TWI487713B - 趨化素－細胞素融合蛋白和其應用 - Google Patents

Description

趨化素-細胞素融合蛋白和其應用

本發明係關於一種融合蛋白，其係包含趨化素和連接至該趨化素的細胞素，其中該趨化素和該細胞素具有共同的標的細胞，且其具有增進的細胞素活性和增進的趨化素活性。

細胞素(cytokine)是一群當細胞受外來刺激後所分泌出來(只有極少種細胞素可表現於細胞膜)的蛋白，細胞素自細胞產生後可以就近或經由血液的運輸而作用於標的細胞以產生影響，而且在極低的濃度下就會有其作用，廣泛具有可促使標的細胞生長、分化或活化等功能，許多細胞素可作用在免疫細胞而參與免疫反應。細胞素可依其結構作用不同大致分為趨化素(chemokines)、介白素(interleukins)、生長因子(growth factors)、轉形生長因子(transforming growth factors)、群落生成刺激因子(colony stimulating factors)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors)和干擾素(interferons)等。

趨化素(chemokines)是一群可趨化吸引白血球的細胞素，通常為分子量小、帶正電、可分泌性的蛋白，主要的功能是將免疫細胞吸引到組織受傷或是有病原感染的區域，白血球繼而能夠在此特定的部位進行吞噬反應(phagocytosis)或是引發發炎反應(inflammation)，以抵禦病原，趨化素所吸引的白血球可能包括屬於先天性免疫力(innate immunity)的嗜中性球(neutrophils)、單核球/巨噬細胞(monocytes/macrophages)、自然殺手細胞(natural killer cells)、樹突細胞(dendritic cells)和其他白血球等，或者是屬於特異性免疫反應(adaptive immunity)的T(淋巴)細胞(T lymphocytes,T cells)或B(淋巴)細胞(B lymphocytes,B cells)，在生物體的免疫系統中扮演相當重要的角色。趨化素大多擁有4個高度保留的半胱胺酸(cysteine,C)形成雙硫鍵來穩定其結構，依據前兩 個C的間的胺基酸數不同和第一個C有無進行分類，可分成CXC(或稱α)、CC(或稱β)、C(或稱γ)與CX₃ C四個亞群(subfamilies)。基質細胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)被歸類在趨化素的CXC亞群裡，又稱為CXC配體12(CXCL12)，在許多的物種中均有發現，包括哺乳類動物中的人類、小鼠和貓與兩棲類動物中的非洲爪蟾(Xenopus )以及斑馬魚(zebra fish)都有發現，在不同物種間變異不大，有相當好的保留性(Shirozuet al. ,Genomics 28,495-500)。SDF-1基因在小鼠和人類中轉錄出的mRNA會先經過不同剪接(splicing)，所以可發現有兩種SDF-1同型異構物(isoform)：SDF-1α和SDF-1β。SDF-1的分布極廣，包括淋巴組織、腎、肺、肝、腦和肌肉等都可偵測的到(Shirozuet al. ,Genomics 28,495-500)。SDF-1的受體CXCR4除了長存於臟器中，亦可見於造血幹細胞(hematopoietic stem cells)、內皮細胞、樹突細胞、B細胞、和T細胞，因此這些細胞會受SDF-1吸引，移動到該趨化素濃度高的部位(Bleulet al. ,Nature ,382：829-833；Oberlin et al.,Nature 382：833-835；Readet al. ,Developmental and comparative immunology ,29,143-152)。介白素-8(interleukin-8,IL-8)亦被歸類在趨化素的CXC亞群裡，又稱為CXCL8，首度在人類發現後，陸續在豬、牛、雞等經濟動物發現。IL-8在低濃度時可以趨化多種免疫細胞，包括單核球、巨噬細胞和淋巴細胞、嗜中性球等。

CD40配體(CD40 ligand,CD40L)是屬於腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族(superfamily)裡之一員，此種細胞素具有使腫瘤壞死與促進白血球細胞分化、增生、凋亡的功用。CD40L蛋白合成時為一穿膜蛋白(transmembrane protein)，以人類CD40L為例，蛋白共261個胺基酸，首先胺基端22個胺基酸為細胞內區域，接著24個胺基酸為穿膜區域，靠羧基端215個胺基酸序列為細胞外(extracellular,Exc)區域，Exc區域在羧基端具有一個TNF超家族蛋白均保留的 TNF同源(TNF homology,TNFh)區域。CD40L主要以穿膜蛋白型式存在活化的CD4⁺ T細胞表面，也存在CD8⁺ T細胞、嗜鹼性球(basophils)、嗜酸性球(eosinophils)、肥大細胞、自然殺手細胞、血小板、甚至在表現CD40的細胞表面也有發現。

CD40L的受體為CD40，分布於B細胞、樹突細胞，巨噬細胞等抗原呈現細胞(antigen presenting cells,APCs)表面。在生理上這些抗原呈現細胞可受到輔助性T細胞(T helper cells)表現的CD40L活化，促進表現第二類組織相容複合物(major histocompatibility complex class II,MHC-II)分子與B7分子以助抗原呈現。CD40L透過與標的細胞上的CD40結合而活化訊息傳遞路徑，除了上述促進抗原呈現的作用，CD40L在B細胞可促進B細胞增殖(proliferation)、免疫球蛋白的類型轉變(isotype switching)、抗體分泌、記憶性B細胞的分化或避免細胞凋亡；CD40L作用在巨噬細胞可加強其活化，促進其產生介白素-12(interleukin-12,IL-12)以活化第一型輔助性T細胞(T helper 1,Th1)或是分泌一些趨化素，或是促進一氧化氮(nitric oxide,NO)產生以提升巨噬細胞防衛微生物的能力；作用在樹突細胞可使其成熟活化，活化的樹突細胞除了表現大量MHC-II分子以助抗原呈現，還會分泌TNF-α以及IL-8、巨噬細胞發炎蛋白1α(macrophage inflammatory protein 1α,MIP-1α)等趨化素。

目前已有許多研究將CD40L應用在疫苗佐劑或是治療上，例如做為鴨B型肝炎病毒(duck hepatitis B virus,DHBV)疫苗(Gareset al.,Clin Vaccine Immunol 13,958-965)、人類免疫不全病毒(human immunodeficiency virus,HIV)DNA疫苗(Stoneet al. ,J Virol 80,1762-1772)的佐劑或是治療人類自體免疫性疾病(Howard & Miller,Autoimmunity 37,411-418)等。

介白素-2(interleukin-2,IL-2)被歸類在造血因子(hematopoietin)家族裡，這家族包括了一些與細胞生長有關 的賀爾蒙或其他細胞素等。IL-2的功能包括：調節T細胞的成熟和分化、刺激B細胞的增殖和抗體分泌、促進自然殺手細胞的毒殺能力、活化單核細胞和巨噬細胞等。IL-2也可以刺激T細胞與B細胞持續表現MHC，也可以刺激自然殺手細胞產生多種不同的細胞素，包括TNF-α、IFN-γ和顆粒單核球群落生成刺激因子(granulocyte/macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)等。研究顯示IL-2有抗腫瘤和提升疫苗的作用。

然而，本領域中仍然需要具較強活性的細胞素和趨化素。

本發明意外地發現，包含趨化素和連接至該趨化素的細胞素的融合蛋白，具有增進的細胞素活性和增進的趨化素活性。

因此，本發明提供一種融合蛋白，其包含一趨化素多肽，其係為一趨化素或其受體結合域；和連接至該趨化素多肽之一細胞素多肽，其係為一介白素、一TNF-超家族細胞素或其受體結合域；其中該趨化素多肽和該細胞素多肽具有共同的標的細胞，且該融合蛋白具有相較於該趨化素多肽的增進的趨化素活性，以及相較於該細胞素多肽的增進的細胞素活性。

根據本發明，該趨化素係為一CXC趨化素、CC趨化素、C趨化素和CX₃ C趨化素，較佳為CXC趨化素。根據本發明的具體實例，該趨化素可以是基質細胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1；SDF-1)或IL-8。

根據本發明，該細胞素多肽係為一介白素、一TNF-超家族細胞素或其受體結合域。在本發明的具體實例中，該細胞素多肽為IL-2、CD40配體或其受體結合域。

另一方面，本發明提供一種經分離的核酸分子，其係編碼本發明的融合蛋白。

又一方面，本發明提供一種表現載體，其係包含本發明的核酸分子。

本發明亦提供一種宿主細胞，其係包含本發明的核酸分子或本發明的表現載體。

本發明的各個具體實例的細節說明如後。本發明的其他特徵將會經由以下各個具體實例中的詳細說明和申請專利範圍而清楚呈現。

無須進一步的闡述，咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於前述說明即可利用本發明至最廣的程度。因此，可以理解以下的說明僅僅是作為例示說明的用，而非以任何方式限制其餘的揭露內容。

除非另有指明，所有在此處使用的技術性和科學性術語具有如同本發明所屬技藝中的通常技術者一般所瞭解的意義。

本文所使用的「一」乙詞，如未特別指明，係指至少一個(一個或一個以上)的數量。

本文所使用的「趨化素多肽」乙詞係指一多肽，其係為趨化素(chemokine)或其受體結合域(receptor binding domain)，其中該趨化素包括但不限於CXC趨化素、CC趨化素、C趨化素和CX₃ C趨化素。

本文所使用的「細胞素多肽」乙詞係指一多肽，其係為細胞素(cytokine)或其受體結合域，其中該細胞素包括但不限於介白素和TNF-超家族細胞素。

本文所使用的「趨化素活性」乙詞係指趨化素於生物體內所具備或可發揮的活性，包括但不限於趨化多種免疫細胞(包括單核球、巨噬細胞、T細胞、B細胞、自然殺手細胞、樹突細胞和嗜中性球等)。

本文所使用的「細胞素活性」乙詞係指細胞素於生物體內所具備或可發揮的活性，包括但不限於促進B細胞增殖、免疫球蛋白的類型轉變、抗體分泌；記憶性B細胞的分化或避免細胞凋亡；促進巨噬細胞分泌介白素-12以活化第一型輔助性T細胞或分泌趨化素；促進巨噬細胞產生一氧化氮以提升防衛微生物的能力；促進樹突細胞成熟活化；調節T細胞的成熟和分化；促進自然殺手細胞的毒殺能力、產生多種不同的細胞 素；活化單核細胞和巨噬細胞；和刺激T細胞與B細胞持續表現MHC等。

本發明提供一種融合蛋白，其包含一趨化素多肽，其係為一趨化素或其受體結合域；和連接至該趨化素多肽的一細胞素多肽，其係為一介白素、一TNF-超家族細胞素或其受體結合域；其中該趨化素多肽和該細胞素多肽具有共同的標的細胞，且該融合蛋白具有相較於該趨化素多肽更增進的趨化素活性，以及相較於該細胞素多肽更增進的細胞素活性。

在本發明的較佳具體實施例中，該趨化素多肽和該細胞素多肽係藉由肽連接子(peptide linker)連接。為了將兩種蛋白接合在一起並且還保有原來的構形與功能，可在兩蛋白的中間加上適當的連接子以降低兩蛋白折疊時的互相干擾。而這類連接子可為具有一定程度的彈性和親水性的彈性連接子(flexible linker)(例如，具有序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n 的連接子(通常n小於6))，或是具親水性的螺旋連接子(helical linker)(例如，具有序列(Glu-Ala-Ala-Ala-Lys)_n 的連接子(通常n小於6))。

在本發明一具體實施例中，該趨化素係為一CXC趨化素。在一特定實例中，該趨化素係為基質細胞衍生因子(SDF-1)。在另一特定實例中，該趨化素係為IL-8。

在本發明的部分具體實施例中，該趨化素多肽係具有選自下列的胺基酸序列之一：序列識別號NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18和其同源物(homolog)和類似物(analog)。

在本發明部分具體實施例中，該細胞素多肽係為IL-2、CD40配體(CD40 ligand；CD40L)或其受體結合域。

在本發明部分具體實施例中，該細胞素多肽係具有選自下列的胺基酸序列之一：序列識別號NO：20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和其同源物和類似物。

在本發明特定具體實施例中，本發明的融合蛋白係具有選自下列的胺基酸序列之一：序列識別號NO：40、42、44、46和48。

另一方面，本發明提供一種經分離的核酸分子，其係編碼 本發明的融合蛋白。

在本發明部分具體實施例中，該經分離的核酸分子係包含選自下列的編碼趨化素多肽的核苷酸序列之一：序列識別號NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17和其同源物和類似物。

在本發明部分具體實施例中，該經分離的核酸分子係包含選自下列的編碼細胞素多肽的核苷酸序列之一：序列識別號NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和其同源物和類似物。

在本發明特定具體實施例中，該經分離的核酸分子係具有選自下列序列之一：序列識別號NO：39、41、43、45和47。

又一方面，本發明提供一種表現載體，其係包含本發明的核酸分子。

本發明亦提供一種宿主細胞，其係包含本發明的核酸分子或本發明的表現載體。

以下實例僅作為說明，而非作為本發明的限制。

實例1：原核表現質體的構築

利用先前已構築雞SDF-1、IL-8、CD40L衍生蛋白和IL-2的表現質體(吳佩珊，國立中興大學獸醫微生物學研究所碩士論文2008，雞CD40L和趨化素的研究；Tsaiet al. ,Taiwan Vet J 31：38-45)做為模版，進行重組聚合酶鏈反應，其中雞CD40L(chCD40L)衍生蛋白包括CD40L的細胞外區域(extracellular domain of CD40L,CD40L_Exc )或TNF同源區域(TNF homology domain of CD40L,CD40L_TNFh )(參見圖1)。由此增幅SDF1CD40L_Exc 、SDF1CD40L_TNFh 、SDF1IL2、IL8CD40L_Exc 、IL8CD40L_TNFh 、IL8IL2等連接蛋白(conjugate protein)或融合蛋白(fusion protein)的基因序列。

方法簡述如下，根據各基因序列分別設計出兩對專一性引子對，第一對引子的正向引子帶有限制酵素Eco R I切位和融合蛋白位於前段的N-端基因序列，反向引子則帶有螺旋連接子和融合蛋白位於前段的C-端基因序列，此對引子可專一性 增幅出編碼融合蛋白前段與連接子的DNA片段；第二對引子的正向引子帶有螺旋連接子和融合蛋白位於後段的N-端基因序列，反向引子則帶有限制酵素Xho I切位和融合蛋白位於後段的C-端基因序列，此對引子則可專一性增幅出編碼連接子與融合蛋白後段的DNA片段；將這兩PCR產物做為模板，以第一對引子的正向引子與第二對引子的反向引子再做一次PCR，則兩個片段會因為螺旋連接子重疊的部分序列而達到連接的目的，所得的產物即為其間含有螺旋連接子的融合基因序列。將上述產物以限制酵素Eco R I與Xho I作用後，與經過Eco R I和Xho I作用過的pET載體(Novagen,Darmstad,Germany)以T4 DNA接合酶(Invitrogen)在16℃進行16小時接合作用，建立原核表現質體命名為pETSDF1CD40L_Exc 、pETSDF1CD40L_TNFh 、pETSDF1IL2、pETIL8CD40L_Exc 和pETIL8IL2。

實例2：重組蛋白表現

將構築好的原核表現質體轉形至E.coli 表現型菌株BL21(DE3)，以0.5 mM IPTG誘導重組蛋白表現，以離心的方式收取菌體去除培養液。所有的菌體接著以結合緩衝液(binding buffer)沖散，使用高壓細胞裂解儀(French Pressure Cell Press,Thermo IEC,Needham,Height,MA,USA)裂解菌體，高速離心的後水溶性的蛋白會位於上清液，以鎳離子親和管柱進行純化。不可溶蛋白則會位於離心後的底部團塊中，以8 M尿素處理此部分不可溶蛋白後，尿素會將蛋白質的折疊打開使其溶解於水溶液中，接著離心12000 rpm 30分鐘取其上清液進行透析，將尿素慢慢置換出來，使蛋白能再摺疊成原來的構形，最後將蛋白質溶解於磷酸鹽緩衝液(pH 7.3)與10%甘油當中，經0.22 μm濾膜過濾後，以BCA蛋白分析套組(Pierce,Rockford,IL,USA)測定蛋白濃度，儲存在-20℃。蛋白純化後經MALDI-TOF質譜儀分析鑑定為正確的融合蛋白，SDS-PAGE與西方墨點法(一級抗體為anti-His抗體，二級抗體為AP-接 合山羊抗小鼠IgG抗體，呈色劑為NBT/BCIP)分析顯示所表現雞重組融合蛋白IL8CD40L_Exc 、IL8IL2、SDF1CD40L_Exc 、SDF1CD40L_TNFh 和SDF1IL2等的分子量如預期大小，分別為52 kDa、44 kDa、38 kDa、44 kDa和26 kDa(參見圖2)。此外，亦製備純化單一蛋白做為對照，方法如前述(吳佩珊，國立中興大學獸醫微生物學研究所碩士論文2008，雞CD40L和

實例3：趨化活性試驗(ehemotactic activity assay)

評估趨化素(SDF-1或IL-8)與CD40L衍生蛋白或IL-2融合後的趨化活性，以Histopaque 1077(Sigma,Saint Louis,Mo,USA)分離周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)，以PBS沖洗兩次後，再以含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI 1640(Gibco,Grand Island,NY,USA)懸浮後加入融溶狀態0.6%洋菜膠，混合均勻，使最後洋菜膠的濃度為0.3%，接著取此混合液2 μl/well點在48孔盤的中央，放入冰箱五分鐘使洋菜膠凝固，而將細胞固定在膠的範圍內。接著每孔加入250 μl含有各濃度待測蛋白的培養液，於37℃培養隔夜後觀察。

依據各蛋白發揮趨化活性的最低有效濃度(minimal effective concentration,MEC)，MEC值愈小即趨化活性愈佳，IL-8無論融合CD40L衍生蛋白或IL-2(IL8CD40L_Exc 或IL8IL2)均可明顯降低MEC值，提高趨化活性，其融合蛋白趨化活性比IL-8的更好(參見表1)；SDF-1無論融合CD40L衍生蛋白或IL-2(SDF1CD40L_Exc 或SDF1IL2)均可降低MEC值，提高趨化活性，其融合蛋白之趨化活性比SDF-1更好(參見表1)。各蛋白濃度愈高，趨化效果愈佳，在相同濃度下，IL8CD40L_Exc (趨化程度最大)或IL8IL2(趨化程度次的)趨化細胞程度明顯大於IL-8單一蛋白(參見圖4)；在相同濃度下，SDF1CD40L_Exc 、SDF1CD40L_TNFh 、或SDF1IL2趨化細胞程度明顯大於混合液或SDF-1單一蛋白(參見圖5)。

表1：趨化活性的最低有效濃度(MEC)

實例4：CD40L衍生蛋白活化巨噬細胞產生一氧化氮(nitric oxide,NO)活性分析

基於CD40L可活化巨噬細胞產生NO的特性，評估趨化素與CD40L衍生蛋白融合後的CD40L活性。分離周邊血液單核細胞，以PBS沖洗兩次後，以含10% FBS的RPMI 1640外加125 ng/ml雞IL-2和4 μg/ml LPS調整細胞至2×10⁶ /ml，24孔盤中各放入1 ml，兩天後外加新鮮培養液1 ml(同樣添加125 ng/ml雞IL-2和4 μg/ml LPS)，五天後完成刺激，單核細胞會分化成巨噬細胞。以PBS沖洗三次去除懸浮細胞後加入不同濃度的CD40L衍生蛋白或融合蛋白，並以培養液、載體表現的標籤蛋白和加入4 μg/ml LPS的培養液分別做為陰性和陽性對照組，培養48小時後取50 μl利用商業可獲得的套組(Griess Reagent System；Promega,Madison,WI,USA)測定培養液中亞硝酸(由NO轉化)濃度。

融合蛋白IL8CD40L_Exc 與只加入CD40L_Exc 的組別相比，有顯著較好的活性(5-30 nM,p <0.05；180 nM,p <0.01)。融合蛋白SDF1CD40L_Exc 的效果顯著較單一CD40L_Exc 蛋白更好(5 nM,p <0.01；30-180 nM,p <0.05)。而在SDF-1和CD40L_TNFh 的組合亦有類似結果，融合蛋白SDF1CD40L_TNFh 的效果也是顯著比單一蛋白(CD40L_TNFh )還要好(5 nM and 180 nM,p <0.01；0.8 nM and 30 nM,p <0.05)(參見圖6)。

實例5：IL2融合蛋白促進淋巴球增生的活性

基於IL-2可促進淋巴球增生的活性，評估趨化素與IL-2融合後的IL-2活性。利用細胞內酸性去磷酸酶(acid phosphatase)的活性與細胞數成正比，加入呈色受質對硝基磷酸苯酯(p-nitrophenyl phosphate,pNpp)。分離周邊血液單核細胞後，以含10% FBS的RPMI 1640培養液加上不同濃度的蛋白、10 μg/ml ConA(陽性對照組)、或10 nM標籤蛋白(陰性對照組)，培養於96孔盤當中，每孔細胞量為2×10⁵ ，培養三天後離心3000 rpm 10分鐘，接著去掉培養液，每孔加入100 μl的呈色試劑(0.1 M sodium acetate,pH 5.5,0.1% Triton X-100,and 10 mM pNpp)，37℃培養兩個小時，接著加入10 μl 1 N NaOH終止反應，以波長405 nm讀取吸光值並計算增生指數(stimulation index,SI)，其中SI=試驗組別的OD/僅以RPMI 1640培養的OD。結果顯示融合蛋白SDF1IL2於0.625-160 nM時促進增生的活性均顯著高於IL-2(0.625 nM,p <0.05；1.25-80 nM,p <0.001；160 nM,p <0.01)，此結果顯示融合趨化素後IL-2活性顯著提高(參見圖7)。

實例6：融合蛋白作為禽類新城病(Newcastle disease,ND)疫苗佐劑促進疫苗引發的免疫反應

以IL-2融合蛋白作為禽類新城病(Newcastle disease,ND)疫苗佐劑(vaccine adjuvant)施用於雞隻，於施用疫苗後抽取雞血，培養淋巴球並加入去活性(inactivated)新城病毒(Newcastle disease virus,NDV)為抗原，進行抗原再刺激試驗(antigen re-stimulation assay)，另於培養液加入10 μg/ml ConA者為陽性對照組，比較各組雞隻可識別NDV抗原的記憶淋巴細胞(memory lymphocytes)增生情形，決定增生情形的方法與實例5所描述者相同，增生百分比=(試驗組別的OD/僅以RPMI 1640培養的OD)×100%。與僅接受ND疫苗的組別(ND vaccine)相較，接受IL-2融合蛋白為ND疫苗佐劑的組別(SDF1IL2+ND vaccine)可顯著(p <0.05)提升抗 原再刺激時具抗原識別特異性(antigen-specific)的記憶淋巴細胞增生活性(參見圖8)。

實例7：融合蛋白作為禽類傳染性支氣管炎(infectious bronchitis,IB)疫苗佐劑促進疫苗引發的免疫反應

以IL-2融合蛋白或CD40L_Exc 融合蛋白作為禽類傳染性支氣管炎(infectious bronchitis,IB)疫苗佐劑，於施用疫苗後抽取雞血，培養淋巴細胞並加入去活性傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)為抗原，進行抗原再刺激試驗，比較各組雞隻可識別IBV抗原的記憶淋巴細胞增生情形，決定增生情形的的方法與實例5所描述者相同，增生百分比=(試驗組別的OD/僅以RPMI 1640培養的OD)×100%。與僅接受IB疫苗的組別(IB vaccine)相較，接受IL-2融合蛋白為IB疫苗佐劑的組別(SDF1IL2+IB vaccine)(p <0.01)或接受CD40L_Exc 融合蛋白為IB疫苗佐劑的組別(SDF1CD40L_Exc +IB vaccine)(p <0.05)均可顯著提升抗原再刺激時具抗原識別特異性的記憶淋巴細胞增生活性(參見圖9)。

圖1為雞CD40L和其衍生蛋白CD40L_Exc 和CD40L_TNFh 的示意圖。

圖2顯示所表現雞重組融合蛋白的SDS-PAGE和西方墨點法分析結果。第1道(lane 1)：IL8CD40L_Exc ，預期大小為52 kDa；第2道：IL8IL2，預期大小為44 kDa；第3道：SDF1CD40L_Exc ，預期大小為38 kDa；第4道：SDF1CD40L_TNFh ，預期大小為44 kDa；和第5道：SDF1IL2，預期大小為26 kDa。

圖3顯示純化單一蛋白的SDS-PAGE和西方墨點法分析結果。第1道：標籤蛋白，預期大小為21 kDa；第2道：IL-8，預期大小為13 kDa；第3道：SDF-1，預期大小為11 kDa；第4道：IL-2，預期大小為32 kDa；第5道：CD40L_Exc ，預期大小為42 kDa；和第6道：CD40L_TNFh ，預期大小為33 kDa。

圖4顯示IL-8衍生蛋白趨化PBMCs的情形。細胞受到膠體外的趨化素吸引，會自中心膠體游向四周，細胞在低放大倍率下呈現雲霧狀，膠體周圍細胞愈多代表趨化細胞程度愈大。在2 μM下，IL8CD40L_Exc 或IL8IL2趨化細胞程度明顯大於IL-8單一蛋白。

圖5顯示SDF-1衍生蛋白趨化PBMCs的情形。在2 μM下，SDF1CD40L_Exc 、SDF1CD40L_TNFh 、或SDF1IL2趨化細胞程度明顯大於單一SDF-1蛋白。

圖6顯示CD40L衍生蛋白活化巨噬細胞產生NO的活性。A：CD40L_Exc ；B：CD40L_TNFh ；C：IL8CD40L_Exc ；D：：SDF1CD40L_Exc ；E：：SDF1CD40L_TNFh ；和對照組：以LPS(4 μg/ml)做為陽性對照組，標籤蛋白(250 nM)和培養液做為陰性對照組。^* 表示與個別單一蛋白相比有顯著較高活性(^* p <0.05,^** p <0.01)。

圖7顯示IL-2融合蛋白促進淋巴球增生試驗的結果。增生指數(stimulation index,SI)=試驗組別的OD/僅以RPMI 1640培養的OD。融合蛋白SDF1IL2濃度在0.625-160 nM時，其SI值顯著高於單獨IL-2組別(^* p <0.05,^** p <0.01,^*** p <0.001)。

圖8顯示IL-2融合蛋白作為新城病(ND)疫苗佐劑，可顯著促進細胞免疫反應。施用IL-2融合蛋白佐劑與ND疫苗組別雞隻，於新城病毒(NDV)抗原再刺激時，其記憶淋巴球增生情形顯著高於ND疫苗組。

圖9顯示融合蛋白作為傳染性支氣管炎(IB)疫苗佐劑，可顯著促進細胞免疫反應。進行傳染性支氣管炎病毒(IBV)抗原再刺激試驗，施用IL-2融合蛋白佐劑與ND疫苗組別雞隻，其記憶淋巴球增生情形顯著(p <0.01)高於IB疫苗組；施用CD40L_Exc 融合蛋白佐劑與ND疫苗組別雞隻，其記憶淋巴球增生情形亦顯著(p <0.05)高於IB疫苗組。

<110> 國立中興大學

<120> 趨化素-細胞素融合蛋白和其應用

<130> IC0333/CHI0001TW

<160> 48

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 263

<212> DNA

<213> Gallus gallus

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<212> PRT

<213> Gallus gallus

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<212> DNA

<213> Sus scrofa

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<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 4

<210> 5

<211> 240

<212> DNA

<213> Bos taurus

<400> 5

<210> 6

<211> 79

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 6

<210> 7

<211> 234

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 77

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 270

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<400> 9

<210> 10

<211> 89

<212> PRT

<213> Gallus gallus

<400> 10

<210> 11

<211> 351

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 11

<210> 12

<211> 116

<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 12

<210> 13

<211> 270

<212> DNA

<213> Bos taurus

<400> 13

<210> 14

<211> 89

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 14

<210> 15

<211> 270

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 89

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 270

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 17

<210> 18

<211> 89

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

<210> 19

<211> 819

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<400> 19

<210> 20

<211> 272

<212> PRT

<213> Gallus gallus

<400> 20

<210> 21

<211> 786

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 21

<210> 22

<211> 261

<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 22

<210> 23

<211> 786

<212> DNA

<213> Bos taurus

<400> 23

<210> 24

<211> 261

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 24

<210> 25

<211> 786

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 261

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 783

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 27

<210> 28

<211> 260

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 28

<210> 29

<211> 429

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<400> 29

<210> 30

<211> 142

<212> PRT

<213> Gallus gallus

<400> 30

<210> 31

<211> 465

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 31

<210> 32

<211> 154

<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 32

<210> 33

<211> 405

<212> DNA

<213> Bos taurus

<400> 33

<210> 34

<211> 135

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 34

<210> 35

<211> 462

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 153

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 500

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 37

<210> 38

<211> 169

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 38

<210> 39

<211> 672

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白之核酸序列

<400> 39

<210> 40

<211> 223

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白之胺基酸序列

<400> 40

<210> 41

<211> 990

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白之核酸序列

<400> 41

<210> 42

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白之胺基酸序列

<400> 42

<210> 43

<211> 615

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白之核酸序列

<400> 43

<210> 44

<211> 204

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白之胺基酸序列

<400> 44

<210> 45

<211> 933

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白之核酸序列

<400> 45

<210> 46

<211> 309

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白之胺基酸序列

<400> 46

<210> 47

<211> 666

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白之核酸序列

<400> 47

<210> 48

<211> 220

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白之胺基酸序列

<400> 48

Claims (17)

1. 一種融合蛋白，其係由趨化素多肽、細胞素多肽及肽連接子所組成，其中：該趨化素多肽和該細胞素多肽係藉由該肽連接子連接；該趨化素多肽為一趨化素或其受體結合域；且該細胞素多肽為一介白素、一TNF-超家族細胞素或其受體結合域；其中該趨化素多肽和該細胞素多肽具有共同的標的細胞，且該融合蛋白具有相較於該趨化素多肽的增進的趨化素活性，以及相較於該細胞素多肽的增進的細胞素活性；且其中該肽連接子為一螺旋連接子。
2. 根據申請專利範圍第1項的融合蛋白，其中該趨化素係選自於由CXC趨化素、CC趨化素、C趨化素和CX₃ C趨化素所組成的群。
3. 根據申請專利範圍第1項的融合蛋白，其中該螺旋連接子具有以下序列：(Glu-Ala-Ala-Ala-Lys)_n ，n小於6。
4. 根據申請專利範圍第2項的融合蛋白，其中該趨化素係為基質細胞衍生因子(SDF-1)或介白素-8(IL-8)。
5. 根據申請專利範圍第1項的融合蛋白，其中該趨化素多肽係具有選自下列的胺基酸序列之一：序列識別號NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18和其同源物和類似物。
6. 根據申請專利範圍第1項的融合蛋白，其中該細胞素多肽係為IL-2、CD40配體或其受體結合域。
7. 根據申請專利範圍第1項的融合蛋白，其中該細胞素多肽係具有選自下列的胺基酸序列之一：序列識別號NO：20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和其同源物和類似物。
8. 根據申請專利範圍第1項的融合蛋白，其具有選自下列的胺基酸序列之一：序列識別號NO：40、42、44、46和48。
9. 一種經分離的核酸分子，其係編碼如申請專利範圍第1-4 項任一項的融合蛋白。
10. 根據申請專利範圍第9項的核酸分子，其係包含選自下列的編碼趨化素多肽的核苷酸序列之一：序列識別號NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17和其同源物和類似物。
11. 根據申請專利範圍第9項的核酸分子，其係包含選自下列的編碼細胞素多肽的核苷酸序列之一：序列識別號NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和其同源物和類似物。
12. 根據申請專利範圍第10項的核酸分子，其係包含選自下列序列之一：序列識別號NO：39、41、43、45和47。
13. 一種表現載體，其係包含根據申請專利範圍第9-12項中任一項的核酸分子。
14. 一種宿主細胞，其係包含根據申請專利範圍第9-12項中任一項的核酸分子。
15. 一種宿主細胞，其係包含根據申請專利範圍第13項的表現載體。
16. 根據申請專利範圍第1或3項的融合蛋白，其中該趨化素係為SDF-1，該細胞素多肽係為IL-2。
17. 根據申請專利範圍第1或3項的融合蛋白，其中該趨化素係為SDF-1，該細胞素多肽係為CD40L、CD40L_Exc 或CD40L_TNFh 。