MX2012013899A - Proteinas de fusion vstm3 dimericas y composiciones y metodos relacionados. - Google Patents

Abstract

Se describen las composiciones y los métodos relacionados a las proteínas diméricas solubles. Las proteínas diméricas comprenden primera y segunda funciones de polipéptido enlazadas vía un dominio de dimerización, cada fusión de polipéptido comprende primero y segundo dominios monoméricos correspondientes a una citocina o a un dominio extracelular de un receptor de la superficie celular. Los dominios de monómero pueden ser colocados amino-terminales y carboxilo-terminales al dominio de dimerización. Alternativamente, los dominios de monómero pueden ser colocados en Tándem, ya sea carboxilo-terminales o amino-terminales al dominio de dimerización. Las proteínas diméricas son útiles en los métodos para la terapia, el diagnóstico y la investigación.

Description

PROTEINAS DE Y METODOS Los receptores de la superficie celular son mediadores de una variedad de efectos biológicos a través del enlace de sus ligandos cognados. Los receptores están típicamente compuestos de una o más| proteínas de membrana integrales que se enlazan al ligando, jtales como una citocina o un contra-receptor, con alta afinidad y transduce este evento de enlace la célula través de porciones citoplásmicas de ciertas subunidades receptoras. Los receptores de la superficie celular han sido agrupados en varias clases con base en las similitudes en sus dominios extracelulares de enlace al ligando.

La importancia fisiológica dé los receptores de la i i superficie celular es e emplificada jpor el papel de los receptores coestimuladores en la mediación de la función de las células inmunitarias . Las céluleLS T son normalmente activadas por el acoplamiento del receptor del antígeno de la célula T (TCR, por sus siglas en inglss) por las moléculas MHC más los péptidos extraños presentados por las células presentadoras de antígeno (APCs, por sus siglas en inglés) . Las APCs profesionales también expresan un núcleo de I moléculas co-estimuladores que se acoplan a otros receptores REF.237391 sobre las células T y contribuyen a | la activación. Un medio probado de inhibir la activación de las células T es la interferencia con el acoplamiento don estas moléculas co- í estimuladoras. De manera más notable1, la CTLA4-Ig puede ser utilizada para prevenir las señales cp-estimuladoras críticas a través de las moléculas CD28, con lo cual se interfiere con ciertas respuestas de las células T. j I Otras moléculas co-estimuladoras han sido identificadas y éstas tienden a', ser importantes en situaciones especializadas donde sus ¡ estructuras contrarias son expresadas . Una molécula de este ¡ tipo cuya contribución ha sido solo recientemente apreciada es el receptor co-estimulador CD226. Las estructuras contrarias para CD226 son i las proteínas PVR de la familia de la nectina (CD155) y la Nectina-2 (CD112) , que son ampliamente^ expresadas en tejidos típicamente infiltrados por linfocitos en trastornos auto-inmunitarios o auto- inflamatorios incluyendo el epitelio, el endotelio, los sinoviocitos , y células del Sistema Nervioso ! Central (CNS, por sus siglas en | inglés) . De manera importante, las señales a través de GD226 han mostrado que son críticas para la activación dé las células T en situaciones donde las células T están siendo estimuladas por las APC's no profesionales (ver Gilfillan et al., J. Exp. Med. 205:2965-2973, 2008; Iguchi-Manaka| et al., J. Exp. Med. 205:2959-2964, 2008), que podrían ¡ incluir trastornos i autoinmunitarios donde las células T 'están siendo activadas y están provocando daño en los tejidos inflamatorios. Además, i un polimorfismo en CD226 ha sido recientemente vinculado al riesgo de desarrollar un número \ de condiciones auto-inmunitarias incluyendo la esclerosis múltiple (MS, por sus I siglas en inglés) , diabetes tipo I,i enfermedad de Grave y i granulomatosis de Wegener. (Ver Consorcio Internacional sobre Genética de Esclerosis Múltiple (International Múltiple Sclerosis Genetics Consortium) (IMSGC) , Genes Immun. 10: 11-14, 2009; Hafler et al., Genes Immun! 10:5-10, 2009; Maier y i Hafler, Immunol. Rev. 229:322-336, 2009; Mait et al., "Non-synonymous variant (Gly307Ser) in CD226 is associated with susceptibility to múltiple autoimmune ¡ diseases , " Rheumatology (Oxford) (Marzo 24, 2010 [Epub ahead of print] ) . ) Por lo i tanto, existe una sana explicación para interferir con las i señales mediadas por CD226 en la función de las células inmunitarias . ¡ VSTM3 (también denominada^ como B7R1 en la Publicación Internacional del PCT No¡. WO 06/124667) es un miembro inhibitorio de la familia CD28¡ que ha mostrado que se I enlaza también a PVR y a la NectinaL2, las mismas contra-estructuras que CD226. De hecho, VSTí{l3 y CD226 compiten de í manera cruzada por el enlace a PVR y a la Nectina-2, indicando que ésta se enlazan en regiones traslapadas sino es que idénticas, aunque VSTM3 parece enlazarse con una afinidad i i í I i algo más alta.

Las formas solubles de muchos receptores de la superficie celular son conocidas. Estos receptores solubles corresponden a los dominios de enlace al ligando de sus contrapartes de la superficie celular. Por ejemplo, los receptores de citocina solubles de origen natural inhiben las respuestas de citocina, y actúan como proteínas de transporte. (Ver, por ejemplo, Aggarwal y Puri, "Common and Uncommon Features of Cytokines and iCytokiea Receptors : An i Overview, " en Aggarwal y Puri, eds., '^ Human atocinas : Their i Role in Disease and Therapy, Blackwell Science, 1995, 3-24.) Además, se ha encontrado que la dimerización de polipéptidos receptores solubles a través del uso de proteínas de fusión, puede mejorar las propiedades de enlace de estos receptores solubles, de modo que éstos se 1 vuelven antagonistas terapéuticamente útiles de sus ligandós cognados. Típicas de i tales fusiones diméricas están I las fusiones de inmunoglobulina. (Ver, por ejemplo, j Sledziewski et al., i Patentes de los Estados Unidos Nos. 51, 155,027 y 5,567,584; Jacobs et al., Patente de los Estadosi Unidos No. 5,605,690; Wallner et al., Patente de los Estados 'Unidos No. 5,914, 111; y Ashkenazi y Chamow, Curr. Opin. Inmuno1. 9: 195-200, 1997.) Por ejemplo, VSTM3 soluble , ha mostrado que es terapéuticamente eficaz en modelos animales de trastornos mediados por células T. En particular, se ha mostrado que los WO 06/124667.) Un tetrámero soluble de VST 3-VASP ha mostrado también que es eficaz en el modelo CIA. (Ver id.) Una variedad de efectos biológicos, incluyendo el crecimiento y la diferenciación de muchos tipos celulares, son también mediados por proteínas solubles pequeñas, I colectivamente denominadas como citocinas (ver por ejemplo, Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59:783, 1990; osmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311, 1991; Paul y Seder, Cell 76:241, 1994).

Las proteínas que constituyen el grupó de citocinas incluyen i las interleucinas , interferones , factíores estimuladores de ¡ I colonias, factores de necrosis tumorál, y otras moléculas regulatorias .

Las actividades in vivo demostradas de los receptores de la superficie celular y las citocinas, ilustran el potencial clínico de, y la necesidad para, moléculas que son mediadoras de las actividades biológicas de los receptores y las citocinas. Por ejemplo, las actividades demostradas in vivo de los receptores pro- inflamatorios y las citocinas, incluyendo las actividades de los receptores co-estimuladores en la mediación de las respuestas de células inmunitarias , ilustran el enorme potencial clínico de y la necesidad para, los antagonistas de moléculas pro-inflamatorias. Existe particularmente una necesidad para fusiones solubles de tales receptores de la superficie celular y citocinas que tengan actividad mejorada con relación a los formatos de proteínas ¡de fusión conocidas. La presente invención, como se describe en la presente, cumple éstas y otras necesidades. funcional o fragmento del mismo; Ll j es un primer ligador polipeptídico; D es un dominio de d'imerización; L2 es un segundo ligador polipeptídico; y P2 es (i) un dominio extracelular de un segundo receptor de la superficie celular o una variante funcional o fragmento [del mismo, o (ii) una segunda citocina o una variante o fragmento funcional de la I i misma. En un aspecto relacionado, la presente invención I I proporciona una proteína dimérica que ¡comprende una primera I ? fusión del polipéptido soluble y una segunda fusión del polipéptido soluble, donde cada una de primera y segunda i fusiones de polipéptido soluble comprenden las fórmulas Pl- L1-D1-L2-P2 o P2-L2-P1-L1-D anteriores. j En ciertas modalidades i de una fusión del I polipéptido soluble o proteína dimérica como se describió anteriormente, donde Pl es el dominio ¡ extracelular del primer i receptor de la superficie celular o una variante o fragmento I funcional del mismo y/o P2 es el dominio extracelular del i segundo receptor de la superficie célular o la variante o I fragmento funcional del mismo, el primer receptor de la I superficie celular y/o el segundo receptor de la superficie i celular son individualmente seleccionados del grupo que consiste de 4-1BB; el Receptor de] ACTH; Receptores de Activina; BLTR (El Receptor de Leucot'rieno B4) ; Receptor de BMP; Receptor de C3a; Receptor de G5a; CCR1; CCR2 ; CCR3 ; CCR4; CCR5; CCR6 ; CCR7 ; CCR8 ; CCR9 ; C¡D19; CD22; CD27; CD28; I CD30; CD40; CD70; CD80; CD86; CTLA-4; CD226; VSTM3 (B7R1) ; i CD112; CD155; B7H6 ; NKp30; ICAM; VLA-4- VCAM; Receptor de CT-1; CX3CR1; CXCR1 ; CXCR2 ; CXCR3 ; CXCR4 ; i CXCR5 ; D6 ; DARC; DcR3 ; í DR4; DR5; DcRl ; DcR2 ; ECRF3 ; Fas ; ¡ Receptores de fMLP; I Receptor de G-CSF; Receptor de GIT;¡ Receptor de GM-CSF; I Receptor de la Hormona del Crecimiento!; HVEM; BTLA; Receptor i de Interferón-a; Receptor de Interferón-ß ; Receptor de i Interferón-?; Receptor Tipo I de IL-li; Receptor Tipo II de IL-1; Receptor de IL-10 Receptor de IL-11; Receptor de IL-12; Receptor de IL-13; Receptor de ÍL-15; Receptor de IL-16 ? (CD4); Receptor A de IL-17; Receptor^ B de IL-17; Receptor C i de IL-17; Receptor D de IL-17; Receptor E de IL-17; Receptor i de IL-18; Receptor de IL-2; Receptor de IL-3; Receptor de IL-4; Receptor de IL-5; Receptor de IL-6; Receptor de IL-7; Receptor de IL-9; Receptor A de IL-2Q; Receptor B de IL-20; i Receptor de IL-21; Receptor A de IL-22; Receptor B de IL-22; Receptor A de IL-28; Receptor A de I -27 ; Receptor A de IL-31; BCMA; TACI ; Receptor de BAFF ;j Receptor CD72 de la Semaforina Inmunorregulatoria; GPCR djel Herpesvirus Asociado I al Sarcoma de Kaposi; Receptor de Liipoxina A4 ; Receptor de i Linfotoxina ß; Receptores del Factor de Crecimiento i Lispfosfolipídico; Neurocinina 1; Receptores de Opioide µ, d, i y para Endorfinas; Receptor de Oncqstatina M; Receptor de Osteopontina; Osteoprotegerina; 0x40; los Receptores de PACAP í y VIP; Receptores de PAF; Poxvirus; Homólogos del Receptor de i i IFNa/ß; Homólogos del Receptor de IFNyjde Poxvirus; Homólogos del Receptor de IL-?ß de Poxvirus; Homólogos del Receptor Acoplado a la Proteína G Enlazado a la Membrana de Poxvirus; i Proteínas de Enlace a la Quimiociha Secretada por el i Poxvirus; Homólogos del Receptor de TN1† de Poxvirus; Receptor I de Prolactina; RA K; Receptor de RON; Receptor de SCF; Receptores de Somatostatina; T1/ST2; Receptores de TGF-beta; Receptores de TNF (por ejemplo, p60 p80) ; TNFRSF19; TPO Receptor; US28; XCRl; Receptor de Er opoyetina; Receptor de la Hormona del Crecimiento; Recepto del factor inhibitorio de Leucemia; y Receptor de C-kit. Do e Pl y P2 son ambos un dominio extracelular de un receptor la superficie celular o una variante o fragmento funcional ¡del mismo, el primero y segundo receptores de la superficie ¡celular pueden ser los í mismos o diferentes.

En otras modalidades, donde Pl es la primera i citocina o la variante o el fragmentó funcional de la misma i y/o P2 es la segunda citocina o la variante o el fragmento funcional de la misma, la primera citocina y/o las segunda i citocina son individualmente seleccionadas del grupo que consiste de a-MSH; 9E3/cCAF; ACTH; Activina; AK155; Angiostatina; Apo2L/TRAIL ; APRIL; BAFF (BLys) ; Ligando de BLR1/BCA-1/BLC/CXCL13; Familia de i BMP; BRAK; Péptido relacionado al Gen de la Calcitonina (CGRP, por sus siglas en inglés) ; Quimiocina CC del Virus del Molusco Contagioso; I CCL27; CCL28; CD100/Sema4D ; Ligando de¡CD27; Ligando de CD30; i Ligando de CD40; CKp8 -1/MPIF-1/CCL23 ; ¡ CLF/CLC; CSF-1; CT-1; í CTAP-III, TG, y NAP-2//CXCL7 ; CXCL16 ; Defensinas; ELC/MIP- I 3p/Exodus-3/CCL19; ENA-78/CXCL5 ; Endorfinas; Endostatina; Eotaxina 2/MPIF-2/CCL24 ; Eritropoyetina; Exodus-l/LARC/MIP-3a (SCYA 20) ; Ligando de Fas; Ligando de Flt-3; fMLP ; Fractalcina/CX3CL1 ; G-CSF; GCP-2/CXCL6 ; GM-CSF; Hormona del Crecimiento; HCC-1/CCL14; HCC-4/CCL16; Caja 1 del i i Grupo de Alta Movilidad (HMGB1, porj sus siglas en inglés); Péptido Antimicrobiano LL-37 de Catelicidina Humana; I-309/CCL1; Ligandos de IFNoc, IFN , e IFNco; IFNy; IL-lot; IL-?ß; IL-10; IL-11; IL-12; IL-13; IL-15; ILj-16; IL-17A; IL-17B; IL-17C; IL-17D; IL-17E; IL-17F; IL-18; IL-IRa; IL-2 ; IL-27; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8/CXCL8; IL-9; IP- 10/CXCL10 ; IL-19; IL-20; IL-21; IL-22; IL-23; IL-24; IL-26; IL-31; Factor de Crecimiento de Queratinocitos ; Ligando de IL-6 relacionado a SHV; Leptina; Leucotactina 1/HCC-2/MIP-15/CCL15; Leucotrieno B4 ; LIGHT; Lipoxina; Linfotactina/XCLl ; Linfotoxina a ß Factores de Crecimiento Lisofosfolipídicos ; Quimiocina Derivada de Macrófagos; Proteína Estimuladora de Macrófago (j MSP); MCP-1/CCL2 , MCP-2/CCL8, MCP-3/CCL7, MCP-4/CCL13 y MCP-5/CCL12; Metoxiestradiol; MGSA/GRO/CXCL1 , CXCL2 , CXCL3 ; MIF; MIG/CXCL9; MIP-la/CCL3, ; ???-??/MRP- 2/CCF18/CCL9/10; Mu C10/CCL6; M; Osteopontina; Homólogo de IL-10 del Parapoxvirus (Virus Orf) ; PARC/DC-CCKl/AMAC-l/CCL18 ; PDGF-A; PDGF-B; PDGF-C; PDGF-D; Factor Activador de Plaquetas; Factor 4 de Plaquetas 4/CXCL4; I Factores de Crecimiento de Poxvirus Relacionados al Factor de Crecimiento Epidérmico; Proteínas de Control de Complemento Secretadas por el Poxvirus; Homólogos del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular de Poxvirus (VEGF, por sus siglas en inglés) del Virus Orf; Prolactina; Ligando RANK; RANTES/CCL5; S100A12; SDF-1/CXCL12 | SERP-1, una Serpina Poxviral Secretada; SLC (6Ckine) /Exodus-2/TCA-4/CCL21; Somatostatina; Factor de Células Madre; Sustancia P; TARC/CCL17; TCA3/CCL1 de Ratóri; TECK/CCL25; TGFP; Trombopoyetina; TNFa; TSG-6; TWEAK; Semaforina del Virus de la Vaccinia; vCXC-1 y vCXC-2; VEGF; VIP y PACAP; y Variantes Virales de IL-10. Pl y P2 son amb'os una citocina o una variante o fragmento funcional de la misma, la primera y la segunda citocinas pueden ser las mismas o diferentes.

En ciertas modalidades, cada uno de Pl y P2 es un dominio extracelular de VSTM3 (B7R1) , o una variante o fragmento funcional del mismo. Por ejemplo, en variaciones particulares de una fusión del polipéptido soluble que tiene la fórmula P1-L1-D-L2-P2 o P2-L2-P1-L1-D como se describió anteriormente, Pl es un primer polipéptido que tiene al menos de la SEQ ID NO: 2; donde la fusión del polipéptido es capaz de enlazarse específicamente al dominio extracelular de CD155 (residuos de aminoácidos 28-343 de la SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, al menos uno de Pl y P2 tiene 100% de identidad con los residuos de 25-141 de la SEQ ID NO: 2. En otras variaciones, de Pl y P2 incluye un residuo no de cisteína, tal coimo la tirosina, en la I posición de aminoácido correspondiente al residuo 69 de la SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, en modalidades específicas, al menos uno de Pl y P2 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en los residuos 23-139 de lai SEQ ID NO: 18. i Los dominios de dimerizacion particularmente i adecuados para el uso de acuerdo con una fusión del i polipéptido o proteína diméricaj como se describió i anteriormente, incluyen las regiones constantes de cadena I pesada de inmunoglobulina. Por ejemplo, en variaciones específicas, el dominio de dimerizacion D es un fragmento Fe, I tal como un fragmento Fe de ?? humano .1 i En algunas modalidades ¡ de una fusión del i polipéptido o proteína dimérica ¡ como se describió anteriormente, el ligador Ll consiste de 15 a 32 residuos de aminoácidos, donde de 1 a 8 (por ejemplo, dos) de estos ¡ i residuos, son residuos de cisteína. En variaciones particulares, Ll comprende una región de bisagra de i inmunoglobulina o una variante de la ¡misma. Por ejemplo, en i una modalidad específica, Ll comprende una variante de í bisagra de inmunoglobulina (por ejemplo, una variante de ¡ bisagra de ?? humana) en donde el residuo de cisteína que corresponde al residuo Eu 220 es remplazado por serina.

Los ligadores de L2 particularmente adecuados para el uso de acuerdo con una fusión del 1polipéptido o protema dimérica como se describió anteriormente, incluyen los i ligadores que comprenden una pluralidad de residuos de glicina y que comprenden opcionalmentie al menos un residuo de i serina. Por ejemplo, en una modalidad específica de una fusión del polipéptido que comprendé la fórmula P1-L1-D-L2- i P2 , o una proteína dimérica que comprende la primera y la í segunda de tales fusiones del polipéptido, L2 comprende la í secuencia de aminoácidos mostrada en ¡ la SEQ ID NO: 25. En una modalidad específica de una fusión del polipéptido que i comprende la fórmula P2-L2-P1-L1-D, o una proteína dimérica que comprende primera y segunda cié tales fusiones del polipéptido, L2 comprende la fórmula i [Gly-Gly-Gly-Ser] n (SEQ I I ID NO: 26) , en donde n es un número entero de 3 a 5, inclusive.

I En variaciones específicas de una fusión del polipéptido que comprende la fórmula ! P1-L1-D-L2-P2 o P2-L2-Pl-Ll-D y en la cual cada uno de Pl y P2 es un dominio extracelular de VSTM3 o una variante! o fragmento funcional del mismo, la fusión del polipéptido ¡comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la secuencia de aminoácidos mostrada en los residuos 93 de la SEQ ID NO: 18 y (b) la secuencia de aminoácidos m'pstrada en los residuos i 23-508 ó 23-507 de la SEQ ID NO:20. ' De manera similar, en variaciones específicas de una proteína dimérica de acuerdo i con la presente invención, cada una d'e la primera y segunda fusión del polipéptido comprende una ¡secuencia de aminoácidos seleccionada de (a) la secuencia de ¡ aminoácidos mostrada en i los residuos 23-493 de la SEQ ID NO: ,18 y (b) la secuencia de i aminoácidos mostrada en los residuos 23-508 ó 23-507 de la i SEQ ID NO: 20.

En otro aspecto más, presente invención proporciona un polinucleótido que codifica para una fusión i del polipéptido como se describió anteriormente. En un aspecto relacionado, la presente i .nivención proporciona un vector que comprende tal polinucleótido. Por ejemplo, en I algunas modalidades, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende los siguientes elementos I operablemente enlazados: un promotor de la transcripción; un segmento de ADN que codifica para unaj fusión del polipéptido i como se describió anteriormente; y ¡ un terminador de la transcripción.

En otros aspectos relacionados, la presente invención proporciona las células cultivadas que comprenden tales vectores, así como los métodos para producir un i polipéptido o proteína dimérica ¡ como se describió anteriormente. Por ejemplo, en algunas modalidades, una 1 célula cultivada de acuerdo con la presente invención i comprende un vector de expresión que incluyen los siguientes I elementos operablemente enlazados: ¡un promotor de la transcripción; un segmento de ADN que codifica para una fusión del polipéptido como se describió anteriormente; y un terminador de la transcripción; y donde la célula expresa la fusión del polipéptido codificada por el segmento de ADN. En ciertas variaciones de un método de elaboración de la fusión del polipéptido, el método incluye (i) cultivar una célula que comprende un vector de expresión como se describió anteriormente, donde la célula expresa la fusión del polipéptido codificada por el segmentó de ADN y la fusión del polipéptido codificado es producida; y (ii) la recuperación de la fusión del polipéptido soluble . De manera similar, en ciertas variaciones de un método de elaboración de la proteína dimérica, el método incluye (i) cultivar una célula que comprende un vector de expresión como se describió anteriormente, donde la célula expresa la fusión del polipéptido codificada por el segmento de ADN y la fusión del i polipéptido codificada es producida como una proteína i dimérica; y (ii) la recuperación de la' proteína dimérica.

La presente invención incluye además una composición que comprende una fusión del polipéptido o proteína dimérica como se describieron anteriormente, y al menos un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un método de tratamiento de un trastorno inmunitario mediado por células T utilizando una proteína VSTM3 dimérica como se describió anteriormente. El método incluye en general administrarle a que tiene el trastorno inmunitario mediado por una cantidad efectiva de la proteína VSTM3 dimérica. Los trastornos inmunitarios mediados por células T, y adecuados para el tratamiento con la proteína dimérica VSTM3 como se describe en la presente, incluyen, por ejemplo, los trastornos autoinmunitarios , la enfermedad injerto versus hospedero trasplantes. método para de artritis , MS espino- óptica, MS progresiva primaria (PPMS, por sus siglas en inglés) , y MS de remisión recaída (RRMS, por sus siglas en inglés) ) , diabetes mellitus dependie te de insulina (IDDM, por sus siglas en inglés) , lupus sistémico (SLE, por sus siglas en inglés) , enfermedad celiaca, neuritis, polimiositis , psoriasis, artritis ipsoriática, vitíligo, I síndrome de Sjogren, pancreatitis autoinmunitaria, un trastorno inflamatorio del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa) , hepatitis crónica activa, autoinmunitaria, pénfigo vulgar, cirrosis biliar primaria, anemia perniciosa, oftalmía simpática, uveítis, anemia i hemolítica autoinmunitaria, fibrosís pulmonar, enfermedad crónica por berilio, y fibrosis pulmonar idiopática. i Estos y otros aspectos de ¡la invención se volverán I evidentes después de la referencia a j la siguiente descripción i detallada de la invención y a las figuras anexas. i I DEFINICIONES > i A no ser que se definan de otro modo, todos los i términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que Sel que es comúnmente I entendido por una persona de experiencia ordinaria en la técnica pertinente a los métodos y composiciones descritas, Como se utilizan en la presente, los siguientes términos y frases tienen los significados adscritos a ellos a no ser que i se especifique de otro modo. I I I Los términos "un," "uno,", ¡"una,", y "el," y "la" incluyen los referentes plurales, a no! ser que el contexto lo indique claramente de otro modo. ¡ I Un "polipéptido" es un polímero de residuos de i aminoácidos unidos por enlaces peptídicos , ya sea producidos i de manera natural o sintéticamente. Los polipéptidos de menos i de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos son comúnmente i I denominados como "péptidos." J I Una "proteína" es una macromolécula que comprende i una o más cadenas polipeptídicas . Una proteína puede también comprender componentes no peptídicos, tales como grupos i carbohidratos. Los carbohidratos yi otros sustituyentes no I peptídicos pueden ser agregados a uria proteína por la célula I en la cual la proteína es producida; y variarán con el tipo i de célula. Las proteínas son definidas en la presente en ! términos de sus estructuras de i cadena principal de i ! aminoácidos; los sustituyentes tales como los grupos carbohidratos son en general no especificados, pero pueden no i obstante estar presentes. i i Los términos "amino-terminal" (o "N-terminal" ) y i "carboxilo-terminal" (o "C-terminal" ), son utilizados en la presente para denotar las posiciones dentro de los polipéptidos . Donde el contexto lo permita, estos términos son utilizados con referencia a una secuencia o porción I particular de un polipéptido para denotar la proximidad o la posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia colocada i carboxilo-terminal a una secuencia de referencia dentro de un i i polipéptido es localizada proximal al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo.

El término "correspondiente a," cuando se aplica a I las posiciones de los residuos de¡ aminoácidos en las i secuencias, significa las posiciones correspondientes en una I pluralidad de secuencias cuando ¡ las secuencias son óptimamente alineadas. ¡ "Asociaciones no covalentes" entre los polipéptidos o proteínas incluyen los enlaces de hidrógeno, las interacciones estéricas, las interacciones hidrofóbicas, y las interacciones iónicas. ' Los términos "polinucleótidb" y "ácido nucleico" se utilizan sinónimamente en la presen'te y se refieren a un polímero de una sola hebra o de doble hebra de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos leídas desde el extremo 51 hacia el extremo 3 ' . Los polinucleótidos incluyen AR y ADN, y pueden ser aislados ' de fuentes naturales, sintetizados in vitro, o preparados a partir de combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos son expresadas como pares de bases (abreviados "bp"), nucleótidos ("nt")!( o kilobases ("kb"). Donde el contexto lo permita, los últimos dos términos pueden describir los polinucleótidos que son ide una sola hebra o de ¡ doble hebra. Cuando el término es aplicado a las moléculas de doble hebra, éste es utilizado para denotar la longitud completa y se entenderá que es equivalente al término "pares de bases." Podrá ser conocido por aquellos expertos en la técnica que las dos hebras de un po¡linucleótido de doble hebra pueden diferir ligeramente en longitud y que los extremos de las 'mismas pueden estar escalonados como resultado de la escisión enzimática; de1 este modo, todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido de doble i hebra pueden no estar apareados . Tales extremos no apareados en general no excederán los 20 nt de longitud.

Un "segmento" es una porcjión de una molécula más polipéptido especificado. También, en el contexto de una fusión del polipéptido de acuerdo cor! la presente invención, un segmento de polipéptido que corresponde a una citocina o un dominio extracelular de un receptor de la superficie celular es una porción de la molécula de fusión de polipéptido más larga que, además del segmento polipeptídico correspondiente a la citocina o al dominio extracelular del receptor de la superficie celular, incluye otros segmentos polipeptídicos (por ejemplo, ligadores, dominio de dimerización) como se describe en la presente.

Un "monómero" o "dominio de monómero" como se utilizan en la presente significan un segmento de polipéptido que corresponden a una citocina o un dominio extracelular de un receptor de la superficie celular.

El término "vector de expresión" es utilizado para denotar una molécula de ADN, lineal o que comprende un segmento que codifica para un polipéptido de interés general derivados del ADN plásmido o 'viral, o pueden contener elementos de ambos .

El término "promotor" es utilizado en la presente por su significado reconocido en la técnica para denotar una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan el enlace de la ARN-polimerasa y el inicio de la transcripción. Las secuencias promotoras son comúnmente, pero no siempre, encontradas en las regiones 5' de no codificación de los genes . j Una "secuencia de señal secretora" es una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un "péptido secretor") que, como un componente un polipéptido más grande, dirige al polipéptido más grande a través de una vía secretora de una célula en la cual éste es sintetizado. El polipéptido más grande es comúnmente escindido para eliminar el péptido secretor durante el tránsito a través de la vía secretora.

"Operablemente enlazado" significa que dos o más entidades están unidas entre sí tal que éstas funcionan en I concierto para sus propósitos pretendidos. Cuando se hace i referencia a los segmentos de ADN;, la frase indica, por ejemplo, que las secuencias de codificación están unidas en I la estructura de lectura correcta, yj la transcripción inicia i en el promotor y proceso a través del o de los segmentos de i codificación hacia el terminador. Cuándo se hace referencia a los polipéptidos , "operablemente incluye secuencias ya sea covalentemente (por ejemplo, mediante enlace disulfuro) y no covalentemente (por egemplo, mediante puentes I de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas o interacciones de i i puente salino) enlazadas, en donde la o las funciones i deseadas de las secuencias son conservadas.

Un "polipéptido aislado" es |un polipéptido que está I esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como impurezas de , lípidos u otras impurezas proteicas asociadas con el polipéptido en la naturaleza. Típicamente, una preparación del polipéptido i aislado contiene el polipéptido en¡ una forma altamente I purificada, es decir, al menos aproximadamente 80% pura, al menos aproximadamente 90% pura, al menos aproximadamente 95% i pura, más del 95% pura, tal como 96%, j97%, ó 98% o más pura, o más del 99% pura. Una manera jáara mostrar que una i preparación de proteína particular contiene un polipéptido aislado es por la aparición de una banda simple después de la electroforesis en gel de dodecil-sulfato de sodio (SDS) -poliacrilamida de la preparación de proteína, y la tinción I del gel con Azul Brillante de Coomassie. No obstante, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo i polipéptido en formas físicas alternativas, tales como I dímeros o formas alternativamente glucosiladas o I derivatizadas . | Una " inmunoglobulina" es proteína sérica que funciona como un anticuerpo en un organismo vertebrado. Cinco i clases de "inmunoglobulina, " o anticuerpo, proteína (IgG, i IgA, IgM, IgD, e IgE) han sido identificadas en vertebrados I superiores. La IgG comprende una clase mayor; ésta existe normalmente como la segunda proteína más abundante encontrada I en el plasma. En los humanos, la IgG consiste de cuatro subclases, designadas IgGl, IgG2, e IgG4. Las regiones constantes de cadena pesada d clase de IgG son identificadas con la letra Gri ?. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la subclase contienen una región I constante de cadena pesada ??. Cada cadena pesada de I i inmunoglobulina posee una región constante que consiste de los dominios de proteína de la región constante (CH1, i bisagra, CH2, y CH3 ) que son esencialmente no variantes para i una subclase dada en una especie. Las | secuencias de ADN que codifican para las cadenas de inmunoglobulina humanas y no I humanas son conocidas en la técnica. Ve'r por ejemplo, Ellison ¡ et al., ADN 1: 11-18, 1981; Ellison etí al., Nuc. Acids Res. 10:4071-4079, 1982; Kenten et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 79:6661-6665, 1982; Seno et al., NUQ. Acide Res. 11:719-726, 1983; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Amster et al., Nuc. Acids Res. 8:2055-2065, 1980; Rusconi y Kohler, i Nature 314:330-334, 1985; Boss et ' al., Nuc. Acids Res. 12:3791-3806, 1984; Bothwell et aí . , Nature 298:380-382, 1982; van der Loo et al., Immunogenetics 42:333-341, 1995; Karlin et al., J". Mol. Evol. 22: 195-208, 1985; Kindsvogel et I al., ADN 1:335-343, 1982; Breiner et! al., Gene 18: 165-174, 1982; Kondo et al., Eur. J. Im unol. 23:245-249, 1993; y GenBank Acceso No. J00228. Para una revisión de la estructura I y función de la inmunoglobulina, Vjer Putnam, The Plasma Proteins, Vol V, Academic Press, Inc . , 49-140, 1987; y Padlan, Mol. Immunol . 31:169-217, 1994¡.

Una "bisagra de inmunoglobulina" es aquella porción de una cadena pesada de inmunglobúlina que conecta los dominios variables y CH1. Dentro de¡ la SEQ ID NO: 27, la bisagra es aproximadamente de 99 residuos (residuos de Eu 216-230 como se muestra en la 1A) .

Los términos "fragmento í^c, " "región Fe," o "dominio Fe, 11 como se utilizan en la presente, son sinónimos y se refieren a la porción de un anticuerpo que es i responsable a los receptores de anticuerpo sobre las células y el componente Clq del complemento. Fe significa "fragmento cristalino, " el fragmento de un anticuerpo que formará asocian bajo condiciones fisiológi para formar un dímero. El segundo polipéptido puede ser ¡mismo o un polipéptido diferente. Los polipéptidos pueden interactuar uno con el otro a través de una o varias asociaciones covalentes y/o no covalentes. Los ejemplos de dominio de dimerización incluyen una región Fe; una región de bisagra,- un dominio CH3 ; un dominio CH4 ; un dominio CH1 o CL; un dominio de cremallera de leucina (por ejemplo, un dominio de cremallera de leucina jun/fos, ver por ejemplo, Kostelney et al, J. Immunol, 148: 1547-1553, 1992; o un dominio de cremallera de leucina GCN4 de levadura) ; un dominio de cremallera de isoleucina; una región de dimerización de un receptor de dimerización de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de interleucina-8 (IL-8R) ; o un heterodlmero de integrina tal como LFA-1 o GPIIIb/IIIa) ; una región de dimerización de un ligando de dimerización, secretado (por ejemplo, el factor de uno, dos, o tres hasta aproximadamente diez residuos de cisteína) tal que el o los puentes di pueden formarse entre el polipéptido y un segundo polipéptido, que comprende al menos un residuo de cisteína (de aquí en adelante "una bisagra sintética"). Un domino de dimerización preferido de acuerdo con la presente invención es una región Fe.

El término "ligador" o "ligador polipeptídico" es utilizado en la presente para indicar idos o más aminoácidos unidos por uno o varios enlaces peptíjiieos y enlazando dos regiones del polipéptido separadas, discretas. El ligador es típicamente diseñado para permitir que las regiones i polipeptídicas separadas realicen ¡sus funciones separadas I (tales como, por ejemplo, donde un ¡dominio de dimerización, i enlazado a las otras regiones del poíipéptido, se asocian uno con el otro, correspondiendo al dominio de dimerización para I formar un dímero) . El ligador puede1, ser una porción de una ¡ secuencia nativa, una variante de la misma, o una secuencia I sintética. Los ligadores son tamb'ién denominados en la presente utilizando la "L." El uso de un subíndice (por ejemplo, "1" ó "2") con "L" se utiliza en la presente para diferenciar entre múltiples ligadores entre una cadena polipeptídica, cuyos ligadores pueden ser los mismos o diferentes con respecto a la secuencia^ de aminoácidos.

I El término "gen de VSTM3 variante" o "gen de B7R1 i variante" se refiere a las moléculas de ácidos nucleicos que j codifican para un poíipéptido que t!iene una secuencia de I aminoácidos que es una modificación de¡ la SEQ ID NO: 2. Tales variantes incluyen los polimorfismos dé origen natural de los i genes VSTM3 (B7R1) , así como los I genes sintéticos que contienen sustituciones conservadoras ! de aminoácidos de la i secuencia de aminoácidos de la SEQ ¡ID NO: 2. Las formas variantes adicionales de los genes VSTM3 son moléculas de I ácido nucleico que contienen inserciones o supresiones de las secuencias nucleotídicas descritas en] la presente. Un gen I VSTM3 variante puede ser identificado por ejemplo, por la i i determinación de si el gen se híbrida o no con una molécula i de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica de la i SEQ ID NO: 1, o su complemento, bajo 1 condiciones estrictas. i Alternativamente, los genejs VSTM3 variantes pueden i ser identificados por comparación de secuencia. Dos secuencias de aminoácidos tiene "100¾ de identidad de I secuencia de aminoácidos" si los residuos de aminoácidos de i las dos secuencias de aminoácidos son las mismas para ser i alineadas para correspondencia máxima. De manera similar, dos i secuencias de nucleótidos tienen i " 100% de identidad de i i secuencia de nucleótido" si los residuos de nucleótido de las dos secuencias nucleotídicas son ilos mismos cuando son i alineadas para correspondencia máxima. Las comparaciones de i secuencia pueden ser realizadas utilizando programas de I software estándares tales como aquellos incluidos en la serie I de cómputo de bioinformática LASERGENE, que es producida por í ADNSTAR ( adison, Wisconsin) . Otros métodos para comparar dos secuencias de nucleótidos o de ¡ aminoácidos por la í determinación de la alineación óptimaj son bien conocidos por I aquellos de experiencia en la técnica. (Ver por ejemplo, ¡ Peruski y Peruski, The Internet and ¡the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wu I et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer I Databases of Nucleic Acids and Proteiris," en Methods in Gene Biotechnology 123-151 (CRC Press, Inc. 1997); Bishop (ed. ) , Guide to Human Genome Computing (2da ed., Academic Press, Inc . 1998) .) Dos secuencias de nucljeótidos o de aminoácidos son consideradas poseedoras de "identidad de secuencia sustancialmente similar" o "identidad secuencial sustancial" si las dos secuencias tienen al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95% de identidad de secuencia una con relación a la otra. Los métodos particulares para determinar la identidad de secuencia son descritos más adelante.

No obstante del para identificar un gen VSTM3 VSTM3 variante, un gen variante o el polipéptido codificado por un gen variante puede ser funcionalmentje caracterizado por la habilidad para a un anticuerpo anti-VSTM3. Un polipéptido VSTM3 variante puede caracterizado por la habilidad del polipéptido para' enlazarse a CD155, utilizando un ensayo biológico o bioquímico tal como se describe en la presente.

El término "variante alélica" se utiliza en la presente para denotar cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de manera natural a través de la mutación, y puede dar como resultado polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones . Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar para polipéptidos que tienen una secuencia alterada de aminoácidos. El término "variante alélica" es también utilizado en la presente para denotar una proteína codificada por una variante alélica de un gen.

El término "ortólogo" denota un polipéptido o proteína obtenida a partir de una especie que es la contraparte funcional de un polipéptido o proteína proveniente de una especie diferente. Las diferencias secuenciales entre ortólogos son el resultado de la especiación. j El término "trastorno inmunitario mediado por células T, " como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier enfermedad o trastorno que tenga una patología que sea mediada, al menos en parte, por la actividad de las células T. Los trastornos inmunitarios mediados por células T incluyen, por ejemplo, trastornos j autoinmunitarios (por ejemplo, artritis reumatoide, ejsclerosis múltiple) , trastornos son particularmente aptas para los métodos de tratamiento que utilizan las proteínas VSTM3 diméricas (B7R1) de la presente invención, como se describe posteriormente en la presente.

El término "cantidad efectiva, " en el contexto del tratamiento de un trastorno por administración de una proteína dimérica soluble a un sujeto como se describe en la presente, se refiere a una cantidad de tal molécula que es suficiente para inhibir la ocurrencia o mejorar uno o más síntomas del trastorno. Por ejemplo, en el contexto específico del tratamiento de un trastorno inmunitario mediado por células T por administración de una proteína respuesta mediada por células T en e| 1 sujeto, para inhibir estándares, los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros se entiende que apropiados. Cuando tal valor es expresado como " " X o "aproximadamente" X, se entenderá que el valor establecido de X será exacto a + i 10%. ¡ I BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS i Las Figuras 1A-1B ilustran la secuencia de i aminoácidos de una porción de una cadena pesada ?? de I inmunoglobulina humana representativa! (SEQ ID NO: 27) (basada en Ellison et al., Nucí. Acids Res. 10:4071, 1982). Los i números de la secuencia de aminoácidos están basados en el I índice Eu (Edelman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 63:78- 85, 1969; Kabat et al., Sequences of Proteins of Im unological Interest, US Departmenjt of Health and Human i Services, NIH, Bethesda, MD, 1991) .j Los residuos de Cys normalmente involucrados en el enlace1 disulfuro a la región i constante de la cadena ligera (LC) y ¡ la región constante de la cadena pesada (HC) son indicados. ¡ Son mostrados también i los límites de los dominios de CHl, de! bisagra, CH2 , y CH3. i Las Figuras las secuencias de aminoácidos de ciertos de inmunoglobulina.

Los números de la secuencia de aminoácidos están basados en i el índice EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of i Inununological Interest, US Department! of Health and Human i Services, NIH, Bethesda, 1991) . Las 1 secuencias ilustradas incluyen una secuencia humana de silvestre ("wt"; SEQ ID NO: 28) y cinco secuencias variantes^ designadas Fc-488 (SEQ ID NO: 29), Fc4 (SEQ ID NO: 30), Fjc5 (SEQ ID NO: 31), Fc6 (SEQ ID NO: 32), y Fc7 (SEQ ID NO: 33). Los residuos de Cys normalmente involucrados en el enlac-e disulfuro a la región I constante de la cadena ligera (LC, por sus siglas en inglés) y la región constante de la cadena pesada (HC, por sus siglas I en inglés) son también indicados. Una¡ " . " indica la identidad I al tipo silvestre en esa posición. ¡*** indica el codón de detención; el residuo de Lys C-terminal ha sido eliminado de I Fc6. Son mostrados también los límites de la bisagra, los I I dominios CH2 , y CH3. ! Las Figuras 3A-3F describen la inhibición de células T inducidas por las proteínas B7R1 solubles (VSTM3) i medida mediante actividad proliferativ in vitro. Las células I T humanas provenientes de tres donadores fueron incubadas en presencia del anticuerpo anti-CD3 y i las células P815 que expresan PVR ya sea en ausencia o ! en presencia de B7R1 soluble (VSTM3) , como se describe en el Ejemplo 13. Tres i diferentes proteínas B7R1 solubles fueron probadas por su habilidad para inhibir la proliferación de la células T CD4+ (Figuras 3A-3C) o CD8+ (Figuras 3D-3F) j. Fueron probadas tres I diferentes proteínas B7R1 solubles: B7rl (G25-P141) C69Y Fc5 Barbell, B7rl (G25-P141) C69Y Fc5 tándem' y B7rl-Fc5.

La Figura 4 describe la! reducción en las i calificaciones de la enfermedad encefalomielitis alérgica experimental (EAE) mediante tratamiento con mB7Rl-Barbell . EAE fue establecida en ratones como se describe en el Ejemplo 14 , más adelante . Los ratones fueronj tratados ya sea con el vehículo solo (PBS) , o bien con el vehículo que contenía la construcción soluble B7R1 Barbell (mB7Rl-Barbell) , la construcción Fc2 murina dimérica (mB7Rl-Fc2) , o la construcción VASP (mB7Rl-VASP) . (Ver ¡Ejemplo 14.) Cada punto I representa la media ± SEM para n = 1|0-12 ratones por grupo. Las calificaciones de enfermedad para el grupo tratado con B7R1-Barbell fueron diferentes para aquellas del grupo control tratados con PBS, ** p <| 0.05 por mediciones i repetidas de análisis de varianza (ANDEVA) .

La Figura 5 describe la reducción en la calificación de la enfermedad de artritis por tratamiento con fueron diferentes para aquellas del grupo control tratado con PBS, * p < 0.05 mediante ANDEVA de dos vías.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION I . Generalidades La presente invención proporciona las composiciones y los métodos relacionados a las proteínas de fusión diméricas solubles. En general, las proteínas de fusión diméricas de la presente invención comprenden primera y segunda cadenas polipeptídicas enlazadas vía un dominio de dimerización, cada cadena polipeptídica que comprende primero y segundo segmentos polipéptidos porrespondientes a una citocina o a un dominio extracelular de un receptor de la superficie celular {también en la presente como "monómeros" o "dominios de ). Las proteínas de fusión diméricas son por lo tanto en general tetravalentes con respecto a los dominios monoméricos . El primero y segundo dominios monoméricos de cada cadena polipeptídica pueden ser los mismos o diferentes. En ciertas modalidades, los dominios monoméricos de la proteína de fusión dimérica son los mismos, proporcionando una molécula que es tetravalente con respecto a un dominio monomérico particular. El primero y el segundo dominios monoméricos pueden ser colocados, respectivamente, en el extremo amino y en el extremo carboxilo respecto al dominio de dimerización (también denominado en la presente como un formato "Barbell") . Alternativamente, el primero y por células T, particularmente trastornos auto- inmunitarios mediados por células T. De acuerdo co la presente invención, las fusiones de VSTM3 diméricas comprenden primera y segunda cadenas polipeptídicas enlazadas vía un dominio de dimerización, cada cadena polipeptídica comprende primero y segundo dominios monoméricos correspondientes al dominio extracelular de VSTM3. Las fusiones jde VSTM3 diméricas son por lo tanto en general tetravalentes con respecto a los ' sitios de enlace para el contra-receptor de VSTM3, CD155. El primero y el segundo dominios monoméricos correspondientes al dominio extracelular VSTM3 pueden ser colocados ya sea en el formato Barbell o el formato tándem, como se resume anteriormente. Como se describe adicionalmente en la presente, las proteínas de fusión VSTM3 diméricas de acuerdo con la presente invención son particularmente eficaces para la supresión de las respuestas mediadas por células T, in vivo.

II .

En consecuencia, en un ¡ aspecto, la presente I invención proporciona una fusión delj polipéptido soluble que I comprende, del extremo amino al 'extremo carboxilo, una fórmula seleccionada de P1-L1-D-L2 -|P2 y P2-L2-P1-L1-D, en donde Pl es (i) un dominio extracelular de un primer receptor i de la superficie celular o una variante funcional o fragmento del mismo, o (ii) una primera cijtocina o una variante I funcional o fragmento de la misma; hl es un primer ligador I polipeptídico; D es un dominio de dimerización,- L2 es un segundo ligador polipeptídico; y P2 es (i) un dominio i extracelular de un segundo receptor dje la superficie celular o una variante o fragmento funcional1, del mismo, o (ii) una I segunda citocina o una variante o fragmento funcional de la misma. ¡ Dentro de ciertas modalidades de la invención, Pl y I P2 son los mismos (o derivados del ¡ mismo receptor de la I superficie celular o de la misma cito'pina) , tal que después j de la homodimerización de la fusión del polipéptido, es ! proporcionada una proteína que es tetramérica con respecto al i monomero P1/P2. 1 I En algunas modalidades alternativas, Pl y P2 son derivados de diferentes receptores de ¡la superficie celular y/o de diferentes citocinas, tal i que después de la I homodimerización de la fusión del polipéptido, una proteína que es dimérica con respecto a dos diferentes dominios monoméricos (Pl y P2) es proporcionada. Por ejemplo, en algunas variaciones, Pl corresponde g. un dominio extracelular de un primer receptor de la superficie celular y P2 I corresponde a un dominio extracelular de un segundo receptor I de la superficie celular que es diferente del primero, tal que la homodimerización de la fusión da como resultado una proteína que es homodimérica con respecto a dos diferentes receptores de la superficie celular, b variantes o fragmentos del mismo. De manera similar, en j otras variaciones, Pl corresponde a una primera citocina y P2 corresponde a una segunda citocina que es diferente deí la primera, tal que la homodimerización de la fusión da comd resultado una proteína que es homodimérica con respecto a dos diferentes citocinas, o variantes o fragmentos de las mismas. En otras variaciones, Pl corresponde a un dominio extracelullar de un receptor de la superficie celular y P2 corresponde a una citocina, o viceversa, tal que la homodimerización de la fusión da como i resultado una proteína que es homodimérica con respecto al receptor de la superficie celular jy a la citocina, o variantes o fragmentos de la misma. | En otras modalidades adicionales, Pl y P2 corresponden a los dominios extracelul!ares de dos diferentes subunidades de un receptor heterodiméjrico de la superficie celular o, alternativamente, a dos dif,erentes subunidades de una citocina heterodimérica . En (tales modalidades, los ligadores polipeptídicos LI y LÍ2 son diseñados para proporcionar espacio y flexibilidad suficientes entre los dominios monoméricos Pl y P2 dentro de una fusión polipeptídica simple para permitir que estos dominios monoméricos se asocien uno con el otro de manera no covalente para formar una unidad heterodiméricéL funcional, simple, tal que la homodimerización de la fusión da como resultado una proteína que tiene dos de tales unidades heterodiméricas funcionales.

Los ejemplos de los receptores de la superficie celular de los cuales pueden ser j derivados Pl y/o P2 Receptor de IL-10; el Receptor de IL-11; el Receptor de IL-12; el Receptor de IL-13; el Receptor de IL-15; el Receptor de IL-16 (CD4) ; el Receptor A de IL-17 (IL-17RA) ; el Receptor Poxvirus; Homólogos del Receptor de TNF de Poxvirus; el Receptor de Prolactina; RANK; el Receptor de RON; el Receptor de SCF; Receptores de Somatostatina; T1/ST2; Receptores de TGF-beta; Receptor de TNF (por ejemplo, p60 y p80) ; TNFRSF19 ; Receptor de TPO; US28; XCR1; Receptor de Eritropoyetina; el Receptor de la Hormona del Crecimiento; el Receptor del Factor Inhibitorio de Leucemia; y el Receptor de C-kit.

Los Ejemplos de citocinas a partir de las cuales pueden ser derivados Pl y/o P2 incluyen, por ejemplo, oc-MSH; 9E3/CCAF; ACTH; Activina; AK155; Angiostatina; Apo2L/TRAIL; APRIL; BAFF (BLys); Ligando de BLRl/BCA-l/BLC/CXCL 13; Familia BMP; BRAK; Péptido relacionado al Gen de Calcitonina i (CGRP) ; Quimiocina CC del Virus del Molusco Contagioso; CCL27; CCL28; CD100/Sema4D; Ligandoj CD27; Ligando CD30; Ligando CD40; CKp8-l/MPIF-l/CCL23 ; CLF/CLC; CSF-1; CT-1; CTAP-III, ß?T, y NAP-2//CXCL7 ; CXCL16 ; Defensinas; ELC/MIP-3 /Exodus-3/CCL19; ENA-78/CXCL5 ; Endorfinas; Endostatina; Eotaxina 2/MPIF-2/CCL24 ; Eotaxina/CCLll ; Eritropoyetina; Exodus-l/LARC/MIP-3a (SCYA 20) ; Ligando de Fas; Ligando de Flt-3; fMLP; Fractalcina/CX3CL1 ; G-CSF; GCP-2/CXCL6; GM-CSF; Hormona del Crecimiento; HCC-1/CCL14 ; HCC-4/CCL16 ; Caja 1 del Grupo de Alta Movilidad (HMGB1) ; Péptido LL-37 Antimicrobiano de Catelicidina Humana; I-309/CCL1; LiJandos de IFNa, IFNp, e I IFNú); IL-la; IL-1 ß; IL-10; IL-11 ; IL'r12; IL-13; IL-15; IL- I 16; IL-17A; IL-17B; IL-17C; E; IL-17F; IL-18; IL-IRa; IL-2; IL-27; IL-3; IL-6; IL-7; IL- 8/CXCL8; IL-9; IP- 10/CXCL10 ; IL-21; IL-22; IL- 23; IL-24; IL-26; IL-31; crecimiento de Queratinocito; Ligando de IL- a KSHV; Leptina; ? Leucotactina l/HCC-2/MIP-l5/CCL15 ; Leucotrieno B ; LIGHT; I Lipoxina; Linfotactina/XCLl; Linfotoxina a y ß; Factores de crecimiento Lisofosfolipídicos ; Quimiocina Derivada de I Macrofagos; Proteína Estimuladora de Macrofagos (MSP, por sus i siglas en inglés); MCP- 1/CCL2 , MCP-2|/CCL8 , MCP-3/CCL7 , MCP- 4/CCL13, y MCP-5/CCL12 ; Metoxiestradiol ; MGSA/GRO/CXCL1, ¡ CXCL2, CXCL3; MIF; MIG/CXCL9; MIP- la/jcCL3 , MIP-ip/CCL4; MIP-ly/MRP-2/CCF18/CCL9/10 ; Mu C10/CGL6; Oncostatina M; Osteopontina; Homólogo de IL-10 de Pajrapoxvirus (Virus Orf) ; PARC/DC-CCK1/AMAC-1/CCL18 ; PDGF-A; PDGF-B; PDGF-C; PDGF-D; I Factor Activador de Plaquetas; Factor Plaquetario 4/CXCL4; i Factores de Crecimiento de Poxvirus Relacionados al Factor de Crecimiento Epidérmico; Proteínas de Control del Complemento í i Secretadas por Poxvirus; Homólogos del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular de Poxvirus (VEGF) del Virus Orf; i Prolactina; Ligando de RA K; RA TES/CCL5 ; S100A12; SDF- 1/CXCL12; SERP-1, una Serpina Poxviral Secretada; SLC (6Ckine) /Exodus-2/TCA-4/CCL21; Somatostatina; Factor de i Células Madre; Sustancia P; TARC/CCL17; TCA3/Ratón CCL1; TECK/CCL25; TGF ; Trombopoyetin NFa; TSG-6; TWEAK; Semaforina del Virus de Vaccinia; 1 y vCXC-2; VEGF; VIP y PACAP; y Variantes de IL-10 Viral, i I Las variantes o fragmentos funcionales de un dominio extracelular particular de la superficie celular pueden ser ficados utilizando ensayos biológicos o bioquímicos rutinarios para evaluar la habilidad de la variante del fragmento para ¡ i enlazarse específicamente a un ligando cognado o un contra-receptor de la superficie celular. De manera similar, las variantes o fragmentos funcionales de juna citocina particular pueden ser fácilmente identificados utilizando ensayos biológicos o bioquímicos rutinarios p^ra evaluar la habilidad i de la variante del fragmento para enlazarse específicamente a i un receptor cognado de la citocina. j Las variantes funcionales ¡de un polipéptido de referencia particular (por ejemplo, luna citocina de tipo silvestre o dominio superficie celular de un dominio extracelul caracterizados como poseedores de unaj o más sustituciones, i supresiones o adiciones de aminoácidos con relación al polipéptido de referencia. Estos cambios son preferentemente de una naturaleza menor, es ¡decir, sustituciones conservadoras de aminoácidos (ver por ejemplo, Tabla 1, más adelante, la cual lista algunas de las sustituciones conservadoras de aminoácidos, ejemplares) y otras sustituciones que no afectan de manera significativa el plegamiento o la actividad de la proteína o del polipéptido; I supresiones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y extensiones amino- i o carboxilo-terminales I pequeñas, tales como un residuo de métionina amino-terminal, un péptido ligador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 I residuos, o una extensión pequeña que facilita la purificación (un marcador de afinidad) , tal como un tramo de poli-histidina, proteína A {Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, I I 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol . 198:3, 1991), la i transferasa del glutatión (Smith y ¡ Johnson, Gene 67:31, I I 1988), u otro epitopo antigénico o dominio de enlace. (Ver en I general Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991.) Los ADNs que codifican para los marcadores i de afinidad están disponibles de los proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Tabla 1: Sustituciones Los aminoácidos esenciales en un receptor o polipéptxdo de citocina pueden ser identificados de acuerdo a los procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085, 1989; Bass et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4498-4502, 1991). En la última técnica, mutaciones simples de alanina son introducidas en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son probadas para la actividad biológica (por ejemplo, enlace al ligando y tjransducción de señales) para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción ligando-receptor pueden también ser determinados por análisis de la estructura cristalina o como es determinado por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcación de fotoafinidad. (Ver por ejemplo, de Vos et al., Science 255:306-312, ¡1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodavjer et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992.) Las identidades de los aminoácidos esenciales pueden también ser inferida's a partir del análisis de las homologías con los receptores o citocinas relacionadas .

Múltiples sustituciones de aminoácidos pueden ser realizadas y probadas utilizando métodos conocidos de i mutagénesis y selección, tales como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer Science 241|:53-57, 1988 o Bowie y Sauer Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989. En resumen, estos autores describen los métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionando el polipéptido funcional, y luego secuenciando los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que pueden ser utilizados incluyen la visualización de fago, por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30 10832-10837, 1991; I Ladner et al., Patente de los Estadojs Unidos No. 5,223,409; Huse, Publicación del WIPO O 92/06204) y la mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et a'l . , Gene 46: 145, 1986; PCR, dando como resultado mutaciones puntuales aleatoriamente introducidas. Esta técnica puede ser modificada mediante el uso de una familia de moléculas de ADN progenitoras , tales como las variantes alélicas o moléculás de ADN provenientes de diferentes especies, para introducir variabilidad adicional dentro del proceso. La selección o clasificación I para la actividad deseada, seguida por iteraciones adicionales de mutagénesis y ensayo, proporciona una I "evolución" rápida de las secuenciás por selección de las I mutaciones deseables mientras que simultáneamente se selecciona contra cambios dañinos . I I I Los métodos de mutagénesis como se describen anteriormente, pueden ser con los métodos de selección de alto rendimiento para detectar la actividad de I los receptores mutagenizados, clonados, dentro de las células ! hospederas. Los ensayos preferidos este respecto incluyen I los ensayos de proliferación celular y los ensayos de enlace al ligando basados en biosensores, los cuales son descritos i más adelante. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican para las variantes activas! del receptor o de la citocina pueden ser recuperadas a partir de las células hospederas y secuenciadas rápidamente utilizando equipo i moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la í importancia de los residuos individuales de aminoácidos en un i polipéptido de interés, y pueden ¡ser aplicados a los polipéptidos de estructura desconocida.] I Como se discutió previamente, una fusión del i I polipéptido de acuerdo con la presente invención puede incluir un segmento polipeptídico que corresponde a un "fragmento funcional" de una citocina particular o de un dominio extracelular de un receptor de la superficie celular. Los análisis de supresión rutinarios de las moléculas de ácido nucleico pueden ser llevados a cabo para obtener fragmentos funcionales de una molécula de ácido nucleico que codifica para una citocina dada o un dominio extracelular de un receptor de la superficie celularj Como una ilustración, las moléculas de ADN que codifican para VSTM3 que tienen la secuencia de nucleótido de los residuos 73-423 de la SEQ ID NO: 1 pueden ser digeridos con la nucleasa Bal31 para obtener una serie de supresiones anidadas. Los fragmentos son luego insertados dentro de los vectores de expresión en la estructura de lectura apropiada, J y los polipéptidos expresados son aislados y probados para la habilidad de enlazarse a CD155 o a CD112. Una alternativa a la digestión con exonucleasa es utilizar la mu Itagénesis dirigida al oligonucleótido para introducir supresiones o condones de detención para especificar la producción de un fragmento deseado. Alternativamente, fragmentos particulares de un gen que codifica para una citocina o receptor, pueden ser sintetizados utilizando la reacción en ¡cadena de polimerasa.

El procedimiento general es e emplificado por estudios sobre el truncamiento en uno o en ambos extremos de los interferones . (Ver Horisberger y Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507, 1995.) Además, las técnicas! estándares para el análisis funcional de las proteínas se describen, por ejemplo por, Treuter et al., Molec. Gen. jGenet. 240: 113, 1993; Content et al., of the 42 kDa en Biological Meeting on Interferon Systems 65 -721 (Cantell, ed. , Nijhoff i 1987); Herschman, "The EGF Receptor;" en Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1 169-199 (Boynton et al., eds . , Academic Press 1985); Coumailleau et al., J". Biol. Chem. i 270:29270, 1995; Fukunaga et al., J.J Biol. Chem. 270:25291, I 1995; Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50: 1295, 1995; y Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30 -A, 1996.

Utilizando los métodos discutidos anteriormente, i una persona de experiencia ordinaria en la técnica puede preparar una variedad de polipéptidos que (i) son sustancialmente idénticos a un polipéptido de referencia correspondiente a una citocina a un dominio extracelular de un receptor de la celular y (ii) conserva las propiedades de enlace funcional del polipéptido de referencia. Los sistemas de ensaco para determinar las propiedades de enlace al receptor Jo al ligando de los polipéptidos de la citocina o del receptor, son en general i conocidos en la técnica y son fácilmente adaptables para el I uso en la determinación de las piropiedades de enlace funcional de una fusión del polipéptidp soluble de la fórmula P1-L1-D-L2-P2 y P2-L2-P1-L1-D, donde Pl y/o P2 corresponde a una citocina o a una variante del receptor de la superficie celular. Los ensayos ejemplares además descritos en la presente .

Por ejemplo, un sistema ensayo preferido emplea un instrumento biosensor comercialmente disponible (BIAcore , Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) , en donde el polipéptido del receptor es inmovilizado sobre la superficie de un chip de receptor. El uso de este instrumento es descrito por Karlsson (J". Immunol . Methods 145:229-240, 1991) y Cunningham y Wells (J. Mol. Biol. 234:554-563, 1993) . Para el uso de acuerdo con la presente invención, una fusión del polipéptido soluble (por ejemplo, una fusión del polipéptido VSTM3 soluble) de acuerdo con la invención es covalentemente enlazada, utilizando la química de amina o de sulfidrilo a las fibras de dextrano que están adheridas a la película de oro dentro de la celda de flujo. Una muestra de prueba es pasada a través de la celda. Si el ligando (por ejemplo, en el caso de una fusión del polipéptido VSTM3 soluble, CD155 soluble o CD112) está presente en la muestra, éste se enlazará a la fusión del polipéptido inmovilizado, provocando un cambio en el índice de refracción | del medio, el cual es detectado como un cambio en la resonancia de plasmón superficial de la película de oro. Este sistema permite la determinación de las velocidades de encendido y apagado, a I VSTM3, o al menos 80% de identidad ¡ de secuencia con un I i fragmento funcional de un dominio extracelular de VSTM3 ; en I donde la fusión capaz de enlazarse específicamente al de un polipéptido de CD155 (por ejemplo, los residuos de aminoácidos 28-343 de la ! SEQ ID NO: 22 o los residuos de aminoácidos 29-345 de la SEQ i i ID NO: 24) . En ciertas modalidades, I?l y/o P2 tiene al menos i 90% o al menos 95% de identidad de secuencia con el dominio extracelular del polipéptido de VSTM3 o fragmento funcional del mismo. Por ejemplo, en algunas 'variaciones, Pl y/o P2 í tienen 100% de identidad de secu'encia con el dominio i I extracelular del polipéptido de ySTM3 o el fragmento funcional del mismo. Pl y/o P2 pueden ser derivados, por i ejemplo, del dominio extracelular de un polipéptido de VSTM3 humano o murino (por ejemplo, los residuos 22-141 o de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 26-138 de lja SEQ ID NO: 4), o a partir de un fragmento funcional del mismo.

I Por ejemplo, en ciertas modalidades, Pl y/o P2 tienen al menos 80%, al menos 90%,' o al menos 95% de i identidad con los residuos de aminoácidos 25-141 de la SEQ ID i NO: 2; o Pl y/o P2 tienen al menos 80|%, al menos 90%, o al menos 95% de identidad con los de aminoácidos 26-138 de la SEQ ID NO: 4. En algunas de tales variaciones, uno o ambos de Pl y P2 tiene 100% de identidad con los residuos de i aminoácidos 25-141 de la SEQ ID NO: 2, jo uno o ambos de Pl y P2 tiene 100% de identidad con los residuos de aminoácidos i i I I I 26-138 de la SEQ ID NO: 4. En otras ¡variaciones , uno o ambos de Pl y P2 comprende un residuo no de cisteína (por ejemplo, tirosina) en la posición de aminoJcido correspondiente al residuo 69 de la SEQ ID NO: 2. Los polipéptidos Pl y/o P2 particularmente adecuados tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en los residuos 23-139 de la SEQ ID NO: 18 (residuos 23-139 de la SEQ ID NO: 20) .

En otras modalidades, Pl y/o P2 tienen al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95%j de identidad con los residuos de aminoácidos 23-139 de la SEQ ID NO: 18 (residuos 23-139 de la SEQ ID NO: 20) . En algunas de tales variaciones, Pl y/o P2 tienen un residuo no de cisteína en la posición del aminoácido correspondiente al residuo 67 de la SEQ ID NO: 18.

Por ejemplo, en variaciones particulares , el Pl y/o P2 polipéptido que tiene al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95% de identidad con los residuos de aminoácidos 23-139 de la SEQ ID NO: 18 conserva el residuo de tiirosina correspondiente a la tirosina 67 de la SEQ ID NO: 18 El porcentaje de identidad de secuencia es una penalidad por apertura de espacio vacío de 10, una penalidad por extensión de espacio vacío de 1, y la matriz de calificación "BLOSUM62 " de Henikoff y Henikoff, supra, como se muestra en la Tabla 2 (los aminoácidos son indicados por los códigos estándares de una sola letra) . El porcentaje de identidad es luego calculado como: ([Número total de concordancias idénticas] / [longitud dej la secuencia más larga más el número de espacios vacíos introducidos dentro de la secuencia más larga con el fin | de alinear las dos secuencias] ) (100) .

Tabla 2: Matriz de Calificación BLOSUM62 A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, y por íjearson, Meth. Enzymol. 183:63, 1990. En resumen, FastA caracjteriza primeramente la similitud de secuencia por la identifijcación de las regiones compartidas por la secuencia de búsqueda (por ejemplo, los residuos 25-141 de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 23-139 de la SEQ ID NO: 18) y una secuencia de prueba que tienen ya sea la más alta densidad de identidades (si la variable ktup es 1) o pares de identidades (si ktup = 2) , sin considerar las sustituciones, inserciones o supresiones conservadoras de aminoácidos. Las diez regiones con la | más alta densidad identidades son luego recalificadas por comparación de la similitud de todos los aminoácidos apareados utilizando una matriz de sustitución de aminoácidos, y los extremos de las regiones son "recortados" para incluir únicamente aquellos residuos que contribuyen a la calificación más alta. Si existen varias regiones con calificaciones mayores que el valor de "corte" (calculado por una fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia y en el valor ktup) , entonces las regiones iniciales recortadas son examinadas calificación ( "SMATRIX" ) , como se explijca en el Apéndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol. 183:63, 1990 FASTA puede ser también utiljizado para determinar I I la identidad de la secuencia de moléculas de ácido nucleico utilizando una proporción como se describió anteriormente. Para las comparaciones de la secuencia de nucleótido, el valor ktup puede es|tar en el intervalo de i entre uno a seis, preferentemente ¿le tres a seis, lo más i preferentemente tres, con otros parámetros establecidos como I se describió anteriormente. ¡ i La presente invención incluye las fusiones del I polipéptido VSTM3 soluble que tiene un cambio conservador de aminoácido, comparado con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, residuos 25-141 o los residuos 23-139 de la SEQ ID NO: 18 (SEQ ID NO: 20 residuos 231-139) . Por ejemplo, las I variantes de VST 3 pueden ser obtenidas, las cuales contienen una o más sustituciones de aminoácidos de los residuos 25-141 de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 23- de la SEQ ID NO: 18, en la cual un aminoácido alquilado jsstá sustituido por un aminoácido alquilado por una secuen'cia de aminoácidos de i VSTM3, un aminoácido aromático es sustituido por un i aminoácido aromático en una secuencia de aminoácidos de i I VSTM3 , un aminoácido que contiene azufre está sustituido con un aminoácido que contiene azufre I en una secuencia de aminoácidos de VSTM3 , un aminoácido 'que contiene hidroxilo I está sustituido por un aminoácido que| contiene hidroxilo en i una secuencia de aminoácidos de VSTM3 , un aminoácido ácido está sustituido por un aminoácido ácido, en una secuencia de i aminoácidos de VSTM3, un aminoácido |alcalino está sustituido por un aminoácido alcalino en una secuencia de aminoácidos de VSTM3, o un aminoácido monocarboxílico dibásico está sustituido por un aminoácido monocarboxílico dibásico en una secuencia de aminoácidos de VSTM3. Entre los aminoácidos más comunes, una "sustitución conservadora de aminoácidos" es ilustrada por, por ejemplo, una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina, y triptofano, (3) serina y jtreonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina. Los grupos ejemplares de cambios conservadores de aminoácidos son además mostrados en la Tabla 1, anterior.

La Tabla BLOSUM62 (ver Tabla 2) es una matriz de sustitución de aminoácidos derivadas djs aproximadamente 2,000 alineamientos múltiples locales de segmentos de la secuencia de protema, que representan regiones! altamente conservadas de más de 500 grupos de proteínas re¡lacionadas (Henikoff y Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 10915, 1992) . En consecuencia, las frecuencias de sustiltución BLOSUM62 pueden únicamente en las propiedades químicas (como se discutió anteriormente) ( la frase "sustitución conservadora de aminoácidos" se refiere preferentemente a una sustitución representada por un valor BLOSUM62 mayor de -1. Por ejemplo, una sustitución de aminoácido es conservadora si la sustitución es caracterizada por un valor BLOSUM62 de 0, 1, 2, ó 3. De acuerdo a este sistema, las sustituciones conservadoras de aminoácidos, preferidas, son caracterizadas por un valor BLOSUM62 de al menos 1 (por e emplo, 1, 2 ó 3) , mientras que las sustituciones conservadoras de aminoácidos, más preferidas, son caracterizadas por un valor BL0SU 62 de al menos 2 (por ejemplo, 2 ó 3) . Las variantes particulares de un polipéptido de citocina o de receptor (por ejemplo, VSTM3) están caracterizadas por tener al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos correspondiente de la SEQ ID NO: 2 o los 18) , en donde la variación debida a una o más aminoácidos .

Diversos dominios de dimeri:zación son adecuados para el uso de acuerdo con las proteínas de fusión diméricas como se describen en la presente. En ciertas modalidades, el dominio de dimerización es una región! constante de cadena pesada de inmunoglobulina, tal como una región Fe. La región Fe puede ser una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variante. En algunas modalidades, la región Fe carece de una o más funciones efectoras (por ejemplo, una o ambas de las funciones efectoras de ADCC CDC) . Las regiones ejemplares que carecen de una o más funciones efectoras incluyen, por ejemplo, Fc-488, Fc4 , Fc5, Fc6, y Fc7 (ver Figuras 2A-2C; SEQ ID Nos: 29-33, respectivamente, desde el residuo de aminoácido 16) .

Los ligadores polipéptidos para el uso de acuerdo con la presente invención pueden ser de origen natural, sintéticos, o una combinación de ambos. El ligador une dos regiones polipeptídicas separadas (por ejemplo, un dominio de dimerización y un polipéptido correspondiente al dominio extracelular de VSTM3 (B7R1) ) y mantiene las regiones polipeptídicas ligadas como dominios separados y discretos de un polipéptido más largo. El ligando | puede permitir que los I dominios discretos, separados, cooperen manteniendo todavía las propiedades separadas (por ejemplo, en el caso de un dominio de dimerización de la región Fe ligado a un polipéptido correspondiente al dominioj extracelular de VSTM3, al enlace al receptor de Fe (por ejemplo, FcRn) puede ser mantenido para la región Fe, mientras que las propiedades enlace a CD155 del dominio extracelular de VSTM3 serán mantenidas) . El uso de los ligados peptídicos de origen natural así como artificial para conectar los polipéptidos en los nuevos polipéptidos de fusión ligados, es bien conocido en la técnica. (Ver por ejemplo, Halllewell et al., J. Biol. Che . 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson y Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; Khandekar et al., J. Biol. Chem. 272, 32190-32197, 1997; Fares et al., Endocrinology 139, 2459-2464, 1998; Smallshaw et al., Protein Eng. 12, 623-630, 1999; Patente de los Estados Unidos No. 5,856,456.) Típicamente, los residuos dentro del polipéptido ligador son seleccionados para proporcionar un carácter hidrofílico completo y para ser no inmunogénicos y flexibles.

Como se utiliza en la presente, un Idgador "flexible" es uno que carece de una conformación de orden superior, sustancialmente estable, en solución, aunque las regiones de estabilidad local son permisibles. En general, son preferidos los residuos pequeños, polares, e hidrofílicos , y los residuos voluminosos e hidrofóbicos no son deseables. Las áreas de carga local tienen que ser evitadas; si el polipéptido ligador incluye residuos cargados, éstos ordinariamente estarán colocados para proporcionar una carga neutra neta dentro de una región pequeña del polipéptido. Por lo tanto, se prefiere colocar un residuo cargado adyacente a un residuo de carga opuesta. En general, los residuos preferidos para la inclusión dentro del polipéptido ligador incluyen Gly, Ser, Ala, Thr, Asn, y Gln; los residuos más i preferidos incluyen Gly, Ser, Ala, ¡ y Thr; y los residuos I todavía más preferidos son Gly y Ser. En general, Phe, Tyr, i Trp, Pro, Leu, lie, Lys, y Arg serán1 evitados (a no ser que estén presentes dentro de una región de bisagra de I inmunoglobulma del ligador) , los residuos de Pro debido a su i hidrofobicidad y falta de flexibilidad, y los residuos de Lys y Arg debido a la inmunogenicidad potencial. Los residuos de Cys serán incluidos, como se describe en la presente, para i proporcionar enlaces disulfuro. La secuencia del ligador será í también diseñada para evitar la proteójlisis no deseada.

I En algunas modalidades, el ligador polipeptídrco Ll i comprende o consiste de 15 a 32 residuos de aminoácidos, en donde 1 a 8 son residuos de cisteína. Dentro de una modalidad preferida de la invención, cada ligador contiene exactamente i dos residuos de cisteína. El ligador está diseñado para I proporcionar espacio suficiente y flexibilidad suficiente I entre el dominio de dimerización y el polipéptido Pl (por I ejemplo, un polipéptido Pl correspondiente al dominio I extracelular de VSTM3) para permitir que los dominios realicen sus funciones pretendidas del polipéptido. La longitud del ligador y la composición del mismo se seleccionan para proporcionar el espaciamiento deseado y el I grado de flexibilidad deseado, mientras que también i proporcionan uno o más enlaces disulfurp intercatenarios para í I I I estabilizar la conformación deseada. i En variaciones particulares, Ll es una región de bisagra de inmunoglobulina, o un fragmento o variante de una j región de bisagra de inmunoglobulina. ¡ Dentro de una modalidad í de la invención, el residuo de cjisteína más N-terminal (residuo de Eu de 220; residuo 103 de la SEQ ID NO: 27) , el I cual en un anticuerpo nativo, ensamblado, forma un enlace disulfuro con una cadena ligera de inmunoglobulina, es omitido de la bisagra, ya sea mediante reemplazo con otro residuo de aminoácido (por ejemplo, o mediante supresión o truncamiento. Otros cambios en secuencia de bisagra pueden también ser realizados. Por erjemplo, el residuo Lys i (Eu 218; residuo 101 de la SEQ ID NO:j 27) puede ser cambiado I a Arg. El ligador polipéptídico puede de este modo comprender una región de bisagra de inmunoglobu|ina, o un fragmento o variante de la misma, que contiene al; menos dos residuos de cisteína que forman enlaces disul'furo con el ligador polipéptídico sobre la otra cadena. Una región de bisagra de inmunoglobulina puede ser obtenida i partir de cualquier cadena pesada de inmunoglobulina. Las regiones de bisagra gamma (IgG) , tales como la bisagra ??, han sido bien caracterizadas y son convenientemente utilizadas dentro de la 1 I I presente invención. j Los ligadores polipeptídicos L2 ejemplares í comprenden una pluralidad de residuos de glicina. Por í ejemplo, en algunas modalidades, un ligador polipeptídico L2 comprende una pluralidad de re'siduos de glicina y opcionalmente al menos un residuo de serina. En variaciones particulares de un polipéptido que cjomprende la fórmula Pl-L1-D-L2-P2, L2 comprende la fórmula Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ j ID No: 21) . En variaciones particulares de un polipéptido que comprende la fórmula P2-L2-P1-L1-D, un ligador polipeptídico L2 comprende la fórmula [Gly-Gly-Gly Ser]n (SEQ ID NO: 22), en donde n es un número entero de 3 a 5. En una variación específica de un ligador L2 que comprende la fórmula [Gly Gly-Gly-Ser] n, n es . J Los segmentos polipeptídicos utilizados dentro de la presente invención (por ejemplo, los segmentos i polipeptídicos correspondientes a un dominio extracelular de VSTM3 , los ligadores que comprenden una región de bisagra de inmunoglobulina, y los dominios de cjimerización tales como los fragmentos Fe) pueden ser obtenidos a partir de una variedad de especies. Si la proteína dimérica va a ser utilizada terapéuticamente en humanos > se prefiere que sean empleadas secuencias polipeptídicas jhumanas. No obstante, pueden ser utilizadas secuencias no humanas, como pueden ser utilizadas también secuencias variantes. Para otros usos, incluyendo los usos de diagnóstico in vitro y usos veterinarios, las secuencias polipeptídicas provenientes de humanos o animales no humanos pueden i ser empleadas, aunque las secuencias provenientes de la ¡ misma especie que el paciente pueden ser preferidas paral el uso veterinario in vivo o para usos in vitro donde está presente la especificidad de especies de las reacciones intermoleculares. De este modo, los segmentos polipeptídicos para el uso dentro de la presente invención pueden ser, sin limitación, humanos, de primates no humanos, de roedor, caninos, felinos, equinos, bovinos, ovinos, porcinos, lagomorfcjs y aviares, asi como variantes de los mismos.

En modalidades específicas de una fusión del polipéptido que comprende la fórmula P1-L1-D-L2-P2 y en la cual cada uno de Pl y P2 son derivados del dominio SEQ ID NO: 20; los residuos 22-513, 22-¡512, 1-513, Ó 1-512 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 26-5041 26-503, 1-504, ó 1-503 de la SEQ ID NO: 12; o los residuos 23-508, 23-507, 1-508, 6 1-507 de la SEQ ID NO: 20.

La presente invención también proporciona proteínas diméricas que comprenden primera y segunda fusiones de polipéptidos como se describen anteriormente. En consecuencia, en otro aspecto más, presente invención proporciona una proteína dimérica que comprende una primera fusión del polipéptido y una segunda fusión del polipéptido, donde cada una de primera y segunda fusión de polipéptidos comprende, del extremo amino al extremo carboxilo, Pl-Ll-Dl-L2-P2 o P2-L2-P1-L1-D como se describe en la presente. Por ejemplo, en modalidades particulares, una protexna VSTM3 dimérica (B7R1) de acuerdo con la presente invención comprende una primera fusión del polipéptido y una segunda fusión del polipéptido, donde cada una de primera y segunda fusión de polipéptidos comprende, del extremo amino al extremo carboxilo, P1-L1-D1-L2-P2 , donde cada uno de Pl y P2 es derivado del dominio extracelular de VSTM3 , y donde la proteína dimérica es capaz de enlazarse específicamente al dominio extracelular de CD155 (por ejemplo, los residuos de aminoácidos 28-343 de la SEQ ID NO: 22) . En otras modalidades, una proteína VSTM3 dimérica de acuerdo con la presente invención comprende una primera fusión del polipéptido y una segunda fusión del polipéptido, donde cada una de primera y segunda fusión polipéptidos comprende, del extremo ammo al extremo carboxilo, P2-L2-P1-L1-D, donde cada uno de Pl y P2 es derivado del ! dominio extracelular de I VSTM3 , y donde la proteína dimérica! es capaz de enlazarse I específicamente al dominio extracelular de CD 155.

III . Materiales y Métodos para la Elaboración de las Fusiones I Polipeptídicas y las Proteínas Diméricas La presente invención támbién proporciona las I moléculas de polinucleótidos, que incluyen las moléculas de ADN y AR , que codifican para los (polipéptidos de fusión descritos anteriormente. Los polinucleótidos de la presente invención incluyen moléculas de una | sola hebra y de doble hebra. Los polinucleótidos que co'difican para diversos segmentos de una fusión del polipéptido (por ejemplo, un dominio de dimerización tal como jun fragmento Fe; los segmentos polipeptídicos Pl y P2) pueden ser generados y i ligados entre sí para formar un polinucleótido que codifica para una fusión del polipéptido como se describe en la I presente, utilizando métodos conoci'dos para manipulación recombinante de ácidos nucleicos. I I Las secuencias de ADN qué codifican para las citocinas y los receptores de la superficie celular (por I ejemplo, VSTM3 (B7R1) ) , incluyendo los segmentos polipeptídicos correspondientes a los kominios extracelulares de tales receptores, son conocidas! en la técnica. Las secuencias de ADN que codifican para diversos dominios de i dimerización (por ejemplo, las regiones constantes de cadena I pesada de inmunoglobulina tales comoj los fragmentos Fe) son también conocidas. Las secuencias ele ADN adicionales que I codifican para la citocina, el receptor de la superficie celular, y los polipéptidos del d'pminio de dimerización I pueden ser fácilmente generadas por aquellas personas de i experiencia ordinaria en la técnica, ; con base en el código genético. Las secuencias de ARN jcontrarias pueden ser generadas mediante sustitución de U personas expertas en la técnica reconocerán en vista de la degeneración del código genético, es posible una i variación considerable de la secuenciaj entre las moléculas de í polinucleótido que codifican para dar un polipéptido dado. El ADN y el ARN que codifican para las 'variantes y fragmentos funcionales de tales polipéptidos, j pueden ser también obtenidos utilizando métodos recombinantes conocidos, para introducir la variación dentro j de una secuencia I polinucleotídica, seguido por la expresión del polipéptido I codificado y la determinación de la actividad funcional (por ejemplo, el enlace a un receptor ¡ o ligando cognado) i utilizando un ensayo de selección apropiado.

Los métodos para preparar ADN y ARN son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los clones de ADN complementario (ADNc) pueden ser preparados a partir del ARN que es aislado de un tejido o una célula que produce grandes cantidades de ARN que codifica para un polipéptido de interés . El ARN total puede ser preparado utilizando extracción con clorhidrato de gmanidina, seguido por aislamiento mediante centrifugación en un gradiente de cloruro de cesio (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). El ARN Poli (A) + es preparado a partir del ARN total utilizando el método de Aviv y Leder (Proc. Nati. Acad. Sci.

USA 69: 1408-1412, 1972). El ADN complementario es preparado i a partir de ADN poli (A) + utilizando métodos conocidos. En una alternativa, el ADN genómico puede se aislado. Para algunas para el polipéptido de interés, fragmentos del receptor u otros socios de enlace específicos, Los polinucleótidos de la presente invención pueden también ser preparados mediante síntesis automatizada. La producción de segmentos cortos de doble hebra (de 60 a 80 pares de bases) es técnicamente directa y puede ser lograda mediante' la síntesis de las hebras complementarias y luego recociéndolas. Segmentos más largos (típicamente > 300 pares elementos genéticos requeridos para su expresión, que incluyen en general un promotor terminador de la transcripción, dentro de un vector de expresión. El vector contendrá también comúnmente uno o más marcadores seleccionables , y uno o más orígenes replicación, aunque aquellas personas expertas en la técnica reconocerán que dentro de ciertos sistemas, pueden ser proporcionados marcadores seleccionables sobre vectores separados, y la replicación del ADN exógeno puede ser proporcionada por la integración dentro del genoma de la célula hospedera. La selección de promotores, terminadores , marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es un asunto de diseño rutinario dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica. Muchos de tales elementos son descritos en la literatura y están disponibles a través de los proveedores comerciales .

Para dirigir una fusión del polipéptido hacia la vía secretora de una célula hospedera, es proporcionada una secuencia de señal secretora en el vector de expresión. La secuencia de señal secretora puede ser aquella del polipéptido nativo no de inmunoglobulina, o puede ser derivada de otra proteína secretada (jpor ejemplo, t-PA; ver Patente de los Estados Unidos No. 5,641,655) o sintetizada de novo. Un sitio de escisión manipulado por ingeniería puede ser incluido en la unión entre el péptido secretor y el resto de la fusión del polipéptido para optimizar el procesamiento proteolítico en la célula hospedera. La secuencia de señal secretora es operablemente enlazada a la secuencia de ADN que codifica para la fusión del polipéptido, por ejemplo, las dos secuencias son unidas en la estructura1 de lectura correctas, y colocadas para dirigir la fusión del polipéptido recién sintetizado hacia la vía secretora de la célula hospedera. La secuencias de señal secretoras son comúnmente colocadas 51 a la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias de señal pueden ser colocadas en otro sitio en la secuencia de ADN de interés (ver por ejemplo, Welch et al., Patente de los Estados Unidos I No. 5,037,743; Holland et al., Patentje de los Estados Unidos No. 5, 143,830). Las secuencias de señal secretoras adecuadas para el uso de acuerdo con la presente invención incluyen, j por ejemplo, los polinucleótidos que codifican para los I residuos de aminoácidos 1-35 de la j SEQ ID NO: 14 ó los í residuos de aminoácidos 1-22 de la SEQ! ID NO: 18.

La expresión de las fusiones de polipéptidos por i medio de una vía secretora de célula hospedera, se espera que i dé como resultado la producción de proteínas diméricas . En I consecuencia, en otro aspecto más, |la presente invención proporciona las proteínas diméricas qúe comprenden primera y segunda fusiones de polipéptidos pomo se describieron anteriormente (por ejemplo, una proteína dimérica que i comprende una primera fusión del polipéptido y una segunda fusión del polipéptido, donde cada ¡una de la primera y segunda fusiones de polipéptidos comprenden, desde el extremo amino hacia el extremo carboxilo, P1J-L1-D1-L2-P2 , o donde ¡ cada una de primera y segunda fusiones de polipéptidos I comprenden, desde el extremo aminb hasta el extremo carboxilo, P2-L2-P 1-L1-D, y donde laj proteína dimérica es i capaz de enlazarse específicamente al dbminio extracelular de I CD155 (por ejemplo, los residuos de aminoácidos 28-343 de la I SEQ ID NO: 22) ) . Los dímeros pueden también ser ensamblados i in vitro después de la incubación i de los polipéptidos componentes, bajo condiciones adecuadas. En general, el montaje in vitro incluirá la incubación de la mezcla de proteínas bajo condiciones de desnaturalización y de reducción, seguido por el replegamiento y reoxidación de los polipéptidos para formar dímeros. La recuperación y el ensamblaje de las proteínas expresadas en las células bacterianas, se describe más adelante, Las células de mamífero cultivadas son hospederos adecuados para el uso dentro de la presente invención. Los métodos para introducir ADN exógeno dentro de las células hospederas de mamífero incluyen la transfección mediada con fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981 : Graham y Van der Eb, Virology 52:456, 1973), electroporación (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), transfección mediada por DEAE- (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651) , BHK (ATCC No.

CRL 1632) , BHK 570 (ATCC No. CRL 10314) , 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) y las líneas celulares de ovario de hámster Chino (por ejemplo, CHO-K1, ATCC No. CCL 61; CHO-DG44, Urlaub et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980) Las líneas celulares adecuadas, adicionales son conocidas en la técnica y están disponibles de los depositarios públicos, tales como la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Pueden ser utilizados promotores de la transcripción fuertes, tales como los promotores del SV-40, del citomegalovirus , o de virus del sarcoma mieloproliferativol Ver por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,956,288 y la Solicitud de para seleccionar las células de mamífero cultivadas dentro de las cuales ha sido insertado el ADN extraño. Tales células son comúnmente denominadas como "transfectantes . " Las células que han sido cultivadas en presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés a su progenie son fluorescencia) , e incluyen, por jemplo, CD8, CD4 , el receptor del factor de crecimiento I nervioso, la proteína fluorescente, y similares. j Otras células eucarióticas superiores pueden ser también utilizadas como hospederas, j incluyendo células de insecto, células vegetales y células de aves. El uso de I Agrobacterium rhizogenes como un vector para la expresión de I los genes en las células vegetales,j ha sido revisado por Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. La transformación de células de insectío y la producción de I polipéptidos extraños en éstas es descorita por Guarino et al, i Patente de los Estados Unidos No. 5, l'62,222 y en Publicación del WIPO O 94/06463. | Las células de insecto pueden ser infectadas con baculovirus recombinantes , comúnmente derivados del virus de la polihedrosis nuclear de la Autographa californica (AcNPV) . Ver King y Possee, The Baculovirus\ Expression System: A Laboratory Guide, Chapman y Hall, London; O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual, Oxford University Press., New York, 1994;) y Richardson, Ed. , i Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, NJ, !l995. El baculovirus recombinante puede ser también producido a través del uso de ¦ i, un sistema basado en transposón, descrito por Luckow et al.

I (J. Virol. 67:4566-4579, 1993). Este sistema, el cual utiliza vectores de transferencia, es comerleialmente disponible en forma de kit (kit BAC-TO-BAC; Life Technologies, Gaithersburg, MD) . El vector de transferencia (por ejemplo, PFASTBAC1; Life Technologies) contiene un transposón Tn7 para mover el ADN que codifica para la proteína de interés hacia un genoma de baculovirus mantenido en E. coli, como un plásmido grande llamado un "báemido." Ver Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75: 1551-1556, 1994; y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Che . 270: 1543-1549, 1995. Utilizando técnicas conocidas en la materia, un vector de transferencia que codifica para una fusión del polipjéptido es transformado dentro de las células hospederas de \E. coli, y las células i son seleccionadas para los báemidos qúe contienen un gen lacZ interrumpido, indicador de baculovirus recombinante . El ADN báemido que contiene el genoma del baculovirus recombinantes I es aislado utilizando técnicas comunes, y utilizado para transfectar células de Spodoptera frügiperda, tales como las I células Sf9. El virus recombinante que expresa la. fusión del polipéptido es subsecuentemente producido. Son realizadas reservas virales recombinantes mediante métodos comúnmente utilizados en la técnica.

Para la producción de proteínas, el virus recombinante es utilizado para infectar las células hospederas, típicamente una línea celular derivada del gusano devastador del otoño, Spodoptera frugxperda (por ejemplo, las i células Sf9 o Sf21) o Trichoplusia\ ni (por ejemplo, las células HIGH FIVE; Invitrogen, Carlsbad, CA) . Ver en general, i Glick y Pasternak, supra. Ver también la Patente de los Estados Unidos No. 5,300,435. Son utilizados medios libres de I suero para desarrollar y mantener las células. Las I formulaciones de medios adecuadas son jconocidas en la técnica y pueden ser obtenidas de los proveedores comerciales . Las células son desarrolladas desde una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 105 células hasta una densidad de 1- I 2 x 106 células, tiempo en el cual e's agregada una viral recombinante a una multiplicidad; de infección (MOI, por sus siglas en inglés) de 0.1 a 10, más típicamente cercana a 3. Los procedimientos utilizados son n general descritos en los manuales de laboratorio disponibles (por ejemplo, King y i Possee, supra; O'Reilly et al., supra.;] Richardson, supra).

Las células de hongos, incluyendo células de i levadura pueden ser también utilizadas i dentro de la presente invención. Las especies de levaduras de interés particular a i este respecto incluyen Saccharo yces cerevisiae, Pichia pastoris, y Pichia methanolica. Los métodos para transformar las células de S. cerevisiae con el ADN exógeno y para producir polipéptidos recombinantes de las mismas, se describen por ejemplo, Kawasaki, de los Estados Unidos No. 4,599,311; Kawasaki et al., Patente de los Estados i j Unidos No. 4,931,373; Brake, Patente de los Estados Unidos No. 4,870,008; Welch et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,037,743; y Murray et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,845,075. Las células transformadas son seleccionadas por fenotipo determinado por marcador seleccionable, comúnmente la resistencia a fármacos o la habilidad para desarrollarse en ausencia de un ñutariente particular (por ejemplo, leucina) . Un sistema vector ejemplar para el uso en Saccharomyces cerevisiae es el sistema vector POT1 descrito por Kawasaki et al. (Patente de los Estados Unidos No. 4,931,373), que permite que las células transformadas sean seleccionadas por crecimiento en medios que contienen glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para el uso en las levaduras incluyen aquellos de los genes de enzimas glucolíticas (ver por ejemplo, Kawasaki, Patente de los Estados Unidos No. 4,599,311; Kingsman et al . , Patente de los Estados Unidos No. 4,615,974; y Bitter, Patente de los Estados Unidos No. 4,977,092) y los genes de la deshidrogenasa alcohólica. Ver tambiér. las Patentes de los Pichia methanolica, Pichia guillermondii, y Candida maltosa son conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986; Cregg, Patente de los Estados Unidos No. 4,882,279; y Raymond et al., Yeast 14: 11-23, 1998. Las células de Aspergillus pueden ser utilizadas de acuerdo a los métodos de McKnight et al. , Patente de los Estados Unidos No. 4,935,349. Los métodos para transformar Acremonium chrysogenu son descritos por Sumino et al., Patente de los Estados Unidos No. 5; 162,228. Los métodos para transformar Neurospora son descritos por Lambowitz, Patente de los Estados Unidos No. 4,48( producción de proteínas recombinantes en Pichia methanolica se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nosj. 5,716,808; 5,736,383; 5,854,039; y 5,888,768.

Las células hospederas procarióticas , incluyendo las cepas de la bacteria Escherichia coli, Bacillus y otros géneros son también células hospederas útiles dentro de la presente invención. Las técnicas para transformar estos hospederos y expresar las secuencias de ADN extrañas, clonadas en éstas son bien conocidas en la materia (ver por ejemplo, Sambrook et al., supra) . Cuando se expresa una fusión del polipéptido en bacterias tales como E. coli, el polipéptido puede ser retenido en el c ':itoplasma, típicamente como gránulos insolubles, o puede ser dirigido hacia el espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células son lisadas, y los granulos son recuperados y desnaturalizados utilizando, por ejemplo, clorhidrato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado puede ser luego replegado y dimerizado mediante dilución del desnaturalizante, tal como por diálisis contra una solución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguido por diálijsis contra una solución salina amortiguada. En una alternativa, la proteína puede ser recuperada del citoplasma en forma soluble y aislada sin el uso de desnaturalizantes. La proteica es recuperada de la I célula como un extracto acuoso en, ¡ por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato. Para capturar la proteína de I interés, el extracto es aplicado directamente a un medio cromatográfico, tal como una columna de anticuerpo inmovilizado o de heparina-Sefaróse . Los polipéptidos secretados pueden ser recuperados del espacio periplásmico de una forma soluble y funcional mediantei desintegración de las I células (por ejemplo, mediante sonicac-ión o choque osmótico) y recuperando la proteína, con lo cualj se evita la necesidad para la desnaturalización y el replegamiento. Ver por ejemplo, Lu et al., J. Immunol. Met . 2¡67 : 213-226 , 2002.

Las células hospederas! transformadas o transíectadas son cultivadas de acuerdo a los procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes I y otros componentes requeridos para jel desarrollo de las í células hospederas elegidas. Una ¡variedad de medios adecuados, incluyendo medios definidos y medios complejos, son conocidos en la técnica e incluyen en general una fuente i de carbono, una fuente de nitrógeno, 'aminoácidos esenciales, vitaminas, y minerales. Los medios pueden también contener componentes tales como factores de crecimiento o suero, como I se requieran. El medio de crecimiento |en general seleccionará las células que contengan el ADN exógenamente agregado mediante, por ejemplo, selección de fármacos o deficiente en un nutriente esencial que es complementado por el marcador seleccionable llevado sobre el vector de expresión, o co-transfectado dentro de la célula hospedera.

Las proteínas de la presente invención son purificadas mediante métodos convencionales de purificación í de proteínas, típicamente por una combinación de técnicas I cromatográficas . Ver en general Affinity Chromatography. Principies & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988; y Scopes, Protein Purifícation: Principies and Practice, Springer-Verlag, New York, 1994. Las proteínas que comprenden un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina i pueden ser purificadas mediante cromatografía de afinidad sobre la proteína A inmovilizada. Los ¡ pasos de purificación adicionales, tales como la fi en gel, pueden ser utilizados para obtener el nivel dese'ado de pureza o para proporcionar la desalación, intercambio de amotiguador, y j similares. ¡ Por ejemplo, los métodos |de fraccionamiento y/o purificación convencionales pueden ser utilizados para obtener fusiones de polipéptidos y prjoteínas diméricas de la í presente invención, purificadas a partir de las células i hospederas recombinantes . En general! la precipitación con I sulfato de amonio y la extracción con ¡ácido o caótropo pueden í ser utilizadas para el fraccionamientb de las muestras. Los I pasos de purificación ejemplares pueden incluir I hidroxiapatita, exclusión de tamaño,) FPLC y cromatografía I líquida de alta resolución de fase| inversa. Los medios cromatográficos adecuados incluyen déxtranos derivatizados , I agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices de especialidad, y i similares. Son adecuados los derivados ¡ de PEI, DEAE, QAE y Q.

I Los medios cromatográficos ejemplares incluyen aquellos I medios derivatizados con los grupos fenilo, butilo u octilo, i tales como la Fenil-Sepharose FF (Pharmacia) , Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville , ! PA) , Octyl-Sepharose i (Pharmacia) y similares; o resinas Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y sólidos adecuados incluyen esferas en sílice, resinas celulósicas, esferas de agarosa, esferas de agarosa reticuladas, esferas de poíiestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas y similares que son insolubles bajo las condiciones en las cuales éstas van a ser probadas. Estos soportes pueden ser modificados! con grupos reactivos que permiten el acoplamiento de las proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o porciones de carbohidrato.

Los Ejemplos de las químicas de acoplamiento incluyen la activación con bromuro de cianógeno, la activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, activación con hidrazida, y Otros métodos de purificación incluyén la purificación de purificación. Además, las propiedades de enlace al receptor o al ligando de una proteína diméricaj pueden ser explotadas í para la purificación. Por ejemploj, una proteína VSTM3 dimérica puede ser aislada mediante el uso de la cromatografía de afinidad en donde CD155 es enlazada a una columna, y la proteína VSTM3 dimérica es enlazada y subsecuentemente eluida utilizando métodos estándares de I cromatografía. ¡ í Los polipéptidos de la presente invención son típicamente purificados al menos ¡ a una pureza de aproximadamente 80%, más típicamente, j al menos a una pureza de aproximadamente 90% y preferentemente al menos a una pureza de aproximadamente 95%, al menos de aproximadamente i 96%, al menos de aproximadamente! 97%, al menos de aproximadamente 98%, o al menos de aproximadamente 99% de pureza con respecto a las contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libres i de agentes infecciosos y pirogénicos. ¡Los polipéptidos de la I presente invención pueden también serj purificados hasta un estado farmacéuticamente puro, que es más del 99.9% puro. En ciertas preparaciones, el polipéptjido purificado está sustancialmente libre de otros polipépjtidos , particularmente invención pueden ser utilizadas para el diagnóstico, terapia o investigación para proporcionar o más actividades asociadas con los polipéptidos Pl . Tales actividades incluyen, sin limitación, el enl'ace al receptor, la i activación del receptor y el enlace al ligando. Aquellas personas expertas en la técnica considerarán fácilmente una gama de usos para las proteínas. Los usos terapéuticos incluyen, por ejemplo, el uso como antagonistas de citocina, tales como para el tratamiento de J cánceres o trastornos I mmunitarios , y como agonistas del factor de crecimiento, uso de agentes de dirección al objetivjo para radioisótopos u í otros marcadores, para detectar la presencia de moléculas sobre las superficies celulares o en fluidos o extractos biológicos, o como controles en ensayos in vitro. Dentro de la investigación, las proteínas de la presente invención í pueden ser utilizadas, por ejemplo, parja marcar células, para evaluar la presencia de los receptores de la superficie celular o las moléculas solubles, y parja estudiar la biología de los polipéptidos citosina o receptores o sus socios de enlace .

En un aspecto particular, la presente invención proporciona los métodos de tratamiento de un trastorno inmunitario mediado por células T. métodos incluyen en general administrarle a un sujeto cjue tiene un trastorno inmunitario mediado por células T, cantidad efectiva de una proteína VSTM3 dimérica (B7R1 ) como se describe en la presente. Los trastornos inmunitarios ¡mediados por células T, aptos para el tratamiento de acujerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo, trastornos autoinmunitarios, trastornos de injerto versus hospede o (GVHD) , y rechazo de i trasplantes. Los Ejemplos de trastornos autoinmunitarios i mediados por células T incluyen j artritis reumatoide, esclerosis múltiple (MS) (por ejemplo, MS espino-óptica, S progresiva primaria ( PPMS ) , y MS en remisión/recidiva ( RPvMS ) ) , diabetes mellitus dependiente de insulina ( IDDM) , lupus eritomatoso sistémico (SLE) ,| enfermedad celiaca, polimiositis , psoriasis, artritis psoriática, vitíligo, síndrome de Sjogren, pancreatitis autoinmunitaria, trastornos inflamatorios del intestino (por ejjemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa) , s crónica activa, glomerulonefritis, esclerodermia, sarcoidosis , trastornos tiroideos autoinmunitarios, tiroidjitis de Hashimoto, enfermedad de Graves, granulomatosis Wegener, miastenia gravis, asma, enfermedad de Addison, uveorretinitis autoinmunitaria, pénfigo vulgar, cirrosis biliar primaria, I anemia perniciosa, oftalamia simpática, uveitis, anemia hemolítica autoinmunitaria, fibrosos i pulmonar, enfermedad crónica por berilio, y fibrosis pulmonar idiopática, por nombrar algunas pocas .

Para el uso terapéutico, una proteína dimérica, como se describe en la presente es distribuida de una manera consistente con metodologías convencionales asociadas con el manejo de la enfermedad o el trastorno para el cual se busca tratamiento. De acuerdo con la descripción de la presente, una cantidad efectiva de la proteína dimérica es administrada a un sujeto en necesidad de tal tratamiento, por un tiempo y bajo condiciones suficientes para prevenir o para tratar la enfermedad o el trastorno.

Los sujetos para la administración de las proteínas diméricas como se describen en la presente, incluyen a pacientes en alto riesgo para desarrollar una enfermedad o trastorno particular, así como los pacientes que presentan una enfermedad o trastorno existente. En ciertas modalidades, el sujeto ha sido diagnosticado como poseedor de la enfermedad o el trastorno para el cual se busca el tratamiento. Además, los sujetos pueden ser monitorizados durante el curso del tratamiento para cualquier cambio en enfermedad o el trastorno (por ejemplo',, para un incremento disminución en los síntomas clínicos Le la enfermedad o el trastorno) . También, en algunas variaciones, el sujeto no sufre de otra enfermedad o trastorno que requiera tratamiento que involucre la administración de una Icitocina o polipéptido receptor correspondiente al segmento dél polipéptido Pl o P2 de la proteína dimérica.

En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o los medicamentos son administrados a un paciente susceptible a, o de otro modo en riesgo de, un trastorno particular en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, o retrasar el inicio de la enfermedad o el trastorno. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones o los medicamentos son administrados a un paciente sospechoso de, o que ya sufre de tal trastorno en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente, los síntomas del trastorno y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto es denominada como una cantidad o dosis . terapéutica o farmacéuticamenjte efectiva. En los regímenes profilácticos y terapéuticos, los agentes son usualmente administrados en varias dosis hasta que ha sido lograda una respuesta suficiente (por ejemplo, la inhibición de las respuestas inapropiadas d'e las células T) Típicamente, la respuesta es monitorizada y son administradas dosis repetidas si la respuesta deseada comienza desvanecerse .

Para identificar a los pacientes objetivo para el tratamiento de acuerdo a los métodos de la invención, pueden ser empleados métodos de selección aceptados para determinar los factores de riesgo asociados con un! trastorno específico, para determinar el estado de una enfermedad existente identificada en un sujeto. Tales métodos pueden incluir, por ejemplo, la determinación de si unj individuo tiene o no parientes quienes han sido diagnosticados con un trastorno particular. Los métodos de selección pueden también incluir, por ejemplo, tratamientos convencionales para determinar el estado familiar para un trastorno particular conocido por tener un componente heredable. Para este fin, las sondas de nucleótidos pueden ser rutinariamente empleadas para marcadores genéticos interés. Además, una son conocidos en la materia, los cuales son útiles paira identificar a los marcadores para trastornos especificeos. La selección puede ser implementada como sea indicada |por la sintomatología I conocida del paciente, los factores | de edad, factores de riesgo relacionados, etc. Estos métodos permiten al clínico í seleccionar rutinariamente a los pacientes en necesidad de los métodos descritos en la presente pjara el tratamiento. De acuerdo con estos métodos, el tratamiento utilizando la proteína dimérica de la (por ejemplo, el tratamiento utilizando 3 dimérica para inhibir las respuestas ulas T) puede ser implementado como un programa de tratamiento independiente o i como un régimen de tratamiento de seguimiento, adjunto o I coordinado para otros tratamientos .

! ¡ Para la administración, proteína dimérica de acuerdo con la presente invención ¡es formulada como una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica que comprende una proteína dimérica puede ser formulada de acuerdo a los métodos conocidos para) preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante los cuales la molécula terapéutica es combinada en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Se dice ¡que una composición es un "portador farmacéuticamente | aceptable." si su í administración puede ser tolerada por ¡un paciente recipiente.

I La solución salina estéril amortiguada con fosfato es un I ejemplo de un portador farmacéuticamente aceptable. Otros ¡ portadores adecuados son bien conocidos por aquellos expertos en la materia. (Ver por ejemplo, (ed.), Remington's Phar aceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19a ed. 1995).) Las uno o más excipientes, agentes amortiguadores, albúmina para prevenir | la pérdida de proteína sobre las superficies del vial, etc.

Una composición farmacéutica que comprende una proteína dimérica de la presente invención es administrada a un sujeto en una cantidad efectiva. La proteína dimérica puede ser administrada a sujetos por una variedad de modos de administración, incluyendo, por ejemplo, mediante las rutas de administración intramuscular, subcutánea, intravenosa, i intra-atrial , intra-articular, parenteral, intranasal, intrapulmonar, transdérmica, intrapleural , intratecal, y oral. Para firtes de prevención y tratamiento, la proteína dimérica puede ser administrada a un sujeto en una distribución de bolo simple, mediante distribución continua I (por ejemplo, distribución transdérmica continua) en un periodo de tiempo prolongado, o en un protocolo de animales, seguidos por las pruebas clíjnicas en humanos, y es i guiada por la determinación de las dosis efectivas y los protocolos de administración que reducen significativamente la ocurrencia o la severidad de la enfermedad o trastorno objetivo en los sujetos modelos. Las dosis efectivas de las Ii composiciones de la presente invención| varían dependiendo de muchos factores diferentes, los medios de administración, el sitio objetivo, el stado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otros medicamentos administrados, si el tratamiento es profiláctico I o terapéutico, así como la activid d específica de la composición misma y su habilidad para I promover la respuesta deseada del individuo. Usualmente, el paciente es un humano, I pero en algunos trastornos, el paciente! puede ser un mamífero colaterales no deseados son ponderados por los efectos benéficos de inhibición de las respuestas inmunitarias mediadas por células T, con la proteína VSTM3 dimérica) . Para la administración de una proteína dimérica de la invención, tal como, por ejemplo, una proteína VSTM3 dimérica, la dosis típicamente está en intervalos de aproximadamente 0.1 g a 100 mg/kg o 1 g/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, y más usualmente 10 g a 5 mg/kg de peso corporal del sujeto. En administración inicial seguida por administraciones múltiples subsiguientes a intervalos semanales o bi-semanales . Otro régimen más consiste de una administración inicial, seguida por múltiples administraciones subsiguientes a intervalos mensuales o bimestrales. Alternativamente, las administraciones pueden ser en una escala irregular como se indica por el monitoreo de los sí tomas clínicos de la enfermedad o trastorno y/o por el monitoreo de los biomarcadores de la enfermedad u cjtras correlaciones de enfermedad (por ejemplo, actividad de células T en el caso de un trastorno inmunitario mediado por células T) .

La dosis de la composición |farmacéutica puede ser variada por el clínico que atiende, para mantener una concentración deseada en un sitio objetivo. Por ejemplo, si se selecciona un modo de administración intravenosa, la concentración local del agente en la 'corriente sanguínea en el tejido objetivo puede estar entre aproximadamente 1-50 nanomoles de la composición por litro,, algunas veces entre aproximadamente 1.0 nanomol por litr:o y 10, 15, ó 25 nanomoles por litro dependiendo de la condición del sujeto y de la respuesta medida proyectada. Pueden ser seleccionadas concentraciones más altas o más bajas con base en el modo de distribución, por ejemplo, la distribición trans-epidérmica versus la distribución a una superficie mucosal. La dosis debe ser también ajustada con base en la velocidad y liberación de la formulación administrada, por ejemplo, el I rocío nasal versus el polvo, partículas orales de liberación i sostenida o inyectadas, formulaciones transdérmicas, etc. Para lograr el mismo nivel de concentración en suero, por ejemplo, las partículas de liberación lenta con una velocidad i de liberación de 5 nanomolares (bajo condiciones estándares) I podrían ser administradas aproximadamente a dos veces la dosis de las partículas con una velocidad de liberación de 10 i nanomolares .

Una composición farmacéutica que comprende una proteína dimérica como se describe | en la presente (por I ejemplo, una proteína VSTM3 dimérica) puede ser proporcionada I en forma líquida, en un aerosol o en forma sólida. Las formas i líquidas son ilustradas por las soluciones inyectables, aerosoles, gotas, soluciones topológicas y suspensiones i orales. Las formas sólidas ejemplares incluyen cápsulas, I tabletas y formas de liberación controlada. La última forma I es ilustrada por bombas mino-osmóticas | e implantes. (Ver por i ejemplo, Bremer et al., Pharm. Biotechnol . 10:239, 1997; Ranade, "Implants in Drug Delivery, " enj Drug Delivery Systems 95-123 (Ranade y Hollinger, eds . , CRC Press 1995); Bremer et al., " Protein Delivery with Infusión Pumps," en Protein Delivery: Physical Systems 239-254 (Sartders y Hendren, eds., i Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from i a Controlled Reléase Injectable Itjiplant, " en Protein Delivery: Physical Systems 93-117 (Sanders y Hendren, eds., Plenum Press 1997).) Otras formas sólidas incluyen cremas, pastas, otras aplicaciones tópicas, y similares.

Los liposomas proporcionan u'n medio para distribuir los polipéptidos terapéuticos a un sujeto, por ejemplo, intravenosamente, intraperitonealmente , intratecalmente, intramuscularmente , subcutáneamente, o vía la administración i oral, inhalación o administración intjranasal . Los liposomas í son vesículas microscópicas que consisten de una o más bicapas lipídicas que rodean los acuosos.

(Ver, en general, Bakker- oudenberg t al., Eur. J. Clin.

I Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1)¡:S61, 1993; Kim, Drugs i 46:618, 1993; Ranade, "Site-Specificj Drug Delivery Using Liposomes as Carriers," en Drug Delivery Systems 3-24 (Ranade y Hollinger, eds., CRC Press 1995) j.) Los liposomas son similares en composición a las membranas celulares y como I resultado, los liposomas pueden ser aclministrados de manera i segura y son biodegradables . Dependiendo del método de preparación, los liposomas pueden ¡ ser unilaminares o 1 multilaminares, y los liposomas pueden ivariar en tamaño en el intervalo de 0.02 µ?a a más de 10 ym. variedad de agentes pueden ser encapsulados en liposomas: la partición de agentes hidrofóbicos en las bicapas y la partición de agentes hidrofílicos dentro del o los espacios acuosos internos. (Ver i por ejemplo, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987) ; Ostro et al., American J.

Hosp. Pharm. 46: 1576, 1989.) Además, es posible controlar la biodisponibilidad terapéutica del agente encapsulado, por la variación del tamaño del liposoma, el número de las bicapas , la composición lipídica, así como la carga y las características superficiales de los liposomas.

Los liposomas pueden adsorberse virtualmente a grandes de partículas de liposomas, o la inactivación selectiva de macrófagos por medios farmacológicos (ver Claassen et al., Biochim. Biophys Acta 802:428, 1984) Además, la incorporación de los fosfiolípidos derivatizados con glucolípido o con polietilenglicol dentro de las membranas liposomales, ha mostrado que da como resultado una absorción significativamente reducida por el sistema reticuloendotelial (ver Alien et al., Biochim. Biophys. Acta 1068: 133, 1991; Alien et al., Biochim Biophys. Acta 1150:9, 1993) .

Los liposomas pueden también ser preparados para dirigirse a células o a órganos particulares mediante la variación de la composición fosfolipídica o mediante la inserción de receptores o contra-receptores dentro de los liposomas. Por ejemplo, los liposomas, preparados con un alto contenido de un tensioactivo no iónico, han sido utilizados para dirigirse al hígado. (Ver por ejemplo, Patente Japonesa No. 04-244,018 a Hayaka a et al.; Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960, 1993.) Estas formulaciones fueron preparadas al mezclar la fosfatidilcolina de soya, cc-tocoferol, y aceite de ricino hidrogenado etoxilado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla a vacío, y luego reconstituyendo la mezcla con agua. Una formulajción liposomal de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de esterilglucósido derivada de soya (SG) colesterol (Ch) mostrado también que se dirige al hígado. (Ver Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881, 1997.) Alternativamente, diversos contra-receptores dirección al objetivo pueden ser enlazados a la superficie del liposoma, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, carbohidratos, vitaminas, y proteínas de transporte. Por ejemplo, para dirigirse al hígado, los liposomas pueden ser modificados con derivados de galactosil-lípido tipo ramificados, para dirigirse a los receptores de la asialoglucoproteína (galactosa) , que son exclusivamente expresados sobre la superficie de las células hepáticas. (Ver Kato y Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287, 1997; Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull 20:259, 1997.) En un procedimiento más general para la dirección a los tejidos, las células objetivo son previamente marcadas con anticuerpos biotinilados específicos para un contra-receptor expresado por la célula objetivo. (Ver Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99, 1998.) Después de la eliminación plasmática del anticuerpo libre, son administrados li osomas conjugados a la estreptavidina. En otro procedimiento más, los anticuerpos de dirección al objetivo son directamente enlazados a los liposomas. (Ver Harasym et al., supra.) Los polipéptidos pueden ser encapsulados dent los liposomas utilizando técnicas estándares encapsulamiento de proteínas. (Ver por ejemplo, Anderson j al-, Infect. Immun. 31: 1099, 1981; Anderson et al., Cáncer Res. 50: 1853, 1990; Cohén et al. Biophys . Acta 1063:95, 1991; Alving et al. " and Use of Liposoraes in Immunological Studies, " len Liposome Technology (Vol. III) 317 (Gregoriadis, ed. , CRC Press, 2a ed. 1993); Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124), 1987.) Como se anotó I anteriormente, los liposomas terapéutlicamente útiles pueden contener una variedad de componentes. Por ejemplo, los i liposomas pueden comprender derivados lipidíeos de poli (etilenglicol) . (Ver Alien et al ., ¡ Biochim. Biophys. Acta i 1150:9, 1993.) ¡ Las microesferas poliméricasj degradables han sido diseñadas para mantener altos nivel as sistémicos de las proteínas terapéuticas. Las microesferas son preparadas a partir de polímeros degradables tales como poli (láctido-co-glicólido) (PLG) , polianhídridos , ¡ poli(orto ésteres) , i polímeros de acetato de etilvinilo no ¡biodegradables , en los cuales las proteínas son atrapadas en | el polímero. (Ver por ejemplo, Gombotz y Pettit, Bioconjuga'jbe Chem. 6:332, 1995; Ranade, "Role of Polímeros in Drug| Delivery, " en Drug Delivery Systems 51-93 (Ranade y Hollinger, eds . , CRC Press 1995) ; Roskos y Maskiewicz, Controlled Reléase Systems Useful for Protein Protein Delivery: Physical Systems 45-92 (Sanders y Hendren, eds., Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281 : 1161 , | 1998 ; Putney y Burke, Nature Biotechnology 16:153, 1998; Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548, 1998.) Las nanoesferas recubiertas con polietilenglicol (PEG) pueden también proporcionar portadores I para administración intravenosa | de las proteínas terapéuticas. (Ver por ejemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167, 1997.) Otras formas de dosis pueden ser consideradas por aquellos expertos en la técnica como es mostrado por, por ejemplo, Ansel y Popovich, Phar aceuéical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lea y Febiger, j 5a ed. 1990) ; Gennaro (ed.), Re ington 's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995) , y Ranade y Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996) . j Las proteínas diméricas comjo se describen en la presente, incluyendo, por ejemplo, j las proteínas VSTM3 diméricas (B7R1) , pueden ser utilizadas en el contexto de la terapia génica. La terapia génica puede ser ampliamente i i definida como la transferencia del material genético hacia una célula para alterar transitoria o permanentemente el fenotipo celular. Están siendo desarrollados numerosos métodos para la distribución de Icitocinas, antigenos tumorales, y moléculas co-estimuladoras| adicionales por medio I de la terapia génica a sitios específicos dentro de los pacientes con tumores (ver en general Rosenberg (ed.), Principies and practice of the biologic therapy of cáncer I (Lippincott Williams y Wilkins, Philadelphia, PA, 3a ed.

I 2000) ) . Estas metodologías pueden ser adaptadas para utilizar I ADN o ARN que codifica para las fusiones de polipéptidos de la presente invención. j En consecuencia, en modalidades, una enfermedad o trastorno en un sujetjo es tratado por la I administración de un ácido nucleico |que . codifica para una fusión del polipéptido como se ejemplo, en ciertas modalidades, células T en un sujeto son inhib un ácido nucleico que codifica fiara una fusión del i polipéptido VSTM3 (B7R1) como se describe en la presente; utilizando tales ácidos nucleicos que ! codifican para VSTM3 , los trastornos inmunitarios mediados pcjr células T pueden ser tratados como se discutió en general) anteriormente. En el I caso de la terapia con ácidos nucleicos, una fusión del I polipéptido como se describe en la presiente es expresada y es secretada desde las células para I formar una proteina dimérica, la cual ejerce un efecto terapéutico de una manera similar a una proteína dimérica de la presente invención que i es directamente administrada a un sujeto como se describió anteriormente (por ejemplo, en el casoj de un ácido nucleico I que codifica para VSTM3 , una fusión de¡l polipéptido como se describe en la presente es expresada y ! secretada para formar j una proteína VSTM3 dimérica, la cual inhibe los efectos I mediados por las células T de una manera similar a una proteína VSTM3 dimérica que es directamente administrada a un sujeto) . Alternativamente, una fusión del polipéptido de la presente invención puede ser expresada en una forma que mantiene la asociación con la superficie de la célula en la cual es expresada la proteína (por ejemplo, con un dominio transmembranal funcional o un enlace GPI) ; tales modalidades son particularmente útiles para facilitar la dirección a células o a tejidos particulares para mantener los efectos terapéuticos localizados (tales como, por ejemplo, la inhibición localizada de las respuestas mediadas por células T vía la expresión de una proteína VSTM3 dimérica) .

Los ácidos nucleicos que codifican para polipéptido para el uso en los métodos terapéuticos pueden ser ADN o ARN. Un segmento de ácido nucleico que codifica para una fusión del polipéptido coiro se describe en la presente es típicamente enlazado a elementos regulatorios, tales como un promotor y un aumentador, que permiten la expresión del segmento de ADN en las células objetivo pretendidas de un paciente. Por ejempld, para la expresión en las células sanguíneas, como es deseable para la inhibición de las respuestas mediadas por células T vía la expresión de los polipéptidos de VSTM3, los elementos promotores y aumentadores provenientes de los genes inmunoglobulina de cadena ligera pesada genes o el promotor temprano intermediario mayor del CMV y el aumentador, son adecuados para la expresión directa. Los elementos reguladores ligados y las secuencias de codificación son a| menudo clonados dentro de un vector.

Un número de sistemas véctores virales están disponibles incluyendo los sistemas retrovirales (ver por ejemplo, Lawrie y Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109, 1993) ; vectores adenovirales (ve:: por ejemplo, Bett et al., J. Virol. 67, 591 1, 1993); vectores virales adeno-asociados (ver por ejemplo, Zhou et al., <J. Exp. Med. 179, 1867, 1994), vectores virales provenientes de la familia de los poxvirus (viruela) incluyendo el virus de la vaccinia y los virus de la viruela aviar, vectores virales provenientes del género de virus alfa tales como aquellos derivados de los Virus Sindbis y del Bosque Semliki (ver por ejemplo, Dubensky et al., J". Virol. 70, 508-519, 1996), y papilomavirus (Ohe et I al., Human Gene Therapy 6, 325-333, 1995; WO 94/12629 (Woo et al.); Xiao y Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622, 1996) .

El ADN que codifica para una fusión del polipéptido de la presente invención, o un vector que contiene el mismo, puede ser empaquetado dentro de los liposomas . Los lípidos adecuados y los análogos relacionados son descritos por las Patentes de los Estados Unidos Nos . 5,208,036, 5,264,618, 5,279,833 y 5,283,185. Los vectores y¡ el ADN que codifica para la fusión del polipéptido pueden ser también adsorbidos a o asociados con los portadores en partículas, ejemplos de los cuales incluyen polímeros de metacrilato de polimetilo y poliláctidos y poli (láctido-co-glicóli ¡¡dos) (ver por ejemplo, McGee et al., J. Micro Encap. , Los vectores para o ADN desnudos pueden ser distribuidos in vi administración a un paciente individual, típicamente mediante administración sistémica (por ejemplo, por medio de j venoclisis, inyección intraperitoneal, nasal, gástrica, intradérmica, intramuscular, subdérmica, o intracraneal) o aplicación tópica (ver por ejemplo, Patente de Jos Estados Unidos No. 5,399,346). El ADN puede también ser Administrado utilizando una pistola de genes. (Ver Xiao y Br ndsma, supra.) El ADN I que codifica para un polipéptido es j precipitado sobre la superficie de esferas metálicas microscópicas . Los microproyectiles son acelerados con una onda de choque o gas i helio en expansión, y penetran los tejidos a una profundidad de varias capas celulares. Por ejemplo, el Dispositivo de Distribución de Genes AccelMR fabricado por Agacetus, Inc. Middleton I es adecuado. Alternativamente, el ADN desnudo puede pasar a través de la piel hacia la corriente sanguínea simplemente mediante la colocación del jADN sobre la piel con irritación química o mecánica (ver por ejemplo, WO 95/05853) .

Las composiciones farmacéuticas como se describen en la presente pueden también ser utilizadas en el contexto de la terapia en combinación. Elj término "terapia en combinación" es utilizada en la presente para denotar que un sujeto es administrado al menjos con una dosis terapéuticamente efectiva de una pro|eína dimérica como se describe en la presente, y otro agentej terapéutico .

Las composiciones farmacéuticas pueden ser i suministradas como un kit que comprende un recipiente que i incluye una fusión del polipeptido, una protema dimerica, o el polinucleótido como se describe j en la presente. Una molécula terapéutica puede ser proporcionada, por ejemplo, en la forma de una solución inyectable j para dosis simples o I múltiples, o como un polvo estéril que será reconstituido antes de la inyección. Alternativamente, tal kit puede incluir un dispersador de polvo generador de aerosol líquido o nebulizador para la administración de una proteína terapéutica o un polinucleótido. además la información escrita sobre de la composición farmacéutica. Po particulares de un kit que comprend (B7R1) , tal información puede incluir una declaración de que la composición de VSTM3 está contraindicada en pacientes con sensibilidad conocida a VSTM3.

La invención es además ilustrada por los siguientes i ejemplos no limitantes. ¡ EJEMPLO 1 Construcción de la Expresión de B7R1-Barbell Murino (mB7Rl- Barbell) Un plásmido de expresión que contiene mB7Rl-mFc2- I mB7Rl (mB7Rl-Barbell con la secuenciaj de guía nativa mB7Rl; la secuencia polinucleotídica mostradajen la SEQ ID NO: 9; la secuencia polipeptídica codificada mostrada en la SEQ ID NO: 10) fue construida por medio de recombinación homologa utilizando un proceso de dos pasos. | Paso 1 j i Primeramente, un fragmento de ADN que contenía la secuencia para la proteína de fusión. mB7Rl-mFc2 (dominio extracelular (ECD) de B7R1 de ratón, fusionado a un fragmento Fe de ratón (mFc2) ) fue generado mediante amplificación por PCR utilizando un clon previamente genjerado, como plantilla.

El fragmento mB7Rl-mFc2 tuvo traslape cié secuencia dentro de i pZMP42 y fue generado utilizando los cebadores zc60639 (SEQ ID NO: 36) , ZC60643 (SEQ ID NO: 37), jy ZC60645 (SEQ ID NO: 38) . Este fragmento fue creado con las Jsiguientes condiciones de PCR: 1 ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto, I seguido por 58°C, 2 minutos, seguido r 72°C, 3 minutos; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos. | i La mezcla de reacción de PCR¡ fue corrida sobre un gel de agarosa al 1% y una banda correspondiente a los tamaños de los insertos fue extraída eni gel utilizando un Kit de Extracción en Gel QIAQUICK"* (Qiageri, Cat. No. 28704) .

El plásmido pZMP42 es un ector de expresión mamífero que contiene un cásete de expresión que tiene promotor MPSV, múltiples sitios de| restricción para la inserción para las secuencias de codificación, y una secuencia peptídica de señal otPA; un elemento del sitio de entrada al ribosoma interno (IRES, por sus siglas en inglés) proveniente del virus de la hepatitis C y el dominio extracelular de CD8 truncado en el extremo C- terminal del dominio transmembranal ; un elemento del sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) proveniente del poliovirus, un gen de DHFR, y el terminador de SV40; un orige:n de replicación de E. coli; y las secuencias URA3 y CEN-ARS requeridas para la selección y para la replicación en S. cerevisiae . Éste fue construido a partir de pZMP21 (Solicitud de Patente de los Estados Unidos Publicación No. 2003/0232414 Al) (depositada en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, designado como ATCC # PTA-5266) .

El plásmido pZMP42 fue cortado con Bglll antes de la recombinación en levadura con el fragmento de PCR. Cien microlitros de las células de levaduras competentes (S. cerevisiae) combinados con 10 µ? del ADN de inserto y 100 ng del vector de pZMP42 cortado, y la mezcla fue transferida a una cubeta de electroporación de 0.¡2 cm. La mezcla de levadura/ADN fue electropulsada utilizando un suministro de energía (Bio ad Laboratories, Hercules, CA) con ajustes a 0.75 kV (5 kV/cm) , 8 ohmios, y 25 µ?. Seiscientos µ? de sorbitol 1.2 M fueron agregados a la cubeta, y la levadura fue sembrada en placa en una alícuota de 100-µ1 y una alícuota de 300 µ?, sobre dos placas de URA-D e incubadas a 30°C. Después de aproximadamente 72 horas, los transformantes de levadura Ura+ provenientes de una placa simple fueron resuspendidos en 1 mi de agua y centrifugados brevemente para concentrar las células de levadura gránulo celular sedimentado fue suspendido mediante agitación en torbellino en 0.1 mi del amortiguador de lisis (2% de Tritón X-100, 1% de SDS, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH , EDTA 1 mM) , y 0.1 mi de Pl (del Kit Spin Miniprep QIAPREP®,] Qiagen, cat # 27106) con 10 unidades de Zimoliasa agregados Zymo Research, cat # E1002) . La suspensión de levaduras jfue incubada por 10 minutos en un baño de agua a 37 °C. El ADN proveniente de las levaduras fue aislado utilizando el protocolo estándar del Kit QIAPREP® Spin Miniprep (Qiagen, cat # 27106) , comenzando en el paso de adición del reactivo P2 La transformación de las células hospederas de E. coli electrocompetentes (DH12S) fue rea .zada utilizando 5 µ? de la preparación de ADN de levadura y 0 µ? de las células.

Las células fueron electropulsadas a 2.0 kV, 25 µ?, y 400 ohmios. Después de la electroporación,| se agregó 1 mi de SOC (2 % de Triptona BACTOMR (Difco, Detroit, MI), 0.5 % de extracto de levadura (Difco), NaCl 10 mM, KC1 2.5 mM, MgCl2 10 mM, MgS0410 mM, glucosa 20 mM) y luego las células fueron sembradas en placa en una alícuota de 50 µ? y una alícuota de 200 µ? sobre dos placas de LB AMP (calido LB (Lennox) , 1.8 % de Agar BACTOMR (Difco) , 100 mg/L Ampicilina) .

Los insertos de varios clones para la construcción I fueron sometidos a análisis secuencial y un clon, que contenía la secuencia correcta, fue j seleccionado. El ADN plásmido a mayor escala fue aislado utilizando un Kit comercialmente disponible (QIAGEN Plasmid Mega, Qiagen, I Valencia, CA) de acuerdo a las instrucCjiones del fabricante.

La construcción fue utjilizada como la base para el segundo paso de la construcción.

Paso 2 E involucra la generación ando un clon previamente agmento mB7Rl ECD tuvo un sitio de escisión de restricción BsPEI agregando el 5' del fragmento y un sitio Bsu36I al extremo 3' del fragmento, y fue generado uti los cebadores ZC60642 (SEQ ID NO: 39), ZC60641 (SEQ ID NO: 40). El fragmento fue creado utilizado las siguientes condiciones de PCR: 1 ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto, I seguido por 58 °C, 2 minutos, seguido |por 72 °C, 3 minutos; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos Las mezclas de reacción d PCR fueron corridas sobre un gel de agarosa al 1 % y una anda correspondiente a los tamaños de los insertos fue extraída en gel utilizando el Kit de Extracción en Gel QIAQUICKMR (Qiagen, Cat. No. 28704).

La construcción proveniente del primer paso y del segundo paso, el fragmento mB7Rl ECD fueron diferidas utilizando BspEI y Bsu36I. El ADN digerido para la construcción del primer paso y el fragmento de mB7RI ECD del segundo paso fueron corridos sobre un gel de agarosa al 1 % y una banda correspondiente a los tamaño 's del ADN fue extraída en gel utilizando un Kit de Extracción en Gel QIAGUICK1 (Qiagen, Cat. No. 28704) . Las dos preparaciones de ADN purificadas fueron luego ligadas entre sí utilizando métodos conocidos en la técnica.

La transformación de las células hospederas de E. coli electrocompetentes (DH12S) fue realizada utilizando 1 µ? de la preparación de ligadura y 50 µ? de las células. Las células fueron electropulsadas a 2.0 kVi , 25 \iF, y 400 ohmios.

Después de la electroporación, se agregó 1 mi de SOC (2 % de Triptona BACTOMR (Difcú, Detroit, MI), 0.5 % de extracto de levadura (Difco) , NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM, glucosa 20 mM) y luego las células fueron sembradas en placa en una alícuota de 50 µ? y una alícuota de 200 µ? sobre dos placas de LB AMP (caldo LB (Lennox) , 1.8 % de Agar BACTOMR (Difco) , 100 mg/L de Ampicilina) . j Los insertos de los diversos clones para la construcción fueron sometidos a análisis secuencial y un clon, que contenía la secuencia corrJcta, fue seleccionado. El ADN plásmido a mayor escala fue aislado utilizando un kit comercialmente disponible (QIAGEN Plasmid Mega, Kit, Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. i Este clon fue designado #1863. j La secuencia de codificación nucleotidica de I longitud completa y la secuenciáj correspondiente de aminoácidos para mB7Rl-Barbell, nativa, se muestran en las respectivamente. La forma madura a los aminoácidos 26-489 de la SEQ ID NO: 10 (codificados por I los nucleótidos 76-1467 de la SEQ ID NOj: 9) .

Expresión de mB7Rl-Barbell j I Tres grupos de 200 µg de la construcción #1863 fueron cada uno digeridos con 200 unidades de Pvu I a 37°C por tres horas, y luego fueron prejcipitados con IPA y centrifugados en un tubo para microcentrífuga de 1.5 mL. El sobrenadante fue decantado del granulo sedimentado, y el gránulo fue lavado con 1 mL de etanol al 70 % y se dejó incubar por 5 minutos a temperatura . El tubo fue centrifugado en una microcentrífuga por 10 minutos a 14,000 RPM y el sobrenadante fue decantado del gránulo sedimentado. El gránulo fue luego resuspendido en 750 µ? del medio ZF1 en un ambiente estéril, se dejó incubar a 60°C por 10 minutos, y se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente. 5 x 106 células CHO DXB11 5xSA fueron centrifugadas en cada uno de tres tubos y fueron resuspendidas utilizando las solución del medio de ADN. Las mezclas de ADN/células fueron colocadas en una cubeta de espacio vacío de 0.4 cm y sometidas a electroporesis utilizando los siguientes parámetros: 950 µ?, alta capacitancia, y 300 V. Los contenidos de las cubetas i fueron luego retirados, combinados y diluidos a 25 mLs con el medio ZF1 y colocados en un matraces de agitación de 125 mL. El matraz, fue colocado en una incubadora sobre un agitador a 37°C, con 6 % de C02, y agitando a 120 RPM.

La línea celular fue sometida a selección de nutrientes seguido por amplificación gradual hasta metotrexato 200 nM (MTX) . La expresión fue confirmada mediante transferencia de western, y la línea celular fue elevada de escala y fue seguida la purificación de proteínas EJEMPLO 2 Construcción y Expresión de B7R1 B¡arbell Humano (B7R1-Barbell) Un plásmido de expresión que !contenia B7R1-FC5-B7RI (B7R-Barbell con la secuencia guía de B7R1 nativa; la secuencia polinucleotídica mostrada en la SEQ ID NO: 5; la secuencia polipéptídica mostrada en la SEQ ID NO: 6) construyó por medio de recombinación homologa utilizando proceso de dos pasos.

Paso 1 Primeramente, fue generado ún fragmento de ADN que contenia la secuencia para la proteína de fusión B7R1-Fc5 (dominio extracelular de B7R1 humano (ECD) fusionado a la función efectora menos el fragmento de Fe, Fc5) mediante amplificación por PCR y recombinaciórí. El fragmento ECD de B7R1 y el fragmento Fc5 fueron , ela orados utilizando los clones previamente generados como plantillas. El fragmento de ECD B7R1 tuvo el traslape de secuencia dentro de Fc5 y fue generado utilizando los cebadores ZC53051 (SEQ ID NO: 41) y zc60385 (SEQ ID NO: 42) . El fragmento que codifica para tuvo un traslape 5' dentro de B7R1 ECD, un ligador de GGGSG, una región de clonación múltiple que contiene un sitio BspEI y un sitio BglII con dirección 3', y el traslape de secuencia con la secuencia del vector pZMP42, y fue generado utilizando los cebadores zc60385 (SEQ ID NO: 43) y ZC59433 (SEQ ID NO: 44 y ZC59434 (SEQ ID NO: 45) . Estos dos fragmentos fueron creados con la siguientes condiciones ¡de PCR: 1 ciclo, 94 °C, 5 minutos; 35 ciclos, 94 °C, 1 minuto, seguido por 58 °C, 2 minutos, seguido por 72°C, 3 minutos; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos .

Las mezclas de reacción d|e PCR fueron corridas sobre un gel de agarosa al 1 % y una correspondiente a los tamaños de los insertos fue extraída en gel utilizando el I Kit de Extracción en Gel QIAQUICKMR (Qiagen, Cat. No. 28704) .

El plásmido pZMP42 es un yector de expresión de mamífero que contiene un cásete de que tiene el promotor PSV, múltiples sitios de J restricción para la inserción de las secuencias de codificación, y una secuencia del péptido de señal otPA; un elemento del sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) proveniente del virus de la hepatitis C, y el dominio extracelularj de CD8 truncado en el extremo C-terminal del dominio transmembranal ; un elemento del sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) proveniente del poliovirus, un gen DHFR, y el terminador SV40; un origen de replicación de E. coli; y las secuencias URA3 y CEN-ARS requeridas para la selección y para ¡la replicación en S. cerevisiae . Esto fue construido a partjir de pZMP21 (Patente i de los Estados Unidos publicación No.j US 2003/0232414 Al) I (depositada en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10-2209, designada como ATCC# PTA-5266) El plásmido pZMP42 fue de la recombinación en levadura con 100 microlitros de las células de (S. cerevisiae) fueron independientemente combinados con 3 µ? de cada uno los fragmentos de ADN de inserto y 100 ng del vector pZMP42 cortado, y la mezcla fue transferida a una cubeta de electroporación de 0.2 cm. La mezcla de levadura/ADN fue electropulsada utilizando los ajustes del suministro de energía (BioRad Laboratories, Hercules, CA) de 0.75 kV (5 kV/cm) , oo ohmios, y 25 \iF . Se agregaron seiscientos microlitros de sorbitol 1.2 M a la cubeta, y la levadura fue sembrada en placa en un alícuota de ??'? µ? y una alícuota de 300 µ? sobre dos placas de URA-D y se incubaron a 30°C.

Después de aproximadamente 72 horas los transformantes de levadura Ura+ provenientes de una j placa simple fueron resuspendidos en 1 mi de agua y centrifugados brevemente para concentrar las células de levadura. El jgránulo sedimentado de I células fueron suspendidos mediante · agitación en torbellino I en 0.1 mi de amortiguador de lisis (2 % de Tritón X-100, 1 % SDS, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8.0, E'DTA 1 mM) , y 0.1 mL de Pl (del kit QIAPREP* Spin Miniprep kijt Qiagen, cat# 27106) con 10 unidades de Zimoliasa agregadaj (Zymo Research, cat# E1002) . La suspensión de levadura fue incubada por 10 minutos en un baño de agua a 37°C. El ADN proveniente de la levadura fue aislado utilizando el protocolo estándar del Kit QIAPREPMR Spin Miniprep (Qiagen, cat# 27106) , comenzando en el paso de I adición del reactivo P2. j La transformación de las céljulas hospederas de E. coli electro-competentes (DH12S) fue realizada utilizando 5 µ? de la preparación de ADN de levadura y 50 µ? de las células.

Las células fueron electropulsadas a 2.0 kV, 25 F, y 400 ohmios. Después de la electroporación, se agregó 1 mi de SOC (2 de Triptona BACTOMR (Difco, Detroit, MI), 0.5 de extracto de levadura (Difco) , NaCl 10 mM, KC1 2.5 mM, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM, glucosa 20 mM) y luego las células fueron sembradas en placa en una alícuota de 50 µ? y una alícuota de 200 µ? sobre dos placas de LB AMP (caldo LB (Lennox) , 1.8 % de Agar BACTOMR (Difco) , 100 mg/L Ampicilina) .

Los insertos de varios clones para la construcción fueron sometidos a análisis de secuencia y se seleccionó un clon, que contenía la secuencia correcta. El ADN plásmido a escala más grande fue aislado utilizando un kit comercialmente disponible (QIAGEN Plasmid Mega, Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

La construcción fue designada #1795 y fue creada para ser como la base para el segundo paso de la construcción.

Paso 2 La construcción # 1795 fue' construida como un primer paso para la construcción de un vector B7R1 Barbell humano en PZMP42. #1795 contiene un frc.gmento B7R1-FC5 en el vector pZMP42 el cual incluye una adición 3' que consiste de una secuencia ligadora, y una región de clonación múltiple que contiene los sitios de restricción BspEI y BglII.

El segundo paso de la construcción involucra a la generación de un fragmento B7R1-ECD utilizando un clon previamente generado como una plantilla. El fragmento B7R1 ECD tuvo un sitio de escisión de restricción de BspEI agregado al extremo 5' del fragmento, y un sitio BglII agregado al extremo 3' del fragmento, y fue generado utilizando los cebadores Zc59435 (SEQ ID NO: 77), zc60392 (SEQ ID NO: 78), y ZC59434 (SEQ ID NO 45) . El fragmento fue creado utilizando las siguientes condiciones de PCR: un ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94 °C, 1 minuto, seguido por 58°C, 2 minutos, seguido por 72°c|, 3 minutos; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos.

Las mezclas de reacción de PCR fueron corridas sobre un gel de agarosa al 1 % y una banda correspondiente a los tamaños de los insertos fue extraída en gel utilizando un Kit de extracción en Gel QIAQUICKMR (Qiagen, Cat . No. 28704).

La construcción #1795 y el fragmento B7R1 ECD del segundo paso fueron digeridos utilizando BsPEI y BglII. El ADN digerido para la construcción #1795 y el fragmento B7R1-ECD del segundo paso fueron corridos sobre un gel de agarosa al 1 % y una banda correspondiente a los tamaños de ADN fue extraída en gel utilizando el Kit de Extracción en Gel QIAQUICKMR (Qiagen, Cat. No. 28704) . Las dos preparaciones de ADN purificadas fueron luego ligadas conjuntamente utilizando los métodos conocidos en la técnica.

La transformación de las célDulas hospederas de E. coli electrocompetentes (DH12S) fue realizada utilizando 1 µ? de la preparación de ligadura y 50 µ? de las células. Las células fueron electropulsadas a 2.0 kV, 25 µ?, y 400 ohmios. Después de la electroporación, fue agregado 1 mi de SOC (2 de Triptona BACTOMR (Difco, Detroit, MI) .5 % de extracto de levadura (Difco), NaCl 10 mM, KC1 2.5 MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM, glucosa 20 mM) y luego las células fueron sembradas en placa en una alícuota de 50 µ? y una alí: cuota de 200 µ? sobre dos placas de LB AMP (caldo LB (Lennox) , 1.8 % de Agar BACTOMR (Difco) , 100 mg/L Ampicilina) .

Los insertos de varios clones para la construcción fueron sometidos a análisis de secuenc:ia y se seleccionó clon, que contenía la secuencia correctta. El ADN plásmido escala más grande fue aislado utilizando un k comercialmente disponible (QIAGEN Plasmid Mega, Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, Este clon fue designado #1812.

La secuencia de codificación nucleotídica de longitud completa y la secuencia correspondiente de aminoácidos para B7R1-Barbell, con la secuencia de señal nativa, se muestran en las SEQ ID NOS : 6, respectivamente. La forma madura de Barbell corresponde a los aminoácidos 22-498 de la SEQ ID NO: 6 (codificados por los nucleótidos 64-1494 de la SEQ ID NO: 5) .

Expresión de B7R1-Barbell Tres grupos de 200 µg de |la construcción #1812 fueron cada uno digeridos con 200 unildades de Pvu I a 37°C por tres horas, y luego fueron precipitados con IPA y centrifugados en un tubo para microcentrífuga de 1.5 mL. El sobrenadante fue decantado del granulo sedimentado, y el gránulo fue lavado con 1 mL de etanol al 70 % y se dejó incubar por 5 minutos a temperatura jambiente . El tubo fue centrifugado en una microcentrífuga por 10 minutos a 14,000 RPM y el sobrenadante sedimentado. El gránulo fue luego medio ZFl en un ambiente estéril, se dejó incubar a 60°C por 10 minutos, y se dejó enfriar a temperatura ambienté. 5 x 106 células CHO i DXBll 5xSA fueron centrifugadas en cadja uno de tres tubos y matraz fue colocado en una incubadora sobre un agitador a 37°C, 6 % de C02, y agitando a 120 RPM.j La línea celular fue sometida a selección de nutrientes seguida por amplificación gradual hasta metotrexato 200 nM (MTX) . La expresión fue confirmada mediante transferencia de western, yj la línea celular fue elevada de escala y seguida la purificación de proteína.

EJEMPLO 3 I Construcción y Expresión del Tándem B7R1 Murino (mB7Rl) - Tándem) Un plásmido de expresión que jcontiene mB7Rlm-mB7Rl-mFc2 (mB7Rl-Tándem con la secuencia guía MB7R1 nativa; la I secuencia polinucleotídica mostrada en la SEQ ID NO: 11; la secuencia del polipéptido codificado en la SEQ ID NO: 12) fue construida por medio de dentro de una versión previamente modificada del vector de expresión pZMP42 que contiene un inserto mFc2 (la construcción descrita en el paso 1 del Ejemplo 1) .

Un fragmento de ADN que contiene el dominio extracelular mB7Rl (ECD) fue elaboradp utilizando un clon previamente generado como una plantilla! El fragmento tuvo un sitio EcoRI manipulado por ingeniería en su extremo 5' y el ECD de mB7Rl, y un ligador de Gly- Ser, y fue generado utilizando los cebadores zc60639 (SEQ ID NO: 36) , ZC60640 (SEQ ID NO: 46), y zc60644 (SEQ ID INO: 47). Un segundo fragmento de ADN fue generado con traslape dentro del ligador de Gly-Ser del primer fragmento sobre el extremo 3', ECD de mB7Rl, y un sitio Bgl II sobre el extremo 3' del fragmento, y fue generado utilizando los cebadores zc60642 (SEQ ID NO: 48) y ZC28844 (SEQ ID NO: 49) .

Las mezclas de reacción dé PCR fueron corridas sobre un gel de agarosa al 1 % y una banda correspondiente a los tamaños de los insertos fueron extraídos con gel utilizando un kit de Extracción en Gel QIAQUICKMR (Qiagen, Cat . No. 28704) .

Estos dos fragmentos de ADN fueron fusionados en un fragmento único utilizando PCR de traslape . Los fragmentos purificados en gel fueron agregados dentro de un tubo de PCR y fueron amplificados utilizando los cebadores ZC60639 (SEQ ID NO: 36) y zc28844 (SEQ ID NO: 49) . El fragmento resultante contenía un sitio EcoRI 5' y un sitio Bgl II 3' flanqueando la secuencia de núcleo mB7Rl-mB7Rl.

La mezcla de reacción de PCR fue corrida sobre un gel de agarosa al 1 % y una banda correspondiente al tamaño del inserto fue extraída en gel utilizando el Kit de Extracción en Gel QIAQUICMR (Qiagen, Cat No. 28704) .

El fragmento purificado y ¡el vector modificado pZMP42 fueron digeridos utilizando EcorI and BglII, las bandas de interés fueron aisladas y fueron purificadas en gel utilizando un Kit de Extracción en Gel (Qiagen, Cat. No. 28704) . Los fragmentos purificados fueron luego ligados utilizando métodos conocidos en la técnica, tal que el fragmento mB7Rl-mB7Rl fue intraestructural con el mFc2 contenido en el vector pZMP42 modificado. La construcción resultante podría expresar una proteína que consiste de mB7Rl-mB7Rl-mFc2.

El plásmido pZMP42 es un vector de expresión de de replicación de E. coli y las secu'encias URA3 y CEN-ARS requeridas para la selección y la replicación en S. cerevisiae. Esto fue construido a partir de pZMP21 (publicación de patente No. US 2003/0232414 Al) (depositada en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, designada como ATCC# PTA-5266) .

La transformación de las céljulas hospederas de E. coli electrocompetentes (DH12S) , fue realizada utilizando 1 µ? de la preparación de ADN de ligadura y 50 µ? de células. Las células fueron electropulsadas a 2.0 kV, 25 µ?, y 400 ohms . Después de la electroporación, se agregó 1 mi de SOC (2 % BACTOMR Triptona (Difco, Detroit, MI), 0.5 % de extracto de levadura (Difco), NaCl 10 mM, KC1 2.5 mM, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM, glucosa 20 mM) y luego las células fueron sembradas en placa en una alícuota de 50 µ? y una alícuota de 200 µ? sobre dos placas de LB AMP caldo (LB Lennox) , 1.8 % de Agar BACTOMR (Difco) , 100 mg/L Ampicilina) .

Los insertos de varias colonias para la construcción fueron sometidos a análisis secuencial y un clon, que contenía la secuencia correcta, fue seleccionado. El ADN plásmido a escala más grande fue aislado utilizando un kit comercialmente disponible (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El clon final fue designado construcción #1864.

La secuencia de codificación del nucleótido de longitud completa y la secuencia de aminoácidos correspondiente para mB7Rl-Tándem, con la secuencia de señal nativa, se muestra de la SEQ ID NOs : 11 y 12, respectivamente. La forma madura de mB7Rl-Tándem corresponde a los aminoácidos 26-504 o 26-503 de SEQ ID NO: 12 (codificados por los nucleótidos 76-1512 o 76-1509, respectivamente, de la SEQ ID NO: 11) .

Expresión de mB7Rl - Tándem Tres grupos de 200 µg de la construcción #1864 fueron cada uno digeridos con 200 unidades de Pvu I a 37°C y luego fueron precipitados con IPA y centrifugados en un tubo para centrifuga de 1.5 mL. El sobrenadante fue decantado del precipitado, y el granulo fue lavado con 1 mL de etanol al 70 % y se dejó incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. El tubo 10 minutos a 14,00 del gránulo sedimentado. El gránulo fue luego resu'spendido en 750 µ? del medio ZF1 en un ambiente estéril, se djejó incubar a 60°C por 10 minutos, y se dejó enfriar hasta laj temperatura ambiente. El 5 x 106 células CHO DXB11 5xSA fueron centrifugadas en cada uno de tres tubos y fueron resuspendidas utilizando la solución del medio de ADN. Las mezclas de ADN/células fueron colocadas en una cubeta con espacio! vacío de 0.4 cm y sometidas a electroporesis utilizando los siguientes parámetros: 950 iF, alta capacitancia, y 300 V. Los contenidos de las cubetas fueron luegoj retirados, combinados y diluidos a 25 mL con el medio ZF1 y colocados en un matraz de agitación de 125 mL. El matraz jfue colocado en una incubadora sobre un agitador a 37°C,| con 6 % de C02, y agitando a 120 RPM. j La línea celular fue sometida a selección de nutrientes seguida por amplificación gradual hasta metotrexato 200 nM (MTX) . La expresión fue confirmada mediante transferencia de western y | la línea celular fue elevada de escala.

EJEMPLO 4 Construcción y Expresión del Tándem1 B7R1 (B7R1-Tándem) Un plásmido de expresión que contiene 7R1-B7R1- (B7R1-Tándem con la secuencia guía de B7R1 nativa; secuencia polinucleotídica mostrada en la SEQ ID NO: 7; la secuencia polipéptidica codificada mostrada en la SEQ ID NO: 8) fue construido por medio de la ligadura dentro de una construcción previamente generada, c.esignada construcción #1795 (la construcción descrita en el aso 1 del Ejemplo 2) . que contiene un inserto B7R1-Fc5 en ejl vector de expresión pZMP42. La construcción fue llevada a |cabo en un proceso de dos pasos .

El plásmido pZMP42 es un v†ctor de expresión de mamífero que contiene un cásete de expresión que tiene el promotor MPSV, múltiples sitios de restricción para la inserción de las secuencias de codificación, y una secuencia peptídica de señal otPA un elemento de 1 sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) proveniente del virus de la Hepatitis C, y el dominio extracelular de CD8 truncado en el extremo C-terminal y del dominio transmembranal ; |un elemento del sitio de entrada al ribosoma interno (IRÉS) proveniente del poliovirus, un gen DHFR, y un terminad.or SV40; un origen de replicación de E. coli; y las secuencias URA3 y CEN-ARS requeridas para la selección y la replicación en S. cerevisiae . Esto fue construido de pZMP21 (publicación de patente No. 2003/0232424 Al) (depositada en la American Type Culture Collection, 1080 designada como ATCC# PTA-5266) .

Paso 1 Un fragmento de ADN que | contenía el dominio extracelular (ECD) de B7R1 fue elaborado utilizando un clon previamente generado como una plantilla. El fragmento tuvo un sitio ECoRI manipulado por ingeniería en su extremo 5' el ECD B7R1, un ligador de Gly-Ser que incorpora un sitio BspEI, y fue generado utilizando los cebadores zc53051 (SEQ ID NO: 41), ZC62529 (SEQ ID NO: 50), y zc6253G¡ (SEQ ID NO: 51). Este fragmento fue creado con las siguientes condiciones de PCR: 1 ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94 °"C, 1 minuto, seguido por 58°C, 2 minutos, seguido por 72°C¡,, 3 minutos; 1 ciclo, ¡ 72 °C, 10 minutos.

La mezcla de reacción de PCR fue corrida sobre un gel de agarosa al 1 % y una banda correspondiente al tamaño del inserto fue extraída en gel utilizando el Kit de Extracción en Gel QIAQUICKMR (Qiagen, Ca . No. 28704) .

La construcción #1795 y el fragmento de PCR purificado fueron digeridos utilizando EcoRI y BspEI . El ADN digerido para la construcción #1795 yl el fragmento de PCR fueron corridos sobre un gel de agarosa al 1 % y una banda correspondiente a los tamaños del ADN fueron extraídos en gel utilizando un Kit de Extracción en Gel QIAGUICKMR (Qiagen, Cat. No. 28704) . Las dos preparaciones de ADN purificadas fueron luego ligadas conjuntamente utilizando los métodos conocidos en la técnica.

La transformación de las células hospederas de E coli electrocompetentes (DH12S) fue realizada utilizando 1 µ? de la preparación de ADN de ligadura y 50 µ? de las células. Las células fueron electropulsadas a 2.0 kV, 25 \iF, y 400 ohmios. Después de la electroporación, se agregó 1 mi de SOC (2 % de Triptona BACTOMR (Difco, Detroit, MI) , 0.5 % de extracto de levadura (Difco) , NaCl 10 mM, KC1 2.5 mM, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM, glucosa 20 mM) y luego las células fueron sembradas en placa en una alícuota de 50 µ? y una alícuota de 200 µ? sobre dos placas de LB AMP (caldo LB (Lennox) , 1.8 % de Agar BACTOMR (Difco) , 100 mg/L de Ampicilina) .

Los insertos de varios clones para la construcción fueron sometidos a análisis de secuencia y fue seleccionado un clon, que contenía la secuencia correcta. El ADN plásmido a mayor escala fue aislado utilizando un kit comercialmente disponible (QIAGEN Plasmid Mega, Kit, Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La construcción fue utilizada como la basé para el segundo paso de la construcción.

Paso 2 El segundo paso de la construcción involucra a la generación de un fragmento B7R1-Fc5 (dominio extracelular B7R1 humano (ECD) fusionado a función efectora menos el fragmento Fc5 de Fe) utilizó un clon previamente generado como una plantilla. El fragmento B7R1-Fc5 tuvo un sitio de escisión agregado al extremo 5' del fragmento, y un sitio Bgl II agregado al extremo 3' del fragnento, y fue generado utilizando los cebadores zc62531 (SEQ ID NO: 52) y zc62532 (SEQ ID NO: 53) . El fragmento fue creado utilizando las siguientes condiciones de PCR: un ciclo, 94 °c, 5 minutos ; ciclos, 94°C, 1 minuto, seguido por 58 C, 2 minutos, seguido por 72°C, 3 minutos; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos .

Las mezclas de reacción de! PCR fueron corridas sobre un gel de agarosa al 1 % y una vía correspondiente a los tamaños de los insertos y fueron extraídos en gel utilizando un Kit de extracción en Gel QIAQUICKMR (Qiagen, Cat. No. 28704) .

La construcción del primer paso y el fragmento B7R1-Fc5 del segundo paso fueron digeridos utilizando BSpEI y Bgl II . El ADN digerido para la construcción del primer paso y el fragmento B7R1-Fc5 del segundo paso fueron corridos sobre un gel de agarosa al 1 % y una vía correspondiente a los tamaños del ADN y fueron extraídos en gel utilizando el Kit de Extracción en Gel QIAQUICK (Qi gen, Cat. No. 28704) Las dos preparaciones de ADN purificado fueron luego ligadas entre si utilizando métodos conocidos la técnica.

La transformación de las células hospederas de E. coli electrocomponente (DH12S) fue realizada utilizando 1 µ? de la preparación de ligadura y 50 µ? lie células. Las células fueron electropulsadas a 2.0 kV, 25 µ? y 400 ohmios. Después de la electroporación, fue agregado 1 mi de SOC (Triptona BACTOMR al 2 % (Difco, Detroit, MI), j 0.5 % de extracto de levadura (Difco), NaCl 10 mM, KC1 2.5 | mM, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM, glucosa 20 mM) y las células fueron sembradas en placa en una alícuota de 50 µ? y una alícuota de 200 µ? sobre dos placas de LB AMP (caldo LB (Lennox) , 1.8 % de Agar BACTO1 MR (Difco) , 100 mg/L Ampicilina) .

Los insertos de varios clone!s para la construcción fueron sometidos a análisis secuenciál y se seleccionó un i clon que contenía la secuencia correcta. El ADN plásmido a escala más grande fue aislado j utilizando un kit comercialmente disponible (el Kit 'QIAGEN Plasmid Mega, Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El clon fue designado #1914 secuencia de codificación del nucleótido longitud completa la secuencia de aminoácidos correspondiente para B7R1-Tándem, la secuencia de señal nativa, se muestran en las SEQ ! ID NOs 8, respectivamente. La forma madura de B7R1-Tándem corresponde a los aminoácidos 22-513 O 22-512 SEQ ID NO: 8 (codificados por los nucleótidos 64-1539 o 64-1536 , respectivamente, de la SEQ ID NO: 7) .

Expresión de B7R1-Tándem Tres grupos de 200 µg de la construcción #1914 I fueron cada uno digeridos con 200 unidades de Pvu I a 37°C por tres horas, y luego fueron precipitados con IPA y I centrifugados en un tubo para microcentrífuga de 1.5 mL. El sobrenadante fue decantado del granillo sedimentado, y el gránulo fue lavado con 1 mL de etanol al 70 % y se dejó incubar por 5 minutos a temperatura 'ambiente . El tubo fue centrifugado en una microcentrífuga 10 minutos a 14,000 RPM y el sobrenadante fue decantado dejl gránulo precipitado.

El gránulo fue luego resuspendido en ^50 µ? de medio ZFl en i un ambiente estéril, se dejó incubar a j60 °C por 10 minutos, y se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente. 5 x 106 células CHO DXB11 5xSA fueron centrifugadas en cada uno de tres tubos y fueron resuspendidas utilizando las solución del medio de ADN. Las mezclas de ADN/célula fueron colocadas en una cubeta de espacio vacio de 0.4 cm y sometidas a medio ZFl y colocados en un matraz de agitación de 125 mL. El matraz fue colocado en una incubadora sobre un agitador a 37°C, 6 % de COz, y agitando a 120 RPM.

La línea celular fue sometida a selección de nutrientes seguida por amplificación gradual hasta metotrexato 200 M (MTX) . La expresión fue confirmada mediante transferencia de western, y la línea celular fue elevada de escala y fue seguida la purificación de proteínas EJEMPLO 5 Construcción y Expresión de B7R1 Barbell Humano con el Inicio Maduro de G25 (B7R1 [G25-P141] -Barbell) Utilizando la Secuencia Guía otPA Un plásmido de expresión que contiene B7R1 [G25-P14.1] -FC5-B7R1 [G25-P141] (B7R1 [G25-P141] -Barbell; la secuencia polinucleotídica mostrada en los residuos 106-1518 de la SEQ ID NO: 13; la secuencia polipeptídica codificada mostrada en los residuos 36-506 de la SEQ ID NO: 14) fue construido por medio de recombinación homologa utilizando tres fragmentos de ADN que, cuando son combinados, contienen la secuencia para B7R1 [G25-P141] -Barbell, y el vector de expresión pZMP42.

El fragmento B7R1 [G25-P141] - Barbell fue generado mediante amplificación por PCR de tres fragmentos utilizando clon previamente generado de B7R1-Barbell como plantilla. El primer fragmento fue creado utilizando los oligos ZC64230 (SEQ ID NO: 54) y zc64219 (SEQ ID NO: 55) que incluye una secuencia flanqueante 5' al vector, parte del vía la PCR de traslape utilizando los Oligos ZC64228 (SEQ ID NO: 58), ZC64220 (SEQ ID NO: 59), ZC64224 (SEQ ID NO: 60) , ZC64231 (SEQ ID NO: 61), ZC64225 (SEQ ID NO: 62), ZC64221 (SEQ ID NO: 63), ZC64226 (SEQ ID NO: 64) , ZC64222 (SEQ ID NO: 65), ZC64223 (SEQ ID NO: 66), ZC64258 (SEQ IN NO: 67), y ZC59434 (SEQ ID NO: 45). Cuando se ensambla mediante recombinación de levadura, la fusión de los tres fragmentos incluye un traslape 5' con el vector pZMP42, la secuencia guía otPA, un primer módulo B7R1 [G25-P141] , fusionado a Fc5, fusionado a un segundo módulo B7R1 [G25-P141] , y un traslape 3' con la secuencia vector de pZMP42. Las condiciones de PCR utilizadas para generar cada uno de los fragmentos fueron como sigue: 1 ciclo, 94°C, 5 minutos I; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto, seguido por 58 °C, 2 minutos, seguido por 72 °C, 3 minutos; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos.

Las mezclas de reacción de PCR fueron corridas sobre un gel de agarosa al 1 % y las bandas correspondientes a los tamaños de los insertos fueron extraídas en gel utilizando el Kit de Extracción en Gel QIAQUICKMR (Qiagen, Cat . No. 28704) .

El plásmido pZMP42 es un vector de expresión de mamífero que contiene un cásete de expresión que tiene el promotor MPSV, múltiples sitios de restricción para la inserción de las secuencias de codificación, y una secuencia del péptido de señal otPA; un elemento del sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) proveniente del virus de la Hepatitis C, y el dominio extracelular de CD8 truncado en el extremo C terminal del dominio transmembranal ; un elemento del sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) proveniente del poliovirus, un gen DHFR, y el terminador SV40; un origen de replicación de E. coli; y las secuencias URA3 y CEN-ARS requeridas para la selección y para la replicación en S. cerevisiae. Este fue construido a partijr de pZMP21 (Solicitud de Patente de los Estados Unidos Publicación No. US 2003/0232414 Al) (depositada en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10· 2209, designada como ATCC# PTA-5266) .

El plásmido pZMP42 fue cortado con BglII antes de la recombinación en levadura con el fragmento de PCR. Unos cien microlitros de las células de levadura competentes (S. cerevisiae) fueron independientemente combinadas con 3 µ?^ de cada uno de los fragmentos de ADN de inserto y 100 ng del vector pZMP42 recortado, y la mezcla fue transferida a una cubeta de electroporación de 0.2-cm. La mezcla de levadura/ADN fue electropulsada utilizando los ajustes de suministro de energía (BioRad Laboratories, Hercules, CA) de 0.75 kV (5 kV/cm) , oo ohmios, y 125 iF. Se agregaron seiscientos µ? de sorbitol 1.2 M a laj cubeta, y la levadura fue colocada en placa en una alícuota I de 100 µ? y de 300 µ? I sobre placas de URA-D y se incubarojn a 30 °C. Después de aproximadamente 72 horas, los transformantes de levadura Ura+ provenientes de una placa simple fueron, resuspendidos en 1 mi de agua y centri ta obtener un granulo de las células gránulo celular fue resuspendido mediante agitación en torbellino en 0.1 mi de amortiguador de lisis (2 % de Tritón xj-100, 1 % de SDS, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM| )) , y 0.1 mL of Pl (de QIAPREP® Spin Miniprep Kit, Qiagen, cat# 27106) con 10 unidades de Zimoliasa agregada (Zymo Research, cat# E1002) . La suspensión de levaduras fue incubadá por 10 minutos en un baño de agua a 37°C. El ADN proveniente de las levaduras fue aislado utilizando el protocolo del jkit estándar QIAPREP'S Spin Miniprep (Qiagen, cat# 27106) , comenzando en el paso de adición del reactivo P2. ! La transformación de las células hospederas de E. coli electrocompetentes (DH12S) fue realizado utilizando 5 µ? de la preparación de ADN de levadura y ¡50 µ? de las células.

Las células fueron electropulsadas a O kV, 25 uF, y 400 ohmios. Después de la electroporación,| e agregó 1 mi de SOC (2 % BACTOR Tryptone (Difco, Detroit, ) , 0.5 % de extracto de levadura (Difco) NaCl 10 mM, KC1 2.5 mM, MgCl210 mM, MgS04 10 mM, glucosa 20 mM) y luego las células fueron sembradas en placa en una alícuota de 50 µ? y una alícuota de 200 µ? sobre dos placas de LB AMP (caldo LB (Lennox) , BACTO al 1.8 % Agar (Difco) , 100 mg/L de Ampicilina) .

Los insertos de varios clones para la construcción fueron sometidos a análisis de secuencia y un clon, que contenía la secuencia correcta, fue seleccionado. El ADN horas, y luego fueron precipitados IPA y centrifugados en un tubo para micro-centrífuga de 1.5 mL. El sobrenadante fue decantado del gránulo sedimentado, y el gránulo fue lavado con 1 mL de etanol al 70 % y se dejó incubar por 5 minutos a temperatura ambiente . El tubo centrifugado en una microcentrífuga por 10 minutos a 14,000 RPM y el sobrenadante fue decantado del gránulo sedimentado El gránulo fue luego resuspendido en 750 µ? de medio ZF1 en un ambiente estéril, se dejó incubar a 60°C por 10 minutos, y luego se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente. 5 x 106 células CHO DXBll 5xSA fueron centrifugadas en cada uno de tres tubos y fueron resuspendidas utilizando la solución del medio de ADN. Las mezclas de ADN/células fueron colocadas en una cubeta de espacio libre de 0.4 cm y se sometieron a electroporesis utilizando los siguientes parámetros: 950 iF, alta capacitancia, y 300 V. Los contenidos de las cubetas fueron luego retirados, combinados y diluidos hasta 25 mLs con el medio ZF1 y colocados en un matraz coñ agitación de 125 mL. El matraz fue colocado en una incubadora sobre un agitador a 37°C, 6 % de C02, y agitando en 120 RMP.

La línea celular fue sometida a selección de nutrientes, seguido por amplificación gradual hasta metotrexato 200nM (MTX) . La expresión fue confirmada mediante transferencia de estern, y la línea celular fue elevada de escala y seguida por purificación de proteínas.

EJEMPLO 6 Construcción y Expresión de B7R1 Barbeil humano con el Inicio Maduro de G25 y Mutación G69Y (B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Barbeil) Utilizando la Secuencia Guía otPA Un plásmido de expresión que contenía B7R1 [G25-P141] [C69Y] -FC5-B7R1 [G25-P141] [C69Y] (B7R1 [G25-P141] [C69Y] Barbeil; la secuencia polinucleotídíca mostrada en los residuos 106-1518 de la SEQ ID NO: 13; la secuencia polipéptídica codificada mostrada en los residuos 36-506 de la SEQ ID NO: 16) fue construida por medio de recombinación homologa utilizando tres fragmentos de ADN que, cuando son combinados, contienen la secuencia para B7R1 [G25-P141] [C69Y] Barbeil, y el vector de expresión pZMP42. fragmento B7R1 [G25-P14il] [C69Y] -Barbeil fue generado mediante amplificación por PCR de tres fragmentos utilizando un clon previamente generado de B7R1-Barbell como plantilla. El primer fragmento fue creado utilizando los oligos ZC64230 (SEQ ID NO: 54) y ZC64218 (SEQ ID NO: 68) los cuales incluyen una secuencia flanqueante 5' hacia el vector, parte del primer módulo del dominio extracelular B7R1 (ECD) hasta el residuo C69, y traslapándose en los residuos detrás de C69. El segundo fragmento fue generado utilizando los oligos ZC64215 (SEQ ID NO: 56) y zc64216 (SEQ ID NO: 57) los cuales abarcan desde la secuencia flanqueante dentro del primer fragmento, hasta el residuo C69 del primer módulo de B7R1, y hasta el final de Fc5. El fragmento final fue sintéticamente creado por medio de PCR de traslape utilizando los oligos ZC64228 (SEQ ID NO: 58) , zc64220 (SEQ ID NO: 59) , 2C64224 (SEQ ID NO: 60), zc64227 (SEQ ID NO: 69), zc64225 (SEQ ID NO: 62), ZC64221 (SEQ ID NO: 63), ZC64226 (SEQ ID NO: 64), ZC64222 (SEQ ID NO: 65), ZC64223 (SEQ ID NO: 66), ZC64258 (SEQ ID NO: 67), y ZC59434 (SEQ ID NO: 45). Cuando se ensambló mediante recombinación de leveidura, la fusión de los tres fragmentos incluyó un traslape 5' con el vector pZMP42, la secuencia guía otPA, un primer módulo B7R1 [G25-P141] [C69Y] , fusionado a Fc5, fusionado a un segundo módulo B7R1 [G25-P141] [C69Y] , y un traslape 3' con la secuencia del vector pZMP42. Las condiciones de PCR utilizadas para generar cada uno de los fragmentos fueron como sigue: 1 ciclo, 5 minutos; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto,' seguido por 58°C, 2 minutos, seguido por 72°C, 3 minutos; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos .

Las mezclas de reacción de PCR fueron corridas sobre un gel de agarosa al 1 % y las bandas correspondientes a los tamaños de los insertos fueron extraídas en gel utilizando el Kit de Extracción en Gel QIAQUICKMR (Qiagen, Cat . No. 28704) .

El inserto contiene los módulos ECD de B7R1. El residuo C69 ina (Y). El inicio N- terminal de la proteína madura fue también ajustado lejos del inicio predicho humano (residuo de aminoácido 22) al residuo de aminoácido 25 (G25) . Estos cambios fueron implementados para superar varios problemas observados con la producción de la proteína humana.

El plásmido pZMP42 es un vjector de expresión de mamífero que contiene un cásete tiene el promotor MPSV, múltiples sitios para la inserción de las secuencias de codificación, y una secuencia I del péptido de señal otPA; un elemento | el sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) proveniente del virus de la hepatitis C, y el dominio extracelular de CD8 truncado en el extremo C-terminal del dominio transmembranal; un elemento del sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) proveniente del poliovirus, un gen DHFR, y el terminador SV40; un origen de í replicación de E. coli; y las secuejncias URA3 y CEN-ARS requeridas para la selección y para j la replicación en S. cerevisiae . Esto fue construido a partdir de pZMP21 (Patente de los Estados Unidos publicación No. US 2003/0232414 Al) (depositada en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10-2209, designada como ATCC# PTA-5266) El plásmido pZMP42 fue cortado con BglII antes de la recombinación en levadura con el fragmento de PCR. 100 microlitros de las células de levadura competentes (S. cerevisiae) fueron independientemente combinados con 3 µ? de cada uno de los fragmentos de ADN de inserto y 100 ng del vector pZMP42 recortado, y la mezcla fue transferida a una cubeta de electroporación de 0.2 cm. La mezcla de levadura/ADN fue electropulsada utilizando los ajustes del suministro de energía (BioRad Laboratories, Hercules, CA) de 0.75 kV (5 kV/cm) , 8 ohmios, y 25 µ?. Seiscientos microlitros de sorbitol 1.2 M fueron agregados a la cubeta, y la levadura fue sembrada en placa en un alícuota de 100 µ? y de 300 µ? sobre dos placas de URA-D y se incubaron a 30 °C. Después de aproximadamente 72 horas los transformantes de levadura Ura+ provenientes de una placa simple fueron resuspendidos en 1 mi de agua y centrifugados brevemente para concentrar las células de levadura. El granulo sedimentado de células fue suspendido por agitación en torbelllino en 0.1 mi de amortiguador de lisis (2 % de Tritón X- ¡100, 1 % SDS, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM) , y 0.1 mL de Pl (del kit Spin Miniprep QIAPREP®, Qiagen, cat# 27106) con 10 unidades de Zimoliasa (Zymo Research, cat# El 0¡02) . La suspensión de levaduras fue incubada por 10 minutos en un baño de agua a 37°C. El ADN proveniente de la levadura fue aislado utilizando el protocolo estándar del Kit QIAPREPMR Spin Miniprep (Qiagen, cat# 27106) , comenzando en el paso de adición del reactivo P2.

La transformación de las células hospederas de E. coli electrocompetentes (DH12S) fue realizada utilizando 5 µ? de la preparación de ADN de levadura y 50 µ? de las células. Las células fueron electropulsadas a 2.0 kV, 25 ]iF, y 400 ohmios. Después de la electroporación, se agregó 1 mi de SOC (Triptona BACTOMR 2 % (Difco, Detroit, MI), 0.5 % de extracto de levadura (Difco) , NaCl 10 mM, KC1 2.5 mM, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM, glucosa 20 mM) y las células fueron sembradas en placa en una alícuota de 50 µ? y una alícuota de 200 µ? sobre dos placas de LB AMP (caldo LB (Lennox) , Agar BACTO al 1.8 % (Difco) , 100 mg/L Ampicilina) .

Los insertos de varios clones para la construcción fueron sometidos a análisis de secuencia y fue seleccionado un clon, que contenía la secuencia correcta. El ADN plásmido a mayor escala fue aislado utilizando un kit comercialmente disponible (QIAGEN Plasmid Mega, Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La construcción fue designada construcción #2026.

La secuencia de codificac] nucleotídica de longitud completa y la secuencia de aminoácidos correspondiente para B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Barbell, con la secuencia de señal otPA, se muestran en las SEQ ID NOs: 15 y 16, respectivamente. La forma madura de B7R1 [G25-P141] -Barbell corresponde a los aminoácidos 36-506 de la SEQ ID NO: 16 (codificados por los nucleótidos 106-1518 de la SEQ ID NO: 15) .

Expresión de B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Barbéll Tres grupos de 200 µg de a construcción fueron cada uno digeridos con 200 unidades de| Pvu I a 37°C por tres horas, y luego fueron precipitados con IPA y centrifugados en un tubo para microcentrífuga de 1.5 mL. El sobrenadante fue decantado del gránulo sedimentado, y gránulo fue lavado con 1 mL de etanol al 70 % y se dejó incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. El tubo fue centrifugado en una microcentrífuga por 10 minutos a 14,000, RPM y el sobrenadante fue decantado del gránulo sedimentado, El gránulo fue luego resuspendido en 750 µ? de medio ZFl en un ambiente estéril, se dejó incubar a 60°C por 10 minutos, y se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente. 5 x 106 ¡células CHO DXB11 5xSA fueron centrifugadas en cada uno de tres tubos y fueron resuspendidas utilizando la solución del medio de ADN. Las mezclas de ADN/célula fueron colocadas en una cubeta de espacio vacío de 0.4 cm y sometidas a electroporesis utilizando los siguientes parámetros: 950 µ?, alta capacitancia, y 300 V. Los contenidos de las cubetas fueron luego retirados, combinados y diluidos hasta 25 mLs con el medio ZFl y colocados en un matraz de agitación de 125 mL. El matraz fue colocado en una incubadora sobre un agitador a 37°C, 6 % de C02, y agitando a 120 RPM.

La línea celular fue sometida a selección de nutrientes seguida por amplificación gradual hasta metotrexato 200 nM (MTX) . La expresión fue confirmada mediante transferencia de estern, y la linea celular fue elevada de escala y seguida la purificación de proteínas.

EJEMPLO 7 Construcción y Expresión de B7R1 Barbe] 1 humano con el Inicio Maduro de G25 y Mutación C69Y (B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Barbell) Utilizando la Secuencia Guía EMIL Un plásmido de expresión que contenía B7R1[G25- P141] [C69Y] -FC5-B7R1 [G25-P141] [C69Y] (B7R1 [G25-P141] [C69Y] - Barbell; la secuencia polinucleotídica mostrada en los residuos 67-1497 de la SEQ ID NO: 17; la secuencia polipéptídica codificada mostrada en los residuos 23-493 de la SEQ ID NO: 18) fue construido por medio de recombinación homologa utilizando un fragmento de ADN que contenía secuencia para B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Barbell , y el vector de expresión pZMP42. El fragmento B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Barbell fue generado mediante amplificación de PCR utilizando los cebadores ZC65030 (SEQ ID NO: 70), ZC65029 (SEQ ID NO: 71), y ZC59434 (SEQ ID NO: 45) .

El fragmento B7R1 [G25-P14Í] [C69Y] -Barbell fue elaborado utilizando un clon previamente generado de B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Barbell como plantilla, designada construcción #2026. El fragmento incluye un traslape 5' con la secuencia del vector pZMP42, una secuencia guía designada como "EMIL" (residuos 1-66 de la SEQ de aminoácidos codificada mostrada en SEQ ID NO: 18), el segmento B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Barbell (residuos 67-1497 de la SEQ ID NO: 1 ; secuencia codificada de aminoácidos mostrada en los residuos 23-493 de la SEQ ID NO: 18), y un traslape 3' con la secuencia del vector pZMP42. Las condiciones de PCR utilizadas fueron como sigue: un ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto, seguido por 58°C, 2 minutos, seguido por 72°G, 3 minutos; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos. ¡ La mezcla de reacción de PCI^. fue corrida sobre un gel de agarosa al 1 % y una banda correspondiente al tamaño del inserto fue extraída en gel utilizando un Kit de Extracción en Gel QIAQUICKMR (Qiagen, cát. No. 28704) .

El inserto contiene modificaciones de los módulos del dominio extracelular (ECD) de B7R1. El residuo C69 fue mutado a tirosina (Y) . El inicio N-terminal. de la proteína madura fue también ajustado lejos del jinicio predicho humano (residuo de aminoácido 22) al residuo de aminoácido 25 (G25) . Estos cambios fueron implementados para superar diversos problemas observados con la producción de la proteína humana.

El plásmido pZMP42 es un vector de expresión de mamífero que contiene un cásete de expresión que tiene el promotor MPSV, múltiples sitios dej restricción para la inserción de las secuencias de codificación, y una secuencia de péptido de señal otPA; un elemento del sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) proveniente del virus de la Hepatitis C, y el dominio extracelular de CD8 trincado en el extremo C-terminal del dominio transmembranal ; un elemento del sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) proveniente del poliovirus, un gen DHFR, y el promotor SV40; un origen de replicación de E. coli; y las secuencias URA3 y CEN-ARS requeridas para la selección y para ¡ la replicación en S. cerevisiae. Este fue construido a partdjr de pZMP21 (Solicitud de Patente de los Estados Unidos J Publicación No. US 2003/0232414 Al) (depositado en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110- 2209, designado como ATCC# PTA-5266) . j j El plásmido pZMP42 fue cortado con BglII antes de la recombinación en levadura con el fjragmento de PCR. Cien microlitros de células de levadura competentes (S. cerevisiae) fueron independientemente combinadas con ??µ?? de inserto y 100 mg del vector pZMP42 cortado, y la mezcla fue transferida a una cubeta de electroporación de 0.2-cm. La mezcla de levadura/ADN fue electropulsada utilizando los ajustes de suministro de energía ¡(BioRad Laboratories, Hercules, CA) de 0.75 kV (5 kv/cm) , oo ohmios, y 25 F.

Seiscientos µ? de sorbitol 1.2 fueron agregados a la cubeta, y la levadura fue sembrada en placa en una alícuota de 100 µ? y una alícuota de 300 µ? sobre placas de URA-D y se incubaron a 30°C. Después de aproximadamente 72 horas, los transformantes de levadura Ura+ provenientes de una placa simple fueron resuspendidos en 1 mi de agua y centrifugados brevemente para concentrar el granulo de las células de levadura. El gránulo celular sedimentado fue resuspendido mediante agitación en torbellino en 0.1] mi de amortiguador de lisis (2 % de Tritón x-100, 1 % de SDSI, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM) , y 0.1 mL of Pl (de QIAPREP® Spin Miniprep Kit, Qiagen, cat# 27106) con 10 unidades de Zimoliasa agregada (Zymo Research, cat# E1002) . La suspensión de levaduras fue incubada por 10 minutos en un baño de agua a 37°C. El ADN proveniente de la levadura fue aislado utilizando el protocolo estándar QljAPREP0 Spin Miniprep (Qiagen, cat# 27106) , comenzando en el paso de adición del reactivo P2.

La transformación de las células hospederas de E. coli electrocomponentes (DH12S) fue realizado utilizando 5 µ? de la preparación de ADN de levadura y 50 µ? de células. Las células fueron electropulsadas a 2.0 kV 25 yF, y 400 ohmios.

Después de la electroporación, se agregó 1 mi de SOC (Tryptone BACTO al 2 % (Difco, Detroit, MI), 0.5 de extracto de levadura (Difco) NaCl 10 mM, KC1 2.5 mM, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM, glucosa 20 mM) y luego las células fueron sembradas en placa en una alícuota de 50 µ? y una alícuota de 200 µ? sobre dos placas de LB AMP (caldo LB (Lennox) , Agar BACTOMR al 1.8 % (Difco), 100 mg/L de Anpicilina) .

Los insertos de varios cloness para la construcción fueron sometidos a análisis de secuencia y fue seleccionado un clon, que contenía la secuencia correcta. El ADN plásmido a mayor escala fue aislado utilizando un Kit comercialmente disponible (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qijagen, Valencia, CA) de acuerdo a las instrucciones del f bricante. La construcción fue designada construcción #2065.

La secuencia de codificación nucleotídica de longitud completa y la secuencia de aminoácidos correspondiente para B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Barbell, con secuencia de señal EMIL, son mostradas en la SEQ ID NOs : 17 y 18, respectivamente. La forma madura de B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Barbell corresponde a los aminoácidos 23-493 de la SEQ ID NO: 18 (codificados por los nucleótidos 6¡7-1497 de SEQ ID NO: 17) .

Expresión de B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Barbell Tres grupos de 200 µg de 1a construcción fueron cada uno digeridos con 200 unidades de Pvu I a 37°C por tres horas, y luego fueron precipitados con IPA y centrifugados en proteínas .

EJEMPLO 8 Construcción y Expresión de B7R1 Tánde'm humano con el Inicio Maduro de G25 y la Mutación C69Y (B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Tándem) Utilizando la Secuencia Guía EMIL Un plásmido de expresión que contiene B7R1[G25-P141] [C69Y] -B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Fc5 | (B7R1 [G25-P141] [C69Y] Tándem; la secuencia polinucleotídíca mostrada en los residuos 67-1524 de la SEQ ID NO: 19; la secuencia polipeptídica codificada mostrada en ios residuos 23-508 de la SEQ ID NO: 20) fue construido por medio de recombinación homologa utilizando un fragmento de ADN que contiene la secuencia para B7R1 [G25-P141] [C6 -B7R1 [G25-P141] [C69Y] (residuos 23-139 de SEQ ID NO: 20), fragmento de ADN que codifica para Fc5, y el vector de (expresión pZMP42. El fragmento B7R1 [G25-P141] [C69Y] -B7R1 ¡ [G25-P141] [C69Y] fue generado por una serie de amplificaciones de PCR utilizando los OÜgos ZC65030 (SEQ ID NO: 70), ZC65029 (SEQ ID NO: 71), ZC65050 (SEQ ID NO: 72), zc65051 (SEQ IlD NO: 73) , y zc65052 (SEQ ID NO: 74) . El fragmento Fc5 fue generado utilizando los Oligos ZC65053 (SEQ ID NO: 75) y zc65054 (SEQ ID NO: 76) .

El fragmento B7R1 [G25Í-P141] [C69Y] -B7R1 [G25- P141] [C69Y] fue elaborado utilizando un clon previamente generado de B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Fc5-¡B7R1 [G25-P141] [C69Y] (B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Barbell) como la ¡ plantilla, designado construcción # 2026 (ver Ejemplo 6)j. La primera reacción amplificó una unidad B7R1 [G25-P141] [C69Y] con una secuencia guía 5'EMIL utilizando los oligos zc65030 (SEQ ID NO: 70), incluye un traslape 5' con la secuencia vector de pZMP42, una secuencia guía designada como "EMIL" (residuos 1-66 de la SEQ NO: 19; la secuencia de aminoácidos codificada mostrada en los residuos 1-22 de la SEQ ID NO: 20) , dos copias secuenciales de B7R1 [G25-P141] [C69Y] 1igadas por un ligador Gly-Ser (residuos 67-828 de la SEQ jlD NO: 19; secuencia codificada de aminoácidos mostrada en los residuos 23-276 de SEQ ID NO: 20), y un traslape 3' el extremo 5 ' de Fc5. condiciones de PCR para todas reacciones utilizadas fueron como sigue: 1 ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto, seguido por 58°C, 2 minutos seguido por 72 °C, 3 minutos; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos.

Un segundo fragmento que j codifica para Fc5 (residuos 829-1524 de la SEQ ID NO: 19; secuencia codificada de aminoácidos mostrada en los residuos 277-508 de la SEQ ID NO: 20) fue generado utilizando los cebadores zc65053 (SEQ ID NO: 75) y zc65054 (SEQ ID NO: 76) . Este fragmento incluye el fragmento Fc5 y un traslape 3' con el vector pZMP42.

Las mezclas de reacción de PCR fueron corridas sobre un gel de agarosa al 1 % y las ¿andas correspondientes a los tamaños de los insertos fue on extraídas en gel utilizando el Kit de Extracción en Gel QIAQUICKMR (Qiagen, Cat . No. 28704) .

El inserto contiene modificaciones de los módulos del dominio extracelular (ECD) de B7pJl . El residuo C69 fue mutado a la tirosina (Y) . El inicio N-tjerminal de la proteína madura fue también ajustado lejos del linicio humano predicho (residuo de aminoácido 22) al residuo de aminoácido 25 (G25) . Estos cambios fueron implementados | para superar varios problemas observados con la producción ke la proteína humana.

El plásmido pZMP42 es un vector de expresión de ribosoma interno (IRES) proveniente del| virus de la hepatitis C, y el dominio extracelular de CD8 en el extremo C- terminal del dominio transmembranal ; un j elemento del sitio de entrada al ribosoma interno (IRE'S) proveniente del poliovirus, un gen DHFR, y el terminador SV40; un origen de replicación de E. coli; y las secuencias URA3 y CEN-ARS requeridas para la selección y la replicación en S. cerevisiae. Esto fue construido a partir de pZMP21 (Solicitud Patente de los Estados Unidos publicación No. US 2003/0232414 Al) (depositada en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 2¡( -2209, designado como ATCC# PTA-5266) El plásmido pZMP42 fue cortado con BglII antes de la recombinación en levadura con los fragmentos de PCR. 100 microlitros de las células de levadura competentes (S. cerevisiae) fueron independientemente combinados con 5 µ? del fragmento de ADN de B7R1 [G25-P141] [C69Y] -B7R1 [G25-P141] [C69Y] , 5 µ? del ADN del fragmento de Fc5, y 100 ng del vector pZMP42 cortado, y la mezcla fue transferida a una cubeta de electroporación de 0.2 cm. La mezcla de levadura/ADN fue electropulsada utilizando los ajustes de suministro de energía (BioRad Laboratories, Hercules, CA) de 0.75 kv (5 kV/cm) , oo ohmios, y 25 µ¥ . sjeiscientos microlitros de sorbitol 1.2 M fueron agregados a la cubeta, y la levadura se sembró en placa en un alícuota de 100 µ? y un alícuota de 300 µ? sobre dos placas de URA-D y se incubaron a 30°C.

Después de aproximadamente 72 horas los transformantes levadura Ura+ provenientes placa simple fueron resuspendidos en 1 mi de agua y centrifugados brevemente para sedimentar las células de levadura. El granulo celular fue resuspendido mediante agitación en torbellino en 0.1 mi de amortiguador de lisis (2 % de Tritón X-100, 1 % SDS, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM) y 0.1 mL de Pl (de QIAPREP® Spin Miniprep Kit Qiagen, cat# 27106) con 10 unidades de Zimoliasa agregada (Zymo iResearch, cat# E1002) . La suspensión de levaduras fue incubada por 10 minutos en un baño de agua a 37°C. El ADN proveniente de la levadura fue aislado utilizando el protocolo estándar del QIAPREPMR Spin Miniprep Kit (Qiagen, cat# 27106) , comenzando en el paso de adición del reactivo P2.

La transformación de las células hospederas de E. coli electrocompetentes (DH12S) fue rea] .zada utilizando 5 µ? de la preparación de ADN de levadura 0 µ? de las células. Las células fueron electropulsadas a 0 kV, 25 uF, y 400 ohmios . Después de la electroporación e agregó 1 mi de SOC (2 de Triptona BACTO (Difco, Detroit, MI), 0.5 % de extracto de levadura (Difco) , NaCl 10 mM, KC1 2.5 mM, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM, glucosa 20 mM) y las células fueron luego sembradas en placa en una alícuota de 50 µ? y una alícuota de 200 µ? sobre dos placas de LB AMP (cai Ido LB (Lennox) , Agar BACT0MR al 1.8 % (Difco), 100 mg/L Ampicilina) .

Los insertos de los diversos clones para la construcción fueron sometidos a análisis de secuencia y fue seleccionado un clon, que contenía la | secuencia correcta. El ADN plásmido a escala más grande fue¡ aislado utilizando un Kit comercialmente disponible (QIAGENj Plasmid Mega, Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante La construcción fue designada construcción #2066.

La secuencia de codificación nucleotídica de longitud completa y la secuencia correspondiente de aminoácidos para secuencia de señal 20, respectivamente Tándem, corresponde a los aminoácidos 23-508 o 23-507 de la i SEQ ID NO: 20 (codificados por los nucjleótidos 67-1524 o 67- 1521, respectivamente, de la SEQ ID NO:¡ 19) .

Expresión de B7R1 [G25-P141] [C69Y1-Tándem Tres grupos de 200 µg de lja construcción fueron cada uno digeridos con 200 unidades de ! Pvu I a 37°C por tres i horas, y luego fueron precipitados con ??? y centrifugados en un tubo para microcentrífuga de 1.5 mL. El sobrenadante fue decantado del gránulo sedimentado, y el granulo fue lavado con 1 mL de etanol al 70 % y se dejó incubar por 5 minutos a temperatura ambiente . El tubo fue centrifugado en una microcentrífuga por 10 minutos a 14,000 RPM y el sobrenadante fue decantado del gránulo sedimentado . | El gránulo fue luego resuspendido en 750 µ? de medio ZFl en un ambiente estéril, se dejo incubar a 60°C por 10 minutos, y luego se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente. 5 x 106 células CHO DXB11 5xSA fueron centrifugadas en cada uno de tres tubos y I fueron resuspendidas utilizando la solución del medio de ADN. Las mezclas de ADN/células fueron colocadas en una cubeta de espacio vacío de 0.4 cm y se sometieron a electroporesis utilizando los siguientes parámetros : 950 µ? , alta capacitancia, y 300 V. Los contenidos) de las cubetas fueron luego retirados, combinados y diluidos hasta 25 mLs con el medio ZFl y colocados en un matraz de agitación de 125 mL. El matraz fue colocado en una incubadora sobre un agitador a 37 °C, con 6 % de C02, y agitando a 120 RPM.

La línea celular fue sometida a selección de nutrientes seguida por amplificación gradual hasta metotrexato 200 nM (MTX) . La exprjesión fue confirmada mediante transferencia de western, y la línea celular fue elevada de escala y siguió la purificación de proteínas.

EJEMPLO 9 ¡ Purificación de las Proteínas B7R1 Tándjem y Barbell de Humano y de Ratón Los dominios extracelulares de B7R1 solubles, de humano y de ratón, fueron fusionados con la Fe humana en dos configuraciones, Tándem y Barbell (ver Ejemplos anteriores) , para la expresión transitoria y estable. Las proteínas de i fusión B7R1 Fe humanas fueron producidas a partir de las células 293 o las células CHO transíecladas , y las proteínas de ratón provenientes de las células jCHO transíectadas . Las transfecciones fueron realizadas utilizando métodos conocidos en la materia. Las proteínas de raltón fueron producidas consistentemente en niveles más altos que las formas humanas, hasta que las formas humanas fueron manipuladas por ingeniería genética para lograr rendimjientos más altos. (Las formas humanas fueron manipuladas por j ingeniería para tener un inicio maduro en la glicina 2j5 (G25) del dominio extracelular B7R1 nativo, así como j para incorporar una mutación de cisteína a tirosina en la posición 69 (C69Y) ; ver por ejemplo, los Ejemplos 7 y 8 anteriores). Todas las formas fueron purificadas utilizando el mismo (proceso consistente de una captura de afinidad seguida pojr concentración para intercambio de amortiguador, utilizando cromatografía de exclusión de tamaño. Para las proteínas de fusión B7R1 Fe de humano y de ratón, las purificaciones fueron realizadas a escala de mesa de laboratorio de 1.5 a 10 Litros.

Tabla 3: Purificación de B7R1-Tándem -Barbell de humano o de ratón Sodio, con Amortiguador de Sulfato de Amonio 250 mM de pH 3 y equilibrada con 20 CV de Citrato de Sodio 25 mM - Fosfato de sodio, Sulfato de Amonio 250 mM de pH 7.2. El sobrenadante de cultivo de CHO fue cargado directamente a la columna de Proteína A, a 24 - 42 cm/hora toda la noche a 4°C para capturar la proteína de fusión B7R1 Fe en el sobrenadante.

Después de que la carga fue completada,] la columna fue lavada con al menos 10 CV de amortiguador de equilibrio. Enseguida la columna fue lavada con al menos 10 !CV de Citrato de Sodio 25 mM - Fosfato de Sodio, Amortiguador de Sulfato de Amonio 250 mM de pH 7.2, después de lo cual la proteína enlazada fue eluida a 92-149 cm/hora con un gradiente de 20 CV desde pH 7.2 hasta pH 3 formado utilizando los amortiguadores de Citrato-Fosfato-Sulfato de Amonio Las fracciones que contenían el objetivo fueron recolectadas dentro de tubos que contenían Tris 2.0 M, pH 8.0, con el fin de neutralizar inmediatamente las proteínas eluidas Las fracciones fueron combinadas con base en las inflexibnes A280 sobre los perfiles de elución.

El combinado de afinidad fue enseguida concentrado a < 3 % del volumen de la columna dé exclusión de tamaño mediante ultrafiltración utilizando ya sea un dispositivo centrífugo Amicon Ultra-15 30K WML (Millipore) o una celda agitada con una membrana de corte de peso molecular de 30 kD.

Posteriormente el concentrado fue inyectado sobre una columna Superdex 200 de tamaño apropiado que fue pre-equilibrada en Fosfato de Sodio 35 mM, Cloruro de Sodio 120 mM, de pH 7.3' a 28 cm/hora. Las fracciones que contenían la proteína de fusión B7R1 Fe purificada fueron combinadas con base en A280, filtradas a través de un filtro de 0.2 µp?, evaluadas para el contenido y para la endotoxina, y congeladas como alícuotas a -80°C. El contenido de la proteína | purificada final fue determinado por absorbancia a A280 utilizando el coeficiente de extinción teórico. Las recuperaciones generales del proceso variaron de 10 a 14 mg/L para jlas proteínas de ratón y de 6 a 66 mg/L para las construcciones humanas.

Análisis de las Proteínas Purificadas B7R1-Tándem y -Barbell Las proteínas de fusión B7R1 Fe recombinantes fueron caracterizadas mediante SDS-PAGE (4-12 % BisTris, Invitrogen, Carlsbad, CA) con tinción de Coomassie R250 al 0.1 % para proteína, y mediante inmunotransferencia con anti- IgG-HRP. La proteína purificada fue sometida a electroforesis utilizando una minicelda Xcell II de Invitrogen Novex's, y se transfirió a nitrocelulosa (0.2 mm; Invitrogen, Carlsbad, CA) a temperatura ambiente a 600 mA por 45 minutos en un amortiguador que contenía base de Tris 25 mM, glicina 200 mM, y 20 % de metanol. Los filtros fueron luego bloqueados con 10 % de leche en polvo descremada en Tris 50 mm, Cloruro de Sodio 150 mM, EDTA 5 mM, 0.05 % de Igepal (TBS) por 15 minutos a temperatura ambiente. La nitrocelulosa fue i rápidamente enjuagada y el anticuerpo IgG-HRP (1:10,000) fue agregado. Las transferencias fueron incubadas toda la noche a 4°C, con agitación suave. Después de la incubación, las transferencias fueron lavadas tres veces por 10 minutos cada una en TBS, y luego enjuagadas rápidamente en agua. Las transferencias fueron reveladas utilizando reactivos de substrato quimioluminiscente comercialmente disponibles (Roche LumiLight) , y la señal fue capturada utilizando el instrumento ImageQuant TL y el software (GE Healthcare) . Las proteínas de fusión Tándem y Barbell de Fe de ratón y humanas de B7R1 purificadas, aparecieron como dos bandas sobre la transferencia de Western y el gel teñido con Coomassie cerca de 160 kDa bajo condiciones no reductoras, y cerca de 64 kDA bajo condiciones reductoras, sugiriendo las formas diméricas glucosiladas como se esperaba. Las proteínas tuvieron el extremo NH2 correcto, la composición correcta de aminoácidos, y fueron bien caracterizadas para la masa y el porcentaje de glucosilación utilizando SEC MALS .

EJEMPLO 10 Análisis de Dispersión Dinámica de Luz (DLS) de las Proteínas de Fusión B7R1 Fue empleada la Dispersión Dinámica de Luz (DLS) para monitorizar la estabilidad a corto plazo y la agregación de las construcciones de fusión B7R1 humana y murina a 21°C, 5°C y 37°C con el instrumento DynaPro Plus (Wyatt Technology, Santa Bárbara, CA) en el formato de lector de placas. Como resultado de estos estudios iniciales que comparan las versiones murina con la humana, fueron llevados a cabo experimentos adicionales con el ¡fin de comparar la estabilidad de las construcciones Barbell y tándem humanas, mutadas a sus contrapartes humanas originales . 1. Antecedentes de la técnica analítica DLS mide las fluctuaciones dependientes del tiempo de la intensidad de luz dispersa sobre una escala de tiempo de microsegundos . Estas fluctuaciones en intensidad son el resultado de las partículas que se la solución debido a un movimiento Browniano, y de difusión está relacionada a su tamaño. Los de DLS son capturados como una gráfica de funciónj de autocorrelación, a partir de la cual es obtenido un coeficiente de difusión (Dt) . Cuando están presentes múltiples jespecies, por ejemplo, el monómero con oligómeros más grandes o agregados, es observada una distribución de los coeficientes de difusión después de la desconvolución por el ¡software Dynamics (v. 6.0, Wyatt Technology). El radio hidrodinámico (o radio de Stokes) Rh, es luego derivado por el Software utilizando la relación de Stokes-Einstein, la cual describe la relación teórica entre la velocidad de difusión y el tamaño de las partículas en solución.

La DLS es extremadamente sensjible a cantidades muy pequeñas de especies grandes, y puede ser utilizada para cuantificar de manera confiable los agregados proteicos hasta 0.01 % de la muestra total. 2. Descripción de los parámetros del análisis Preparación de la Muestra Fueron recuperadas muestras del almacenamiento a -80 °C y descongeladas hasta la temperatura ambiente por 30 minutos para el análisis a 1 mg/mL, o después de un paso concentración por centrifugación en unidades 10K M CO Amicon para el análisis de 25 mg/mL. Fueron luego transferidas alícuotas de 200 µ?? a tubos para microqentrífuga de 1.5 mL, y centrifugadas por cinco minutos a 14K rpm en una centrífuga de mesa Eppendorf a temperatura ambiente . Después de la centrifugación, 20 µ]-? de la muestra fueron transferidos a una placa de fondo de vidrio de 384 pozos Corning para el barrido por triplicado para cada muestra. Una gota única cubierta de aceite de silicona fue agregada a cada pozo por la duración del análisis. Ambas concentraciones! de muestra fueron probadas en el amortiguador de formulación original únicamente .

Parámetros de Análisis Fueron recolectados los datos sobre cada pozo por 60 segundos en paquetes de 15 segundos cada uno. Las muestras fueron exploradas después de 2 horas a temperatura ambiente para la lectura 21°C, toda la noche a 5°C y después de una incubación de 2 horas a 37°C. Un experimento de curso de tiempo separado a 37°C, o muestras recién preparadas, fue también conducido para monitorizar la agregación sobre el tiempo a la temperatura más alta. 3_. Resumen de los Resultados Clave para las clasificaciones de distribución de tamaño por DLS Los términos "monomodal" y "multimodal" describen el número de charolas (o picos) delectados. Los términos "monodisperso" y "polidisperso" describe la variabilidad del tamaño de las especies dentro de cada charola. Por ejemplo, una muestra clasifica como monomodal/polidisperso = una charola detectada que contiene más de una especie estrechamente relacionada, tal como monómero/dímero/trímero .

Diferencias observadas entre as formas murina humana El análisis de las formas iniciales de B7R1 murina purificada mostró que las cuatro configuraciones, es decir, las formas Fe (SEQ ID NO: 34) , VASP (SEQ ID NO: 35) , Barbell (SEQ ID NO: 10 residuos 26-489; Construcción 1863) y tándem (SEQ ID NO: 12 residuos 26-504 o 26-503; Construcción 1864), fueron estables a las tres temperaturas . No se observó ninguna inestabilidad a 37°C. De manera contraria, las formas humanas de las formas Barbell (SEQ ID NO: 6 residuos 22-498; Construcción 1812) y tándem (SEQ ID NO 8 residuos 22-513 o 22-512; Construcción 1914) mostraron agregación desordenada marcada e inestabilidad a 37°C, la mostraron las construcciones Fe humana (B7R1-Fc5; SEQ ID NO: 79) y VASP (B7R1-VASP; SEQ ID NO: 81) . Esta agregación fue observada dentro de 2 horas y no fue reversible, sugiriendo que la asociación/agregación había procedido a través de la vía del desplegamiento . La inestabilidad en B7R1 a 37°C fue observada a las concentraciones baja y alta, y fue consistente de lote a lote analizado.

El efecto de la mutación de las formas humanas Barbel1 y tándem Las formas humanas de las moléculas Barbell y tándem de B7R1 humana [G25-P141] [C69Y] -jBarbell (SEQ ID NO: 18 residuos 23-493; ver Ejemplo 7) y B7R1 [JG25-P141] [C69Y] -Tándem (SEQ ID NO: 20 residuos 23-508 o 23-507; ver Ejemplo 8) -fueron también analizadas utilizando DLS. Los datos fueron recolectados a las tres temperaturas con un estudio de curso de tiempo adicional a 37 °C.

A 1 mg/mL, ambas form s mutadas muestran estabilidad a corto plazo a 21°C y 5°C, únicamente con multimerización menor observada, como se indica por un ligero incremento en el radio promedio. Una especie grande de radio de 59 nm fue observada a T=4 horas a 37 °C, pero fue un componente menor de la muestra (O.lj % en peso) y fue reversiblemente disociada después del ¡enfriamiento hasta la temperatura ambiente .

A la concentración más alta de 25 mg/mL, ambas formas tuvieron un radio promedio ligeramente más grande y polidispersión incrementada, indicadora de un ligero incremento en la cantidad de las especies estrechamente relacionadas, pequeñas, tales como dímero/trímero, pero la muestra permaneció monomodal y monodispersa (es decir, una charola detectada) y libre del agregado de alto peso molecular (HM ) En estas dos formas, la Bairbell fue considerada ligeramente más estable*, sin embargo, ninguna muestra mostró alguna inestabilidad significativa a 3 7'° en el corto plazo, hasta la medición final de T=18 horas.

Conclusión B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Barbell B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Tándem mostraron un increjmento deseado en la inestabilidad a 37 °C y a baja y altla concentración, con mejoramiento completo de los problemas de agregación observados con las construcciones humanas originales.

EJEMPLO 11 Ensayo de Enlace para las Construcciones B7R1 Humanas Un ensayo de enlace basado células para las proteínas B7R1 que contienen el receptor B7R1 fue establecido utilizando el apareamiento de receptor-ligando de PVR (receptor del polio virus; CD155)-B7R1. Las células P815 (línea celular de mastocitoma murino, ATCC) fue transfectada con un vector de expresión de PVR humano que contenía un marcador de selección de la neomici:na (G418) utilizando técnicas estándares. Después del creei:miento bajo selección de G418, fue confirmada la expresión de hPVR mediante citometría de flujo. Una transfeccion paralela de las células P815 con un vector vacío (control) fue desarrollada bajo selección de G418 y se confirmó que no tenía expresión de hPVR mediante citometría de flujo.

Cuatro proteínas que contenían el receptor de B7R1 humano fueron probadas para su habilidad de enlazarse a las células P815 que expresan hPVR; A1648.1, una molécula de hB7Rl-VASP (SEQ ID NO: 81) que fue directamente marcada con AlexaFluor 647 a través de conjugación de amina A2648F, un dímero de hB7Rl-Fc2 (SEQ ID NO: 79); A2751F, una proteína hB7Rl-"Barbell-Fc" (SEQ ID NO: 18 residuos 23-493); A2752F, una proteína de hB7rl- "Tándem Fe" (SEQ ID NO: 20 residuos 23-508 o 23-507). Las últimas 3 fueron marcadas directamente con el kit de marcación de IgG murino Zenon-PE (Invitrogen) 100,000 células control negativo o que ¡expresan hPVR por pozo fueron sembradas en placa en una placal de 96 pozos de fondo en forma de U. La placa fue centrifugada por 5 minutos a 300xg a temperatura ambiente y el sobrenadante fue retirado.

Las células fueron resuspendidas en 100 µ? del Medio de Tinción (PBS, 1 % (v/v) FBS, 0.05 % (p/v) de azida de sod por una titulación de las proteínas anteriores comenzando a 5 g/mL y tituladas con diluciones cereales a un tercio hasta 0.06 µ? para una curva de 6 puntos que incluía el control cero. Las proteínas/células fueron incubadas por 1 hora sobre hielo y luego las células fueron lavadas con 150 µ? de Medio de Tinción para un total de 3 lavados. Después del lavado final, las células fueron resuspendiLas en 150 µ? de una mezcla 1:1 de Medio de Tinción: Cytofjix (Becton Dickenson) . Las células fueron analizadas mediante citometría de flujo sobre un instrumento LST II (Becton Dickenson) . Todos puntos de datos fueron corridos por triplicado. Todas proteínas que contienen hB7Rl mostraron enlace dependiente de i la dosis a las células P815 que expresan hPVR. No existió enlace a las células control negativo.

EJEMPLO 12 Ensayo de Competencia para las Construyeiones de B7R1 Humanas Fue establecido un ensayo basado en células para medir el enlace competitivo de las construcciones que contiene B7R1 humana. 100,000 de l|as células P815 que expresan hPVR, previamente descritas, | fueron sembradas en placa por pozo en una placa de 96 pozos de fondo en U. La placa fue centrifugada por 5 minutos a 300xg a temperatura ambiente y el sobrenadante fue retirado. Las células fueron resuspendidas en 50 µ? del Medio de jTinción (PBS, 1 % de (v/v) FBS, 0.05% p/v) de azida de sodio) que contiene una i dilución 1:100 del "bloque-Fc" comercialmente disponible (Becton Dickenson) para reducir al mínimo el enlace antecedente. Después de una incubación sobre hielo por 10 minutos, se agregaron 50 µ? del Medio de Tinción que contenía una titulación de las proteínas que contienen B7rl humana, a una concentración "3X" que fue una titulación desde 30 µg/mL hasta 0.042 µg/mL. Inmediatamente después de esta adición, se agregaron 50 µ? del medio de tinción que contenía 3 pg/mL A1476-Alexa Fluor 647 (hB7rl-Fc2 directamente marcado con Alexa Fluor 647 a través de conjugación de amina) y se agregó a cada pozo mezclado mediante pipeteo suave. La tinción 141] [C69Y] -Barbell (SEQ ID NO: 18 ¡residuos 23-493); y B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Tándem (SEQ ID NO:20 residuos 23-508 o 23- 507) - mostraron competencia dependiente de la dosis para el enlace hB7Rl-Fc2 marcado. No existió enlace a las células P815 de tipo Silvestre "WT" que son negativas para la expresión de hPVR. Las IC50s de dos diferentes experimentos son mostradas en la Tabla 4 siguiente.

Tabla 4: Competencia para el enlace de| B7R1-Fc2 a las Células PV P815 EJEMPLO 13 Actividad Biológica de las Proteínas B7R1-Tándem y -Barbell Humanas Las células T son normalmente activadas por el acoplamiento del receptor de antígend de células (TCR) por las moléculas MHC más los péptidos extraños presentados por las células presentadoras de antígeno (APC's). Las APC's profesionales también expresan un número de moléculas coestimuladoras que se acoplan a otros receptores sobre las células T y contribuyen a la activación. Este proceso puede ser imitado por las células que expresan el receptor de Fe "que presentan" anticuerpos al complejo TCR/CD3. La presentación de las moléculas coestíimuladoras puede ser entonces controlada en cierta medida por la provisión de moléculas seleccionadas mediante transfección de las células que expresan el receptor de Fe. Se utilizó la línea celular de mastocitoma de ratón P815, la cual expresa los receptores de Fe, y retícula los anticuerpos anti-CD3 de manera efectiva. Las células P815 de tipo silvestre más los anticuerpos anti-CD3 pueden estimular las células T humanas, pero el nivel de estimulación es aumentado si las células P815 también expresan PVR (CD155) debido a que PVR se acopla a CD226 (AD M-1) sobre las células T, dando una señal coestimuladora. B7R1 soluble inhibe esta interacción y bloquea la señal de coestimulación por CD2 Las células T humanas fueron aisladas de sangre periférica mediante selección negativa (Kit de aislamiento de células Pan T, Miltenyi Biotec, Auburn CA) y fueron marcadas con CFSE (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Las células T fueron sembradas en placa en cada pozo de una placa de 96 pozos a 100,000 células por pozo, en el medio de crecimiento (medio RPMI 1640, L-glutamina, 10 % de FBS, EAA, HEPES , Pen-Strep Invitrogen, Carlsbad, CA) . Los pozos fueron establecidos por triplicado con y sin los siguientes reactivos adicionales: células P815 a 50,000 células por pozo o células P815 transfectadas con y que expresan establemente PVR humano de longitud completa (P815/PVR) a 50,000 células por pozo, anti-CD3 a 50 ng/ml (BD Bioscience, San Diego, CA) , las proteínas de fusión de B7R1 a 0.6-5 g/ml . En este sistema, los receptores de Fe sobre las células P815 reticulan los Mabs anti-CD3 agonistas para que las células T proporcionen una estimulación sub-óptima primaria, a través del receptor de células T (TCR) y PVR coestimula a través del acoplamiento de CD226. La adición de B7R1 soluble debe inhibir la coestimulación por el enlace a PVR y el bloqueo de la activación de CD226. Las muestras fueron incubadas a 37°C por 4 días, cosechadas, y teñidas con anti-CD4 y anti-CD8 conjugados a fluorocromo (BD Bioscie ce, San Diego, CA) , siguiendo los protocolos de tinción típicos. Las células T fueron analizadas mediante citometría de flujo (LSRII, BD Bioscience, San Diego, CA) y la proliferación celular fue medida mediante dilución de CFSE. Los efectos sobre las células T CD4 y CD8 fueron monitorizados independientemente mediante la entrada de estas poblaciones específicas.

En este ejemplo, fueron probadas dos formas tetraméricas de la proteína, y se compararon con una proteína dimérica de Fe que incluye los siguientes lotes de proteínas: B7rl (G25-P141) C69Y Fc5 Barbell (SEQ ID NO: 18 residuos 23-493) ; también denominada en la presente como B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Barbell; ver Ejemplo 7) ; B7rl (G25-P141) C69Y Fc5 tándem (SEQ ID NO: 20 residuos 23-508 o 23-507) ; también denominada en la presente como B7R1 [G25-P141] [C69Y] -Tándem; ver üjemplo 8); y B7rl(G25-P 141) C69Y Fc5 (dímero bivalente) (SEQ ID NO: 80) .

Las Figuras 3A-3F indican el nivel de inhibición de las células T inducido por las proteínas B7R1 solubles como se midió por actividad proliferativa reducida. Existió relativamente poca inhibición por la proteína B7R1-Fc5. En contraste, las proteínas tándem y Barbell indujeron la inhibición significativa a través de todos los intervalos de dosis para los tres donadores de sangre y para los dos tipos de células T, CD4+ y CD8+, con el tándem que muestra geramente más actividad que el Barbell. Esto indica que estas proteínas fueron inhibidores efectivos de la proliferación de las células T in vitro y fueron superiores a la forma dimérica, y sugiere además que éstas deben ser también superiores al dímero bivalente en un panorama clínico .

EJEMPLO 14 El Receptor de B7R1 soluble (Construcc:ión Barbel1) Disminuye la Incidencia y la progresión de la Enfermedad en el modelo de Encefalomielitis Alérgica Experimental de Ratón (EAE) de la Esclerosis Múltiple A) Modelo de Encefalomielitis alérgica de ratón (EAE) Para estudiar el mecanismo y levaluar los efectos de las terapias potenciales para la esclerosis múltiple, es comúnmente utilizado el modelo animal de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) para el modelo de EAE progresiva crónica, ratones hembras C57BL/6 de 8 a 10 semanas de edad (Charles River Laboratories ) fueron inmunizados subcutáneamente con el péptido 35-55 de la glucoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG) emulsificado en el adyuvante completo de Freund en el día 0 seguido por la administración intraperitoneal de la toxina pertusis en el día 0, y la toxina pertusis intravenosa en el día 2. Dentro de aproximadamente 8 a 23 días, los animales comienzan a mostrar síntomas de pérdida parálisis que son característicos de este modelo. El grado de enfermedad evaluado diariamente en los ratones, tomando sus pesos corporales y asignando una calificación clínica (0-8) a cada ratón, como se detalla más adelante. El patrón típico de los síntomas de la enfermedad en los ratonfes inmunizados, pero de otro modo no tratado, es uno de pérdida de peso y parálisis.

La construcción Barbell del receptor de B7R1 soluble (mB7Rl -Barbell; residuos 26-489 de SEQ ID NO: 10), la construcción Fc2 murina dimérica Fc2 (SEQ ID NO: 34), la construcción VASP (SEQ ID NO: 35) , o vehículo (PBS) fueron administrados a los ratones comenzando el día -1, Los tratamientos fueron | distribuidos como inyecciones intraperitoneales cada tercer día, con cada una i i de las moléculas de B7R1 que son administradas a 150 µg por i ratón por dosis. Estas pudieron también ser distribuidas utilizando un régimen de dosificación similar u otra vía de administración.

B) Monitoreo de la Enfermedad Los animales pueden comenzar a mostrar signos de parálisis y pérdida de peso entre aproximadamente 8 y 23 días después de las inmunizaciones con MOG35-55. La mayoría de los animales desarrollan síntomas dentro de 11 a 17 días de las inmunizaciones, pero algunos pueden | mostrar síntomas más pronto o más tarde que esto.

Todos los animales fueron observados, pesados y se j les asignó una calificación clínica diariamente para evaluar el estado de la enfermedad. I C) Calificación Clínica 0 = Normal; saludable. 1 = ligera debilidad de la cola (la punta de cola no se enrosca) 2 = parálisis de la cola (¡< ncapaz de mantener erguida la cola. 3 = parálisis de la cola contoneo leve caminar . 4 = parálisis de la cola y contoneo severo. 5 = parálisis de la cola ¡ y parálisis de una extremidad. 6 = parálisis de la cola y parálisis de cualesquiera de las dos extremidades 7 = tetraparesis (las 4 patas paralizadas) 8 = moribundo o muerto La sangre fue recolectada durante el experimento y al final para monitorizar los niveles del suero de citocina y j los niveles de otros mediadores de la j enfermedad. Al tiempo de la eutanasia, la sangre fue recolectada para el suero.

D) Resultados grupos de ratones cada uno) que recibieron mB7Rl-Barbell fueron caracterizados por una reducción significativa (p<0.05) en la severidad de la enfermedad sobre el tiempo como se puso en evidencia por las reducciones significativas (p<0.05) en la calificación clínica en comparación a los ratones tratados con vehículo (PBS) , como se analizó por mediciones repetidas, análisis de varianza de dos vías (ANDEVA) (verj Figura 4) . Existieron tendencias para los grupos de ratones tratados con las construcciones Fc2 VASP murinas, diméricas para ser protegidos en cierta medida de la enfermedad como es mostrado por el retraso en la progresión de la enfermedad. No obstante, las diferencias entre e'stos dos grupos y el grupo tratado con vehículo no fuerpn significativamente diferentes por la ANDEVA de dos víajs . Cuando se analizó como una suma de las calificaciones de la enfermedad sobre el tiempo (similar al cálculo de Área Sobre la Curva o "Exposición a la Enfermedad", los ralones tratados con la construcción B7R1-Barbell tuvieron un índice promedio significativamente más bajo de "expos ción a la enfermedad" que los ratones tratados con PBS (aproximadamente 2.3 veces la calificación acumulativa menor; p < 0.05). Los grupos de ratones tratados con las construcciones Fc2 o VASP murinas diméricas, cada una tuvieron calificaciones acumulativas menores de aproximadamente 25 % que ¡el grupo tratado con PBS, pero las diferencias no fueron estadísticamente diferentes. Los ratones tratados con la construcción B7R1-Barbell y la construcción murina dimériica Fc2 cada una tuvo una incidencia más baja de inicio de la enfermedad, tal que í aproximadamente 25 % de los grupos de ' ratones tratados con Barbell B7R1 y con Fc2 murino dimérico fueron protegidos de la enfermedad, aproximadamente 17 % de los ratones tratados con VASP fueron protegidos de la enfermedad, y únicamente aproximadamente 8 % de los ratones t atados con PBS fueron protegidos. Además, el día promedio de inicio de la enfermedad para los ratones que recibieron B7R1 Barbell fue de 19 días, 17.6 días para los ratones tratados con Fc2 murino dimérico, y 16.5 días para los ratones tratados con VASP, mientras que el día promedio de inicio de la enfermedad para los ratones tratados con PBS fue más corto (13.7 días), indicando que el inicio de la enfermedad fue retrasado con las moléculas B7R1 soluble, especialmente con el tratamiento con B7R1 Barbell.

Tomados conjuntamente, esto]s resultados indican que la administración in vivo de B7R1- Barbell fue eficaz en reducir el inicio de la enfermedad y la severidad en EAE, un modelo de esclerosis múltiple humana . Existieron tendencias para la eficacia observada con las otras moléculas de B7R1 solubles, aunque la construcción Barbell fue el único receptor soluble que mostró diferencias estadísticamente significativas en este experimento. Estos resultados sugieren que una construcción de Barbell B7R1 soluble es eficaz en el tratamiento de la esclerosis múltiple humana.

EJEMPLO 15 La Construcción de B7R1 Tándem Disminuye la Incidencia y la Progresión de la Enfermedad en la Encefalomielitis Alérgica Experimental (EAE) en Ratón con Recidiva-Remisión (RR) como un Modelo de la Esclerosis Múltiple A) Modelo de Encefalomielitis Alérgica de Ratón (EAE) Para estudiar el mecanismo para evaluar efectos de las terapias potenciales para la esclerosis múltiple, es comúnmente empleado el modelo animal de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) . Para el modelo de EAE con recidiva-remisión, ratones SJL de hembras de 9 a 10 semanas de edad (Jackson o Charles River Labs) fueron inmunizados subcutáneamente con el pépticlo proteolipídico (PLP) emulsificado en el adyuvante completo de Freund, sin toxina pertusis intravenosa. Dentro de aproximadamente 14 a 18 días, los animales comenzaron a mostrar síntomas de pérdida de peso y parálisis que son característicos de este modelo. El grado de enfermedad fue evaluado diariamente en los ratones al tomar sus pesos corporales y asignar una calificación clínica (0 a 8) a cada ratón, como se detalla más adelante. El patrón típico de síntomas de la enfermedad en los ratones inmunizados pero de otro modo no tratados, es uno de pérdida de peso y parálisis, seguido por un periodo de remisión de los síntomas de la enfermedad, y una recidiva subsiguiente de los síntomas de la enfermedad. Un patrón de recidivas y remisiones de los síntomas de la enfermedad se presenta, el cual es también encontrado en humanos con este tipo de esclerosis múltiple, conocida como enfermedad de recidiva-remisión. I i I La construcción en tándem del receptor B7R1 (mB7Rl-Tándem; residuos 26-504 o 26-503 de la SEQ ID NO: 12), la construcción Barbell de receptor de B7R1 (mB7Rl-Barbell; residuos 26-489 de la SEQ ID NO: 10), vehículo (PBS) , o un control positivo clínicamente relevante (CTLA4-Ig específico murino) fueron administrados en un régimen de dosificación terapéutica, tal que éstos iniciaron '..os tratamientos en el segundo día después de que éstos habían ido a través de su primer pico de fueron distribuidos como tercer día, con las moléculas de mB7Rl-Tándem, mB7Rl-Barbell y mCTLA4-Ig que son administradas a 150 ujg por ratón por dosis. Estas pudieron también ser distribuidasi utilizando un régimen de dosificación similar u otra vía de administración.

B) Monitoreo de la Enfermedad ¡ Los animales pueden comenzar a mostrar signos de parálisis y pérdida de peso en aproximadamente 8 y 23 días después de las inmunizaciones de PLP . La mayoría de los animales en este experimento desarrollaron síntomas dentro de 14 a 18 días de las inmunizaciones.

Todos los animales fueron observados, pesados y se les asignó una calificación clínica para evaluar el estado de la enfermedad.

C) Calificación Clínica 0 = Normal; saludable. 1 = ligera debilidad de la| cola (la punta de la cola no se enrosca) 2 = parálisis de la cola ( incapaz de mantener erguida la cola) I 3 = parálisis de la cola y contoneo leve al caminar 4 = parálisis de la cola y contoneo severo 5 = parálisis de la colaj y parálisis de una extremidad I 6 = parálisis de la cola parálisis de i cualesquiera de las dos extremidades j 7 = tetraparesis (las 4 extremidades paralizadas) 8 = moribundo o muerto D) Resultados Los grupos de ratones (n = 12 - 13 cada uno) que i fueron tratados con B7R1 -Tándem fueron caracterizados por una reducción significativa (p<0.05) en la severidad de la enfermedad hacia la fase de la remisión, como se pone en evidencia por las reducciones significativas (p<0.05) en la calificación clínica y la pérdida de peso corporal comparada a ratones tratados con vehículo (PBS) J Además, los ratones tratados con B7R1 -Tándem tuvieron una incidencia significativamente menor (P<0.05) de la recidiva de la enfermedad en comparación a los tratados con vehículo (PBS) . Este es un hallazgo muy importante ya que la recidiva de la enfermedad es un sello distintiivo de este modelo de enfermedad y de la MS de recidiva-remisión en humanos. El grupo de ratones tratados con la j molécula B7R1-Barbell tuvieron calificaciones de la enfermedad y proporciones de recidivas similares al grupo de ratones tratados con el control positivo, mCTLA4-Ig. Ninguno de los grupos tratados con B7R1-Barbel calificaciones en o proporciones de tratados con PBS . j Tomados conj ntamente, estos | resultados indican que la administración in vivo de B7R1-Tándjsm puede ser eficaz en reducir el inicio y la severidad de la I enfermedad en PLP EAE, un modelo de esclerosis múltiple dej recidiva-remisión en humanos. Estos resultados sugieren que iuna construcción B7R1-Tándem soluble es eficaz en el tratamiento de la esclerosis múltiple humana.

EJEMPLO 16 B7R1-Tándem Disminuye la Incidencia yj la Progresión de la Enfermedad en un Modelo de Ratón de la Colitis de Transferencia Adoptiva de CélulaL T y Psoriasis Modelo de Colitis de Transferencia Adopliva de Células T transferencia adoptiva de células T intactas dentro de ratones inmunocomprometidos con histocompatibilidad menor desigual o singénicos conduce al desarrollo de la colitis (Leach et al, 1996; Powrie et al, 1997) así como a lesiones en la piel que se asemejan a la psoriasis (Schon et al, 1997; Davenport et al, 2002) . El trasplante de tan pocas como 0.2 millones de células T CD4+ CD25 - provenientes de ratones BALB/C o B10.D2 dentro de ratones C.B-17 SCID inmunocomprometidos, da como resultado pérdida de peso, heces positivas al hemocultivo y desarrollo de lesiones de la piel. Los síntomas de estos ratones varían de colonia a colonia.

Este modelo de colitis/psoriasis tiene ciertas similitudes con la enfermedad de Crohn' s humana y la psoriasis, y ha sido utilizada extensamente para probar la eficacia de la terapéutica para estos trastornos en humanos. Para este experimento, fueron obtenidos ratones (5 ratones hembra 5B10.D2 donadores; 20 ratones hembra C.B-17 SCID recipientes) de Jackson Laboratorios o Charles River Laboratories, respectivamente. Fueron recolectados los bazos de 5 ratones B10.D2. Las células CD4+CD25- fueron aisladas de los bazos combinados utilizando la metodología estándar conocida en la técnica. La pureza de las células T fue evaluada mediante citometría de flujo.

Los ratones CB-17 SCID recibieron 5xl05-10xl05 células CD4+ CD25- provenientes del bazo por medio de inyección intravenosa. Todos los ratones fueron pesados al menos cinco veces por semana y cuidadosamente observados para la pérdida de peso. Las calificaciones clínicas de la colitis (consistencia de las heces y sangre en heces) fueron tomadas al menos un día por semana. Los ratones fueron también monitorizados al menos 5 días por semana y se les asignó una calificación para los signos y el grado de la psoriasis (pérdida de pelo, rascadura y alopecia] La construcción en tándem del receptor de B7R1 soluble (B7R1 -Tándem) o el vehículo (PBS) se administraron a los ratones comenzando en el día 0 (día de la transferencia celular) . Los tratamientos fueron distribuidos como inyecciones intraperitoneales cada tercer día, con el B7R1 Tándem que es administrado a 150 µ<3 por ratón por dos Estos pudieron también ser distribuidos utilizando un régimen de dosificación similar u otra vía de administración.

Al final del estudio, lasj muestras de tejidos (intestino y piel, por ejemplo fueron enviadas para la evidencia histológica de colitis y psoriasis, respectivamente, y el suero fue recolectado para el análisis de los niveles de citocina y quimiocina.

Resultados Grupos de ratones (n=10 cada uno) que recibieron B7R1-Tándem fueron caracterizados por una reducción significativa (p<0.05) en la severidad de la enfermedad, como se puso en evidencia por las reducciones significativas (p<0.05) en las calificaciones clínicas de la colitis y la psoriasis, y la pérdida de peso corporal en comparación a los ratones tratados con vehículo (PBS) Además, los ratones tratados con B7R1-Tándem tuvieron menos evidencia patológica/histológica de colitis y psoriasis en comparación a los ratones tratados con el vehículo (PBS) .

Tomados conjuntamente, estos resultados indican que la administración in vivo de B7R1-Tándem puede ser eficaz en reducir la colitis y la psoriasis en un modelo de transferencia de células T murinas, y sugieren que este receptor soluble puede ser eficaz en el tratamiento del trastorno inflamatorio del intestino y/o la psoriasis en humanojs EJEMPLO 17 Los Receptores Solubles de B7R1 (Construcciones Barbel y Tándem) Disminuyen la Incidencia en Progresión de Enfermedad en el Modelo de Artritis en Ratón Inducida por Colágeno (CIA) A) Modelo de Artritis Inducida por Colágeno (CIA) en Ratón Ratones machos DBA/1J de diez semanas de edad (Jackson Labs) fueron divididos en 3 grupos de 15 ratones/grupo, diseñados para la dosificación profiláctica de PBS, proteína B7R1-Barbell o la proteica B7R1-tándem . En el día -21, a todos los animales se les administró un inyección intradérmica en la cola de 50-100 L de colágeno Tipo II de pollo a 1 mg/mL, formulado en Adyuvante Completo de Freund (preparado por Chondrex, edmond, wJ.) , y tres semanas más tarde en el Día 0 a éstos se les administró la misma inyección excepto que preparada en el Adyuvante Incompleto de Freund. Las construcciones (mB7Rl-Barbell ; residuos 26-489 de la SEQ ID NO: 10), B7R1-Tándem (mB7R1-[Tándem; residuos 26-504 O 26-503 de SEQ ID NO: 12), B7R1-VASP (mB7Rl-VASP; SEQ ID NO: 35) , o el vehículo (PBS) fueron administrados como inyecciones intraperitoneales cada tercer día por 3 semanas comenzando en el día -1. Los grupos recibieron 150 µg de la proteína B7R1-Barbell o B7R1-Tándem por animal por dosis, y los grupos control recibieron el control de vehículo, PBS (Life Technologies, Rockville, MD) . Los animales comenzaron a mostrar síntomas de artritis después de la segunda inyección de colágeno, o la mayoría de los animales que desarrollaron inflamación dentro de 1-2 semanas. El grado de enfermedad fue evaluado en cada pata mediante el uso de un calibrador para medir el espesor de la pata, y mediante la asignación de una calificación clínica (0-3) a cada pata (ver más adelante) . B) Monitoreo de la Enfermedad Los animales pueden comenzar a mostrar signos de inflamación de la pata poco después de la segunda inyección de colágeno, y algunos animales pueden incluso comenzar a tener signos de inflamación de los dedos de las patas antes de la segunda inyección del colágeno. La mayoría de los animales desarrollan artritis dentro de 1-2 semanas de la inyección de refuerzo, pero algunos pueden requerir un periodo de tiempo más prolongado. La incidencia de la enfermedad en este modelo es típicamente de 90 a 100 %, y 0 ja 5 no respondedores (determinado después de 6 semanas de observación) son típicamente observados en un estudio que; utiliza 60 animales.

Todos los animales fueron (observados diariamente I I para evaluar el estado de la enfermedad en sus patas, lo cual realizado mediante la asignació de una calificación clínica cualitativa a cada una de las patas. Cada día, a cada I animal se le calificaron sus 4 patas de acuerdo a su estado 1 de enfermedad clínica. Para determ!inar la calificación I clínica, se puede pensar que la pata tiene 3 zonas, los dedos, la pata misma (manos o pies) , y| la articulación de la muñeca o tobillo. El grado de severidad y la inflamación relativa a estas zonas se anota incluyendo: observación de cada dedo para hinchazón; uñas rotas o| enrojecimiento de los dedos; observación de cualquier evidencia de edema o enrojecimiento en cualquiera de las patas; observación de cualquier pérdida de demarcación anatómica fina de los tendones o los huesos; evaluación de l|a muñeca o el tobillo para cualquier edema o enrojecimiento; y observación de si la inflamación se extiende o no proximalmente hacia arriba de la pata. Una calificación de la pata de l!, 2 ó 3 estuvo basada primeramente en la impresión general de severidad, y en segundo lugar respecto a qué tan involucradas están muchas zonas. La escala utilizada para la calificación clínica se muestra enseguida.

C) Calificación Clínica 0 = Normal .0.5 = Uno o más dedos involucrados, pero únicamente los dedos que están inflamados 1 = inflamación leve que involucra la pata (1 zona) y puede incluir un dedo o más dedos. 2 = inflamación moderada en la pata y puede incluir algunos de los dedos y/o la muñeca/tobillo (2 zonas) 3 = inflamación severa en la pata, muñeca/tobillo, y algunos o todos los dedos (3 zonas) Fue recolectada sangre al final del experimento para monitorizar los niveles en suero de los anticuerpos anti-colágeno, así como los niveles de quimiocina y citocina en suero.

Los grupos de ratones que recibieron las moléculas B7R1-Barbell y B7R1-Tándem fueron caracterizados por inflamación de la pata y artritis significativamente menores en el curso del experimento, en comparación a los ratones que recibieron PBS (p<0.05) (Ver Figura 5). Además, los ratones que recibieron B7R1-Tándem tendieron a tener incluso menos artritis e inflamación de la pata en el curso del experimento, en comparación a los ratones que recibieron la proteína B7R1-VASP (p=9.09). Los niveles en suero de IL-6 y las quimiocinas MCP-1, 10-1 y KC fueron más bajos en los ratones tratados con las moléculas B7R1-Barbell y B7R1-Tándem, en comparación a los ratones: tratados con PBS . No existieron diferencias significativas en los niveles en suero de los anticuerpos anti-colágeno re grupos . Estos resultados indicaron que B7R1-Barbell¡ B7R1-Tándem pueden reducir la inflamación, así como progresión de la enfermedad asociada con este modelo de artritis, y sugieren que las construcciones Barbell o tándem de B7R1 de los receptores solubles de B7R1 pueden ser eficaces en el tratamiento de la artritis reumatoide.

A partir de lo anterior, se apreciara que, aunque han sido descritas en la presente] algunas modalidades específicas de la invención, para fines de ilustración, pueden ser realizadas diversas modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. En consecuencia, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas aquí son incorporadas por referencia en presente en su totalidad, para todos los propósitos Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el qujs resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: |

1. Una fusión de polipeptido soluble que comprende, desde el extremo amino hacia el extremo carboxilo, P1-L1-D-L2-P2 , caracterizada porque: | i Pl es un primer polipéptido que tiene al menos 95 % de identidad con los residuos de aminoácidos 25-141 de SEQ ID NO: 2; j LI es un primer ligador polipeptídico; i D es un dominio de dimerizacíón; L2 es un segundo ligador polipeptídico; P2 es un segundo polipéptido que tiene al menos % de identidad con los residuos de aminoácidos 25-141 de SEQ ID NO: 2; j en donde la fusión del polipéptido es capaz de enlazarse específicamente al dominio extracelular de CD155 (residuos de aminoácido 28-343 de SEQ ID NO: 22) .

2. Una fusión de polipéptido soluble que comprende, desde el extremo amino haciaj el extremo carboxilo, P2-L2-P1-L1-D, caracterizada porque: Pl es un primer polipéptido que tiene al menos 95 % de identidad con los residuos de aminoácidos 25-141 de SEQ ID NO: 2; Ll es un primer ligador polipeptídico; D es un dominio de dimerizaqión; L2 es un segundo ligador polipeptídico; P2 es un segundo polipéptido que tiene al menos 95 % de identidad con los residuos de aminoácidos 25-141 de SEQ ID NO: 2; en donde la fusión del polipéptido es capaz de enlazarse específicamente al dominio extracelular de CD155 (residuos de aminoácido 28-343 de SEQ ID NO: 22) .

3. La fusión de polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque al menos uno de Pl y P2 tiene 100 % de identidad con los residuos de aminoácidos 25-141 de la SEQ ID NO: 2

4. La fusión de polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque al menos uno de Pl y P2 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en los residuos 23-139 de la SEQ ID NO: 18

5. La fusión de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque D es una región constante |de cadena pesada de inmunoglobulina.

6. La fusión de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque Ll consiste de 15 a 32 residuos de aminoácidos, en donde 1 a 8 de los residuos son residuos de cisteína.

7. La fusión de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4, caracterizada porque L2 comprende una pluralidad de residuos de glicina y comprende opcionalmente al menos un residuo de serina.

8. La fusión de polipéptido de conformidad con la reivindicación l ó 2, caracterizada porque L2 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 21.

9. La fusión de polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la fusión de polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en los residuos 23-493 de la SEQ ID NO: 18.

10. La fusión de polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la fusión de polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en los residuos 23-508 o 23-507 de la SEQ !ID NO: 20.

11· Un polinucleótido, caracterizado porque codifica para la fusión de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende los siguientes elementos operablemente enlazados : un promotor de la transcripción; un segmento de ADN que codifJcca para la fusión del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; y un terminador de la transcripción

13. Una célula cultivada dentro de la cual ha sido introducido el vector de expresión |de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la célula expresa el segmento de ADN.

14. Un método de elaboración de una fusión de polipéptido, caracterizado porque comprende: cultivar una célula dentro de la cual ha sido introducido el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 12, donde la célula expresa el segmento de ADN y la fusión del polipéptido codificado es producida; y la recuperación de la fusión del polipéptido;

15. Una composición, caracterizada porque comprende : una- proteína dimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; y un portador farmacéuticamenté aceptable .

16. Un método de tratamiento de un trastorno inmunitario mediado por células T, caracterizado porque comprende : administrarle a un sujeto que tiene un trastorno inmunitario mediado por células T una cantidad efectiva de una fusión de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

17. El método de conformidadj con la reivindicación 16, caracterizado porque el trastorno autoinmunitario se selecciona de artritis reumatoide y esclerosis múltiple.