KR20050042230A - 티모신 알파 1 펩티드/중합체 결합체 - Google Patents

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Abstract

본 약제학적 조성물은, 결합체를 환자에게 투여 시, 환자의 혈청 내에 TA1 펩티드의 반감기를 증가시키는 물질에 결합된 티모신 알파 1(TA1)을 포함하는 생리학적 활성 결합체를 포함한다. 그 물질은 실질적으로 비항원성 중합체일 수 있다. 본 발명의 방법에서, 실질적으로 비항원성인 중합체는 TA1 펩티드에 결합된다. 본 발명에 따른 조성물은 면역 자극이 필요한 환자에게 투여된다.

Description

티모신 알파 1 펩티드/중합체 결합체{THYMOSIN ALPHA 1 PEPTIDE/POLYMER CONJUGATES}
본 발명은 티모신 알파 1 펩티드에 관한 것이다.
티모신 알파 1(경우에 따라, TA1 라고 칭함)은 면역조절성을 가지고, 송아지 흉선의 티모신 분획 5로부터 기원하여 단리된 천연 생성물과 상동성을 가지는 28-아미노산 흉선 펩티드이다. 그것의 생물학적 효과에는, T 림프구 기능의 강화가 포함되고, 또한 인터류킨-2(IL-2)의 조절, 인터페론-γ 생성의 자극, T 림프구 및 NK 세포 활성의 유도 및 티모포이에시스(thymopoiesis)의 자극이 포함된다. 티모신 알파 1은 또한 MHC 클래스 I 발현을 상향 제어하는 것으로 나타났다.
TA1 및 관련 펩티드를 함유하는 향상된 조성물이 여전히 요망된다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 결합체를 환자에게 투여 시, 환자의 혈청 내에 TA1 펩티드의 반감기를 증가시키는 물질에 결합된 티모신 알파 1(TA1)을 포함하는 생리학적 활성 결합체를 포함한다. 그 물질은 실질적으로 비항원성 중합체일 수 있다. 본 발명의 방법에 따라, 실질적으로 비항원성 중합체는 TA1 펩티드에 결합된다. 본 발명에 따른 조성물은 면역 자극이 필요한 환자에게 투여된다.
본 발명은 천연 발생 TA1 뿐만 아니라 합성 TA1, 및 천연 발생 TA1의 아미노산 서열, 그와 실질적으로 유사한 아미노산 서열, 또는 그의 생략된 서열 형태를 갖는 재조합 TA1을 포함하는 TA1 펩티드, 및 이의 생물학적 활성 유사체로서 TA1의 생물활성과 실질적으로 유사한 치환, 결실, 신장, 대체 또는 기타 변형된 유사체, 예컨대, TA1 와 충분한 아미노산 상동성을 가짐으로써 TA1과 실질적으로 동일한 활성으로 실질적으로 동일한 방식으로 기능하는 TA1 펩티드에 적용가능하다
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 결합체를 환자에게 투여 시, 환자의 혈청 내에 TA1 펩티드의 반감기를 증가시키는 물질에 결합된 티모신 알파 1(TA1)을 포함하는 생리학적 활성 결합체를 포함한다. 그 물질은 실질적으로 비항원성 중합체일 수 있다. 적당한 중합체는 약 200 내지 300,000, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000, 더욱 바람직하게는 약 5,000 내지 35,000, 가장 바람직하게는 약 10,000 내지 30,000의 분자량을 가지게 되는데, 약 20,000의 분자량이 특히 바람직하다.
포함되는 중합체성 물질은 또한 바람직하게 실온에서 수용성이다. 그러한 중합체의 비제한적 목록에는, 폴리알킬렌 옥시드 유사체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화 폴리올, 그의 공중합체 및 그의 블록 공중합체(단, 블록 공중합체의 수용성이 유지되어야 함)가 포함된다. 실질적으로 비항원성 중합체들 중에, 모노-활성, 알킬-말단의 폴리알킬렌 옥시드(PAO), 예컨대 모노메틸-말단의 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이 고려된다. mPEG에 부가하여, C1-4 알킬-말단의 중합체가 또한 유용할 수 있다.
PAO-계 중합체에 대한 대안으로서, 효과적으로 비항원성인 물질, 예컨대 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 알콜, 탄수화물계 중합체 등을 사용할 수 있다. 당업자라면, 상기 목록이 단순히 설명을 위한 것이며, 본원에 기재된 특질을 갖는 모든 중합체 물질이라면 고려 대상이 됨을 인지할 것이다. 본 발명의 목적을 위해, “효과적으로 비항원성" 이라는 용어는, 당 기술분야에 있어 포유동물에 대해 비독성이며, 상당한 면역원성 반응을 나타내지 않는 것으로 이해되는 모든 물질을 의미한다.
중합체는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 특히 바람직한 중합체이다.
중합체는 임의의 적당한 방법에 의해 TA1에 결합될 수 있다. 중합체가 펩티드에 결합되는 예시적 방법이, 미국 특허 제 4,179,337 호, 제 4,766,106 호, 제 4,917,888 호, 제 5,122,614 호 및 제 6,177,074 호, 또한 PCT 국제 공보 제 WO 95/13090 호(이들 모두는 본원에 참고로 인용된 것임)에 개시되어 있다. 티모신 알파 1은 중합체의 아미노기 결합을 위한 가능성있는 5개의 분리된 자리이며, 중합체(들)는 하나 또는 다수의 자리에서 결합될 수 있다. 한 실시예에 따라, 분자량 20,000의 PEG가 TA1의 N-말단에 결합되어, PEG-TAl을 형성한다. 이는 당업계에 공지된 바대로, 적절한 측쇄 보호기로, 불용성인 중합체성 지지체 비이드 상에서의 고체상 펩티드 합성에 의해 형성될 수 있다. 비이드 상에서 TA1 펩티드가 완전히 합성된 후, 보호된 TA1은 분자량 20,000 PEG 와 반응하는 유리 아미노기를 갖는 N-말단기를 남겨두고 비이드로부터 분리된다. 이어서 측쇄 보호기가 제거되어, 본 발명의 본 실시예에 따른 결합체를 형성한다.
본 발명에 따른 조성물을 이용하여, 면역 자극이 필요한 환자를 치료할 수 있다. 그러한 환자에는, 암 환자, B형 간염 또는 C형 간염 바이러스에 감염된 환자를 비롯한 간염 환자, HIV 환자 등이 포함된다. 방법은 환자에게 면역 자극 유효량의 본 발명에 따른 생리학적 활성 결합체를 투여하는 것을 포함한다.
TA1 펩티드의 단리, 특성화 및 사용이 미국 특허 제 4,079,127 호, 미국 특허 제 4,353,821 호, 미국 특허 제 4,148,788 호 및 미국 특허 제 4,116,951 호에 기재되어 있다. TA1 펩티드의 면역 자극 유효량을 통상적 용량 적정 실험으로 결정할 수 있다. TA1은 16mg/kg 체중/1일과 같은 큰 용량으로 투여될 때 인간에게 안전하다는 것이 밝혀졌다. TA1 펩티드의 바람직한 용량은 0.001mg/kg 용량/1일 내지 10mg/kg 체중/1일이며, 예컨대 약 0.02mg/kg 체중/1일이다. 한 실시예에 따라, 면역 자극 유효량은 TA1 펩티드를 약 0.1 내지 10mg의 양으로 포함하는 용량이다. 바람직한 용량은, 펩티드를 약 1 내지 5mg의 양으로 포함한다. 상기 용량은 조성물 내에 존재하는 TA1 펩티드만을 반영한 것이며, 거기에 결합된 중합체의 중량을 반영하는 것은 아니다.
바람직한 실시예에 있어, TA1 펩티드는 약제학적으로 허용가능한 액체 담체(예컨대, 주사용수, 생리학적 농도의 염수, 또는 그와 유사한 것들 내에서 존재한다.
피하 주사된 TA1의 혈장 반감기는 단지 약 2 시간이다. 그러나, 본 발명에 따른 TA1 펩티드에 대한 중합체의 결합은 실질적으로 펩티드의 혈장 반감기를 증가시킨다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명되나, 그에 제한되지 않는 것으로 한다.
실시예 1
쥐(rat)에 대해 5-플루오로우라실(5-FU)을 주사하여, 면역 억제를 일으킨 후, 티모신 알파 1(200㎍/kg) 또는 페길화 티모신 알파 1(20,000 MW PEG-티모신 알파 1)(200㎍/kg 티모신 분자량의 몰을 기초로 한 동등량)을 주사 처리하여, 면역 파라미터에 대한 영향을 결정하였다. 그 결과, (1) (5-FU에 의한 억제 후) NK 활성의 회복이 티모신 알파 1 보다 PEG-티모신 알파 1을 주사한 동물에서 더 컸고, (2) 활성화된 T 세포, CD25+의 회복이 티모신 알파 1 보다 PEG-티모신 알파 1을 주사한 동물에서 더 컸음이 밝혀졌다.
하기 비제한적 실시예에서, 5일간 일정한 유속으로 플루이드를 전달하는 수술 이식된 삼투압 미니펌프를 사용하여, 암 치료 모델에서 TA1의 연속 주입을 평가하였다. 쥐에게 5-플루오로우라실(5-FU)을 투여하여, 면역 억제를 일으킨 후, 8일 후(5-FU 후 백혈구 수의 최하점), 주사 또는 주입된 TA1으로 치료하였다. 각기 8 마리 쥐로 된 치료군은 : 대조군(염수를 이용한 미니펌프); 저용량 TA1군(0.2mg/Kg 피하 주사; 빈 미니펌프); 고용량 TA1군(3.5mg/Kg 피하 주사; 빈 미니펌프); 및 고용량 주입된 TA1군(3.5mg/Kg 미니펌프 주입량) 이었다. 면역 파라미터는 기선(baseline) 및 5-FU 처리(TA1 처리 1일)로부터 8일 후, 또한 TA1 처리로부터 5, 12, 20 및 27일 후에 결정하였다.
실시예 2
체중 250 내지 300g의 10주령 쥐에게 면역 억제를 위해 100mg/kg 5-플루오로우라실(5-FU)을 투여하였다.
5-FU 치료로부터 8일 후, 쥐를 무작위로 하기 군들(n = 8) 중 하나로 정했다 :
- 대조군(염수가 있는 미니펌프)
- 저용량 TA1군, 0.2mg/Kg로 피하 주사(빈 미니펌프)
- 고용량 TA1군, 3.5mg/Kg로 피하 주사(빈 미니펌프)
- 연속 주입 TA1군, 3.5mg/Kg/5일로 미니펌프 이용.
면역 파라미터는 기선 및 5-FU 처리(TA1 처리 1일)로부터 8일 후, 또한 TA1 처리로부터 5, 12, 20 및 27일 후에 결정하였다.
평가에는, NK 활성(PBMC에 4 시간 노출된 후, YAC-1 세포로부터 방출된 LDH), 총 백혈구 수(단일클론 항체에 의한 특이성을 증명한 후, 물리적 세포형광측정법으로 판단), 총 림프구 수(CD3+ 유세포분석법(flow cytometry)에 의해), 및 활성화된 림프구(CD25+ CD3+ 유세포분석법에 의해)가 포함되었다.
NK 활성은 기선에서 42±5% 이었고, 5-FU 후 9±2%로 억제되었다. 저용량 TA1 처리 결과, 12일 후, NK 활성이 상당히 회복된 반면, 고용량 TA1은 단지 5일 후 상당한 회복이 달성되었다. 그러나 TA1의 연속 주입은 5일째, 반응이 2배가 되어 32±4%(vs. 고용량 주입 시는, 16±2% 이고, 저용량 주입 시는 12±3%이며, 대조군은 11±1%임). 연속 주입으로 TA1을 처리한 동물만이 기선 수준까지 NK 활성이 완전 회복되었다.
형태로 결정된 총 백혈구 수는, 14,590±2,071 세포/mm3에서 2,597±582 세포/mm3 이었다. 주사에 의한 저용량 또는 고용량 TA1 처리는 비처리된 동물에 비해 회복의 증가를 더 앞당기는 경향이 있었다. 그러나 TA1의 연속 주입은 단지 5일 후에 기선 수준으로 통계학적으로 상당하고 완전한 회복을 제공하였다.
활성화된 림프구(CD3+ CD25+)는 5-FU 처리에 의해 상당히 감소하지 않았으나(65±21 세포/mm3에서 37±10 세포/mm3로), 고용량 TA1 처리한지 12일 및 20일 후에는 그 수준이 급격히 증가하였다(각기, 297±136 세포/mm3 및 321±75 세포/mm3 대 166±70 세포/mm3 및 212±77 세포/mm3). 연속 주입에 의해 제공된 TA1은 422±105 세포/mm3 및 446±73 세포/mm3로 더욱 더 증가시켰다.
실시예 3
체중 250 내지 300g의 10주령 쥐에게 면역 억제를 위해 100㎍/kg 5-플루오로우라실(5-FU)을 투여하였다.
5-FU 치료로부터 8일 후, 쥐를 무작위로 하기 군들(n = 15) 중 하나로 정했다 :
- 대조군(염수가 있는 미니펌프)
- 고용량 TA1군, 3.5mg/Kg로 피하 주사(빈 미니펌프)
- 연속 주입 TA1군, 3.5mg/Kg/5일로 미니펌프 이용.
면역 파라미터는 기선 및 5-FU 처리(TA1 처리 1일)로부터 8일 후, 또한 TA1 처리로부터 5 및 14일 후에 결정하였다.
평가에는, 총 백혈구 수(단일클론 항체에 의한 특이성을 증명한 후, 물리적 세포형광측정법으로 판단), 과립구(FITC 안티 쥐 과립구 HIS-48을 이용하는 유세포분석법에 의해), 총 백혈구 수(유세포 분석법에 의해 CD3+) T 보조세포 림프구(CD4+ 유세포분석법에 의해), 활성화된 림프구(CD25+ CD3+ 유세포분석법에 의해) 및 혈장에서의 사이토카인 발현(IL-2 및 IFN-γ, ELISA)가 포함되었다.
실시예 2에서 피하 주사에 비해 연속 주입에 의해 제공된 TA1은 백혈구 수의 총 수에 지대한 영향을 미친다는 것을 측정한 후, 그 증가에 대해 백혈구의 유형이 어떠한 것인지를 결정하는 것이 관건이었다. 과립구는 연속 주입에 의해 제공된 TA1에 의해 가장 영향을 받는 백혈구의 부분집합으로 보인다. 과립구의 수는 5-FU 후, 4,485±1,116개에서 1,249±432개로 감소하였다. TA1 처리 결과, 5일 이내에 14,652±2,463개로 증가하였고(이에 비해, 주사에 의한 TA1의 경우는 9,924±3,218개이고, 혹은 TA1이 없는 경우는 6,954±1,519개임), 이 수준은 14일 후 여전히 최고였다.
주목컨대, 본 연구에서는, 주사(3.5mg/Kg으로) 및 연속 주입(이도 또한 3.5mg/Kg으로)의 양자 모두에 의해 TA1이 제공된 동물이 없었다. 이 동물은 건강하고 원기왕성하며, 이상 반응도 없었을 뿐만 아니라, 측정된 면역 파라미터에 대한 TA1 영향은 다른 동물들의 경우에서보다 더욱 컸다. 과립구의 경우, 본 연구에서의 동물은 5일 후, 주입된 다른 동물에서의 평균 14,652±2,463 세포/mm3에 비해, 크게 증가된 수준인 19,376 세포/mm3 이었다.
총 림프구(CD3+)의 수는 5-FU 처리에 의해 급격히 감소했다 (10,904±1,973 세포/mm3에서 1,740±560 세포/mm3로). TA1 처리로 인해, 기선 수준으로 회복되었는데, 이는 TA1이 연속 주입에 의해 제공되었을 때는 단지 5일 후에 일어났으나, TA1이 주사된 경우에는 14일까지 보이지 않았다
TA1이 주사 및 주입 모두에 의해 제공된 동물은 다른 동물들과 매우 상이하지 않은 수준을 가졌으나 (평균 9,644±961 세포/mm3에 비해, 9,765 세포/mm3), 활성화되지 않은 이들 림프구의 퍼센트는 매우 증가했다 (TA1이 주입된 동물의 경우에는 428±89, 즉 4%이고, TA1이 고용량 주사된 후 주입된 동물의 경우에는, 976, 즉 10% 임).
T 보조 림프구 (CD3+ CD4+)는 또한 5-FU의 처리에 의해 5,411±1,084 세포/mm3에서 1,710±449 세포/mm3로 억제되었다. T 세포의 상기 억제된 수준은 시험 14일 동안 TA1의 처리없이 증가하지 않았다. 과립구에서 나타난 결과, 즉 연속 주입에 의해 제공된 TA1이 주사에 의해 제공된 TA1 보다 세포 수 회복에 더 우수하다는 결과와 대조적으로, 어느 하나만의 전달 방법에 의해 제공된 TA1이 T 보조세포의 수준을 기선으로 회복시키는데 충분하였다.
주사 또는 연속 주입 중 어느 하나에 의해 제공된 TA1은 CD4+ T 보조 림프구를 증가시키기 때문에, 이 증가가, T 보조 세포의 Thl 또는 Th2 부분집합에 대한 영향에 기인한 것인지 아닌지를 결정하는 것이 관건이다. 이전의 생체 외 및 생체 내 데이터는, TA1이 T 세포의 Th1 부분집합을 증가시키는 것을 증명하였고, 본 연구에서 동일한 효과가 나타났다. 연속 주입으로 TA1을 제공함으로써, 피하 주사 후에 나타나는 것보다 Th1 사이토카인 IL-2의 혈장 수준이 더욱 더 증가하게 되었다 (TA1 주사의 경우에는 21±16pg/ml 이고, 또한 대조군 동물의 경우에는 10±16pg/ml인 것에 비해, TA1 연속 주입한지 14일 후에는 42±7pg/ml 임).
TA1 처리로써, Thl 사이토카인 IL-2가 증가하게 되고, TA1은 또다른 Thl 사이토카인인 IFN-γ을 증가시킨다. 수준이 낮으나, TA1 피하 주사 처리한지 5일 후에는, IFN-γ의 혈장 수준이 더 높아진다. 처리 후 14일경에는, 연속 주입에 의해 TA1이 제공된 동물이 최고 수준을 가졌다 (주사의 경우에는 10±1pg/ml 이거나, 혹은 대조군의 경우에는 8±8pg/ml인 것에 비해, 연속 주입의 경우에는 14±5pg/ml 임).
주사 및 연속 주입 모두에 의해 TA1이 제공된 동물은 측정된 Th1 사이토카인, 특히 IFN-γ의 양자 모두의 수준이 더 컸고, 이는, 다른 동물들의 경우 14±5pg/ml인 것에 비해, 14일 후 45pg/ml 이었다.
결론 :
- 순환에서 많은 일수동안 TA1의 일정한 수준을 유지함은 측정된 면역학적 효과를 증가시킨다.
- 이 투여계획은 TA1의 주사 후 나타나는 단핵세포들에 대한 포지티브 효과 뿐만 아니라, 과립구에 대해서도 기대치못한 포지티브 효과를 가져온다.
- TA1를 통상적인 수준의 15배를 투여했을 경우(또한 한 동물의 경우, 통상적인 수준의 30배를 투여함)에서도, 이상 반응이 관찰되지 않았다.

Claims (23)

  1. 결합체를 환자에게 투여 시, 환자의 혈청 내에 TA1 펩티드의 반감기를 증가시키는 물질에 결합된 티모신 알파 1(TA1)을 포함하는 생리학적 활성 결합체가 포함된 약제학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 물질이 실질적으로 비항원성 중합체인 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 중합체가 PEG인 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 PEG가 약 200 내지 300,000 범위 내의 분자량을 가지는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 분자량이 약 5,000 내지 35,000인 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 분자량이 약 20,000인 조성물.
  7. 제 2 항에 있어서, 상기 중합체가 TA1 펩티드의 N-말단 위치에 결합된 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 TA1이 TA1인 조성물.
  9. 실질적으로 비항원성인 중합체를 티모신 알파 1 펩티드에 결합시키는 것을 포함하는 제 2 항에 기재된 조성물의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 중합체가 티모신 알파 1의 N-말단 위치에 결합되는 제 2 항에 기재된 조성물의 제조 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 중합체가 PEG인 제 2 항에 기재된 조성물의 제조 방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 PEG가 약 200 내지 300,000 범위 내의 분자량을 가지는 제 2 항에 기재된 조성물의 제조 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 분자량이 약 5,000 내지 35,000인 제 2 항에 기재된 조성물의 제조 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 분자량이 약 20,000인 제 2 항에 기재된 조성물의 제조 방법.
  15. 제 9 항에 있어서, 상기 티모신 알파 1 펩티드가 TAl인 제 2 항에 기재된 조성물의 제조 방법.
  16. 결합체를 환자에게 투여 시, 환자의 혈청 내에 TA1 펩티드의 반감기를 증가시키는 물질에 결합된 티모신 알파 1(TA1)을 포함하는 생리학적 활성 결합체가 포함된 약제학적 조성물을 면역 자극 유효량으로 환자에게 투여함으로써 면역 자극이 필요한 환자를 치료하는 것을 포함하는 제 1 항에 기재된 조성물의 투여 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 물질이 실질적으로 비항원성 중합체인 제 1 항에 기재된 조성물의 투여 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 중합체가 PEG인 제 1 항에 기재된 조성물의 투여 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 PEG가 약 200 내지 300,000 범위 내의 분자량을 가지는 제 1 항에 기재된 조성물의 투여 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 분자량이 약 5,000 내지 35,000인 제 1 항에 기재된 조성물의 투여 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 분자량이 약 20,000인 제 1 항에 기재된 조성물의 투여 방법.
  22. 제 17 항에 있어서, 상기 중합체가 TA1 펩티드의 N-말단 위치에 결합되는 제 1 항에 기재된 조성물의 투여 방법.
  23. 제 16 항에 있어서, TA1 펩티드가 TA1인 제 1 항에 기재된 조성물의 투여 방법.
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