KR101004362B1

KR101004362B1 - 자가 면역 질환 예방 및 치료용 ＴＮＦ－α와 ＴＷＥＡＫ 이중 길항제

Info

Publication number: KR101004362B1
Application number: KR1020100024699A
Authority: KR
Inventors: 박영우; 조기원; 유석호; 유정; 김동진; 윤선하; 송은정; 이은경; 오진미; 조규원; 조미라; 김호연; 박미경; 오혜좌; 박진실; 우윤주
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단; 한국생명공학연구원
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2010-12-28
Also published as: WO2011115456A3; US8916525B2; WO2011115456A2; US20130017226A1

Abstract

본 발명은 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 자가 면역 질환의 하나인 자가 면역 관절염의 주요 병인으로 알려진 TNF-α와 TWEAK에 대한 이중 길항제의 역할을 하는 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 포함하는 조성물을 Th17 세포에 처리하였을 때, 염즘성 사이토카인 IL-17의 분비가 줄어들었으며, Treg 세포에서 생성되는 항염증성 사이토카인 IL-10의 분비가 증가하며, 또한 이러한 효과는 TNFR2-Fc와 TWEAK-Fc보다 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 효과가 뛰어남을 확인함으로써, 자가 면역 질환의 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

자가 면역 질환 예방 및 치료용 ＴＮＦ－α와 ＴＷＥＡＫ 이중 길항제{TNF-α and TWEAK coupled antagonist for the prevention and treatment of autoimmune diseases}

본 발명은 TNF-α와 TWEAK에 대한 이중 길항제를 유효성분으로 함유하는 자가 면역 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

면역체계는 해로운 외부물질인 항원(antigen)으로부터 신체를 보호하는 역할을 한다. 이러한 항원의 종류로는 박테리아, 바이러스, 독소, 암세포와 다른 사람 혹은 동물로의 혈액과 조직이 이에 해당된다. 면역체계는 이러한 해로운 물질들을 파괴하기 위하여 항체를 생산한다. 그러나 자가 면역에 이상이 생긴 경우, 면역체계는 자신의 건강한 신체의 장기와 해로운 항원을 구분하지 못하여, 정상적인 조직을 파괴하게 되며, 이러한 반응을 자가 면역 질환(autoimmune disease)라고 불린다. 이러한 반응은 과민반응(hypersensitivity reaction)으로 보이나, 알레르기의 경우 신체에 해가 되지 않는 외부 물질에 대해서 반응을 하지만, 자가 면역에 이상이 생긴 경우에는 신체의 정상적인 조직을 대상으로 반응이 일어나게 된다. 면역체계가 신체의 장기와 항원을 구분하지 못하게 된 원인은 확실치 않으나, 박테리아와 같은 미생물 또는 약물이 자가 면역 질환에 걸리기 쉬운 유전자를 가지고 태어난 사람들에게 병을 유발하는 것이라는 가설이 있다.

자가 면역 질환의 종류에는 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 악성 빈혈, 애디슨 병(Addison's disease), 제1형 당뇨, 자가 면역 관절염(Rheumatoid arthritis), 전신 홍반성 루프스(Systemic lupus erythematosus), 피부근염, 쇼그랜 증후군(Sjogren syndrome), 홍반성 루프스(Lupus erythematosus), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 중증 근무력증(Myasthenia gravis), 반응성 관절염(Reactive arthritis), 그레이브즈 병(Grave's disease) 및 셀리악 병(Celiac disease - sprue) 등이 있다.

자가 면역 반응의 치료는 자가 면역 반응을 조절하고, 신체의 손상된 면역기능을 회복시키는 것을 목적으로 이루어지며, 이는 다양한 자가 면역 질환의 종류에 따라 치료의 방법에 차이가 있다. 예를 들어, 혈액에 문제가 생긴 경우에는 수혈을 해야하며, 뼈, 관절 혹은 근육에 문제가 생긴 경우에는 운동 혹은 다른 기능적인 치료를 받아야 한다. 또한 면역 체계의 반응을 조절하기 위해서 약물이 처방된다. 면역억제약(immunosuppressive medicine)이라고 불리며, 사용되고 있는 면역억제약의 종류에는 코르티코스테로이드(corticosteroids) 약물인 프레드니손(prednisone)과 비스테로이드성(nonsteroid) 약물인 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 아자티오프린(azathioprine), 및 타크로리무스(tacrolimus) 등이 있다.

자가 면역 질환의 한 종류인 자가 면역 관절염(rheumatoid arthritis, RA)은 전 세계 인구의 약 1%에 해당하는 2,100만 명이 걸려있는 높은 유병률에도 불구하고, 아직까지 발병원인이 알려지지 않은 자가 면역성 질환이다. 자가 면역 관절염은 그 병적 증상이 주로 가동관절(diarthrodial joint)에 대칭적으로 나타나는 전신성 만성염증적 소견을 보이며, 심한 경우 관절의 부전에까지 이르는 심각한 질환이다. 또한 자가 면역의 이상으로 관절의 염증 및 고통뿐만, 관절과 그 주위의 조직, 더불어 여러 장기에까지 침투하여 골다공증, 폐, 피부, 눈으로까지 침범되는 전신장기침범과 고통을 동반하여 환자에게 엄청난 삶의 질 저하를 가져오고 정상인과 같은 생활을 불가능하게 한다.

자가 면역 관절염의 치료는 과거에는 생활습관의 개선이나, 수술, 치료제의 복용으로 발병의 속도를 늦추거나, 고통을 줄이며, 감염의 억제 및 치료에 중점을 두며, 관절의 기능이 향상되는 것에 관해서는 기대하지 않았으나, 근래에 들어서는 관절의 기능적인 회복과 심지어 완치를 목표로 치료하고 있으며, 이는 근 10년 동안 자가 면역 관절염의 치료에 있어서 획기적인 치료법인 항 TNF 길항제들의 개발로 가능하게 되었다.

종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)는 다면발현(pleiotropic) 사이토카인(cytokine)으로서, 염증성 반응뿐만 아니라 면역체계의 중요한 역할을 담당하며, 자가 면역 관절염의 관절 및 크론병(Crohn's disease) 환자의 결장(colon)에서 발견되며, 또한 골파괴(osteoclast) 과정에서 중요한 역할을 한다고 보고되었다. 따라서, 치료제들은 병인으로 작용하는 TNF 의 작용을 억제하기 위하여, TNF 슈퍼패밀리에 속하는 리간드와 결합하여 신호전달을 방해하거나 혹은 TNF 리간드와 수용체간의 결합을 방해하는 역할을 수행하도록 제작되었다. TNF 신호 전달을 억제 하기 위해 TNF 리간드에 대한 단일 항체를 사용하는 방법과 합성 단백질(recombinant protein)을 사용하는 방법으로 개발이 이루어졌다. 레미케이드 (Remicade)사의 인플릭시맙(infliximab), 또는 휴미라(Humira)의 아달리무맙(adalimumab)과 같이 단일 항체의 방식으로 치료를 하는 방법과 CTLA-4 Ig와 엔브렐(Enbrel)의 엔트라셉트(entracept)와 같은 합성 단백질(recombinant protein)을 사용하기도 한다. 보다 구체적으로, 인플릭시맙은 가용성 및 막횡단 형태의 TNF에 결합하여, TNF와 이의 수용체의 결합을 억제함으로써 TNF의 생물학적 활성을 중화시키는, 뮤린 가변 영역 및 인간 IgG1 및 κ 불변 영역을 지니는 키메라 항체이다. 인플릭시맙의 구조는 천연 발생 항체의 구조와 유사하다. 엔트라셉트는 p75 TNF 수용체의 세포외 도메인 및 인간 IgG1의 힌지 및 Fc 도메인으로 구성된 융합 단백질이다. 이러한 인플릭시맙, 엔트라셉트, 아달리무맙은 최초로 자가 면역 관절염 치료제로 인증받은 생물학적 치료제로서 근 10년간 임상에서 높은 효능을 보이며 치료제로서 활용되어왔다. TNF 이외의 다른 사이토카인을 타겟으로도 치료제의 개발로 이어졌으며, 인터루킨(interleukin)을 억제시키는 류미티드 관절염 개선약(Disease-modifying antirheumatic drugs, DMARD) 치료제가 IL-6 혹은 IL-1을 타겟으로 개발 중에 있으나, TNF 치료제보다 뛰어난 효과가 나타나지 않고 있는 실정이다.

트위크(TNF-related weak inducer of apoptosis, TWEAK)는 세포사멸(apoptosis) 유도체로서, TNF 슈퍼패밀리(superfamily)에 속하는 리간드의 한 종류로, 항염증성 반응, 혈관생성과 세포의 분열 등의 다양한 세포반응을 조절하는 사이토카인이다. TWEAK은 콜라겐으로 유도된 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 동물 모델에서 발병전 TWEAK 항체를 처리하여, 그 신호전달을 억제하였을 때, 관절의 염증과 활막 혈관생성과 관절과 뼈의 침식이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(J Immunol. 2006 Aug 15;177(4):2610-20.).

이러한 항 TNF 치료제들은 높은 효능에도 불구하고, 극복되어야 할 많은 문제들이 있다. 치료의 부작용으로는 항 TNF 치료제를 투여받음으로써, TNF의 기작이 정지되며 이에 따라, 면역체계에서 기능 이상으로 진균 혹은 세균의 감염의 위험이 높아지며, 특히 잠복중인 폐결핵의 재발의 위험을 높인다. 탈수초 질환(demyelinating disorders)으로 다발성 경화증, 혹은 혈액암(hematologic malignancies)으로 이어질 위험이 알려져 있으며, 류마티스 학회에 따르면, 항 TNF 치료제들을 투여받은 자가 면역 관절염 환자들의 경우, 기존의 치료제들을 받은 경우에 비해서 피부암이 발병될 가능성이 높다는 보고가 있다.

또한, 자가 면역 관절염 치료제들의 효과는 모든 환자들에게 나타나는 것은 아니다. 치료를 받은 환자의 3분의 2가 치료의 효과가 있으며, 3분의 1의 경우는 효과가 나타나지 않고 있다. 이는 환자의 병력에 따라서, 혹은 유전적인 요인에 따라서 치료의 한계가 있음을 확인해 주고 있다. 더욱이 병으로 인한 고통뿐만 아니라, 치료제를 투여 받았을 때 유발될 수 있는 부작용과, 안전성에 대한 문제는 해결되어야만 하는 문제이다. 자가 면역 관절염을 갖고 있는 임산부의 경우 항 TNF 치료제를 투여 받을 경우, 태아의 안전성에 대한 문제가 거론되어 왔다. 더불어 환자에 따라서 치료제의 효능과 부작용을 예측할 수 있는 진단학적인 문제가 과제로 남아있다.

이에 본 발명자들은 기존 항 TNF 치료제로 사용되고 있는 단일 길항제가 가지고 있는 안전성과 효능성의 단점을 극복할 수 있는 새로운 자가 면역질환의 치료제를 개발하고자 예의 노력한 결과, TNF-α(alpha, 알파)와 TWEAK에 대한 길항작용을 하는 TNFR2-TWEAKR을 제작하여, Th17 세포로에 처리하였을 때, IL-17 염증성 사이토카인의 분비 및 RORc의 발현이 감소되는 것을 확인함으로써, TNFR2-TWEAKR의 염증성 사이토카인의 분비 억제 효능을 밝혔으며, 자가 면역 보호 세포에서 분비되는 항염증성 사이토카인인 IL-10 단백질 분비량이 증가시키는 것을 확인하였으며, 골 파괴와 관련이 있는 것으로 알려진 RANKL이 TWEAK와 서로 유의하게 상관관계를 이루면서 증가되는 것을 자가 면역 관절염 환자의 혈청에서 확인함으로써, TNF-α와 TWEAK에 대한 이중 길항제의 자가 면역질환의 예방 및 치료의 효과를 확인하여, 상기 TNFR2-TWEAKR이 자가 면역 질환의 하나인 자가 면역 관절염의 치료제로서의 가능성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 TNF-α(alpha, 알파)와 TWEAK 융합 단백질, 및 이를 유효성분으로 함유하는 자가 면역질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2) 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편 및 TWEAKR(TNF-related weak inducer of apoptosis receptor) 단백질 또는 상기 TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편이 연결된 융합 단백질 제공한다.

또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.

또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡를 숙주세포에 형질 전환시킨 형질 전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

아울러, 약제학적으로 유효한 양의 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환 치료방법을 제공한다.

본 발명의 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 자가 면역 질환의 하나인 자가 면역 관절염의 병인으로 알려진 TNFR2와 TWEAK에 대하여 길항작용을 하는 조성물로서, 기존에 사용되고 있는 TNFR2-Fc와 TWEAKR-Fc보다 염증성 사이토카인인 IL-17의 분비를 감소시키며, 또한 항염증성 사이토카인인 IL-10의 분비를 증가시키는 효과가 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질이 TNFR2-Fc와 TWEAKR-Fc과 비교하였을 때,현저히 뛰어난 효능을 보이므로 자가 면역 질환의 치료용 조성물서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 TWEAKR 유전자가 클로닝된 TWEAKR-Fc의 구조를 나타내는 그림이다.
도 2는 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 클로닝된 TWEAKR-Fc가 발현된 것을 확인한 웨스턴 블랏과 발현된 단백질을 protein A 비드를 이용하여 정제한 후, HIS 항체를 이용하여 웨스턴 블랏한 결과를 나타낸 그림이다:
BSA: 대조군으로 사용한 소 혈청 알부민;
F228: TWEAKR F228 프라이머를 사용한 산물;
F448: TWEAKR F448 프라이머를 사용한 산물.
도 3은 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 TNFR2 유전자가 클로닝된 TNFR2의 구조를 나타내는 그림이다.
도 4는 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 클로닝된 TNFR2가 발현된 것을 확인한 웨스턴 블랏과 발현된 단백질을 protein A 비드를 이용하여 정제한 후, HIS 항체를 이용하여 웨스턴 블랏한 결과를 나타낸 그림이다:
BSA: 대조군으로 사용한 소 혈청 알부민;
F227: TNFR2 F227 프라이머를 사용한 산물.
도 5는 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 TWEAKR 유전자와 TNFR2 유전자가 같이 클로닝된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 구조를 나타내는 그림이다.
도 6은 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 제조하기 위한 PCR 프라이머의 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 클로닝된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 발현을 확인한 웨스턴 블랏한 결과를 나타낸 그림이다:
CD24: 대조군;
F227: TNFR2 F227 프라이머를 사용한 산물;
F227-2: TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 생성하기 위한 F227-2 프라이머를 사용한 산물.
도 8은 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 클로닝된 TTNFR2-TWEAKR 융합 단백질이 발현되는 것을 확인한 웨스턴 블랏과. 발현된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 protein A 비드를 이용하여 정제한 후, HIS 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 나타낸 그림이다.
CD24: 대조군;
F227-2: TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 생성하기 위한 F227-2 프라이머를 사용한 산물.
도 9는 대량으로 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 정제한 결과를 나타낸 웨스턴 블랏을 나타낸 그림이다:
Fc control: Fc 도메인 포함된 벡터 대조군;
TNFR2-Fc: Fc 도메인 포함된 TNFR2를 발현 군;
TWEAKR-Fc: Fc 도메인 포함된 TWEAKR을 발현 군;
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질: Fc 도메인 포함된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 발현 군.
BSA: 대조군으로 사용한 소 혈청 알부민.
도 10은 정제한 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질과 그 리간드인 TNF-α와 TWEAK와의 결합력(Binding affinity)을 측정한 그림이다.
도 11은 자가 면역 관절염 환자의 활막조직에서 TWEAK, TWEAKR, IL-17 및 RANKL의 발현을 관찰한 그림이다.
도 12는 Th17 세포의 분화과정에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리한 후, IL-21, IL-17, RORc, β-actin의 발현을 확인한 RT-PCR 결과와, Th17 세포의 분화과정에서 TNFR2, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리하였을 때, 분비되는 염증성 사이토카인 IL-17의 양을 나타낸 그래프이다.
도 13은 Th17 세포의 분화과정에서 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리한 후, 분비되는 항염증성 사이토카인 IL-10의 양을 나타내는 그래프이다.
도 14는 자가 면역 관절염 환자의 혈청 및 활막액에서 TWEAK와 RANKL의 양을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2) 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편 및 TWEAKR(TNF-related weak inducer of apoptosis receptor) 단백질 또는 상기 TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편이 연결된 융합 단백질을 제공한다.

TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에서 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번 아미노산의 23번 ~ 179번 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에서 TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 3번 아미노산의 28번 ~ 76번 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 200~ 250 개의 아미노산으로 구성된 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않는다.

TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 항체의 중쇄(heavy chain)의 불변(constant) 도메인으로부터 유래된 단편을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에 포함되는 Fc 도메인(domain)은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 CH2와 CH3 불변(constant domain) 도메인 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 TNFR2, TWEAKR의 세포외 수용성 도메인의 카르복실- 및 아미노-말단에 항체의 중쇄의 불변(constant) 도메인 영역 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 하기의 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:

1) DNA 라이브러리를 주형으로 삼고, TWEAKR 프라이머를 사용하여 PCR(중합효소 연쇄 반응)을 수행하는 단계;

2) DNA 라이브러리를 주형으로 삼고, TNFR2 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 단계;

3) 단계 1)과 단계 2)의 PCR 산물을 주형으로 삼고, TNFR2-TWEAKR의 융합 유전자를 코딩하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 단계;

4) 단계 4)의 PCR 산물을 제한효소로 절단하는 단계;

5) pYK-602-HIS-Fc 발현 벡터를 제한효소로 절단하는 단계;

6) 단계 4)와 단계 5)의 제한효소로 절단된 플라스미드를 라이게이션(ligation)하는 단계;

7) 단계 6)의 라이게이션 반응이 완료된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 형질전환하는 단계;

8) 단계 7)의 형질전환 후, LB 플레이트에 접종하는 단계;

9) 단계 8)의 생성된 콜로니(colony)를 이용한 PCR을 수행하는 단계;

10) 단계 9)에서 확인된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 293E 세포에 형질감염(transfection)시키는 단계;

11) 단계 10)의 293E 세포에서 발현된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 세포 배양액으로부터 정제하는 단계;

12) 단계 11)의 정제된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 세포독성을 제거하는 단계; 및

13) 단계 12)의 정제된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 결합능력(Binding affinity)를 확인하는 단계.

본 발명의 제조방법에 있어서, 벡터의 제조는 DNA 라이브러리(library)로 부터 PCR을 이용하여 수행하는 것이 바람직하며, 상기 DNA 라이브러리는 간, 태반, 췌장 및 간 조직에서 제조된 것을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

상기 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터는 pYK602-HIS-Fc가 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질 전환체를 제공한다.

상기 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환체는 E. coil의 DH5α인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, pYK602-HIS-Fc 발현 벡터에 TWEAKR과 TNFR2을 서브클로닝(subcloning)하기 위하여, PCR을 수행하여 TWEAKR 유전자와, TNFR2 유전자를 증폭하였다. 증폭된 각각의 PCR 산물을 pYK602-HIS-Fc 발현벡터에 라이게이션하여, TNFR2-Fc 및 TWEAKR-Fc를 구축하였다(도 1 및 도 3 참조). 구축한 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc를 293E 세포에 형질감염시킨 후, 생성되는 단백질과, 이를 정제한 단백질의 발현을 확인하였다(도 2 및 도 4 참조).

또한, DNA 라이브러리 혼합을 주형으로 하여 TWEAKR와 TNFR2 유전자를 PCR을 수행하여 증폭시키며, 증폭된 산물을 주형으로 하여, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 증폭한기 위한 프라이머를 제작한 후(도 5 참조), TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 PCR을 이용하여 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 pYK602-HIS-Fc 발현 벡터에 라이게이션 반응을 통해서, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 구축하였다(도 6 참조). 구축한 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 293E 세포에 형질감염시킨 후, 생성되는 단백질과, 이를 정제 후 단백질을 확인하였다(도 7 및 도 8 참조).

또한, 제조한 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 대량 제조하기 위하여, TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 발현량을 기준으로 293E 세포에 형질감염 한 후, 융합된 단백질들을 정제한 후 이를 확인하였다(표 1, 표 2 및 도 9 참조).

또한, 제조된 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질이 가지고 있는 세포내독성을 측정후, 이를 제거하였다(표 3 및 표 4 참조).

아울러, TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 리간드인 TNF-α 또는 TWEAK와의 결합력을 알아보기 위하여 결합 정도(binding affinitty)를 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, TNFR2-Fc는 TNF-α와 결합력이 높으며, TWEAKR-Fc는 TWEAK와 결합력이 높으며, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 TNF-α와 TWEAK 두 리간드에 대하여 결합력이 높은 것을 확인할 수 있었다(도 10 참조).

또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 자가 면역 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시 양태에서는 자가 면역 관절염 환자와 골관절염(Osteoarthritis, OA)환자의 활막 조직에서 발현되는 TWEAK, TWEAKR, IL-17 및 핵 인자 카파비 리간드의 수용체 활성제(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand, RANKL)의 발현량을 비교한 결과, 자가 면역 관절염 환자의 경우, OA 환자보다 TWEAK, TWEAKR, IL-17 및 RANKL의 발현량이 많은 것을 관찰할 수 있었다(도 11참조). 또한, Th17 세포에 <실시예>를 통해서 구축된 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리한 후, IL-21, IL-17 및 RORc의 발현이 모두 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 12 참조). 또한, TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 각각 처리하였을 때 Th17 세포에서 분비되는 염증성 사이토카인 IL-17의 양의 변화를 ELISA를 이용하여 측정한 결과, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리하였을 때가 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc를 처리하였을 때와 비교해 현저히 감소된 IL-17의 분비량을 확인할 수 있었다(도 12 참조). 또한, TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리한 후, 항염증성 사이토카인 IL-10의 단백질 분비량을 ELISA 방법을 사용하여 측정한 결과, IL-10 단백질의 분비량이 TNFR2-Fc 및 TWEAKR-Fc에 비하여, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리하였을 때 더욱 증가함을 확인할 수 있었다(도 13 참조). 아울러, 자가 면역 관절염 환자와 OA환자의 혈청 및 활막액에서 TWEAK 및 RANKL의 양을 ELISA 방법으로 측정한 결과, 혈청과 활막액에서 유의하게 상관관계를 이루며 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 14 참조).

따라서, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 염증성 사이토카인 IL-17의 생성을 감소시키며 TNFR2-F와 TWEAKR-Fc보다 더욱 유의하게 감소시키며, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 생성을 TNFR2-F와 TWEAKR-Fc보다 더욱 증가시키는 효과를 가지므로, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 자가 면역 질환의 예방 및 치료용 조성물서 유용하게 사용될 수 있다.

상기 자가 면역 질환은 자가 면역 관절염, 루푸스, 중증근무력증(Myasthemia gravis), 강직성 척추염, 갑상선 기능 향진증, 갑상선 기능 저하증, 궤양성 대장염, 크론병, 심장판막증, 다발성 경화증, 전신성 경피증(Scleroderma), 자가 면역성 간염으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 자가 면역 관절염인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본원 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 생체내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.

조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.001 ㎍ ~ 10 ㎎/㎏이며, 바람직하게는 0.01 ㎍ ~ 10 ㎎/㎏이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 염증성 사이토카인 IL-17의 생성을 감소시키며 TNFR2-F와 TWEAKR-Fc보다 더욱 유의하게 감소시키며, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 생성을 TNFR2-F와 TWEAKR-Fc보다 더욱 증가시키는 효과를 가지므로,약제학적으로 유효한 양의 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환 치료방법으로서 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> TWEAKR - Fc 제조

<1-1> TWEAKR - Fc 발현벡터 제조

TWEAKR-Fc 발현 벡터를 제조하기 위하여, 신장, 태반, 췌장 및 간의 혼합 DNA Library(21C Frontier Human GENE Bank(한국생명공학연구원)에서 구입. Clone ID:Ku012783, 플레이트 No. UG-0134-G10, 벡터: pCNS)를 주형으로 사용하여, TWEAKR 유전자를 발현시키기 위한 제한효소 SfiⅠ 서열을 포함하는 F228 정방향 프라이머(서열번호 4: 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCGAGCAAGCGCCAGGCACCGC-3'), F228 역방향 프라이머(서열번호 5: 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCAATTCAGCTGGGGGGCTGGGGC-3'). F448 정방향 프라이머I(서열번호 6: 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCAGTTTGGGGAGCCGGGCATC-3') 및 F448 역방향 프라이머(서열번호 7: 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCAAGTGAACCTGGAAGAGTCCGA-3')를 사용하여 유전자를 하기 조건으로 증폭한 후, SfiⅠ 제한효소로 처리한 후, pYK602-HIS-Fc 벡터에 서브클로닝(subcloning)하였다. PCR 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 100 ng이 되도록 넣어주었고, pfu 폴리머라제(제노텍, 한국) 2.5 unit, 정방향과 역방향 프라이머를 각각 10 pmole/50 ㎕를 넣고, 남은 부피를 증류수로 채워 총 50 ㎕의 반응액을 조성한 후, 94℃ 2 분, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초로 30 사이클 반복하여 유전자를 증폭시킨 후, 72℃ 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다.

증폭된 PCR 산물 및 벡터를 각각 SfiI 제한효소로 절단하고 37℃에서 4시간 반응시킨 후 젤 정제 키트(gel purification kit)(QIAGEN, # 28706, USA)를 이용하여 정제하였다. 증폭된 PCR 산물과 벡터의 비율을 3(150 ㎍):1(50 ㎍)로 하여 1 ㎕ T4 DNA 리가아제(#SDL01-R40k, Solgent, Korea)와 2 ㎕ 10×리가아제 버퍼를 섞은 후, 총 반응액을 20 ㎕로 하여 16℃에서 16시간 라이게이션(ligation)을 수행하였다.

라이게이션이 완료된 플라스미드(plasmid)를 E. coli DH5α에 형질변환(transfromation)한 후 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 플레이트에 뿌린(spreading)후 37℃ 배양기에서 16시간 배양시킨다. 콜로니 생성 후 콜로니를 10 ㎕ 암피실린이 포함된 LB 배지에 풀은 후, 콜로니 PCR 방법을 이용하여, 그 중 4~5 ㎕를 PCR 주형으로 삼고, PCR을 수행하여, TWEAKR 유전자가 발현벡터에 서브클로닝 됨을 확인하였다.

<1-2> TWEAKR - Fc 발현 및 정제

293E 세포를 DMEM 500 ㎖에 FBS가 50 ㎖이 첨가된 배지를 이용하여, 150 ㎜ 플레이트(플레이트)(#430599, Corning, USA)에 70~80% 면적을 차지할 정도로 세포를 심은 후, TWEAKR-Fc 발현벡터 20 ㎍과 PEI(polyethylenimine)(#23966, Polysciences, USA) 40 ㎍을 1:2 비율로 혼합하여 상온에 20분 정도 반응시킨 후, 세포에 떨어뜨려 형질감염(transfection)시켰다. 16~20시간 경과 후, 혈청이 포함되지 않은 20 ㎖ DMEM 배지로 교환해주며, 세포의 상층액은 2~3일 마다 한 번씩 걷었다. 상측액을 수득한 후, 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액만을 새로운 병에 옮겨서 4℃에 정제하기 전까지 보관하였다.

10개의 150 mm 플레이트에서 3일, 5일, 7일째에 걷은 상층액 총 600 ㎖을 정제하였다. 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터한 후, 5 ㎖ 컬럼(column)에 패킹(packing)되어있는 500 ㎕의 protein A 비드(#17-1279-03 ,GE healthcare, Sweden)에 결합시켰다. Peri-start 펌프를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨후, 100 ㎖ 이상의 PBS로 컬럼을 세척하여 0.1M 글리신 염산(Glycine-HCl)(#G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG. Sigma. USA)(pH 9.0)으로 중화시켰다. 그 다음 TWEAKR-Fc를 정량하고, TWEAKR-Fc의 발현이 있는 분획을 2~3개 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)을 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10 번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 TWEAKR-Fc를 960 ㎍/㎕으로 총 1.9 ㎎을 얻었다(도 1 및 도 2).

< 실시예 2> TNFR2 - Fc 제조

<2-1> TNFR2 - Fc 발현벡터 제조

TNFR2-Fc 발현 벡터를 제조하기 위하여,신장, 태반, 췌장 및 간의 혼합 DNA 라이브러리(21C Frontier Human GENE Bank(한국생명공학연구원)에서 구입. Clone ID:hMU013725, 플레이트 No. IRAU-86-H09, 벡터: pDNR-LIB )를 주형으로 사용하여, TNFR2 유전자를 발현시키기 위한 제한효소 SfiⅠ 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 8: 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTGCCCGCCCAGGTGGCATT-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 9: 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCAATTCAGCTGGGGGGCTGGGGC-3')를 사용하여 유전자를 하기 조건으로 증폭한 후, SfiⅠ 제한효소로 처리한 후, pYK602-HIS-Fc 벡터에 서브클로닝하였다. PCR 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 100 ng이 되도록 넣어 주었고, pfu 폴리머라제(제노텍, 한국) 2.5 unit, 정방향과 역방향 프라이머를 각각 10 pmole/50 ㎕ 넣고, 남은 부피를 증류수로 채워 총 50 ㎕의 반응액을 조성한 후, 94℃ 2 분, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분으로 30 사이클 반복하여 유전자를 증폭시킨 후, 72℃ 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다.

증폭된 PCR 산물 및 벡터를 각각 SfiI 제한효소로 절단하고 37℃에서 4시간 반응시킨 후 젤 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 증폭된 PCR 산물과 벡터의 비율을 3(150 ㎍):1(50 ㎍)로 하여 1 ㎕ T4 DNA 리가아제와 2 ㎕ 10× 리가아제 버퍼를 섞은후, 총 반응액을 20 ㎕로 하여 16℃에서 16시간 라이게이션을 수행하였다.

라이게이션된 플라스미드를 E. coli DH5α에 형질변환한 후 암피실린이 포함된 LB 플레이트에 뿌린 후 37℃ 배양기에서 16시간 배양시켰다. 콜로니 생성 후 콜로니를 10 ㎕ 암피실린이 포함된 LB 배지에 풀은 후, 콜로니 PCR 방법을 이용하여, 그 중 4~5 ㎕를 PCR 주형으로 삼고, PCR을 수행하여, TNFR2 유전자가 pYK602-HIS-Fc 발현벡터에 서브클로닝됨을 확인하였다(도 3 및 도 4).

<2-2> TNFR2 - Fc 발현 및 정제

293E 세포를 DMEM 500 ㎖에 FBS가 50 ㎖이 첨가된 배지를 이용하여, 150㎜ 플레이트에 70~80% 면적을 차지할 정도로 세포를 심은 후, TNFR2-Fc 발현벡터 20㎍과 PEI 40 ㎍을 1:2 비율로 혼합하여 상온에 20분 정도 반응시킨 후, 세포에 떨어뜨려 형질감염시켰다. 16~20시간 경과 후, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지 20 ㎖로 교환해주며, 세포의 상층액은 2~3일 마다 한 번씩 걷었다. 상측액을 수득한 후, 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액만을 새로운 병에 옮겨서 4℃에 정제하기 전까지 보관하였다.

10개의 150 mm 플레이트에서 3일, 5일, 7일째에 걷은 상층액 총 600 ㎖을 정제하였다. 전체 상층액을 0.22㎛ top-filter를 사용하여 필터한 후, 5 ㎖ 컬럼(column)에 패킹되어 있는 500㎕의 protein A 비드에 결합시켰다. Peri-start 펌프를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS로 컬럼을 세척하여 0.1M 글리신 염산을 이용하여 6개 분획으로 나누어 용리하고, 1M Tris(pH 9.0)으로 중화시켰다. 그 다음 TNFR2-Fc를 정량하고, TNFR2-Fc가 있는 분획을 2~3개 모아 amicon ultra를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10 번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 TNFR2-Fc를 300 ㎍/㎖로 총 235 ㎍을 얻었다.

< 실시예 3> TNFR2 - TWEAKR 융합 단백질의 제조

<3-1> TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 발현벡터 제조

TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 발현시키는 발현 벡터를 제조하기 위하여, 신장, 태반, 췌장 및 간의 혼합 DNA Library를 주형으로 사용하여, TNFR2과 유전자를 발현시키기 위한 제한효소 SfiⅠ 서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 10:5'-GCGGTGCCTGGCGCTTGCTCCGTGCAGACTGCATCCATGCT-3')를 사용하여 TNFR2유전자를 증폭하며, TWEAKR 유전자를 증폭시키기 위하여 정방향 프라이머(서열번호 11: 5'-AGCATGGATGCAGTCTGCACGGAGCAAGCGCCAGGCACCGC-3')과 역방향 프라이머를 하기 조건으로 증폭한 후, 두 개의 PCR 산물을 1:1의 비율로 총 100 ng을 주형으로 넣어 세 가지의 프라이머를 넣어 PCR 하여 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 pYK602-HIS-Fc 벡터에 서브클로닝하였다. 사용된 PCR 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 100 ng이 되도록 넣어 주었고, pfu 폴리머라제(제노텍, 한국) 2.5 unit, 정방향과 역방향 프라이머를 각각 10 pmole/50㎕ 넣고, 남은 부피를 증류수로 채워 총 50㎕의 반응액을 조성한 후, 94℃ 2 분, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분으로 30 사이클 반복하여 유전자를 증폭시킨 후, 72℃ 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다.

증폭된 PCR 산물 및 벡터를 각각 SfiI 제한효소로 절단하고 37℃에서 4시간 반응시킨 후 젤 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 증폭된 PCR 산물과 벡터의 비율을 3(150 ㎍):1(50 ㎍)로 하여 1 ㎕ T4 DNA 리가아제와 2 ㎕ 10×리가아제 버퍼를 섞은후, 총 반응액을 20 ㎕로 하여 16℃에서 16시간 라이게이션을 수행하였다.

라이게이션된 플라스미드를 E.coli DH5α에 형질변환한 후 암피실린이 포함된 LB 플레이트에 뿌린 후, 37℃ 배양기에서 16시간 배양시킨다. 콜로니 생성 후 콜로니를 10 ㎕ 암피실린이 포함된 LB 배지에 풀은 후, 콜로니 PCR 방법을 이용하여, 그 중 4~5 ㎕를 PCR 주형으로 삼고, PCR을 수행하여, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 유전자가 pYK602-HIS-Fc 발현벡터에 서브클로닝됨을 확인하였다.

<3-2> TNFR2 - TWEAKR 융합 단백질의 발현 및 정제

293E 세포를 DMEM 500 ㎖에 FBS가 50 ㎖이 첨가된 배지를 이용하여, 150 ㎜ 플레이트에 70~80% 면적을 차지할 정도로 세포를 심은 후, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 20 ㎍과 PEI 40 ㎍을 1:2 비율로 혼합하여 상온에 20분 정도 반응시킨 후, 세포에 떨어뜨려 형질감염시켰다. 16 ~ 20시간 경과 후, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지 20 ㎖로 교환해주며, 세포의 상층액은 2~3일 마다 한 번씩 걷었다. 상측액을 수득한 후, 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액만을 새로운 병에 옮겨서 4℃에 정제하기 전까지 보관하였다.

10개의 150 mm 플레이트에서 3일, 5일, 7일째에 걷은 상층액 총 600 ㎖을 정제한다. 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter를 사용하여 필터한 후, 5 ㎖ 컬럼에 패킹되어 있는 500 ㎕의 protein A 비드에 결합시켰다. Peri-start 펌프를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨후, 100 ㎖ 이상의 PBS로 컬럼을 세척하여 0.1M 글리신 염산을 이용하여 6개 분획으로 나누어 용리하고, 1M Tris(pH 9.0)으로 중화시켰다. 그런 후, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 정량하고, 단백질이 있는 분획을 2~3개 모아 amicon ultra를 사용하여 농축한 후 PBS로 10 번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 380 ㎍/㎖로 총 1 ㎎을 얻었다.

<실시예 4> TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 대량 정제

<4-1> 형질감염

150 ㎜ 플레이트(#430599, Corning, USA)에 293E 세포가 80% ~ 90%정도 찼을 때 형질감염을 수행하였다. PEI:TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 비율은 2:1로 하여 보통 150 ㎜ 플레이트에 플라스미드 DNA양은 20 ㎍과 PEI는 40 ㎍을 넣는다. 1 ㎖의 혈청이 제거된 배지(Serum free media)에 PEI와 플라스미드 DNA를 혼합한 용액을 넣고 간단히 Vortex를 이용하여 섞어준 후, 20분 정도 상온에서 반응시킨 다음 1 ㎖을 150 ㎜ 플레이트에 분주하였다. 형질감염 효율을 높이기 위해 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 반응시킨 다음 PBS로 150 ㎜ 플레이트를 세척하여, PEI와 플라스미드 DNA를 제거하였다. 150 ㎜ 플레이트에 혈청이 제거된 배지(Serum free media)를 20 ㎖ 정도 분주하여 넣은 후 CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양시켰다.

<4-2> 상층액 수득

상층액의 샘플링(Supernatant sampling)은 2일에 1번씩 5회차 까지 상층액을 얻을수 있으며, 150 ㎜ 플레이트 1장에서 얻어지는 상층액은 100 ㎖ 정도였다. 하기 표 1의 시료들(발현벡터, TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질)의 발현량 측정을 참조하여 대량 정제시 어느 정도 정제될 것 인지 예상한 뒤에 필요한 배양액을 계산하였다. TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 및 대조군인 발현벡터를 각각 1 ㎎씩 얻기 위해서 필요한 배양액의 부피는 하기 표 2와 같다(표 1 및 표 2).

시료	발현량
발현벡터	1.0 mg/ℓ
TNFR2-Fc	0.6 mg/ℓ
TWEAKR-Fc	0.6 mg/ℓ
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질	0.6 mg/ℓ

시료	발현량
발현벡터	1ℓ
TNFR2-Fc	2ℓ
TWEAKR-Fc	2ℓ
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질	2ℓ

<4-3> 정제

배양 상층액(culture supernatant)을 0.22 ㎛ Top-filter를 이용하여 필터를 한 후, 멸균된 1ℓ병에 옮겨서 저온실에서 정제를 수행하였다. Peristart-펌프를 이용하여 정제하며, 정제용 컬럼을 인젝터(Injector)를 이용하여 PBS로 2 ㎖/분의 속도로 30분간 세척하였다. 세척이 끝나면 protein A 비드를 컬럼 안에 패킹(packing)해주며, 상층액의 부피가 1ℓ일 경우 protein A 비드를 약 700 ㎕ 패킹하였다. protein A 비드의 패킹이 끝나면 다시 50 ㎖의 PBS로 세척하였다. 그런 다음, 배양 상층액을 컬럼안에 넣었다. 속도는 1 ㎖/분으로 하고 오버나잇으로 결합시켰다. 다음날, 200 ㎖의 PBS로 2 ㎖/분의 속도로 세척하고, 용리(elution)를 수행하였다. 용리된 단백질의 농도를 확인한 다음, PBS로 버퍼를 교체한 뒤, 4℃에 보관하였다. 그리고, QC test를 위해 10% SDS-PAGE 젤에 걸어 정제도를 확인하였다(도 7, 도 8 및 도 9).

<실험예 1> 정제된 융합 단백질의 세포독성 제거

<1-1> 독성검사

<실시예>에서 제조한 융합 단백질들(TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질)을 정제한 후, 정제된 단백질의 세균내독소(bacterial endotoxin)를 측정하기 위해서 Chromo-LAL(cat# C0031, CAPE COD)을 이용하였다. 대조군으로 사용되는 기준 독소(CSE, control 스탠다드 세균내독소; cat# E0005, CAPE COD)를 1 EU/ml부터 2 배씩 희석하여 최소 농도가 0.03125 EU/㎖이 되도록 준비하였다. 음성 대조군으로 LRW(LAL reagent water, cat# WP1001, CAPE COD) 100 ㎕에 LAL 100 ㎕을 넣어주고, 양성 대조군으로 0.125 EU/ml 농도의 기준 독소(CSE) 100 ㎕에 LAL 100 ㎕를 섞어 실험에 사용하였다. 분석을 위해 LRW로 50 ㎍/㎖의 일정 농도가 되도록 희석한 샘플 100 ㎕에 LAL 100 ㎕를 준비하였다. 추가로 샘플의 간섭확인을 위해 생성물질 양성 대조군 실험을 하는데, 앞서 희석한 샘플 50 ㎕에 0.125 EU/㎖ 기준 독소(CSE)　50 ㎕과　LAL 100 ㎕를 넣어 준비하였다. VersaMax 마이크로플레이트 reader(Molecular devices)로 측정시 프로토콜화 한 파일(Chromo LAL setting.pda)을 이용하여 기준값을 정하였다. 플레이트는 37℃로 10분 정도 예열을 미리 준비한 후 실험을 시작하였다. LAL을 처리함과 동시에 프로토콜화 한 파일을 시작하여 OD를 측정하였다. 스탠다드 Curve는 X축은 Log EU/㎖, Y축은 Log Onset time으로 작성되며, 샘플의 세포내독성 수치는 측정한 OD를 소프트웨어 상에서 자동으로 계산하여 EU/㎖로 표시된다. 스탠다드 curve의 R² 값이 0.98이상 되는 경우에 측정치에 대한 신뢰성을 두었다.

그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 4개의 샘플(발현벡터,TNFR2-Fc ,TWEAKR-Fc및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질)은 세포독성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(표 3).

정제된 시료	세포독성(EU/㎖)
발현벡터	62.14
TNFR2-Fc	40.33
TWEAKR-Fc	171
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질	171.52

<1-2> 세포내독성 제거

정제된 융합 단백질들의 세포내독성을 제거하기 위해 EndoTrap Red(cat# 83-009U, Lonza) 컬럼을 사용하였다. 컬럼을 3 ㎖의 재생(regeneration) 버퍼로 2회 세척한 후, 동량의 평형(equilibration) 버퍼로 2회 세척한다. 그 뒤 샘플을 적용함과 동시에 분획을 받기 시작하였다. 이때 샘플의 유량속도(flow rate)는 0.5 ~ 1 ㎖/분으로 하며, 컬럼 내의 잔여샘플은 평형 버퍼 1 ㎖을 적용하여 받았다. 세포 내 독성의 제거 후, 그 결과를 확인하기 위해 실험예 <1-1> 동일한 방법으로 세포독성 검사를 하였다.

그 결과, 하기 표 4에 나타난 바와 같이 정제된 단백질이 가지고 있는 세포독성의 수치가 모두 감소됨을 확인할 수 있었다(표 4).

정제된 시료	세포독성(EU/㎖)
발현벡터	3.76
TNFR2-Fc	36.12
TWEAKR-Fc	36.17
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질	12.73

< 실험예 2> TNFR2-TWEAKR 융합 단백질과 리간드의 결합력 측정

<실시예>에서 제조한 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질과 그 리간드인 TNF-a와 TWEAKR와 결합하여 길항 작용을 할 수 있을지 알아보기 위하여, 결합력을 측정하는 실험(Binding affinity test)을 수행하였다.

ELISA 플레이트(#439454, Nunc, Denmark)를 이용하여 웰(well)당 100 ng의 TNF-α(#C001-1MG, enzynomics, Korea)와 TWEAK을 웰당 100 ㎕의 PBS(pH7.4)로 4℃에서 오버나잇으로 코팅을 수행하였다. 코팅이 완료된 ELISA 플레이트에 PBS 200 ㎕에 4% 스킴 밀크(Skim milk)(#232100, Difco, France)를 넣은 용액을 넣고, 비특이적인 반응을 억제하기 위하여 상온에서 대략 1시간 블로킹 버퍼[4% 스킴 밀크 in PBS]로 블로킹시켰다. 블로킹이 끝나면 ELISA 플레이트에서 블로킹 버퍼를 제거하고, 각각의 정제된 단백질들을 블로킹 버퍼 100 ㎕에 100 nM 농도로 준비한 뒤, 이를 1/4의 희석농도로 순차희석(serial dilution)을 한 다음 상온에서 대략 2시간 반응시켰다. 그 다음, 200 ㎕ PBS로 플레이트를 5회 세척을 해주고 2 ㎕의 2차 항체(secondary antibody)인 anti-Human Fc-HRP(#31413, Thermo, USA)를 1% 스킴 밀크가 함유된 4 ㎖의 PBS에 섞은 다음, ELISA 플레이트에 한 웰당 200㎕씩 넣어 준 다음 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, ELISA 플레이트의 2차 항체를 제거한 후, 200 ㎕의 PBS로 5회 세척해주고 한 웰당 10 ㎕의 과산화수소 용액(H2O2,#H1009-100ML, Sigma, USA)과 10 ㎖의 PC버퍼[5.1 g 구연산 모노하이드레이트(Citric acid monohydrate), 7.3 g 인산나트륨(Sodium phosphate)(pH 5.0)/ℓ]와 OPD 정제(#P8787-100TAB Sigma USA) 1개를 혼합하여 총 100 ㎕의 부피로 만든 반응액을 넣었다. 반응액을 넣은 다음, 상온의 어두운 상태에서 10분간 반응시킨 뒤, 발색을 확인하고, 반응을 중단시키는 STOP 버퍼를 한 웰당 50 ㎕씩 넣어 반응을 종료시키고, ELISA 리더(reader)에서 490 nm의 파장에서 Kd 값을 측정하였다.

그 결과, 하기 표 5에 나타난 바와 같이, TNF-α 리간드는 TNFR2-Fc와 TNF-α와 TNFR2-TWEAKRR-Fc와는 높은 결합력을 보였으나, TWEAKR-Fc와는 낮은 결합력 보임을 확인할 수 있었다. TWEAK 리간드는 TWEAKR-Fc와 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질과는 낮은 Kd value를 보임으로써, 높은 결합력을 확인할 수 있었으며, TNFR2-Fc와는 낮은 결합력을 확인할 수 있었다(표 5 및 도 10).

시료	TNF-α (Kd value)	TWEAKR (Kd value)
TNFR2-Fc	1.080	37.89
TWEAKR-Fc	46.13	0.6414
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질	1.724	0.1217

<실험예 3> 활막조직의 사이토카인의 발현 측정

골치환술을 겪은 자가 면역 환자의 활막 조직에서 TWEAK, TWEAKR(TWEAK receptor) 및 염증성 사이토카인 IL-17과 골파괴에서 주요한 역할을 하는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)의 발현 정도를 확인하기 위하여 면역조직화학염색법을 이용하였다. 골관절염 환자(osteoarthritis, OA)의 활막 조직을 대조군으로 하여, 자가 면역 환자에게서 활막 조직의 구조를 고정시키기 위해서, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 이용하여 고정시킨 후, 통상의 방법대로 조직을 파라핀(Parrafin)에 포매한 후, 활막 조직을 절편기를 이용하여 7 ㎛의 두께로 절편을 만들어 슬라이드에 붙였다. 슬라이드에 부착된 절편을 자일렌(xylene)과 에탄올로 탈파라핀과 함수를 시킨 후, 3% 과산화수소(H₂O₂)로 내 인성 과산화효소를 차단시키고 PBS(phosphate-버퍼ed saline, Gibco BRL, Carlsbad, CA, USA)로 수세하였다. 비 특이적인 반응을 차단할 목적으로 블로킹 용액[10% Normal goat serum] 100 ㎕에 30분 반응시킨 후, 1차 항체(Primary antibody)인 TWEAK, TWEAKR, IL-17 및 RANKL(Santa Cruz, Burlingame, CA, USA)를 1:100으로 희석하여 조직 위에 100 ㎕씩 넣은 후, 4℃에서 16~18시간 반응시켰다. 1차 항체와 반응시킨 후 결합이 안 된 항체를 제거한 후, 50 ㎖ PBS로 수세하고, 바이오틴(Biotin)이 결합된 이차 항체와 과산화 효소가 결합된 스트렙타비딘(streptavidin) 100 ㎕과 반응을 시킨 후 DAB으로 발색시켜 광학현미경(Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

그 결과, OA환자의 조직을 비교군으로 함께 염색하였다. OA 환자와 비교하여 자가 면역 관절염 환자의 조직에서 TWEAK 및 TWEAKR가 매우 높게 발현되었으며, 또한 IL-17과 RANKL의 높은 발현을 확인할 수 있었다(도 11).

<실험예 4> TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 염증성 사이토카인 억제 측정

<4-1> 말초혈액 단핵세포 분리

건강인으로부터 헤파린(Heparin) 처리된 주사기를 이용하여 혈액을 체취한 후 PBS와 1:1 비율로 희석하였다. 피콜(Ficoll)(Amercham Biosciences, Burkinghamshire, England)과 희석한 혈액의 비율이 1:4로 되게 하여 피콜 층에 섞이지 않게 혈액을 띄운 뒤에 2000rpm, 20 ℃ 조건으로 30분간 원심분리하여 연막층에서 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 분리하였다. 분리된 세포를 PBS로 세척한 후 10% 우태아 혈청(Gibco, Burlingame, CA, USA)이 포함된 세포배양액 RPMI 1640(Gibco BRL)에 1×10⁶ 세포/㎖ 로 희석하였다.

<4-2> Th17 세포 배양

실험예 <4-1>에 기재된 말초혈액 단핵세포를 10% 우태아혈청이 포함된 세포배양액 RPMI 1640으로 5×10⁵ 세포/500 ㎕ 수의 세포로 48웰 플레이트 (Nalge Nunc International, IL, USA)에 분주하여, 이들 세포에 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 10 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 1시간 배양하였다. 1시간 후, 세포를 파이펫을 사용하여 바닥에 붙은 세포를 뜯어 anti-CD3(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)가 0.3 ㎍/㎖로 코팅 처리된 48웰 플레이트로 옮기고, 말초혈액 단핵세포를 Th17 세포로 분화 유도시키기 위해 IL-6(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 20 ng/㎖, IL-23(R&D Systems) 10 ng/㎖ 그리고 IL-1β(R&D Systems) 5 ng/㎖을 1회 처리하여 37℃, 5% CO₂ 환경의 배양기에서 72시간 배양하였다. 배양하는 72 시간 동안 배지 교환 및 추가 자극은 하지 않았다.

<4-3> RT-PCR

실시예 <2-2>의 72시간 배양한 세포로부터 총 RNA를 RNA zol-B (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)를 이용하여 추출하였다. 총 2 ㎍의 RNA 3 ㎕에 랜덤 프라이머(random primer)(Genotech, Daejeon, Korea) 1 ㎕를 가하여, 70℃에서 5분간 방치한 후 바로 얼음에 넣어 급냉 시키고, 4 ㎕의 5×M-MULV 버퍼, 1㎕의 10 mM dNTP, 0.5㎕ 알엔아제 억제제(RNase inhibitor)(Takara, Shiga, Japan)와 혼합한 후 총 반응액이 19 ㎕가 되도록 증류수 9.5 ㎕를 가하였다. 25℃에서 5분간 반응시킨 후 1 ㎕의 역 전사 효소 M-MULV(Takara, Shiga, Japan)를 처리하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 72℃에서 10분간 반응시켜 cDNA를 얻었다.

이렇게 생성된 cDNA산물을 주형으로 하여 역전사 중합효소 연쇄반응(PCR)을 시행하였다. RT-PCR을 위한 반응 화합물은 한 샘플당 총 25 ㎕가 되도록 하였고, 용액의 조성은 10×반응 버퍼 2.5 ㎕, 0.5 mM의 dNTP 2.5 ㎕, Taq 0.3 ㎕(Takara, shinga, Japan) 및 타깃 정방향과 역방향 프라이머를 각각 2 ㎕와 cDNA 1 ㎕ 및 14.7 ㎕의 증류수를 사용하였다. 증폭을 위해 Dual-bay Thermal cycler system(MJ Research)을 사용하였다. 음성 대조군으로 추출한 cDNA 대신 증류수를 사용하여 PCR 산물이 관찰되지않는 것을 통해 PCR 오염이 없음을 확인하였다.

IL-21은 94℃ 3분 변성과정을 거친 후 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초간 반응을 30 회 반복 한 후 신장을 위해 72℃에서 7분간 반응을 실행하였다. IL-17 증폭조건은 94℃ 3분 변성과정을 거친 후 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 1분간 반응을 30 회 반복한 후 72℃에서 7분간 반응을 실행하였다. RORc와 β-actin은 94℃에서 3분간 변성 과정을 거친 후 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초간 반응을 각각 30 회, 26회 반복하였다. 중합효소반응에 의해 얻어진 증폭 산물은 브롬화에티듐(ethidium bromide)이 포함된 1.5% 아가로즈 젤(agarose gel)에 전기 영동을 시킨 후 Gel-Doc 2000(Bio-rad Laboratories, Hercules, CA)으로 영상을 얻고 Quantity-One(Bio-rad) 프로그램을 이용하여 증폭 산물을 농도 계측법으로 정량하였다. 이 값을 β-actin과의 비율로 환산하여 각 세포군 간의 mRNA 발현 정도를 비교하였다. 사용한 프라이머 서열은 아래와 같다:

IL-21 ;

5'-CTT ACC TGG CAA GAC CAG TAT GA-3'(서열번호 12);

5'-GTA GAA GGC AGG GTC TTC GTA AT-3'(서열번호 13);

IL-17;

5'-TGA AGT GCT GTC TGG AGC AG-3'(서열번호 14);,

5'-TCC TCA GAA TCA TCC ATG TC-3')(서열번호 15);

RORc;

5'-AGT CGG AAG GCA AGA TCA GA-3'(서열번호 16);

5'-CAA GAG AGG TTC TGG GCA AG-3'(서열번호 17);

β-actin;

5'-GGA CTT CGA GCA AGA GAT GG-3'(서열번호 18); 및

5'-TGT GTT GGC GTA CAG GTC TTT G-3'(서열번호 19).

증폭 산물을 β-actin 발현 비율에 따라 환산하여 각 mRNA 발현 정도를 비교하였다.

그 결과, Th17 세포의 분화 조건에서는 염증성 사이토카인인 IL-17 및 IL-21과 Th17 세포의 분화과정에서 발현된다고 보고된 특정 전사인자인 RORc의 mRNA 발현이 높았다. 하지만 동일한 조건의 Th17 세포에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 10 ㎍을 처리한 경우, IL-17, IL-21 및 RORc 유전자의 발현이 현저히 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(도 12).

<4-4> TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 IL-17 감소 측정

TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에 의해 IL-17 단백의 생성 또한 감소하는지 확인하기 위해 실험예 <2-3>에서 배양한 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질이 처리된 Th17 세포의 상층액에서 염증성 사이토카인 IL-17 단백질의 양을 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다.

Sandwich ELISA용 96웰 플레이트에 IL-17(R&D Systems) 항체를 2 ㎍/㎖로 1 웰에 100 ㎕을 넣어 상온에서 2시간 반응시킨 후, 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 0.05% PBST에 섞은 블로킹 버퍼 200 ㎕를 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 스탠다드로 사용할 인간 재조합 IL-17(R&D Systems)은 각 5,000∼78.125 pg/㎖ 농도로 100 ㎕을 웰에 넣어 사용하였다. 표준시료(standard)와 함께 측정할 세포배양 상층액을 50 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 0.05% PBST 300 ㎕로 4번 세척하고, 바이오틴(Biotin)이 결합된 anti-human IL-17(R&D Systems)을 200 ng/㎖의 농도로 희석하여 50 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 4번 PBST로 세척하고, 엑스트라아비딘 포스파타아제 접합체(ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate)(Sigma, Louis, MO, USA)를 1：2,000으로 희석하여 50 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2시간 반응 후, PBST로 세척한 후, 포스페이트 디소디윰 솔트 헥사하이드레이트(Phosphate Disodium salt Hexahydrate, PNPP)/DEA 용액을 1 ㎎/㎖ 농도로 50 ㎕/웰로 첨가하여 반응시켰다. 반응 후 0.2N NaOH 50 ㎕/웰을 넣어 반응을 멈추고, 405 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, Th17 세포가 분화 자극 조건하에서 IL-17 단백질의 생성물은 증가되는 것을 관찰할 수 있었으며, TNFR2-Fc와 TWEAKR-Fc 10 ㎍/㎖을 처리한 경우 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리했을 때와 보다, IL-17의 생성이 더욱 효과적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 12).

<실험예 5> TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 항염증성 사이토카인 IL-10 생성 측정

TNFR2-TWEAKR 융합 단백질이 Th17 세포 반응을 억제함과 동시에 자가 항원에 대한 균형을 유지하고 자가 면역으로부터 보호하는 역할을 하는 면역 억제 세포인 Treg의 작용에 상승효과를 줄 수 있을지 알아보기 위하여, Treg 세포에서 생성되는 항염즘성 사이토카인 IL-10 단백질을 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다.

Sandwich ELISA용 96웰 플레이트에 IL-10(R&D Systems) 항체를 2 ㎍/㎖로 1웰에 100 ㎕을 넣어 상온에서 2시간 반응시킨 후, 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 0.05% PBST에 섞은 블로킹 버퍼 200 ㎕를 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 표준시료로 사용할 인간 재조합 IL-10(R&D Systems)은 각 5,000∼78.125 pg/㎖ 농도로 100 ㎕/㎖을 웰에 넣어 사용하였다. 표준시료와 함께 측정할 세포배양 상층액을 100 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2 시간 반응시켰다. 반응 후 0.05% PBST 300 ㎕로 4번 세척하고, 바이오틴(Biotin)이 결합된 anti-human IL-10(R&D Systems)을 200 ng/㎖의 농도로 희석하여 50 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 4번 PBST로 세척하고, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate(Sigma, Louis, MO, USA)를 1：2,000으로 희석하여 50 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2시간 반응시키고, PBST로 세척 후 Phosphate Disodium salt Hexahydrate(PNPP)/DEA 용액을 1 ㎎/㎖ 농도로 100 ㎕/웰로 첨가하여 반응 시켰다. 반응 후 0.2 N NaOH 100 ㎕/웰씩 넣어 반응을 멈추고 405 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, Th17 세포 분화 조건에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리하였을 때, TNFR2-Fc 또는 TWEAKR-Fc를 처리한 것에 비해 통계적으로 유의하게 IL-10의 생성이 더욱 증가함을 확인하였다(도 13).

< 실험예 6> TWEAK 와 RANKL 의 상관관계 확인

자가 면역관절염의 주요 증상 중 하나인 골파괴는 과도한 파골세포 생성으로 인해 뼈 침식이 심화됨으로 인해 발생되며, 파골세포 분화에 주요한 요소인 RANKL이 TNF 및 IL-1과 같은 사이토카인에 의해서 증가되는 것이 보고되어있다. 이에 따라, TWEAK와 RANKL의 관계를 조사하기 위해, 자가 면역 관절염 환자의 혈청 및 활막액에서 TWEAK 및 RANKL의 양을 ELISA 방법으로 측정하였다.

혈청과 활막액에서 TWEAK과 RANKL의 측정은 Peprotech 제품을 사용하였다. RANKL capture 항체는 100 ㎍/㎖을 1 ㎍/㎖ 농도가 되도록 PBS에 희석하여 ELISA 플레이트에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 12 시간 반응하였다. capture 항체 희석 용액을 제거하고 300 ㎕ 세척 버퍼[0.05% Tween-20 in PBS]로 4번 세척하였다. 세척 후, 300㎕ 블로킹 버퍼[1% BSA in PBS]를 각 웰에 넣어 1시간 동안 상온에서 반응하였다. 1시간 뒤, 세척 버퍼 300 ㎕로 4번 세척하였다. 스탠다드로 사용하기 위해 RANKL 단백 1 ㎍/㎖을 희석액[0.05% Tween-20, 0.1% BSA in PBS]에 2 ng/㎖ 농도로 희석하고, 이것을 0 ng/㎖까지 5% 순차희석하였다. 측정하고자 하는 샘플과 준비해 둔 스탠다드를 ELISA 플레이트에 100 ㎕씩 넣고, 상온에서 2시간 반응하였다. 반응 후, 4번 세척하고 검출 항체 100 ㎍/㎖을 희석액에 0.5 ㎍/㎖로 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 넣어 상온에서 2시간 반응하였다. 4번 세척 후, avidin-HRP conjugate 5.5 ㎕를 희석액 11 ㎖에 1:2000으로 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 넣고, 상온에서 30분간 반응하였다. 반응 후 4번 세척하여 Phosphate Disodium salt Hexahydrate(PNPP)/DEA 용액을 1 ㎎/㎖농도로 100 ㎕ 첨가하여 반응시켰다. 반응 후 0.2N NaOH 100 ㎕를 넣어 반응을 멈추고 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

TWEAK의 측정은 capture 항체는 100 ㎍/㎖을 0.5 ㎍/㎖ 농도가 되도록 PBS에 희석하여 ELISA 플레이트에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 12 시간 반응하였다. capture 항체 희석 용액을 제거하고 300 ㎕ 세척 버퍼로 4번 세척하였다. 세척 후, 300 ㎕ 블로킹 버퍼를 각 웰에 넣어 1시간 동안 상온에서 반응하였다. 1시간 뒤, 세척 버퍼 300 ㎕로 4번 세척하였다. 스탠다드로 사용하기 위해 RANKL 단백 1 ㎍/㎖을 희석액에 2 ng/㎖ 농도로 희석하고 이것을 0 ng/㎖까지 순차희석하였다. 측정하고자 하는 샘플과 준비해 둔 스탠다드를 ELISA 플레이트에 100 ㎕씩 넣고, 상온에서 2시간 반응하였다. 반응 후, 4번 세척하고 검출 항체 100 ㎍/㎖을 희석액에 0.5 ㎍/㎖로 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 넣어 상온에서 2시간 반응하였다. 4번 세척 후, avidin-HRP conjugate 5.5 ㎕를 희석액 11 ㎖에 1:2,000으로 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 넣고, 상온에서 30분간 반응하였다. 반응 후 4번 세척하여 Phosphate Disodium salt Hexahydrate (PNPP)/DEA 용액을 1 ㎎/㎖ 농도로 100 ㎕ 첨가하여 반응시켰다. 반응 후 0.2 N NaOH 100 ㎕를 넣어 반응을 멈추고 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, <실험예 1>의 조직염색 결과와 일치하게 OA환자와 비교하여 자가 면역 관절염 환자의 혈청 및 활막액에서 TWEAK 및 RANKL의 양이 이 서로 유의하게 상관관계를 이룬 것을 확인할 수 있었다(도 14). 이로써, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 이용하여 RANKL을 증가시킨다고 보고된 TNF와 함께 TWEAK을 동시에 억제하는 것은 더 큰 치료 효과를 나타낼 수 있을 것이라 기대된다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 제시한다.

<제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 염증성 사이토카인인 IL-17 단백질의 분비를 감소시키며, 항염증성 사이토카인인 IL-10 단백질의 분비를 증가시키며, 이러한 효과는 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 보다 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질이 더욱 우수한 효과를 나타내며, 아울러 자가 면역 관절염 환자의 활막의 RANKL과 TWEAK의 발현이 서로 유의하게 증가하므로, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 자가 면역 질환인 자가 면역 관절염의 예방 및 치료 효과를 갖는 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

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Claims

TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2) 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편 및 TWEAKR(TNF-related weak inducer of apoptosis receptor) 단백질 또는 상기 TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편이 연결된 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 200 ~ 250개의 아미노산으로 구성된 것을 특징으로 하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열 중 N 말단으로부터 23번 ~ 179번을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 3번의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인것을 특징으로 하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열 중 N 말단으로부터 28번 ~ 49번을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
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제1항에 있어서, 자가 면역 질환은 악성빈혈, 제1형 당뇨, 자가 면역 관절염, 루프스, 다발성 경화증, 반응성 관절염 및 피부근염으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
제 12항에 있어서, 자가 면역 질환은 자가 면역 관절염인것을 특징으로 하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
약제학적으로 유효한 양의 제 1항의 융합 단백질을 함유하는 약학적 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환 치료방법.