KR101783308B1 - 감마-사이클로덱스트린을 함유한 생체주입형 조직접착성 하이드로젤 및 이의 생의학적 용도 - Google Patents

감마-사이클로덱스트린을 함유한 생체주입형 조직접착성 하이드로젤 및 이의 생의학적 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤을 피부 접착제로 이용할 경우, γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤은 α- 및 β-사이클로덱스트린보다 더 큰 소수성 공동을 가짐으로써 호스트-게스트 상호작용보다 더 강력한 상호작용이 일어나며, 또한 수소결합을 통해 젤라틴 접착제의 응집력 및 접착성 모두를 향상시킬 수 있으며, 또한, 우수한 세포 생존율을 갖는 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤을 이용하여 피부 절개를 접착함으로써 조직의 재생을 효과적으로 촉진할 수 있다.

Description

감마-사이클로덱스트린을 함유한 생체주입형 조직접착성 하이드로젤 및 이의 생의학적 용도{Injectable tissue adhesive hydrogels including gamma cyclodextrins and biomedical use thereof}
본 발명은 빠른 경화시간과 강한 조직접착력을 갖는 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체주입형 조직접착성 하이드로젤 및 이의 생의학적 용도에 관한 것이다.
분자의 물리적 상호작용을 기반으로 하는 초분자 화학 (예를 들어: 수소 결합, 호스트-게스트 상호작용, 금속 배위, 반데르발스 힘, 및 방향족 쌓임)은 여러 가지 장점을 바탕으로 다양한 생체재료 연구 분야에 이용되고 있다. 상기 초분자의 구조체는 복잡한 공정 단계를 필요로 하지 않는 비공유 결합에 의해 간편하게 합성되거나 제조될 수 있다. 또한, 상기 초분자 화합물은 비공유 결합을 포함하고 있기 때문에 외부의 물리적/화학적 자극에 의해 가역적인 성질을 가진다. 따라서 상기 초분자 화합물은 사용 후 쉽게 회수할 수 있으며, 외부의 기계적인 손상에서 자가 치유를 할 수 있는 장점을 가지고 있다.
다양한 초분자 중에서, 사이클로덱스트린 (cyclodextrins; CDs)은 생물학적 적용을 위해 많은 주목을 받고 있다. 사이클로덱스트린은 α- (1-4) - 글리코시드 결합에 의해 연결된 6개, 7개, 및 8개의 글루코피라노스 유닛으로 구성된 링 형상(torus)의 고리 올리고머로서, 각각 α-CD, β-CD, 및 γ-CD로 명명한다.
상기 사이클로덱스트린은 외부의 친수성 표면과 내부의 소수성 부분으로 이루어지며, 상기 외부의 친수성 표면은 수소 결합을 통해 주위 분자들과 보다 용이하게 상호작용을 할 수 있게 하며, 상기 내부의 소수성 부분은 다양한 소수성 게스트와 물리적 결합을 할 수 있으며, 수용성 조건 및 심지어 고체 상태에서도 호스트-게스트 상호 작용에 의해 물리적 결합체를 형성할 수 있다.
약학 분야에서, 상기 사이클로덱스트린은 소수성 약물과 호스트-게스트 복합체를 형성함으로써 약물 용해도 개선 및 방출거동을 조절하여 약물 생체이용율을 향상시킬 수 있다. 생의학 분야에서는 사이클로덱스트린계 고분자의 나노 스케일 수준에서의 조립 또는 응집을 통해 다양한 형상으로 마이셀, 층상 중공 마이크로캡슐 (layer-by-layer hollow microcapsules) 또는 고분자 하이드로젤을 제조하여 왔다.
하이드로젤 기반 조직 접착제 (tissue adhesives)는 봉합술 (suturing)에 비해 시간이 적게 걸리며, 고도의 기술을 필요로 하지 않을 뿐 아니라 보다 적은 외상성 봉합, 보다 적은 통증과, 봉합사를 제거할 필요가 없으며, 국부적으로 약물 방출의 이점을 가지고 있기 때문에 지혈 (hemostasis), 상처 봉합 및 치료를 포함한 다양한 임상 응용에서 우수한 재료로 알려져 있으며, 경막 (dura mater), 폐 (lung), 간 (liver), 비장 (spleen), 신장 (kidney)과 같은 무른 조직에 적용할 때, 하이드로젤 조직 접착제는 특히 중요한 역할을 수행한다.
다만, 이러한 많은 장점들에도 불구하고, 강하고 신속한 접착력, 낮은 면역원성과 생분해성과 같은 임상 요구조건을 충족하지 못하기 때문에 조직 접착제로서의 적용에는 여전히 제한적이었으며, 이러한 한계점을 극복하기 위하여 생체 적합성이 우수하며 가교반응에 의한 우수한 기계적 강도 및 신속한 젤화를 통해 강력한 접착력을 갖는 사이클로덱스트린을 이용한 생체주입형 조직접착성 하이드로젤을 개발할 필요성이 크게 부각되고 있다.
다만, α-사이클로덱스트린을 함유한 생체주입형 조직접착성 하이드로젤은 α-사이클로덱스트린의 작은 소수성 공동으로 인하여 접착력이 상대적으로 떨어지며, 또한 β-사이클로덱스트린을 함유한 생체주입형 조직접착성 하이드로젤은 β-사이클로덱스트린의 낮은 수용성으로 인하여 접착력이 상대적으로 떨어지는 바, 보다 접착성을 향상시킬 수 있으며, 피부재생 촉진력이 우수한 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체주입형 조직접착성 하이드로젤에 대한 연구 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허 제2014-0091259호
본 발명의 목적은, 빠른 경화시간과 강한조직접착력을 갖는 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤을 이용하여 피부 절개를 접착함으로써 조직의 재생을 효과적으로 촉진하는 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 고분자 주사슬에 페놀 또는 이의 유도체를 포함하고, 아미노기 또는 카르복실기 중에서 선택된 하나 이상의 관능기를 지닌 하나 이상의 동종 또는 이종 고분자와, 티올기로 치환되거나 치환되지 않은 하나 이상의γ-사이클로덱스트린을 포함하는 혼합물에 호스래디시 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase) 및 과산화수소를 첨가시켜 in situ 가교된 것을 특징으로 하는, γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤을 포함하는, 조직 접착 및 지혈용 소재를 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤을 포함하는, 조직재생 및 충진용 임플란트 소재를 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤을 포함하는, 생리활성 물질 또는 약물 전달체용 담체를 제공한다.
본 발명에 따른 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤은 α-사이클로덱스트린 및 β-사이클로덱스트린보다 더 큰 소수성 공동을 가짐으로써 보다 강한 호스트-게스트 상호작용을 할 수 있으며, 또한 수소결합을 통해 젤라틴 접착제의 응집력 및 접착력을 모두 향상시킬 수 있을 뿐 아니라, 신속하게 경화되며 기존의 섬유소 접착제(fibrin glues)보다 20배 이상 조직 접착력이 우수하므로, 피부재생 촉진용 조직 접착제로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, 및 γ-사이클로덱스트린의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 사이클로덱스트린을 함유한 조직접착성 하이드로젤과 생체조직 간의 페놀-페놀 가교결합(A), 수소결합(B), 및 호스트-게스트 상호작용(C)에 대해 나타낸 도면이다.
도 3은 젤라틴-티라민/γ-사이클로덱스트린 접착제의 응집력 및 접착력을 이루는 세부요소에 대해 나타낸 도면이다.
도 4는 실험예 1에 따른 하이드로젤 제조 모식도에 대해 나타낸 도면이다.
도 5는 실험예 1에 따른 하이드로젤 젤화시간에 대해 나타낸 도면이다.
도 6은 실험예 2에 따른 기계적 강도에 대해 나타낸 도면이다.
도 7은 실험예 3에 따른 접착력 평가방법에 대해 나타낸 도면이다.
도 8은 실험예 3에 따른 접착력 평가방법에 대해 나타낸 도면이다.
도 9은 실험예 3에 따른 조직 조건 하에서 접착강도 결과에 대해 나타낸 도면이다.
도 10은 실험예 3에 따른 금 기판 조건 하에서 접착강도 결과에 대해 나타낸 도면이다.
도 11은 실험예 4에 따른 생분해도 평가에 대해 나타낸 도면이다.
도 12은 실험예 5에 따른 세포독성 평가에 대해 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
감마-사이클로덱스트린 (γ-cyclodextrin; 이하'γ-CD')은 알파-사이클로덱스트린 (α-cyclodextrin; 이하 'α-CD')와 비교하여, 더 큰 소수성 공동을 포함하여 2 개의 게스트를 포함할 수 있어 보다 강력한 호스트-게스트 상호작용을 수반할 수 있고 젤라틴/γ-CD는 조직과의 더 높은 친화도를 가지기 때문에 젤라틴/α-CD 보다 높은 접착력을 제공할 수 있으며, 또한 베타-사이클로덱스트린 (β-cyclodextrin; 이하'β-CD')과 비교하여, β-CD보다 우수한 수용성을 지님으로써 β-CD를 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤보다 접착력을 보다 향상시킬 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은, 고분자 주사슬에 페놀 또는 이의 유도체를 포함하고, 아미노기 또는 카르복실기 중에서 선택된 하나 이상의 관능기를 지닌 하나 이상의 동종 또는 이종 고분자와, 티올기로 치환되거나 치환되지 않은 하나 이상의γ-사이클로덱스트린을 포함하는 혼합물에 호스래디시 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase) 및 과산화수소를 첨가시켜 in situ 가교된 것을 특징으로 하는, γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤을 제공한다.
도 3을 참조하면, 상기 하이드로젤은 고분자 주사슬의 곁가지에 포함된 페놀 또는 페놀 유도체 간의 결합에 의해 기본적인 하이드로젤을 형성하며, 고분자 주사슬이 갖고 있는 아미노기 또는 카르복실기 중에서 선택된 하나 이상의 관능기와 18 내지 24개의 하이드록실기를 포함하는 γ-사이클로덱스트린 간의 수소결합, 및 고분자와 γ-사이클로덱스트린 간의 호스트-게스트 상호작용에 의해 추가적으로 결합함으로써 보다 기계적 강도가 향상된 하이드로젤을 형성할 수 있다.
그리고, 상기 하이드로젤은 γ-사이클로덱스트린과 조직의 페놀 유도체와의 호스트-게스트 상호작용으로 조직접착력을 향상시킬 수 있으며, 극성기를 갖는 조직과 γ-사이클로덱스트린의 수소결합을 통해 조직 접착력을 향상시킬 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 1 및 도 2를 참조하면, α-사이클로덱스트린, 및 β-사이클로덱스트린의 소수성 공동보다 γ-사이클로덱스트린의 소수성 공동의 크기가 큼을 알 수 있으며, 이로 인하여 γ-사이클로덱스트린의 호스트-게스트 상호작용이 1 : 2인 반면, α-사이클로덱스트린, 및 β-사이클로덱스트린의 호스트-게스트 상호작용이 1 : 1이므로, α-사이클로덱스트린, 및 β-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤에 비해 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤이 응집력 및 접착력이 우수함을 알 수 있다.
또한, 상기 고분자 주사슬은 젤라틴, 키토산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 알지네이트, 콜라겐, 알부민, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 비트로넥틴, 히알루론산, 피브리노겐 및 다지-고분자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상 일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 다지-고분자는 3지(3-arm)-폴리에틸렌글리콜(3armPEG), 4지(4-arm)-폴리에틸렌글리콜(4armPEG), 6지(6-arm)-폴리에틸렌글리콜(6armPEG) 또는 8지(8-arm)-폴리에틸렌글리콜(8armPEG)에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 다지-폴리에틸렌글리콜; 및 테트로닉 시리즈(4arm-PPO-PEO)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 하이드로젤은 호스래디시 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase) 및 과산화수소의 농도를 조절하여 젤화 시간, 분해 시간, 기계적 강도, 또는 함수율에서 선택된 물리화학적 성질을 조절할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 하이드로젤은 이중 주입식 주사기 키트(dual syringe kit)를 구성하여 in situ 가교 형성할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 이중 주입식 주사기 키트(dual syringe kit)에 분사 노즐을 결합하여 분사(spray) 가능하게 할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 이중 주입식 주사기 키트(dual syringe kit)와 테프론 성형(teflon mold)을 이용하여 하이드로젤 쉬트 또는 디스크를 제조할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤을 포함하는, 조직 접착 및 지혈용 소재를 제공한다.
또한, 상기 지혈용 소재는 혈관 외과 영역을 포함한 뇌신경 외과수술; 뼈의 접착을 포함한 정형외과 수술; 열상 환자의 지혈; 대퇴동맥의 봉합; 백내장 절개 봉합, 연골 및 관절연골 치유; 피부 접합; 장기/분비선 절개면 지혈; 위장관 분합; 및 힘줄 및 인대 치유로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 적용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤을 포함하는, 조직재생 및 충진용 임플란트 소재를 제공한다.
또한, 상기 충진용 임플란트 소재는 연골 재생(cartilage regeneration), 골 재생(bone regeneration), 치주골 재생, 피부 재생(skin regeneration), 심근 재생(cardiac tissue regeneration), 인공 수정체(artificial intraocular lens), 척수 신경 재생(spinal cord regeneration), 뇌신경 재생(cranial regeneration), 성대 재생 및 충진제(vocal regeneration and augmentation), 유착 방지막 (adhesion barrier), 요실금 치료제(urinary incontinence treatment), 주름 제거(wrinkles removal)용 충진제, 화상 치료제(wound dressing), 조직 충진제(tissue augmentation) 및 척추 추간판 치료제(intervertebral disc treatment)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 적용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤을 포함하는, 생리활성 물질 또는 약물 전달체용 담체를 제공한다.
또한, 상기 생리활성물질 또는 약물은 펩타이드 또는 단백질 의약품, 항균제, 항암제 및 항염증제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 전환 성장인자(transforming growth factor; TGF), 골형성 성장인자(bone morphogenetic protein; BMP), 인간성장호르몬(hGH), 돼지성장호르몬(pGH), 백혈구성장인자(G-CSF), 적혈구성장인자(EPO), 대식세포성장인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 상피세포 성장인자(EGF), 혈소판유도성장인자(PDGF), 인터페론-α,β,γ, 인터루킨-2(IL-2), 칼시토닌, 신경성장인자(NGF), 성장호르몬 방출인자, 엔지오텐신, 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 작동약(LHRH agonist), 인슐린, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(TRH), 엔지오스태틴, 엔도스태틴, 소마토스타틴, 글루카곤, 엔도르핀, 바시트라신, 머게인, 콜리스틴, 바시트라신, 단일 항체, 백신류 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 항균제는 미노싸이클린, 테트라싸이클린, 오플록사신, 포스포마이신, 머게인, 프로플록사신, 암피실린, 페니실린, 독시싸이클린, 티에나마이신, 세팔로스포린, 노르카디신, 겐타마이신, 네오마이신, 가나마이신, 파로모마이신, 미크로 노마이신, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 세포탁신, 세파클러, 에리스로마이신, 싸이프로플록사신, 레보플록사신, 엔옥사신, 반코마이신, 이미페넴, 후시딕산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 항암제는 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 항염증제는 아세토아민펜, 아스피린, 이부프로펜, 디크로페낙, 인도메타신, 피록시캄, 페노프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 수프로펜, 록소프로펜, 시녹시캄, 테녹시캄 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 재료 준비
젤라틴 (type A from porcine skin, >300 bloom), 3-(4-히드록시페닐)프로피온산 (3-(4-hydroxyphenyl)propionic acid; HPA), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide; EDC), N-히드록시석신이미드 (N-hydroxysuccinimide; NHS), 페록시다아제-호스래디시 (peroxidase from horseradish; HRP, type VI, 250-330 units/mg solid), 과산화수소 (hydrogen peroxide; H2O2) 및 콜라게나아제 타입 II (collagenase type II)는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, 디메틸포름아마이드 (Dimethylformamide; DMF)는 Junsei (Tokyo, Japan)로부터 구입하였다.
알파-사이클로덱스트린 (Alpha-cyclodextrin; α-CD, Mw = 972.85 g/mol), 베타-사이클로덱스트린 (beta-cyclodextrin; β-CD, Mw = 1134.98 g/mol), 및 감마-사이클로덱스트린 (gamma-cyclodextrin; γ-CD, Mw = 1297.12 g/mol)은 T.C.I (Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd, Tokyo, Japan)로부터 구입하였다.
두 가지 조성 (Tissucol Duo 500)을 갖는 피브린 젤 (Fibrin gel)은 Baxter AG(Volkitswil, Switzerland))로부터 구입하였다.
DMEM 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium ; DMEM), 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin; P/S) 및 트립신/EDTA (trypsin/EDTA)는 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였으며, 소태아혈청 (Fetal bovine serum; FBS) 및 DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline; DPBS)용액은 Wisent (Saint-Bruno, QC, Canada)로부터 구입하였다. 또한 Live/Dead Viability/Cytotoxicity Assay Kit는 Invitrogen (USA)으로부터 구입하였으며, EZ-Cytox enhanced cell viability assay kit (WST-1 assay reagent)는 ITSBIO (Seoul, South Korea)로부터 구입하였다. 다른 화학물질 및 용매들은 추가적인 정제 없이 사용하였다.
<실시예 2> 3-(4-히드록시페닐)프로피온산-컨쥬게이티드 젤라틴 (GH) 고분자의 합성
GH 고분자는 종래 방법에 따라 EDC 및 NHS의 존재 하에 젤라틴과 3-(4-히드록시페닐)프로피온산의 결합에 의해 합성되었다.
물 15 mL의 조용매 (co-solvent)에 용해된 EDC 3.83 g (20 mmol) : DMF (3:2)를 조용매 125 mL 중 3.32 g HPA (20 mmol)가 포함된 용액에 투입하였다.
1시간 활성화 후에, 상기 용액에 물 15 mL에 용해된 3.45 g NHS (30 mmol) : DMF (3:2) 조용매를 1시간 동안 교반 하에 투입하였다.
상기 활성화된 HPA 용액을 젤라틴 용액 (5 g in 150 mL DI water, 40℃)으로 투입하였다.
상기 활성화된 HPA 용액과 젤라틴 용액의 반응을 24시간 동안 수행하였으며, 젤라틴이 HPA 용액에 균질하게 용해되도록 40℃의 온도를 유지하였다.
상기 반응된 혼합물을 40℃에서 3,500 kDa의 MWCO를 갖는 투석막 (dialysis tube)으로부터 한외여과 하였고, 상기 배지 (media)를 3일 동안 하루에 3번씩 교체하였다. 상기 GH 고분자를 냉동 건조 후에 78.8%의 수율로 얻을 수 있었다.
<실시예 3> 금 표면의 개질
금 기판 (Gold substrates) (8 × 10 mm2)은 Ti-primed Si 웨이퍼 상에 금의 저항성 증착 공정 (resistive evaporation proccess)에 의해 제작하였다.
상기 금 기판의 표면을 15분 동안 피라냐 용액(H2SO4:H2O2=4:1)에 침지시킨 후, 피라냐 용액에 상기 침지된 금표면을 탈이온수로 두 차례 세척하였고, 과도한 피라냐 시약을 제거하기 위해 에탄올로 세척하였다. 세척된 금 기판을 12시간 동안 메르캅토에탄올 10 mM 및 메르캅토언데칸산 1 mM이 포함된 에탄올에 담궜다. 상기 개질된 표면은 에탄올로 3회 세척하였고, 이를 Au-C11 기질로 명명하였다.
상기 Au-C11 기질을 15분 동안 수성 1 mM EDC 용액에 침지시킨 후, 수성 1 mM NHS 용액을 투입하였고, 이를 15분 동안 배양하여 혼합물을 합성하였다. DMSO에 1 mM의 4-아미노페놀이 포함된 용액을 상기 혼합물에 보충하였고, 1시간 동안 반응시켰다. 상기 2단계에 의해 합성된 개질된 기질은 Au-C11-Phenol 기질로 명명하였고, 에탄올로 3회 세정하였다.
<실험예 1> 하이드로젤 형성 및 젤화 시간
10 중량%의 GH고분자를 40℃에서 용해시키고, α, β, γ-CD가 담지된 GH/CD의 하이드로젤을 제조하기 위해, 10 중량%의 농도를 갖는 α, β, γ-CD 용액을 각각 준비하였다. 상기 CD 용액에 10 중량%의 GH를 투입하여 다음과 같은 1/1 w/w 비율인 GH/α-CD 5/5 중량% (GH5/α-CD5), GH/β-CD 5/5 중량% (GH5/β-CD5), GH/γ-CD 5/5 중량% (GH5/γ-CD5)로 혼합물을 준비하였다. 보다 상세한 조직 접착성 하이드로젤의 제조조건은 표 1에 나타내었다.
하이드로젤 조성
GH5 GH 5 wt% + H2O 95 wt%
GH5/α-CD5 GH 5 wt% + α-CD 5 wt% + H2O 90 wt%
GH5/β-CD5 GH 5 wt% + β-CD 5 wt% + H2O 90 wt%
GH5/γ-CD5 GH 5 wt% + γ-CD 5 wt% + H2O 90 wt%
상기 모든 혼합물은 30분 동안 최대 40℃까지 가열하였고, 젤라틴을 완벽히 녹이고, 시스템 균질화를 보장하기 위해 교반(vortexed)하였다.
실험과정 동안, 낮은 온도 (23 ℃ 이하)에서 젤라틴의 물리적 겔 형성을 막기 위해 상기 고분자 용액의 온도는 약 40℃로 유지하였으며, 젤라틴 접착제 및 젤라틴/CD 접착제의 젤화시간은 바이알 틸팅 기법(Vial tilting method)에 의해 결정되었다.
고분자 용액 (90 ㎕) 및 HRP 용액 (10 ㎕)을 마이크로튜브에 투입하였고 (용액 A), 다른 마이크로튜브에는 고분자 용액 (90 ㎕) 및 H2O2 (10 ㎕)을 투입하여(용액 B) 상기 용액 A 및 용액 B를 혼합하여 하이드로젤을 형성하기 위해 완만하게 교반 (vortexed)하였으며, 흐름이 관찰되지 않을 때 까지, 실온에서 완만하게 교반 (shaken)하였다.
HRP 농도의 함수로서 젤라틴 접착제 및 젤라틴/CD 접착제의 젤화시간을 조사하기 위해 HRP 농도를 0.003 mg/mL 부터 0.01 mg/mL까지 변화시켰으며, 상기 모든 샘플들은 각각의 실험 상태를 고려하여 3번씩 실험하였다.
실험결과, HRP의 농도를 조절하여 하이드로젤 젤화시간을 10 ~ 210초까지 조절이 가능하였으며, HRP의 농도가 증가함에 따라, 젤 형성시간이 감소하였다. 이는 HRP 농도 증가로 인해 H2O2의 분해가 촉진되어 라디칼의 생성속도가 빨라지고, 결국 생성된 라디칼에 의해 젤이 형성되기 때문에 하이드로젤 형성시간이 짧아지게 된다.
또한, CD를 담지함에 따라 대조군인 GH5에 비해 상대적으로 젤화시간이 증가하였다. 이는 CD가 하이드로젤 가교반응시 고분자에 있는 페놀 유도체 혹은 고분자 주사슬에 있는 아민기, 카르복실기 간의 상호작용으로 젤화형성에 영향을 주는 것으로 설명될 수 있다.
도 4는 이중 주입식 주사기 키트를 이용하여 주입(injectable) 및 분사(sprayable)형 하이드로젤 제조의 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 HRP 농도 변화에 따른 GH5와 GH5/α-CD5, GH5/β-CD5, GH5/γ-CD5 하이드로젤의 젤화시간 비교 평가를 나타낸다.
<실험예 2> 기계적 강도 (Elastic modulus) 평가
0.03%의 H2O2 및 0.005 mg/mL의 HRP 조건 하에서, 상기 젤화시간 부분에 설명한 바와 같은 방법으로 GH, GH/α-CD, GH/β-CD, GH/γ-CD 조성의 하이드로젤을 제조하였다. 레오미터(rheometer)를 사용하여 기계적 강도를 측정하였으며, 실험조건은 25 mm 직경의 원판을 사용하여, 37℃에서 10분간 측정을 하였다.
대조군인 GH5 하이드로젤 접착제의 경우, 12200 Pa의 기계적 강도를 나타냈으며, 5 중량% 농도의 CD를 추가적으로 담지할 경우 GH5에 비해 상대적으로 기계적 강도가 증가하였다. 실험결과 GH5/α-CD5, GH5/β-CD5, GH5/γ-CD5 하이드로젤은 각각 15800, 13100, 17580 Pa의 기계적 강도를 가졌다. 이는 하이드로젤 내에 담지된 CD가 GH 고분자 네트워크 간의 수소결합 및 호스트-게스트 상호작용을 유도하여 추가적인 가교반응으로 설명이 가능하다.
특히, α-CD, β-CD 보다 우수한 수용성 및 호스트-게스트 상호작용을 가질 수 있는 γ-CD는 동일한 5 중량% 조건 하에서 가장 높은 기계적 강도를 나타내었다.
도 6은 GH5와 GH5/α-CD5, GH5/β-CD5, GH5/γ-CD5 하이드로젤의 기계적 강도를 나타낸다.
<실험예 3> 접착력 평가
ASTM F2255-03 ("Test Method for Strength Properties of Tissue Adhesives in Lap-Shear by Tension Loading") 평가방법을 기준으로, 유압식 만능 재료 시험기(Universal testing machine, UTM)을 이용하여 돼지 피부에서 하이드로젤의 조직 접착제 강도(tissue adhesive strength)를 측정하였다. 대조군으로는 피브린 글루(fibrin glue)과 CD를 담지하지 않은 GH 하이드로젤을 사용하였다.
돼지 피부(porcine skin)의 치수는 직경 2.5 cm이었으며, 에틸 시아노아크릴레이트 접착제 (ethyl cyanoacrylate glue)에 의해 직사각형 플라스틱 기판 상에 돼지 피부의 모든 부분을 부착하였다.
실험 전에, 탈이온수에 아이소프로판올 70%를 사용하여 세포제거 (decellularization)를 위해, 피부 표면을 세척하였고, 상기 세척과정이 끝난 다음 15분 후에, 100 ㎕ 접착제를 돼지 피부의 영역에 도포 한 후, 2 개의 표면을 함께 랩핑하였다. 상기 접착부는 100 g의 힘으로 습윤 환경에서 실온에서 60분 동안 유지하였다. 이어서, 상기 시료를 10 mm/min의 크로스헤드 속도(crosshead speed)로 전단 불량으로 로딩하였다. 변위 (displacement)에 대한 최대 강도를 측정하였고, 각 샘플의 접착력을 특성화하기 위해 파단 (최종 접착 강도)시 전단 응력 (shear stress)을 사용하였다. 적어도 5 개의 샘플을 각 측정에 이용하였다.
금 기판을 이용한 젤라틴/CD 접착제의 접착력을 평가하는 경우, 개질된 금 기판을 (8 × 10 mm)을 사용하여 돼지피부 측정과 동일한 방법을 측정을 하였다.
도 7 및 도 8은 돼지피부와 금 기판을 이용하여 하이드로젤의 접착력을 테스트 하는 방법을 나타낸다.
돼지피부를 이용하여 조직접착력을 평가한 결과, 담지한 CD의 농도가 증가함에 따라 향상된 접착강도를 나타내었다. 특히, γ-CD의 경우 α-CD와 β-CD 비교시 가장 높은 접착강도를 보여줬으며, 이는 향상된 하이드로젤의 응집력과 접착력의 의한 영향으로 설명할 수 있다. β-CD의 경우 제한된 수용성으로 5 중량% 농도의 경우 접착강도가 오히려 감소하는 결과를 나타내었다.
CD 중 가장 우수한 접착강도를 나타낸 GH/γ-CD의 경우, 고분자 중량% 및 담지한 γ-CD의 농도를 증가시킴에 따라, 24250 ~ 95020 Pa의 접착강도를 나타내며, 대조군인 피브린 글루 (4560 Pa)와 비교하여 최대 20 배 정도의 높은 접착강도를 보였다.
또한, 조직과 조직 접착성 하이드로젤 간의 상호작용을 이해하기 위해 페놀기가 도입된 금 기판을 사용하여 접착강도를 평가한 결과, 돼지피부를 이용한 접착강도 결과와 유사하게 경향성을 보였다. GH/γ-CD는 GH/α-CD에 비해 상대적으로 향상된 접착력을 보여줬으며, 이는 동일한 중량% 조건에서 γ-CD가 α-CD에 비해 금 기판에 유도된 페놀분자와 보다 강한 호스트-게스트 상호작용을 갖기 때문이다.
도 9는 돼지피부 조건 하에서 (a) GH5 하이드로젤을 대조군으로 GH5/α-CD, GH5/β-CD, GH5/γ-CD의 하이드로젤 내에 담지된 각 CD 농도별 접착강도와 (b) 피브린 글루를 대조군으로 GH10 내에 담지된 γ-CD 농도별 하이드로젤의 접착강도를 나타낸 것이다.
도 10은 금 기판 조건 하에서 GH5/α-CD와 GH5/γ-CD의 하이드로젤 내에 담지된 각 CD 농도별 접착강도를 나타낸 것이다.
<실험예 4> 생분해도 평가
젤라틴 접착제의 생분해성을 평가하기 위해, 젤화시간 시험과 동일한 제조방법으로 마이크로 튜브 내에 300㎕의 하이드로젤 접착제를 제조하였다.
젤라틴 접착제의 분해 속도에 대한 CD 효과를 평가하기 위해, 0.3 % 농도의 H2O2 및 0.005 mg/mL 농도의 HRP를 이용하여 GH5와 GH5/α-CD5, GH5/β-CD5, GH5/γ-CD5 하이드로젤을 합성하였다.
실온에서 상기 하이드로젤 샘플의 안정을 위해 30분 동안 방치한 후, 각 접착제 샘플의 무게 (Wi)를 기록하였으며, 이후 콜라게나아제 (0.005 mg/mL) 효소를 처리하였다. 특정시간 간격으로 완전히 상청액 (supernatant)을 제거한 후에 상기 하이드로젤 무게를 계량하였고, 그 후 1 mL 신선한 배지를 추가하였다. 생분해성 정도는 아래와 같은 식을 이용하여 계산하였다.
[수학식 1]
Figure 112016031676712-pat00001
상기 Wd 및 Wi는 각각 열화된 하이드로젤 및 원래의 하이드로젤의 무게를 나타낸다.
실험결과, 0.005 mg/mL 농도의 콜라게나아제 효소 처리에 따라 모든 하이드로젤 샘플군은 시간에 따라 분해가 되었으며, CD가 담지된 하이드로젤 샘플 군은 상대적으로 지연되는 분해거동을 나타내었다. 특히, GH5/γ-CD5는 GH5/α-CD5, GH5/β-CD5와 비교하여 가장 느린 거동속도를 보여줬으며, 이는 향상된 기계적 강도, 즉 높은 가교도에 의한 영향으로 해석할 수 있다.
도 11은 콜라게나아제 처리에 의한 GH5와 GH5/α-CD5, GH5/β-CD5, GH5/γ-CD5 하이드로젤의 시간에 따른 분해거동을 나타낸 것이다.
<실험예 5> 조직접착성 하이드로젤의 세포독성 평가
체외 세포 적합성 평가를 위해, GH5와 GH5/α-CD5, GH5/β-CD5, GH5/γ-CD5 하이드로젤(300㎕)을 24-well 배양접시에 형성한 후, 하이드로젤 표면에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 세포독성 평가를 수행하였다. 실험에 사용된 세포의 농도는 1×104cells/wells 이며, 37℃, 5 % CO2 분위기 하에서 3일간 배양 후 Live/Dead Viability/Cytotoxicity Assay Kit (Invitrogen, USA)를 이용하여 세포 생존능 (cell viability)을 측정하였다. Live/Dead 분석은 세포 독성으로 사멸된 세포는 붉은 색으로 살아있는 세포는 초록색으로 나타내어 세포 독성 유무를 평가하는 방법이다.
실험결과, 도 12과 같이 상기 제조된 모든 하이드로젤 샘플 군에서 사멸된 세포가 관찰되지 않는 것을 관찰함으로서, 우수한 체외 세포 적합성 결과를 나타내었다.
도 12는 GH5와 GH5/α-CD5, GH5/β-CD5, GH5/γ-CD5 하이드로젤 세포독성 평가결과를 나타낸다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims (20)

  1. 고분자 주사슬에 페놀 또는 4-아미노페놀을 포함하고, 아미노기 또는 카르복실기 중에서 선택된 하나 이상의 관능기를 지닌 하나 이상의 동종 또는 이종 고분자와, 티올기로 치환되거나 치환되지 않은 하나 이상의γ-사이클로덱스트린을 포함하는 혼합물에 호스래디시 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase) 및 과산화수소를 첨가시켜 in situ 가교된 것을 특징으로 하는, γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로젤은 고분자 주사슬의 곁가지에 포함된 페놀 또는 4-아미노페놀 간의 페놀-페놀 결합에 의해 연결되어 in situ 가교되는 것을 특징으로 하는, γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로젤은 고분자 주사슬이 갖고 있는 아미노기 또는 카르복실기 중에서 선택된 하나 이상의 관능기와 γ-사이클로덱스트린의 하이드록실기 간의 수소결합에 의해 연결되어 in situ 가교되는 것을 특징으로 하는, γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로젤은 동종 또는 이종 고분자와 γ-사이클로덱스트린 간의 호스트-게스트 상호작용에 의해 결합되는 것을 특징으로 하는, γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 고분자 주사슬은 젤라틴, 키토산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 알지네이트, 콜라겐, 알부민, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 비트로넥틴, 히알루론산, 피브리노겐 및 다지-고분자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며,
    상기 다지-고분자는 3지(3-arm)-폴리에틸렌글리콜(3armPEG), 4지(4-arm)-폴리에틸렌글리콜(4armPEG), 6지(6-arm)-폴리에틸렌글리콜(6armPEG), 8지(8-arm)-폴리에틸렌글리콜(8armPEG), 또는 4지(4-arm)-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드(4arm-PPO-PEO)에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 고분자인 것을 특징으로 하는, γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤.
  6. 삭제
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로젤은 호스래디시 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase) 및 과산화수소의 농도를 조절하여 젤화 시간, 분해 시간, 기계적 강도, 또는 함수율에서 선택된 물리화학적 성질을 조절한 것을 특징으로 하는, γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로젤은 이중 주입식 주사기 키트(dual syringe kit)를 구성하여 in situ 가교 형성한 것을 특징으로 하는, γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 이중 주입식 주사기 키트(dual syringe kit)에 분사 노즐을 결합하여 분사(spray) 가능하게 한 것을 특징으로 하는, γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 이중 주입식 주사기 키트(dual syringe kit)와 테프론 성형(teflon mold)을 이용하여 하이드로젤 쉬트 또는 디스크를 제조한 것을 특징으로 하는, γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤.
  11. 청구항 1 내지 청구항 5 및 청구항 7 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 따른 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤을 포함하는, 조직 접착 및 지혈용 소재.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 지혈용 소재는 혈관 외과 영역을 포함한 뇌신경 외과수술; 뼈의 접착을 포함한 정형외과 수술; 열상 환자의 지혈; 대퇴동맥의 봉합; 백내장 절개 봉합, 연골 및 관절연골 치유; 피부 접합; 장기/분비선 절개면 지혈; 위장관 분합; 및 힘줄 및 인대 치유로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 적용된 것을 특징으로 하는, 조직 접착제 및 지혈제용 소재.
  13. 청구항 1 내지 청구항 5 및 청구항 7 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 따른 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤을 포함하는, 조직재생 및 충진용 임플란트 소재.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 충진용 임플란트 소재는 연골 재생(cartilage regeneration), 골 재생(bone regeneration), 치주골 재생, 피부 재생(skin regeneration), 심근 재생(cardiac tissue regeneration), 인공 수정체(artificial intraocular lens), 척수 신경 재생(spinal cord regeneration), 뇌신경 재생(cranial regeneration), 성대 재생 및 충진제(vocal regeneration and augmentation), 유착 방지막 (adhesion barrier), 요실금 치료제(urinary incontinence treatment), 주름 제거(wrinkles removal)용 충진제, 화상 치료제(wound dressing), 조직 충진제(tissue augmentation) 및 척추 추간판 치료제(intervertebral disc treatment)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 적용된 것을 특징으로 하는 조직재생 및 충진용 임플란트 소재.
  15. 청구항 1 내지 청구항 5 및 청구항 7 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 따른 γ-사이클로덱스트린을 함유한 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤을 포함하는, 생리활성 물질 또는 약물 전달체용 담체.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 생리활성물질 또는 약물은 펩타이드 또는 단백질 의약품, 항균제, 항암제 및 항염증제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는, 생리활성 물질 또는 약물 전달체용 담체.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 전환 성장인자(transforming growth factor; TGF), 골형성 성장인자(bone morphogenetic protein; BMP), 인간성장호르몬(hGH), 돼지성장호르몬(pGH), 백혈구성장인자(G-CSF), 적혈구성장인자(EPO), 대식세포성장인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 상피세포 성장인자(EGF), 혈소판유도성장인자(PDGF), 인터페론-α,β,γ, 인터루킨-2(IL-2), 칼시토닌, 신경성장인자(NGF), 성장호르몬 방출인자, 엔지오텐신, 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 작동약(LHRH agonist), 인슐린, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(TRH), 엔지오스태틴, 엔도스태틴, 소마토스타틴, 글루카곤, 엔도르핀, 바시트라신, 머게인, 콜리스틴, 바시트라신, 단일 항체, 백신류 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생리활성 물질 또는 약물 전달체용 담체.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 항균제는 미노싸이클린, 테트라싸이클린, 오플록사신, 포스포마이신, 머게인, 프로플록사신, 암피실린, 페니실린, 독시싸이클린, 티에나마이신, 세팔로스포린, 노르카디신, 겐타마이신, 네오마이신, 가나마이신, 파로모마이신, 미크로 노마이신, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 세포탁신, 세파클러, 에리스로마이신, 싸이프로플록사신, 레보플록사신, 엔옥사신, 반코마이신, 이미페넴, 후시딕산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생리활성 물질 또는 약물 전달체용 담체.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 항암제는 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생리활성 물질 또는 약물 전달체용 담체.
  20. 청구항 16에 있어서, 상기 항염증제는 아세토아민펜, 아스피린, 이부프로펜, 디크로페낙, 인도메타신, 피록시캄, 페노프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 수프로펜, 록소프로펜, 시녹시캄, 테녹시캄 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생리활성 물질 또는 약물 전달체용 담체.
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