KR102088107B1 - 염증 억제 펩타이드의 물리적/화학적 함유 주사 제형 전달체, 이의 제조 방법 및 응용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 염증 억제 펩타이드를 물리적 또는 화학적인 방법으로 함유하여, 이를 전달할 수 있는 전달체로서의하이드로겔 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 하이드로겔은 천연 생체 물질에 염증 억제 효과를 가진 펩타이드가 물리적 또는 화학적으로 포함된 구조를 이루어, 생체 내에서 불안정한 상기 펩타이드가 안정적이고 높은 생체 적합성을 가지면서 염증 반응의 질환 부위로 전달될 수 있도록 한다. 이에 따라 염증 억제 펩타이드의 낮은 생체 안정성에 따른 낮은 치료 효율을 향상시킬 수 있으며, 및 반복 투여에 따라 나타나는 복용시 부작용을 완화시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물은 주사 제형 등으로 다양한 응용이 가능하여, 류마티스 관절염 또는 퇴행성 관절 질환과 같은 염증성 질환의 치료제 개발로의 응용이 가능하다.

Description

염증 억제 펩타이드의 물리적/화학적 함유 주사 제형 전달체, 이의 제조 방법 및 응용{Inflammatory peptide-loadedinjectable hydrogel by physical or chemical loading, and method of manufacturing and application}

본 발명은 염증 억제 펩타이드를 물리적 또는 화학적인 방법으로 함유하여, 이를 전달할 수 있는 전달체로서의하이드로겔 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

염증성 질환은 전 세계에 걸쳐 이환 및 사망의 주요 원인으로 알려져 있다. 염증성 질환은 여러 기관 및 조직, 예컨대, 혈관, 심장, 뇌, 신경, 관절, 피부, 폐, 눈, 위장관, 신장, 갑상선, 부신, 췌장, 간 및 근육에 침범하여 근증, 백혈구 손상, 암, 알레르기 비염, 자가면역질환(류마티스 관절염, 천식, 루푸스 등) 등의 질환을 일으킨다.

염증성 및 통증성 질환의 치료는 제약업계로부터 큰 관심이 집중되어있다. 최근의 진척에도 불구하고, 염증성 및통증성질환에대한 현행요법은 비-특이적 약물로의 증상 완화와 염증 및 통증 감소, 질환-조절제로의 질환 진행의 저하 및 생활 양식의 변화로의 삶의 질의 개선을 여전히 포함하지만, 이들 모두는 약물에 대한 부작용 및 내성의 문제가 있다. 부작용이 덜 잠재적인 보다 양호한 치료 옵션이 필요하다.

염증성 질환 중 하나인 류마티즘을 예로 들면, 류마티즘이 나타난 관절에서는 면역 이상이나 감염증이 원인이되어활막에 염증성 세포가 침윤하고, 나아가 혈관 신생을 수반하여 활막섬유아세포의 증식이 항진되어 판누스라고 불리는 염증성활막육아조직이 형성된다. 판누스가 형성되면 뼈나 연골의 파괴가 진행되어 관절에 불가역적인 장애가 초래된다. 뼈나 연골이 파괴되는 과정에서는 다량으로 존재하는 콜라겐이나 프로테오글리칸등의 각종 세포외매트릭스가 분해된다. 종래, 관절 류머티즘의 약물 요법은 주로 관절의 동통 및 염증을 경감시키기 위해, 각종 비스테로이드성항염증약, 프레드니졸론등의 스테로이드제나 메소트렉세이트를 비롯한 항류머티즘약이 사용되고 있다(Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 21, 27-42, Bernard Combe, 2007). 변형성 관절 증에서는 동통 및 염증의 제거를 위해 각종비스테로이드성항염증약이나 진통제를 관절부위에 직접 주입하는 방법을 사용하여 왔다. 또한 관절질환의 공통적인 치료 방법으로서 연골파괴를 억제하는 히알루론산을 연골보호제로 사용하고 있다.

약물전달시스템(Drug Delivery System: DDS)이란 기존 의약품의 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 설계한 제형을 말한다. 특히, 관절염의 치료시 소염 진통제를 경구로 투여했을 때 약물이 관절에 작용할 경우는 약효를 나타내지만 그 이외의 부분에서는 부작용을 나타내게 되므로 이러한 부작용을 줄이고 약효를 극대화하도록 제형을 설계하는 것이다. 약물 전달 체계에서 이러한 고려들이 필요한 전형적인 약물들은 만성 치료에 사용되는 것으로서 주사로 일회 투여되는 독성이 심한 약물, 세포 독성을 지닌 불안한 약물, 쉽게 불활성화되는 약물 및 국소적용이 요구되는 약물이다.

일반적인 약물 주입이나 경구용 약물 제제의 경우 약물이 혈액 중에 높은 농도로 존재하여 신체에 독성을 나타내며, 질환이 있는 특정 부위 외 다른 부위에서 부작용을 나타낸다는 문제점이 있어, 이를 보완하고 더욱 효과적인 약물 전달 시스템에 대한 요구가 절실하다.

생체 물질로서, 생체 적합성이 우수하고 생체 내에서 분해되는 생분해성 소재에 대한 연구는 오랜시간 지속되고 있다. 구체적으로, 천연 생분해성 고분자 소재 또는 합성 생분해성 고분자 소재 등에 대한 연구가 집중되고 있다. 보다 구체적으로 천연 생분해성 고분자 소재로는 히알루론산, 카복시메틸셀룰로오스, 알지네이트 등의 폴리사카라이드류; 콜라겐, 젤라틴 등의 폴리펩타이드류; 폴리-L-글루탐산, 폴리-L-라이신 등의 폴리아미노산류 등이 있다. 이때, 폴리사카라이드류는카르복실기를 작용기로 포함하는 것을 특징으로 한다.

펩타이드 의약품의 장기 약효 지속제형에 관한 연구는 최근까지 생체 적합한 생분해성 고분자와의 컨쥬게이션 반응을 통한 제형 개발에 포커스가 맞추어지고 있다. 상기와 같은 펩타이드 의약품의 약효 지속 시간은 제형의 형태 및 컨쥬게이션되는 활성 성분에따라 몇 주까지 연장되기도 한다. 이와 같은 제형을 개발하기 위해서는 제형의 약효 지속 시간의 증대 및 활성 성분에 컨쥬게이션되는 고분자의 생체 적합성 여부도 고려해야 한다.

따라서, 최근에는 생체 적합한 생분해성 폴리 에틸렌 글리콜(poly ethylene glycol, PEG) 또는 히알루론산(hyaluronic acid, HA)과 활성성분을 컨쥬게이션하여 약물 전달 시스템에 응용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

하지만, 활성성분에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 컨쥬게이션하는 반응, 즉 소위말하는페길화(PEGylation) 반응에 사용되는 PEG는 FDA에서 공인한 대표적인 생체용 고분자 재료 중의 하나이지만, 약물 전달체로 활용되는 폴리에틸렌글리콜-리포솜(PEG-Liposome) 접합체를 반복 주사하게되면 체내에서 투여된 약물의 소실이 빨리 일어나는 'accelerated blood clearance(가속된혈중청소율, ABC)' 현상이 일어나는 것으로 보고되고 있다.

따라서, 본 발명자들은 이와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 염증 억제 효과를 가진 펩타이드가 천연 생체물질에 물리적 또는 화학적으로 포함된 하이드로겔을 제조하고자 하였다. 상기 하이드로겔을 펩타이드 전달체로서 사용하는 경우, 주사 제형으로 사용할 수 있으며, 생체 안정성이 낮은 염증억제 펩타이드의 반복 투여에 의한 환자 복용 문제점을 해결할 수 있을 것으로 확인하였다. 또한, 염증 억제 효과를 가지는 펩타이드를 단회 투여하는 것에 비해, 상기 펩타이드를 포함하는 주사제형의 하이드로겔은 염증 억제 효과 및 그 지속 시간 등이 우수한 이점을 가질 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 생체 안정성이 낮은 염증 억제 펩타이드의 반복 투여에 의한 낮은 치료 효율과 복용 부작용을 해결하기 위한, 염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로겔 및 이의 제조 방법을 제공하는 것에 있다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 하이드로겔을 주사 제형으로서 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 단계 i) 내지 iii)을 포함하는, 염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로겔의 제조 방법을 제공한다:

i) 제 1 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체물질과, 염증 억제 펩타이드를 혼합한 제 1 반응액을 준비하는 단계;

ii) 제 2 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체 물질과, 염증 억제 펩타이드를 혼합한 제 2 반응액을 준비하는 단계; 및

iii) 상기 단계 i)에서 준비한 제 1반응액 및 상기 단계 ii)에서 준비한 제 2 반응액을 혼합하는 단계.

또한, 본 발명은 하기 단계 i) 내지 iii)을 포함하는, 염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로겔의 제조 방법을 제공한다:

i) 염증 억제 펩타이드 및 제 1 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체 물질을 포함하는 제 1 반응액을 준비하는 단계;

ii) 염증 억제 펩타이드 및 제 2 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체 물질을 포함하는 제 2 반응액을 준비하는 단계; 및

iii) 상기 단계 i)에서 준비한 제 1반응액 및 상기 단계 ii)에서 준비한 제 2 반응액을 혼합하는 단계.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 따라 제조된, 염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로겔을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 제 1 화학 작용기는 테트라진, 알카인기, 에폭시기 및 아크로일기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 제 2 화학 작용기는 사이클로옥텐, 아자이드기, 티올기 및 아민기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 천연 생체물질은 히알루론산, 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC) 및 알지네이트(alginate, AGNT)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 염증 억제 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 결합은 축합제로 유도된 아마이드 반응으로 이루어질 수 있으며, 상기 축합제는 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride)(DMTMM)인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로겔을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 염증성 질환은 인슐린-의존성 당뇨병, 다발 경화증, 실험적 자가면역 뇌척수염, 류마티스성 관절염, 실험적 자가면역 관절염, 중증 근무력증, 갑상선염, 실험적 형태의 포도막염, 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종, 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 애디슨 질환, 조기 폐경, 남성 불임증, 소아 당뇨병, 굿파스처 증후군, 보통 천포창, 유천포창, 교감성안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소, 원발성 담관 경화증, 만성 활동성 간염 Hbs-ve, 잠재성 간경변증, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 경피증, 베게너육아종증, 다발근육염/피부근육염, 원판상 LE 및 전신 홍반 루푸스로 이루어진 군으로부 터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 약학적 조성물은 주사 제형인 것일 수 있다.

본 발명은 염증 억제 효과를 가지는 펩타이드 전달용 하이드로겔 및 이의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 하이드로겔은 천연 생체 물질에 염증 억제 효과를 가진 펩타이드가 물리적 또는 화학적으로 포함된 구조를 이루어, 생체 내에서 불안정한 상기 펩타이드가 안정적이고 높은 생체 적합성을 가지면서 염증 반응의 질환 부위로 전달될 수 있도록 한다. 이에 따라 염증 억제 펩타이드의 낮은 생체 안정성에 따른 낮은 치료 효율을 향상시킬 수 있으며, 및 반복 투여에 따라 나타나는 복용시 부작용을 완화시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물은 주사 제형 등으로 다양한 응용이 가능하여, 류마티스 관절염 또는 퇴행성 관절 질환과 같은 염증성 질환의 치료제 개발로의 응용이 가능하다.

종래 기술에서 사용되는 하이드로겔 약물 전달체는 가교제를 사용하지 않아 하이드로겔 만을 사용함에 있어서 적절한 점도를 얻기 위해 히알루론산을 고농도로 사용하여야 하나, 본 발명에 따른 하이드로겔은 가교제를 사용하여 가교를 형성함으로써 종래의 약물 전달체에 비해 히알루론산을 저농도로 사용하여 원하는 점도를 달성할 수 있고, 약물 포집능 또한 고농도의 히알루론산을 사용하는 경우에 비해 현저히 상승할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 하이드로겔의 제조 과정, 및 상기 하이드로겔을류마티스 관절염이 유발된 관절에 투여하는 적용 예를 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 제조된 히알루론산하이드로겔이 염증 세포에 대하여 나타내는 시간-세포 생존률을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 항염증 펩타이드를 화학적 결합을 통해 포함하는 히알루론산하이드로겔을류마티스 관절염이 유도된 동물 모델에 투여한 후의 조직을 Hematoxylin & Eosin 염색한 결과를 나타낸다: control은 관절염이 유도되지 않은 정상 대조군을 나타내고, Non treatment는 항염증 펩타이드를 투여하지 않은 관절염 동물 모델인 미처리 대조군을 나타낸다.
도 4는 항염증 펩타이드를 화학적 결합을 통해 포함하는 히알루론산하이드로겔을류마티스 관절염이 유도된 동물 모델에 투여한 후의 조직을 Safranin O 염색한 결과를 나타낸다: control은 정상 대조군을 나타내고, Non treatment는 미처리 대조군을 나타낸다.
도 5는 항염증 펩타이드를 화학적 결합을 통해 포함하는 히알루론산하이드로겔을류마티스 관절염이 유도된 동물 모델에 투여한 후의 조직에서 TNF-α를 형광 염색한 결과를 나타낸다: control은 정상 대조군을 나타내고, Non treatment는 미처리 대조군을 나타낸다.
도 6은 항염증 펩타이드를 화학적 결합을 통해 포함하는 히알루론산하이드로겔을류마티스 관절염이 유도된 동물 모델에 투여한 후의 염증 반응에 따른 붓기의 정도를 관찰한 결과를 나타낸다: control은 정상 대조군을 나타내고, Non treatment는 미처리 대조군을 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

염증 억제 펩타이드를 물리적으로 포함하는 천연 생체 물질의 하이드로겔

본 발명은 하기 단계 i) 내지 iii)을 포함하는, 염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로겔의 제조 방법을 제공한다:

i) 제 1 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체물질과, 염증 억제 펩타이드를 혼합한 제 1 반응액을 준비하는 단계;

ii) 제 2 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체 물질과, 염증 억제 펩타이드를 혼합한 제 2 반응액을 준비하는 단계; 및

iii) 상기 단계 i)에서 준비한 제 1반응액 및 상기 단계 ii)에서 준비한 제 2 반응액을 혼합하는 단계.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 따라 제조된, 염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로겔을 제공한다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 제 1 화학 작용기는 테트라진, 알카인기, 에폭시기 및 아크로일기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 구체적으로 테트라진인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 제 2 화학 작용기는 사이클로옥텐, 아자이드기, 티올기 및 아민기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 구체적으로 사이클로옥텐인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

보다 구체적으로, 상기 제 1 화학 작용기 및 제 2 화학 작용기는 다음의 조합으로 구성되어 하이드로겔 제조에 적용되는 것이 가장 바람직하다: (테트라진, 사이클로옥텐), (알카인기, 아자이드기), (알카인기, 티올기), (에폭시기, 아민기), (에폭시기, 티올기), (아크로일기, 아민기) 또는 (아크로일기, 티올기).

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 천연 생체물질은 카르복실기(carboxyl group)을 포함하는 것이 바람직하다. 카르복실기를 포함하는 천연 생체물질은 아마이드 결합을 통해 화학 작용기를 포함하는 화합물과 결합될 수 있다. 구체적으로, 상기 천연 생체물질은 히알루론산, 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC) 및 알지네이트(alginate, AGNT)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

보다 구체적으로, 상기 천연 생체물질이 히알루론산인 경우, 이의 분자량은 500,000 Da 내지 6,000,000 Da 범위에 해당하는 것이 바람직하다. 이 때, 히알루론산의 분자량이 500,000 Da 미만인 경우, 물성이 너무 낮아져 유의적으로 하이드로겔을 이룰 수 없으며, 6,000,000 Da 초과인 경우, 점도가 상승하여 주사 제형으로서의 적용에 한계를 가져올 수 있으므로, 바람직하지 않다.

히알루론산은 동물 조직에서 널리 분포하는 세포외 기질의 기초 성분으로, 생체 내에서 세포증식과 분화를 조절하는 기능을 한다. 즉, 히알루론산은 중요한 생물학적 공정, 세포 이동성 및 조직 치유에 관여하며 염증 반응을 조절할 수 있는 것으로 알려져 있다. 히알루론산은 세포 표면에 위치하는 특정 수용체와 상호 작용함으로써 종양 성장에도 관여하는 것으로 확인되었다. 이는 개질 히알루론산이항종양 활성을 갖는 거대분자 프로드러그(prodrug)의 생산에 가용성 담체로서의 적용 가능성을 나타낼 수 있어, 약물 전달체의 제조 분야에서 많은 관심을 끌고 있다. 이와 같은 이유로, 히알루론산에 기초한 생체 재료는 생체 적합성 및 세포 성장 유도 물질로서 유용한 조직공학적 지지체로 매우 적합하다는 것이 당업계에 잘 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, 히알루론산 단독으로는 그다지 탄력적이지않고 쉽게 부서지는 골격을 발생시키는 등의 단점으로 그 사용이 제한된다. 또한 이들 골격의 표면은 친수성이 너무 강하여 부착과 세포 분화 조절 효과가 유의적으로 나타나지 않을 수 있다.

때문에, 히알루론산을 콜라겐 또는 겔라틴과 같은 생체 적합성 천연 고분자 등과 함께 혼합하거나 가교결합함으로써, 또는 히알루론산을 소수성기로 변형함으로써 히알루론산을개질하는 방법 등이 제안되고 있다. 이와 비슷하게 히알루론산의 표면에 관능기를 도입함으로써 다당류 분자 내의 화학적 개질은히알루론산 내에 도입된 약물의 방출속도를 늦추거나 하는 제약학적 약물 방출 제어 시스템(Drug Delivery System, DDS)을 얻고자 하는 목표를 가지는 연구가 계속되고 있다. 이러한 목표는히알루론산 자체의 생체적합성, 생분해성, 비면역성 등의 성질을 그대로 유지하면서 화학적 개질을 통해 물리화학적 성질을 향상시키고 in vivo에서의 분해도를 변화시킴으로써 적용될 수 있음을 의미한다. 구체적으로, 히알루론산의카르복실기의 반응, 약물 방출 기전 조절을 위한 고분자-약물결합, 하이드로젤로 가교화, 표면 코팅 등의 방법 외에도, 다른 재료와 혼합한 조성물에 대해서도 논의가 되고 있다. 또한, 많은 히알루론산 유도체(예를들어, 자체 가교화된히알루론산)의 사용 가능성을 in vitro, in vivo 단계에서 평가한 연구 결과에 대하여도 보고된 바 있다. 또한, 히알루론산과 다양한 약물과의 에스테르화 반응은 약물 방출제어 및 조직 공학에 사용 가능한 새로운 물리화학적 성질을 제공하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 하이드로겔의 제조 방법에 있어서, 염증 억제 펩타이드가 천연 생체물질에 물리적으로 포함되었다는 것은, 화학적으로 개질된 히알루론산에 단순 혼합에 의해 물리적으로 약제가 봉입되어 그 개질된히알루론산의 특성에 따라 약물의방출 기전을 제어할수있는 시스템으로 적용되었음을 의미한다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 염증 억제 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 3의 아미노산 서열은, 대한민국 등록공보 제 10-1745520호에 공지된 서열로서, 18개 아미노산으로 이루어진 펩타이드인 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 제조 방법에 적용될 수 있는 펩타이드는, 천연 단백질 유래 또는 인공적으로 합성된 펩타이드 중 염증 억제 효과를 가지는 것으로 당업자에게 인정될 수 있는 범위라면 제한없이 적용될 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 결합은 천연 생체 물질을 포함하는 용액에 축합제를 추가로 첨가함으로서, 축합 반응, 바람직하게는 아마이드 반응이 유도되는 것으로 수행되는 것이 바람직하다. 상기 축합제는 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride)(DMTMM)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에 의해 천연 생체물질에 대하여 축합 반응을 유도할 수 있는 것으로 이해될 수 있는 축합제라면 제한없이 적용될 수 있다. 상기 축합제의 양은, 축합 반응의 정도를 제어하기 위해 당업자가 임의적으로 조절할 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 화학 작용기를 포함하는 화합물이 결합(축합)된 천연 생체물질에, 염증 억제 펩타이드를 일정 농도로 혼합한 후, 5분 내지 10 분 가량 충분히 볼텍싱하면, 펩타이드가 천연 생체물질과 균일하게 혼합될 수 있으며, 이에 따라 염증 억제 효과를 가진 펩타이드를 물리적으로 포함하는 천연 생체물질을 제조할 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 iii)의 "제 1반응액 및 제 2 반응액을 혼합" 함에 있어, 혼합 비율에 따라 염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로젤의 물성을 조절할 수 있다. 구체적으로, "제 1 화학 작용기를 가지는 화합물" 및 "제 2 화학 작용기를 가지는 화합물"이, 각각의 반응액 내에 동일 wt% 농도로 포함되어 제조된 것으로 가정할 때, 상기 제 1 반응액 및 상기 제 2 반응액은 1:0.1 내지 1:10의 몰비율로 혼합되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 제 1 반응액 및 상기 제 2 반응액은 1:0.5 내지 1:5의 몰비율로 혼합되는 것이 더욱 바람직하며, 1:0.5 내지 1:2의 몰비율로 혼합되는 것이 가장 바람직하다. 제 1반응액 및 제 2 반응액이 위와 같은 비율보다 낮은 비율로 혼합되는 경우, 하이드로겔이 유의적으로 형성되지 않아 TAP2를 효과적으로 포함할 수 없으므로 약물 전달체로서 효과적이지 않고, 위와 같은 비율보다 높은 비율로 혼합되는 경우, 높은 가교도에 의해 제조된 하이드로겔의점도가 증가하여 기계적 강도가 강해져 TAP2가 유의적으로 유입 및/또는 방출될 수 없으므로, 약물 전달체로서 유의적인 효과를 나타낼 수 없다.

염증 억제 펩타이드를 화학적으로 포함하는 천연 생체 물질의 하이드로겔

또한, 본 발명은 하기 단계 i) 내지 iii)을 포함하는, 염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로겔의 제조 방법을 제공한다:

i) 염증 억제 펩타이드 및 제 1 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체 물질을 포함하는 제 1 반응액을 준비하는 단계;

ii) 염증 억제 펩타이드 및 제 2 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체 물질을 포함하는 제 2 반응액을 준비하는 단계; 및

iii) 상기 단계 i)에서 준비한 제 1반응액 및 상기 단계 ii)에서 준비한 제 2 반응액을 혼합하는 단계.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 따라 제조된, 염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로겔을 제공한다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 제 1 화학 작용기 및/또는 상기 제 2 화학 작용기에 대하여는, 상기 “염증 억제 펩타이드를 물리적으로 포함하는 천연 생체 물질의 하이드로겔”에서 기술한 바 있으므로, 중복된 설명은 생략하기로 한다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 천연 생체물질에 대하여는, 상기 “염증 억제 펩타이드를 물리적으로 포함하는 천연 생체 물질의 하이드로겔”에서 기술한 바 있으므로, 중복된 설명은 생략하기로 한다.

본 발명에서 천연 생체물질에 염증 억제 펩타이드를 화학적으로 결합시킨 하이드로겔을 제조함에 있어서, 상기 제 1 화학 작용기를 테트라진으로 사용하는 경우, 제 1 화학 작용기 포함 화합물로서, 메틸테트라진-PEG4-아민(methyltetrazine-PEG4-amine)을 사용하는 것이 보다 바람직하며, 이 때의 구체적인 반응식은 하기 [반응식 1]에서 나타난 바와 같다:

[반응식 1]

.

본 발명에서 천연 생체물질에 염증 억제 펩타이드를 화학적으로 결합시킨 하이드로겔을 제조함에 있어서, 상기 제 2 화학 작용기를 사이클로옥텐으로 사용하는 경우, 제 2 화학 작용기 포함 화합물로서, 트랜스-사이클로옥텐-아민(trans-cyclooctene-amine)을 사용하는 것이 보다 바람직하며, 이 때의 구체적인 반응식은 하기 [반응식 2]에서 나타난 바와 같다:

[반응식 2]

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본 발명의 제조 방법에 있어서, 염증 억제 펩타이드를 화학적으로 포함될 수 있다는 것은, 본 발명에 따른 염증 억제 펩타이드(예를 들어, TAP2 펩타이드)가 천연 생체물질(예를 들어, 히알루론산)에 공유결합을 통해 직접 화학적으로 결합되어 작용 부위에 운반되고 이의 생체 이용 효율이 증가될 수 있는 방법으로 적용되거나, 및/또는 화학적으로 개질된 천연 생체물질(예를들어, 히알루론산)에 물리적으로 약제가 봉입되어 그 개질된 히알루론산의 특성에 따라 약물의 방출 기전이 제어되는 것을 의미한다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 염증 억제 펩타이드에 대하여는, 상기 “염증 억제 펩타이드를 물리적으로 포함하는 천연 생체 물질의 하이드로겔”에서 기술한 바 있으므로, 중복된 설명은 생략하기로 한다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 축합 및 축합제에 대하여는, 상기 “염증 억제 펩타이드를 물리적으로 포함하는 천연 생체 물질의 하이드로겔”에서 기술한 바 있으므로, 중복된 설명은 생략하기로 한다.

본 발명의 제조 방법에 있어서 상기 단계 iii)에서 “제 1 반응액및 제 2 반응액을 혼합”하는 것은, 제 1 화학 작용기 및 제 2 화학 작용기의 화학적 결합을 유도하기 위한 단계로 이해될 수 있다. 이러한 화학적 결합은 짧은 시간, 특히, 수초 이내에 이루어질 수 있는 것으로, 상기 제 1반응액 및 제 2 반응액이 혼합되는 것을 통해 단시간에 겔화가 가능하다는 이점을 가진다.

본 발명에서 하이드로겔을 제조함에 있어서, 상기 제 1 화학 작용기 및 제 2 화학 작용기의 조합으로 (테트라진, 사이클로옥텐)의 조합을 사용하는 경우, 구체적인 반응식은 하기 [반응식 3]에서 나타난 바와 같다:

[반응식 3]

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염증 억제 효과를 가지는 펩타이드를 포함하는 천연 생체물질의 응용

또한, 본 발명은 상기 염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로겔을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 염증성 질환은 인슐린-의존성 당뇨병, 다발 경화증, 실험적 자가면역 뇌척수염, 류마티스성 관절염, 실험적 자가면역 관절염, 중증 근무력증, 갑상선염, 실험적 형태의 포도막염, 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종, 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 애디슨 질환, 조기 폐경, 남성 불임증, 소아 당뇨병, 굿파스처 증후군, 보통 천포창, 유천포창, 교감성안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소, 원발성 담관 경화증, 만성 활동성 간염 Hbs-ve, 잠재성 간경변증, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 경피증, 베게너육아종증, 다발근육염/피부근육염, 원판상 LE 및 전신 홍반 루푸스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 약학적 조성물은 주사 제형인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 염증 억제 펩타이드를 포함하는 하이드로겔을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 60 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 항염증 펩타이드를 물리적 결합을 통해 포함하는 히알루론산하이드로겔의 제조

(1) 3차 증류수 10 ㎖에 히알루론산(HA)(분자량: 1, 000, 000 Da) 100 ㎎을 투입한 후, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여히알루론산 용액을 제조하였다. 제조한 히알루론산 용액은 바이알에 5 ㎖씩 분주하였다.

(2) 단계 (1)에서 분주한 히알루론산 용액에, 축합체인 4-(4, 6-디메톡시-1, 3, 5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4, 6-Dimethoxy-1, 3, 5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride; DMTMM) 8.3 ㎎ 및 메틸테트라진-PEG4-아민(methyltetrazine-PEG4-amine; TET) 9.93 mg을 투입하고, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시켰다. 그런 다음, 72 시간 동안 투석하여 용액을 농축시킨 후, -80℃에서 동결건조시켜, 히알루론산에 TET가 도입된, HA-TET를 제조하였다.

(3) 단계 (1)에서 분주한 히알루론산 용액에, DMTMM 8.3 ㎎ 및 트랜스-사이클로옥텐-아민(trans-cyclooctene-amine)(TCO) 7.7 ㎎을 투입하고, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시켰다. 그런 다음, 72 시간 동안 투석하여 용액을 농축시킨 다음, -80℃에서 동결건조시켜, 히알루론산에 TCO가 도입된, HA-TCO를 제조하였다.

(4) 단계 (2)에서 제조한 HA-TET 및 단계 (3)에서 제조한 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹여 5 ㎖ 용액으로 제조하고, 각각의 용액에 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 항염증 펩타이드 TAP2 0.207 mg를 첨가하였다. 1 시간 동안 교반한 후, 각각 교반된 혼합액을, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 항염증 펩타이드를 물리적으로 포함하는 히알루론산하이드로겔 용액(Cx-HA+TAP2)을 최종적으로 수득하였다.

실시예 2: 항염증 펩타이드를 화학적 결합을 통해 포함하는 히알루론산하이드로겔의 제조

(1) 3차 증류수 10 ㎖에 히알루론산(HA)(분자량: 1, 000, 000 Da) 100 ㎎을 투입한 후, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여히알루론산 용액을 제조하였다. 제조한 히알루론산 용액은 바이알에 5 ㎖씩 분주하였다.

(2) 단계 (1)에서 분주한 히알루론산 용액에, 축합체인 DMTMM 0.066 ㎎을 투입하였다. 그런 다음, 이를 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 TAP2 0.207 ㎎를 포함하는 3차 증류수 5 ㎖에 천천히 적하시키면서, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시켰다. 교반 후, 72 시간 동안 투석하여 용액을 농축시킨 다음, -80℃에서 동결건조시켜, TAP2가 도입된 히알루론산을 제조하였다.

(3) 단계 (2)에서 제조한 TAP2가 도입된 히알루론산을 1 중량%의 농도가 되도록 5 mℓ의 3차 증류수에 투입한 후, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여히알루론산 용액을 제조하였다. 여기에, DMTMM 8.3 ㎎ 및 TET 9.93 ㎎을 투입하고, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시켰다. 그런 다음, 72 시간 동안 투석하여 용액을 농축시킨 후, -80℃에서 동결건조시켜, TAP2가 도입된 HA-TET(HA-TET-TAP2)를 제조하였다. 원소 분석을 통해 HA-TET에 TAP2가 도입된 양을 분석하였다(표 1).

(4) 단계 (3)과 동일한 방법을 수행하되, TET 대신 TCO 7.7 ㎎을 히알루론산 용액에 투입하여, TAP2가 도입된 HA-TCO(HA-TCO-TAP2)를 제조하였다. 원소 분석을 통해 HA-TCO에 TAP2가 도입된 양을 분석하였다(표 1).

(5) TAP2가 도입된 HA-TET-TAP2 및 HA-TCO-TAP2를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 TAP2가 도입된 히알루론산하이드로겔 용액(Cx-HA-TAP2)을 최종 제조하였다.

시료	C(%)	H(%)	N(%)	C/N 몰비	치환도(%)
HA	34.7	5.2	2.9	14.0	-
HA-TCO	45.1	6.2	4.6	9.7	24.9
HA-TET	40.2	6.0	5.4	7.4	20.7
HA-TCO-TAP2	40.2	6.3	5.0	8.0	12.9
HA-TET-TAP2	45.1	6.2	5.2	9.2	10.8

실시예 3: 항염증 펩타이드를 화학적 결합을 통해 포함하는 CMC 및 CMC-하이드로겔의 제조

(1) 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC)를 사용하고, [실시예 1]과 동일한 방법을 진행하여, TAP2가 물리적인 결합으로 도입된 CMC-TET(CMC-TET-TAP2) 및 CMC-TCO(CMC-TCO-TAP2)를 각각 제조하였다.

(2) 단계 (1)에서 제조한, CMC-TET-TAP2 및 CMC-TCO-TAP2를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 TAP2가 도입된 CMC-하이드로겔 용액(Cx-CMC-TAP2)을 최종 제조하였다. 마찬가지로, 원소 분석을 통해 도입량을 분석하였다.

시료	C(%)	H(%)	N(%)	C/N 몰비	치환도(%)
CMC	43.6	5.45	-	-	-
CMC-TCO-TAP2	20.2	5.3	3.2	8.0	9.9
CMC-TET-TAP2	25.1	6.2	5.2	9.2	11.7

실시예 4: 항염증 펩타이드를 화학적 결합을 통해 포함하는 AGNT 및 AGNT-하이드로겔의 제조

(1) 알지네이트(alginate, AGNT)를 사용하고, [실시예 1]과 동일한 방법을 진행하여, TAP2가 물리적인 결합으로 도입된 AGNT-TET(AGNT-TET-TAP2) 및 AGNT-TCO(AGNT-TCO-TAP2)를 각각 제조하였다.

(2) 단계 (1)에서 제조한, AGNT-TET-TAP2 및 AGNT-TCO-TAP2를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 TAP2가 도입된 AGNT-하이드로겔 용액(Cx-AGNT-TAP2)을 최종 제조하였다. 마찬가지로, 원소 분석을 통해 도입량을 분석하였다.

시료	C(%)	H(%)	N(%)	C/N 몰비	치환도(%)
AGNT	441.1	4.0	-	-	-
AGNT-TCO-TAP2	18.2	6.3	8.2	8.0	9.9
AGNT-TET-TAP2	22.1	7.2	4.2	9.2	11.7

[비교예]

비교예 1: TAP2 반복 투여 용액의 제조

TAP2를 5 ㎍/uℓ 농도로 생리식염수에 녹인 용액을 준비하였다.

비교예 2: HA가 도입된 TAP2의 제조

종래 기술에 따라 사용되는 히알루론산 전달체를 비교예로 사용하기 위해, 본 발명에서 사용한 TCO 또는 TET의 가교제를 도입하지 않은 히알루론산(HA)에 TAP2 펩타이드를 단순 혼합하였다.

(1) 3차 증류수 5 ㎖에 히알루론산(HA)(분자량: 1, 000, 000 Da) 100 ㎎을 투입한 후, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여2 wt% 히알루론산 용액을 제조하였다. 제조한 히알루론산 용액은 바이알에 5 ㎖씩 분주하였다.

(2) 단계 (1)에서 제조한 히알루론산용액에 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 항염증 펩타이드 TAP2 0.207 mg를 첨가하였다. 1 시간 동안 교반하여 항염증 펩타이드를 물리적으로 포함하는 가교하지 않은 히알루론산하이드로겔 용액(HA+TAP2)을 최종적으로 수득하였다.

[실험예]

실험예 1: 화학 작용기 포함 여부에 따른 점도 평가

본 발명에서 제조한, 펩타이드 전달용 생체 재료 하이드로겔의 기계적 물성을 비교하기 위해, 다음과 같은 단계 (1) 내지 단계 (4)의 방법으로 화학 작용기 1 또는 화학 작용기 2의 포함 여부에 따른 생체 재료 하이드로겔의 점도를 확인하였다.

(1) 화학 작용기 1을 포함하는 생체 재료의 준비: 상기 [실시예 1]의 단계 (3)에서 제조한 HA-TCO를 증류수에 2 wt% 농도로 녹여 준비하였다. 또한, 동일한 방법을 사용하여 CMC-TCO 및 ALGN-TCO를 각각 제조한 후, 증류수에 각각 2 wt% 농도로 녹여 준비하였다.

(2) 화학 작용기 2를 포함하는 생체 재료의 준비: 상기 [실시예 1]의 단계 (2)에서 제조한 HA-TET를 증류수에 2 wt% 농도로 녹여 준비하였다. 또한, 동일한 방법을 사용하여 CMC-TET 및 ALGN-TET를 각각 제조한 후, 증류수에 각각 2 wt% 농도로 녹여 준비하였다.

(3) 가교된하이드로겔의 형성: 상기 단계 (1)에서 준비한 HA-TCO 용액 및 상기 단계 (2)에서 준비한 HA-TET 용액을 하기 [표 4]에 개시된 바에 따라 몰비율이 1:1이 되도록 각각 혼합하여 가교된하이드로젤의 형성을 유도하였다(Cx-HA). 동일한 방법을 사용하여 CMC-TCO 및 CMC-TET를 혼합하였고, ALGN-TCO 및 ALGN-TET를 혼합하여, Cx-CMC 및 Cx-AGLN의 형성을 각각 유도하였다.

(4) 점도 측정: Rheometer를 이용하여, 상기 단계 (3)에서 준비한 Cx-HA, Cx-CMC 및 Cx-AGLN의 점도를 측정하였다.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 화학 작용기가 도입된 천연 생체 재료 하이드로겔의 점도가 증가하여, 기계적 강성이 높아졌음을 확인하였다. 또한, 도 3에서 나타난 바와 같이 화학 작용기의 도입 함량 증가함에 따라, 제조된 하이드로젤의 점도 역시 증가하는 것으로 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 생체 재료 하이드로겔은 화학작용기의 도입 함량을 조절하는 것을 통해 기계적 강성을 조절할 수 있음을 확인하였다.

	cxHA 500	cxHA750	HA(가교제 미포함)
DMTMN	15.7 mg(0.059 mmol)	23.7 mg (0.09 mmol)	0.0 mg
TCO	13.8 mg(0.050 mmol)	20.8 mg (0.075 mmol)	0.0 mg
TET	18.5 mg(0.050 mmol)	27.7 mg (0.075 mmol)	0.0 mg

실험예2: 염증 세포 및 활액 세포에서 염증 억제효과 및 세포 성장률 평가

<2-1> 염증 관련 세포 증식 억제 효과의 확인

본 발명에서 제조한 항염증 펩타이드를 포함하는 주사제형 전달체가 항염증 활성을 나타내는 전달체로서 효과를 나타낼 수 있는지 확인하고자, 먼저 in vitro 단계에서 염증 세포 증식에 영향을 미칠 수 있는지 확인하고자 하였다.

먼저, 세포를 배양하였다. 활액 세포(Synovial cells)인 SW 982세포를 24-transwell plates에 3×10⁴ cells/well의 밀도로 분주하였다. 배양을 위해 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS)을 포함하는 Leibovitz’ L15 배지를 가하고, CO₂의 공급이 없는 배양 환경에서 배양하였다. 염증 세포로서는 RAW 264.7 세포를 배양하였다. RAW 264.7 세포는 1×10⁴ cells/well 밀도로 24-transwell 플레이트에 분주한 다음, 10 % FBS 및 1 % PS를 포함하는 DMEM 배지를 가하고 5% CO₂의 가습 환경에서 배양하였다.

그런 다음, TAP2 전달체 용액을 준비하였다. 실험군으로서, [실시예 1]에서 제조한 TAP2를 물리적으로 포함하는 Cx-HA+TAP2 및 [실시예 2]에서 제조한 TAP2를 화학적으로 포함하는 Cx-HA-TAP2를 각각 2%(w/v)로 생리식염수에 녹인 후, 듀얼 실린지에 주입시켜 준비하였다. 또한, 대조군으로는 [비교예 1]에서 제조한 TAP2 반복 투여 용액 및 [비교예 2]에서 제조한 HA+TAP2 포함 용액을 준비하였다. 준비된 실험군 또는 대조군을 배양된 RAW 264.7 세포 및 SW 982 세포에 각각 처리하였다. 1일, 4일 및 7 일 동안 TAP2를 처리한 다음, Alamar blue 분석을 통해 각 세포의 생존률을 확인하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 활액 세포인 SW982 세포는 모든 실험군 및 대조군에서 시간이 지남에 따라 세포 증식이 나타나는 것을 확인하였다. 이를 통해, TAP2 및 HA는 관절 내 정상 세포인 활액 세포의 성장에는 유의적인 영향을 미치지 않는 것으로 확인하였다(도 4b). 이에 비해, 염증 세포인 RAW 264.7 세포의 경우, TAP2가 도입된 HA를 처리한 대조군과 함께 Cx-HA+TAP2(물리적 포함) 또는 Cx-HA-TAP2(화학적 포함)을 처리한 실험군에서 세포 성장률이 유의적으로 감소된 수준을 나타내는 것으로 확인하였다. 이를 통해, HA 자체의 항염증 효과로 인해 염증세포의 증식이 억제되는 효과를 나타낸 것으로 확인하였다(도 4a).

<2-2> 염증 세포 내 TNF-a 발현수준 변화의 확인

본 발명에서 제조한 하이드로겔 복합체가 항염증 활성을 나타내는 전달체로서 효과를 나타낼 수 있는지 확인하고자, 염증 세포에서 발현되는 TNF-a의 발현 수준을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 염증 세포인 RAW264.7 세포를 배양하고, TAP2 전달체를 각각 처리하였다. TAP2 처리 1 일, 4 일 및 7 일 이후, 세포 배양액을 수득하고 ELISA 방법을 통해 배양액 내 TNF-a의 농도를 측정하였다.

그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 TAP2 미처리 대조군(control)에 비해 TAP2를 포함하는 시료를 처리한 모든 대조군 및 실험군에서 TNF-a 발현이 억제되는 것을 확인하였다. 특히, TAP2가 물리적 또는 화학적으로 포함된 Cx-HA의 경우, 생체 재로 하이드로겔에서 TAP2가 지속적으로 방출되어 TNF-a의 발현 수준의 감소가 점차적으로 지속되어 나타나는 것으로 확인하였고, 이를 통해 본 발명에서 제조한 하이드로겔 복합체가 항염증 펩타이드의 전달체로서 역할을 하여 효과적으로 염증을 억제할 수 있는 것으로 확인하였다.

실험예3: 염색을 통한 관절 조직 염증 억제 효과에 대한 조직학적 평가

본 발명에서 제조한 항염증 펩타이드를 포함하는 주사제형 전달체가 항염증 활성을 나타내는 전달체로서 효과를 나타낼 수 있는지 확인하고자, 먼저 in vivo 단계에서 세포에 대한 염증 억제효과를 확인하였다.

구체적으로, 실험군으로서 [실시예 2]에서 제조한 TAP2를 화학적으로 포함하는 Cx-HA-TAP2를 각각 2%(w/v)로 생리식염수에 녹인 후, 듀얼 실린지에 주입시켜 하이드로겔 형태로 투여할 수 있도록 준비하였다. 동물 모델로서는, 루이스 렛에 CIA 법으로 류마티스 관절염을 유발시켜 준비하였다. 그런 다음, Cx-HA-TAP2를 루이스 렛의 무릎 관절에 100 ㎕씩 주입한 후, 1 주, 3 주, 및 6 주 경과 후 무름 관절을 적출하였다. 대조군으로는 [비교예 1]에서 제조한 TAP2 반복 투여 용액을 준비하여 동일한 방법으로 류마티스 관절염 모델에 주입한 후 무릎 관절을 적출하였다.

적출한 조직은 10% 포르말린에 3 일 동안 고정한 후, 파라핀 블록으로 제작하였다. 이를 8μm 두께로 자른 후, 슬라이드에 고정하고 조직학적 평가를 위해 H&E 염색, safranin-o 염색 및 TNF-α형광 염색을 실시하였다.

그 결과, H&E 염색을 통해 세포의 핵과 세포질을 염색하여 관찰하였으며(도 6), safranin-o 염색을 통해 연골의 글라이코사미노글리칸을 염색해서 연골의 기능과 재생을 확인하였다(도 7). 또한, TNF-α 형광염색을 통해 염증반응의 정도를 확인하였다(도 8). 이를 통해 TAP2를 물리적으로 포함하는 히알루론산하이드로겔 및 TAP2이 화학적으로 도입된 히알루론산하이드로겔 모두는 관절 내 염증 반응을 감소시키고 연골의 기능을 회복시킴으로써, 염증성 질환인 류마티스 관절염의 치료에 매우 효과적인 것을 확인하였다. 즉, TAP2 전달체로서 제조한 주사제형의 하이드로겔은 TAP2이 나타내는 항염증 효과를 유의적으로 나타낼 수 있음을 확인하였다.

실험예4: 염증 완화 정도를 평가하기 위한 렛의 발 및 발바닥 관찰

[실시예 1]에서 제조한 TAP2를 물리적으로 포함하는 Cx-HA+TAP2 및 [실시예 2]에서 제조한 TAP2를 화학적으로 포함하는 Cx-HA-TAP2를 각각 2%(w/v)로 생리식염수에 녹인 후, 듀얼 실린지에 주입시켜 하이드로겔 형태로 투여할 수 있도록 준비하였다. 동물 모델로서는, 루이스 렛에 CIA 법으로 류마티스 관절염을 유발시켜 준비하였다. 그런 다음, Cx-HA-TAP2를 루이스 렛의 무릎 관절에 100 ㎕씩 주입한 후, 1 주, 3 주, 및 6 주가 경과함에 따라 실험 동물 발의 측면과 발바닥을 촬영하여 염증에 따른 붓기의 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이 TAP2를 포함하는 하이드로겔을 투여한 실험군에서 시간이 지남에 따라 염증 수준이 감소되면서 붓기 또한 감소되는 것으로 확인하였다(도 9). 이를 TAP2 반복 투여 용액을 주입한 비교예의 대조군과 비교하였을 때, TAP2을 하이드로겔 형태로 주입한 실험군에서 나타나는 붓기 감소 효과가 보다 유의적으로 높은 것을 확인하였다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Inflammatory peptide-loadedinjectable hydrogel by physical or chemical loading, and method of manufacturing and application <130> 1063848 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAP1 <400> 1 Ala Ser Ala Asn Lys Asn Leu Leu Phe Lys Ile Arg Tyr Ser Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gly Gly Ser 20 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAP2 <400> 2 Ala Met Ala Leu Asp Cys Phe Arg Trp Gly Trp Arg Met Trp Cys Ser 1 5 10 15 Ser Gly <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAP3 <400> 3 Ala Met Ala Tyr Glu Ile Arg Cys Trp Trp Arg Trp Cys Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Ser Gly

Claims (12)

1. i) 제 1 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체 물질과, 염증 억제 펩타이드를 혼합한 제 1 반응액을 준비하는 단계;
   ii) 제 2 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체 물질과, 염증 억제 펩타이드를 혼합한 제 2 반응액을 준비하는 단계; 및
   iii) 상기 단계 i)에서 준비한 제 1 반응액 및 상기 단계 ii)에서 준비한 제 2 반응액을 1:0.5 내지 1:2의 몰비로 혼합하는 단계;를 포함하고,
   상기 제 1 화학 작용기 및 상기 제2 화학 작용기의 조합은 (테트라진, 사이클로옥텐), (알카인기, 아자이드기), (알카인기, 티올기), (에폭시기, 아민기), (에폭시기, 티올기), (아크로일기, 아민기) 또는 (아크로일기, 티올기) 이고,
   상기 천연 생체물질은 히알루론산, 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC) 및 알지네이트(alginate, AGNT)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이며,
   상기 염증 억제 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는,
   염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로겔의 제조 방법.
   
2. i) 염증 억제 펩타이드 및 제 1 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체 물질을 포함하는 제 1 반응액을 준비하는 단계;
   ii) 염증 억제 펩타이드 및 제 2 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체 물질을 포함하는 제 2 반응액을 준비하는 단계; 및
   iii) 상기 단계 i)에서 준비한 제 1 반응액 및 상기 단계 ii)에서 준비한 제 2 반응액을 1:0.5 내지 1:2의 몰비로 혼합하는 단계;를 포함하고,
   상기 제 1 화학 작용기 및 상기 제2 화학 작용기의 조합은 (테트라진, 사이클로옥텐), (알카인기, 아자이드기), (알카인기, 티올기), (에폭시기, 아민기), (에폭시기, 티올기), (아크로일기, 아민기) 또는 (아크로일기, 티올기) 이고,
   상기 천연 생체물질은 히알루론산, 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC) 및 알지네이트(alginate, AGNT)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이며,
   상기 염증 억제 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는,
   염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로겔의 제조 방법.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 결합은 축합제로 유도된 아마이드 반응으로 이루어진 것을 특징으로 하는, 염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로겔의 제조 방법.
   
8. 제 7항에 있어서, 상기 축합제는 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride)(DMTMM)인 것을 특징으로 하는, 염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로겔의 제조 방법.
   
9. 제 1항 또는 제 2항의 방법으로 제조된, 염증 억제 펩타이드 전달용 하이드로겔.
   
10. 제 9항의 하이드로겔을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
11. 제 10항에 있어서, 상기 염증성 질환은 인슐린-의존성 당뇨병, 다발 경화증, 실험적 자가면역 뇌척수염, 류마티스성 관절염, 실험적 자가면역 관절염, 중증 근무력증, 갑상선염, 실험적 형태의 포도막염, 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종, 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 애디슨 질환, 조기 폐경, 남성 불임증, 소아 당뇨병, 굿파스처 증후군, 보통 천포창, 유천포창, 교감성안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소, 원발성 담관 경화증, 만성 활동성 간염 Hbs-ve, 잠재성 간경변증, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 경피증, 베게너육아종증, 다발근육염/피부근육염, 원판상 LE 및 전신 홍반 루푸스로 이루어진 군으로부 터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
12. 제 10항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 주사 제형인 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    

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