KR20230096959A - Il-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질 - Google Patents

Il-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질 Download PDF

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Abstract

본 출원은 단일 쇄 가변 단편 스캐폴딩 시스템에 융합된 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자, 및 scFv의 힌지 영역에 연결된 제2 시토카인을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질 조성물, 그의 제약 조성물, 및/또는 제제에 관한 것이다. 본 출원은 또한 암, 염증성 질환 또는 장애, 및 면역 및 면역 매개 질환 또는 장애를 치료하기 위해 이중 시토카인 융합 단백질 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

IL-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 7월 20일 출원된 미국 가출원 번호 63/054,208에 대한 우선권을 주장하며, 상기 우선권 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 개시내용은 생명공학 분야, 더욱 구체적으로 다른 염증 및 면역 조절 시토카인과 조합된 인터류킨-10 ("IL-10")을 포함하는 신규한 이중 시토카인 융합 단백질, 염증성 및 면역 질환 또는 병태를 치료하는 방법, 및/또는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
원래 시토카인 합성 억제 인자로 명명된 IL-10 (Malefyt, Interleukin 10 inhbits cytokine synthesis by human monocytes: An autoreglatory role of IL-10 produced by monocytes, 1991)은 염증 반응을 억제시키고 (Fedorak, 2000), 더욱 최근에는 CD8+ T 세포를 활성화시켜 인터페론γ ("IFNγ") 의존성 항-종양 면역 반응을 유도하는 것 (Mumm J., 2011) 둘 모두로 공지된 다면발현성 시토카인이다. IL-10은 IFNγ와 구조적 유사성을 갖는 비공유 동종이량체 시토카인이다. IL-10은 IL10 수용체 1 (IL10R1)의 두 서브유닛과 IL-10 수용체 2 (IL10R2)의 두 서브유닛으로 이루어진 IL-10 수용체에 결합한다 (Moore, 2001). IL-10 수용체 복합체는 대부분의 조혈 세포의 표면 상에서 발현되고, 대식세포 및 T 세포에서 가장 높게 발현된다. IL-10은 면역억제 시토카인 (Schreiber, 2000) 및 면역자극 시토카인 (Mumm, 2011) 둘 모두로 보고되었지만, 크론병 환자의 IL-10 치료에 대한 임상 평가에서는 그 결과로 역 용량 반응을 얻은 반면 (Fedorak, 2000; Schreiber, 2000), PEG화된 IL-10을 이용한 암 환자 치료에서는 그 결과로 용량 적정가능한 강력한 항-종양 반응을 얻었다 (Naing, 2018). PEG화된 IL-10 항-종양 반응은 내인성 CD8+ T 세포 및 IFNγ를 필요로 한다 (Mumm, 2011). 종양 보유 동물을 PEG화된 IL-10으로 치료하면 종양내 CD8+ T 세포는 증가하고, 세포당 기준으로 IFNγ는 증가한다. 그러나, 가장 최근에는 PEG화된 IL-10으로 치료받은 암 환자는 면역 자극의 증거는 보였지만, 항-종양 반응 증가의 증거는 나타내지 않았다 (Spigel, 2020).
인터류킨-2 ("IL-2")는 항-종양 면역 반응을 유도할 뿐만 아니라 (Jiang, 2016), 자연 살해 ("NK") 세포 및 CD4+ T 세포의 비제어된 활성화 및 그에 의한 IFNγ 분비 및 T 조절 세포의 확장에 기인하여 높은 독성을 보이는 것으로 공지된 (Chinen, 2016) 4-나선형 번들 다면발현성 시토카인이다. 이러한 이유로 많은 그룹들이 IL-2의 독성을 감소시키기 위한 노력의 일환으로 고친화성 수용체에 대한 그의 결합을 감소시키기 위해 IL-2를 돌연변이화시키는 시도를 해 왔다 (Chen, 2018). 상기 뮤테인은 실질적인 임상적 성공을 거두지 못했다 (Bentebibe, 2019). 이는 IL-2의 잠재적으로 치명적인 독성을 감소시키기 위해서는 다른 메커니즘을 사용하여야 한다는 것을 시사한다.
IL-10은 NK 및 CD4+ T 세포 둘 모두에 의해 분비되는 IL-2 유도된 IFNγ 생산을 억제하는 것으로 보고되었지만 (Scott, 2006), IL-2 유도된 CD8+ T 세포 증식에 대한 보조인자로서 작용하는 것으로도 또한 보고되었다 (Groux, 1998). 따라서, IL-2 및 IL-10이 면역계의 세포를 공동 활성화시키는지 또는 서로 상쇄시키는지 여부는 알려져 있지 않다.
인터류킨-4 ("IL-4")는 대부분 대식세포에 의한 대체 활성화를 유도하는 것과 연관된 (Balce, 2011), 본질적인 Th2 유도 시토카인으로 간주되는 (McGuirk, 2000), 4-나선형 번들 다면발현성 시토카인이다. IL-4는 우세하게 알레르기 반응 및 천식과 연관된 염증 유도와 관련이 있다 ([Steinke, 2001]; [Ryan, 1997]). 추가로, 일부 암세포 증식을 억제시킬 수 있는 IL-4의 능력에 기인하여 ([Lee, 2016]; [Gooch, 1998]), 암 환자는 IL-4로 안전하게 치료되었다 (Davis, 2009). IL-4는 염증유발성 시토카인의 단핵구 분비를 억제하는 것으로 보고되었지만 (Woodward, 2012), 항원 제시 세포를 프라이밍하고, 박테리아에 노출된 단핵구에 의한 염증유발성 시토카인 분비를 유도하는 그의 능력에 기인하여 강력한 항-염증성 시토카인으로 간주되지 않는다 (Varin, 2010).
놀랍게도, 주요 IL-10 수용체 결합 도메인 영역에 (서열식별번호(SEQ ID No.) 3의 성숙한 EBV IL-10 아미노산 서열의 아미노산 위치 31, 75, 또는 둘 모두에서) 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 ("EBV") IL-10 변이체가 IL-10 수용체에 결합하고 이를 활성화시키는 EBV IL-10의 능력을 변경시켰다는 것이 발견되었다. 이러한 변형에는 IL-10 수용체에 대한 EBV IL-10의 친화성을 증가시키는 능력이 포함되었다. 본 발명자는 EBV IL-10 변이체 분자가 면역 질환, 염증성 질환 또는 병태를 치료할 수 있고, 암을 치료하는 데에서 IL-10 수용체 효능제로 작용한다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 또한 단량체 EBV IL-10 변이체를 비-면역원성 가변 중쇄 ("VH") 및 가변 경쇄 ("VL") 영역을 포함하는 스캐폴딩 시스템에 도입함으로써 생성된 EBV IL-10 변이체 분자는 반감기가 연장되었고, 적절하게 폴딩되었고, 기능적으로 활성을 보였다는 것을 발견하였다. 스캐폴딩 시스템 내로 도입된 EBV IL-10 변이체는 염증성 세포 (예컨대, 단핵구/대식세포/수지상 세포) 및 면역 세포 (예컨대, CD8+ T 세포) 둘 모두 상에서 증진된 IL-10 기능을 보였다. 2020년 3월 6일 미국 출원 16/811,718로 출원된 미국 특허 10,858,412 (그 전문이 본원에서 참조로 포함)를 참조한다. 염증성 질환, 면역 질환, 및/또는 암을 치료하기 위해 IL-10 생물학적 성질을 상가적으로 또는 상승작용적으로 증진시키는 새로운 융합 단백질 구조의 일부로서 IL-10 및 또 다른 시토카인 둘 모두를 전달하는 이전에 기술된 EBV IL-10 스캐폴딩 시스템에 대한 변형에 초점을 두고 있다.
본 개시내용은 일반적으로 이중 시토카인 융합 단백질에 관한 것이다.
따라서, 제1 측면에서, 본 개시내용은 제1 시토카인으로서 모노클로날 항체의 항원 결합 단편 또는 가변 중쇄 ("VH") 및 가변 경쇄 ("VL") 영역에 융합된 IL-10 또는 IL-10 변이체, 및 항원 결합 단편의 VH와 VL 영역 사이에 연결된 제2 시토카인을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 제1 시토카인은 IL-10, 예컨대 비제한적으로 인간, 마우스, 시토메갈로바이러스 ("CMV"), 또는 EBV IL-10 형태 또는 IL-10 변이체 분자이며, 여기서, IL-10 변이체는 IL-10 수용체 결합 도메인에 영향을 미치는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 갖는다. 융합 단백질은 또한 제1 시토카인과 상이한 시토카인으로서, IL-10 또는 IL-10 변이체 분자와 함께 작용하여 제1 및 제2 시토카인이 융합 단백질에 의해 특정 항원에 표적화되었을 때, 또는 항원 결합 단편의 VH 및 VL 영역에 의해 반감기가 연장되었을 때, 상가적 또는 상승작용적 효과가 있도록 하는 제2 시토카인을 포함한다. 융합 단백질은 또한 이중 시토카인 융합 단백질을 항체, 항체 단편, 또는 그의 항원 결합 부분의 VH 및 VL 영역에 의해 인식되는 표적 항원에 지시하는 VH 및 VL 영역을 포함하는 항체, 항체 단편, 또는 항원 결합 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단편은 scFv이다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 (I)의 이중 시토카인 융합 단백질에 관한 것이다:
NH2-(IL10)-(X1)-(Zn)-(X2)-(IL10)-COOH;
상기 식에서,
"IL10"은 IL-10의 단량체이고, 여기서, IL-10은 인간, 마우스, CMV, 또는 EBV IL-10, 또는 그의 변이체이고, 더욱 바람직하게, IL10은 서열식별번호 1, 3, 9, 10, 11, 12, 14, 또는 16으로부터 선택되는 서열을 포함하는 단량체이고;
"X1"은 제1 모노클로날 항체로부터 수득된 VL 또는 VH 영역이고; "X2"는 제1 모노클로날 항체로부터 수득된 VH 또는 VL 영역이고; 여기서, X1이 VL일 때, X2는 VH이거나, 또는 X1이 VH일 때, X2는 VL이고;
"Z"는 IL-10 이외의 다른 시토카인이고;
"n"은 0-2로부터 선택되는 정수이다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 (II)의 IL-10 융합 단백질에 관한 것이다:
NH2-(IL10)-(L)-(X1)-(L)-(Zn)-(L)-(X2)-(L)-(IL10)-COOH;
상기 식에서,
"IL-10"은 서열식별번호 1, 3, 9, 10, 11, 12, 14, 또는 16으로부터 선택되는 단량체 서열이고;
"L"은 임의의 링커이고, 더욱 바람직하게, 링커는 서열식별번호 39, 40, 또는 41로부터 선택되고;
X1"은 제1 모노클로날 항체로부터 수득된 VL 또는 VH 영역이고; "X2"는 제1 모노클로날 항체로부터 수득된 VH 또는 VL 영역이고; 여기서, X1이 VL일 때, X2는 VH이거나, 또는 X1이 VH일 때, X2는 VL이고;
"Z"는 IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-21 IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, 인터페론-α, -β, -γ, TGF-β, 또는 종양 괴사 인자-α, -β, 염기성 FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, 또는 IL-13으로부터 선택되는 시토카인이고;
"n"은 0-2로부터 선택되는 정수이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 이중 시토카인 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 이중 시토카인 융합 단백질을 제조 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 이중 시토카인 융합 단백질을 제조하는 방법은 이중 시토카인 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 재조합적으로 발현시키는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 이중 시토카인 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 염증성 질환 또는 병태 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 이중 시토카인 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 염증성 질환은 크론병, 건선, 및/또는 류마티스 관절염이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 면역 질환 또는 병태 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 이중 시토카인 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 면역 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 패혈증 및/또는 패혈성 쇼크 및 이의 연관 증상을 치료, 억제 및/또는 완화시키는 방법에 관한 것이다.
상기 대표적인 측면의 단순화된 요약은 본 개시내용의 기본적인 이해를 제공하는 역할을 한다. 이 요약은 모든 고려된 측면의 광범위한 개요가 아니며, 모든 측면의 주요 또는 중요한 요소를 확인하는 것으로도 본 개시내용의 임의의 또는 모든 측면의 범주를 설명하는 것으로도 의도되지 않는다. 그의 유일한 목적은 하기 본 개시내용의 더욱 상세한 설명에 대한 서두로서 단순화된 형태로 하나 이상의 측면을 제시하는 것이다. 전술한 것을 달성하기 위해, 본 개시내용의 하나 이상의 측면은 청구범위에서 설명되고, 예시적으로 지적된 특징을 포함한다.
도 1은 미국 특허 10,858,412에 기술된 IL-10 시토카인 융합 단백질의 개략도이다.
도 2는 이중 시토카인 융합 단백질이 말단 연결된 IL-10 단량체 (또는 IL-10 변이체)를 포함하고, 여기서, 제2 시토카인은 scFv의 VH와 VL 사이의 링커 내로 도입된 것인, 본 개시내용에서 구현된 이중 시토카인 융합 단백질의 개략도이다.
도 3은 scFv의 VH 및 VL에 연결된 DV07 (EBV IL-10의 IL-10 수용체 고친화성 변이체), 및 최극단의 C-말단 IL-10 단량체의 카르복시 말단에 융합된 IL-2를 포함하는 ("SLP-IL-2"로 명명되는) 대안적 형태의 2개의 시토카인을 포함하는 융합 단백질의 개략도이다.
도 4는 단핵구/대식세포로부터의 TNFα 분비 감소율(%)에 대해 SLP-IL-2를 IL-10, IL-2, 및 IL-10과 IL-2의 조합과 비교하는 적정 연구이다.
도 5는 단핵구로부터의 TNFα 분비 감소율(%)에 대해 DK210을 IL-10 및 DegfrDV07 (SLP 변이체 3; 서열식별번호 31)과 비교하는 적정 연구이다.
도 6은 SLP 및 DK210을 비교한 T 세포 IFNγ 강화 검정이다. 진한 회색 막대는 두 시토카인의 혈청 최저 치료 농도를 나타내고, 옅은 회색 막대는 DK210에 대한 예상 치료 농도 요건을 나타낸다.
도 7은 NK 세포, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 상의 IL-10이 IL-2 매개 IFNγ 유도에 대한 효과를 결정하는 검정이다. 진한 회색 막대는 두 시토카인의 혈청 최저 치료 농도를 나타내고, 옅은 회색 막대는 DK210에 대한 예상 치료 농도 요건을 나타낸다.
도 8은 T 세포에서 모델 항원 제시에 대한 시토카인의 효과를 측정하는 검정이다.
도 9는 항원 노출 후 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 IFNγ의 유도를 측정하는 검정이다.
도 10은 Degfr:DV07 또는 DK210으로 처리된 마우스에서 항종양 효과를 비교하는 생체내 CT26 (hEGFR+) 종양 마우스 모델 연구이다.
도 11은 Degfr:DV07 또는 DK210으로 처리된 마우스의 체중을 비교한 생체내 CT 26 (hEGFR+) 종양 마우스 모델 연구이다.
도 12는 Degfr:DV07 및 DK210으로 처리된 마우스의 생존을 비교한 생체내 CT26 (hEGFR+) 종양 마우스 모델 연구이다.
도 13은 단핵구로부터의 TNFα 분비 감소율(%)에 대한 IL-10, IL-4, 및 IL-10 및 IL-4에 대한 적정 연구이다.
도 14는 단핵구로부터의 TNFα 분비 감소율(%)에 대한 IL-10, IL-4, IL-4 및 DeboWtEBV, 및 DeboWtEBV 단독에 대한 적정 연구이다.
도 15는 DeboWtEBV 단독에 비해 DeboWtEBV 및 IL-4를 비교하는 T 세포 IFNγ 강화 검정이다.
도 16은 단핵구/대식세포에 의한 LPS 유도된 TNFα 분비 억제에 대한 IL-10, IL-4, DeboDV06, 및 IL-4와 조합된 DeboDV06을 평가하는 적정 연구이다.
도 17은 DK410 형태로 지정된 분자 부류의 개략도이다.
도 18은 단핵구/대식세포에 의한 LPS 유도된 TNFα 분비 억제에 대한 IL-10, IL-4, DeboDV06, 및 IL-4와 조합된 IL-10을 비교하여 DK410 형태의 IL-4DeboDV06 (이는 또한 "4DeboDV06"으로 공지)을 평가하는 적정 연구이다.
도 19는 CD8+ T 세포 상에서 IL-10, IL-4, DeboDV06, 및 IL-4와 조합된 DeboDV06과 비교하여 DK410 형태의 IL-4DeboDV06 (이는 또한 "4DeboDV06"으로도 공지)을 평가하는 적정 연구이다.
도 20은 비-글리코실화 (N38A) 및 고친화성 (T13D) 형태의 인간 IL-4를 포함하는 DK410 분자 부류의 구성원인 IL-4HADeglymCD14DV06 및 IL-4HADeglymCD14DV07을 대식세포/단핵구에 의한 LPS 유도된 TNFα 분비 억제에 대해 IL-10, IL-4, 및 DK410 형태의 IL-4DeboDV06 (이는 또한 "4DeboDV06"으로도 공지)과 비교하여 평가하는 적정 연구이다.
도 21은 N38A에 단일 치환을 포함하여 비-글리코실화된 형태의 IL4로 생성된 DK410 분자 부류의 구성원인 IL-4ngDmCD14DV06 및 IL-4ngDmCD14DV07을 단핵구/대식세포에 의한 LPS 유도된 TNFα 분비 억제에 대해 IL-10과 비교하여 평가하는 적정 연구이다.
도 22는 N38A에 단일 치환을 포함하여 비-글리코실화된 형태의 IL4로 생성된 DK410 분자 부류의 구성원인 IL-4ngDmCD14DV06 및 IL-4ngDmCD14DV07을 CD8+ T 세포에 의한 IFNγ 유도 매개에 대해 IL-10과 비교하여 평가하는 적정 연구이다.
도 23은 N38A에 단일 치환을 포함하여 비-글리코실화된 형태의 IL4로 생성된 DK410 분자 부류의 구성원인 IL-4ngDmMAdCAMDV06을 단핵구/대식세포에 의한 LPS 유도된 TNFα 분비 억제에 대해 IL-10과 비교하여 평가하는 적정 연구이다.
도 24는 N38A에 단일 치환을 포함하여 비-글리코실화된 형태의 IL4로 생성된 DK410 분자 부류의 구성원인 IL-4ngDmMAdCAMDV06을 CD8+ T 세포에 의한 IFNγ 유도 매개에 대해 IL-10과 비교하여 평가하는 적정 연구이다.
도 25는 LPS 투여 이전 및 이후에 IL-4ngDmMAdCAMDV06으로 처리된 마우스의 생존을 비교한 생체내 패혈증 마우스 모델 연구이다.
상세한 설명
본원에서는 IL-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질, IL-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질의 제조 방법, 및 염증성 질환 또는 병태, 면역 질환 또는 병태를 치료하기 위해, 암을 치료 및/또는 예방하기 위해 IL-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질을 사용하는 방법과 관련하여 예시적인 측면을 기술한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 하기 설명이 단지 예시적인 것이며, 어떤 식으로든 제한하려는 것으로 의도되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 본 개시내용의 이점을 갖는 다른 측면이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 쉽게 제안될 것이다. 이제 첨부된 도면에 예시된 바와 같은 예시적인 측면의 구현에 대해 상세히 참조될 것이다. 동일한 참조 인디케이터는 동일하거나 유사한 항목을 참조하기 위해 도면 및 하기 설명 전체에 걸쳐 가능한 한도까지 사용될 것이다.
본원에 기술된 것과 유사하거나, 또는 등가인 다수의 방법 및 물질이 기술된 다양한 실시양태의 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에서 기술된다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 기술된 실시양태는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 분자 생물학, 생화학, 약리학, 화학 및 면역학의 통상적인 방법 및 기술을 이용한다. 인간, 마우스, CMV 및/또는 EBV 형태의 IL-10을 포함하나, 이에 제한되지 않는, IL-10 변이체를 디자인하고 제작하기 위한 여러 일반 기술 뿐만 아니라, IL-10 변이체를 시험하기 위한 검정법은 관련 기술분야에서 용이하게 입수가능하고 상세하게 설명된 널리 공지된 방법이다. 예컨대, 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)]; [Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)]; [Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications)]; [A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)]을 참조한다. N-말단 알데히드 기반 PEG화 화학이 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
정의
하기 용어를 사용하여 본원에서 논의된 다양한 실시양태를 기술할 것이고, 하기 나타낸 바와 같이 정의되는 것으로 의도된다.
다양한 실시양태를 기술하는 데 본원에서 사용된 바, 단수 형태 "하나"는 내용상 명백히 달리 지시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다.
"약"이라는 용어는 명시된 수치 또는 수치 범위로부터 0.0001-5%의 편차를 나타낸다. 한 실시양태에서, "약"이라는 용어는 명시된 수치 또는 수치 범위로부터 1-10%의 편차를 나타낸다. 한 실시양태에서, "약"이라는 용어는 명시된 수치 또는 수치 범위로부터 최대 25%의 편차를 나타낸다. 더욱 구체적인 실시양태에서, "약"이라는 용어는 야생형 서열과 비교할 때 뉴클레오티드 서열 상동성 또는 아미노산 서열 상동성의 측면에서 1-25%의 차이를 지칭한다.
용어 "인터류킨-10" 또는 "IL-10"은 동종이량체를 형성하기 위해 비공유적으로 연결된 2개의 서브유닛을 포함하는 단백질을 지칭하며, 여기서, IL-10은 2개의 6개 나선 번들 (나선 A-F)의 삽입된 이량체이다. 본원에서 사용된 바, 달리 명시되지 않는한, "인터류킨-10" 및 "IL-10"은 인간 IL-10 ("hIL-10"; 진뱅크 수탁 번호(Genbank Accession No.) NP_000563; 또는 미국 특허 번호 6,217,857) 단백질 (서열식별번호 1) 또는 핵산 (서열식별번호 2); 마우스 IL-10 ("mIL-10"; 진뱅크 수탁 번호: M37897; 또는 미국 특허 번호 6,217,857) 단백질 (서열식별번호 7) 또는 핵산 (서열식별번호 8); 또는 바이러스 IL-10 ("vIL-10")을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의 형태의 IL-10을 지칭한다. 바이러스 IL-10 상동체는 EBV 또는 CMV (각각 진뱅크 수탁 번호 NC_007605 및 DQ367962)로부터 유래될 수 있다. 용어 EBV-IL10은 EBV IL-10 단백질 상동체 (서열식별번호 3) 또는 핵산 상동체 (서열식별번호 4)를 지칭한다. 용어 CMV-IL10은 CMV IL-10 단백질 상동체 (서열식별번호 5) 또는 핵산 상동체 (서열식별번호 6)를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "단량체(monomeric)" IL-10 또는 IL-10의 "단량체"라는 용어는 비공유적으로 연결될 때, IL-10 또는 변이체 IL-10의 동종이량체를 형성하는 IL-10 또는 변이체 IL-10의 개별 서브유닛을 지칭한다. "야생형," "wt" 및 "본래의"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 해당하는 특정 IL-10의 기원의 종에서 자연상에서 흔히 발견되는 단백질 (예컨대, IL-10, CMV-IL10 또는 EBV IL-10)의 서열을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 용어 "야생형" 또는 "본래의" EBV IL-10은 자연상에서 가장 흔히 발견되는 아미노산 서열에 상응할 것이다.
용어 "변이체," "유사체" 및 "뮤테인"은 원하는 활성, 예컨대, 예를 들어 항-염증 활성을 유지하는 참조 분자의 생물학적으로 활성인 유도체를 지칭한다. 일반적으로, 용어 "변이체," "변이체들," "유사체" 및 "뮤테인"이 폴리펩티드와 관련이 있는 경우, 이는 본래의 분자와 비교하여 하나 이상의 아미노산 부가, 치환 (본질적으로 보존적일 수 있다) 및/또는 결실을 갖는 본래의 폴리펩티드 서열 및 구조를 가진 화합물 또는 화합물들을 지칭한다. 따라서, 용어 "IL-10 변이체," "변이체 IL-10," "IL-10 변이체 분자," 및 그의 문법적 변형어 및 복수 형태는 모두 서열 동일성 또는 상동성이 야생형 IL-10과 1-25% 차이가 나는 IL-10 아미노산 (또는 핵산) 서열을 지칭하는 등가의 용어인 것으로 의도된다. 따라서, 예를 들어, EBV IL-10 변이체 분자는 하나 이상의 아미노산 (또는 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열) 부가, 치환 및/또는 결실을 가짐으로써 야생형 EBV IL-10과 상이한 것이다. 따라서, 한 형태에서, EBV IL-10 변이체는 약 1-42개 아미노산 차이에 해당하는 서열 상동성에서의 약 1% 내지 25% 차이를 가짐으로써 서열식별번호 3의 야생형 서열과 상이한 것이다. 한 실시양태에서, IL-10 변이체는 V31L 아미노산 돌연변이 ("DV05"; 서열식별번호 12), A75I 아미노산 돌연변이 ("DV06"; 서열식별번호 14), 또는 V31L 및 A75I 아미노산 돌연변이 둘 모두 ("DV07"; 서열식별번호 16)를 포함하는 EBV IL-10이다.
용어 "융합 단백질"은 자연적으로는 일반적으로 존재하지 않는 단백질의 신규한 배열을 생성하는 둘 이상의 단백질 또는 폴리펩티드의 조합 또는 접합을 지칭한다. 융합 단백질은 둘 이상의 단백질 또는 폴리펩티드의 공유적인 연결의 결과이다. 융합 단백질을 구성하는 둘 이상의 단백질은 아미노-말단 단부 ("NH2")에서부터 카르복시-말단 단부 ("COOH")까지 임의의 배치로 배열될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 한 단백질의 카르복시-말단 단부는 또 다른 단백질의 카르복시 말단 단부 또는 아미노 말단 단부에 공유적으로 연결될 수 있다. 예시적인 융합 단백질은 단량체 IL-10 또는 단량체 변이체 IL-10 분자와 하나 이상의 항체 가변 도메인 (즉, VH 및/또는 VL) 또는 단일 쇄 가변 영역 ("scFv")의 조합을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 또한 이량체를 형성하거나, 또는 동일한 유형의 다른 융합 단백질과 회합하여 융합 단백질 복합체를 생성할 수 있다. 융합 단백질의 복합체화는 일부 경우에 복합체화되지 않은 융합 단백질과 비교할 때 융합 단백질의 기능성을 활성화시키거나, 또는 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 항체 가변 도메인을 갖는 단량체 IL-10 또는 단량체 변이체 IL-10 분자는 IL-10 수용체와 결합하는 데 있어서 제한된 또는 감소된 능력을 가질 수 있지만; 융합 단백질이 복합체화될 때, IL-10 또는 변이체 IL-10 분자의 단량체 형태는 동종이량체가 되고, 가변 도메인은 기능적 디아바디와 회합한다.
"상동체," "상동성," "상동성인" 또는 "실질적으로 상동성인"이라는 용어는 적어도 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 적어도 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 동일성(%)을 지칭한다. 서열이 정의된 길이의 분자에 걸쳐 적어도 약 50%, 바람직하게 적어도 약 75%, 더욱 바람직하게, 적어도 약 80%-85%, 바람직하게 적어도 약 90%, 및 가장 바람직하게 적어도 약 95%-98%의 서열 동일성을 보일 때, 서열은 서로 상동성인 것이다.
용어 "서열 동일성"은 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 대응을 지칭한다. 서열 동일성은 100%의 서열 동일성 내지 50%의 서열 동일성 범위일 수 있다. 서열 동일성(%)은 서열을 정렬시키고, 정렬된 두 서열 사이의 정확한 매칭 개수를 카운팅하고, 참조 서열의 길이로 나누고, 결과에 100을 곱함으로써 두 분자 (참조 서열, 및 참조 서열과의 동일성(%)이 공지되지 않은 서열) 사이의 서열 정보를 직접적으로 비교하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 용이하게 이용가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 동일성(%) 확인을 지원할 수 있다.
"대상체," "개체" 또는 "환자"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 척추동물, 바람직하게, 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 뮤린, 설치류, 유인원, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물, 및 특정 애완동물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"투여하는"이라는 용어는 본 출원의 활성 성분이 그의 의도된 기능을 수행하도록 하는 투여 경로를 포함한다.
예를 들어, 본원에 기술된 EBV IL-10 변이체 또는 그의 융합 단백질의 투여와 관련하여 "치료 유효량"은 특정 생물학적 활성을 촉진시키는 데 충분한 EBV IL-10 변이체 또는 그의 융합 단백질의 양을 지칭한다. 이는 예를 들어, 골수 세포 기능의 억제, 증강된 쿠퍼 세포 활성, 및/또는 CD8+ T 세포에 대한 임의의 효과의 결여, 또는 증강된 CD8+ T 세포 활성 뿐만 아니라, Fc 수용체의 비만 세포 상향조절의 차단, 또는 탈과립화의 예방을 포함할 수 있다. 따라서, "유효량"은 의학적 병태의 증상 또는 징후를 호전시키거나, 또는 예방할 것이다. 유효량은 또한 진단을 가능하게 하거나, 또는 용이하게 하는 데 충분한 양을 의미한다.
"치료하다" 또는 "치료"라는 용어는 질환 또는 병태의 효과를 감소시키는 방법을 지칭한다. 치료는 또한 단지 증상이 아니라, 질환 또는 병태 자체의 근본적인 원인을 감소시키는 방법을 지칭할 수 있다. 치료는 본래의 수준으로부터 임의의 감소일 수 있고, 질환, 병태, 또는 질환 또는 병태의 증상의 완전한 제거일 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
하기 표는 본 개시내용에서 참조되는 IL-10을 포함하는 다양한 IL-10 융합 단백질 및 이중 시토카인 융합 단백질에 대한 정의를 제공한다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
이중 시토카인 융합 단백질 구조
본 개시내용은 이전에 미국 특허 10,858,412 (미국 출원 번호 16/811,718로 출원) (이는 그 전문이 본원에서 참조로 포함)에서 기술된 IL-10 융합 단백질의 실시양태에 대한 개선을 제공한다. IL-10 융합 단백질에 대한 개선은 이전에 기술된 IL-10 융합 단백질에 제2 시토카인 분자를 도입하는 것을 포함한다. 도 1은 미국 특허 10,858,412에 기술된, 이전에 개시된 IL-10 융합 단백질 구축물들 중 하나를 나타내는 개략도이다. 이 IL-10 융합 단백질은 각 말단에 2개의 IL-10 단량체 (즉, 아미노 말단 단부 상의 제1 IL-10 단량체 및 카르복시 말단 단부 상의 제2 IL-10 단량체)를 특징으로 하는 VH 및 VL scFv 스캐폴딩에서 구축된다. 1차 스캐폴딩 시스템은 인간 항-에볼라 항체로부터 수득된 scFv를 포함한다. 미국 특허 10,858,412에 기술된 IL-10 융합 단백질은 VH에 상보성 결정 영역 ("CDR") 1-3 및 VL에 CDR 1-3을 갖는 6개의 CDR을 포함한다. 임의적으로, VH 및 VL 영역은 IL-10 융합 단백질을 특정 항원에 표적화할 수 있다. 이는 VH 및 VL 쌍의 6개의 CDR 영역 (VH에 3개의 CDR 및 VL에 3개의 CDR)을 수용체 또는 항원 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 VH 및 VL로부터의 6개의 CDR 영역으로 치환함으로써 달성된다. 6개의 CDR 및 프레임워크 영역을 치환 및 최적화하고, 이들 CDR을 본원에 기술된 scFv 스캐폴딩으로 인그라프팅할 수 있는 능력은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 널리 공지되어 있고, 그에 의해 실시된다. 어느 통상의 기술자라도 관심 특정 표적에 기초하여 결정할 수 있을 임의의 모노클로날 항체로부터의 6개의 CDR로 상기 6개의 CDR 영역은 치환될 수 있다.
제1 측면에서, 본 출원은 IL-10 및 적어도 하나의 다른 시토카인을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질로서, 이에 의해 이중 시토카인 융합 단백질은 이전에 미국 특허 10,858,412에 기술된 IL-10 융합 단백질과 비교하여 조합된 또는 상승작용적 기능성을 갖는 것인, 이중 시토카인 융합 단백질에 관한 것이다. 도 2는 IL-10을 포함하는 개선된 이중 시토카인 융합 단백질의 대표도이다. 특히, 개선된 이중 시토카인 융합 단백질은 IL-10의 두 단량체가 아미노 및 카르복시 말단 단부에서 이중 융합 단백질을 종결하도록 VH 및 VL scFv로 구성된 동일하거나, 또는 실질적으로 동일한 스캐폴딩 시스템을 적합화시킨다. 제2 시토카인은 scFv의 힌지 영역인 scFv의 VH와 VL 영역 사이에 융합됨으로써 IL-10 융합 단백질에 접합된다. 이중 시토카인 융합 단백질은 IL-10 단량체가 기능성 IL-10 분자로 동종이량체화되고, VH 및 VL 영역은, 함께 회합하여 항원 결합 및 인식을 허용하는 scFv 복합체를 형성하는 쌍을 형성하도록 기능성 단백질 복합체를 형성할 수 있다.
특정 실시양태에서, IL-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질은 하기 화학식 I을 갖는 구조이다
NH 2 -(IL10)-(X 1 )-(Z n )-(X 2 )-(IL10)-COOH
상기 식에서,
"IL-10"은 임의의 IL-10 단량체, 예컨대 비제한적으로 인간, 마우스, CMV 또는 EBV IL-10, 또는 IL-10 변이체 분자이고;
"X1"은 제1 모노클로날 항체로부터 수득된 VL 또는 VH 영역이고;
"X2"는 제1 모노클로날 항체로부터 수득된 VH 또는 VL 영역이고;
여기서, X1이 VL일 때, X2는 VH이거나, 또는 X1이 VH일 때, X2는 VL이고;
"Z"는 제2 시토카인으로, 여기서, 제2 시토카인은 IL-10 이외의 다른 시토카인이고;
"n"은 0-2로부터 선택되는 정수이다.
또 다른 실시양태에서, IL-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질은 하기 화학식 II를 갖는 구조이다
NH 2 -(IL10)-(L)-(X 1 )-(L)-(Z n )-(L)-(X 2 )-(L)-(IL10)-COOH
상기 식에서,
"IL-10"은 IL-10 단량체이고;
"L"은 링커, 바람직하게, 서열식별번호 39, 40, 또는 41의 링커이고;
"X1"은 제1 모노클로날 항체로부터 수득된 VL 또는 VH 영역이고;
"X2"는 제1 모노클로날 항체로부터 수득된 VH 또는 VL 영역이고;
여기서, X1이 VL일 때, X2는 VH이거나, 또는 X1이 VH일 때, X2는 VL이고;
"Z"는 제2 시토카인이고;
"n"은 0-2로부터 선택되는 정수이다.
한 실시양태에서, IL-10 단량체는 인간 (서열식별번호 1), CMV (서열식별번호 5), EBV (서열식별번호 3), 또는 마우스 (서열식별번호 7)를 비롯한, 임의 형태의 IL-10을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, IL-10 단량체는 미국 특허 10,858,412에 기술된 것을 비롯한, EBV IL-10 (서열식별번호 3)의 변형된 형태 또는 변이체 형태이다. 바람직한 실시양태에서, EBV IL-10은 서열식별번호 3 중 아미노산 위치 31 (본원에서 "DV05"로 명명), 75 (본원에서 "DV06"으로 명명), 또는 둘 모두 (본원에서 "DV07"로 명명)에 하나 이상의 치환을 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, IL-10 단량체는 서열식별번호 9, 10, 11, 12, 14, 또는 16의 서열이다. IL-10 또는 IL-10 변이체 분자의 제1 및 제2 단량체는 각각 도 1에 제시되어 있는 바와 같이 융합 단백질의 말단 단부에 위치해 있다 (즉, 제1 단량체는 아미노 말단 단부에 위치해 있고, 제2 단량체는 카르복시 말단 단부에 위치해 있다).
또 다른 실시양태에서, VH 및 VL 영역은 항체, 항체 단편, 또는 그의 항원 결합 단편으로부터의 것이다. 항원 결합 단편은 scFv, Fab, F(ab')2, V-NAR, 디아바디 또는 나노바디를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, VH 및 VL은 단일 쇄 가변 단편 ("scFv")으로부터의 것이다.
또 다른 실시양태에서, IL-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질은 단일 항체로부터의 VH 및 VL 쌍을 포함한다. VH 및 VL 쌍은 IL-10 또는 그의 변이체의 단량체가 부착되어 IL-10 또는 그의 변이체의 단량체가 기능성 IL-10 분자로 동종이량체화될 수 있도록 하는 스캐폴딩으로서 작용할 수 있다. 따라서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 융합 단백질에 사용되는 VH 및 VL 스캐폴딩은 IL-10 단량체 또는 IL-10 단량체 변이체의 적절한 동종이량체화에 필요한 원하는 물리적 속성 및 VH 및 VL 표적화 능력을 유지시키기 위한 요구에 기초하여 선택될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 유사하게, 통상의 기술자는 또한 VH 및 VL 쌍 내의 6개의 CDR (VH로부터의 3개의 CDR 및 VL로부터의 3개의 CDR) 또한 특이적으로 표적화된 융합 단백질을 수득하기 위해 다른 항체로부터의 6개의 CDR로 치환될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 한 실시양태에서, 임의의 모노클로날 항체의 VH로부터의 3개의 CDR 및 VL로부터의 3개의 CDR (즉, VH 및 VL 쌍)은 서열식별번호 18, 20, 21, 23, 24, 또는 25를 포함하는 스캐폴딩 시스템 내로 인그라프팅될 수 있다. 융합 단백질이 임의의 특정 항원을 표적화하는 것으로 의도되지 않는 경우, VH 및 VL 쌍은 예컨대, 항-HIV 및/또는 항-에볼라 항체의 VH 및 VL 쌍과 같이, 임의의 특정 항원을 표적화하지 않는 (또는 생체내에서 존재비가 낮은 항원인) 스캐폴딩으로서 선택될 수 있다는 것 또한 구상된다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 출원의 IL-10 융합 단백질은 인간 항-에볼라 항체로부터의 VH 및 VL 쌍, 더욱 바람직하게, 서열식별번호 18, 21, 또는 25의 서열을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 1-4개 범위의 가변 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 가변 영역은 동일한 항체로부터 또는 적어도 2개의 상이한 항체로부터의 것일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체 가변 쇄 또는 VH 및 VL 쌍 또는 VH 및 VL 쌍의 6개의 CDR의 표적 특이성은 단백질, 세포 수용체 및/또는 종양 연관 항원을 표적화하는 것을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 임의의 VH 및 VL 쌍으로부터의 CDR 영역은 상기 기술된 스캐폴딩 시스템 내로 인그라프팅될 수 있고, 이로써, 스캐폴딩은 바람직하게, IL-10 단량체가 인간 항-에볼라 항체의 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv에 연결되어 있고, 제2 시토카인은 scFv의 힌지 영역에 연결되어 있는 (도 2에 개략적으로 제시), Debo로 명명되는 시스템 (도 1에 개략적으로 제시)을 포함한다. 더욱 바람직하게, Debo 스캐폴딩 시스템 내로의 인그라프트먼트는 서열식별번호 18, 20, 21, 23, 24, 또는 25의 서열을 포함하는 스캐폴딩에서 이루어진다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 예를 들어, EGFR, PDGFR, VEGFR1, VEGFR2, Her2Neu, FGFR, GPC3, 또는 다른 종양 연관 항원, MAdCam, ICAM, VCAM, CD14 또는 다른 염증 연관 세포 표면 단백질, HIV 및/또는 에볼라에 대한 항체로부터의 가변 영역과 같이, 가변 영역 또는 VH 및 VL 쌍 또는 VH 및 VL 쌍의 6개의 CDR은 각종 질환 (예컨대, 암)과 연관된 항원, 또는 건강한 대상체의 혈청에서는 전형적으로는 발견되지 않거나, 또는 드물게 발견이 되는 항원을 표적화하는 항체로부터 수득된다. 따라서, 한 실시양태에서, 가변 영역은 예를 들어, 항-EGFR, 항-MAdCam, 항-HIV (Chan et al., J. Virol, 2018, 92(18):e006411-19), 항-ICAM, 항-VCAM, 항-CD14, 또는 항-에볼라 (미국 공개 출원 2018/0180614 (그 전문이 참조로 포함), 특히, 표 2, 3, 및 4에 기술된 mAb) 항체로부터 수득되거나, 또는 유래된다. 또 다른 실시양태에서, 가변 영역은 IL-10이 그의 생물학적 효과를 유도할 수 있도록 특정한 표적 영역에 대해 시토카인, 예컨대 IL-10의 농도를 농축시킬 수 있는 항체로부터 수득되거나, 또는 유래된다. 이러한 항체는 특정 이환 영역에서 과다발현되거나, 또는 상향조절된 수용체 또는 항원을 표적화하는 것 또는 영향을 받은 특정한 부위에서 특이적으로 발현되는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); CD52; CD14; 다양한 면역 체크포인트 표적, 예컨대 비제한적으로 몇 가지 예를 들면, PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 또는 CTLA4; CD20; CD47; GD-2; VEGFR1; VEGFR2; HER2; PDGFR; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5T4; Trop2; EDB-FN; TGFβ 트랩; MAdCam, β7 인테그린 서브유닛; α4β7 인테그린; α4 인테그린 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; 및 SR-J1에 대해 특이적인 항체로부터 수득될 수 있다. IL-10 (예컨대, 인간, CMV, 또는 EBV) 또는 변이체 IL-10 분자 (본원에 기술됨)의 단량체는 가변 영역 (VH 또는 VL)의 아미노 말단 단부 또는 카르복시 말단 단부에 접합되고, 이로써, 단량체 IL-10 또는 변이체 IL-10 분자는 서로 이량체화할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, IL-10 (또는 변이체 IL-10)의 단량체는 화학식 I 또는 II에 따라 VH 및 VL 쌍에 융합되고, 여기서, IL-10 단량체는 EBV IL-10, DV05, DV06, 또는 DV07 형태의 IL-10이다.
이중 시토카인 융합 단백질 또는 이중 시토카인 융합 단백질 복합체는 또한 항원 표적화 기능을 가질 수 있다. 이중 시토카인 융합 단백질 또는 이중 시토카인 융합 단백질 복합체는 함께 회합하여 항원 결합 부위 또는 ABS를 형성할 수 있는 VH 및 VL 쌍을 포함할 것이다. 일부 배치에서, IL-10 단량체 또는 그의 IL-10 변이체 단량체는 항원 결합 부위를 포함하는 단부에 공유 결합될 것이다. 가변 영역은 대상체에서 항원성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산을 변경함으로써 (예컨대, 부가, 차감 또는 치환에 의해) 추가로 변형될 수 있다. 가변 영역에 대한 다른 변형은 VH 및 VL 영역의 6개 CDR 영역 외부에서 발견되고, scFv의 VH 및 VL 영역의 안정성 및 발현을 증가시키는 역할을 하는 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형은 서열식별번호 27, 29, 31, 또는 33에 기술된 변형을 포함할 수 있으며, 여기서, CDR 영역은 항-EGFR 항체의 VH 및 VL 영역으로부터 수득되고, CDR 외부 영역은 scFv를 안정화시키도록 최적화되고/거나, 발현을 증가시키기 위해 최적화되며, 이는 scFv의 VH 및 VL 영역 사이에 제2 시토카인을 연결하기 위한 기초로서 사용될 수 있다. 이러한 유형의 변형이 통상의 기술자의 범위 내에 있음을 입증하기 위해, DV07을 포함하고, 인간 HER2를 표적화하는 DK210 형태의 분자 (즉, DK210her2), 예컨대, 서열식별번호 52-54, 또는 55, 더욱 바람직하게, 서열식별번호 54 (변이체 4) 또는 55 (변이체 5)에 기술된 것에 CDR 영역 및 CDR 외부 영역에 대하여 유사하게 변형시켰다. 또한, DV06을 포함하고, 인간 CD14를 표적화하는 DK410 형태의 분자 (즉, DK410CD14DV06), 예컨대, 서열식별번호 56-58, 또는 59, 더욱 바람직하게, 서열식별번호 56 (변이체 2)에 기술된 것에 CDR 영역 및 CDR 외부 영역에 대해서도 유사하게 변형시켰다. 상기 및 다른 변형은 또한 DV07을 포함하고, 인간 VEGFR1 또는 VEGFR2를 표적화하는 DK210 형태의 분자; 또는 DV06을 포함하고, 인간 VEGFR1 또는 VEGFR2를 표적화하는 DK410 형태의 분자에 대해서도 이루어질 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 scFv를 안정화하고/거나, 발현 목적을 위해 서열을 최적화하는 다른 변형을 결정할 수 있을 것이다.
VH 및 VL 쌍은 다수의 항체에 대해 수득된 CDR 영역이 그라프팅 또는 인그라프팅될 수 있는 스캐폴딩을 형성한다. 이러한 항체 CDR 영역은 상기 공지되고, 기술된 항체를 포함한다. 상기 기술된 VH 및 VL 스캐폴딩의 CDR 영역은 CDR 인그라프트먼트/삽입을 위해 이용가능한 하기 개수의 아미노산 위치를 포함할 것이다:
Figure pct00005
바람직한 실시양태에서, IL-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질은 VH 및 VL 쌍이 항-에볼라 항체 (예컨대, 서열식별번호 19, 27, 29, 31, 및 33에 기술된 것)로부터 유래되고, 이로써, 항-에볼라 항체로부터의 6개의 CDR 영역은 제거되고, 예컨대 비제한적으로 EGFR; CD52; CD14; 다양한 면역 체크포인트 표적, 예컨대 비제한적으로 PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 또는 CTLA4; CD20; CD47; GD-2; VEGFR1; VEGFR2; HER2; PDGFR; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, CD14, FAPα; 5T4; Trop2; EDB-FN; TGFβ 트랩; MAdCam, β7 인테그린 서브유닛; α4β7 인테그린; α4 인테그린 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; 및 SR-J1에 대한 것과 같은, 특정 표적화 항체의 VH 및 VL 쌍이 인그라프팅된 것인 상기 기술된 스캐폴딩 IL-10 융합 단백질을 포함할 것이다. 한 실시양태에서, 6개의 항-에볼라 CDR 영역은 항-EGFR, 항-MAdCAM, 항-VEGFR1, 항-VEGFR2, 항-PDGFR, 또는 항-CD14로부터의 6개의 CDR 영역으로 치환된다. 바람직한 실시양태에서, IL-10 융합 단백질은 상기 기술된 항체로부터의 CDR 중 임의의 것이 인그라프팅될 수 있는 서열식별번호 18, 20, 21, 23, 24, 또는 25의 서열이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, IL-10 융합 단백질은 서열식별번호 19, 22, 또는 26의 서열이다. 바람직한 실시양태에서, 제2 시토카인, 예컨대 비제한적으로 IL-2, IL-4, IFNα는 서열식별번호 18-27, 29, 31, 또는 33의 서열을 갖는 IL-10 융합 단백질로부터의 인간 항-에볼라 항체로부터 수득된 scFv의 VH와 VL 사이의 힌지 영역에 연결된다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 제2 시토카인은 도 2에 도시된 바와 같이, scFv의 VH와 VL 사이에 융합된다. 제2 시토카인은 제2 시토카인이 그의 기능적 특성을 유지하도록 VH 또는 VL 영역 사이에 접합된다. 한 실시양태에서, 제2 시토카인은 IL-10 단량체와 상이한 것이다. 또 다른 측면에서 제2 시토카인은 IL-10이다. 한 실시양태에서, 제2 시토카인은 IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-21, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, 인터페론-α, -β, -γ, TGF-β, 또는 종양 괴사 인자-α, -β, 염기성 FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, 또는 IL-13이다. 바람직한 실시양태에서, 이중 시토카인 융합 단백질 중 제2 시토카인은 IL-10 및 IL-2 또는 IL-4를 포함한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 이중 시토카인 융합 단백질은 서열식별번호 35, 46-58 또는 59의 서열이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 이중 시토카인 융합 단백질은 DV05, DV06, 또는 DV07로부터 선택되는 IL-10 변이체 분자로서; IL-10 변이체 분자는 인간 항-에볼라 항체로부터의 VH 및 VL 영역을 포함하는 스캐폴딩 시스템 (즉, Debo)에 연결되고, 여기서, 항-EGFR, 항-HER2, 항-CD14, 항-VEGFR1, 항-VEGFR2, 항-MAdCAM, 또는 항-PDGFR로부터 선택된 항체의 CDR이 함께 Debo 내로 인그라프팅되고; IL-2, IL-4, IFNα로부터 선택된 제2 시토카인이 VH 및 VL 쌍의 힌지 영역에 연결되는 것인 IL-10 변이체 분자를 포함할 것이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 이중 시토카인은 서열식별번호 35, 46-58, 또는 59의 융합 단백질이다.
추가의 다른 실시양태에서, IL-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질은 링커를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 융합 단백질 부분의 적절한 공간 배치를 달성하기 위해 링커 또는 스페이서가 사용되고, 따라서, IL-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질의 형성에 사용할 적절한 링커를 선택할 수 있다는 것을 알고 있다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 링커 또는 스페이서는 무작위 아미노산 서열 (예컨대, SSGGGGS (서열식별번호 39), GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호 40) 또는 SSGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호 41)) 항체의 불변 영역일 수 있다. 불변 영역은 비제한적으로 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD 또는 IgE로부터 유도될 수 있다. 한 실시양태에서, 링커 또는 스페이서는 불변 중쇄 ("CH") 영역 1, CH2, 또는 CH3이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 링커 또는 스페이서는 서열식별번호 40의 무작위 아미노산 서열이다. 또 다른 측면에서, 링커 또는 스페이서는 적어도 2개의 쇄간 디술피드 결합을 추가로 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 IL-10 및 제2 시토카인을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 따라서, 한 실시양태는 서열식별번호 35, 46-58, 또는 59에 기술된 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 핵산 서열은 DK210egfr (서열식별번호 60), DK210her2 (서열식별번호 62 또는 63), DK410CD14DV06 또는 DK410ngDV06CD14 (서열식별번호 61), 또는 그와 70% 내지 99% 서열 상동성을 공유하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 서열은 DV07을 포함하고, 인간 VEGFR1 또는 VEGFR2를 표적화하는 DK210 형태; 또는 DV06을 포함하고, 인간 VEGFR1 또는 VEGFR2를 표적화하는 DK410 형태의 분자를 코딩한다. IL-10 및 제2 시토카인을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 기술된 이중 시토카인 융합 단백질의 기능적 특성을 변경시키지 않는 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 통상적인 재조합 DNA 기술 및 방법을 사용할 것이다. 예를 들어, 특정 아미노산 서열의 부가 또는 치환은 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 부위 지정 돌연변이유발 방법을 사용하여 핵산 (DNA) 수준에서 IL-10 서열에 도입될 수 있으며, 이 방법 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 실시양태에서, IL-10 및 제2 시토카인을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 IL-10 변이체 분자의 기능성을 변경시키지 않는 삽입, 결실 또는 치환 (예컨대, 축퇴 코드)을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 IL-10 변이체 및 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 유전자 코드의 축퇴성에 기인하여 아미노산 서열과 상이할 수 있으며, 상기 언급된 서열과 70-99%, 바람직하게 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성일 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 실시양태는 서열식별번호 35, 46-58, 또는 59의 단백질을 코딩하되, 유전자 코드의 축퇴성에 기인하여 70-99%만큼 상이한 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 이중 시토카인 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 단백질의 발현, 생성 또는 분비에 도움이 되는 널리 공지된 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열로는 예를 들어, 리더 서열, 신호 펩티드 및/또는 번역 개시 부위/서열 (예컨대, 코작 컨센서스 서열)을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 뉴클레오티드 서열은 또한 다양한 발현 시스템/벡터로의 삽입을 가능하게 하는 하나 이상의 제한 효소 부위를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이중 시토카인 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 유전자 요법에 직접 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 출원의 변이체 IL-10 분자 또는 융합 단백질은 돌연변이체 IL-10 단백질의 직접적인 투여, 및 돌연변이체 IL-10 단백질을 코딩하는 벡터에 의한 유전자 요법을 비롯한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 전달될 수 있다. 유전자 요법은 플라스미드 DNA 또는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-관련 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 이용하여 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 출원의 바이러스 벡터는 바이러스 입자로서 투여되고, 다르게는 이들은 플라스미드로서 (예컨대, "네이키드" DNA로서) 투여된다.
뉴클레오티드 서열의 전달을 위한 다른 방법으로는 관련 기술분야에 이미 공지된 것들을 포함한다. 이는 세포 투과 펩티드, 소수성 모이어티, 정전기 복합체, 리포솜, 리간드, 리포솜 나노입자, 지단백질 (바람직하게, HDL 또는 LDL), 폴레이트 표적화된 리포솜, 항체 (예컨대, 폴레이트 수용체, 트랜스페린 수용체), 표적화 펩티드에 의해, 또는 압타머에 의해 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 비제한적으로 DNA, RNA, siRNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드, 또는 그의 변이체의 전달을 포함한다. IL-10 변이체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 직접적인 주사, 주입, 패치, 붕대, 미스트 또는 에어로졸에 의해, 또는 박막 전달에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 뉴클레오티드 (또는 단백질)는 시토카인 자극의 표적화된 전달을 위해 필요한 임의의 영역으로 지시될 수 있다. 이는 예를 들어 폐, GI 관, 피부, 간, 두개뇌 주사를 통한 뇌, 초음파 유도된 주사를 통한 심재성 전이성 종양 병변을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 IL-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질을 제조하고, 정제하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 기술된 이중 시토카인 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 융합 단백질을 재조합적으로 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 통상적인 분자 생물학 및 단백질 발현 기술을 사용하여, 본원에 기술된 이중 시토카인 융합 단백질을 포유동물 세포 시스템으로부터 발현 및 정제할 수 있다. 상기 시스템은 널리 공지된 진핵 세포 발현 벡터 시스템 및 숙주 세포를 포함한다. 변이체 IL-10 분자 및 융합 단백질의 발현 및 도입에 사용될 수 있는 다양한 적합한 발현 벡터가 사용될 수 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이들 벡터로는 예를 들어, pUC-타입 벡터, pBR-타입 벡터, pBI-타입 벡터, pGA-타입, pBinl9, pBI121, pGreen 시리즈, pCAMBRIA 시리즈, pPZP 시리즈, pPCV001, pGA482, pCLD04541, pBIBAC 시리즈, pYLTAC 시리즈, pSB11, pSB1, pGPTV 시리즈, 및 바이러스 벡터 등을 포함하며, 사용될 수 있다. 널리 공지된 숙주 세포 시스템은 CHO 세포에서의 발현을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이중 시토카인 융합 단백질을 보유하는 발현 벡터는 또한 벡터 기능성을 위해 필요한 다른 벡터 성분도 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 이중 시토카인 융합 단백질의 적절한 복제 및 발현을 위해 필요한 신호 서열, 태그 서열, 프로테아제 식별 서열, 선별 마커 및 다른 서열 조절 서열, 예컨대, 프로모터를 포함할 수 있다. 벡터에서 사용되는 특정 프로모터는 다양한 숙주 세포 유형에서 이중 시토카인 융합 단백질의 발현을 유도할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 유사하게, 태그 서열이 발현된 변이체 IL-10 분자의 정제를 더욱 간단하게 또는 용이하게 만드는 한, 태그 프로모터의 유형은 제한되지 않는다. 이는 예를 들어, 6-히스티딘, GST, MBP, HAT, HN, S, TF, Trx, Nus, 비오틴, FLAG, myc, RCFP, GFP 등을 포함하고, 사용될 수 있다. 프로테아제 인식 서열은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 인식 서열, 예컨대, 인자 Xa, 트롬빈, HRV, 3C 프로테아제가 사용될 수 있다. 선택된 마커는 형질전환된 벼 식물 세포를 검출할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 네오마이신-내성 유전자, 카나마이신-내성 유전자, 히그로마이신-내성 유전자 등이 사용될 수 있다.
상기 기술된 이중 시토카인 융합 단백질은 또한 제조 프로세스 동안에 융합 단백질의 회수 또는 정제에 도움이 되는 추가의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이는 다양한 서열 변형 또는 친화성 태그, 예컨대 비제한적으로 단백질 A, 알부민-결합 단백질, 알칼리성 포스파타제, FLAG 에피토프, 갈락토스-결합 단백질, 히스티딘 태그, 및 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 다른 태그를 포함할 수 있다. 예컨대, 문헌 [Kimple et al. (Curr. Protoc. Protein Sci., 2013, 73: Unit 9.9, Table 9.91 (그 전문이 참조로 포함)]을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 친화성 태그는 HHHHHH (서열식별번호 42)의 아미노산 서열을 갖는 히스티딘 태그이다. 히스티딘 태그는 최종 생성물로부터 제거되거나, 또는 무손상 상태 그대로 남아 있을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 친화성 태그는 융합 단백질에 (예컨대, 본원에 기술된 융합 단백질의 VH 영역에) 포함된 단백질 A 변형이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기술된 임의의 이중 시토카인 융합 단백질 서열이 관련 기술분야에 기술된 바와 같이, 항체 프레임워크 영역 내에 아미노산 점 치환을 삽입시킴으로써 단백질 A 변형을 포함하도록 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
또 다른 측면에서, 이중 시토카인 융합 단백질을 코딩하는 단백질 및 핵산 분자는 치료 유효량의 이중 시토카인 융합 단백질 및 제약 담체 및/또는 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물로서 제제화될 수 있다. 제약 조성물은 일반적으로 사용되는 완충제, 부형제, 보존제, 안정화제로 제제화될 수 있다. 이중 시토카인 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합된다. 다양한 제약 담체가 관련 기술분야에 공지되어 있고, 제약 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들어, 담체는 본 출원의 이중 시토카인 융합 단백질 조성물을 환자에게 전달하기에 적합한 임의의 상용성 비독성 물질일 수 있다. 적합한 담체의 예로는 생리식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 행크스 용액을 포함한다. 담체로는 또한 분자량이 2900 (L64), 3400 (P65), 4200 (P84), 4600 (P85), 11,400 (F88), 4950 (P103), 5900 (P104), 6500 (P105), 14,600 (F108), 5750 (P123), 및 12,600 (F127)인 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 공지된 임의의 폴록사머를 포함할 수 있다. 담체로는 또한 몇 가지 예를 들면, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 및 폴리소르베이트 80을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 유화제를 포함할 수 있다. 비수성 담체, 예컨대, 고정유 및 에틸 올레에이트 또한 사용될 수 있다. 담체로는 또한 첨가제, 예컨대, 등장성 및 화학적 안정성을 증강시키는 물질, 예컨대, 완충제 및 보존제를 포함할 수 있으며, 예컨대, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984)]를 참조한다. 치료제 및 진단제의 제제는 예를 들어, 동결건조된 분말, 슬러리, 수성 용액 또는 현탁액의 형태로 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조될 수 있다.
제약 조성물은 원하는 치료 결과를 제공하는 데 충분한 치료 유효량으로 환자에게 투여하기 위해 제제화될 것이다. 바람직하게는, 상기 양은 최소한의 부정적인 부작용을 갖는다. 한 실시양태에서, 이중 시토카인 융합 단백질의 투여량은 염증성 질환 또는 병태를 치료하는 데 충분할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 이중 시토카인 융합 단백질의 투여량은 면역 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 데 충분할 것이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 이중 시토카인 융합 단백질의 투여량은 암을 치료 또는 예방하는 데 충분할 것이다. 투여량은 환자마다 다를 수 있고, 대상체 또는 환자의 질환 또는 병태, 환자의 전반적인 건강, 투여 방법, 부작용의 중증도 등을 고려하여 결정되어야 할 것이다.
특정 환자에 대한 유효량은 예컨대, 치료할 병태, 환자의 전반적인 건강, 투여 방법의 경로 및 용량, 및 부작용의 중증도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 환자에게 투여되는 적절한 용량은 전형적으로 치료에 영향을 미치는 것으로 관련 기술분야에서 공지되거나, 의심되거나, 또는 치료에 영향을 미치는 것으로 예측되는 파라미터 또는 인자를 이용하여 임상의에 의해 결정된다. 일반적으로, 용량은 최적 용량보다 다소 적은 양으로 시작하고, 그 후에 임의의 부정적인 부작용에 비해 원하는 또는 최적의 효과가 달성될 때까지 소량씩 증가된다. 중요한 진단 척도로는 예컨대, 염증의 증상 또는 생성된 염증성 시토카인의 수준을 포함한다.
본원에 기술된 이중 시토카인 융합 단백질의 투여를 결정하는 방법은 미국 특허 10,858,412에 기술된 것과 실질적으로 유사할 것이다. 일반적으로, 본원에 기술된 이중 시토카인 융합 단백질의 투여는 0.5 ㎍/㎏ 내지 100 ㎍/㎏ 범위가 될 것이다. 이중 시토카인 융합 단백질은 매일, 주 3회, 주 2회, 매주, 격월 또는 매월 투여될 수 있다. 유효량의 치료제는 증상을 완화시킴으로써 염증 또는 질환 또는 병태의 수준에 영향을 줄 것이다. 예를 들어, 영향은 적어도 10%; 적어도 20%; 적어도 약 30%; 적어도 40%; 적어도 50%; 또는 그 초과의 영향 수준을 포함할 수 있으며, 이로써, 질환 또는 병태는 완화되거나, 또는 완전히 치료된다.
본 출원의 조성물은 경구적으로 투여되거나, 또는 체내로 주사될 수 있다. 경구용 제제는 위장관에서 프로테아제로부터 변이체 IL-10 분자를 추가로 보호하기 위한 화합물 또한 포함할 수 있다. 주사는 일반적으로 근육내, 피하, 피내 또는 정맥내이다. 대안적으로, 적절한 상황에서 관절내 주사 또는 다른 경로가 이용될 수 있다. 비경구적으로 투여되는 이중 시토카인 융합 단백질은 바람직하게는 제약 담체 및/또는 제약상 허용되는 부형제와 함께 회합된 단위 투여량 주사가능한 형태 (액제, 현탁제, 에멀젼)로 제제화된다. 다른 실시양태에서, 본 출원의 조성물은 이식가능한 또는 주사가능한 약물 전달 시스템에 의해 환자의 체내로 도입될 수 있다.
이중 시토카인 융합 단백질 시험
원하는 생물학적 기능을 시험하기 위한 다수의 스크리닝 검정법이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 이용가능하다. 한 실시양태에서, 원하는 생물학적 기능으로는 항-염증 반응 감소, T 세포 자극 감소, T 세포 기능 증강, 쿠퍼 세포 기능성 증강 및 비만 세포 탈과립화 감소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, IL-10 노출이 T 세포 수용체 자극시에 T 세포가 더 많은 IFNγ를 생성하고 분비하도록 프라이밍한다는 것이 공지되어 있다. 동시에, IL-10 노출은 LPS에 대한 반응으로 단핵구/대식세포로부터 분비되는 TNFα, IL-6 및 다른 염증유발성 시토카인의 분비를 방지한다. IL-10은 또한 FoxP3+CD4+ Treg 증식을 억제시킨다. 한 실시양태에서, 자극성 및 억제성 반응, 그 둘 모두를 비롯하여 단핵구/대식세포 억제를 최대화시키지만, T 세포 효과는 결여된 이중 시토카인 융합 단백질은 양성으로 선택될 것이다. 한 실시양태에서, 증가된 항-염증성 효과를 갖는 이중 시토카인 융합 단백질에 대한 스크리닝은 자가면역, 항-염증성 질환, 또는 그 둘 모두의 치료를 위해 양성으로 선택될 것이다. 또 다른 실시양태에서, 쿠퍼 세포 스캐빈징을 증강시키고, Treg 억제가 결여된 이중 시토카인 융합 단백질 또한 비알콜성 지방간염 (NASH) 및/또는 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD)의 치료를 위해 개발되도록 선택될 것이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 자극성 및 억제성 반응, 그 둘 모두를 비롯하여 T 세포 생물학적 성질을 최대화시키고, 증강된 쿠퍼 세포 스캐빈징 또한 갖는 이중 시토카인 융합 단백질은 암의 치료를 위해 개발되도록 선택될 것이다. 이중 시토카인 융합 단백질을 스크리닝하는 다양한 검정법 및 방법은 동시 계류 중인 미국 특허 10,858,412 (이는 그 전문이 참조로 포함된다)에서 이전에 기술된 바 있다. 미국 출원 16/811,718의 명세서 39-42 페이지를 참조한다.
이중 시토카인을 이용한 치료 및/또는 예방 방법
다른 측면에서, 본 개시내용은 악성 질환 또는 병태 또는 암 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, IL-10 및 제2 시토카인을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 악성 질환 또는 병태 또는 암을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 상기 단백질은 DK210 형태가 될 것이며, 여기서, 융합 단백질은 VH와 VL의 힌지 영역 사이에 연결된 제2 시토카인인 IL-2와 함께, 종양 연관 항원 ("TAA")을 표적화하는 임의의 항체로부터의 CDR이 인그라프팅된 인간 항-에볼라 항체로부터 수득된 VH 및 VL 스캐폴딩 시스템에 연결된 DV07의 단량체를 포함할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 이중 시토카인 융합 단백질은 DV07의 EBV IL-10 단량체를 포함한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, EBV IL-10 단량체는 서열식별번호 3의 EBV IL-10의 아미노산 위치 31 (V31L) 및 75 (A75I) 둘 모두에 치환을 포함한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, EBV IL-10은 서열식별번호 11 또는 16이다. 바람직한 실시양태에서, 이중 시토카인 융합 단백질은 항-에볼라 항체로부터의 VH 및 VL 쌍을 포함하고, 여기서, CDR은 임의의 TAA 표적화 항체로부터의 6개의 CDR로 치환된다. 바람직한 실시양태에서, 이중 시토카인 융합 단백질의 VH 및 VL 영역은 서열식별번호 37의 VH 및 서열식별번호 38의 VL을 포함한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 이중 시토카인 융합 단백질은 항-에볼라 항체로부터의 VH 및 VL 쌍을 포함하고, 여기서, CDR은 항-EGFR 항체 (서열식별번호 27, 29, 31, 또는 33)로부터의 6개의 CDR로 치환되고, 여기서, 제2 시토카인은 scFv의 VH와 VL 영역 사이에 연결된다. 다른 실시양태에서, 6개의 CDR 영역은 항-Her2 Neu; 항-PDGFR; 항-VEGFR1 및 항-VEGFR2, 항-FGFR; 항-HER3; 또는 항-GPC3으로부터의 6개의 CDR로 치환된다. 바람직하게, 6개의 CDR은 항-EGFR, 또는 항-HER2로부터 수득된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 제2 시토카인은 IL-2이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 서열식별번호 35 (EGFR 표적화) 또는 52-55 (HER2 표적화)의 이중 시토카인 융합 단백질은 암을 치료하는 데 사용된다.
추가의 다른 측면에서, 본 개시내용은 염증성 질환 또는 병태 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, IL-10 (또는 그의 변이체, 예컨대, DV06) 및 제2 시토카인 (예컨대, IL-4)을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 또는 병태를 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 염증성 질환 또는 장애는 크론병, 건선, 및 류마티스 관절염 ("RA")을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 단백질은 DK410 형태가 될 것이며, 여기서, 융합 단백질은 VH와 VL의 힌지 영역 사이에 연결된 제2 시토카인인 IL-4 (서열식별번호 43) 또는 비-글리코실화된 형태의 IL-4 (서열식별번호 44)와 함께, 각종 염증성/면역 수용체 또는 단백질을 표적화하는 임의의 항체 (예컨대, 항-CD14, 항-VEGFR2, 항-MAdCAM)로부터의 CDR이 인그라프팅된 인간 항-에볼라 항체로부터 수득된 VH 및 VL 스캐폴딩 시스템에 연결된 DV06의 단량체를 포함할 것이다. 한 실시양태에서, IL-10 단량체는 야생형 EBV IL-10, EBV IL-10의 위치 75에 단일 아미노산 치환을 갖는 EBV IL-10 변이체 (DV06), 또는 EBV IL-10의 위치 31 및 75에 2개의 아미노산 치환을 갖는 EBV IL-10 변이체 (DV07)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, EBV IL-10 단량체는 야생형 EBV IL-10 또는 DV06이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, EBV IL-10은 서열식별번호 3, 9, 10, 11, 14 또는 16이다. 바람직한 실시양태에서, 이중 시토카인 융합 단백질은 인간 항-에볼라 항체로부터의 VH 및 VL 쌍을 갖는 스캐폴딩 시스템을 포함한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 염증성 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용되는 이중 시토카인 융합 단백질은 인간 항-에볼라 항체로부터의 VH 및 VL 쌍을 포함하고, 여기서, CDR은 항-MAdCAM 항체 (바람직하게, 인간 항-MAdCAM 항체) 또는 항-CD14 항체 (바람직하게, 인간 항-CD14 항체) 또는 항-VEGFR2 (바람직하게, 인간 항-VEGFR2 항체)의 VH 및 VL로부터의 6개의 CDR로 치환된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 제2 시토카인은 IL-4, 바람직하게, N38A 치환을 갖는 IL-4 변이체 (서열식별번호 44)이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 염증성 질환은 패혈증 및/또는 패혈성 쇼크를 포함하며, 이는 DV06 또는 DV07 단량체 및 IL-4를 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질로서, 여기서, 항-CD14 항체로부터의 CDR이 항-에볼라 VH 및 VL scFv 스캐폴딩 시스템으로 인그라프팅된 것인 이중 시토카인 융합 단백질로 치료된다. 바람직한 실시양태에서, 이중 시토카인 융합 단백질은 서열식별번호 56-58, 또는 59, 더욱 바람직하게, 서열식별번호 56의 DK410 형태이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 염증성 질환은 IBD를 포함하며, 이는 DV06 단량체 및 IL-4를 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질로서, 여기서, 항-MAdCAM 항체로부터의 CDR이 항-에볼라 VH 및 VL scFv 스캐폴딩 시스템으로 인그라프팅된 것인 이중 시토카인 융합 단백질로 치료된다. 추가의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 염증성 질환은 건선 또는 RA를 포함하며, 이는 DV06 단량체 및 IL-4를 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질로서, 여기서, 항-VEGFR2 항체로부터의 CDR이 인간 항-에볼라 VH 및 VL scFv 스캐폴딩 시스템으로 인그라프팅된 것인 이중 시토카인 융합 단백질로 치료된다. 가장 바람직한 실시양태에서, 서열식별번호 46-50, 56-58, 또는 59 (CD14 표적화) 또는 51 (MAdCAM 표적화)의 이중 시토카인 융합 단백질이 염증 또는 패혈증을 감소시키는 데 사용된다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 면역 질환 또는 병태 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, IL-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 면역 질환 또는 병태를 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 관련 기술분야에 널리 공지된, 제2 치료제, 예컨대, 시토카인, 스테로이드, 화학요법제, 항생제, 항염증제, 또는 방사선을 이용한 공동 투여 또는 치료 방법을 고려한다. 이는 다른 치료제, 예컨대 비제한적으로 하기 중 하나 이상의 것과의 조합 치료를 포함할 수 있다: 화학요법제, 인터페론-β, 예를 들어, IFNβ-1α 및 IFN-β-1β; 미엘린 염기성 단백질을 모방하는 단백질; 코르티코스테로이드; IL-1 억제제; TNF 억제제; 항-TNFα 항체, 항-IL-6 항체, IL-1br-Ig 융합, 항-IL-23 항체, CD40 리간드 및 CD80에 대한 항체; IL-12 및 IL-23의 길항제, 예컨대, IL-12 및 IL-23의 p40 서브유닛의 길항제 (예를 들어, p40 서브유닛에 대한 억제성 항체); IL-22 길항제; 소분자 억제제, 예컨대, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 시롤리무스 (라파마이신) 및 그의 유사체, 예컨대, CCI-779; Cox-2 및 cPLA2 억제제; NSAID; p38 억제제; TPL-2; Mk-2; NFkβ 억제제; RAGE 또는 가용성 RAGE; P-셀렉틴 또는 PSGL-1 억제제 (예컨대, 소분자 억제제, 그에 대한 항체, 예컨대, P-셀렉틴에 대한 항체); 에스트로겐 수용체 베타 (ERB) 효능제 또는 ERB-NFkβ 길항제.
추가로, 이중 시토카인 융합 단백질과의 투여에 유용한 조합 치료는 TNF 억제제, 예컨대, TNF에 결합하는 키메라, 인간화, 효과적으로 인간, 인간 또는 시험관내 생성된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편; TNF 수용체의 가용성 단편, 예컨대, p55 또는 p75 인간 TNF 수용체 또는 그의 유도체, 예컨대, 75 kdTNFR-IgG (75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, 엔브렐(ENBREL)™), p55 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; 및 TNF 효소 길항제, 예컨대, TNFα 전환 효소 (TACE) 억제제를 포함할 수 있다. 항염증제/약물과의 다른 조합 치료는 표준 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID) 및 시클로-옥시게나제-2 억제제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. NSAID로는 아스피린, 셀레콕시브, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 피록시캄, 살사레이트, 술린닥, 및/또는 톨메틴을 포함할 수 있다. 본 출원에 따른 조성물에서 사용되는 시클로-옥시게나제-2 억제제는 예를 들어, 셀레콕시브 또는 로페콕시브일 수 있다.
이중 시토카인 융합 단백질과 공동 투여될 수 있고/거나, 공동 제제화될 수 있는 추가의 치료제로는 하기 중 하나 이상의 것을 포함한다: 인터페론-β, 예를 들어, IFN β-1α 및 IFN β-1β; 코팍손(COPAXONE)®; 코르티코스테로이드; IL-1 억제제; TNF 길항제 (예컨대, TNF 수용체의 가용성 단편, 예컨대, p55 또는 p75 인간 TNF 수용체 또는 그의 유도체, 예컨대, 75 kdTNFR-IgG; CD40 리간드 및 CD80에 대한 항체; 및 IL-12 및/또는 IL-23의 길항제, 예컨대, IL-12 및 IL-23의 p40 서브유닛의 길항제 (예컨대, IL-12 및 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 억제성 항체); 메토트렉세이트, 레플루노미드, 및 시롤리무스 (라파마이신) 또는 그의 유사체, 예컨대, CCI-779. 다른 치료제로는 임핌지(Imfimzi) 또는 아테졸리줌브(Atezolizumb)를 포함할 수 있다.
NASH를 치료하기 위해, 예를 들어, 이중 시토카인 융합 단백질을 콜레스테롤 강하제, 예컨대, 스타틴 및 비-스타틴 약물과 조합할 수 있다. 이들 작용제는 심바스타틴, 아토르바스타틴, 로수바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴, 겜피브로질, 플루바스타틴, 콜레스티라민, 페노피브레이트, 콜레스테롤 흡수 억제제, 담즙산-결합 수지 또는 격리제, 및/또는 마이크로솜 트리글리세리드 전달 단백질 (MTP) 억제제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기술된 이중 시토카인 융합 단백질과 함께 공동 투여될 수 있는 대표적인 화학요법제로는 하기 완전하지 않은 목록을 포함할 수 있다: 알킬화제, 예컨대, 티오테파 및 시클로스포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)™); 알킬 술포네이트, 예컨대, 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대, 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸엔이민 및 메틸아멜라민, 예컨대, 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸올멜라밈 질소 머스타드, 예컨대, 키오람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대, 아클라시노미신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사산물, 예컨대, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대, 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토프로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 (Ara-C); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예컨대, 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)® 브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology: 미국 뉴저지주 프린스톤)) 및 독세탁셀 (탁소테레(Taxotere)™, 롱-프랑 로리(Rhone-Poulenc Rorer: 프랑스 앙토니)); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토미신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다(Xeloda)® 로슈(Roche: 스위스); 이반드로네이트; CPT11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나, 억제하도록 작용하는 항호르몬제, 예컨대, 항에스트로겐, 예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (파레스톤(Fareston)); 및 항안드로겐, 예컨대, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체 또한 본 정의에 포함된다.
실시예
실시예 1: IL-10 및 IL-2 이중 시토카인 융합 단백질 시험관내 연구
2개의 시토카인을 종양에 표적화하는 시험관내 효과를 평가하기 위해, 하기 구성요소로부터 DK210 (서열식별번호 35) (구조의 대표도로서 도 2 참조)으로 명명되는 이중 시토카인 융합 단백질을 구축하였다:
(a) EGFR을 표적화하는 VH 및 VL 쌍을 포함하는 scFv에 커플링된 (고친화성 IL-10 수용체 결합, EBV IL-10 변이체인) 2개의 DV07 단량체 (서열식별번호 31의 "SLP"로 명명되는 IL-10 융합 단백질); 및
(b) IL-2 시토카인 (서열식별번호 36);
여기서, IL-2 시토카인은 EGFR을 표적화하는 scFv의 VH (서열식별번호 37)와 VL (서열식별번호 38) 사이의 힌지 (또는 링커) 영역에 접합 또는 연결된다 (서열식별번호 31의 SLP 변이체).
NK, CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터 IFNγ의 IL-2 유도에 대한 상기 두 시토카인의 조합 효과를 평가하기 위해 상기 이중 시토카인 융합 단백질을 생성하였다. 상기 기술된 SLP 구축물의 최극단 C-말단 DV07 단량체의 C-말단에 IL-2를 연결하여 "SLP-IL-2"로 명명되는 구축물 (도 3)을 생성하는 비교 구축물 또한 디자인하였다.
SLP-IL-2 (도 3) 및 DK210 (서열식별번호 35, 도 2에 개략적으로 제시)이 면역계에 미치는 효과를 시험하기 위하여, DV07 기능 평가를 위해 자기 비드 양성 선택에 의해 말초 혈액 단핵구를 단리시킨 후, 시험관내 시험을 위해 NK, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 유사하게 단리시켰다. 인체에 피하 주사된 분자의 노출 주기 중 상이한 시점에서의 면역학적 기능을 모델링하기 위해 일련의 세포 시험관내 검정법을 셋업하였다.
먼저, IL-10, IL-2, IL-10과 IL-2의 조합, 및 SLP-IL-2가 단핵구/대식세포에 미치는 효과를 시험하였다. 본 시험은 IL-2 단독으로는 LPS에 대한 반응으로 염증유발성 시토카인인 TNFα 분비를 억제시키지 못하지만, DV07을 포함하는 SLP:IL-2 구축물은 염증유발성 시토카인 분비를 억제시킬 수 있었다는 것을 보여준다. IL-10, IL-2, IL-10과 IL-2의 조합, 및 SLP-IL-2의 적정을 수행하였다 (도 4). 예상외로, 이들 데이터는 또한 DV07 함유 구축물의 기능이 IL-10 단량체의 C-말단에의 IL-2 시토카인 부가 (즉, SLP-IL-2; 도 3)에 의해 손상된다는 것을 시사한다.
(도 2에 개략적으로 제시된) 인간 항-에볼라 항체로부터 수득된 scFv의 VH와 VL 사이의 링커 내로 IL-2가 도입된, DV07 함유 변이체로서 디자인된 DK210이 단핵구/대식세포에 미치는 효과 또한 평가하여 구축물이 IL-10 기능을 유지하는지 여부를 결정하였다. IL-10, SLP (서열식별번호 31의 DegfrDV07의 최적화된 변이체), 및 DK210egfr (서열식별번호 35)의 적정을 수행하였고 (도 5), 데이터는 IL-2를 최극단 C-말단 IL-10 단량체의 C-말단에 연결시킨 것 (SLP-IL-2)과 달리, 예상외로 IL-2를 scFv의 VH와 VL 사이의 링커 내로 도입하는 것이 SLP (서열식별번호 31의 IL-10 융합 단백질을 함유하는 DV07)의 기능을 손상시키지 않는다는 것을 시사한다.
DK210egfr이 T 세포에 미치는 직접적인 효과를 평가하기 위해, 우세하게 오직 T 세포 수용체 인게이지먼트시에만 방출되는 IFNγ 강화인, CD8+ T 세포에 대한 IL-10의 주요 기능을 직접적으로 설명하는 것으로 보고된 검정법 ([Chan, 2015]; [Mumm J., 2011]; [Emmerich, 2012])을 수행하였다.
전신 순환에서 PEG-rHuIL-10의 필요한 치료 농도는 2-5 ng/mL인 것으로 밝혀졌다 ([Mumm J., 2011]; [Naing A., 2018]; [Naing A., 2016]). CD8+ T 세포 IFNγ 검정은 1-10 ng/mL에서 최대 T 세포 IFNγ 강화를 나타내며, 이는 암 적용을 위한 IL-10의 특정 효능을 평가하기 위한 적절한 모델 검정 시스템임을 시사한다.
고용량 IL-2 요법은 5일 동안 매 8시간마다 600,000 내지 720,000 U/kg IL-2 (37 - 45 ug/kg의 등가량 (1.1 mg = 18x106 IU (IL-2)))를 투여하는 것이다 (Buchbinder, 2019). 고용량 IL-2에 대한 전신 순환에서의 C최대 농도는 37 내지 45 ng/mL이고 (Kirchner, 1998), 여기서, 최저 노출은 약 10 ng/ml이다. 이 데이터는 항원 특이적 T 세포 기능의 최대 IL-2 자극이 시험관내에서 대략 10 ng/ml이기 때문에, 본 검정법을 사용하는 것이 또한 IL-2에 대한 T 세포 반응을 평가하는 데 적합하다는 것을 시사한다. 따라서, 본 발명자들은 본 검정 포맷에서 IL-10, IL-2, IL-10과 IL-2의 조합, SLP 및 DK210에 대한 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응을 평가하였다 (도 6). 예상외로, IL-2와 DV07을 함께 테더링 (즉, IL-2를 scFv의 VH와 VL 사이의 링커로 SLP에 테더링)함에 따라 어느 한 분자가 단독으로 보여주는 효능을 100배만큼 증가시켰다 (~1-10 ng/mL에서 0.01 ng/mL). 예상외로, 상기 농도에서 테더링되지 않은 IL-2 및 IL-10를 부가하였을 때, IFNγ 분비는 증진되지 않았고, 이는 IL-2와 DV07을 함께 테더링하는 것이 T 세포 기능에 미치는 효과가 상가적 또는 상승작용적 효과보다 유의적으로 더 크다는 것을 시사하는 것이다.
IL-2 독성 (혈관 누출 증후군)은 NK (Assier, 2004), 및 CD4+ T 세포 (Sivakumar, 2013), 염증유발성 시토카인 분비 ([Guan, 2007]; [Baluna, 1997])와 연관이 있다. 그러므로, 본 발명자들은 IL-10이 혈액으로부터 직접 단리된 NK 세포에 대한 IL-2의 염증유발성 효과를 뮤팅할 수 있는지 여부를 평가하였다. (1) 혈액으로부터 직접 단리된 CD4+ 및 CD8+ T 세포, (2) 항원 프라이밍을 모델링하기 위해 항-CD3/항-CD28과 시토카인에 노출된 CD4+ 및 CD8+ T 세포, (3) 종양에서의 노출을 모델링하기 위해 항원 프라이밍 후 시토카인에 노출된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 (4) 동족 항원과의 인게이지먼트시 노출이 항원 프라이밍된 T 세포 기능에 미치는 효과 (도 7). 말초 혈액으로부터 직접 단리된 NK 세포, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 4일 동안 IL-10, IL-2, IL-10과 IL-2의 조합, SLP (서열식별번호 31의 DegfrDV07의 최적화된 변이체), 및 DK210egfr의 적정으로 처리하였다 (도 7). DK210egfr에 대한 예상 투여 요건은 4일마다 1회이며, 이러한 시험관내 노출이 4일 동안 예상 C최대 노출을 훨씬 초과하는 고농도의 시토카인 (최대 100 ng/mL)을 모델링한다는 것을 시사한다. 본 데이터는 IL-10을 IL-2에 개별 시토카인으로 부가하거나, 또는 DK210egfr로 함께 테더링하면 NK, CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터의 IL-2 매개 IFNγ 분비 유도를 5-10 ng/mL에서 각각 ~50%, ~80% 및 ~50%만큼 억제시킨다는 것을 나타낸다. 0.01 ng/mL의 예상 치료 용량에서, 조합된 시토카인 DK210egfr에 의해서는 IFNγ이 거의 유도되지 않거나, 또는 전혀 유도되지 않는다.
모델 항원 제시 (고정화된 10 ng/mL 항-CD3/2 ng/mL 항-CD28) 동안 시토카인 노출의 효과 (Chan, 2015)도 조사하였다 (도 8). 데이터에 따르면, IL-2에 IL-10을 추가하였을 때, 특히, DK210egfr을 통해 테더링된 IL-2 및 IL-10을 추가하였을 때, 10 ng/mL에서 CD4+ 및 CD8+ IFNγ 유도는 각각 ~75% 및 ~90%만큼 억제된 것으로 나타났고, 0.01 ng/mL에서는 어떤 IFNγ 유도도 보이지 않는 것으로 나타났다.
마지막으로, 동족 종양 항원과의 인게이지먼트 전 종양에서의 T 세포 수송을 모델링하기 위해 항원 노출 후 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 IFNγ 유도를 조사하였다 (도 9). 예상외로, 데이터에 따르면, DK210egfr 대비 IL-2, 개별적으로 적용된 IL-10 및 IL-2의 효과는 항원 프라이밍된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대하여 상이한 기능을 발휘하는 것으로 나타났다. DK210egfr 경우, 예상 치료 농도에서, DK210egfr이 IL-2, 또는 개별적으로 적용된 IL-10 및 IL-2보다 더 많이 IFNγ 분비를 강화시킨다. IL-10 및 IL-2 경우, 예상 치료 농도에서, DK210egfr, IL-2 및 개별적으로 적용된 IL-10 및 IL-2는 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터의 IFNγ 분비를 등가적으로 유도한다. 상기 데이터는 일괄하여 IL-2 및 IL-10을 (DK210 형태로) 함께 테더링하는 것이 IL-2 독성과 연관된 염증유발성 시토카인 분비를 억제시키면서, 항원 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 강화시킨다는 것을 나타낸다. 특히, 이러한 효과는 항-에볼라 scFv 스캐폴딩으로의 항-EGFR CDR의 인그라프트먼트에 의해 영향을 받지 않았다.
실시예 2: IL-10 및 IL-2 이중 시토카인 융합 단백질 생체내 연구
안정적으로 발현된 인간 EGFR CT26 뮤린 결장직장 종양 세포주를 생성함으로써 종양 미세환경으로 DV07을 항-EGFR scFv를 통해 표적화하는 것 (여기서, DV07은 6개의 인그라프팅된 항-EGFR CDR을 포함하는, 인간 항-에볼라 ScFv 스캐폴딩으로부터 수득된 VH 및 VL을 포함하는 scFv에 융합되어 있다; 서열식별번호 31의 "Degfr:DV07")이 PEG-rHuIL-10과 비교하였을 때 우수한 항-종양 기능을 보이는 것으로 이전에 밝혀졌다. 미국 특허 10,858,412를 참조한다. 동일한 생체내 종양 연구를 이용하여, 인간 EGFR 발현 CT26 세포 뮤린 종양 세포주에서 DK210egfr을 평가하고, Degfr:DV07과 비교하였다.
종양이 평균 100 ㎣인 CT26 (hEGFR+) 종양 보유 B 세포 k.o. Balb/C 마우스를 표 1에 제시된 바와 같이 제공되는 시험 물품, 용량 및 빈도로 처리하였다. 시험 물품을 목덜미에 피하 투여하였다. 모든 물품을 15일 동안 매일 투여하였다.
Figure pct00006
전자 캘리퍼로 3일마다 종양의 길이와 너비를 측정하고, 종양 부피를 계산하였다 ((LxW2)/2)). 본 실시예에서, "Degfr:DV07"이라는 용어는 인간 EGFR 표적화된 DV07이고; DK210egfr은 "DK210"으로 약칭되고, 세툭시맙 CDR 그라프팅된 항-에볼라 scFv 스캐폴드를 통해 DV07과 커플링된 인간 IL-2이다.
방법
시험관내 세포 배양: CT26( hEGFR +) 종양 세포 (ATCC)를 완전 RPMI, 10% FCS, 및 10 ug/mL 퓨로마이신 중에서 전면생장률이 70%가 될 때까지 성장시켰다. 세포를 이식 전 시험관내에서 3회 이하의 계대배양 동안 계대시켰다. 아큐타제(Accutase) (바이오레전드(Biolegend))를 이용하여 세포 배양 플레이트로부터 세포를 꺼내고, 4℃에서 400 g로 10분 동안 스피닝하면서 완전 RPMI 중에서 세척하였다.
종양 이식: 종양 세포를 B 세포 녹아웃 마우스의 우측 옆구리에 피하로 50% 성장 인자 감소된 마트리겔(Matrigel), 50% RPMI에서 100 ㎕ 중 1 x105개의 세포/마우스로 이식하였다.
결과
종양 성장에 대한 Degfr:DV07 및 DK2 10 비교: 안정적으로 형질감염된 종양 세포 상에 존재하는 EGFR에의 결합을 통한 DV07의 종양 미세환경으로의 표적화는 효과적인 것으로 이전에 밝혀졌다. 미국 특허 10,858,412를 참조한다. 동일한 종양 시스템을 사용하여, Degfr:DV07 대 DK210을 비교하였다.
종양을 주 3회 측정하였다 (표 2). 75 ㎣ CT26( hEGFR +) 종양을 보유하는 암컷 Balb/C B 세포 녹아웃 마우스를 표 2에 예시된 시험 물품 및 투여 빈도로 피하 처리하였다.
Figure pct00007
Figure pct00008
본 실험을 위해, 종양 항원에 대한 마우스의 면역화를 제한하기 위해 CT26(hEGFR+) 세포를 50% 성장 인자 감소된 마트리겔에서 1x105개의 세포로 이식하였다.
1 mg/kg에서의 Degfr:DV07의 항-종양 효과를 동일 용량의 DK210 뿐만 아니라, 2 및 4 mg/kg 용량과도 비교하였다 (도 10). Degfr:DV07을 1 mg/kg으로 매일 투여하는 것과 비교하여 DK210을 1 mg/kg으로 매일 투여하는 것이 더 우수한 항-종양 기능을 발휘한다. 2 및 4 mg/kg 용량의 DK210은 1 mg/kg보다 더 큰 항-종양 기능을 발휘한다.
DK2 10 의 안전성 평가 : DK210 투여의 안전성을 시험하기 위해, Degfr:DV07 및 DK210으로 처리된 종양 보유 마우스의 체중을 평가하였다 (도 11). Degfr:DV07 또는 DK210 투여가 마우스의 체중에 미치는 뚜렷한 효과는 없다.
Degfr:DV07 및 DK2 10 투여가 생존에 미치는 효과 : DK210에 대한 CT26(hegfr+) 종양 보유 마우스의 생존성을 평가하였다 (도 12).
비히클 처리 마우스의 모든 종양은 17일째까지 IAACUC 규정에 의하면 너무 컸다. 30일째 4 mg/kg, 2 mg/kg 및 1 mg/kg DK210 및 Degfr:DV07 1 mg/kg 처리군에서 각각 100%, 80%, 80% 및 60%의 마우스가 살아 있었다.
본 데이터는 일괄하여 고친화성 IL-10 변이체 (DV07)의 IL-2에의 커플링 및 상기 두 분자를 모두 (DK210egfr을 통해) 종양 미세환경으로 표적화하는 것이 치료상 유효 용량에서 명백한 IL-2 매개 독성을 방지한다는 것을 시사한다. 인간 항-에볼라 스캐폴딩으로부터 수득된 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 스캐폴딩으로 항-EGFR CDR을 인그라프팅하는 것은 IL-10 및 IL-2의 조합 효과에 영향을 주지 않고, 오히려 항-EGFR CDR은 DK210 분자를 종양 미세환경에 집중시키는 수단으로서 작용한다. 본 발명자들은 종양 미세환경을 표적화하는 (적절히 최적화된) 임의의 항체로부터의 CDR을 인그라프팅하면, 그 결과로 동일하거나, 또는 유사한 효과가 관찰될 것으로 여기고 있다.
실시예 3: IL-10 및 IL-4 이중 시토카인 융합 단백질
크론병 환자에서, 고용량 IL-10은 IFNγ 증가와 함께 항-염증 반응을 감소시켰다. 시토카인과 IL-10의 조합이 IL-10의 항-염증 기능을 증강시키고, IL-10의 자극 (IFNγ 강화) 기능을 억제시키는지 여부를 결정하기 위해, IL-10 및 IL-4 이중 시토카인 융합 단백질을 생성하였다. 본 발명자는 예상외로 단핵구에 대한 IL-10 및 IL-4의 조합 처리가 IL-10 또는 IL-4 단독 처리보다 LPS 유도된 염증 반응을 더 강력하게 억제시킨다는 것을 발견하게 되었다 (하기에서 더욱 상세하게 논의). 추가로, IL-4는 CD8+ T 세포에서 IL-10 매개 IFNγ 강화를 억제시켰다. (상기 실시예 1 및 2에서 기술된) DK210egfr을 디자인하기 위해 유사한 방법 및 원리를 이용하여, IL-4 또는 다양한 IL-4 변이체를 융합 구축물로서 IL-10 또는 IL-10 변이체에 커플링시켜 (대표도로서 도 17 참조) IL-10의 억제 기능을 증강시켰다. 생성된 분자 부류를 DK410으로 명명하였다.
표 3은 시토카인 및 다양한 DK410 융합 분자를 비롯한, 연구된 다양한 분자 요약을 제공한다.
Figure pct00009
Figure pct00010
건강한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 제제로부터 유래된, 자기 비드 양성 선택에 의해 단리된 단핵구/대식세포 및 CD8+ T 세포에 대해 하기 분자 및 분자 조합이 미치는 효과에 대하여 그를 시험하였다:
1. IL-4;
2. IL-10;
3. IL-10과 함께 조합된 IL-4;
4. DeboWtEBV;
5. IL-4와 함께 조합된 DeboWtEBV;
6. DeboDV06;
7. IL-4와 함께 조합된 DeboDV06;
8. DeboDV07;
9. IL-4와 함께 조합된 DeboDV07;
10. 야생형 IL-4 및 DV06을 포함하는 DK410 ("4DeboDV06");
11. 고친화성, 비-글리코실화된 IL-4 (T13D) 및 mCD14로 표적화되는 DV06을 포함하는 DK410;
12. 고친화성, 비-글리코실화된 IL-4 (T13D) 및 mCD14로 표적화되는 DV07을 포함하는 DK410;
13. mCD14로 표적화되는 DV06과 함께 비-글리코실화된 IL-4 (N38A)를 포함하는 DK410;
14. mCD14로 표적화되는 DV07과 함께 비-글리코실화된 IL-4 (N38A)를 포함하는 DK410; 및
15. mMAdCAM으로 표적화되는 DV06과 함께 비-글리코실화된 IL-4를 포함하는 DK410.
방법
PBMC 및 CD8+ T 세포 단리 : 자석 보조형 세포 분류에 의해 항-CD14 (단핵구) 또는 항-CD8 (CD8+ T 세포) 자기 마이크로비드를 사용하여 PBMC 또는 류코팩으로부터 대식세포 및 CD8+ T 세포 둘 모두를 단리시켰다.
세포 검정 - 시토카인 및 지질다당류 ( LPS )에 대한 단핵구/대식세포 세포 반응 : 본 검정에서, PMBC 유래 단핵구를 CD14 양성 선택 비드로 단리시키고, 2x105개의 세포/웰로 플레이팅하고, 적정 시토카인 및 10 ng/mL LPS에 노출시킨다. 18시간 후, 분비된 염증유발성 시토카인에 대한 ELISA에 의해 상청액을 평가한다. TNFα 감소율(%)을 플롯팅하여 시토카인 또는 시험 물품이 LPS에 미치는 영향을 나타낸다. 본 검정이 말초 혈액에서의 시토카인 및 박테리아 유래 염증유발성 생성물에 대한 단핵구의 반응을 가장 적절하게 모방한다.
세포 검정 - CD8+ T 세포 . 다중 CD8+ T 세포 검정법을 이용하였다.
먼저, CD8+ 양성 자기 선택 비드를 이용하여 PBMC로부터 유래된 CD8+ T 세포를 수득하고, 2x105개의 세포/웰로 플레이팅하고, 하기 조건하에 적정 시토카인 또는 시험 물품에 노출시켰다:
(i) 단독으로 4일 동안,
(ii) 본 분자가 동족 항원 제시에 대한 세포 반응에 주는 영향 방식을 모방하기 위해 시토카인의 존재하에 플레이트 결합된 항-CD3/항-CD28에 3일 동안,
(iii) 항원 자극된 세포가, 세포가 종양에 진입함에 따라 본 시토카인 및 신규 인자에 반응하는 방식을 모방하기 위해 항-CD3/항-CD28 후 3일 동안, 및
(iv) 종양 미세환경에서 T 세포가 동족 항원 노출에 반응하는 방식을 모방하기 위해 시험관내에서 노출된 세포로부터 4시간 후에 T 세포 수용체 유발 IFNγ 분비를 평가하였다.
단핵구/대식세포 및 CD8+ T 세포 둘 모두를 언급된 바와 같이 밤새도록 또는 3-4일 동안 0.1, 1, 10, 100 ng/mL 또는 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 ng/mL (또는 몰 당량)의 적정 인간 IL-4, IL-10, DeboWtEBV, DeboDV06 및 다양한 DK410 융합 분자에 노출시켰고, 모든 조건은 이중으로 수행하였다. 상기 분자의 항-염증성 (단핵구/대식세포) 및 자극 효과 (CD8+ T 세포)를 이용하여 가장 효과적인 항-염증성 시토카인 쌍을 결정하였다.
단백질 측정 : 대식세포 세포 배양 배지를 ELISA에 의해 TNFα에 대하여 검정하고, CD8+ T 세포 배양 배지를 ELISA에 의해 IFNγ에 대하여 검정하였다. DeboDV06, 4DeboDV06 및 다양한 DK410 융합 분자는 각 단백질의 각각의 흡광 계수를 사용하여 나노드롭(Nanodrop) OD280 nM에 의해 평가하고, 농도는 쿠마시(Coomassie) 염색된 SDS-PAGE 겔 밴드 강도에 의해 제공하였다.
결과
IL-10 및 IL-4 조합에 대한 이론적 근거 전개 : IL-10은 LPS에 대한 반응으로 대식세포에 의한 TNFα 분비를 억제시키는 것으로 보고되었다 ([Interleukin 10 Inhibits Cytokine Synthesis by Human Monocytes An Autoregulatory Role of IL-10 Produced by Monocytes, 1991]; [Moore, 2001]). IL-4는 인간 단핵구 (Hart, Potential antiinflammatory effects of interleukin 4: Suppression of human monocyte tumor necrosis factor ca, interleukin 1, and prostaglandin E2, 1989) 및 인간 복막 대식세포 (Hart, 1991)로부터의 LPS 유도된 TNFα 분비를 억제시키는 것으로 보고되었다.
염증 자극으로 LPS에 반응하여 나타나는 단핵구 염증유발성 시토카인 분비 억제에 대해 IL-4 및 IL-10 조합이 미치는 효과를 결정하기 위해, 자기 비드 양성 선택에 의해 말초 혈액 단핵구를 건강한 공여자 PBMC로부터 단리시켰다. 단리된 단핵구를 적정 IL-10, IL-4, 및 IL-10과 IL-4의 조합에 노출시켰다 (도 13). 적정 (0.1, 1, 10, 100 ng/mL) 인간 IL-10, IL-4, 및 IL-10과 IL-4의 조합에 대한 건강한 인간 대식세포 반응을 평가함으로써 IL-10 단독 및 IL-4 단독 둘 모두가 LPS 유도된 TNFα 분비를 억제시킬 수 있다는 것이 입증된다. 그러나, IL-10과 IL-4를 함께 조합한 것이 TNFα 분비를 억제시키는 데 있어서 어느 시토카인이든 그 단독인 것보다 우수하다.
IL-4 및 DeboWtEBV가 단핵구/대식세포에 미치는 효과 : DeboWtEBV는 (이전에 미국 특허 10,858,412에 기술된) 인간 항-에볼라 항체로부터 유래된 반감기가 연장된 VH 및 VL 스캐폴딩 시스템에 커플링된 야생형 EBV IL-10으로 구성된다. DeboWtEBV는 TNFα 분비를 억제시키는 것으로 밝혀졌다. 단리된 단핵구를 적정 IL-10, IL-4, DeboWtEBV, 및 IL-4와 조합된 DeboWtEBV에 노출시켰다 (도 14). DeboWtEBV와 함께 IL-4의 조합은 IL-4 또는 DeboWtEBV 단독인 것보다 우수한 방식으로 단핵구로부터의 LPS 유도된 TNFα 분비를 억제시킨다.
IL-4 및 DeboWtEBV가 T 세포에 미치는 효과 : IL-10 및 IL-4가 단핵구/대식세포에 미치는 조합된 억제 효과를 평가하는 것 이외에도, IL-4 및 DeboWtEBV가 T 세포에 미치는 조합 효과를 또한 조사하였다 (도 15). DeboWtEBV는 동일한 몰 농도의 IL-10과 비교하여 CD8+ T 세포로부터 더 적은 IFNγ를 유도한다. DeboWtEBV와 IL-4의 조합은 100 ng/mL에서 DeboWtEBV 단독인 것에 의해 유도된 것보다 더 많이 IFNγ를 감소시킨다.
IL-4 및 DeboDV06이 단핵구/대식세포에 미치는 효과 : IL-10의 억제 효과가 증가될 수 있는지를 여부를 결정하기 위해, DV06으로 표시되는, 더 높은 고친화성 EBV IL-10 변이체를 평가하였다. DV06은 점 돌연변이 (A75I)를 함유하고, 야생형 EBV IL-10을 DV06으로 치환함으로써 (이전에 미국 특허 10,858,412에 기술된) 인간 항-에볼라 항체로부터 유래된 반감기가 연장된 VH 및 VL 스캐폴딩 시스템에 커플링된다. 단리된 단핵구를 적정 IL-10, IL-4, DeboDV06, 및 IL-4와 함께 조합된 DeboDV06에 노출시켰다 (도 16). DeboDV06은 (도 15와 비교하여) DeboWtEBV 대비 증가된 억제 기능을 보이고, IL-4와 DeboDV06의 조합은 유사하게 LPS에의 단핵구/대식세포 반응에 대한 억제 기능을 증가시킨다. DeboDV06과 IL-4의 조합은 IL-4 또는 DeboDV06 단독인 것보다 우수한 방식으로 단핵구로부터의 LPS 유도된 TNFα 분비를 억제시킨다.
(DK4 10 형태의) DeboDV06과 커플링된 IL-4 평가: 본 데이터는 IL-10 변이체인 DV06 (친화성이 증진된 야생형 EBV IL-10의 변이체)과 IL-4의 조합이 어느 분자이든 그 단독인 것보다 우수한 방식으로 LPS 매개 단핵구 염증 반응을 억제시킨다는 것을 시사한다. 따라서, 반감기가 연장된 스캐폴드 분자의 VH와 VL 사이의 링커에서 IL-4를 발현시킴으로써 IL-4를 DeboDV06 분자에 커플링시켜 (도 17), 이중 시토카인 융합 단백질의 비-표적화 형태인 (즉, 항-에볼라 항체로부터의 6개의 CDR 영역을 포함하는), "IL-4DeboDV06" 또는 "4DeboDV06"으로 표시되는 DK410 분자 부류의 제1 구성원을 생성하였다.
(DK4 10 형태의) IL- 4DeboDV06이 단핵구/대식세포에 미치는 효과 : DK410 형태의 IL-4DeboDV06이 LPS 유도된 염증 반응을 억제시키는지 여부를 결정하기 위해, 단리된 단핵구를 적정 IL-10, IL-4, DeboDV06, IL-4와 함께 조합된 IL-10, 및 IL-4DeboDV06에 노출시켰다 (도 18). DK410 형태의 IL-4DeboDV06은 IL-4 또는 DeboDV06 단독인 것보다 우수한 방식으로 단핵구로부터의 LPS 유도된 TNFα 분비를 억제시키지만, 특히, 더 낮은 농도에서는 IL-4 + IL-10만큼은 아니다.
(DK4 10 형태의) IL- 4DeboDV06이 CD8+ T 세포에 미치는 효과 : IFNγ를 강화시키고, CD8+ T 세포로부터 IFNγ를 유도할 수 있는 IL-4DeboDV06의 능력을 조사하고, IL-10, IL-4, DeboDV06, 및 IL-4와 함께 조합된 DeboDV06과 비교하였다 (도 19). DK410 형태의 IL-4DeboDV06은 DeboDV06 + IL-4의 조합과 유사하게 CD8+ T 세포로부터의 IFNγ 분비를 억제시킨다.
(DK4 10 형태의) IL- 4HADeglyDmCD14DV06 및 IL- 4HADeglyDmCD14DV07이 단핵구/대식세포에 미치는 효과: DK410 형태의 IL-4DeboDV06을 제조하는 데 사용된 IL-4 아미노산 서열이 글리코실화된 것으로 나타난 것으로 결정되었다. 서열 분석 결과, 추정 N-연결 글리코실화 변이가 아미노산 위치 N38에 존재하지만, 글리코실화가 기능에는 필요하지 않다는 것이 확인되었다 (Li, 2013). 추가 연구는 아미노산 T13을 아스파르테이트 (D)로 치환하였을 때, 고친화성 IL-4 변이체가 생성되었다는 것을 시사하였다 (미국 특허 6,028,176). N38A 및 T13D에서 치환을 갖는 두 점 돌연변이 모두 IL-4에 도입되었고, 뮤린 CD14로부터의 6개 CDR이 인그라프팅된 Debo 스캐폴딩에 연결되고, 도입되었다 (도 20). 본 데이터는 고친화성, 비-글리코실화된 IL-4 변이체 (즉, N38A 및 T13D 점 돌연변이 둘 모두를 포함하는 것)가 DK410 커플링된 포맷에서는 동일한 포맷의 야생형 IL-4와 비교하였을 때, 열등한 기능을 나타낸다는 것을 시사한다.
(DK4 10 형태의) IL- 4ngDmCD14DV06 및 IL- 4ngDmCD14DV07 이 단핵구/대식세포에 미치는 효과: 단리된 단핵구를 적정 IL-10, IL-4ngDmCD14DV06 ("DK410mCD14DV06"으로도 또한 공지), 및 IL-4ngDmCD14DV07 ("DK410mCD14DV07"로도 또한 공지)에 노출시켜 LPS 유도된 염증 반응의 억제에 대해 검정함으로써 N38A 치환을 포함하는 IL-4 변이체를 포함하는, DK410 형태의 IL-4ngDmCD14DV06 및 IL-4ngDmCD14DV07을 평가하였다 (도 21). "IL-4ng"로 명명되는 IL-4 변이체는 본 발명자들이 제조가능성을 개선시키기 위해 도입한 비-글리코실화된 형태의 IL-4 (N38A 치환 포함, 서열식별번호 44)이고, "mCD14"는 항-mCD14 항체로부터의 6개의 CDR이 Debo 스캐폴딩으로 인그라프팅된 것을 나타낸다. (DV06 및 DV07의 IL-10 변이체를 포함하는) 두 DK410 분자 모두 LPS 유도된 TNFα 분비를 억제시킨다.
(DK4 10 형태의) IL- 4ngDmCD14DV06 및 IL- 4ngDmCD14DV07이 T 세포에 미치는 효과: IL-10, (상기 기술된 바와 같은) DK410 형태의 IL-4ngDmCD14DV06 및 IL-4ngDmCD14DV07의 자극 효과를 T 세포에 대해 평가하였다 (도 22). (DV06 및 DV07의 IL-10 변이체를 포함하는) 두 DK410 분자 모두 CD8+ T 세포로부터의 IFNγ 분비를 IL-10만큼 유도하지 못한다. IL-4ngDmCD14DV06은 IL-4ngDmCD14DV07과 비교하였을 때 1 - 100 ng 등가 몰에의 노출시 약간 더 적은 IFNγ 분비를 유도한다.
(DK4 10 형태의) IL- 4ngDmDMAdCAMDV06이 단핵구/대식세포에 미치는 효과: 단핵구/대식세포에 대한 LPS 유도된 염증 반응 억제를 검정함으로써 DK410 형태의 IL-4ngDmMAdCAMDV06이 미치는 효과를 평가하였다. IL-4ngDmMAdCAMDV06은 (1) (N38A 치환을 포함하는) 비-글리코실화된 IL-4ng 변이체; (2) 마우스 항-MAdCAM 항체로부터의 6개의 CDR의 Debo 스캐폴딩으로의 인그라프트먼트; 및 (3) IL-10 변이체 DV06을 포함하는 DK410 형태의 이중 시토카인 융합체이다. 단리된 단핵구/대식세포를 IL-10 또는 IL-4ngDmMAdCAMDV06으로 적정하였다 (도 23). IL-4ngDmMAdCAMDV06은 단핵구/대식세포에서 LPS 유도된 TNFα 분비를 억제시킨다.
(DK4 10 형태의) IL- 4ngDmMAdCAMDV06이 T 세포에 미치는 효과: 본 발명자들은 또한 IL-10 및 IL-4ngDmMAdCAMDV06 (DK410 포맷)이 T 세포에 미치는 자극 효과도 평가하였다 (도 24). IL-4ngDmMAdCAMDV06은 IL-10과 달리 CD8+ T 세포로부터의 IFNγ 분비를 유도하지 않는다.
결론
본 데이터는 IL-4 변이체 및 IL-10 변이체가 상기 두 시토카인을 인간 항-에볼라 유래 VH/VL 스캐폴드 시스템에 커플링시킴으로써 (즉, DK410 형태로) 공동-발현될 수 있다는 것을 시사한다. IL-4 및 IL-10 변이체의 조합은 단핵구/대식세포에 의한 LPS 유도된 염증 반응을 억제시키면서, 동시에 VH 및 VL 스캐폴딩 시스템 내에 존재하는 표적화 CDR에 관계없이 CD8+ T 세포로부터의 IFNγ 유도를 억제시킨다 (4DeboDV06을 항-mCD14 및 항-mMAdCAM으로부터의 CDR을 포함하는 인그라프팅된 버전의 DK410과 비교).
항-에볼라 유래 VH 및 VL 스캐폴드는 IL-4 및 IL-10 변이체 시토카인을 효과적으로 커플링시키고, 다수의 표적화 CDR의 그라프트를 수용할 수 있다. IL-4ng (N38A 치환에 의해 비-글리코실화된 IL-4를 생성하는 IL-4 변이체)와 DV06의 조합은 0.1 - 100 ng/mL에서 LPS 매개 TNFα 분비를 효과적으로 억제시키고, 동일한 용량 범위에서 CD8+ T 세포로부터 유의적인 IFNγ를 유도하지 못한다.
실시예 4: 패혈증 치료에서의 DK4 10
("DK410mCD14DV06"으로도 공지된) IL-4ngDmCD14DV06이 LPS 유도된 TNFα 분비를 억제시킬 수 있었고, CD8+ T 세포로부터의 IFNγ 유도를 둔화시켰다는 것이 결정되었는 바 (도 21 및 도 22 참조), 상기 분자를 널리 공지되고, 통상적인 패혈증 모델에서 조사하였다.
간략하면, 야생형 Balb/C 마우스를 입수하고, 표준 IACUCU 프로토콜에 따라 적응시켰다. 마우스를 12시간 명/암 주기로 표준 사료 및 수분을 자유롭게 섭취하게 하면서 유지시켰다.
LPS의 복강내 투여 (350 mg/마우스) 전 ("이전") 또는 후 ("이후") 언급된 시점에 100 ml의 비히클 중 언급된 용량으로 비히클, DK410mCD14DV06을 동물에서 피하로 투여하였다.
적응 4일 후, 군당 마우스 다섯 (5)마리씩 하기의 것으로 처리하였다:
(1) LPS 투여 30분 전 1 mg/kg DK410mCD14DV06; 및
(2) LPS 투여 30분 후 1 mg/kg DK410mCD14DV06.
LPS 투여 48시간 후 마우스를 생존에 대해 평가하였다. LPS 투여 30분 전에 DK410mCD14DV06으로 마우스를 처리하였을 때, 그 결과로 생존율은 100%인 반면, LPS 투여 30분 후 DK410mCD14DV06으로 처리하였을 때에는 패혈성 쇼크에 대한 보호 효과가 입증되었다 (도 25).
본 데이터는 IL-10 변이체를 IL-4 변이체 (IL-4ng)에 커플링시키고, (예컨대, DK410mCD14DV06을 이용하여) 마우스 항-CD14 항체로부터의 6개의 CDR을 갖는 Debo 스캐폴딩 시스템을 통해 두 분자를 표적화하는 것이 염증 반응을 유의적으로 약화시키고, 패혈성 쇼크를 치료한다는 것을 시사한다.
본 서면 설명은 예를 사용하여 바람직한 실시양태를 비롯한, 본 개시내용의 측면을 개시하고, 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자가 임의의 장치 또는 시스템을 제조하고, 사용하고, 임의의 통합된 방법을 수행하는 것을 포함하는 그의 측면을 실시할 수 있게 한다. 이러한 측면의 특허가능한 범주는 청구범위에 의해 정의되며, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 착안하는 다른 예를 포함할 수 있다. 그러한 다른 예들은 그들이 청구범위의 문자 그대로의 언어와 다르지 않은 구조적 요소를 갖거나, 청구범위의 문자 그대로의 언어와 실질적이지 않은 차이가 있는 등가의 구조 요소를 포함한다면, 청구범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 기술된 다양한 실시양태로부터의 측면 뿐만 아니라 이러한 각각의 측면에 대한 다른 공지된 등가물은 본 출원의 원리에 따라 추가적인 실시양태 및 기술을 구축하기 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 혼합 및 매칭될 수 있다.
참고문헌
Figure pct00011
Figure pct00012
SEQUENCE LISTING <110> DEKA BIOSCIENCES, INC. <120> Dual Cytokine Fusion Proteins Comprising IL-10 <130> 039451.00032 <140> <141> <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human IL-10 Amino Acid Sequence <400> 1 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 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gacagcctcc 720 aggcaaagga ctggaatggg tcgccagaat ctaccccacc aacggctaca ccagatacgc 780 cgactctgtg aagggcagat tcgccatctc tgccgacacc tccaagaacc aggccagcct 840 gcagatgaac agcctgagag ctgaggacac cgccgtgtac tactgctcta gatggggcgg 900 agatggcttc tacgccatgg actattgggg caagggcacc accgtgacag ttagtagtgg 960 tggtggcggt agtggcggag gcggctcagg cggtggtgga tctgctccta catcctccag 1020 caccaagaaa acccagctgc agttggagca tctgctgctg gacctccaga tgatcctgaa 1080 cggcatcaac aactacaaga accccaagct gacccggatg ctgaccttca agttctacat 1140 gcccaagaag gccaccgagc tgaaacatct gcagtgcctg gaagaggaac tgaagcccct 1200 cgaggaagtg ctgaatctgg cccagtccaa gaacttccac ctgaggccta gggacctgat 1260 ctccaacatc aacgtgatcg tgctcgagct gaagggctcc gagacaacct tcatgtgcga 1320 gtacgccgac gagacagcta ccatcgtgga atttctgaac cggtggatca ccttctgcca 1380 gtccatcatc tctaccctga ctggtggcgg aggaagcggc ggaggcggat ctggcggcgg 1440 aggctctgaa attcagatga cccagtctcc ttccagcctg tctctgtccc ctggcgagag 1500 agctaccctg tcttgtagag ccagccagga cgtgaacacc gctgtggctt ggtatcagca 1560 gaagcctgga caggcccctc ggctgctgat ctactctgcc tcctttctgt actccggcgt 1620 gcccgacaga ttctccggct ctagatctgg caccgacttt accctgacaa tcagctccct 1680 gcagcctgag gacttcgcca cctactactg ccagcagcac tacaccacac cacctacctt 1740 tggccagggc accaagctgg aaatcaaagg tggtggcgga tcaggcggtg gcggtagcgg 1800 tggcggaggt tctacagacc agtgtgataa ttttccccaa atgctgaggg atctgcggga 1860 cgccttctct agggtcaaga cattttttca gacaaaggat gaactcgata acctcttgct 1920 caaagagagc ctgctcgagg acttcaaagg atatctggga tgccaggctc tgagcgaaat 1980 gattcagttt tatttggagg aagtcatgcc tcaagcagaa aaccaggatc cagagattaa 2040 ggatcatgtc aacagcctcg gcgagaatct caagacactg agactgaggc tgcggagatg 2100 tcaccggttt ctgccttgtg aaaacaagag caaggctgtc gagcagatta agaatgcttt 2160 taacaaactc caagaaaaag ggatctataa ggctatgtct gagtttgata tctttatcaa 2220 ttatatcgaa gcttatatga ctattaaggc tcgctagggg cccgtttaaa cccgctgatc 2280 agcctcgact gtgccttcta gtt 2303

Claims (39)

  1. 모노클로날 항체의 단일 쇄 가변 영역 (scFv) 또는 항원 결합 단편에 융합된 IL-10의 단량체 및 제2 시토카인을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질로서, 여기서, 제2 시토카인은 scFv 또는 항원 결합 단편의 VH와 VL 영역 사이에 융합된 것인 이중 시토카인 융합 단백질.
  2. 하기 화학식 (I)의 이중 시토카인 융합 단백질:
    NH2-(IL10)-(X1)-(Zn)-(X2)-(IL10)-COOH (화학식 I);
    상기 식에서,
    "IL-10"은 서열식별번호 1, 3, 9, 10, 11, 12, 14, 또는 16으로부터 선택되는 단량체 서열이고;
    "X1"은 제1 모노클로날 항체로부터 수득된 VL 또는 VH 영역이고;
    "X2"는 제1 모노클로날 항체로부터 수득된 VH 또는 VL 영역이고;
    여기서, X1이 VL일 때, X2는 VH이거나, 또는 X1이 VH일 때, X2는 VL이고
    "Z"는 IL-10 이외의 다른 시토카인이고;
    "n"은 0-2로부터 선택되는 정수이다.
  3. 제2항에 있어서, X1 및 X2가 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); CD14; CD52; 다양한 면역 체크포인트 표적, 예컨대 비제한적으로 PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 또는 CTLA4; CD20; CD47; GD-2; VEGFR1, VEGFR2; HER2; PDGFR; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5T4; Trop2; EDB-FN; TGFβ 트랩; MAdCam, β7 인테그린 서브유닛; α4β7 인테그린; α4 인테그린 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; SR-J1; HIV, 또는 에볼라(Ebola)에 대해 특이적인 제1 모노클로날 항체로부터 수득되는 것인 이중 시토카인 융합 단백질.
  4. 제2항에 있어서, VL 및 VH가 항-HIV 또는 항-에볼라 항체인 제1 모노클로날 항체로부터 수득되는 것인 이중 시토카인 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 항-HIV 또는 항-에볼라 모노클로날 항체로부터의 VL 및 VH가 제2 항체로부터의 6개의 CDR이 인그라프팅된 (그로 치환된) 6개의 CDR을 포함하는 것인 이중 시토카인 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 제2 항체가 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); CD14; CD52; 다양한 면역 체크포인트 표적, 예컨대 비제한적으로 PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 또는 CTLA4; CD20; CD47;GD-2; VEGFR1; VEGFR2; HER2; PDGFR; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5T4; Trop2; EDB-FN; TGFβ 트랩; MAdCam, β7 인테그린 서브유닛; α4β7 인테그린; α4 인테그린 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; 또는 SR-J1로부터 선택되는 모노클로날 항체인 이중 시토카인 융합 단백질.
  7. 제5항에 있어서, 제2 모노클로날 항체로부터의 6개의 인그라프팅된 CDR이 항-EGFR 항체, 항-HER2 항체, 항-VEGFR1 항체, 또는 항-VEGFR2 항체로부터의 6개의 CDR을 포함하고, 여기서, 6개의 CDR이 VL로부터의 CDR 1-3 및 VH로부터의 CDR 1-3을 포함하는 것인 이중 시토카인 융합 단백질.
  8. 제2항에 있어서, Z가 IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-21, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, 인터페론-α, -β, -γ, TGF-β, 또는 종양 괴사 인자-α, -β, 염기성 FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, 또는 IL-13으로부터 선택되는 시토카인인 이중 시토카인 융합 단백질.
  9. 제2항에 있어서, Z가 IL-2, IL-4, 또는 IL-15인 이중 시토카인 융합 단백질.
  10. 제2항에 있어서, Z가 정수 1인 이중 시토카인 융합 단백질.
  11. 제2항에 있어서, 링커를 추가로 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질.
  12. 제2항에 있어서, IL-10이 서열식별번호 3, 12, 14, 16인 이중 시토카인 융합 단백질.
  13. 제2항에 있어서, 이중 시토카인 융합 단백질이 서열식별번호 35, 46-58, 또는 59인 이중 시토카인 융합 단백질.
  14. 하기 화학식 (II)의 IL-10 융합 단백질:
    NH2-(IL10)-(L)-(X1)-(L)-(Zn)-(L)-(X2)-(L)-(IL10)-COOH (화학식 II);
    상기 식에서,
    "IL-10"은 서열식별번호 1, 3, 9, 10, 11, 12, 14, 또는 16으로부터 선택되는 단량체 서열이고;
    "L"은 서열식별번호 39, 40, 또는 41의 링커이고;
    "X1"은 제1 모노클로날 항체로부터 수득된 VL 또는 VH 영역이고;
    "X2"는 제1 모노클로날 항체로부터 수득된 VH 또는 VL 영역이고;
    여기서, X1이 VL일 때, X2는 VH이거나, 또는 X1이 VH일 때, X2는 VL이고;
    "Z"는 IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-21, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, 인터페론-α, -β, -γ, TGF-β, 또는 종양 괴사 인자-α, -β, 염기성 FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, 또는 IL-13으로부터 선택되는 시토카인이고;
    "n"은 0-2로부터 선택되는 정수이다.
  15. 제14항에 있어서, VL 및 VH가 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); CD14; CD52; 다양한 면역 체크포인트 표적, 예컨대 비제한적으로 PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 또는 CTLA4; CD20; CD47;GD-2; VEGFR1; VEGFR2; HER2; PDGFR; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5T4; Trop2; EDB-FN; TGFβ 트랩; MAdCam, β7 인테그린 서브유닛; α4β7 인테그린; α4 인테그린 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; SR-J1; HIV, 또는 에볼라에 대해 특이적인 제1 항체로부터 수득되는 것인 IL-10 융합 단백질.
  16. 제15항에 있어서, VL 및 VH가 HIV 또는 에볼라에 대해 특이적인 제1 항체로부터 수득되는 것인 IL-10 융합 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 항-HIV 또는 항-에볼라로부터의 VL 및 VH가 제2 항체로부터의 6개의 CDR이 그라프팅된 (그로 치환된) 6개의 CDR을 포함하는 것인 IL-10 융합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 제2 항체가 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); CD14; CD52; 다양한 면역 체크포인트 표적, 예컨대 비제한적으로 PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 또는 CTLA4; CD20; CD47;GD-2; VEGFR1; VEGFR2; HER2; PDGFR; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5T4; Trop2; EDB-FN; TGFβ 트랩; MAdCam, β7 인테그린 서브유닛; α4β7 인테그린; α4 인테그린 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; 또는 SR-J1로부터 선택되는 항체인 IL-10 융합 단백질.
  19. 제17항에 있어서, 제2 항체로부터의 6개의 인그라프팅된 CDR이 항-EGFR 항체로부터의 6개의 CDR을 포함하고, 여기서, 6개의 CDR이 VL로부터의 CDR 1-3 및 VH로부터의 CDR 1-3을 포함하는 것인 IL-10 융합 단백질.
  20. 제14항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호 35, 46-58, 또는 59인 IL-10 융합 단백질.
  21. 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의, 제1항, 제2항 및 제14항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 융합 단백질이 항-HIV 또는 항-에볼라로부터 선택되는 제1 항체로부터의 VL 및 VH 영역을 포함하고, 여기서, 제1 항체의 6개의 CDR 영역은 항-EGFR 항체, 항-HER2 항체, 항-VEGFR1 항체, 또는 항-VEGFR2 항체로부터 선택되는 제2 항체로부터의 6개의 CDR 영역이 인그라프팅된 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 제1 항체가 항-에볼라 항체이고, 제2 항체가 항-EGFR 항체, 항-HER2 항체, 항-VEGFR1 항체, 또는 항-VEGFR2 항체로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 시토카인 또는 "Z"가 IL-2인 방법.
  25. 제24항에 있어서, "Z"의 "n" 값이 1인 방법.
  26. 제21항에 있어서, 융합 단백질이 0.01 ng/ml 내지 100 ng/ml로 투여되는 것인 방법.
  27. 제21항에 있어서, 융합 단백질이 0.01 ng/ml 내지 10 ng/ml로 투여되는 것인 방법.
  28. 제21항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호 35 52-54, 또는 55인 방법.
  29. 염증성 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항, 제2항 및 제14항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환을 치료하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 융합 단백질이 항-HIV 또는 항-에볼라로부터 선택되는 제1 항체로부터의 VL 및 VH 영역을 포함하고, 여기서, 제1 항체의 6개의 CDR 영역은 항-CD14 항체, 항-MAdCam 항체, 항-VEGFR1, 또는 항-VEGFR2 항체로부터의 6개의 CDR 영역이 인그라프팅된 것인 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 시토카인 "Z"가 IL-4인 방법.
  32. 제29항에 있어서, "Z"의 "n" 값이 1인 방법.
  33. 제29항에 있어서, 융합 단백질이 0.01 ng/ml 내지 100 ng/ml로 투여되는 것인 방법.
  34. 제29항에 있어서, 염증성 질환이 패혈증, 크론병, 류마티스 관절염, 건선, 및/또는 염증성 장 질환 (IBD)인 방법.
  35. 제34항에 있어서, IL-10 단량체가 서열식별번호 14의 DV06인 방법.
  36. 제29항에 있어서, 융합 단백질이 항-에볼라 항체로부터 선택되는 제1 항체로부터의 VL 및 VH 영역을 포함하고, 여기서, 제1 항체의 6개의 CDR 영역은 항-CD14 항체, 항-MAdCAM 항체, 항-VEGFR1 항체, 또는 항-VEGFR2 항체로부터 선택되는 제2 항체로부터의 6개의 CDR 영역이 인그라프팅된 것인 방법.
  37. 제34항에 있어서, IL-10 단량체가 서열식별번호 16의 DV07인 방법.
  38. 제29항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호 46-51, 56-58, 또는 59의 단백질인 방법.
  39. 패혈증, 패혈성 쇼크, 및/또는 그와 연관된 증상 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의, 제1항, 제2항 및 제14항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 패혈증, 패혈성 쇼크, 및/또는 그와 연관된 증상을 치료하는 방법.
KR1020237005848A 2020-07-20 2020-12-02 Il-10을 포함하는 이중 시토카인 융합 단백질 KR20230096959A (ko)

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