KR101745520B1

KR101745520B1 - 신규한 tlr4 길항제

Info

Publication number: KR101745520B1
Application number: KR1020150076101A
Authority: KR
Inventors: 최상돈; 유태현; 박설희
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2017-06-12
Also published as: EP3305803B1; US20180148487A1; WO2016195159A1; EP3305803A1; CN107922460A; US10435443B2; JP2018525326A; JP6576471B2; ES2791954T3; KR20160140031A; CN107922460B; EP3305803A4

Abstract

본 발명은 TLR4 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 TLR4 길항제, 상기 펩타이드를 포함하는 자가면역 질환 및 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 펩타이드는 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 유도되는 TLR4 신호전달 경로를 억제함으로써 인터루킨-6(IL-6), NO 및 ROS의 분비와 NFκB와 MAPKs의 활성화를 억제하는 효과가 우수한바, TLR4 신호전달 경로에 의해 발생하는 자가면역 질환 및 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

신규한 TLR4 길항제{Novel TLR4 antagonist}

본 발명은 TLR4 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 TLR4 길항제, 자가면역 질환 및 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 TLR4/MD2 복합체에 결합하여 인터루킨-6(IL-6), NO 및 ROS의 분비와 NFκB와 MAPKs의 활성화를 억제하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 TLR4 길항제, 자가면역 질환 및 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

선천적 면역은 포유류의 면역 시스템에서 세균 감염에 대항하는 첫 번째 방어 작용으로 톨-유사 수용체(TLRs; Toll-like receptors, 이하 TLRs이라 한다)와 같은 패턴 인식 수용체가 병원균-연관 분자 패턴(PAMPs; pathogen-associated molecular patterns)이나 위험-연관 분자 패턴(DAMPs; danger-associated molecular patterns)을 인식함으로써 활성화된다.

TLRs는 선천적 면역 반응에서 중요한 역할을 하며, TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 및 TLR11을 포함하는 원형질막에서 작용을 하는 세포 밖 TLRs와 TLR3, TLR7, TLR8 및 TLR9를 포함하는 리소좀이나 엔도솜과 같은 세포 내에서 작용을 하는 세포 내 TLRs로 나눌 수 있다. 구조적으로, TLRs는 세포 밖 도메인의 N-말단에 리간드 또는 부속분자(accessory molecule)에 의해 인식되는 루신고반복(LRR; leucine-rich repeat) 부위를 가지고 있으며, 세포 내 부분의 C-말단에 신호를 전달하는 톨/인터루킨 1 수용체(TIR; Toll/interleukin 1 receptor) 도메인을 가지고 있다.

특히, 톨-유사 수용체 4(TLR4; Toll-like receptor 4, 이하 TLR4라 한다)는 TLR 패밀리에서 처음으로 규명된 수용체로서, MyD88(myeloid differentiation 88)-의존 신호전달 과정 및 MyD88-비의존 신호전달 과정을 통해 증폭되는 선천적 면역 시그널링을 활성화시킨다. 이러한 TLR4의 역할로 인해 여러 면역 질병을 치료하기 위한 타겟으로 TLR4을 활용하기 위한 연구에 대한 관심이 높아지고 있는 추세이다. LPS(lipopolysaccharide)-결합 단백질(LBP), CD 14(cluster of differentiation 14) 및 MD2(myeloid differentiation factor 2)와 같은 부속 분자를 통해 인식된 LPS는 TLR4를 활성화시킨다. 활성화된 TLR4는 Myd88-의존 신호전달 과정을 통해 NFκB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)의 초기 활성화 및 핵으로의 이동을 유도하고, MAPKs(mitogen-activated protein kinases)의 활성화를 유도한다. 상기 NFκB와 MAPKs의 활성화는 TNF-α(tumor necrosis factor α), IL-1β(interleukin 1β) 및 IL-6(interleukin 6)와 같은 염증성 사이토카인을 분비시킨다. MyD88-비의존 신호전달 과정은 트램/트리프(TRAM/TRIF), 인터페론-조절자(IRFs; interferon-regulatory factors) 및 NFκB의 활성화에 의해 유도되어 타입 1 인터페론을 분비시킨다. 또한, LPS에 의해 유도된 TLR4는 대식세포에서 일산화질소(이하, NO라 한다)와 활성산소(이하, ROS라 한다)와 같은 산화 스트레스성 물질을 생성한다.

이와 같이 TLR4는 자가면역 질환, 염증성 질환 및 암과 같은 다양한 질환을 치료하기 위한 타겟이 될 수 있으므로 TLR4를 타겟으로 하는 물질과 TLR4와 관련된 질병을 치료하기 위한 의학적 조성물에 대한 연구가 이루어지고 있다. 특히, 지질 A(lipid A)의 주요 골격 구조를 변형함으로써 많은 수의 TLR4 촉진제와 길항제를 얻었으며, 에리토란(eritoran), 지질 A(lipid A) 및 Rhodobacter sphaeroids 지질 A(RsLA)가 LPS와 MD2의 상호작용을 억제하고 쥐에서 LPS로 유도된 쇼크를 예방할 수 있음이 밝혀졌다.

한편, 효모 2-잡종 분석법(yeast two-hybrid assay)와 파지 디스플레이(phage display)와 같은 다양한 기술을 통해 병원균-연관 분자 패턴(PAMPs)과 유사하거나 반대되는 작용을 하고, 타겟 단백질들과 상호작용을 할 수 있는 작은 펩타이드를 발굴하고 있으며, 치료와 백신 보조제에 관한 분야에서 이러한 펩타이드를 활발히 연구하고 있다. 펩타이드들은 일반적인 치료제에 비해 부작용이 적고, TLRs를 활성화시키는 균의 지질 또는 단백질을 제거하는 것과 같은 변형이 수월한 것으로 알려져 있다.

그러나 여전히 TLR4 신호전달 경로를 효과적으로 차단할 수 있으며 이를 통해 관련 질환을 치료할 수 있는 새로운 길항제에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.

본 발명자들은 서열번호 1 내지 3의 펩타이드가 리포폴리사카라이드(LPS; lipopolysaccharide)에 의해 유도된 TLR4 신호전달 경로를 억제하여 인터루킨-6(IL-6), NO 및 ROS의 분비와 NFκB와 MAPKs의 활성화를 억제하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드 및 이를 포함하는 신규한 TLR4 길항제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는 TLR4 길항제를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 펩타이드는 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 유도되는 TLR4 신호전달 경로를 억제함으로써 인터루킨-6(IL-6), NO 및 ROS의 분비와 NFκB와 MAPKs의 활성화를 억제하는 효과가 우수한바, TLR4 신호전달 경로에 의해 발생하는 자가면역 질환 및 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 재조합 인간 TLR4/MD2 복합체에 대한 15-머 및 12-머 펩타이드 라이브러리의 바이오패닝의 각 라운드별 아웃풋/인풋 비율을 나타낸 도이다(가로축의 1R 내지 5R은 바이오패닝의 각 라운드를 의미한다).
도 2는 HEK-Blue^TM hTLR4 세포에 농도를 달리하여 TAPs(TAP1, TAP2 및 TAP3)를 또는 TAPs와 LPS를 함께 처리한 경우 SEAP 활성을 나타낸 도이다.
도 3은 쥐 대식세포인 RAW264.7 세포에 농도를 달리하여 TAPs를 또는 TAPs와 LPS를 함께 처리한 경우 IL-6 분비량을 나타낸 도이다.
도 4는 쥐 대식세포인 RAW264.7 세포에 농도를 달리하여 TAPs를 또는 TAPs와 LPS를 함께 처리한 경우 NO 분비량을 나타낸 도이다.
도 5는 쥐 대식세포인 RAW264.7 세포에 농도를 달리하여 TAPs를 또는 TAPs와 LPS를 함께 처리한 경우 iNOS 발현량을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 쥐 대식세포인 RAW264.7 세포에 TAPs를 또는 TAPs와 LPS를 함께 처리한 경우 세포질에서의 NO 발생량을 나타낸 도이다.
도 7은 쥐 대식세포인 RAW264.7 세포에 TAPs를 또는 TAPs와 LPS를 함께 처리한 경우 DCF-DA로 염색된 세포 수와 세포질 내 ROS의 발생량을 나타낸 도이다.
도 8은 쥐 대식세포인 RAW264.7 세포에 TAPs를 또는 TAPs와 LPS를 함께 처리한 경우 MitoSOX로 염색된 세포 수와 미토콘드리아의 ROS의 발생량을 나타낸 도이다.
도 9는 쥐 대식세포인 RAW264.7 세포에 TAPs를 또는 TAPs와 LPS를 함께 또는 TAPs와 PAM₃CSK₄를 함께 처리한 경우 NFκB의 활성을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 쥐 대식세포인 RAW264.7 세포에 TAPs를 또는 TAPs와 LPS를 함께 처리한 경우 MAPKs의 활성을 알아보기 위해 ERK, JNK, p38의 인산화된 정도 및 ATF3의 발현 정도를 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 HEK-Blue^TM hTLR4 세포에 LPS를 또는 TAPs와 LPS를 함께 처리한 경우 NFκB가 세포질에서 핵으로 이동하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 TAPs 및 TLR4에 의해 유도되는 신호전달 과정을 모식적으로 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 제공한다.

본 발명에서 용어, “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법에 따라 제조될 수 있으며, 바람직하게는 고체상 합성 기술에 따라 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 용어, “TLR4”는 병원체 감염에 대한 감시자로서 기능하는 막관통(tranmembrane) 단백질 패밀리인 TLRs에 속하는 단백질로서, TLR4 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 말하며, CD 284(cluster of differentiation 284)로 명명되기도 한다. 상기 TLR4는 그람-음성 박테리아의 LPS를 비롯한 다양한 PAMPs(pathogen-associated molecular patterns)를 인지하기 때문에 선천성 면역 시스템의 활성화에 매우 중요하다.

본 발명에서 용어, “TLR4 신호전달 경로”는 TLR4를 통한 신호전달 경로를 말하며, TLR4 및 MD2에 의해 형성된 막-횡단 복합체인 TLR4/MD2 복합체에 의존하는 LPS 반응일 수 있으며, 이를 통해 신호가 전달된다. TLR4는 여러 가지 어댑터 단백질에 의해 신호를 전달하며, 상기 신호전달 경로는 Mal(TIRAP로도 지칭됨)과 MyD88, 및 트램(TRAM)과 트리프(TRIF)로 작동한다. 활성화된 TLR4는 Myd88-의존 신호전달 과정을 통해 NFκB를 활성화시켜 핵으로 이동시키며, MAPKs의 활성화를 유도한다. 상기 NFκB와 MAPKs의 활성화로 인해 TNF-α, IL-1β 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인이 분비되고, 대식세포에서 일산화질소(이하, NO라 한다)와 활성산소(이하, ROS라 한다)와 같은 산화 스트레스성 물질을 생성한다. 또한, 트램/트리프(TRAM/TRIF), 인터페론-조절자(IRFs) 및 NFκB의 활성화에 의해 MyD88-비의존 신호전달 과정이 유도되어 타입 1 인터페론이 분비된다.

본 발명에서 용어, “억제”는 결핍, 부조화, 그 밖의 많은 원인에 의하여 생물 활동이나 활성이 저하되는 현상을 말하며, TLR4의 활성을 부분적으로 또는 완전히 블로킹하거나, 감소시키거나, 예방하거나, 활성화를 지연시키거나, 불활성화시키거나 또는 하향 조절하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, “TLR4/MD2 복합체”는 TLR4 및 MD2에 의해 형성된 막-횡단 복합체를 의미하며, 본 발명의 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 펩타이드는 TLR4/MD2 복합체에 결합함으로써 TLR4 신호전달 경로를 억제할 수 있다.

따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 펩타이드의 TLR4 신호전달 경로 억제용도를 제공한다.

본 발명의 “서열번호 1 내지 3으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 펩타이드”는 TLR4/MD2 복합체에 효과적으로 결합하는 능력을 갖는 한, 서열번호 1 내지 3의 서열과 동일한 펩타이드 뿐만 아니라, 이의 아미노산이 보존적 치환에 의하여 치환된 펩타이드, 이와 서열 상동성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상인 펩타이드를 모두 포함할 수 있다. 상기 용어 "상동성"이란 야생형(wild type) 아미노산 서열 및 야생형 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것을 말한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 펩타이드는 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 유도되는 TLR4 신호전달 경로를 억제함으로써 인터루킨-6(IL-6), NO 및 ROS의 분비와 NFκB와 MAPKs의 활성화를 억제하는 효과가 우수한바, TLR4 신호전달 경로에 의해 발생하는 자가면역 질환 및 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 TLR4 길항제를 제공한다.

본 발명에서 용어, “길항제”는 임의의 메커니즘에 의하여, 수용체 또는 세포 내 매개체와 같은 다른 분자의 영향을 부분적으로 또는 완전히 저해하는 분자를 의미한다.

본 발명에서 용어, “TLR4 길항제”는 TLR4의 생물학적 활성을 직간접적으로, 또는 실질적으로 방해, 감소 또는 저해할 수 있는 물질을 말하며, 바람직하게는 TLR4와 반응성인 펩타이드는 TLR4 또는 TLR4/MD2 복합체에 직접 결합하고, TLR4의 활성을 중화시킴으로써 TLR4 신호전달 경로를 차단하여, NFκB 및 MAPKs의 활성화의 감소를 유발해 염증성 사이토카인, NO 및 ROS의 분비를 감소시킬 수 있다.

이에, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, “자가면역 질환”은 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 발생하여 자기항원에 대한 면역반응이 일어나, 이로 인해 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는 과정에 의해 발병되는 질환을 의미한다. 상기 자기관용이란 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness)을 말한다. 본 발명의 자기면역 질환은 인슐린-의존성 당뇨병, 다발 경화증, 실험적 자가면역 뇌척수염, 류마티스성 관절염, 실험적 자가면역 관절염, 중증 근무력증, 갑상선염, 실험적 형태의 포도막염, 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종, 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 애디슨 질환, 조기 폐경, 남성 불임증, 소아 당뇨병, 굿파스처 증후군, 보통 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소, 원발성 담관 경화증, 만성 활동성 간염 Hbs-ve, 잠재성 간경변증, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 경피증, 베게너 육아종증, 다발근육염/피부근육염, 원판상 LE 및 전신 홍반 루푸스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 펩타이드를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 자가면역 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

상기 “약학적으로 허용되는” 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 펩타이드와 함께 자가면역 질환 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 인간을 제외한 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 자가면역 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, “염증성 질환”은 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α, IL-1, IL-6, 프로스타글란딘(prostaglandin), 루코트리엔(leukotriene) 또는 NO와 같은 염증 유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 의미하며, 본 발명의 염증성 질환은 천식, 습진, 건선, 알러지, 류마티스 관절염, 건선 관절염(psoriatic arthritis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염, 알레르기성 피부염, 만성 부비동염, 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 폐염증, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 패혈증, 맥관염, 활액낭염, 루프스, 류마티스 다발성 근육통, 측두 동맥염, 다발성 경화증, 고형암, 알쯔하이머병, 동맥경화증, 비만 및 바이러스 감염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 상술한 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 제제를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 조성물과 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : TLR4/MD2 특이적 펩타이드 선별

TLR4/MD2 복합체에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하기 위해 15-머(mer) 펩타이드는 fUSE55, 12-머(mer) 펩타이드는 pHEN2 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하고, 파지 디스플레이법(phage display method)을 수행하였다.

실시예 1-1 : 라이브러리 제작

먼저, 15-머(mer) 펩타이드 라이브러리를 제작하기 위하여 정방향 프라이머 5'-TTG ATC GCA AGG ATC GGC TAG C-3' 역방향 프라이머 5'-AA GGC CTT GGT ACC GCT GCC ACC (MNN)₁₅ GCT AGC CGA TCC TTG CGA TCA A-3'및 Pfu DNA 중합효소(SolGent, Daejeon, Korea)를 이용하여 90℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 60초간 연장하는 과정을 25회 반복하여 만들어진 DNA 가닥을 NheⅠ/KpnⅠ으로 자른 뒤 T4 DNA 리가아제(New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA)를 사용하여 fUSE55 벡터 안으로 연결시켰다. 3개의 DNA 라이브러리를 일렉트로컴피턴트 대장균 세포(electrocompetent E.coli cells)인 DH10B 균주 내로 옮겨 결과적으로 6.6 X 10⁷ 개의 클론을 만든 뒤, 대장균 균주 TG-1에서 증폭시키고 번식시켰다.

또한, 무작위적인 12-머(mer) 펩타이드 라이브러리를 제작하여 pHEN2의 pⅢ 지역에 삽입하기 위해 정방향 프라이머 5'-GCC CAG CCG GCC ATG GCC (NNK)₁₂ TCG AGT GGT GGA GGC GGT TCA G-3' 역방향 프라이머 5'-GCC AGC ATT GAC AGG AGG TTG AG-3'및 Pfu DNA 중합효소를 이용하여 상기와 같은 조건의 과정을 25회 반복하여 3번의 독립적인 PCR을 수행하였다. 상기 PCR의 결과물을 NheⅠ/KpnⅠ으로 자른 뒤 T4 DNA 리가아제를 사용하여 pHEN2 벡터 안으로 연결시키고 상기 라이브러리 DNA들을 일렉트로컴피턴트 대장균 세포(electrocompetent E.coli cells)인 XL-1 Blue(Stratagene, Santa Clara, CA, USA) 균주 내로 도입시켰다. 파지들(pahge particle)은 하이퍼파지 M13K07△pⅢ(PROGEn Biotechnik GmbH, Heidelberg, Germany)를 사용하여 2.0 X 10⁹개의 다양한 클론들을 가지도록 제작하였으며, 그 뒤 대장균 균주 XL-1에서 증폭시켰다.

실시예 1-2 : 바이오패닝(Biopanning)

변형된 그리핀-1 라이브러리(Griffin-1 library)(Griffin H., MRC, Cambridge, UK, unpublished data)에서 바이오패닝(Biopanning)을 수행하였다. 보다 구체적으로, 코트된 버퍼에서 리서스펜드된 재조합 인간 TLR4/MD2 복합체(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA) 5 ㎍/ml을 넌크 맥티소프 96-웰 플레이트(Nunc Maxisorp 96-well plate)(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)로 코트한 후 하룻밤 동안 냉장시켰다. 그런 다음, 상온에서 2시간동안 PBS에서 1% BSA로 블로킹한 후, 최종 농도가 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS(PBST)에서 BSA 농도가 1%가 되게끔 상온에서 2시간동안 상기 냉장시킨 웰들을 파지 라이브러리에 노출시켰다. 라이브러리에 결합된 파지들은 용출완충액(100mM HCl) 100㎕으로 녹여서 분리하고 PBST로 워싱한 후 pH 11을 나타내는 1M Tris HCl의 1/8 부피로 중화시켰다. 15-머(mer) 라이브러리용 파지 타이터(titer)는 200 ㎍/ml의 테트라사이클린(Tet, tetracycline)과 10 ㎍/ml의 엠피실린(Amp, ampicillin)을 포함하는 LB(Luria-Bertani) 한천 플레이트 위의 대장균 TG1에서, 12-머(mer) 라이브러리용은 대장균 상기 한천 플레이트 위의 XL-1 Blue에서 CFU로 계산하였다. 이 후, 파지를 대장균 TG1, Xl1 Blue에서 증폭시키고, PEG(polyethylene0glycol)/NaCl 침전을 통해 계속되는 패닝 라운드동안 정제하였다. 총 5 라운드의 각 라운드에서 인풋-아웃풋 비율은 농축 효율을 측정하여 계산하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 15-머 양성 및 12-머 양성 펩타이드 라이브러리의 재조합 인간 TLR4/MD2 복합체에 대한 아웃풋/인풋 비율이 라운드를 거듭할수록 더 증가하였으며, 이를 통해 본 발명에 따른 5 라운드의 바이오패닝의 효율이 뛰어남을 알 수 있다.

실시예 1-3 : TLR4/MD2 복합체에 대한 높은 결합 친화도를 보이는 파지 스크리닝

상기 실시예 1-2에서 감염된 세포의 분리된 독립형 클론을 15-머 라이브러리의 LB/Tet와 12-머 라이브러리의 LB/Amp 한천 플레이트에서 U-바텀(bottom) 96-웰 플레이트로 모았다. 그런 다음, 5번의 바이오패닝 라운드 후 37 ℃에서 하룻밤 동안 키우고, 이를 LB/Tet나 LB/Amp 한천 플레이트에 놓은 뒤, 상층액의 파지 제제를 얻기 위해 30 분에 3000g의 조건으로 원심 분리시켰다. 파지-결합 친화도를 측정하기 위해 PBS에 2% BSA가 포함된 바인딩 버퍼(binding buffer)와 동일한 부피로 섞여있는 상기 상층액을 1.25 ㎍/ml의 TLR4/MD2-양성 96-웰 플레이트와 TLR4/MD2-음성 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 상기 웰들을 2시간동안 블로킹 버퍼(2% BSA가 포함된 PBST)로 블로킹한 후, PBS로 워싱하였다. 상온에서 1시간동안 결합 반응을 시킨 뒤, 결합하지 않은 파지는 PBST로 워싱하여 제거하고, 결합한 파지들은 HRP(horseradish peroxidase)에 컨쥬게이션된 항-M13 항체 100 ㎕로 배양한 후 결합하지 않은 여분의 파지들을 PBST로 워싱하여 제거함으로써 결합한 파지들을 검출하였다. 이 후, 테트라메틸벤지딘 100 ㎕(Thermo Fisher Scientific Inc.)를 각 웰에 첨가한 후 상기 혼합물을 색 변화가 나타날 때까지 상온에 둔 다음, 반응을 멈추기 위해 1N H₃PO₄ 100 ㎕를 첨가하였다. ELISA (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정함으로써 높은 결합 친화도를 보인 파지를 선택하고 선택된 파지들을 하기 실험에 사용하였다.

실시예 2 : DNA 시퀀싱 및 TAPs 합성

상기 실시예 1-3에서 선택된 파지에서 파지 DNA를 분리하기 위해 미니프레프 키트(Miniprerp Kit)(GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하였고, 15-머 DNA는 5'-TGA ATT TCC TGT ATG AGG-3'의 염기서열을 갖는 프라이머를, 12-머 DNA는 5'-TTG TGA GCG GAT AAC AAT TTG-3'의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 마크로젠(Macrogen, Inc., Seoul, Korea)으로 DNA 시퀀싱을 하였다. 상기 시퀀싱을 통해 확인한 DNA 염기서열을 아미노산 서열로 번역하고, 바이오에디트 소프트웨어(Bioedit software)를 사용하여 변이를 측정한 뒤 정렬하였다. 그런 다음, TLR4/MD2에 높은 결합 친화도를 보이는 표 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드(TAPs; TLR4 agonistic peptides로서 TAP1, TAP2 및 TAP3을 총칭하며, 이하 TAPs라 한다)를 95% 이상의 순도를 갖도록 펩트론(PEPTRON)(Daejeon, Korea)에서 합성하고, 최종 농도가 10 mg/ml가 되도록 TAP1은 물에, TAP2와 TAP3는 다이메틸 설폭사이드에 녹인 후 -20℃에서 적당히 엘리쿼트(aliquote)하여 보관하였다.

실시예 3 : 세포 배양 및 준비

HEK-Blue^TM hTLR4 세포(InvivoGen, San Diego, CA, USA)를 10%의 소 태아 혈청(FBS; fetal bovine serum)(Thermo Fisher Scientific Inc.), 50 IU/ml의 페니실린, 50 ㎍/ml의 스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific Inc.), 100 mg/ml의 노모신(normocin)(InvivoGen) 및 항생제의 HEK-Blue 혼합물(500 ml 당 2ml)(InvivoGen)이 첨가된 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium)(Thermo Fisher Scientific Inc.) 배지에 넣고, 5% CO₂, 37 ℃의 습한 조건의 배양 시스템(Thermo Fisher Scientific Inc.)에서 배양하였다. 쥐 대식세포인 RAW264.7 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)는 10%의 FBS, 100 IU/ml의 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신이 첨가된 저당 DMEM(Low-Glucose DMEM)(Thermo Fisher Scientific Inc.)에 넣고, 배양 시스템에서 배양하였다. LPS는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서, PAM₃CSK₄는 InvivogGen에서 구입하였다.

실험예 1 : TAPs의 TLR4/MD2-결합 친화도 확인

TAPs(TAP1, TAP2, TAP3)의 TLR4/MD2-결합 친화도를 확인하기 위해 상기 실시예 3에서 배양한 HEK-Blue^TM hTLR4 세포에서 NFκB의 활성을 측정하였다. NFκB와 AP-1(activator protein 1)의 DNA가 결합하는 부위를 포함하는 IL-12 p40 미니멀 프로모터(IL-12 p40은 TLR4의 자극 후 NFκB와 AP-1의 활성화에 의해 생성된다)의 조절 부분 아래에 유도성 SEAP(secreted embryonic alkaline phosphatase) 리포터 유전자를 위치시켰다. 그 후, TAPs의 농도를 10, 50, 100 ㎍/ml로 다양하게 하여 HEK-Blue^TM hTLR4 세포에 처리한 다음, SEAP 활성의 평균값을 계산하여 TLR4의 활성을 측정하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 오직 TAPs만을 첨가한 경우 SEAP의 활성은 큰 변화가 없으나, TAPs를 처리한 후 LPS로 TLR4을 자극하였을 때, LPS에 의해 유도된 SEAP 활성이 농도 의존적으로 감소하였다. 이를 통해 본 발명의 TAPs는 TLR4/MD2 길항제로 작용하여 LPS에 의해 유도되는 NFκB의 활성을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있다.

실험예 2 : TAPs가 IL-6 및 NO 분비와 ROS 발생에 미치는 영향

상기 실시예 2에서 제조한 TAPs를 상기 실시예 3에서 배양한 쥐 대식세포인 RAW264.7 세포에 처리하였을 때 IL-6(interleukin-6)와 NO(Nitric Oxide)의 분비 및 세포질과 핵 내의 ROS(reactive oxygen species)의 발생이 억제되는지를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험예 2-1 : TAPs가 IL-6 및 NO 분비에 미치는 영향

상기 실시예 2에서 제조한 TAPs를 처리한 상기 실시예 3의 RAW264.7 세포의 배양 상층액의 IL-6, NO 수치를 쥐 IL-6 ELISA 키트 Ready-SET-Go!(eBioscience San Diego, CA, USA)와 NO 검출 키트(iNtRON Biotechnology, Gyeonggi, Korea)를 사용하여 측정하였다. 마이크로플레이트 리더 분광 광도계(Molecular Devices In.)를 사용하여 IL-6는 450nm, NO는 540nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 소프트맥스 프로 5.3 소프트웨어(Molecular Devices Inc.)를 사용하여 분석하여 도 3 및 4에 나타내었다.

도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 오직 TAPs만을 첨가한 경우 IL-6 및 NO의 분비량에는 큰 변화가 없으나, TAPs와 LPS를 함께 처리하였을 때, IL-6 및 NO의 분비량이 감소함을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 TAPs가 LPS에 의해 유도된 IL-6 및 NO의 분비를 억제하는 것을 알 수 있다.

실험예 2-2 : iNOS(inducible nitric oxide synthase)의 웨스턴 블롯팅

웨스턴 블롯팅을 수행하기 위해 전-단백질 추출 용액(M-PER, Thermo Fisher Scientific Inc.)을 프로테아제 및 포스파타아제 억제 혼합물과 섞어 상기 실시예 3의 RAW264.7 세포 펠릿(pellet)에 첨가하였다. 상기 펠릿을 10분간 냉각시킨 후 10분 동안 16000 X g에서 상기 용해물을 원심 분리하였다. 그런 다음, NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약(Thermo Fisher Scientific Inc.)을 사용하여 세포질과 핵의 단백질을 각각 추출하고, BCA 키트(Sigma-Alderich Co. LLC)를 사용하여 상기 단백질의 농도를 측정하였다. 이 후, 동일한 양의 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 전개하고, Hybond-ECL 니트로셀룰로스 막(Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ, USA)으로 옮겼다. 상기 막을 1시간 동안 탈이온수에서 0.05% 탈지 분유로 블로킹한 후, 1차 항체로 4℃의 온도에서 하룻밤 동안 가볍게 쉐이킹하여 면역블롯팅하였다(상기 1차 항체는 iNOS(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 및 β-액틴(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA)에 대한 항체이다). 그런 다음, PBST로 철저히 쉐이킹한 후 상기 막을 항-쥐/-토끼 HRP-컨쥬게이티드 2차 항체(Thermo Fisher Scientific Inc.)와 함께 2시간 동안 배양하고, SuperSignal West Pico ECL 용액(Thermo Fisher Scientific Inc.)으로 단백질을 검출하고 Fuji LAS-3000 시스템(Fujifilm, Tokyo, Japan)으로 상기 단백질을 시각화하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군인 β-액틴과 비교했을 때, LPS 첨가 시, iNOS의 발현이 증가하였으나, 여기에 TAPs를 함께 처리하면, iNOS의 발현이 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명에 따른 TAPs가 LPS에 의해 유도된 iNOS의 발현을 억제하는 것을 알 수 있다.

실험예 2-3 : TAPs가 NO 및 ROS 발생에 미치는 영향

또한, 상기 실시예 2에서 제조한 TAPs가 세포질에서 NO 및 ROS(reactive oxygen species) 발생에 미치는 영향을 확인하기 위해 상기 실시예 3에서 배양한 쥐 대식세포인 RAW264.7 세포에 TAPs를 처리하고, 각각 DAF-FM(Invitrogen Corp., CA, USA), DCF-DA(Invitrogen Corp.) 및 MitoSOX(Invitrogen Corp.)로 염색한 후, 1시간동안 배양하였다. 그 후, 5분당 200X g으로 원심 분리하여 거둬들이고 갈색 튜브에 옮겨 4℃의 온도에서 PBS에 보관하였다. 상기 DAF-FM 염색으로 NO를, DCF-DA 염색으로 세포질의 ROS를, MitoSOX 염색으로 미토콘드리아의 ROS를 각각 정량화하였다. 디바 소프트웨어로 FACSAria Ⅲ를 사용하여 DAF-FM, DCF-DA 및 MitoSOX 형광물질의 강도를 측정하여 상기 정량화를 하였으며, WinMDI 소프트웨어를 사용하여 이미지를 얻고, 그 결과를 도 6 내지 8에 나타내었다.

도 6 내지 8에 나타낸 바와 같이, LPS 첨가 시, 세포질 내에서 NO와 ROS, 핵 내에서 ROS의 발생 정도가 증가하였으나, 여기에 TAPs를 함께 처리하면, NO와 ROS의 발생 정도가 농도 의존적으로 감소하였다. 이를 통해, 본 발명에 따른 TAPs가 세포질 및 핵 내에서 LPS에 의해 유도된 NO와 ROS의 발생을 억제하는 것을 알 수 있다.

실험예 3 : TAPs가 NFκB 및 MAPKs의 활성에 미치는 영향

상기 실시예 2에서 제조한 TAPs가 NFκB 및 MAPKs의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

실험예 3-1 : NFκB 및 MAPKs의 웨스턴 블롯팅

상기 실시예 2에서 제조한 TAPs가 NFκB 및 MAPKs의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅을 상기 실험예 2-2와 같은 방법으로 수행하였다. 이 때 사용한 1차 항체는 HDAC1(Merck Millipore, Billerica, MA, USA), NFκB (p65), IκBα, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-p38, p38, ATF3 및 β-액틴(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA)에 대한 항체이며, 2차 항체는 항-쥐/-토끼 HRP-컨쥬게이티드 2차 항체(Thermo Fisher Scientific Inc.)이다. 웨스턴 블롯팅을 수행하여 얻은 결과를 도 9 및 10에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군인 쥐 대식세포인 RAW264.7 세포에 오직 LPS만을 처리한 경우, NFκB의 활성이 증가하여 IκBα가 분해된 반면, TAPs를 함께 처리한 경우, NFκB의 활성이 억제되어 IκBα가 분해되는 정도가 감소하였다. 특히, TLR1/2의 리간드인 PAM₃CSK₄를 TAPs와 함께 처리하였을 때, NFκB의 활성 및 IκBα의 분해 정도에 영향이 없었다. 이를 통해 본 발명에 따른 TAPs는 TLR4에 특이적으로 결합하여 LPS에 의해 유도된 NFκB의 활성을 억제하는 것을 알 수 있다.

또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 대조군인 쥐 대식세포인 RAW264.7 세포에 오직 LPS만을 처리한 경우, MAPKs의 활성이 증가하여 ERK, JNK, p38이 인산화되고 ATF3의 발현이 증가하지만, TAPs를 함께 처리한 경우, MAPKs의 활성이 억제되어 상기 효소들의 인산화된 정도가 감소하였고 ATF3 발현량도 감소하였다. 이를 통해, 본 발명에 따른 TAPs는 LPS에 의해 유도된 MAPKs의 활성 및 ATF3 발현을 억제하는 것을 알 수 있다.

실험예 3-2 : NFκB의 핵으로의 이동 여부 확인

상기 실시예 3에서 배양한 HEK-Blue^TM hTLR4 세포를 10⁴/well의 96-웰 플레이트에 시딩한 후 2일 동안 인큐베이터에서 키웠다. 상층액을 교환한 뒤, 상기 인큐베이터 안의 세포에 각각 TAPs를 처리하고 1시간 후 20 ㎍/ml의 LPS를 각각 처리하였다. 그 후, 상기 HEK-Blue^TM hTLR4 세포를 10분 동안 3.7% 포름알데히드로 고정하고, 15분 동안 0.2% 트리톤 X-100에 침지한 후 1시간 동안 5.0% FBS로 블로킹하였다. 상기 블로킹된 세포들을 1시간 동안 1차 항체와 함께 배양한 다음, 1시간 동안 AlexaFluor 546-컨쥬게이션된 2차 항체(Invitrogen Corp.)와 함께 배양하였다. 이 후, 5 μM의 Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich Co.)을 이용하여 상온에서 30분간 염색을 하고, 공초점 현미경(LSM-700, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Germany)을 사용하여 상기 형광 염색된 세포의 수를 세었으며, Zen 2009 소프트웨어(Carl Zeiss MicroImaging GmbH.)를 사용하여 이미지를 분석한 후, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, LPS만을 처리한 경우 NFκB는 세포질과 핵에 고루 분포하고 있으나, TAPs를 함께 처리한 경우 NFκB가 세포질에만 존재하였다. 이를 통해, 본 발명에 따른 TAPs는 LPS에 의해 유도된 NFκB의 핵으로의 이동을 억제하여 NFκB에 의해 발현되는 염증성 인자와 iNOS 및 ATF3의 발현을 억제하는 것을 알 수 있다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Novel TLR4 antagonist <130> AJou1-65P <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAP1 <400> 1 Ala Ser Ala Asn Lys Asn Leu Leu Phe Lys Ile Arg Tyr Ser Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gly Gly Ser 20 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAP2 <400> 2 Ala Met Ala Leu Asp Cys Phe Arg Trp Gly Trp Arg Met Trp Cys Ser 1 5 10 15 Ser Gly <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAP3 <400> 3 Ala Met Ala Tyr Glu Ile Arg Cys Trp Trp Arg Trp Cys Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Ser Gly

Claims

서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 TLR4(Toll-like receptor 4) 신호전달 경로 억제용인 펩타이드.
제2항에 있어서, 상기 TLR4 신호전달 경로는 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 인터루킨-6(IL-6; interleukin-6), NO 또는 ROS(reactive oxygen species)를 억제하는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 NFκB 또는 MAPKs의 활성을 억제하는 것을 특징으로하는, 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 TLR4/MD2 복합체에 결합하는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는, TLR4(Toll-like receptor 4) 길항제.
서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 인슐린-의존성 당뇨병, 다발 경화증, 실험적 자가면역 뇌척수염, 류마티스성 관절염, 실험적 자가면역 관절염, 중증 근무력증, 갑상선염, 실험적 형태의 포도막염, 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종, 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 애디슨 질환, 조기 폐경, 남성 불임증, 소아 당뇨병, 굿파스처 증후군, 보통 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소, 원발성 담관 경화증, 만성 활동성 간염 Hbs-ve, 잠재성 간경변증, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 경피증, 베게너 육아종증, 다발근육염/피부근육염, 원판상 LE 및 전신 홍반 루푸스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제10항에 있어서, 상기 염증성 질환은 천식, 습진, 건선, 알러지, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염, 폐염증, 알레르기성 피부염, 만성 부비동염, 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 패혈증, 맥관염, 활액낭염, 루프스, 류마티스 다발성 근육통, 측두 동맥염, 다발성 경화증, 고형암, 알쯔하이머병, 동맥경화증, 비만 및 바이러스 감염으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.