 측정결과-0일 손상 전 TEWL 측정결과)]×100
그 결과, 하기 표 9에 개시된 바와 같이 경피수분손실량(TEWL) 개선율은 제품 사용 1주 후에 흑효모 균체 추출물 함유 로션(제형예 1) 사용 부위에서 81.27%, 흑효모 균체 추출물 미포함 로션(비교예 1) 사용 부위에서 75.91%로 나타났고, 2주 후에는 89.46% 및 80.92%로 나타났다. 비교예 1에 비해 제형예 1을 사용하였을 때 경피수분손실량 개선율은 인체 피부 첩포 임상시험에서 인정되는 통계적 유의 수준(p<0.05)으로, 이를 통해 본 발명의 흑효모 균체 추출물은 손상된 피부장벽의 회복 효능이 탁월하다는 것을 확인하였다.
| 경피수분손실량 개선율 | ||||
| 시료 | 1주 후 | 2주 후 | p<0.05 | |
| 제조예 5 | 제형예 1 | 81.27% | 89.46% | |
| 비교예 1 | 75.91% | 80.92% | ||
Claims (7)
- 기탁번호가 KCCM11373P인 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 균체 에틸아세테이트 또는 헥산 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 화장료 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 오레오바시디움 풀루란스 균체는 포도당, 펩톤, 효모 추출물(Yeast extract) 및 정제수를 혼합한 배지를 이용하여 32~38℃에서 24~72시간 동안 배양한 후 여과하여 분리한 균체를 동결건조한 것을 특징으로 하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 오레오바시디움 풀루란스 균체 에틸아세테이트 또는 헥산 추출물은 아쿠아포린-3의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 오레오바시디움 풀루란스 균체 에틸아세테이트 또는 헥산 추출물은 NO(Nitric Oxide)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 화장료 조성물.
- 기탁번호가 KCCM11373P인 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 균체 에틸아세테이트 또는 헥산 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습, 항염 및 피부장벽강화용 건강기능식품 조성물.
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-
2018
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