MXPA02001417A

MXPA02001417A - Complejos multiples de citosina-anticuerpo.

Info

Publication number: MXPA02001417A
Application number: MXPA02001417A
Authority: MX
Inventors: Stephen D Gillies
Original assignee: Lexigen Pharm Corp
Priority date: 1999-08-09
Filing date: 2000-08-09
Publication date: 2002-08-12
Also published as: US20040072299A1; WO2001010912A1; SK1842002A3; US7141651B2; CN1235911C; CA2380331C; ATE316982T1; JP2011067211A; NO20020641L; US7582288B2; HUP0202442A3; KR100827757B1; PL353348A1; PL202058B1; AU6626800A; DE60025832T2; EP1200479A1; RU2263118C2; JP2003507012A; US20070258944A1

Abstract

La invencion se refiere a complejos de proteina y proteinas de fusion incluyendo por lo menos dos diferentes moleculas de citosina. Los complejos de proteina y las proteinas de fusion ademas pueden incluir una porcion de activacion o direccion tal como una region de una inmunoglobulina. Tambien se describen metodos para utilizar los complejos de proteina y las proteinas de fusion.

Description

COMPLEJOS MÚLTIPLES DE CITOSIN A-ANTICUERPO REFERENCIA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud de E.U.A. serie No. 60/147,924, presentada el 9 de Agosto de 1999, la descripción de la cual se incorpora aquí por referencia.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a métodos para la construcción y expresión de complejos múltiples de proteína de citosina, y sus composiciones. Más específicamente, la invención se refiere a proteínas de fusión compuestas de múltiples citosinas y un componente de activación, y métodos para utilizar los mismos para el tratamiento de enfermedades tales como cáncer e infecciones virales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las redes reguladoras que controlan el sistema inmune se basan en moléculas de señalización de proteína secretada denominadas citosinas para activar y desactivar las funciones de células inmunes así como para regular su proliferación. Estas respuestas generalmente involucran múltiples citosinas que actúan -AfcA..! ^OtfMim^U JUiíUí^i^^ÜmmmáU^ Mmmm^áii en concierto para obtener el efecto biológico deseado. Ciertas citosinas, tales como la interleucina-2 ( I L-2) pueden inducir la proliferación de célula inmune por sí mismas y pueden activar otras funciones, incluyendo la secreción de citosinas secundarias. Otra citosina, interleucina-12 (IL-12) [revisado por Trinchieri, 1994, Blood 84:4008-4027], puede inducir la proliferación de ciertas células inmunes e inducir otro modulador inmune clave, interferón-? (IFN-?). Esta inducción de IFN-? es una actividad clave de IL-12, aunque IL- 12 tiene otras actividades importantes que son independientes de IFN-?. Ya que IL-12 por sí misma es inducida en una etapa temprana en situaciones de enfermedad infecciosa, se cree que enlaza los sistemas inmunes innatos y adquiridos. Muchos estudios in vitro con células inmunes tanto de ratón como de ser humano han mostrado la importancia de combinaciones de citosina en el desarrollo de respuestas inmunes óptimas. Por ejemplo, la mayoría de las células T no expresan receptores IL-12 (IL-12R) hasta que han sido activadas con mitógenos o cultivadas en altas concentraciones de I L-2 [Desai y otros, (1992), J. Immunol. 148:3125-3132]. Una vez que los receptores que son expresados, las células quedan más sensibles a IL-12. Además, IL-12 induce la transcripción de IFN-?, pero el ARNm de IFN-? es degradado solo justo después. En presencia de I L-2, el ARNm es estabilizado, dando como resultado un incremento dramático en la cantidad de IFN-? producida [Chan y otros, (1992) J. Immunol. 148:92-98]. En otros estudios, se ha encontrado que las combinaciones de citosina de IL- 3 más IL-11 o IL-3 más el factor Steel tuvieron un efecto sinergístico con IL-12 sobre la proliferación de células progenitoras hematopoyéticas tempranas [Trinchieri, 1994; citada anteriormente]. La combinación de interleucina-4 y GM-CSF es particularmente útil para estimular células dendríticas (Palucka y otros,

[1998] J. Immunol. 161:4587-4595). Para la estimulación de respuesta inmune mediada por célula también es útil combinar IL-12 con IL-18, una citosina promotora de Th1 recientemente descubierta con ciertas actividades que son complementarias a IL-12 (Hashimoto y otros,

[1999] J. Immunology 163:583-589; Barbulecu y otros,

[1998] J Immunology 160:3642-3647). Además, la I L-2 e interferón-? son sinergísticos en ciertas circunstancias [Palladito, M.A., patente de E.U.A. No. 5,082,658]. En muchos de estos estudios de sinergia, se encontró que el nivel relativo de cada citosina fue muy importante. Mientras la adición de IL-12 en presencia de cantidades subóptimas de I L-2 condujo a sinergia en la inducción de proliferación, la actividad citolítrca y la inducción ? e de IL'-2 e IL-12 utilizando una alta dosis de una citosina se encontraron que son antagonísticas [Perussia y otros, J. Immunol. 149: 3495-3502 (1992); Mehortra y otros, J. Immunol. 151:2444-2452 (1993)]. Una situación similar también existe en combinaciones de IL-12 e IL-7. Los estudios de sinergia entre IL-12 y otras citosinas para la generación de respuestas antitumorales en ratones también han mostrado resultados mixtos. En algunos modelos, la sinergia fue ^^tA-^-*.*-*... **** .*-** .ih.i,.,..-^-^-, — -„- ^...... ----- 'nuttmnjm^?mm *H> nS •* vista a dosis subóptimas de cada citosina y dosis más altas condujeron a una toxicidad mejorada, mientras que en otros modelos las combinaciones de IL-12 e I L-2 mostraron poca o nada de sinergia [ver, por ejemplo, Nastala y otros, J. Immunol. 153:1697- 5 1706. (1994)]. Estos resultados pueden reflejar la dificultad inherente de combinar dos agentes potencialmente sinergístícos, in vivo, especialmente cuando existe la necesidad de mantener una relación fija de actividades de dos agentes con diferentes propiedades farmacológicas, tal como una vida media en circulación 10 diferente y biodistribución. En experimentos de cultivo de célula in vitro, lo principal es controlar los niveles de citosina, pero muchos factores pueden afectar la biodistribución relativa y la localización de citosinas in vivo, afectando así su capacidad inmunoestimulante. El aspecto más 15 importante de estos factores es la vida media. La vida media de I L-2 en la circulación después de inyección de bolo es de aproximadamente 10 minutos. En contraste a estas propiedades farmacocinéticas, ~ la • vid'a'-metlra "en cfrcul^-eHón de I *12 ha sido reportada por ser >3 horas en ratones [Wysocka y otros (1995) Eur. 20 J. Immunol. 25:672] y de 5-10 horas en seres humanos [Lotze y otros (1996) Ann NY Acad Sci. 795:440-454]. Esta diferencia se cree que se debe a los tamaños relativamente pequeños tanto de IL-12 como de GM-CSF (15-25 kD, vs. 75 kD para IL-12), permitiendo que IL-12 y GM-CSF sean 25 eliminados a través de filtración renal. Las proteínas con un peso .t_..«ji_ .i...h«„„.., . w, ,,-a» „.,.m_„„ ,. - -*. ----- ....,.*..T1| molecular menor que 50 kD son eliminadas por filtración renal. Casi todas las citosinas son más pequeñas que 50 kD y experimentan una rápida eliminación, similar a través de filtración renal. Cuando se desea el tratamiento con dos citosinas rápidamente eliminadas, pequeñas, es suficiente co-administrar simplemente las citosinas, sin embargo, la co-administración no es óptima para citosinas con vidas medias significativamente diferentes. La administración sistémica de citosinas es difícil debido a sus efectos laterales nocivos. Por ejemplo, altos niveles de interferón- alfa dan como resultado efectos laterales importantes, incluyendo toxicidades en la piel, neurológicas, inmunes y endocrinas. Se espera que múltiples fusiones de citosina puedan mostrar efectos laterales particularmente serios. Para reducir los efectos laterales de administración sistémica de citosinas, una estrategia es fusionar una citosina a una segunda molécula con capacidad de activación. Las fusiones en donde una región Fc es colocada en el término N de otra proteína (denominadas "inmunofusinas" o"fus¡e e*s~~?'F©-^!l7 en í-cK e X es un ligando tal como interferón-alfa) tienen un número de distintas propiedades biológicas, ventajosas [Lo y otros, patentes de E.U.A. Nos. 5,729,044 y 5,541,087: Lo y otros, Protein Engineering 11:495]. En particular, dichas proteínas de fusión aún pueden unirse a los receptores Fc importantes sobre superficies de células. Sin embargo, cuando el ligando se une a su receptor sobre una superficie de célula, la orientación de la región Fc se ve alterada y las secuencias que median la citotoxicidad mediada por célula, dependiente de anticuerpo (ADCC) y fijación de complemento parecen ser ocluidas. Como resultado, la región Fc en una molécula Fc-X no median ADCC o fijación de complemento, efectivamente. El efecto citotóxico debido a la fusión de una citosina N-terminal y una región Fc C-terminal es bien conocido. Por ejemplo, la fusión de IL-12 al término N de una región Fc crea una molécula que es capaz de unirse a células que llevan el receptor IL-2, fijar complemento y lisar las células como un resultado [Landolfi, N.F. (1993) patente de E.U.A. No. 5,349,053]. En contraste, las proteínas de fusión Fc-IL-2 no tienen esta propiedad. De esta manera, se espera que las fusiones de Fc-X tengan las virtudes de la vida media incrementada en el suero y la concentración relativa en el hígado, sin efectos nocivos de ADCC y fijación de complemento. Se ha demostrado que muchas diferentes proteínas con vidas medias en suero cortas pueden ser fusionadas a una región Fc en una configuración Fc-X, y las fusiones resultantes tienen vidas medias en suero marcho smás-*+a-rgas:"-"Stn='errrbatgo, las vidas medias en suero de dos diferentes fusiones Fc generalmente son serán idénticas. De esta manera, cuando se desea el suministro de dos diferentes fusiones X generalmente no será óptima una coadministración de dos diferentes proteínas Fc-X. Bajo algunas circunstancias, un mejor aspecto es activar el efecto de la citosina hacía un antígeno de superficie de célula fusionándola a un anticuerpo (o fragmento derivado de la misma) teniendo carácter especifico y afinidad para ese antígeno (Gillies, patente de E.U.A. No, 5,650,151: Gi Mies y otros, Proc. Nati Acad. ZIL. 898:1425) o enlazando un antígeno de proteína y citosina estimulante a través de un enlace de péptido en la forma de una proteína de fusión (Hazama y otros, 11:629). Aunque los mismos anticuerpos pueden incrementar la vida media de una citosina fusionada, siguen existiendo diferencias entre las diferentes fusiones de citosina con el mismo anticuerpo [ver, por ejemplo, Gillies y otros, Bíoconjugate Chem. 4:230-235 (1993); Gillies y otros, J. 10 Immunol. 160:6195-6203] que podría hacer difícil la co-localización en un sitio objetivo. Como se discutió anteriormente, esto puede conducir a un desequilibrio en las actividades de citosina y reducir los efectos sinergísticos deseados. Además, el uso de dos diferentes proteínas de fusión requiere de probar cada fusión en 15 forma separada para su seguridad y perfil de efectividad, y después además probar como mezclas.

- CQiVIPE-NBrO-D? LrA~tNVE N C I O N 20 La presente invención proporciona complejos o fusiones entre dos o más citosinas diferentes, que son útiles para terapia inmune general así como dirigida o activada. Estos complejos o fusiones óptimamente incluyen otras porciones de proteína. Una característica de dichos complejos o fusiones es que proporciona las actividades 25 de las citosinas del componente en una relación fija.

En general, la invención se refiere a un complejo de proteína conteniendo por lo menos dos diferentes citosinas, las citosinas pueden estar en la misma cadena de polipéptido o estar conectadas a través de un enlace covalente tal como un enlace de disulfuro o un enlace formado a través de un enlace de entrelazamiento químico. Alternativamente, las citosinas pueden estar en una asociación no covalente, estable. En algunas modalidades preferidas, el complejo de protéina comprende una porción de activación, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que dirige el anticuerpo hacia un sitio en un mamífero. En una modalidad preferida, la invención proporciona un complejo de protéina combinando la bioactividad de una citosina de dos cadenas, tal como IL-12, con aquella de una segunda citosina. Las citosinas pueden ser covalentemente enlazadas (por ejemplo, fusionadas) entre sí. Las citosinas también pueden ser asociadas a través de otras porciones. Por ejemplo, la cadena de polipéptído que contiene la segunda citosina puede incluir una porción de unión específicamente tfue une- b-t-2,-tal csmc wi anticuerpo a IL-12 o un receptor a IL-12. Alternativamente, la porción de unión puede ¡nteractuar con una segunda porción que está asociada con IL-12. Por ejemplo, si una cadena de polipéptido que codifica una subunidad de IL-12 también incluye avidina, el polipéptido que contiene la segunda citosina puede incluir biotina como una porción de dirección o activación. En una modalidad preferida, la segunda citosina es IL-2.

La invención proporciona métodos para la producción de proteínas de fusión de IL-12 que mantienen tanto a la actividad de IL-12 como aquella de la segunda citosina, mientras se proporciona un comportamiento farmacocinética individual más largo, similar a aquel de la misma IL-12, que incrementa la duración de la actividad de la segunda y mantiene el equilibrio de actividades de las dos citosinas después de inyectarse a un animal. En otra modalidad de la invención, las proteínas de fusión comprenden una forma heterodimérica de IL-12, en donde las sub-unidades p35 y p40 de IL-12 están enlazadas a través de un enlace de disulfuro y covalentemente enlazadas a una segunda citosina ya sea en el término amino o carboxilo de la sub-unidad p35 o p40 de IL-12 con la fórmula general IL-12 o X-IL-12, en donde X es una segunda citosina. En otra modalidad de la invención, las proteínas de fusión comprenden una segunda citosina covalentemente unida ya sea en el término amino o carboxilo a una forma de cadena individual (Se) de IL-12 comprendiendo lars*-dos s u b - a n i d atle*s* de polipéptido unidas a través de un enlazador de péptido flexible con la fórmula general sclL-12-X o X-sclL-12. En otra modalidad más, dos citosinas se fusionan adicionalmente una proteína capaz de formar una estructura dimérica o multimérica en ya sea el término amino o carboxilo de dicha cadena de proteína. En una forma preferida de esta modalidad, una de las formas de proteína de fusión de IL-12 con una segunda .„, .. -. ¿L.?.? 1 i i- *, , 10 citosina además es fusionada a una porción de una cadena de inmunoglobulina (Ig) tal como la región Fc que es capaz de dimerización. Otras modalidades incluyen la fusión de por lo menos una cadena de polipéptido de IL-12 ya sea en cualquiera de los 5 términos de una porción de una cadena Ig y una segunda citosina fusionada en el otro término. En otra modalidad, dos o más citosinas se fusionan a una proteína con capacidad de dirección o activación en virtud de la unión a un receptor específico, por ejemplo una región Fc es capaz 10 de unirse a receptores Fc, los cuales son abundantes en el hígado. Las fusiones de una región Fc con múltiples citosinas ilustran las ventajas tanto de la dimerización como de la dirección o activación, pero en algunas circunstancias es útil construir fusiones de múltiples citosina que tengan solamente la capacidad de multimerización o 15 activación o dirección pero no ambas capacidades. En otra modalidad más, una protéina de fusión que comprende múltiples citosinas además es fusionada en ya sea el término amino o carboxilo a urn mrembro-de-una ctas~e— de moléculas con diversidad- capacidad de dirección o activación, tal como un anticuerpo o un 20 aptámero de péptido con o sin un andamio (Colas y otros,

[1998] Proc Nati Acad Sci USA, 95;14272-7). Una modalidad particular es la fusión de múltiples citosinas a por lo menos una porción de un anticuerpo capaz de unir un antígeno, tal como un anticuerpo intacto, un anticuerpo de cadena individual, o una región Fc de cadena 25 individual. Otras modalidades incluyen fusiones de por lo menos una cadena de polipéptido de IL-12 en cualquier término de por lo menos una porción de una cadena de anticuerpo que es capaz de unir un antígeno, y una segunda citosina fusionada en el otro término. De acuerdo con las descripciones anteriores, generalmente se prefieren construir múltiples proteínas de fusión de citosina y múltiples proteínas de fusión de citosina-anticuerpo a través de técnicas de ingeniería genética, de manera que las proteínas componentes están enlazadas a través de enlaces covalentes, tales como enlaces de amida o enlaces de disulfuro. Sin embargo, también es útil usar enlazadores cruzados químicos, para construir dichos complejos de proteína. Dichos métodos están bien establecidos en la técnica de química de proteínas. Alternativamente, algunas veces es suficiente generar complejos de proteína fusionando diferentes citosinas con proteínas de patrón que forman complejos no covalentes estables. Por ejemplo, se utiliza una proteína de soporte de heterodímero no covalente: una primera citosina es fusionada a una sub-unidad del heterodímero, una segunda citosina es fusionada a una segunda sub-unldad- del heterodímero, y las dos proteínas de fusión se mezclan bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican las dos proteínas de fusión de sub-unidad-citosina son expresadas en la misma célula, de esta manera, se puede construir un complejo múltiple de protéina de citosína, en donde las citosinas de componente no están covalentemente enlazadas, directa o indirectamente. Para lograr el propósito de la invención es necesario que dicho complejo sea lo suficientemente estable para ser mantenido después de la administración a un animal lograr un efecto biológico. La invención también proporciona ácidos nucleicos codifican proteínas de fusión comprenden dos o más citosinas, en una de las citosinas preferiblemente es IL-12, y la proteína de fusión codificada por el ácido nucleico opcionalmente incluye otras porciones de proteína. Las modalidades preferidas incluyen ácidos nucleicos que codifican fusiones de dos o más citosinas a una proteína de dimerización, tal como una porción Fc de una cadena de anticuerpo. Otro grupo de modalidades preferidas son los ácidos nucleicos que codifican fusiones de dos o más citosinas a una proteína con capacidad de dirección o activación, tal como un anticuerpo. La invención también proporciona métodos para la construcción de fusiones de dos más citosinas, así como métodos para la expresión de tales proteínas de fusión. La invención también proporciona métodos para el tratamiento de enfermedades y otras condiciones médicas, dicho tratamiento involucra la- cpmbinación útil de dos o más proteínas. En una. modalidad, por lo menos una de las proteínas tiene una vida media en el suero corta (por ejemplo, menor que 20 minutos), o sólo moderadamente larga (por ejemplo, menos de 40 minutos). Las proteínas son fusionadas a través de ingeniería genética u otras técnicas que se administran a un ser humano. De esta manera, las actividades de las dos proteínas están presentes en una relación fija, y las administraciones separadas en diferentes horarios de dosificación de las dos proteínas no son requeridas. Además, la vida media en el suero de la proteína de fusión generalmente será más similar a aquella del componente de proteína con la vida media en el suero más larga, alargando así la vida media efectiva de la proteína o proteínas con la vida media más corta en el suero. Más específicamente, la invención proporciona tratamiento inmune-terapéutico de enfermedades, tales como cáncer, infecciones u otras enfermedades, que pueden ser útilmente tratadas en una citosina de dos cadenas, tal como IL-12 en combinación con una segunda citosina. En una modalidad preferida, la IL-12 se fusiona con I L-2 o GM-CSF y se administra a un animal o ser humano. En otras modalidades preferidas, GM-CSF se fusiona IL-4 y se administra a un animal o un ser humano. En otras modalidades preferidas, GM-CSF se fusiona a IL-4 y se administra a un animal o un ser humano. En otra modalidad, IL-12 se fusiona a IL-18 y se administra a un animal o a un ser humano. Dichos tratamientos pueden ser usados en combinación con otros tratamientos de .enfermedad. - Además, Ja inyencLÓc. proporciona métodos de vacunación contra diversos antígenos, que pueden ser usados para prevenir o tratar varias enfermedades. En otras modalidades de estos métodos, dos diferentes citosinas se fusionan a una porción de proteína dimérica tal como la región Fc de un anticuerpo y se administran a un animal o a un ser humano. En una forma preferida de estos métodos, la citosina, IL-12 es, fusionada a la región Fc junto con una segunda citosina que fc.-^a..! ¿ *--<"-- «»-¿> *-*--** preferiblemente es IL-12 o GM-CSF. En otras modalidades de métodos, dos diferentes citosinas se fusionan a un anticuerpo intacto, y se administran a un animal o ser humano. En una forma preferida de estos métodos, la citosina, IL-12 se fusiona a la porción de anticuerpo junto con una segunda citosina que preferiblemente es IL-12 o GM-CSF. La invención también describe mezclas de proteínas de fusión de anticuerpo-citosina que son útiles para tratar enfermedades. En otra modalidad, se utiliza una mezcla de un anticuerpo-proteína de fusión I L-2 y un anticuerpo- proteína de fusión IL-12 para tratar enfermedades. Por ejemplo, se puede tratar cáncer, infecciones virales, infecciones bacterianas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los objetos anteriores y otros objetos de la presente invención, y sus varias características pueden entenderse más completamente a partir de las siguientes descripciones, cuando se lean junto con los dibujos ane-xos. A- través de los dü ijos, números de referencia similares se refieren a estructuras similares. La Figura 1A esquemáticamente ilustra la fusión de dos citosinas en su forma más simple: una citosina es fusionada a una segunda citosina, opcionalmente a través de un enlazador. Las Figuras 1B-1I muestra varias formas en las cuales se puede unir una segunda citosina (mercada como 'cyt') a la citosina heterodimérica, IL-12. Específicamente, la segunda citosina puede ser fusionada al término mayúscula C de p40 (Figura 1B), al término N de p40 (Figura 1C) al término C de p35 (Figura 1D), o al término N de p35 (Figura 1E). Además, la Figura 1 muestra como una segunda citosina puede ser fusionada a una versión de cadena individual de IL-12. Específicamente, las moléculas de IL-12 de cadena individual pueden tener una termina N de p35 a p40, con la segunda citosina en el término C (Figura 1F) o el término N (Figura 1G). Alternativamente, las moléculas de IL-12 de cadena individual pueden tener una terminal mayúscula N de p40 a p35, con la segunda citosina en el término C (Figura 1H) o el término N (11). Las Figuras 2A-2C esquemáticamente muestran como múltiples fusiones de citosina (en caja) ilustradas en la Figura 1 pueden ser fusionadas adicionalmente a una de región Fc de un anticuerpo mostrado aquí como un gozne (H), un dominio CH2 y un dominio CH3 (óvalos). Específicamente, cualquiera de las 8 moléculas de la Figura 1 puede ser fusionada ya sea al término C (Figura 2A) o el término con N (Figura 2B) de la región Fc. Además, la primera citosina y la se.gunda citosina (cada una_,en una caja) no necesitan, ser unidas directamente una a la otra, pero puede ser conectados a través de la región Fc (Figura 2C). Las Figuras 3A-3G esquemáticamente muestran un subgrupo de formas en las cuales una proteína de fusión de citosina múltiple puede ser fusionada adícionalmente a una inmunoglobulina intacta, tal como una IgG. La región V de cadena pesada se muestra como una VH marcada ovalada, la región V de cadena ligera se muestra ÍAÍ como una VL marcada, ovalada, y las regiones constantes son óvalos en blanco. Una fusiones citosina múltiple, como se ¡lustra una Figura 1, puede ser colocada en el término C de cadena pesada (Figura 2A), el término N de la cadena pesada (Figura 2B), el término N de la cadena ligera (Figura 2C), o el término C de la cadena ligera (Figura 2D). Además, existen muchas formas en las cuales una primera y una segunda citosina puede ser unidas en forma separada en los términos N- y C- de las cadenas ligera y pesada; desde este se muestran en las Figuras 3E-3G. Las Figuras 4A-4C esquemáticamente ilustran como una primera citosina y una segunda citosína puede ser fusionadas a un anticuerpo de "cadena individual", en donde las cadenas pesada variable y ligera variable están fusionadas, y la proteína expresada como un polipéptido individual después se homodimeriza. Específicamente, una expresión de citosina múltiple puede ser colocada en el término C (Figura 4A) o el término N (Figura 4B). Además, la primera citosina y la segunda citosina no necesitan estar directamente unidas, pero p.uede ser cojiectados a Iravés de la.....^ porción de anticuerpo de cadena individual (Figura 4C) Las Figuras 5A-5C esquemáticamente muestran una primera citosina y una segunda citosina que pueden ser fusionadas a una región Fv de cadena individual consistiendo la regiones variables fusionadas de una cadena pesada y de una cadena ligera. Específicamente, una fusión de primera citosina-citosina puede ser colocada en el término C (Figura 5A), o el término N (Figura 5B).

Además, la primera cítosina y la segunda citosina no necesitan estar directamente unidas, pero pueden ser conectados a través de la porción Fv de cadena individual (Figura 5C). Las Figuras 6A y 6B muestran la sinergia entre IL-12 e I L-2 en la inducción de IFN-? a través de células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMCs) en respuesta a la citosinas separadas de proteínas de fusión. En la Figura 6A, se trataron células con IL-12 humana antes de (cuadro) o a través de la activación con fitohemaglutinina (X's), o con IL-12-proteína de fusión I L-2 antes (diamante) o después del activación de fitohemaglutinina (triángulos). La Figura 6B muestra un experimento en donde las células fueron tratadas con una mezcla de IL-12 más I L-2 agregado en una relación molar de 1:1 (diamantes negros), Fc-IL-12-proteína de fusión de I L-2 humana (cuadros grises), proteína de fusión de anticuerpo-IL-12-IL-2 humana (triángulos gris claro). El eje X. indica la concentración de IL-12 en pg/ml, si está presente como una proteína intacta o como una proteína de fusión. El eje Y. indica la concentración de-IFN-? (en ng/ml), qu<e-~se analizó-a través de ELISA.. La Figura 7 muestra un bioensayo de IL-12 típico que en forma separada muestra la actividad de una proteína de fusión y la compara con aquella de una molécula de IL-12 no fusionada. Lo que se ilustra esa estimulación de absorción de 3H-timidina de células PBMCs humanas en después en respuesta IL-12 de murino (círculos blancos), para una muestra de IL-12 de molino más I L-2 agregado en una relación molar de 1:1 (cuadros negros) a IL-2 de murino (triángulos blancos), y la una proteína de fusión anticuerpo-IL-12 de murino-IL-2 (diamantes negros). El eje X indica la concentración (pM) de citosina(s) monomérica(s), si está presente como una proteína intacta o como una proteína de fusión; el eje y. indica las CPM de la incorporación de timidina titulada. La Figura 8 muestra un ensayo de bioactividad de I L-2 estándar. La gráfica muestra la estimulación de proliferación de célula CTLL de ratón, en respuesta a I L-2 de murino (círculos), para una proteína de fusión de anticuerpo-IL-12 de murino-IL-2 (diamantes) e IL-12 de murino (cuadros). El eje x indica la concentración (pM) de citosina(s) monomérica(s), si está presente como una proteína intacta o como una proteína de fusión. Las células fueron incubadas con un medio conteniendo varias cantidades de citosina o proteína de fusión durante 48 horas, después se analizó para el número de células viables utilizando el ensayo MTT/MTS. El eje y indica la absorbancia a 490 nanómetros en unidades de densidad óptica (OD). La, Figura 9 muestra la-, .estimulación,-, de absorcióa Jiß 3H-timidina de células PBMCs en respuesta a IL-12 de murino (círculos blancos), para una mezcla de IL-12 de murino más I L-2 agregado en una relación molar de 1:1 (círculos negros), a una proteína de fusión de Fc-IL-12 de cadena individual-IL-2 (triángulos negros), y a IL-12 de cadena individual de murino fusionada a I L-2 (diamantes negros). El eje x indica la concentración (pM) de citosina(s) monomérica, si está presente como una proteína intacta o como una proteína de fusión; el eje y indica la CPM de incorporación de timidina titulada. La Figura 10 muestra la estimulación de absorción de 3H- timidina a través de células PBMCs, humana, en respuesta a IL-12 de murino (círculos blancos) a una mezcla de IL-12 de murino más 5 GM-CSF agregada en una relación molar de 1:1 (círculos negros), a GM-CSF de murino (triángulos negros), y a una proteína de fusión de Fc-IL-12 de murino-GM-CSF (X's). El eje x indica la concentración (pM) de citosina(s) monomérica, cuando está presente como una proteína intacta o una proteína de fusión; el eje y indica la CPM de 10 la incorporación de timídina titulada. La Figura 11 muestra el efecto de la proteína de fusión de anticuerpo-citosina-citosina, en el tratamiento de ratones Balb/C que llevan tumores subcutáneos derivados de células de carcinoma de colon CT26 y que se diseñaron por ingeniería para expresar EpCAM 15 humana, el antígeno para KS-1/4. Los diamantes negros indican volúmenes promedio de tumor en ratones que fueron inyectados con PBS como controles en los días 0,1, 2, 3, y 4. Los triángulos indican ~~. volúmenes promedio de tumor en ratones tratados^con 6 micr gramos de KS-IL-12-IL-2- Los cuadros indican volúmenes de tumor promedio 20 en ratones tratados con 3.4 microgramos de KS-IL-2 y 5.3 microgramos de KS-IL-12. Se realizaron inyecciones intratumorales. El eje x indica el número de días transcurridos después de la primera inyección; el eje y indica el volumen de tumor promedio en mililitros cúbicos. 25 La Figura 12 muestra el efecto del tratamiento de proteína de j^ ^ ^^^ fusión de anticuerpo-citosina-citosina de ratones SCID llevando tumores subcutáneos derivados de células de carcinoma de colon, CT26, fueron diseñadas por ingeniería para expresar EpCAM humano. Los diamantes indican volúmenes de tumor promedio en ratones que fueron inyectados con PBS como controles en los días 0, 1, 2, 3, y 4. Los triángulos indican volúmenes de de tumor promedio en ratones tratados con 6 microgramos de KS-IL-12-IL-2. Los cuadros indican volúmenes de tumor promedio en ratones tratados con 3.4 microgramos de KS-IL-2 y 5.3 microgramos de KS-IL-12. Se realizaron inyecciones intratumorales. El eje x indica el número de días transcurridos después de la primera inyección; el eje y indica el volumen de tumor promedio en mililitros cúbicos. La Figura 13 compara el efecto de la proteína de fusión de anticuerpo-citosina y anticuerpo-citosina-citosina, que es un tratamiento con ratones llevando tumores subcutáneos derivados de células de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) que fueron diseñados por ingeniería para expresar EpCAM humana. Los diamantes prora& io de tumor-* fl ratones que fueron inyectados intratumoralmente con PBS como controles en los días 0, 1, 2, 3, y 4. Los cuadros indican volúmenes promedio de tumor en ratones inyectados intratumoralmente con 20 microgramos de KS-IL-2 en los días 0, 1, 2, 3, y 4. Los triángulos indican volúmenes de tumor promedio en ratones inyectados intratumoralmente con 20 microgramos de KS-IL-12 en los días 0, 1, 2, 3, y 4: Xs indican volúmenes de tumor promedio en ratones r Mir-tp- «i mi !i r,- ?táUi¡^iajaai^.^hfc^^?>¿*i^.^a......l.i^.^^Í fa inyectados intratumoralmente con llevan tumores subcutáneos derivados de células de carcinoma de colon CT26 y que se diseñaron por ingeniería para expresar EpCAM humana, el antígeno para KS-1/4. Los diamantes negros indican volúmenes promedio de tumor en ratones que fueron inyectados con PBS como controles en los días 0, 1, 2, 3, y 4. Los triángulos indican volúmenes promedio de tumor en ratones tratados con 6 microgramos de KS-IL-12-IL-2- Los cuadros indican volúmenes de tumor promedio en ratones tratados con 3.4 microgramos de KS-IL-2 y 5.3 microgramos de KS-IL-12. Se realizaron inyecciones intratumorales. El eje x indica el número de días transcurridos después de la primera inyección; el eje y indica el volumen de tumor promedio en mililitros cúbicos. La Figura 14 muestra el efecto del tratamiento de proteína de fusión de anticuerpo-citosina-citosina de ratones que llevan tumores subcutáneos derivados de células de carcinoma de pulmón de Lewis y que fueron diseñadas por ingeniería para expresar EpCAM. Los diamantes indican volúmenes tumorales promedio en ratones que fueron -tfiyec ad-&s~ e-o-rv-P-B-S -©-©•R*©*- control es días en los día*s-*0, -1, 2, 3, y 4. Los triángulos indican volúmenes promedio del tumor en ratones tratados con 20 microgramos de KS-IL-12-IL-2. Los cuadros indican volúmenes tumorales promedio en ratones tratados con 11.5 microgramos de KS-IL-2 y de 18 microgramos de KS-IL-12. Se realizaron inyecciones intratumorales. El eje x indica el número de días transcurridos después de la primera inyección; el eje y indica el volumen de tumor promedio en mililitros cúbicos. duaáa t é á timi ?ß???mí imli? iii ^^ á La Figura 15 muestra el efecto del tratamiento de proteína de fusión de anticuerpo-citosina-citosina de ratones que llevan tumores subcutáneos derivados de células de carcinoma de pulmón de Lewis que tanto como expresan o no expresan EpCAM humanas. Los cuadros negros indican volúmenes tumorales promedio en ratones que llevan tumores derivados de LLC-KSA. Los diamantes negros indican volúmenes promedio de tumor en ratones que llevan tumores derivados de LLC. Los ratones fueron tratados con 20 microgramos de KS-IL-12-IL2 en los días 0, 1, 2, 3, y 4. Se realizaron inyecciones intratumorales. El eje x indica el número de transcurridos después de la primera inyección; el eje y indica el volumen promedio de tumor en mililitros cúbicos. La Figura 16 muestra el efecto del tratamiento de proteína de fusión de anticuerpo-citosina-citosina de ratones que llevan tumores subcutáneos derivados de células de carcinoma de pulmón de Lewis. Aproximadamente 106 células fueron inyectadas simultáneamente en el día 0. Los diamantes indican volúmenes promedio de tumor en ratsnes indi can volúmenes pronred o de tumor en ratones que previamente tuvieron tumores subcutáneos derivados de células de carcinoma de pulmón de Lewis que fueron diseñados por ingeniería para expresar EpCAM humana y los tumores de curaron a través del tratamiento con KS-IL-12-IL2. El eje x indica el número de días transcurridos después de la inyección; el eje y indica el volumen promedio de tumor en mililitros cúbicos. Las Figuras 17A y 17B muestran el efecto de secreción ífc aa.u , « >^ >- í ÍJ proteína de su citosina individual o múltiple a través de células tumorales sobre la capacidad de células para formar tumores en un animal con un sistema inmune normal. En la Figura 17A, se compararon cuatro grupos ratones: los ratones C57BL/6 inyectados s.c. 1 x 106 de células tumorales de células LLC (diamantes negros); ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 5 x 106 células tumorales LLC (diamantes blancos); ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 1 x 106 células tumorales de LLC expresando sclL-12 (triángulos negros); y ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 5 x 106 células tumorales LLC expresando sclL-12 (triángulos blancos). La Figura 17B compara los ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 1 x 106 células tumorales LLC (diamantes negros); ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 5 x 106 células tumorales LLC (diamantes blancos); ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 1 x 106 células tumorales de LLC que expresan sclL-12-IL-2(X's); y ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 5 x 106 células tumorales LLC expresando sclL-12 (círculos, blancos). El eje x indica el número de días después de inyección de las células - tum^a-le-S;— &l«~eje'»yHfld &a-el volumen -del tumor en™m lilitros cúbicosr- La Figura 18 muestra el efecto de la secreción proteína de cítosina individual o múltiple a través de células tumorales a través de la habilidad de células para formar tumores en un animal inmunodeficiente. Esta Figura compara ratones SCID inyectados s.c. con 1 x 106 células tumorales LLC (diamantes negros); ratones SCID inyectados s.c. con 1 x 106 de células tumorales de LLC expresando sclL-12 (triángulos negros); y ratones SCID inyectados s.c. con 1 x taÍ_t.l ??.Í. tAj 10 células tumorales LLC expresando sclL-12 (círculos blancos). El eje x índica el número de días después de la inyección de las células tumorales. El eje y indica el volumen de tumor en milímetros cúbicos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION La invención proporciona moléculas de proteína en donde dos o más diferentes citosinas están fusionados o en complejo. Los complejos de proteína o proteínas de fusión opcionalmente pueden incluir porciones de proteína adicionales, incluyendo porciones capaces de multimerización y dirección tal como las regiones Fc y las regiones de anticuerpo que incluyen sitios de combinación de antígeno. La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican múltiples proteínas de fusión de citosina. La invención también proporciona métodos para la construcción de ácidos nucleicos que codifican múltiples proteínas de fusión de citosina, métodos para la producción de proteínas de fusión múltiples de cito-s-iaa.-^~OT'ó ad©&. p^ r-a utilizarse, en proteínas -de fusión múltipLes citosina en el tratamiento de enfermedades y condiciones médicas. Como se utiliza en la presente, "citosina" se refiere a una proteína secretada o fragmento activo o mutante de la misma que modula actividades células del sistema inmune. Ejemplos de citosina incluyen las interleucinas, interferones, quimosinas, factores de necrosis tumoral, factores estimulantes de colonia para precursores de célula inmune, etc. -fe-. >.» ^A. ....A t ~. . «aaMft.aktti lI Como se utiliza la presente, "citosina heterodimérica" se refiere a una citosina que consiste de dos distintas sub-unidades de proteína. En la actualidad, la IL-12 es la única citosina heterodimérica de existencia natural que es conocido. Sin embargo, se pueden construir citosina heterodimérica artificiales. Por ejemplo, la IL-6 y un fragmento soluble de y en IL-6R pueden ser combinados para formar una citosina heterodimérica, como puede ser CNTF y CNTF-R alfa [Trinchierí (1994) Blood 84:4008]. Como se utiliza en la presente, "interleucina-12" (IL-12) se refiere a la citosina de dos subunidades que consiste de una subunidad de p35 y una subunidad de p40, o una fusión de cadena individual actividad de p35 y de p40, una variante de especie, fragmento o derivado de la misma. Como se utiliza en la presente, "interleucina-2" (I L-2) se refiere a cualquier I L-2 de mamífero tal como I L-2 humana, IL-2 de ratón, o una especie activa o variante alélica, fragmento o derivado de la misma. -..Co.mo_sJe» iJtJli a,-, a. la presente "GM-CSF". „se refiere a una proteína de citosina de factor estimulantes de colonia de granulocitos/monocito, tal como GM-CSF humano, GM-CSF de ratón, o una especie activa o variante alélica, fragmento o derivado del mismo. Como se utiliza en la presente "región Fc de inmunoglobulina" representa la porción de carboxilo-terminal de una región constante de cadena deseada de inmunoglobulina, o un análogo o porción de la misma. Por ejemplo, una región de Fc de inmunoglobulina de IgG puede comprender por lo menos una porción de una región de gozne, un dominio CH2 y un dominio CH3. En una modalidad preferida, la región Fc incluye por lo menos una región de gozne y un dominio CH3. En otra modalidad preferida, la región Fc incluye por lo menos un dominio CH2 y muy preferiblemente también incluye por lo menos una porción de una región de gozne. Como se utiliza en la presente "enlazador de péptido" representa uno o más péptido utilizados para acoplar dos proteínas juntas (por ejemplo, una proteína y una región Fc). El enlazador de péptido por lo general es una serie de aminoácidos tales como por ejemplo, predominantemente glicina y/o serina. De preferencia, el enlazador de péptido es una serie mezclada de residuos predominantemente de glicina y serina y tiene una longitud aproximadamente 10-15 aminoácidos. Como se utiliza en la presente el término "multimérico" se refiere a la asociación estable de dos o más subunidades de proteína a xayjé.s^je .rJJt^ a.C£;i.?íi.,covaIente cuno covalente,^.„p )r ejemplo, enlace de dísulfuro. Como se utiliza en la presente, el término "dimérica" se refiere a una molécula multimérica especifica, en donde dos subunidades de proteína se asocian establemente a través de interacciones covalentes o no covalentes. Un complejo estable es un complejo con un régimen de disociación, o fuera de régimen, de por lo menos varios minutos (de manera que complejo puede ser lo Siá^i.íÍ.? suficientemente estable durante el uso in vivo para alcanzar un tejido objetivo y tener un efecto biológico). El mismo fragmento Fc típicamente forma un dímero de los fragmentos de cadena pesada que comprenden una porción de la región de gozne, dominio CH2 y/o dominio CH3. Sin embargo, muchos ligandos de proteína se sabe se unen a sus receptores como un dímero. Sí una citosina X dimeriza en forma natural, la porción X en una molécula Fc-X dimerizará un grado mucho mayor, ya que el proceso de dimerización es dependiente de la concentración. La cercanía física de las dos porciones X conectadas a través de Fc podría hacer de la dimerización un proceso intramolecular, desplazando enormemente el equilibrio a favor del dímero y mejorando su unión al receptor. Como se utiliza en la presente, "vector" representa cualquier ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido competente para ser incorporada a una célula huésped y ser combinada con e integrada con el genoma de célula huésped, o para replicarse autónomamente como un episoma. Dichos vectores n clß,ico5_ lineares, ...plásmidos, fagémidos, cósmidos, vectores de ARN, vectores virales y similares. Ejemplos no limitantes de un vector viral incluyen un retrovirus, un adenovírus y un virus asociado con adeno. Como se utiliza en la presente "expresión de gen" o "expresión de una proteína" se entiende que significa la transcripción de la secuencia de ADN, traducción de la transcripción de ARNm, y cualquier secreción de un producto de proteína o producción de laá-^Jt i ?.. producto de proteína en una forma que se puede aislar. Como se utiliza en la presente, una "inmunocitosina" es una proteína de fusión que comprende un anticuerpo y una citosina, como se descríbela patente de E. U A. número 5,650,150. Como se describe en la presente una "secuencia líder" es una secuencia de proteína que está unida, usualmente en el término N, a una segunda secuencia de proteína, y que dirige a la segunda secuencia de proteína para ser secretada desde una célula. La secuencia líder usualmente es dirigida y removida de la segunda secuencia de proteína, la cual se vuelve la proteína madura. El término "secuencia líder" generalmente es sinónimo de "secuencia de señal". Como se utiliza en la presente, "EpCAM" se refiere a una molécula de adhesión de célula epitelial (Cirulli y otros,

[1998] 140:1519-1534), y es sinónimo de "KSA", representando el antígeno unido a través del anticuerpo monoclonal KS-1/4. La EpCAM es una proteína de superficie celular es abundantemente expresada sobre - -cé-Lu!as-e.a«nce*.o.sas.,derívado de.-células epiteliales. Como se utiliza en la presente, "KS-1/4", se refiere a un anticuerpo monoclonal particular que se une a EpCAM. Como se utiliza en la presente, "KS-IL2", "KS-IL12", y "KS- IL12-IL2", (y similares) se refiere una proteína de fusión de anticuerpo-citosina consistiendo de KS-1/4 con interleucina-2, KS- 1/4 con interleucina-12, y KS-1/4 tanto con interleucina-12 como con interleucina-2, respectivamente. También se utilizan en la presente construcciones de proteína de fusión análogamente nombradas. Ya que es posible fusionar citosinas en varias posiciones sobre una molécula de anticuerpo, una descripción tal como "KS-IL12-IL2" se refiere a la clase de proteínas que comprenden KS-1/4 tanto con interleucina-12 como con interleucina-2 fusionadas en cualquier posición posible, a menos que explícitamente se indique otra cosa. Como se utiliza en la presente "14.18" se refiere a un anticuerpo monoclonal particular que se une al antígeno específico en tumor GD2. Varias modalidades ilustrativas de las construcciones de proteína que modalizan la invención se ilustra en las Figuras 1-5. Partes de las moléculas ilustradas en las Figuras 2-5 están marcadas con 1A-1I, haciendo referencia a las proteínas datos de de fusión mostradas en las Figuras 1A-1I, e ilustrando que cualquiera de las proteínas de fusión de la Figura uno puede ser además fusionada con otras proteínas como se indique. Las citosina se muestran como rectángulos, las regiones constantes de anticuerpos se muestran -como.~?valo«s,."y-.la.~ cegión variable de cadena-pesada y la región variable de cadena ligera se muestran con óvalos marcados. La presente invención describe complejos de proteína que contienen dos diferentes citosinas y opcionalmente incluyen porciones de proteína adicionales. Una citosina homodimérícas (por ejemplo, interferón-alfa, interferón-beta, interferón-gama, IL-5, IL-8, o similares), aunque contienen múltiples subunidades, sin embargo es una citosina individual. Similarmente, una citosina heterodimérica t ¿ Í.«... ? -ÍÍ&-.1L ¿ . ?-iaji-j-m»,-.. » ?~ .. j*.-.,**.JIk. *.~ M., ? ^á.. tal como IL-12, aunque contiene subunidades que son diferentes, es una citosina individual. Además, una forma heterodimérica de citosinas normalmente homodiméricas, tal como el heterodímero MCP-1/MCP-2, o de dos alelos de una citosina normalmente homodiméricas (por ejemplo, Zhang y otros, J. Biol. Chem. [1994) 269:15918-24) es una citosina individual. Los complejos de la presente invención contienen dos diferentes citosinas, cada una de las cuales (por ejemplo, IL-2 y IL-12; IL-4 y GM-CSF; MCP-1 y eotaxina; etc.) es capaz de modular una actividad de una célula del sistema inmune. La Figura 1A ¡lustra una modalidad preferida de la invención: en la proteína de fusión 10, el término C de una primera citosina 12 está fusionada al término N de una segunda citosina 14, opcionalmente través de una región de enlazador (no mostrado). En algunas modalidades de la invención, el complejo de proteína de invención contiene por lo menos dos citosinas con vidas medias de suero significativamente diferentes. Por ejemplo, utilizando una -D-r-ot-e-í-n-a. ß-q-u-ßña y una grande por lo general dará como resultado una proteína de fusión con una característica de vida media en circulación de la proteína más grande. Por lo tanto en situaciones en donde los efectos combinados de IL-12 y una segunda citosina son deseados, puede ser ventajoso expresar las dos citosinas como una proteina de fusión de la fórmula general: IL-12-X o X-IL-12, en donde X es una segunda citosina. Se pueden ver dos ventajas particulares. En primer lugar la vida media en el suero de la citosina eliminada .l.. más rápidamente, es extendida. En segundo lugar, las vidas medias en el suero de ambas citosinas se vuelven muy similares entre sí. Una citosina de dos cadenas, tal como IL-12, puede ser fusionada a otra citosina en el término N o C de cualquier cadena de la citosina de dos cadenas. En una modalidad, una segunda citosina es fusionada ya sea al término N o al término C ya sea de las subunidad p35 o p40 de IL-12 (Figuras 1B-1E). En la proteína de fusión 16 de la Figura 1B, el término N de una primera citosina 12 está fusionado al término C de la subunidad p40 de IL-12, 18. La subunidad p40, 18, está conectada a la subunidad p35 de IL-12, 20, a través de un enlace covalente 22. En la proteína de fusión 24 de la Figura 1C, el término N de la subunidad p40, 18, está fusionado al término C de la primera citosina 12 y está conectado a la subunidad p35, 20 a través de un enlace covalente 22. La Figura 1D ilustra la proteína de fusión 26, en donde el término N de la primera citosina 12 está fusionado al término C de la subunidad p35, 20, la cual está conectada a través del enlace covalente 22 a la subunidad 18 p40. _. JiD.Ja- Figma^UE, la proteína de fusión-.,.„Z8 incluye la subunidad 20 p35, fusionada en el término N al término C de la primera citosina 12 y conectado a través de un enlace covalente 22 a la subunidad 18, p40. En una segunda modalidad, las subunidades de IL-12 pueden estar fusionadas para formar una proteína de cadena individual, sclL-12, ya sea con la subunidad p35 o la subunidad p40 en la posición N-terminal; la segunda citosina puede estar unida al término *^ N o C de la sclL-12 resultante (Figuras 1F-1I). De esta manera, en una modalidad preferida ilustrada en la Figura 1F, la proteína de fusión 30 contiene IL-12 de cadena individual, en donde el término N de la subunidad 18, p40, está fusionado al término C de la 5 subunidad 20, p35, opcionalmente a través de un enlazador de péptido. En esta modalidad, el término N de la citosina 12 está fusionado al término C de la subunidad 18, p40. En la modalidad mostrada en la Figura 1G, el término N de la subunidad 20, p35 está fusionado al término C de la citosina 12, opcionalmente a través de 10 un enlazador de péptido. Las Figuras 1H y 11 muestran proteínas de fusión 34 y 36, conteniendo otra versión de cadena individual de IL- 12, en donde el término N de la subunidad p35 está fusionado al término C de la subunidad p40, opcionalmente a través de un enlazador de péptido. En la proteína de fusión 34, mostrada en la 15 Figura 1H, el término N de citosina 12, está fusionado al término C de la subunidad 20, p35. En la proteína de fusión 36, mostrada en la Figura 11, el término N de la subunidad 18, p40, está fusionado al _ — J.é?m.Loa C ifí citosina 12_En una modalidad altamente preferida, IL- 12 está fusionada a I L-2. 20 La producción de dichas moléculas además se describe en los ejemplos. Por lo general es conveniente expresar moléculas heteromultimérícas, tales como IL-12 o un anticuerpo, como moléculas de cadena individual, en donde las subunidades no 25 idénticas están conectadas a través de enlazadores de aminoácidos cortos [Huston y otros (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 855879; Lieschke y otros (1997) Nat Bíotechnol. 15:35; Lieschke; G.J. y Mulligan; R. C, patente de E.U.A. No. 5,891,680]. Se construyó una fusión de gen, después la proteína deseada puede ser expresada en 5 células que contienen una construcción de ADN recombinante individual. Dichas versiones de cadena individual de una citosina heteromultimérica además pueden ser fusionadas a una segunda citosina, la cual sigue permitiendo que una proteína de fusión con actividades deseadas sea expresada a partir de una construcción de 0 ADN recombinante individual. Expresión de tales moléculas expresan los ejemplos. La invención también describe una proteína de fusión que comprende y IL-4 y GM-CSF. Esta combinación es particularmente útil para estimular funcionalmente representación de antígeno a 5 través de células dendríticas. Otra fusión útil comprende IL-12 e IL- 18. Ambas de estas citosinas promueven la respuesta de Th1, pero tienen actividades complementarias un poco diferentes. „,_ ^.^___La nve,?.cJÁ?i- también describe proteloas de fusión, en donde múltiples distintas citosinas fusionadas son además fusionadas a una 0 proteína capaz de formar multímeros, tales como homodímeros o heterodímeros. La ventaja de dicha molécula es que la potencia de una o más de las citosinas puede ser mejorada a través de dimerización. En algunos casos, la mejora de la potencia a través de dimerización puede ocurrir ya que la citosina se une a su receptor como un dímero. En una modalidad, se fusionan múltiples citosmas a una porción de una molécula de anticuerpo, tal como una región Fc (Figura 2). En otra modalidad, la IL-12 y una segunda citosina se fusionan a la proteína de homodimerización. En una modalidad preferida, la segunda citosina es I L-2 o GM-CSF. Las proteínas de fusión pueden ser creadas en una variedad de formas, reflejando todos sus varios órdenes de varias porciones diferentes de proteína a partir del los términos N al C en una proteína de fusión. Por ejemplo, cuando se fusionan una interleucina-12 y una segunda citosina a una región Fc, las dos citosinas puede ser ambas fusionadas en cualquiera o de al término N o C de la proteína Fc, o una citosina puede ser fusionada en el término N y la otra en el término C. Algunas de estas permutaciones se ilustran en la Figura 2. Por ejemplo, en la modalidad mostrada en la Figura 2A, una proteína de fusión 44 de la invención es fusionada al término C de una región Fc en conteniendo la región de gozne 38, la región CH2 40 y la región CH3 42. La proteína de fusión 44 pueden tener una variedad e.Sitrj C tunas, üijcJ« .ye n d o , por ejjemplo, las estructuras de las proteínas de fusión 10, 16, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36 ilustradas en las Figuras 1A-1I. Si la proteína de fusión 44 tiene más de un término N y término C, como las proteínas de fusión 16, 24, 26 y 28, la región Fc en puede ser fusionada ya sea al término N de la proteína de fusión 44. Como se muestra la Figura 2B, la proteína de fusión 44 puede ser fusionadas al término N de una región Fc. En la modalidad mostrada en la Figura 2C, una primera citosina 12 puede ser •** . ^ ?^i t£? M fusionada al término N de una región Fc, y una segunda citosina 14 puede ser fusionada al término C de la región Fc.

Consideraciones Estructurales 5 Es importante observar que las citosinas, como una clase de proteínas, son similares en tamaño y propiedades de doblamiento generales. De esta manera, los ejemplos específicos aquí descritos ilustran como construir múltiples proteínas de fusión de citosina para la familia de proteínas de citosina. Por ejemplo, muchas citosinas 10 caen en una clase de doblamiento de proteína denominada el "grupo de cuatro hélices". Las proteínas del grupo de cuatro hélices incluyen el factor de estimulación de granulocitos-colonia (G-CSF), interleucina-6 (IL-6), factor inhibidor de leucemia (Ll F), hormona de crecimiento, factor neurotrófico ciliar (CNTF), leptina, eritropoyetina, 5 factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago (GM- CSF), interleucina-5 (IL-5), factor de estimulación de colonia de macrófago (M-CSF), IL-2, IL-4, interleucina-3 (IL-3), IL-10, el interfex?n .estrechamenje relacionado tau, e interferón gama (IFN-gama). 0 Con expresión de IL-5 e IFN-?, todas estas proteínas se doblan como monómeros con cuatro hélices alfa ásperamente paralelas y dos conexiones transversales. En cada caso, excepto para IL-5 e IF- gama el término N y el término C están sóbrela misma cara proteína. Ya que las proteínas del grupo de cuatro hélices, excepto IL-5 e IFN- 5 ?, tienen el mismo patrón de doblamiento, los métodos descritos en i.l.j ^..«? .A.k-i la presente para IL-2, IL-4, y GM-CSF también se aplican a otras proteínas del grupo de cuatro hélices y otras proteínas de cítosinas pequeñas que se doblan como monómeros. Las quimosinas son una clase específica de citosinas que se 5 cree que forman a gradientes extraceluiares y median la quimiotaxis de clases específicas de células inmunes. Por ejemplo, la MCP-1 es un quimioatrayente para monocitos, macrófagos y células T activadas; la eotaxina es un quimioatrayente para eosinófilos; y la interleucina-8 es un quimioatrayente para neutrófilos. Además de sus 10 funciones quimioatrayentes, las quimosínas, así como otras citosinas son capaces de inducir expresión de genes específicos en células objetivo específicas. Por ejemplo, la MCP-1 se cree que induce la expresión del factor de tejido en células de músculo liso vascular (Schecter y otros, J. Biol. Chem.

[1977] 272:28568-73). 15 La ¡nvención describe fusiones de citosína-citosina y fusiones de anticuerpo-citosina-citosina, en donde una o más citosinas es una quimosina. La ¡nvención también describe construcciones de proteína ---,», CQ?^tcje.s.-Q^-Ji)á.s_ ití3?J a-S,, en doade una o más* citosinas es una quimosina. Por ejemplo, las quimosinas IP-10, RANTES, MIP-1alfa, 20 MIP-1beta, las proteínas químioatrayentes de macrófago, eotaxina, linfotactina, BLC, pueden ser fusionadas a una segunda citosina con o sin otras porciones tales como una porción de anticuerpo. El genoma humano, por ejemplo, modifica por lo menos 50 quimosinas. Las quimosinas conocidas generalmente comparten una 25 estructura de monómero tridimensional similar y un patrón de h*á>Jí &_ i ¿a^ji g ^^ doblamiento de proteína. Por consiguiente, los tipos generales de construcciones de proteína y estrategias de construcción aquí descritas puede ser aplicadas a una variedad de quimosinas conocidas o aún no descubiertas. Las quimosínas tienen un patrón de doblamiento distinto con tres estructuras de cadena beta y una hélice alfa. Las quimosinas se doblan como monómeros y, en algunos casos, pero no en todos, se dimerizan después del doblamiento. Para todas las quimosinas, el patrón de doblamiento de la subunidad de monómero es idéntico y todas las estructuras son extremadamente similares. Por ejemplo, las estructuras tridimensionales de interleucina-8, factor cuatro de plaqueta, actividad estimulante de crecimiento de melanoma (MGSA), proteína inflamatoria de macrófago, MIP, RANTES, (regulada después de activación, célula T normal expresada y secretada), proteína-1 quimioatrayente de monocito (MCP-1. MCAF), eotaxina, proteína-3 quimioatrayente de monocito, (MCP-3), dominio de quimosina de fractalquina, péptido-2 de activación de neutrófilo estramal,(SDF-1 ),-«.p..fc?Jteína-2 inflamatoria de macrófago, hcc-2 de quimosina (proteína-5 inflamatoria de macrófago), Gro beta quimioatrayente de neutrófilo inducido por citosina, y CINC/Gro ha sido determinadas mediante cristalografía de rayos X y/o métodos de NRM; todas estas estructuras muestran el mismo doblamiento, y generalmente son similares. Ya que las quimosinas tienen mismo patrón de doblamiento, los métodos descritos en la presente para la 11 nfotacti na también se aplican a otras proteínas de quimosinas. Un término N libre de una quimosina por lo general es importante para su función. Por lo tanto, es ventajoso para algunas modalidades construir fusiones en donde una segunda citosina, porción anticuerpo, u otra porción de proteína puede ser fusionada al término C de la quimosina. Para construir un complejo de proteína que contenga dos quimosinas activas, es útil, por ejemplo, fusionar las dos diferentes quimosinas a los términos N de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo. Algunas químosinas, tales como IL-8, son diméricas bajo condiciones fisiológicas. Para ciertas aplicaciones, es útil co-expresar una fusión de citosina-anticuerpo múltiple, tal como una fusión de IL-8-anticuerpo-citosina, junto con una porción no fusionada de IL-8 o una porción de IL-8 con un patrón de fusión diferente que no interactúe con la porción del anticuerpo. De esta manera, las diferentes porciones de IL-8 pueden heterodimerizar sin restricciones espaciales o la polimerización que puede resultar si todas las porciones de IL-8 fueran fusionadas a una cadena de ntßuerDO^^L ...^pr^teJ a-,.-JÍa.;u.í sión de— citosina múltiple deseada entonces puede ser separada basándose en el tamaño o basándose en unión a una proteína de anticuerpo-unión tal como la proteína de Staphylococcus A. Para proteínas de fusión de citosína múltiple que comprende una quimosina, es una modalidad preferida que la proteína de fusión también comprenda una función de localización, tal como una porción de anticuerpo que se une a un antígeno. Sin desear que esté ligado . í.ik- t,¡ por teoría, generalmente se cree que la distribución amplia de cuerpo de una quimosina no tendrá ningún efecto o conducirá a una vez desensibilización general de células hacia esa quimosina. Además, se cree que la función quimioatrayente de una quimosina solamente puede ser manifestada cuando existe un diferencial de concentración de la quimosina. Una modalidad preferida es una proteína de fusión de linfocina-anticuerpo-interleucina-2. Otra modalidad preferida es una en donde tanto la quimosina como la segunda citosina promueven una respuesta de Th1. Por ejemplo, una proteína de fusión que comprende IP-10 e IL-12 es una modalidad altamente preferida.

Extensión de la vida media de múltiples citosinas con vidas medias cortas en el suero La ¡nvención también describe proteínas de fusión que comprende dos citosinas, ambos con una vida media corta en el suero, fusionadas a una tercera porción con una vida media larga en el- sAe o«-J^ac»~.eje»p«lor---iau ? Q se desea, estimulación- .de células dendríticas, es útil combinar las actividades de IL-4 y GM-CSF (Thurner, J. Immunol. Methods (1999] 223:1-15; Palucka y otros,

[1988] J. Immunol. 160:4587-4595). Ya que tanto IL-4 como GM-CSF son pequeñas moléculas con vidas medias cortas en el suero, es útil construir una proteína de fusión que comprenda una región Fc, IL-4 y GM-CSF. La molécula resultante es una estimulante poderosa de la proliferación y actividad de células dendríticas. Asimismo, tanto IL-4 >-^.< 1UÜ como GM-CSF pueden ser fusionadas a un componente de activación o dirección tal como un anticuerpo con el propósito de suministrar las actividades de citosina combinadas el sitio de células que expresan un antígeno predeterminado. 5 La región Fc sola o como parte de un anticuerpo intacto puede conferir varias propiedades a múltiples fusiones a citosina que pueden ser ventajosas, o desventajosas, dependiendo de la aplicación específica. Estas propiedades incluyen dimerización, extensión de vida media en el suero, habilidad para fijar el 10 complemento, habilidad para mediar la citotoxicidad mediada por célula, dependiente del anticuerpo (ADCC), y unión a receptores Fc. Si extensión de la vida media en el suero es un aspecto primario deseado y las propiedades inmunológicas de las regiones Fc no son importantes o son indeseables, se prefiere utilizar una región Fc de 15 desea una variante natural o mutante de carezca de una o más propiedades inmunológícas. Por ejemplo, si se desea igualar y extender las vidas medias en el suero de dos o más citosinas con vidas mejdLasi&xoria.s„.e?a^je suet.aµ.-s.e .prefiere.„construir una..p.xo teína de fusión de citosina múltiple que comprenda una región Fc de lgG2 20 o lgG4 humana, las cuales respectivamente tienen una afinidad reducida o ninguna afinidad para receptores Fc o para utilizar una región Fc que lleva una mutación en el sitio de unión del receptor de Fc. En realidad, ya se ha mostrado que la fusión de algunas citosinas a anticuerpos incrementan la afinidad de la citosina de 25 fusión a receptores Fc y que esto da como resultado velocidades £¿6*^^*^*** ^^^ t „„,.,, ^,, más rápidas de eliminación en animales. El uso de regiones Fc con afinidad reducida para receptores Fc demostró que mejora enormemente la vida media en el suero de estas moléculas (Gillies y otros,

[1999] Cáncer Res. 59:2159-2166). Bajo algunas circunstancias y dependiendo de las citosinas utilizadas, una región Fc que se une al receptor Fc dará como resultado la internalización de la proteína de fusión de citosina múltiple y la degradación de una o más porciones de citosina.

Activación o dirección La invención también describe proteínas de fusión en donde dos o más citosinas se unen a una proteína que es capaz de localizar citosinas en una molécula objetivo particular, célula o ubicación en el cuerpo. La molécula preferida con capacidad de localización es un anticuerpo o una porción que comprende las regiones variables de unión a antígeno de un anticuerpo. Sin embargo, se pueden utilizar otras moléculas de localización, o sus domini-os?±aL<ns„ oJig nd.os.jC Lejcje tores específicos, prateüías de unión de existencia natural, enzimas que se unen a substratos particulares, péptidos artificialmente generados que han sido seleccionados para una unión particular o capacidad de localización, químicos con distintos propiedades el fisicoquímicas que dan como resultado la capacidad de activación, proteínas que poseen una capacidad de activación en virtud de unirse a otra molécula de esta activada, u otros tipos de proteínas. En el caso de la fusión de dos tei~]k.!ttA.¿.i.-,...: .1^?J?»?~- „>„..„.„.. £^g^^ citosmas a una molécula de activación, una primera citosina preferida es IL-12. Cuando se utiliza IL-12, una segunda citosína preferida es IL región 2, o GM-CSF. En el caso de un anticuerpo, existe un gran número de formas en donde dos o más citosinas pueden ser fusionadas, ya que existen varios posibles sitios de unión. Por ejemplo, un anticuerpo IgG consiste de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. Las dos citosinas pueden ser fusionadas entre sí y después fusionarse a un término N o C de la cadena pesada o de la cadena ligera. Alternativamente, cada citosina puede ser fusionada en forma separada a uno de los términos N o C sobre la molécula de anticuerpo. La Figura 3 ilustra un subgrupo de formas en dos citosinas que pueden ser fusionadas a una molécula de anticuerpo. Por ejemplo, haciendo referencia la Figura 3A, una proteína de fusión 44 de la invención puede ser fusionada al término C de una cadena pesada de inmunoglobulina 46, la cual está asociada con una cadena ligera de inmunc^la ulina.4A..„Cjo,mo-.sedje_aaJa-Jrigura 2^-Ja proteína djs fu-sjón 44 puede tener una variedad de estructuras, incluyendo, por ejemplo, las estructuras de las proteínas de fusión 10, 16, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36 ilustradas en las Figuras 1A-1I. Como se muestra en la Figura 3B, una proteína de fusión 44 puede ser fusionada al término N de una cadena pesada de inmunoglobulina 46, asociada con una cadena ligera de inmunoglobulina 48. En las modalidades mostradas en las Figuras 3C y 3D, la proteína de fusión 44 esta fusionada al «A. - término N (Figura 3C) o al término C (Figura 3D), de una cadena ligera de inmunoglobulina 48 asociada con una cadena pesada de inmunoglobulína 46. Como se muestran las Figuras 3E y 3F, una primera citosina 12 puede ser fusionada a una cadena ligera de inmunoglobulina 48 asociada con una cadena pesada de inmunoglobulina 46 fusionada a una segunda citosina 14. Las citosinas 12 y 14 pueden ser fusionadas a los términos N (Figura 3E) o a los términos C (Figura 3F) de las cadenas de inmunoglobulina. Alternativamente, como en la Figura 3G, la primera citosina 12 puede ser fusionada al término N de la cadena ligera de inmunoglobulina de 48 mientras que la segunda citosina 14 es fusionada al término C de la cadena pesada de inmunoglobulina 46.

Fusiones a anticuerpos de cadena individual Algunas veces es conveniente expresar anticuerpos como moléculas de cadena individual. La invención también proporciona proteínas de fusión en donde dos o más citosinas son fusionadas a Esto presenta -la. ventaja de reducir el número de las construcciones de ADN utilizadas cuando se expresa la proteína de fusión deseada, que puede ser especialmente útiles en terapia de gen. En particular, si las citosinas son moléculas de cadena individual, entonces la fusión de las citosinas al anticuerpo de cadena individual permitirá la expresión de la proteína de fusión como una proteína de cadena individual. Como se muestra las Figuras 4A-4C, en algunas modalidades, '.i.?.Í.-.it¿.é-í tfa?*_i .ja *t-Á?& l - las citosinas pueden ser fusionadas al anticuerpo de cadena individual es un término N, su término C, o en ambos términos. Por ejemplo, como se muestran la Figura 4A, la proteína de fusión 44 puede ser fusionada al término C del anticuerpo de cadena individual 50 teniendo una región de cadena variables ligera 52 y una región variable de cadena pesada 54. Como se muestra la Figura 4B, la proteína de fusión 44 también puede ser fusionada al término N de cadena individual 50. En la modalidad mostrado en la Figura 4C, una primera citosina 12 es fusionada al término N del anticuerpo de cadena individual 50, y una segunda citosina 14 esta fusionada al término C el anticuerpo de cadena individual 50. Una modalidad preferida comprende una fusión de IL-12 y una segunda citosina al anticuerpo de cadena individual. Una modalidad muy preferida comprende IL-12 o GM-CSF como las segunda citosina. Las regiones constantes anticuerpos tienen el potencial de mediar una variedad de funciones efectoras. Por ejemplo, IgG 1 median a sJi.u xúó.r„d.e. ©mple ex?tof ADCC^Ia unión al receptor Fc. La posición en la cual la citosina es fusionada puede alterar la función efectora de la región constante del anticuerpo, la cual es útil si se deséala modulación de estas funciones efectoras. En algunos casos, puede ser deseable construir una fusión de una o más cítosinas para una porción con la región de activación de un anticuerpo, pero sin las regiones constantes. Dicha proteína de fusión es más pequeña que una fusión de un anticuerpo completo a Í?.& á-.i,ju-«-.»t .A- A-8-J « .^...^ 'i- ^.. i dos o más citosinas, la cual puede ser ventajoso para ciertos propósitos. Además, dicha proteína de fusión carecerá de una o más de las funciones efectoras de un anticuerpo intacto, pero retendrá la capacidad de activación de un anticuerpo. La invención, por lo tanto, modaliza proteínas de fusión en donde dos o más citosinas son fusionadas a una región Fv de cadena individual. Como se muestran las modalidades ilustradas en las Figuras 5A-5C, dos citosinas pueden ser fusionadas al término N o al término C de la región Fv, o una citosína a cada término. Por ejemplo, como se muestran las Figuras 5A, una proteína de fusión 44 de la invención puede ser fusionada al término C de una región Fv de cadena individual conteniendo una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina 52 y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina 54. Una proteína de fusión 44 también puede ser fusionada al término N de una región Fv como se muestra en la Figura 5B. Como se muestran en la Figura 5C, una primera citosina 12 puede ser fusionada al término N de una región Fv, y una segunda Gitosiría-lá^p-uede ser.lusionada al término C de la,*x.-eg,ión Fv.

Anticuerpos como vehículos heterodiméricos para múltiples citosinas En algunas circunstancias, es deseable construir una fusión de dos o más citosinas en donde, para las dos citosinas, el mismo extremo de la proteína es esencial para actividad. Por ejemplo, puede ser que el término N de existencia natural de dos diferentes -.,í i . I. jt.l. citosinas se esencial para actividad de cada citosma. No es posible construir una proteína de fusión de cadena de polipéptido individual, en donde ambas porciones de citosína puede ser activas. Los anticuerpos son proteínas heterodimérica que consisten de cadenas pesadas y ligeras están covalentemente unidos a través de enlaces de disulfuros. Si se desea construir una proteína de fusión de citosina múltiple con dos porciones de citosina que ambas se requieran de un término N no fusionado, intacto, se prefiere fusionar en forma separada las dos citosinas a los términos N de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo (Figura 3E). Similarmente, si se desea construir una proteína de fusión de citosina múltiple con dos porciones de citosina que ambas requieren de un término C, no fusionada, intacto, es preferible fusionar en forma separada las dos citosinas a los términos C de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo (Figura 3F). Si el anticuerpo se utiliza solamente como un vehículo para conectar dos citosinas de ésta manera, puede ser útil mutar o eliminar aquellas porciones del anticuerpo que confieran propiedades** adicionales re La carnadas co .- función inmuiae. Por ejemplo, se prefiere utilizar una región Fab como un vehículo, ya que la región Fab tiene la característica de heterodimerización de un anticuerpo, pero carece de las funciones características de la región Fc. También puede ser útil usar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo en donde el sitio de combinación de antígeno es no funcional. Las fusiones de múltiples citosinas a anticuerpos combinan t-j..... .... ...t..^i-^AA., muchos de los aspectos novedosos de la invención. En funciones de anticuerpo-citosinas múltiples, la vida media en el suero de las citosinas se iguala y se extiende; la actividad de ambas citosinas es localizada en un objetivo y los efectos especialmente tóxicos debido a la administración sistémica de múltiples citosinas de acción sinergística son editados; cada citosina es efectivamente dimerizada o multimerizada; y la citosinas no necesitan ser directamente fusionadas, pero puede ser fusionadas a diferentes sitios sobre las cadenas pesadas y ligeras de la molécula de anticuerpo. Para diseñar una proteína de fusión comprendiendo múltiples citosinas y un anticuerpo, existe un número de opciones y configuraciones que pueden ser distinguidas a través de experimentación por rutina. También son útiles consideraciones de biología estructural. Por ejemplo, muchas citosinas caen en una clase denominada grupos de cuatro hélices. Estas estructuras consisten de cuatro hélices alfa y tienen el término N y el término C en la misma cercanía. En general, la cara de una citosina alrededor receptor d? citosina, de manera que cualquiera de los términos puede ser utilizado para la fusión a y un anticuerpo a una segunda citosína. Sin embargo, algunas veces es difícil directamente fusionar en tanto término N como el término C de una citosina de grupos de cuatro hélices en diferentes porciones, por razones estéricas. Cuando se desea fusionar dos diferentes citosinas de grupos de cuatro hélices a un anticuerpo, por lo tanto, es útil fusionar la citosina a un sitio diferente del anticuerpo. Alternativamente, si es necesario construir una cadena de polipéptido de la forma de cadena Ig-cítosina- citosina, se pueden utilizar uno o más enlazadores flexibles para superar los problemas estéricos. En lugar de un anticuerpo, también es posible utilizar otras moléculas heterodimérica secretadas para llevar múltiples citosinas. Por ejemplo, un complejo que incluye una antígeno específico en próstata y el inhibidor de proteasa con el cual forma un complejo, la cadena pesada de IgA y la cadena J, los miembros de la familia TGF- 10 beta, y sus patrones de unión de tipo astacina, o IL-12, puede ser utilizados. Ácidos nucleicos La invención además modaliza ácidos nucleicos capaces de 15 expresar cada uno de los tipos anteriores de proteínas. Estos incluyen ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión que comprenden dos o más citosinas, fusiones que comprenden dos o más^ciio-sinas y un dominio de dimerización tal como una región EJC, ¡fusiones que comprenden dos o más citosinas fusionadas a un 20 ¡anticuerpo, y dos o más citosinas fusionadas a una región Fv. Las [formas preferidas en los ácidos nucleicos con vectores de ADN a partir de los cuales las proteínas de fusión pueden ser expresadas ya sea en bacterias o células de mamíferos. Para proteínas de fusión que comprenden múltiples cadenas de polipéptido, más de un ácido 25 nucleico de codificación puede ser utilizado. Alternativamente, puede '?f ,- t.i. i -pÉan«.fc; ser útil colocar dos o más secuencias de codificación de proteína de fusión sobre una molécula de ácido nucleico individual. Los ejemplos ilustran formas particulares de los ácidos nucleicos caracterizados que codifican múltiples citosinas. Los ácidos nucleicos de la invención son particularmente útiles para la expresión de múltiples proteínas de fusión de citosina, ya sea para la producción de estas proteínas o para propósitos de terapia de gen. Los métodos para sintetizar modalidades útiles de la invención, así como ensayos útiles para probar sus actividades farmacológicas, se describen en los ejemplos. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento y prevención de una amplia variedad enfermedades, incluyendo, pero no limitándose al tratamiento de varias infecciones y de cáncer, y vacunación contra varías enfermedades. Se pueden utilizar proteínas de fusión de citosina múltiples para tratar infecciones. bacterianas, de parásito, fúngicas o virales, o cáncer. Por ejemplo, se sabe que IL-12 tiene un efecto protector en muchos tipos de infecciones, incluyendo, pero no limitándose a infecciones con la bacteria Listeria monocytogenes; los parásitos Toxoplasma gondii, Leishmania major, y Schistosoma mansoni; y el hongo Candida albicans; y el virus de coriomeningitis de virus y citomegalovirus. Ya que la citosina generalmente actúan en combinación, por lo regular es útil utilizar proteínas de fusión que i A ¿.? . . .. ^_ a. .toa ci.& . comprenden dos o más citosinas que se sepa que actúan sinergísticamente. Por ejemplo, ya que I L-2 potencia los efectos de IL-12, es útil combinar esta citosinas en el tratamiento de enfermedades bacterianas, de parásito, fúngicas y virales. Un método preferido de tratamiento de enfermedad infecciosa es utilizar múltiples proteínas de fusión de citosina que además se fusionen a un agente de activación que coloque las múltiples citosinas en el sitio de infección. A continuación se describen varias estrategias de oxidación. Las composiciones farmacéuticas de la invención puede ser utilizadas en la forma de formas de dosis sólidas, semísólidas o líquidas, tales como por ejemplo, pildoras, cápsulas, polvos, líquidas, suspensiones, o similares, preferiblemente en formas de dosis unitaria adecuadas para la administración de dosis precisas. Las composiciones incluirán un vehículo o excipiente farmacéutico y además, pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, auxiliares, portadores, etc. Dichos excipientes pueden incluir otras^roteínas, tales- como por ejemplo?- lbúmina de suero humano o proteínas de plasma. Los métodos actuales para preparar dichas formas de dosis son conocidos o serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. La composición con formulación que será administrada, en cualquier caso, contendrá una cantidad del componente(s) activo(s) en una cantidad efectiva para lograr el efecto deseado en el sujeto que se va a tratar. La administración de las composiciones de la presente puede ser través de cualquiera de los modos aceptados administración para agentes que reciben dicha actividad. Estos métodos incluyen administración oral, parenteral o tópica y de otra manera formas sistémicas. La inyección es un método preferido de administración. 5 La cantidad del compuesto activo administrado, por supuesto, dependerá del sujeto que se está tratando, la severidad del padecimiento, la manera de administración, y el juicio del médico que atiende. Como se describió anteriormente, la citosinas tales como IL-2, 10 y tienen-12, GM-CSF, IL-4 y otras han sido investigadas para el tratamiento de cáncer. Bajo algunas circunstancias, es ventajoso utilizar una proteína de fusión de citosina múltiples en el tratamiento de cáncer, por razones administración más simple, vida media incrementada en el suero de una de las citosinas de componente, y/o 15 modulación superior de las actividades relativas de las dos citosinas. Un método preferido de tratamiento de cáncer es dirigir las citosinas hacia un órgano particular o tejido, de manera que el efecto - - de las -e-itosinas pued«~ ser concentrado y se pueden «evitar -los efectos laterales de la distribución sistémica. Por ejemplo, se espera 20 que las fusiones de múltiples citosinas a una región Fc se concentren en hígado, lo cual puede ser útil en el tratamiento de cáncer limitado al hígado. Un método muy preferido es utilizar una proteína de fusión de citosina múltiple que además es fusionadas hacia un agente de activación tal como anticuerpo. En particular, los 25 anticuerpos KS-1/4 y 14.8 son dirigidos contra antígenos específicos de tumor (Varkí NM y otros, Cáncer Res

[1984] 44:681-7' Gillies y otros, Journal Of Immunological Methods 125:191

[1989], patentes de E.U.A. Nos. 4,975,369 y 5,650,150). Cuando se utiliza un anticuerpo- fusión de citosina múltiple por lo regular es útil investigar el tipo de tumor, y seleccionar un anticuerpo dirigido contra un antígeno que probablemente estará presente sobre este tipo de tumor. Por ejemplo, puede ser útil caracterizar el tumor a través de análisis FACS, tinción Western, examen del ADN del tumor, o simplemente identificando el tipo de célula tumoral. Dichos métodos de caracterización de tumor son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica de caracterización de tumor, tales como oncólogos y biólogos de tumores. También es posible activar múltiples proteínas de fusión de citosina a través de una variedad de otros medios, tal como la fusión a ligandos específicos o porciones de receptor, la fusión a aptámeros de péptido con actividades de unión preseleccionadas, conjugación química a pequeñas moléculas, con características de localización, etc. Estos métodos de activación -- también .-pueden ser , sados para *el tratamiento . «- , otras enfermedades, tales como infecciosas.

Tratamiento de cáncer y otros trastornos celulares a través de terapia de gen los ácidos nucleicos del invención pueden ser utilizados como agentes de terapia de gen para tratamiento de cáncer y otras enfermedades, en donde es deseable dirigir el sistema inmune hacia há=? _, . un tipo de célula específico. Por ejemplo, las células cancerosas son retirados de un ser humano o animal, uno o más ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión de citosina múltiple son transfectados hacen las células cancerosas, y las células cancerosas 5 después se volverá introducir en el ser humano o animal. Alternativamente, el ADN puede ser introducidos en las células cancerosas in situ. El ser humano o animal después monta una respuesta inmune en las células cancerosas, que puede curar o reducir la severidad del cáncer. Una fusión de gen de citosína 10 múltiple, acoplada a elementos reguladores apropiados para promover la expresión de células de mamífero puede ser transfectada a las células cancerosas a través de cualquiera de una variedad de técnicas, incluyendo en métodos de fosfato de calcio, una "pistola de gen", vectores de adenovirus, liposomas catiónicos, 15 vectores retrovirales o cualquier otro método de transfección eficiente. El ácido nucleico puede codificar una proteína de fusión de citosina múltiple que además está fusionado a otras porciones. La terapia de gen contra cáncer con ufi ácido nuclei&a expresa una fusión de más de una citosina fusionadas, puede ser combinada 20 con otros tratamientos para cáncer, tales como tratamiento se pueden incrementar las propiedades inmune-estimulantes de la proteína de citosina fusionada. Por ejemplo, el ácido nucleico de la invención también puede expresar otras porciones de proteína que pueden ayudar en el desarrollo de una respuesta inmune a antígenos 25 expresados por las células de cáncer, o puede ser co-transfectado jia-É ^¿?tmeu?a** .* t con otros ácidos nucleicos que expresan porciones de proteína. En particular, los ácidos nucleicos que expresan la proteína de superficie co-estimulante B7 pueden ser co-transfectadas a las células cancerosas [Robinson y otros, patente de E.U.A. No, 5,738,852]. La transfección de células cancerosas con un ácido nucleico que expresa fusión de citosina múltiple también pueden verse acompañada por el tratamiento con un anticuerpo o inmunocitosina que activar la células cancerosas [Lode y otros, (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. 95:2475]. La transfección de células cancerosas con un ácido nucleico expresando una fusión de citosina múltiple también puede verse acompañada por el tratamiento con bloqueador angiogénesis [Lode y otros (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. 9:1591]. También se pueden combinar terapias utilizando estimulantes inmunes adicionales y/o bloqueadores de angiogénesis con el tratamiento sistémico con proteínas de fusión de citosina múltiple.

Una ventaja de co-tratamiento con estimulantes inmunes adicionales -<• de bloqueadores de angiogénesis es d-e estos tratamientos ~a diferencia de los agentes de daño de ADN y bloqueadores del ciclo celular, no aniquilan células inmunes se pueden ser divididas debido a la estimulación por la proteína de fusión de citosina múltiple. Una modalidad preferida de este método de terapia de gen es introducir uno o más ácidos nucleicos que codifican IL-12 y una segunda citosina en células cancerosas, y después volver a introducir las células cancerosas en el ser humano o animal. La segunda citosina preferiblemente es I L-2 o GM-CSF. La presente invención proporciona composiciones novedosas de vacuna y métodos de auxilio de vacunas destinadas a proporcionar una respuesta inmune mediada por célula protectora en mamíferos huésped vacunados contra ciertos patógenos, utilizando como un auxiliar dos o más citosinas que han sido fusionadas. Por ejemplo si se desea una respuesta inmune de Th1, se pueden fusionar múltiples citosinas promotoras de Th1 y la proteína de fusión resultante administrada en un mamífero en combinación con un antígeno. En particular, IL-12 y I L-2 pueden ser fusionadas y administradas con un antígeno. Alternativamente, IL-12 y I L-2 además pueden ser fusionadas a una misma proteína antigénica y utilizarse para estimular una respuesta inmune. En este caso, la invención está dirigida a vacunas que se basan en la inmunidad mediada por la célula huésped, es decir, la producción de linfocitos T citotóxicos y fagocitos activados para proporcionar protección contra infecciones por un patógeno particular. Es especialmente útil realizar vacunas con proteínas de fusión comprendiendo IL-12, I L-2 y en antígeno, ya que esta combinación dirige una respuesta de Th1 contra el antígeno. Los auxiliares convencionales utilizados en seres humanos, tales como alumbre, tienden a inducir una respuesta de Th2. Si se desea una respuesta inmune de Th2, se pueden utilizar combinaciones fusionadas de citosinas promotoras de Th2. Por i íí ejemplo, puede ser útil fusionar IL-4 e IL-10 para formar una sola molécula, y la proteína de fusión resultante utilizada como un auxiliar. En particular, si se desea reclutar células dendríticas en un animal, las combinaciones fusionadas de IL-4 y GM-CSF pueden ser fusionadas adicionalmente ya sea con una región Fc para promover la unión a células de presentación de antígeno, o fusionarse adicionalmente a un anticuerpo capaz de dirigir las citosinas fusionadas hacia un tejido objetivo, tal como un tumor. La presente invención también proporciona composiciones terapéuticas novedosas y métodos para auxiliar a proporcionar un efecto sinergístico con ciertas composiciones terapéuticas, incluyendo las así llamadas "vacunas contra cáncer", las cuales pueden incluir un antígeno seleccionado que ocurre en una célula cancerosa. Por ejemplo, una proteína comprendiendo dos o más cítosinas fusionadas puede ser administrada directamente a través e una ruta apropiada junto con células cancerosas apropiadamente tratadas.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Construcción de fusiones de gen capaces de expresar proteínas de fusión de citosina-citosina Para crear proteínas multífuncionales teniendo una pluralidad de citosinas, se sintetizaron fusiones de gen entre p40 de IL-12 e IL-2, y entre p40 de IL-12 y GM-CSF. Además, la secuencia de ?A-v t 9 ^ fcj codificación para p35 de murino maduro (SEC ID NO:1) se fusionó a una secuencia promotora líder que permite altos niveles de expresión y secreción eficiente. La secuencia de codificación de p40- IL-2 y p40-GM-CSF de murino se muestran en SEC ID NO:2 y SEC ID NO:3, respectivamente. También se construyó la fusión de p40-IL-2 humana (SEC ID NO:4). Las fusiones de una región Fc de ratón de lgG2a al p35 del ratón (SEC ID NO:5) y el p35 humano a una región Fc humana de IgG 1 (SEC ID NO:6) fueron construidas, utilizando plásmidos de expresión previamente descritos (Lo y otros, Protein Engineering 11:495-500

[1998]; Lo y otros, patente de E.U.A. No, 5,726,087). La fusión de p35 de ratón y ser humano maduro al término C de la cadena pesada del anticuerpo KS-1/4 se describe por Gillies y otros (J. Immunology

[1998] 160:6195-6203). Las fusiones de p35 de ratón y humano al término C de la cadena pesada de anticuerpo 14.18 se construyeron en una forma análoga (publicación de PCT internacional WO99/29732). E tipo de estrategia discutida aqwí para transportarlo p4ß a- IL- 2 y a GM-CSF es generalmente aplicable a la fusión de dos o más citosinas. Específicamente la secuencia de codificación de la porción N mayor comprende una secuencia de señal para la secreción, mientras que las porciones C terminales no requieren una secuencia de señal. En algunos casos puede ser deseable colocar una secuencia de codificación para un enlazador de péptido corto preferiblemente con una longitud de 10-15 aminoácidos y rico en á'?.s ¡? ¿ . .. iJ ^ *6ajá 2 l-íi glicina y serina entre las secuencias de codificación para las dos citosinas. Las manipulaciones de ADN involucradas en la generación de todos estos tipos de fusiones están dentro del nivel del experto en la técnica. Por ejemplo, los detalles de la construcción de una fusión entre la subunidad de p40 de IL-12 de murino e I L-2 de murino, fueron los siguientes. Para ADNc de longitud completa de la subunidad p40 de la IL-12 de murino se clonó a través de PCR a partir de células de bazo de ratón activadas con concavalina A (5 µg/ml en un medio de cultivo durante 3 días). El iniciador anterior tuvo la secuencia AA GCT AGC ACC ATG TGT CCT CAG AAG CTA ACC (SEC ID NO:7), en donde un sitio GCTAGC de Nhel (residuos 3-8 de SEC ID NO:7) se colocó corriente arriba del codón de iniciación de traducción, ATG y el iniciador inverso tuvo la secuencia CTC GAG CTA GGA TCG GAC CCT GCA GGG (SEC ID NO:8), en donde un sitio CTCGAG de Xhol (residuos 1-6 de SEC ID NO:8) se colocó inmediatamente corriente abajo del codón de detención de traducción TAG (anticodón CTA). Después de la verificación de secuencia., el fragmento^ JSIheL-Xhol conteniendo el ADNc de mu-p40 con su líder nativo se ligó al vector de expresión digerido mediante Xbal-Xhol Pécs [Lo y otros (1998) Protein Engineering 11:495-500]. Los sitios de restricción Nhel y Xbal, tiene extremos adherentes compatibles, y se utilizó el sitio Nhel para la clonación de mu-p40 ya que mu-p40 tiene un sitio interno Xbal. Para la construcción de ADN que codifica mu-p40-mulL-2, se i .1 H....-..Í — .«-»->*- •*" - >**'- i utilizó un enlazador de ollgonucleótido para unir el ADN de mu-p40 a través de su sitio Pstl (C TGC AG) a un fragmento de Smal-Xhol conteniendo de ANDc de la IL-12 de murino maduro. La secuencia de ADN en la unión de la proteína de fusión fue de C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGT AAA GCA CCC (SEC ID NO:9), en donde C TGC AG (residuos 1-6 de SEC ID NO:9) es el sitio Pstl, C CCG GG (residuos 15-20 de SEC ID NO:9) es el sitio Smal, TCC es el resido del término aminoácido C-terminal de p40 de murino, y GCA es el residuo N-terminal de I L-2 de murino madura. El ADN que codifica mulL-12-muGMCSF de cadena individual se derivó de la construcción de ADN que codifica mulL12-mulL2 de cadena individual anterior, reemplazando el ADNc de mulL2 por el ADNc de muGMCSF en el sitio Smal. La secuencia de ADN en la unión de mulL-12 y muGMCSF de cadena individual fue C TGC AGG TCC CCG GGA AAA GCA (SEC ID NO:10), en donde C TGC AG (residuos 1-6 de SEC ID NO:10) es el sitio Pstl, C CCG GG (residuos 17-22 de SEC ID NO:10) es el sitio Smal, TCC es el residuo de aminoá-cido C-terminal de p40 de m-urino, y GCA -es ei residuo N- terminal de GMCSF de murino maduro.

Ejemplo 2: Expresión de proteínas de fusión de IL-12 Las proteínas de I - 12-1 L-2 se expresaron como sigue. Diferentes combinaciones de los vectores individuales que codifican fusiones p40 y vectores que codifican proteínas que comprenden p35 fueron co-transfectadas en 293 células de carcinoma epidérmico **&¡á ' . i*- iLÍa i¿, ¿r mi- A. i i- > humano para una expresión pasajera de proteínas de fusión. El ADN se purificó utilizando equipos de preparación (Wizard Promega Inc.), etanol precipitado para la esterilización y resuspendido en agua estéril. 5 Para la expresión de heterodímeros de proteína de fusión IL- 12 biológicamente activos, diferentes combinaciones de los vectores individuales que codifican formas de fusión y no fusión de las subunidades fueron expresadas en forma pasajera a través de la co- transfección de 293 células de carcinoma epidérmico humanas. El 10 ADN se purificó utilizando equipos de preparación (Wizard, Promega Ine) etanol precipitado para la esterilización y resuspendido en agua estéril. Se prepararon precipitados de fosfato de calcio a través de métodos estándares utilizando 10 µg de ADN por ml (5 µg de cada uno cuando se co-transfectaron dos plásmidos) y se agregaron 0.5 15 ml/placa a los cultivos de 293 células en crecimiento en placas de 60 mm a aproximadamente 60% de confluencia (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a. Ed. Sambrook, Fritsch y Maniatis, ,-*-.., eds. Cold. Spring Harbox. Laboratory Press, 1989). D-espués de 16 horas, el medio conteniendo el precipitado fue removido y 20 reemplazado con un medio fresco. Después de 3 días, el sobrenadante se removió y se analizó para la producción de expresión de gen transfectado y a través de ELISA, determinación biológica de la actividad IL-12 o inmunoprecipitación y análisis sobre geles de SDS de proteínas radioactivamente marcadas. Para la 25 marcación, se utilizó un medio sin metíonina para reemplazar el i?JkA il . » .?. A»>_ medio de crecimiento al segundo día de cultivo y se agregó 35S- metionina (100 µCi/ml). Después de una incubación de 16 horas adicionales, el medio se cosechó, se aclaró a través de centrifugación (5 minutos a 13,000 rpm en una microcentrífuga 5 superior de mesa) y se incubó con perlas de Sepharose de proteína A (10 µl de volumen de perla por ml de sobrenadante de cultivo). Después de una hora a temperatura ambiente las perlas se lavaron a través de centrifugación repetida y se volvieron a suspender en regulador de pH de PBS conteniendo 1% de Nonidet-P40 (NP-40). La 10 pella final se volvió a suspender en regulador de pH y gel conteniendo SDS y se hizo hervir durante 2 minutos. Después de remover las perlas a través de centrifugación, el sobrenadante se dividió en dos alícuotas. De agregó un agente de reducción (5% de 2-mercaptoetanol) a una muestra y ambas muestras se hicieron 15 hervir durante 5 minutos antes de cargarse en un gel de poliacrilamida de SDS. Después de electroforesis, el gel fue expuesto a una película de rayos X (autoradiografía). _-«, - Se .. realizaron transfecciones . utilizando los- siguientes plásmidos de expresión: mu.p35 más mu.p40-IL-2, KS-1/4-mu.35 más 20 mu.p40, KSS-1/4-mu.p35 más mu-p40-IL-2, 14.18-mu.p35 más mu.p40-IL-2, hu.Fc-.p35 más hu.p40-IL-2, KS-1/4-hu.p35 más hu.p40-IL-2, y 14.18-hu,p35 más hu.p40-IL-2, en donde "mu" se refiere a proteínas de murino, y "hu" a proteínas humanas. Cuando las células fueron metabólicamente marcadas con 35S- 25 metionina y las proteínas secretadas fueron examinadas reduciendo , ~^~ ^ . la electroforesís de gel de SDS y autoradiografía, se observó, en cada caso, un alto nivel de expresión. Los pesos moleculares de proteínas de fusión reducidas se pronosticaron con base en los pesos moleculares de proteínas de componente, como sigue: p35 de 5 IL_12, 35 kD; p40 de IL-12, 40 kD; IL-6, 16 kD; Fc, 32 kD; cadena pesada de Ig, 55 kD; y cadena ligera de Ig, 29 kD. Se observó la migración de proteínas con aproximadamente los pesos moleculares pronosticados. Las líneas de célula establemente transfectadas que expresan 10 múltiples proteínas de fusión de citosina también fueron aisladas. En el caso de construcciones heterodiméricas, la proteína de fusión IL- 12 p40-IL-2 o IL-12 p40-GM-CSF que codifica vectores de expresión como se describió anteriormente solo para subunidad p40 de IL-12 (Gillies y otros,

[1998] J. Immunol. 160:6195-62030). Las líneas de 15 célula transfectada que expresan las proteínas de fusión p40 fueron transfectadas una segunda vez con vectores de expresión que codifican ya sea la subunidad p35 de IL-12, una proteína de fusión • .ir» .Fc-p35 o un vector de^ expresión de . proteína de -fusión de anticuerpo-p35 como se desea (Gillies y otros,

[1998] J. Immunol. 20 160:6195-62030). El sobrenadante de las células establemente transfectadas expresando Fc-IL-12-IL-2 humano (es decir, expresando KS-p35 y p40-IL-2) se recogió y los productos se purificaron uniéndose y mediante la elusión de la Sepharose de proteína A de acuerdo con 25 los procedimientos del fabricante (Repligen, Needham, MA). Las proteínas puras fueron analizadas a través de ELISA para el contenido de IL-12 e I L-2. Los resultados mostraron que los contenidos de citosina individual fueron aproximadamente 4 veces diferentes por masa, que se correlaciona con la diferencia de 4 doblamientos en el peso molecular entre IL-12 y I L-2. Similarmente, el ensayo de los productos de células transfectadas expresando KS- IL-12-IL-2 humana a través de ELISA para que los niveles de IL-12 e I L-2 tengan valores similares de IL-12 e I L-2. De esta manera, con la exactitud de las pruebas de ELISA los valores medidos indican que IL-12 e I L-2 han sido producidos en una relación molar de aproximadamente 1:1. Los mismos resultados de obtuvieron con las proteínas de fusión IL-12-GM-CSF hechas ya sea con la Fc o el anticuerpo completo.

Ejemplo 3: Actividad sinergistica de proteínas de fusión en un ensayo de inducción de IFN-? La actividad biológica de proteínas de fusión de IL-12-IL-2 fue medida en un ensayo de inducción de IFN-? utilizando -células mononucleares de sangre periférica humanas tanto en reposo como activadas por mitógeno (PBMCs) de voluntarios seres humanos (Figura 6). Se midió la producción de IFN-? a través de ELISA. Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) se obtuvieron de voluntarios saludables y se purificaron a través de centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia) (1700 rpm durante 20 minutos). La cubierta amarilla conteniendo la I? í _ PBMC se diluyó con un medio de cultivo libre de suero (SF-RPMI) a un volumen de 50 ml y se recogió a través de centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos. Después de centrifugación del gradiente, las células se volvieron a suspender en un medio de cultivo de célula conteniendo 10% de suero de bovino fetal (RMPI-10) con o sin fitohemaglutinina (PHA; 10 µg/ml) a una densidad de 5 x 106 células/ ml y se cultivaron durante 3 días a 37°C en un incubador de CO2 humedecido. Las células se recogieron a través de filtración, se lavaron 3 veces con un volumen igual de SF-RPMI y se volvieron a suspender en RPMI-10 fresco (1 x 10a células/ml). Se surtieron alícuotas (100 µl) a las cavidades de placas múltiples de 96 cavidades para proporcionar un número final de célula de 105 por cavidad. Las muestras de prueba del medio de cultivo fueron diluidas en serie en un medio de cultivo fresco y se agregaron a las cavidades de la placa de 96 cavidades. Las cavidades de control recibieron IL-12 (Figura 6A) o una mezcla equimolar de I L-2 e IL-12 comercial (Figura 6B; las citosinas se compraron en R & D Systems). Las placas se incubaron durante 48 horas a 37°C en un incubador de* CO2, en ese momento, se removieron alícuotas (20 µl) para el análisis de la concentración de IFN-? a través de ELISA, siguiendo las instrucciones del fabricante (Endogen, Inc., Woburn, MA EUA). En la Figura 6A, las actividades de la proteína de fusión de IL-12-1 L-2 humana se compararon solo con IL-12. Los resultados ilustran que IL-12 sola indujo IFN-? a niveles moderados, mientras que la proteína de fusión I L- 12- 1 L-2 fuertemente indujo la síntesis , -IÉ2^ j U Í de IFN-?. Ya que I L-2 también se sabe es que insuficiente para la síntesis de IFN-? estos estudios indican que las porciones de IL-12 de I L-2 ambas son funcionales dentro de la proteína de fusión y funcionan sinergísticamente. Después, se compararon las actividades de una proteína de fusión de Fc-IL-12-IL-2, una proteína de fusión KS-IL-12-IL-2, y una mezcla consistiendo de una relación molar de 1:1 de IL-12 a IL-2, para su habilidad para inducir IFN-?. Los resultados de la Figura 6B indican que la proteína de fusión de Fc-IL-12-IL.2 y al proteína de fusión KS-IL-12-IL-2 tiene aproximadamente la misma actividad como una mezcla equimolar de IL-12 e I L-2. Los mismos resultados de obtuvieron cuando las formas de ratón de I L-2 e IL-12, construidas en la forma descrita en el ejemplo 1 para formas humanas, se utilizaron para la construcción de proteínas de fusión.

Ejemplo 4: Bioactividad de I L-2 e IL-12 de proteínas de fusión de IL-12-IL-2 Las actividades "de I L-2 e IL-12 en las proteínas de fusión* íTe^ compararon con las citosinas libres en ensayos basados en proliferación. La actividad de una molécula de 14.18-IL-12-IL-2 de anticuerpo de murino fue probada en un ensayo de proliferación típico de IL-12. Las células PBMCs humanas se obtuvieron de voluntarios y se cultivaron con 5 microgramos/ml de fitohemaglutinina-P durante 3 días, se lavaron con HBSS, de Hank, y se colocaron en placas de mícrotitulación a 105 células por cavidad, , i É, de acuerdo con un procedimiento estándar (Gately, M. K., Chizzonite, R., y Presky, D.H. Current Protocols in Immunology

[1995] pp. 6.16.1-6.16.15). Las células se incubaron en presencia de varias proteínas de prueba durante 48 horas, se agregaron 0.3 microCuries de 3H-timidina 10 horas antes de determinar los niveles de incorporación radioactiva. La IL-12 y una mezcla equimolar de IL- 12 e I L-2 estimularon la incorporación de 3H-timidina en las células en una forma dependiente de dosis, y la proteína de fusión 14.18-IL- 12-IL-2 fue aproximadamente igual de efectiva para estimular la incorporación de 14.18-IL-12-IL-2. La IL-12 estimuló la incorporación de 3H-timidina solamente a concentraciones molares más altas, indicando que la incorporación observada de 3H-timidina estimulada mediante la proteína de fusión 14,18-IL-12-IL-2 se debe principalmente a su actividad de IL-12. Los resultados se muestran en la Figura 7. Además, se probó la actividad biológica I L-2 en un ensayo de proliferación de célula diferente, siguiendo un procedimiento estándar (Davis, L.S., Lipsky, P.E., y Bottomly^ K. Current PcotoaoJs in Molecular Immunology

[1995] p. 6.3.1 - 6.3.7). La línea de célula CTLL-2 de ratón depende de I L-2 para la proliferación. La línea de célula de CTLL-2 también puede proliferar en respuesta a IL-4 pero no es sensible a IL-12. La células de CTLL-2 en un crecimiento de fase de registro activo, se lavaron dos veces en un medio carente de I L-2 y se colocaron en placas a aproximadamente 1 x 104 células por cavidad en cavidades de microtitulación en presencia de varias ¿)£¿ ÍA.-A.-j J i . _. t„ «. *. i-, v. -• cantidades de I L-2 de murino comercial, proteína de fusión 14.18-1 L-12- 1 L-2 de murino, o IL-12 de murino comercial, y se dejaron desarrollar durante 48 horas. Al término del periodo de crecimiento, el número de células viables fue cuantifícado utilizando el ensayo MTT-MTS. La Figura 8 muestra un experimento en donde se variaron los niveles de la proteína de fusión de I L-2 , IL-12 o 14.18-IL-12-IL-2. Los resultados indican que la I L-2 de murino y la proteína de fusión de 14.18-IL-12-IL-2 de murino son aproximadamente igual de potentes para estimular la proliferación, aunque el aumento de las cantidades de IL-12 de murino no ocasionó ninguna estimulación detectable de la proliferación de células. Este resultado indica que la estimulación de la proliferación de células de CTLL-2 a través de la proteína de fusión de 14.18-IL-12-IL-2 se debió a la porción de IL-2 y no a la porción de IL-12.

Ejemplo 5: Construcción y expresión de proteínas de fusión de IL-12-IL-2 de cadena individual y cadena múltiple con y sin porciones de anticuerpo . . . _,.,. . s..- Se construyó como sigue una proteína de fusión de IL-12-IL-2 de murino de cadena individual. Se construyó una fusión de secuencia de codificación de p40-IL-2 a través de métodos análogos a aquellos utilizados en la construcción de la fusión de p40-IL-2 humano en el ejemplo 1. Para conectar los ADNs que codifican las subunidades p35 y p40 de IL-12 y generar una sola secuencia de codificación, se sintetizó un ADN que codifica un enlazador con un ^ i. *t -»u -,.-&¿ >-fc -- » - i&iS, ,.sFa& í ti sitio Xhol en el extremo 5' y un sitio BamHl en el extremo 3'. El extremo 5' de la secuencia de codificación p40-IL-2 maduro se modificó para introducir un sitio de restricción, y después se ligó al extremo 3' del enlazador. El extremo 3' de la secuencia de 5 codificación p35 se modificó para generar un sitio de restricción y se ligó al sitio Xhol del enlazador. Los ADNcs que codifican mulL12 y mu-p40-mulL2, de cadena individual, descritos en el ejemplo 1, se combinaron utilizando un sitio de restricción conveniente en p40, para proporcionar una tercera construcción de ADN que codifica 10 mulL-12-mulL-2 de cadena individual. Estos pasos se realizaron utilizando varios vectores y aislamiento de fragmento de ADN según fue necesario. La secuencia del enlazador de p35 de murino-región de codificación de p-40-IL-2 es SEC ID NO:11. Al mismo tiempo, se construyó, a través de métodos 15 correspondientes una secuencia de codificación de IL-12 de murino de cadena individual correspondiente. La secuencia de codificación es SEC ID NO:12. Además, se construyó adicionalmente una s e c u en cia^ .di© ADN. que codifica una región lgG2a Fc de murino fusionada al término N 20 p35 enlazador-p40-IL-2. La secuencia de codificación es SEC ID NO:13. Se transfectaron 293 células cultivadas con plásmidos de expresión que codifican las proteínas Fc-IL-12-IL-2 y Fc-IL-12 de cadena individual de murino. La expresión de las proteínas de fusión 25 se analizó como se describe en el ejemplo 2. Las proteínas de fusión - -t-rtll-m-fif-i-flí i Fc se purificaron a través de su unión a la proteína A de Sepharose, y se observaron altos niveles de la expresión de Fc-IL-12-IL-2 y Fc-IL-12. Las proteínas fueron sintetizadas intactas, según inferido por los pesos moleculares aparentes a partir de la migración sobre geles de SDS: Fc-IL-12-IL-2, 123 kD; y Fc-IL-12, 107 kD. La proteína de fusión KS-sclL12-IL2 descrita en el ejemplo 1 es un tetrámero con dos diferentes cadenas de polipéptido: la cadena ligera KS-1/4 y la cadena pesada KS-1/4 con la porción sclL-12-IL2 en el término C. Para investigar qué sitio sobre una molécula de anticuerpo son adecuados para la unión de porciones de citosina, se construyó una segunda proteína de fusión, en donde el anticuerpo KS-1/4, y las porciones IL-12 e I L-2 estuvieron en una configuración distinta de la configuración de KS-IL12-IL2 en el ejemplol. Esta segunda proteína fue tetramérica y consistió de dos diferentes polipéptidos. Un polipéptido consistió de la cadena ligera del anticuerpo KS-1/4, el otro polipéptido consiste de un mulL12 de cadena individual fusionado al término N maduro de la cadena pesada del anticuerpo KS-1.4, seguido por -!L-2 de muri ,~e* .-jel término carboxilo de la cadena pesada. El ADNc que codifica la subunidad p35 de IL-12 de murino se clonó a través de PCR a partir de células de bazo de ratón activadas con concanavalina A (5 µg/ml en un medio de cultivo durante 3 días). El iniciador anterior tiene la secuencia AAGCTT GCTAGCAGC ATG TGT CAÁ TCA CGC TAC (SEC ID NO:14), en donde AAGCTT del sitio Hindlll (residuos 1-6 de SEC ID NO:14) se colocó corriente arriba del codón de iniciación de traducción ATG, y el iniciador inverso tiene la secuencia CTCGAG CTT TCA GGC GGA GCT CAG ATA GCC (SEC ID NO:15), en donde CTCGAG del sitio Xhol (residuos 1-6 de SEC ID NO:15) se colocó corriente abajo del codón de tensión de traducción TGA (anticodón TCA). El ADN que codifica a IL-12 de cadena individual comprende el ADN de mup35 unido a oligonucleótidos que codifican un enlazador rico en residuos de glicina y serina, seguido por ADN de mup40. La construcción resultante tiene la siguiente secuencia en la unión de oligonucleótido: Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly G AGC TCC GCG TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala (SEC ID NO:17) AGC GGC GGG GGG GGA TCC GCC ATG (SEC ID NO:16) en donde G AGC TC (residuos 1-6 de SEC ID NO.16) es un sitio de restricción Sacl justo corriente arriba del codón de detención - de traducción de p35 de murino, GCG codifica eL > e-sidu©-- - e aminoácido C-terminal de p35 de murino, GGA TCC (residuo 50-55 de SEC ID NO:16) es un sitio de restricción de BamHl introducido para facilitar la ligación, y ATG codifica el residuo N-terminal de mu- p40 maduro. El ADN que codifica mulL12-KS de cadena pesada de muGMCSF de cadena individual tiene la siguiente secuencia en la unión de mup40 y el término N maduro de la cadena pesada KS: : , - fe-Sa^J Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly C 7"GC AGG GTC CGA TCC CCG GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser (SEC ID. NO:19) 5 GGA GGT AGC GGC GGA GGG GGC TCC TTA AGC CAG (SEC ID. NO.18) en donde C TGC AG (residuos 1-6 de SEC ID NO:18) es un sitio Pstl justo corriente arriba del codón de detención de traducción de p40 de murino, TCC codifica el residuo de aminoácido C-terminal 10 de p40 de murino, y CAG codifica el residuo N-terminal de la cadena pesada de KS maduro. El ADN resultante que codifica mulL2 de cadena pesada de mulL12-KS de cadena individual después fue coexpresado con la cadena ligera de KS. Para investigar más cual de los extremos de una molécula de 15 anticuerpo está disponible para la generación de uniones de fusión y para investigar como muchos distintos polipéptidos pueden ser ensamblados en una proteína de fusión de citosina múltiple, se expresó y KS-1/4, IL-12, y IL-2, principalmente IL12-KS (cadena ligera) + KS 20 (cadena pesada)-IL2. Esta proteína de fusión es hexamérica y comprende 3 diferentes polípéptidos. Un polipéptido consiste de p35 de murino fusionado a la cadena ligera del anticuerpo KS1/4. Un segundo polipéptido consiste de la cadena pesada del anticuerpo KS1/4 fusionado a IL-2 humana [Gillies y otros, (1992) Proc. Nati. 25 Acad. Sci. 89:1425], y un tercer polipéptido es p40 de murino. **»* ' ' "í ¿JMa^^M1MM| f . ?tíím?? í Á ?a^x . -. - . _~- . ,. - . **. afa-Li-.

Después de la expresión, dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas son disulfuro unido para formar la estructura de antícuerpo-citosina tetramérica. Además, p35 en el término N de la cadena ligera también es disulfuro unido con el p40. El ADN que codifica la cadena ligera de mup35-KS tiene la siguiente secuencia en la unión. Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly G AGT TCC GCG TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser (SEC ID NO. 21) AGC GGC GGG GGC GGA TCC TTA AGC GAG (SEC ID NO: 20) en donde G AGC TC (residuos 1-6 de SEC ID NO.20) es un sitio de restricción de Sacl justo corriente arriba de codón de detención de traducción de p35 de murino, GCG codifica el residuo de aminoácido C-terminal de p35 de murino, GGA TCC (residuos 50-55 de SEC ID NO:20) es un sitio de restricción BamHl introducido para facilitar la ligación, y GAG codifica el residuo de aminoácido N-terminal de la cadena ligera. Para la expresión -de esta proteína- de fusión hexantéti5sa '*se generó una línea de célula expresando p40 de murino a través de transfección con un vector de expresión conteniendo un gen de resistencia a neomicina y selección medíante G418. La línea de célula de expresión de p40 de murino después fue transfectada con un vector de expresión conteniendo unidades de transcripción tanto de cadena ligera como de cadena pesada y un marcador de selección de reductasa de dihidrofolato, el cual permitió la selección a través de metotrexato [Gillies y otros, (1998) J. Immunol. 160:6195], Ejemplo 6: Actividad de proteínas de fusión IL-12-IL-2 de cadena individual de murino Los mismos métodos utilizados en el ejemplo 4 se utilizaron para probar la actividad de IL-12-IL-2 de cadena individual de murino producido a través de expresión pasajera. La cantidad de cada citosina en el sobrenadante de cultivo de célula primero fue determinada a través de ELISA y se utilizó para fijar una curva de dosis-respuesta. Las actividades estrechamente correspondieron a lo que se encontró con las proteínas de fusión de Fc y anticuerpo-IL-12-1 L-2 , y como se describió anteriormente. Específicamente, la actividad de IL-12 de IL-12-IL-2 de cadena individual se de murino y las moléculas de Fc-sclL-12-IL-2 de murino se probaron en el ensayo de proliferación de célula PBMC humana descrito en el ejemplo 4. La IL-12 y una mezcla equimolar de IL-12 e I L-2 estimularon la incorporación de 3H-timidina a las células en una forma* dependiente tie dosis. En una base por" motr tanto* las proteínas de fusión sel L- 12-I L-2 como Fc-sclL-12-IL-2 fueron aproximadamente tan efectivas como IL-12 para estimular la incorporación de 3H-timidina (Figura 9). Como se describió en el ejemplo 4, la IL-12 estimula la incorporación de 3H-timidina solamente a concentraciones molares mucho más altas, indicando que la incorporación observada 3H-timidina de estimulada por las proteínas de fusión sclL-12-IL-2 se debió principalmente a su , ÜA actividad de IL-12. Además, la actividad biológica de la porción I L-2 en las proteínas de fusión sclL-12-IL-2 fue probada en un ensayo basado en célula, y se encontró que es aproximadamente igual como la I L-2 comercial en una base por mol, dentro de la exactitud del ensayo. La actividad biológica de la porción I L-2 se probó en el ensayo de proliferación de célula CTLL-2, como se describió en el ejemplo 4. Los resultados indican que la proteína de fusión de I L-2 de murino, scIL- 2-í L-2 de murino y Fc-IL-12-I L-2 de murino fueron aproximadamente igual de potentes para estimular la proliferación. La IL-12 de murino no ocasionó ninguna estimulación detectable de la proliferación de célula CTLL-2. Estos resultados indican que la estimulación de la proliferación de célula CTLL-2 a través de las proteínas de fusión sclL-12-IL-2 se debió a la porción de I L-2 y no a la porción de IL-12. Las actividades de I L-2 y IL-12 de las proteínas Fc-I L12-IL2, IL12-KS-IL2, y IL12-KS (cadena ligera) + KS(cadena pesada)-IL2 descritas en el ejemplo 5, también se probaron en'ensayos basados en células. Al utilizar el ensayo de proliferación de célula PBMC/incorporación de timidina titulada, las proteínas Fc-I L 2-IL2, IL12-KS-IL2, y IL12-KS (cadena ligera) + KS(cadena pesada)-IL2 todas mostraron una potente actividad de IL-12. Similarmente, utilizando el ensayo de proliferación de célula CTLL-2, las proteínas Fc-IL12-IL2, IL12-KS-IL2, y IL12-KS (cadena ligera) + KS(cadena pesada)-IL2 todas mostraron una potente actividad de I L-2. Además, . . i».- $ *&t ¿& i *i, & 4 es un ensayo de ELISA las proteínas IL12-KS (cadena ligera) + KS(cadena pesada)-IL2 ambas se unieron herméticamente al antígeno EpCAM, aunque que las regiones V de cadena ligera y pesada, respectivamente, se fusionaron a otras proteínas es sus términos N.

Ejemplo 7: Actividad de proteína de fusión IL-12-GM-CSF Se probó la actividad de IL-12 de una molécula de Fc-IL-12- GM-CSF de murino en un ensayo de proliferación de célula (Figura 10). Se obtuvieron las PBMC's humanas de tres voluntarios y se cultivaron con 5 mícrogramos/ml de fitohemaglutinina-P durante 3 días, se lavaron con HBSS de Hank, y se colocaron en placas de microtitulación a 105 células por cavidad, de acuerdo con un procedimiento estándar (Gately, M. K., Chizzonite, R., y Presky, D.H. Current Protocols in Immunology

[1995] pp. 6.16.1-6.16.15). Las células se incubaron en presencia de varias proteínas de prueba durante 48 horas, y se agregaron 0.3 microCuries de 3H-timidína antes de determina? los niveles de' ¡ncorporación'rádi activa. La IL- 12 y una cantidad equimolar de IL-12 y GM-CSF estimularon la incorporación de 3H-timidina a células en un forma dependiente de dosis, y la proteína de fusión 14.18-IL-12-GM-CSF fue aproximadamente igual de efectiva para estimular la incorporación de 3H-timidina. El GM-CSF no estimuló la incorporación de 3H- timidina a las concentraciones probadas, indicando que la incorporación observada de 3H-timidína estimulada por la proteína de i -*-_-?« 1 í 3. • • nifillliittíft fusión 14.18-IL-12-GM-CSF se debió principalmente a su actividad de IL-12. Además, la actividad biológica de la porción GM-CSF de varías proteínas de fusión IL-12-GM-CSF se probó en ensayos basados en células. Se encontró que a porción GM-CSF es activa, con una actividad por mol en la misma escala general como GM-CSF comercial. Por ejemplo la actividad biológica de la porción GM-CSF se probó en un ensayo de proliferación de célula diferente, siguiendo un procedimiento conocidos por aquellos expertos en la técnica de inmunología molecular (Cooper, S. C, y Broxmeyer, H.E. Current Protocols in Molecular Immunology,

[1996], p- 6.4.1 - 6.4.20). La línea de célula 32D (GM) de ratón depende de GM-CSF para la proliferación; esta línea ha sido adaptada de la línea de célula 32D original, descrita por Cooper y Broxmeyer como siendo particularmente sensible a GM-CSF (Faas y otros, Eur. J. Immunol.

[1993] 23:1201-14). La línea de célula 32D (GM) no es sensible a IL-12. Las células 32D (GM) en crecimiento de registro-fase activo se lavaron dos veces en un medio carente de GM-CSPy "Sé5 csldóaton a aproximadamente 5 x 103 células por cavidad, en cavidades de microtitulación en presencia de varias cantidades de la proteína de fusión de GM-CSF de murino comercial o IL-12- GM-CSF de murino y se desarrollaron durante 48 horas. 16 horas antes de determinar los niveles de incorporación radioactiva se agregaron 0.3 microCuries de 3H-timidina. Existe un incremento responsable de la dosis en la incorporación de 3H-timidina con niveles en incremento de la proteína de fusión IL-12- GM-CSF, indicando que la porción GM-CSF de la proteína de fusión IL-12- GM-CSF es activa. Además, la actividad biológica de GM-CSF de la proteína de fusión calculada en una base molar, es comparable con aquella de GM-CSF de murino comercial.

Ejemplo 8: Tratamiento de carcinoma de colon en un mamífero inmuno-hábil con una proteína de fusión de citosina múltiple Para probar si una proteína de fusión citosina-anticuerpo 10 múltiple puede ser usada para tratar carcinoma de colon en mamífero con un sistema inmune intacto, se realizaron los siguientes experimentos. CT26 es una línea de carcinoma de colon derivada de ratones Balb/C. a través de técnicas de ingeniería genética estándares, está línea de célula fue diseñada por ingeniería para 15 expresar la molécula de adhesión de célula epitelial humana (EpCAM), las cual es el antígeno reconocido por el anticuerpo KS- 1/4; estas células se denominan células CT26/KSA. Los ratones Balb/7 fueron inoculados stibcutáneamente'Gsrr 2-^ 106 células CT26/KSA. Cuando los tumores alcanzaron un volumen 20 de aproximadamente 100-200 milímetros cúbicos, los ratones fueron aleatorizados en tres grupos de nueve ratones para cada estudio adicional. Comenzando en india 0, 2 ratones que llevan el tumor fueron tratados con PBS, alrededor de 3.4 microgramos de KS-IL2 mezclado con aproximadamente 5.3 microgramos de de KS-IL12, o 25 alrededor de seis microgramos de KS-IL2-IL12. estas dosis se v TtWMrJr4**^^-' Biü.1 -f -" '- »» i „ t.. . -X- '..» A, £• ¡ diseñaron para suministrar un número igual de moléculas IL-12 e IL-2 a cada grupo de ratones. Los ratones fueron inyectados intratumoralmente, una vez al día durante cinco días. Los tamaños de los tumores se midieron con calibradores. Los resultados de cada uno de los experimentos se muestran en la Figura 11. En este experimento, KS-IL12-IL2 ocasionó una profunda inhibición de crecimiento del tumor. La mezcla de KS-IL12 y KS-IL2 también ocasionó una inhibición significativa de crecimiento de tumor, pero no tan completa como KS-IL12-IL2. en el grupo de ratones tratados con KS-IL12-IL2, 6 de 9 ratones quedaron aparentemente curados de sus tumores: estos seis ratones sobrevivieron hasta el día 93, cuando el experimento terminó; y los tumores en estos ratones se encogieron y desaparecieron, de manera que no se pudo detectar ningún tumor subcutáneo del día 39 al día 93. los otros tres ratones tuvieron tumores cuyo crecimiento se retrasó de manera que los volúmenes del tumor excedieron de 4000 milímetros cúbicos solamente después del día 87. De los ratones tratados con una mezcla de KS'-IL7f2 y KS-IL2, dos ratones quedaron aparentemente curados de sus tumores subcutáneos y sobrevivieron hasta el fin del experimento. Los tumores en los 7 ratones restantes no desaparecieron y finalmente crecieron a volúmenes de 1000 milímetros cúbicos (un ratón) o más de 4000 milímetros cúbicos (6 ratones). El hecho de que KS-IL12-IL2 es más efectivo que una cantidad equimolar de KS-IL12 y KS-IL2 es sorprendente. Las dosis en este experimento suministran alrededor de 15 picomoles de proteína de fusión por dosis lo cual corresponde a aproximadamente 9 x 1012 moléculas. Al inicio del tratamiento, cada tumor tiene un volumen de aproximadamente 160 milímetros cúbicos, lo cual corresponde a aproximadamente 160 millones de células. Cada célula expresa alrededor de 106 moléculas de de EpCAM, de manera que existen aproximadamente 1.6 x 1014 moléculas de antígeno de EpCAM en donde el anticuerpo KS puede unirse. De esta manera, cuando se mezclan KS-IL12 y KS-IL2 y se inyectan a ratones que llevan tales tumores, es improbable que estas dos proteínas de fusión de inmunocitosina compitan una con la otra para sitios de unión de antígeno. De esta manera, la dosis efectiva de IL-12 de I L-2 en el sitio del tumor de haber sido por lo menos tan alta para la mezcla KS-IL12 y KS-IL2 como para KS-IL12-IL2.

Ejemplo 9. Tratamiento de carcinoma de colon en un mamífero inmunodeficiente con una proteína de fusión de citosina múltiple MucTias formas de~ terapia de cáncer tienen ^el é écfó"'"*avt-aniquilar células de división, incluyendo las células del sistema inmune. Como resultado, los pacientes con cáncer por lo regular quedan inmunosuprimidos. Para dirigir si las proteínas de fusión de cítosina múltiples pueden ser usadas para tratar un mamífero con un sistema inmune suprimido, se trataron ratones SCID que llevan tumores CT26/KSA con KS-IL12-IL2, una mezcla de KS-IL12 y KS-IL2 o PBS. Los ratones SCID están deficientes tanto en células B como > t i. células T y dependen de ramificaciones del sistema inmune innato, tales como células NK, por su habilidad para pelear contra infecciones. Los ratones con tumores subcutáneos CT26/KSA fueron generados como se describió en el ejemplo 8. Tres grupos de 8 ratones cada uno, llevando tumores de aproximadamente 100 a 200 milímetros cúbicos fueron tratados a través de inyección intratumoral con la misma dosificación y programa como en el ejemplo 8. Los resultados se muestran en la Figura 12. En este caso, la proteína de fusión KS-IL12-IL2 y la mezcla de KS-IL12 y KS-IL2 fueron aproximadamente igual de efectivas: cinco de ocho ratones se curaron en cada grupo en el día 25. Sin embargo, en los ratones que no se curaron, cinco de seis tumores comenzaron a crecer a una velocidad característica de tumores en animales no tratados, con un retraso efectivo de aproximadamente 14 a 21 días. Esto se encuentra en contraste con tumores en ratones inmuno-hábiles en el ejemplo 8: aún cuando los tumores no se eliminaron completamente a través del tratamiento con KS-IL12-IL2, los tumores no comenzaron iaJ*'c"re'csr agresivamente hasta aproximadamente 60 días después del comienzo del experimento. Estos experimentos demostraron que una proteína de fusión de anticuerpo de citosina múltiple puede ser utilizada para tratar cáncer en un animal inmunosuprimido. Í??* . . A t >Í.A a Ejemplo 10 Tratamiento de carcinoma de pulmón a través de inyección mtratumoral de una proteína de fusión de citosina múltiple: comparación con el tratamiento a través de inmunocitosmas individuales Para dirigir la efectividad de proteínas de fusión de citosina múltiples e inmunocitosinas que llevan porciones de citosma individuales contra y cáncer derivado de célula de pulmón, se realizó el siguiente experimento. El carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) es un tumor agresivo derivado de ratones C57BL/6. Una línea de célula de carcinoma de pulmón de Lewis expresando la proteína de EpCAM humana se construyó a través de técnica de ingeniería genética estándares; la línea de células se denominó LLC/KSA. Se generaron ratones C57BL/6 con tumores de LLC/KSA subcutáneos como se describió en el ejemplo 8 (verificar # de células KML). Cuatro grupos de cinco ratones cada uno, llevando tumores de aproximadamente 100 a 200 milímetros cúbicos, fueron tratados a través de inyección intratumoral durante...5 -días,. -Loe ratones fueron inyectados con PBS, alrededor de 20 microgramos de KS-IL12, alrededor de 20 microgramos de KS-IL12, o aproximadamente 20 microgramos de KS-IL12-IL2. Los resultados se muestran en la Figura 13. En este caso, la proteína de fusión KS-IL12-IL2 fue mucho más efectiva que KS-IL12 o KS-IL2. En todos los ratones tratados con la proteína de fusión KS- IL12-IL2, los tumores desaparecieron al día 27. En el día 74, estos ? ¡á.tt.*m & í ? í.t ratones fueron utilizados en un ensayo de metástasis de pulmón como se describió en el ejemplo 14; lo tumores subcutáneos originales no volvieron a aparecer en el período de intervención o durante el segundo experimento. En contraste, el tratamiento ya sea con KS-IL12 o KS-IL2 dio como resultado cierto encogimiento aparente del tumor y un retraso significativo en el crecimiento del tumor, pero los tumores finalmente crecieron. Una comparación de los resultados en este ejemplo y ejemplos previos, indica que, para ciertas enfermedades y modos de administración, el tratamiento con una mezcla de inmunocitosinas llevando diferentes porciones de citosina es superior al tratamiento con un solo tipo de inmunocitosina.

Ejemplo 12. Tratamiento de carcinoma de pulmón a través de infección intratumoral de una proteína de fusión de citosina múltiple: comparación del tratamiento a través de una mezcla de inmunocitosinas Para dirigir la efectividad de proteinas.de fusión-dé citosinas múltiples y mezclas de inmunocitosinas llevando diferentes porciones de cítosina contra un cáncer derivado de célula de pulmón, se realizó el siguiente experimento. Se generaron ratones C57BL/6 con tumores de LLC/KSA subcutáneos como se describió en el ejemplo 11. Tres grupos de siete ratones cada uno, llevando tumores de aproximadamente 100 a 200 milímetros cúbicos, fueron tratados a través de inyección «i.. ,<-,....; i..1.: intratumoral durante 5 días. Los ratones fueron inyectados con PBS, una mezcla de aproximadamente 18 microgramos de KS-IL12, y aproximadamente 11.5 microgramos de KS-IL12, o aproximadamente 20 microgramos de KS-IL12-IL2. Los resultados se muestran en la Figura 14. En este caso, la proteína de fusión KS-IL12-IL2 fue mucho más efectiva que la mezcla KS-IL12 y KS-IL2. En todos los ratones tratados con la proteína de fusión KS-IL12-IL2, los tumores desaparecieron al día 27. En contraste, el tratamiento con la mezcla de KS-IL12 y KS-IL2 dio como resultado cierto encogimiento aparente del tumor y un retraso significativo en el crecimiento del tumor, pero todos los tumores en este grupo de tratamiento creciendo finalmente.

Ejemplo 13. Dependencia de antígeno de actividad antitumoral de una proteína de fusión de citosina-anticuerpo múltiple Para dirigir la efectividad de proteínas de fusión de citosina- anticuerpo múltiple en el tratamiento de un tumor fue dependiente de la— expresión específica en tumor del antígeno reconocido »por el anticuerpo, se realizó el siguiente experimento. Un grupo de siete ratones C57BL/6 con tumores de LLC/KSA subcutáneos y un segundo grupo de 9 ratones con tumores derivados de la línea de célula de LLC parenteral fueron generados como se describió en el ejemplo 11. Estos dos grupos de ratones llevando tumores de aproximadamente 100 a 200 milímetros cúbicos, fueron tratados a través de inyección intratumoral durante 5 días. Los LU- ratones fueron inyectados con aproximadamente 20 microgramos de KS-IL12-IL2. Los resultados se muestran en la Figura 15. En este caso, los ratones que llevan los tumores de LLC/KSA todos se curaron completamente de sus tumores. En contraste solamente dos de los ratones que llevan los tumores de LLC/KSA se curaron; los otros ratones que llevan tumores LLC disfrutaron de una reducción pasajera en sus volúmenes de tumor, pero sus tumores finalmente crecieron a grandes volúmenes. Estos resultados indican que el reconocimiento del antígeno de la superficie de EpCAM promueve la adherencia de KS-IL12-IL2 a la superficie de células tumorales de LLC/KSA y la respuesta inmune resultante es mejorada. Se observó algún efecto antitumoral contra tumores derivados de LLC también; sin desear que esté ligado por teoría, el efecto antitumoral de KS-IL12-IL2 en este caso, puede deberse al hecho de que la proteína de fusión fue inyectada directamente al tumor y, por lo tanto, fue pasajeramente localizada e-n el tumor. ~ -••>.—- *-- . •^•- - Ejemplo 14. Generación de una memoria inmune contra un tipo de célula tumoral El desarrollo de metástasis es un problema principal en el tratamiento de cáncer. Para probar si el tratamiento con una proteína de fusión de citosina-anticuerpo múltiple puede conducir a la formación de una memoria inmune de larga duración contra un tipo l-?,.í.¿i ? .t í fcA». de célula tumoral y puede evitar el establecimiento de metástasis, se realizó el siguiente experimento. Cinco ratones C57BL/6 del ejemplo 11 que fueron tratados con KS-IL12-IL2 y aparentemente de curaron de sus tumores subcutáneos. En el día 74 con relación al inicio del tratamiento como se describió en el ejemplo 14, estos cinco ratones fueron inyectados, i.v. con 106 células de LLC/KSA como un control, ocho ratones C57BL/6 también fueron inyectados i.v. con 106 células de LLC/KSA. En el día 28, los ratones fueron sacrificados y los pulmones fueron examinados para metástasis. Los tumores de los ocho ratones de control estuvieron de 70% a 100% cubiertos con metástasis, con un promedio de 85% de cobertura de superficie del pulmón. El peso medio del pulmón para estos ratones fue de 0.86 gramos. En contraste, no se encontró ninguna metástasis sobre la superficie de pulmones de los cinco ratones pretratados, y el peso promedio del pulmón fue 0.28 gramos, lo cual corresponde al peso de un pulmón de ratón normal. Estos resultados indican que el tratamiento de las células tumorales originales dio como resultado una. de larga duración contra las células tumorales; esta memoria evitó el establecimiento de metástasis de este tipo de célula tumoral.

Cuadro X. Protección de ratones "de retroceso" de metástasis pulmonar de LLC-KSA Tratamiento anterior Clasificación metastática Peso del pulmón (g) Ninguno 4,4,4,4,4,4,3,3 0.88 + /-0.27 .i KS-IL12/IL2 0,0,0,0,0 0.27 + /-0 03 El peso promedio del pulmón del grupo de control, con tumor fue de 0.2 gramos. Las clasificaciones metastáticas se basaron en el porcentaje de cobertura de superficie de nodulos metastáticos fusionados, en donde 0 = sin metástasis; 1 = 1-25% de cobertura; 2 = 25-50% de cobertura; 3 = 50-75% de cobertura; y 4 = 75-100% de cobertura. Un segundo experimento para probar la formación de memoria inmune utilizó seis de los siete ratones del ejemplo 12 a quienes se les había inyectado células tumorales de LLC/KSA, desarrollaron tumores subcutáneos, y esos tumores desaparecieron. 62 días después del inicio del tratamiento en el ejemplo 12, seis ratones pretratados y diez naturales, ratones de control C57BL/6 no tratados, fueron inyectados s.c. con 106 células de LLC. Estas células no expresan el antígeno de KS humano, EpCAM. En los ratones naturales, las células de LLC inyectadas formaron tumores que crecieron a una rápida velocidad engodos -os." ratones. En contraste, los tumores en los ratones pre-tratados crecieron mucho más lentamente, y en un ratón, no se detectó ningún tumor subcutáneo. Los resultados se muestran en la Figura 16. Ya que el antígeno KS humano, EpCAM no es expresado en células de LLC, la respuesta inmune a las células LLC se basó en otros antígenos expresados por esta célula.

Ejemplo 15: Proteínas de fusión de citosina múltiples como vacunas Las proteínas de fusión de citosina múltiples pueden ser utilizadas como vacunas cuando se fusionan a una proteína de antígeno. El orden particular de porciones a partir del término N al término C, o si la proteína de fusión es una cadena de polípéptido individual o un oligómero, puede variar dependiendo de la conveniencia de la construcción de los plásmídos de expresión. La proteína puede ser administrada a través de una variedad de rutas, tales como intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, etc. Similarmente, la dosis y frecuencia de administración generalmente necesitan ser determinadas empíricamente, como es la práctica estándar para vacunas para seres humanos y como es bien conocido por aquellos expertos en la técnica de desarrollo de vacunas. Por ejemplo, una proteína de fusión de la forma de antígeno- IL-12-citosina es administrada a un ratón, en donde la citosina en la proteína de fusión es una segunda citosina diferente de IL-12. Los ratones de control recibieron la misma cantidad-d*e antígeno-cUosina,-antígeno-IL-12, o solamente antígeno. En varios momentos durante y/o después de la administración de la proteína de fusión de antígeno, se tomaron muestras de sangre a través de sangrado retro-orbital y se preparó plasma y se analizó para la presencia de anticuerpos dirigidos contra el antígeno. Se encontró que se generaron anticuerpos contra el antígeno. Además, la naturaleza de la respuesta inmune al antígeno es característica de una respuesta ,,-^ s * & , de Th1. La respuesta de anticuerpo es más fuerte y el tipo de anticuerpos producidos es diferente que en ciertas inmunizaciones de control. Más específicamente, una proteína de fusión de anticuerpo humanizado-IL-12-IL-2 de murino en regulador de pH de PBS se inyectó a ratones Balb/c intravenosamente (5 µg/día x 5). Los ratones de control reciben el mismo anticuerpo, en las mismas cantidades, pero no IL-12-IL-2 unido. Ninguna solución de inyección contiene ningún otro tipo de auxiliar. En el día 10, se tomaron muestras de sangre en tubos de microcentrífuga a través de sangrado retro-orbital y se preparó plasma recolectando muestras de sangre en tubos de plástico conteniendo citrato de sodio; seguido por centrifugación a una velocidad total en una microcentrífuga de mesa de Eppendorf. Se cubrieron placas (96 cavidades) de ELISA con la proteína de anticuerpo humanizada, la cual contiene la región constante humana y se utilizó para capturar cualesquiera anticuerpos de ratón hechos en respuesta a la inmunización. Después de lavar el material no unido, los anticuerpos de ratón unidos se -detectaron con-: el anticuerpo Fc de anti-ratón de cabra (Jackson ImmunoResearch) acoplado a peroxidasa de rábano. Cualesquiera anticuerpos unidos pueden ser dirigidos ya sea a las regiones constantes humanas o a la región variable, ambas son compartidas entre el anticuerpo humanizado y las proteínas de fusión. Existe muy poca o nada de reactividad en el anticuerpo humanizado sin IL-12-IL-2 fusionada. La proteína de fusión, por otro ^^^ . i - ..^ ,^-t <M¿b¿á .J -Í. Í lado, induce una fuerte respuesta de anticuerpo en ausencia de auxiliares exógenos, y a pesar del hecho de que la ruta intravenosa de administración es altamente desfavorable para inducir tales respuestas, comparado ya sea con administración subcutánea o 5 intraperitoneal. Los anticuerpos del isotipo lgG2a, los cuales son típicos de respuestas mejoradas de IL-12, se ven en el grupo inyectado con anticuerpo-IL-12-IL-2, pero no en el grupo inyectado con el anticuerpo humanizado. La inmunogenicidad de proteínas de fusión de citosina múltiple 10 de antígeno de IL-12 administradas a través de varias rutas, se probó inyectando una solución de la proteína de fusión (tal como aquella descrita anteriormente) en PBS u otro regulador de pH biocompatible o un auxiliar conocido tal como auxiliar incompleto o completo de Freund . Por ejemplo, cada dos semanas se pueden 15 administrar inyecciones subcutáneas, intradérmícas o intraperitoneales, individuales o múltiples. Alternativamente, la proteína de fusión puede ser administrada primero a través de inyección subcutánea y después seguida - por - inyección- intraperitoneal. El auxiliar de Freund no puede ser usado para uso 20 humano, debido a la irritación en el sitio de inyección. Los auxiliares alternativos tales como precipitados de hidróxido de aluminio (Alum) están aprobados para uso humano y pueden ser utilizados en la presente invención. También se pueden utilizar para inyecciones en la piel nuevos auxiliares químicos orgánicos basados en escualenos 25 y lípidos.

-J""~'*aÍ &alftlÉÍ • • *,-» t ,....Aait Ejemplo 16: terapia de gen con proteínas de fusión de citosina múltiples La actividad anti-cáncer de proteínas de fusión de cítosina múltiples suministrada a través de métodos de terapias de gen también fue demostrada para el tratamiento de cáncer en el pulmón. Se transfectaron en forma estable células de carcinoma de pulmón de Lewis utilizando el sistema de vector viral descrito anteriormente (pLNCS-sclL-12-IL-2 o pLNCX-sclL-12 ADN transfectado a la línea de célula de empaque PA317). Estas construcciones codifican una versión de IL-12, de cadena individual, en donde las subunidades p35 y p40 han sido conectadas con un enlazador. Los clones fueron seleccionados in vitro utilizando un medio conteniendo G418, y los clones establemente expresando alrededor de 50 a 60 ng/ml de IL- 12, fueron identificados a través de ELISA (R & D Systems). Alrededor de 1 x 106 y aproximadamente 5 x 105 células LLC expresando sclL-12 o sclL-12-IL-2 fueron inyectadas s.c., a ratones C57BL/6 y también ratones SCID. Como un control, se inyectaron 2 x 106 células de LLC en ratones C57BL/6 -y también-~a ratones SSIDT las células LLC expresando IL-12 forman tumores que crecieron aproximadamente a la misma velocidad como los tumores derivados de células LLC que no fueron diseñadas por ingeniería para expresar citosinas. Sin embargo, tanto los ratones C57BL/6 como en los ratones SCID, las células de LLC expresando sclL-12-IL-2 ni formaron tumores subcutáneos ni formaron tumores que subsecuentemente se encogieran y desaparecieran (Figuras 17 y 18). lt.1 Ejemplo 17. Construcción de proteínas de fusión de citosina múltiples conteniendo IL-4 y GM-CSF La citosinas IL-4 y GM-CSF, cuando se utilizan en combinación, son potentes activadores de células dendríticas. Una proteína de fusión de citosina-anticuerpo múltiple conteniendo la actividad de IL-4 y GM-CSF se construyó como sigue. La secuencia de codificación para GM-CSF se fusionó en marco al extremo 3' de la secuencia de codificación de cadena pesada del anticuerpo KS-1/4, por una secuencia líder. Además, la secuencia de codificación para IL-4, incluyendo una secuencia líder, fue fusionada en marco con enlazador al extremo 5' de la secuencia de codificación para la cadena ligera del anticuerpo KS-1/4 maduro. Específicamente, para construir el ADN que codifica una proteína de fusión de IL-4 de murino y la cadena ligera del anticuerpo KS-1/4 el ADNc de IL-4 de murino fue adaptado a través de PCR utilizando el iniciador anterior TCTAGACC ATG GGT CTC AAC CCC CAG C (SEC ID NO:22), en donde TCTAGA del sitio Xbal -{residuos 1-6 de SEC ID NO:22) fue colocado corriente arriba de4- codón de iniciación de traducción ATG, y el iniciador inverso C GGA TCC CGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GCT CTT TAG GCT TTC CAG G (SEC ID NO.23) el cual contiene GGA TCC del sitio BamHl (residuos 2-7 de SEC ID NO.23) inmediatamente 3' al codón TCG (anticódon CGA) que codifica el residuo de aminoácido C-termínal de II-4 de murino. Después de la clonación del fragmento de PCR y la verificación de secuencia, el fragmento Xbal-BamHI conteniendo el ADNc de IL-4 de murino se ligó a un dúplex de oligonucleótido BamHI-AflII que codifica un enlazador de péptido flexible rico en residuos de glicina y serina. El extremo Aflll se unió a un sitio Aflll artificialmente colocado precediendo al término N de la cadena ligera de KS-1/4 maduro. El ADN y las secuencias de proteína en las uniones que resultan de las dos ligaciones se presentan a continuación.

ADN: TCG GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT AGC Proteína: (Ser) Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser GGC GGA GGG GGC TCC TTA AGC GAG (SEC ID NO:24) Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser (Glu) (SEC ID NO:25) En esta secuencia de ADN, GGATCC (residuos 4-9 de SEC ID No.24) y CTTAAG (residuos 48-53 de SEC ID No.24) son los dos sitios de restricción BamHl y Aflll, respectivamente, utilizados para la reconstrucción; TCG codifica el residuo de serina C-terminal de IL-4 de murino; GAG codifica el término N maduro de la cadena ligera de KS-1/4; y la secuencia de aminoácido del enlazador de péptido rico en GlySer se muestra después de la secuencia del ADN.

Las secuencias auxiliares para una expresión de alto nivel, incluyendo promotores fuertes, se colocaron apropiadamente alrededor de los segmentos de ADN que codifican ambos polipéptidos de fusión, utilizando técnicas descritas en los ejemplos previos y otras técnicas estándares de biología molecular. ijt í. &.. . i : Las secuencias de ADN que codifican las proteínas de fusión IL4-KS(cadena ligera) y KS(cadena pesada)-GM-CSF fueron transfectadas a células NS/0 y los polipéptidos correspondientes fueron expresados a altos niveles. El análisis de SDS-PAGE bajo 5 condiciones de reducción mostró una banda difusa a aproximadamente 80 kD correspondiendo al polipéptido de cadena pesada-GM-CSF y bandas múltiples a aproximadamente 50 kD correspondiendo a la fusión de cadena ligera de IL-4- La apariencia de bandas difusas y múltiples se debió a la glicosilación variable de 10 IL-4 y GM-CSF, respectivamente. Las subunidades se ensamblaron en una proteína tetramérica unida a disulfuro con una estructura que corresponde a una estructura genérica en la Figura 3G. Esta proteína tuvo la actividad de unión a antígeno de KS-1/4, la habilidad de unirse a la proteína 15 Staph A a través de sus regiones Fc, y las actividades de citosina IL- 4 y GM-CSF. La actividad de IL-4 se midió a través de estimulación dependiente de IL-4 de la incorporación de timidina titulada en células de CTLL-2. La actividad de GM-CSF se midió a través de la estimulación dependiente de G-CSF de la incorporación de timidina 20 titulada en células 32(D)GM. En una base molar, la actividad de IL-4 y la actividad de GM-CSF de KS-IL4-GMCSF fueron similares a IL-4 y GM-CSF purificados. Una fusión de las citosinas IL-4 y GM-CSF, sin secuencias de anticuerpo asociadas, se construyó como sigue. Se clonó IL-4 de 25 murino a través de PCR a partir del ARN de células de bazo de ^rrtfíillt**Ht?a*lM~í-- - -- murino. El iniciador anterior tuvo la secuencia TCTAGACC ATG GGT CTC AAC CCC CAG C (SEC ID NO: 26), en TCTAGA del sitio Xbal (residuos 1-6 SEC ID NO:26) se colocaron corriente arriba del codón de iniciación de traducción ATG, y el iniciador inverso tuvo la secuencia CGA TAT CCC GA CGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GCT CTT TTAG GCT TTC CAG G (SEC ID NO:27) el cual colocó GAT ATC del sitio EcoRV (residuos 2-7 de SEC ID NO:27) inmediatamente 3' del codón TCG (anticodón CGA) que codifica el residuo de aminoácido C-terminal de IL-4 de murino. Después de la verificación de secuencia, el fragmento Xbal-EcoRV conteniendo el ADNc de mulL-4 con su líder nativo fue ligado al fragmento Smal-Xhol conteniendo ADNc de muGM-CSF para dar la siguiente secuencia en la unión de la fusión entre mulL-4 y muGM-CSF: AGT GAT TAC TCG TCC GGG ATG GGA AAA GCA CCC GCC CGC (SEC ID NO:28), en donde la secuencia C-terminal de mulL4 y la secuencia N-terminal de muGM-CSF están en negritas; y G ATG GG (residuos 17-22 de SEC ID NO:28) es la secuencia que resulta de la ligación de un extremo rasurado de EcoRV . a un extremo rasurado de Smal. El ADN resultante que codifica mulL4-muGMCSF después fue clonado a un vector de expresión. La proteína expresada fue analizada a través de SDS-PAGE y se encontró que opera como una banda difusa con un peso molecular aparente de 45 a 50 kD. En una base molar, la actividad de IL-4 y la actividad de GM-CSF de IL4-GMCSF fueron similares a IL-4 y GM-CSF purificadas.

Ejemplo 18. Construcción de ADN que codifica linfotactina-KS-IL2 y expresión de la proteína linfotactina-KS-IL2 Las quimiosinas son una clase distinta de citosinas que se cree que forman gradientes y median la quimiotaxis de células inmunes. Además, como otras citosinas, las quimiosinas pueden inducir la expresión de genes específicos en células objetivo. Una característica de las quimiosinas es que el término N libre por lo general es requerido para la actividad, lo cual puede colocar límites en las formas en las que se pueden construir las proteínas de fusión. Se construyó una proteína de fusión de citosina-anticuerpo-citosina consistiendo de la linfotactina de citosina, la cual es una quimiosina, el anticuerpo KS-1/4 y la citosina I L-2. Esta proteína de fusión fue tetraméríca y estuvo compuesta de dos diferentes polipéptidos. Un polipéptído consistió de línfotactina de murino fusionada al término N de la cadena del anticuerpo KS-1/4, seguido por I L-2 en el término C. La fusión de la cadena pesada de KS-1/4 con I L-2 en el término C la "cadena pesada de IK-IL2", fue como se describió previamente [Gillies y otros, (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:1428]. El otro polipéptido consistió de la cadena ligera del anticuerpo KS-1/4. La secuencia de codificación completa de linfotactina de murino fue publicada por Zlotnik (Science 266:1395

[1998]). Para construir el ADN que codifica una proteína de fusión de linfotactina de murino y a cadena pesada de KS-IL-2, el ADNc de linfotactina de murino fue adaptado a través de PCR utilizando el iniciador anterior jk?. ,á ¿I * TCTAGAGCCACC ATG CTT CTC CTC CTG AC (SEC ID NO.29), en donde TCTAGA del sitio Xbal (residuos 1-6 de SEC ID NO:29) se colocó corriente arriba del codón de iniciación de traducción ATG, y el iniciador inverso GGA TCC CCC AGT CAG GGT TAC TGC TG (SEC 5 ID NO:30), el cual colocó GGA TCC (residuos 1-6 de SEC ID NO:30) inmediatamente 3' del codón GGG (anticodón CCC) que codifica el residuo de aminoácido C-terminal de linfotactina de murino. Después de la clonación del fragmento de PCR y la verificación de secuencia, el fragmento Xbal-BamHI conteniendo el ADNc de linfotactina de 10 murino fue ligado a un dúplex del oligonucleótido BamHI-AflII codificando un enlazador de péptido flexible rico en residuos de glicina y serina. El extremo Aflll a su vez fue unido a un sitio Aflll artificial precediendo el término N maduro de la cadena pesada de KS-IL2. La secuencia de ADN en las uniones que resultan de las dos 15 ligaciones se presenta a continuación: Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly CCC GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT AGC GGC GGA Gly Gly Ser Leu Ser (SEC ID NO:32) 20 GGG GGC TCC TTA AGC CAG (SEC ID NO:31) en donde GGATCC (residuos 4-9 de SEC ID NO:31) y CTTAAG (residuos 48-53 de SEC ID NO:31) son los dos sitios de restricción BamHl y Aflll, respectivamente, utilizados para la reconstrucción; 25 CCC codifica el residuo de aminoácidos C-terminal de linfotactina de ^á murino; CAG codifica el término N maduro de a cadena pesada KS-IL2; y la secuencia de aminoácido del enlazador de péptido rico en GlySer se muestra por arriba de la secuencia de ADN. El ADN que codifica la cadena pesada de linfotactina-KS-IL2 de murino después se clonó a un vector de expresión y después se co-expresó con la cadena ligera de KS-1/4. La proteína de fusión de linfotactina-KS-IL2 expresada de trató para la actividad de linfotactina en un ensayo de migración de cámara de Borden utilizando células T (Leonard y otros,

[1999] Current Protocols in Immunology p. 6.12.3). Alternativamente, se utilizaron células NK. Alternativamente, de observó la actividad de linfotactina en un ensayo celular estándar para el flujo de calcio en respuesta a la activación de un receptor acoplado a la proteína G (Maghazachí y otros FASEB J.

[1997]; 11:765-74.). Además, la proteína de fusión de linfotactina-KS-IL2 se probó y se encontró que es activa en ensayos para la habilidad de unirse a EpCAM y también es activa en ensayos para la actividad de I L-2, tales como el ensayo de proliferación de célula CTLL-2.

Incorporación por Referencia Todas las publicaciones mencionadas anteriormente se incorporan aquí por referencia en esta solicitud en su totalidad.

" Zf Equivalentes La invención puede ser modalizada en otras formas específicas sin apartarse del espíritu o sus características esenciales. Las modalidades anteriores, por lo tanto, se deben considerar en todos los aspectos como ilustrativas en lugar de limitantes de la invención descrita aquí. El alcance de la invención de esta manera está indicado por las reivindicaciones anexas en lugar de por la descripción anterior, y todos los cambios que están dentro del significado y escala de equivalencia de las reivindicaciones, por lo tanto están destinados a ser abarcados en las mismas. -fcA-fa.- . ? » -•»< -w-M-h--. .¿.j -i j LISTA DE SECUENCIAS <110> Gillies, Stephen Lo, Kin Ming <120> Corrplejos Múltiples de Proteína de Citosina <130> LEX-01OPC <140> <141> <150> 60/147,924 <151> 1999-08-09 <160> 32 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 582 <212> ADN <213> Mus usculus <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación de p35 de murino para proteína madura i*¿«*Jfc*-; *& *-. k ja-j^a <400> 1 agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60 accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120 gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180 ccactggaac tccacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240 agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300 atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360 aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cagtgacatg 420 atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480 gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcetgcttc acgccttcag cacccgsgtc 540 gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcct ga 582 <210> 2 <211> 1472 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación de proteína de fusión de p40-IL-2 de murino <400> 2 atgtgtcctc agaagctaac atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg 60 ttttgctggt gtctccactc atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag 120 aggtggactg gactcccgat gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg 180 aagaagatga catcacctgg acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga 240 ccctgaccat cactTtcaaa gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag 300 '-tis?á,¡á.? ?.?. ..-I---.»»-.- «^ - jjí.í. 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ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540 agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600 gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660 gaaaatgaaa ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acecaagaac 720 ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780 acctggagt ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ecagggcaag 840 aagaagatgg agaagaagaa tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900 cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960 gaatgggcat ctgtgccctg cagtgcacct acttcaagtt ctacaaagaa aacacagcta 1020 caactggagc atttactgct ggatttacag atgattttga atggaattaa taattacaag 1080 aatcccaaac tcaccaggat gctcacattt aagttttaca tgcccaagaa ggccacagaa 1140 ctgaaacatc ttcagtgtct agaagaagaa ctcaaacctc tggaggaagt gctaaattta 1200 gctcaaagca aaaactttca cttaagaccc atggaattaa tcagcaatat caacgtaata 1260 gttctggaac taaagggatc tgaaacaaca ttcatgtgtg aatatgctga tgagacagca 1320 accattgtag aatttctgaa cagatggatt accttttgtc aaagcatcat ctcaacacta 1380 acttgataa 1389 <210> 5 <211> 1278 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia que codifica la proteína de fusión Fc-p35 <400> 5 gagcccagag ggcccacaat caagccctgt cctccatgca aatgcccagc acctaacctc 60 ttgggtggac catccgtctt catcttccct ccaaagatca aggatgtact catgatctcc 120 etgagcccca tagtcacatg tgtggtggtg gatgtgagcg aggatgaccc agatgtccag 180 atcagctggt ttgtgaacaa cgtggaagta cacacagctc agacacaaac ccatagagag 240 gattacaaca gtactctccg ggtggtcagt gccctcccca tccagcacca ggactggatg 300 agtggaaaag agttcaaatg caaggtcaac aacaaagacc tcccagcgcc catc agaga 360 'Jl *¥!*» IHI?JÍ J «i. .. j. e, * i *, 4 accatctcaa aacccaaagg gtcagtaaga gctccacagg tatatgtett gcctccacca 420 gaagaagaga tgactaagaa acaggtcact ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct 480 gaagacattt acgtggagtg gaccaacaac gggaaaacag agctaaacta caagaacact 540 gaaccagtcc tggactetga tggttcttac ttcatgtaca gcaagctgag agtggaaaag 600 aagaagatgg tggaaagaaa tagctactcc tgttcagtgg tccacgaggg tctgcacaat 660 caccacacga ctaagagctt ctcccggacc ccgggtaggg tcattccagt ctctggacct 720 gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg 780 gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc actgctgaag acatcgatca tgaagacatc 840 acacgggacc aaaccagcac attgaagacc tgtttaccac tggaactaca caagaacgag 900 agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc acaacaagag ggagctgcct gcccccacag 960 aagacgtctt tgatgatgac cctgtgcctt ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac 1020 cagacagagt tccaggccat caacgcagca cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt 1080 ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc 1140 gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag 1200 ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc 1260 tatctgagct ccgcctga 1278 <210> 6 <211> 1287 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia que codifica proteína de fusión Fc-p35 humana ?A A.J. *± J tX> * r ¿ &>& I Ífa.ÍL: <400> 6 ggccctgaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcagcgtc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcacgg 420 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggcaaggagc 600 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggaagaaacc tccccgtggc cactccagac 720 ccaggaatgt tcccatgcct tcaccactcc caaaacctgc tgagggccgt cagcaacatg 780 ctccagaagg ccagacaaac tctagaattt tacccttgca cttctgaaga gattgatcat 840 gaagatatca caaaagataa aaccagcaca gtggaggcct gtttaccatt ggaattaacc 900 aagaatgaga gttgcctaaa ttccagagag acctctttca taactaatgg gagttgcctg 960 gcctccagaa agacctcttt tatgatggcc ctgtgcctta gtagtattta tgaagacttg 1020 aagatgtacc aggtggagtt caagaccatg aatgcaaagc ttctgatgga tcctaagagg 1080 cagatctttc tagatcaaaa catgctggca gttattgatg agctgatgca ggccctgaat 1140 ttcaacagtg agactgtgcc acaaaaatcc tcccttgaag aaccggattt ttataaaact 1200 aaaatcaagc tctgcatact tcttcatgct ttcagaattc gggcagtgac tattgacaga 1260 gtgacgagct atctgaatgc ttcctaa 1287 <210> 7 <211> 32 - í.i? .1 -JN <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> 5 <223> Descripción de Secuencia Artificial: iniciador anterior par ala construcción de proteína de fusión p40-IL-2 de murino <220> <221> misc_aspectos 10 <222> (12) .. (14) <223> codón de iniciación de traducción <400> 7 aagctagcac catgtgtcct cagaagctaa ce 32 15 <210> 8 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 20 <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: iniciador inverso para la construcción de proteína de fusión p40-IL-2 de murino <220> 25 <221> misc_aspectos <222> Complemento ( (7) .. (9) ) <223> codón de detención de traducción <400> 8 ctcgagctag gatcggaccc tgcaggg 27 <210> 9 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de AND en la unión de proteína de fusión p40-IL-2 de murino <220> <221> misc_aspectos <222> (14) .. (16) <223> codifica el residuo de aminoácido C-terminal de p40 de murino <220> <221> misc_aspecto <222> (26) .. (28) <223> codifica el residuo de aminoácido N-terminal de IL-2 de murino maduro <400> 9 ctgcagggtc cgatccccgg gtaaagcacc c 31 <210> 10 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de AND en la unión de IL12 y GMCSF de murino de cadena individual <220> <221> misc_aspecto <222> (14) .. (16) <223> codifica el residuo de aminoácido C-terminal de p40 de murino <220> <221> misc_aspecto <222> (26) .. (28) <223> codifica el residuo de aminoácido N-terminal de GMCSF de murino maduro <400> 10 ctgcagggtc cgatccccgg gaaaagca 28 <210> 11 <211> 2013 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia que codifica de proteína de fusión de p35-enlazador-p40-IL-2 <400> 11 agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60 accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120 gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180 ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240 agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300 atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360 aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420 atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480 gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540 gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcgt cgagcggggg cagcgggggc 600 ggaggcagcg gcgggggcgg atccgccatg tgggtgctgg agaaagacgt ttatgttgta 660 gaggtggact ggactcccga tgcccctgga gaaacagtga acctcacctg tgacacgcct 720 gaagaagatg acatcacctg gacctcagac cagagacatg gagtcatagg ctctggaaag 780 accctgacca tcactgtcaa agagtttcta gatgctggcc agtacacctg ccacaaagga 840 ggcgagactc tgagccactc acatctgctg ctccacaaga aggaaaatgg aatttggtcc 900 actgaaattt taaaaaattt caaaaacaag actttcctga agtgtgaagc accaaattac 960 tccggacggt tcacgtgctc atggctggtg caaagaaaca tggacttgaa gttcaacatc 1020 aagagcagta gcagttcccc tgaccctggg gcagtgacat gtggaatggc gtctctgtct 1080 gcagagaagg tgcccctgga ccaaagggac tatgagaagt atgcagtgtc ctgccaggag 1140 gatgtcacct gcccaactgc cgaggagacc ctgcccattg aactggcgtt ggaagcacgg 1200 cagcageata aatatgagaa ctacagcacc agcttcttca tcagggacat catcaaacca 1260 gacccgccca agcacttcaa gatgaagcct tatgagaagt cacaggtgga ggtcagctgg 1320 gagtaccctg actcctggag cactccccat tcctacttct ccctcaagtt ctttgttcga 1380 atccagcgca agaaagaaaa gatgaaggag acagaagacg ggtgtaacca gaaaggtgcg 1440 ttcctcgtag agaagacatc taccgaagtc caatgcaaag gcgggaatgt ctgcgtgcaa 1500 gctcaggatc gctattacaa ttcctcatgc agcaagtggg catgtgttcc ctgcagggtc 1560 cgatccccgg gtaaagcacc cacttcaagc tctacagcgg aagcacagca gcagcagcag 1620 cagcagcagc atcagcagaa gcacctggag cagctgttga tggacctaca gaagctctgg 1680 agcaggatgg agaattacag gaacctgaaa ctccccagga tgctcacctt caaattttac 1740 ttccacaacc aggccacaga attgaaagat cttcagtgcc tagaagatga acttggacct 1800 ctgcgccagg ttctggattt gactcaaagc aaaagctttc aattggaaga tgctgagaat 1860 ttccacaaca atatcagagt aactgttgta aaactaaagg gctctgacaa cacatttgag 1920 tgccaattcg atgatgagtc agcaactgtg gtggactttc tgaggagatg gagagacttc 1980 tgtcaaagca tcatctcaac aagccctcaa taa 2013 <210> 12 <211> 1569 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación de proteína de fusión p35-enlazador-p40 <400> 12 agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60 accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcrctgct 120 l .L i .. - . i »* . gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180 ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240 agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300 atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360 aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420 atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480 gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540 gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcgt cgagcggggg cagcgggggc 600 ggaggcagcg gcgggggcgg atccgccatg tgggtgctgg agaaagacgt ttatgttgta 660 gaggtggact ggactcccga tgcccctgga gaaacagtga acctcacctg tgacacgcct 720 gaagaagatg acatcacctg gacctcagac cagagacatg gagtcatagg ctctggaaag 780 accctgacca tcactgtcaa agagtttcta gatgctggcc agtacacctg ccacaaagga 840 ggcgagactc tgagccactc acatctgctg ctccacaaga aggaaaatgg aatttggtcc 900 actgaaattt taaaaaattt caaaaacaag actttcctga agtgtgaagc 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60 ttgggtggac catccgtctt catcttccct ccaaagatca aggatgtact catgatctcc 120 ctgagcccca tagtcacatg tgtggtggtg gatgtgagcg aggatgaccc agatgtccag 180 atcagctggt ttgtgaacaa cgtggaagta cacacagctc agacacaaac ccatagagag 240 gattacaaca gtactctceg ggtggtcagt gccctcccca tccagcacca ggactggatg 300 15 agtggcaagg agttcaaatg caaggtcaac aacaaagacc tcccagcgcc catcgagaga 360 accatctcaa aacccaaagg gtcagtaaga gctccacagg tatatgtctt gcctccacca 420 gaagaagaga tgactaagaa acaggtcact ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct 480 gaagacattt acgtggagtg gaccaacaac gggaaaacag agctaaacta caagaacact 540 gaaccagtcc tggactctga tggttcttac ttcatgtaca gcaagctgag agtggaaaag 600 20 agcaagtggg tggaaagaaa tagctactcc tgttcagtgg tccacgaggg tetgcacaat 660 caccacacga ctaagagctt ctcccggacc ecgggtaggg tcattccagt ctctggacct 720 gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg 780 gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc actgctgaag acatcgatca tgaagacatc 840 acacgggacc aaaccagcac attgaagacc tgtttaccac tggaactaca caagaacgag 900 25 agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc acaacaagag ggagctgcct gcccccacag 960 aagacgtctt tgatgatgac cctgtgcctt ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac 1020 ?irfl-1i(--JÍ-M- ---aBl-Étí;:? i i \ t S : , ^í i . .. .. ..... . , . ... , . .-., ,,. -^?.. «...At.,,^».. ,A_,*S. -. t*?.i i cagacagagt tcagggacat caacgcagca cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt 1080 ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc 1140 gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag 1200 ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc cgcgtcgtga ccatcaacag gtggaatggc 1260 tatctgagct ccgcgtcgag cgggggcagc gggggcggag gcagcggcgg gggcggatcc 1320 gccatgtggg tgctggagaa agacgtttat gttgtagagg tggactggac tcccgatgcc 1380 cctggagaaa cagtgaacct cacctgtgac acgcctgaag aagatgacat cacctggacc 1440 tcagaccaga gacatggagt cataggctct ggaaagaccc tgaccatcac tgtcaaagag 1500 tttctagatg ctggccagta cacctgccac aaaggaggcg agactctgag ccactcacat 1560 ctgctgctcc acaagaagga aaatggaatt tggtccactg aaattttaaa aaatttcaaa 1620 aacaagactt tcctgaagtg 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Js^a t?«i ti gttgtaaaac taaagggctc tgacaacaca tttgagtgcc aattcgatga tgagtcagca 2640 actgtggtgg actttctgag gagatggata gccttctgtc aaagcatcat ctcaacaagc 2700 cctcaataa 2709 5 <210> 14 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> 10 <223> Descripción de Secuencia Artificial: iniciador anterior para amplificación de PCR de la subunidad p35 de murino de IL-12 <220> <221> misc_aspecto 15 <222> (16) .. (18) <223> codón de inicio de traducción <400> 14 aagcttgcta gcagcatgtg tcaatcacgc tac 33 20 <210> 15 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 25 <220> -^".- <223> Descripción de Secuencia Artificial: iniciador inverso para amplificar mediante PCR la subunidad p35 de IL-12 de murino <220> <221> misc_aspecto <222> Complement ( (10) .. (12) ) <223> codón de detención de traducción <400> 15 ctcgagcttt caggcggagc tcagatagcc 30 <210> 16 <211> 61 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación en la unión entre p35 y p40 que comprende la IL-12 de cadena individual de murino <220> <221> misc_aspecto <222> (8).. (10) <223> codifica el residuo de aminoácido C-terminal de p35 de murino <220> ?*á-Á Á.*?- -4 tefta>. ? &--<««*^ ^+ <221> misc_aspecto <222> (59) .. (61) <223> codifica el residuo de aminoácido N-terminal de p40 de murini maduro <400> 16 gagctccgcg tcgagcgggg gcagcggggg cggaggcagc ggcgggggcg gatccgccat 60 g 61 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de proteína en la unión entre p35 y p40 que comprende la IL-12 de cadena individual de murino <400> 17 Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 1 5 10 15 <210> 18 <211> 73 <212> ADN <213> Secuencia Artificial ;220> ^^^^^^^. <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación en la unión entre p40 de murino y el término N maduro de la cadena pesada KS <220> <221> misc_aspecto <222> (14) .. (16) <223> codifica eñ residuo de aminoácido C-terminal de p40 de murino <220> <221> misc_aspecto <222> (71) .. (73) <223> codifica el residuo N-te-tinal de la cadena pesada de KS <400> 18 ctgcagggtc cgatccccgg gatccggagg ttcagggggc ggaggtagcg gcggaggggg 60 ctccttaagc cag 73 <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de proteína en la unión entre p40 de murino y el término N maduro de la cadena pesada KS <400> 19 t-AAJ- ?-Á. ¿-J-A..., Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Ser <210> 20 <211> 64 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia Artificial: secuencia de codificación en la unión entre p35 de murino y la cadena ligera KS <220> <221> misc_aspecto <222> (8) .. (10) <223> codifica el residuo de aminoácido C-terminal de p35 de murino <220> <221> misc_aspecto <222> (62) .. (64) <223> codifica el residuo de aminoácido N-terminal de la cadena ligera <400> 20 gagctccgcg tcgagcgggg gcagcggggg cggaggcagc ggcgggggcg gatccttaag 60 cgag 64 ¿ a <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de proteína en la unión entre p35 y la cadena ligera KS <400> 21 Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15 Ser <210> 22 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: iniciador anterior para la amplificación de PCR de IL-4 de murino <220> <221> misc_aspecto <222> (9) .. (11) <223> codón de iniciación de traducción t«l*t..a. ¿¿ a * .i..^.i t.ite .. ?? ÍÍ ??' <400> 22 tctagaccat gggtctcaac ccccagc 27 <210> 23 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: iniciador inverso para la amplificación de PCR de IL-4 de murino <220> <221> mise-aspecto <222> Complemento ( (8) .. (10) ) <223> codifica el residuo de aminoácido C-terminal de IL-4 de murino <400> 23 cggatcccga gtaatccatt tgcatgatgc tctttaggct ttccagg 47 <210> 24 <211> 57 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripcic'a de Secuencia Artificial: secuencia de codificación en la l i l unión de IL-4 de murino y la cadena ligera KS-1/4 madura <220> <221> misc_aspecto <222> (1) .. (3) <223> codifica el residuo de serina C-terminal de IL-4 de murino <220> <221> misc_aspecto <222> (55) .. (57) <223> codifica el residuo de aminoácido N-terminal de la cadena ligera KS-1/4 madura <400> 24 tcgggatccg gaggttcagg gggcggaggt agcggcggag ggggctcctt aagcgag 57 <210> 25 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de proteína en la unión de IL-4 de murino y la cadena ligera KS-l/4 madura <400> 25 Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser M. ??m.á .^?^¿ . 10 15 Leu Ser Glu <210> 26 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: iniciador anterior para la amplificación de PCR de IL-4 de murino <220> <221> misc_aspecto <222> (9).. (11) <223> codón de iniciación de traducción <400> 26 tetagaccat gggtctcaac ccccagc 27 <210> 27 <211> 52 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> ^^^^^s^^s^^. r -&1A í ,4 ,i <223> Descripción de Secuencia Artificial: iniciador inverso para la amplificación de PCR de IL-4 de murino <220> <221> misc_aspecto <222> Complemento ( (13) .. (15) ) <223> codifica el residuo de aminoácido C-terminal de IL-4 de murino <400> 27 cgatatcccg gacgagtaat ccatttgcat gatgctcttt aggctttcca gg 52 <210> 28 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación en la unión entre IL-4 y G;-CSF de murino <220> <221> mise-aspecto <222> (1)..(12) <223> codifica la secuencia de muIL4 C-terminal <220> <221> m?sc_aspecto <222> (28).. (39) <223> codifica la secuencia N-terminal de muGM-CSF <400> 28 atggattact cgtccgggat gggaaaagca cccgcccgc 39 <210> 29 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: iniciador anterior para la amplificación de PCR de linfotactina de murino <220> <221> misc_aspecto <222> (13) .. (15) <223> codón de iniciación de traducción <400> 29 tctagagcca ccatgagact tctcctcctg ac 32 <210> 30 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial : iniciador inverso para la amplificación de PCR de linfotactina de murino <220> <221> misc_aspecto <222> Complemento ( (7) .. (9) <223> codifica el residuo de aminoácido C-terminal de linfotactina de murino <400> 30 ggatccccca gtcagggtta ctgctg 26 <210> 31 <211> 57 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codifcación en la unión entre linfotactina de murino y cadena pesada KS-IL2 <220> <221> miscfeature <222> (1)..(3) <223> codifica el residuo de aminoácido C-terminal de linfotactina de murino <220> átÍ?.a. m^. *.« . <221> misc_aspecto <222> (55) .. (57) <223> codifica el residuo de aminoácido N-terminal de la cadena pesada KS-IL2 <400> 31 cccggatccg gaggttcagg gggcggaggt agcggcggag ggggctcctt aagccag 57 <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de proteína en la unión entre linfotactina de murino y cadena pesada KS-IL2 <400> 32 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15 Ser .- íiJíC?- ?&i-A?- ií ,A , jl .. .-. ..I *..Í,?¿1 Ar-i ínkü

Claims

REIVINDICACIONES 1.- Una proteína de fusión multifuncional que comprende una cadena de polipéptido que define una región de inmunoglobulina (lg), una primera citosina (Cl) y una segunda citosina diferente (C2).
2.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha Ig, dicha C1 y dicha 02 están dispuestas en una dirección N- a C-terminal para producir una proteína de fusión definida por una fórmula seleccionada del grupo que consiste de: (i) Ig - Cl - C2; (ii) Cl - Ig - C2; y (iii) Cl - C2 - Ig, en donde una línea desvanecida representa un polipéptido unido o un enlazador de polipéptido.
3.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde C1 o 02 comprenden IL-2, IL-4 o GM-CSF.
4.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde C1 o 02 comprende una subunidad de citosina heterodimérica.
5.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde 01 es una quimíosina.
6.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la subunidad comprende una subunidad p35 de IL-12 o una subunidad p40 de IL-12.
7.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde C1 o 02 es una citosina humana.
8.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la Ig comprende un dominio de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH).
9.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 u 8, en donde la Ig comprende una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.
10.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la región constante comprende un dominio de región de gozne, un dominio CH2 y un dominio CH3.
11.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la región constante además comprende un dominio CH1.
12.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicha VH es inmunológicamente reactiva con antígeno específico en cáncer o un antígeno viral.
13.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde C1 y C2, cuando se enlazan a la proteína de fusión, tienen vidas medias similares en circulación, in vivo
14.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la Ig, C1 y 02 todas son activas bajo las mismas condiciones.
15.- Un complejo de proteína multifuncional que comprende: una primera cadena de polipéptido definiendo una región de inmunoglobulina y una primera porción de una primera citosina, y una segunda cadena de polipéptido definiendo una segunda citosina y una segunda porción de la primera cítosina.
16.- El complejo de proteína multifuncional de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la primera cadena de pol i péptido está covalentemente unida a la segunda cadena de polípéptido.
17.- El complejo de proteína multifuncional de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la primera citosina es una citosina dimérica.
18.- El complejo de proteína multifuncional de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la primera citosina es IL-12.
19.- El complejo de proteína multifuncional de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la segunda citosina es IL-2.
20.- Un complejo de proteína multifuncional que comprende por lo menos: una primera proteína de fusión comprendiendo una primera citosina fusionada por lo menos a una porción de una cadena ligera de inmunoglobulina, y una segunda proteína de fusión comprendiendo una segunda citosina diferente fusionada por lo menos a una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina.
21.- El complejo de proteína de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la primera proteína de fusión está covalentemente unida a la segunda proteína de fusión.
22.- El complejo de proteína de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la porción de la cadena ligera de inmunoglobulina es un disulfuro unido a la porción de la cadena pesada de ¡nmunoglobulina.
23.- El complejo de proteína de acuerdo con la reivindicación '^^^m^m^L^m^^^mm^¿^^^^^¡¿' .^4 á**>? A .-20, en donde el término amino de la primera citosina está fusionado al término carboxi de la cadena ligera de inmunoglobulina.
24.- El complejo de proteína de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el término amino de la segunda citosina está fusionado al término carboxi de la cadena pesada de inmunoglobulina.
25.- El complejo de proteína de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la primera citosina es IL-12.
26.- El complejo de proteína de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la segunda citosina es IL-12.
27.- Una proteína de fusión multifuncional que comprende una cadena de polipéptido definiendo una primera citosína (C1), y una segunda citosina, diferente (C2), en donde la C2 cuando está libre tiene una vida media en circulación in vivo mayor que aproximadamente dos veces a aquella de C1 libre, pero cuando C1 está enlazada a C2 en la proteína de fusión C1 tiene una vida media en circulación in vivo aproximadamente igual a C2 en la proteína de fusión.
28.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 27, en donde 01 es IL-2 o GM-CSF.
29.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 27, en donde C2 es IL-4, I L-2 o una subunidad del mismo.
30.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 27, en donde un extremo C-terminal y C1 está enlazado a un extremo N-terminal de C2.
31.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 27, en donde un extremo C-termmal de C2 está enlazado a un extremo N-terminal de 01.
32.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 30 o 31, en donde el extremo C-terminal está enlazado a través de un enlazador de polipéptido a dicho extremo N-terminal.
33.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 32, que comprende además una región de inmunoglobulina (Ig).
34.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 33, en donde Ig comprende un dominio de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH).
35.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 33, en donde Ig comprende una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.
36.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 35, en donde la región constante comprende un dominio de región de gozne, un dominio CH2 y un dominio CH3.
37.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 36, en donde la región constante de cadena pesada además comprende un dominio CH1.
38.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 27, en donde 02 libre tiene una vida media en circulación in vivo de por lo menos aproximadamente 4 veces mayor que aquella de 01.
39.- La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 38, en donde 02 tiene una vida media en circulación de aproximadamente 8 veces mayor que aquella de 01. . - -J-i -i* S *. iim ^ , .*. A . , 4 í-Já
40.- Un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 1, 15, 20 o 27.
41.- Una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 40.
42.- Un método para preparar una proteína de fusión que comprende una primera citosina (C1), una segunda citosina, diferente (C2), y una porción de activación o dirección capaz de activar un sitio preseleccionado en un mamífero, el método comprende los pasos de: (a) expresar en una célula huésped, un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión comprendiendo la C1, la 02 y la porción de activación capaz de dirigir dicha proteína de fusión hacia el sitio seleccionado cuando la proteína de fusión es administrada al mamífero; y (b) cosechar dicha proteína de fusión.
43.- Un método para activar o dirigir una primera citosina (C1) y una segunda citosina, diferente (C2) hacia un sitio preseleccionado en un mamífero, el método comprende: administrar al mamífero una proteína de fusión multifuncional comprendiendo una 01, C2, y una región de ¡nmunoglobulina (Ig) capaz de dirigir dicha proteína de fusión hacia el sitio preseleccionado en el mamífero.
44.- Un método de acuerdo con la reivindicación 42 o 43, en donde dicha Ig comprende un dominio de región variable de cadena pesada de inmunoglobulína, inmunológicamente reactivo con un , ~ * * i il antígeno dispuesto en el sitio preseleccionado en el mamífero.
45.- El método de acuerdo con la reivindicación 44, en donde el antígeno es un antígeno específico de cáncer o un antígeno viral.
46.- El método de acuerdo con la reivindicación 42 o 43, en donde dicha Ig comprende una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina capaz de unir un receptor Fc de inmunoglobulina dispuesto en el sitio preseleccionado en el mamífero.
47.- El método de acuerdo con la reivindicación 42 o 43, en donde dicha Ig, C1 y C2 todas están activas cuando la proteína de fusión es administrada al mamífero.
48.- El método de acuerdo con la reivindicación 42 o 43, en donde el mamífero es un ser humano.
49.- El método de acuerdo con la reivindicación 42 o 43, en donde la 01 es IL-12 o una subunidad de la misma.
50.- El método de acuerdo con la reivindicación 49, en donde la 02 se selecciona del grupo que consiste de I L-2 y GM-CSF.
51.- Un método para tratar una enfermedad en un mamífero, el método comprende administrar al mamífero la proteína de la reivindicación 1, 15, 20 o 27.
52.- Un método para tratar una enfermedad en un mamífero, el método comprende administrar al mamífero un ácido nucleico de la reivindicación 40.
53. Un método para tratar una enfermedad en un mamífero, el método comprende administrar al mamífero la célula de la reivindicación 41. I??üá? A . rlí?l9 Mi.flÉÉ