JP6768633B2 - 自己免疫疾患を治療するために調節性ｔ細胞を選択的に活性化する分子 - Google Patents

Description

免疫系は、自己と非自己を識別することができなければならない。自己／非自己の識別が失敗すると、免疫系により体の細胞および組織が破壊され、その結果、自己免疫疾患が引き起こされる。調節性Ｔ細胞は、免疫系の活性化を能動的に抑制し、病的な自己反応性およびその結果としての自己免疫疾患を予防するものである。自己免疫疾患を治療するための、調節性Ｔ細胞を選択的に活性化する薬物および方法を開発することが熱心な研究の主題であり、本発明が開発されるまではほとんどが失敗してきた。

調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、他の免疫細胞の活性を抑制するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のクラスである。Ｔｒｅｇは、免疫系の恒常性の中核をなし、自己抗原に対する寛容性の維持および外来抗原に対する免疫応答の調節において主要な役割を果たす。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含めた多数の自己免疫疾患および炎症性疾患ではＴｒｅｇ細胞数またはＴｒｅｇの機能に欠損があることが示されている。したがって、Ｔｒｅｇ細胞の数および／または機能を増大させる療法の開発に大きな関心が寄せられている。

研究されている自己免疫疾患に対する治療手法の１つは、自己由来の、ｅｘ ｖｉｖｏで増大させたＴｒｅｇ細胞の移植である（Ｔａｎｇ， Ｑ．ら、２０１３年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｐｅｒｓｐｅｃｔ． Ｍｅｄ．、３巻：１〜１５頁）。この手法は、疾患の動物モデルの治療およびいくつかの初期ヒト臨床試験において見込みがあることが示されているが、患者自身のＴ細胞を用いた個人向けの治療が必要であり、浸潤性であり、また、技術的に複雑である。別の手法は、低用量のインターロイキン２（ＩＬ−２）を用いた治療である。Ｔｒｅｇ細胞は、サブユニットＩＬ２ＲＡ（ＣＤ２５）、ＩＬ２ＲＢ（ＣＤ１２２）、およびＩＬ２ＲＧ（ＣＤ１３２）で構成される高親和性ＩＬ−２受容体であるＩＬ２Ｒαβγを高い構成的レベルで特徴的に発現し、Ｔｒｅｇ細胞の成長はＩＬ−２に依存することが示されている（Ｍａｌｅｋ， Ｔ． Ｒ．ら、２０１０年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３３巻：１５３〜６５頁）。慢性ＧＶＨＤ患者（Ｋｏｒｅｔｈ， Ｊ．ら、２０１１年、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．、３６５巻：２０５５〜６６頁）およびＨＣＶ関連自己免疫性血管炎患者（Ｓａａｄｏｕｍ， Ｄ．ら、２０１１年、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．、３６５巻：２０６７〜７７頁）に対する低用量のＩＬ−２による治療に関する臨床試験により、Ｔｒｅｇレベルの上昇および臨床的有効性の徴候が実証された。多数の他の自己免疫疾患および炎症性疾患におけるＩＬ−２の有効性を調査する新しい臨床試験が開始されている。

これらの試験において使用されているＩＬ−２の組換え形態であるプロロイキン（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡにより販売されている）には高い毒性が伴う。プロロイキンは、転移性黒色腫および転移性腎がんの治療に関して認可を受けているが、その副作用は集中治療が利用可能な病院環境でのみ推奨されるほど重篤なものである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ．ｃｏｍ／ａｓｓｅｔｓ／ｐｄｆ／ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ．ｐｄｆ）。Ｔｒｅｇ細胞がごく最近特徴付けられるまで、ＩＬ−２は、Ｔ細胞および他の免疫細胞を活性化してがん細胞を排除する免疫系刺激物質であると考えられていた。自己免疫疾患におけるＩＬ−２についての臨床試験では、Ｔｒｅｇ細胞がＩＬ２Ｒαβγを発現するので多くの他の免疫細胞型よりも低濃度のＩＬ−２に応答することに起因して、Ｔｒｅｇ細胞を標的化するために低用量のＩＬ−２が使用されてきた（Ｋｌａｔｚｍａｎｎ Ｄ、２０１５年、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５巻：２８３〜９４頁）。しかし、これらの低用量でさえも、安全性および耐容性の問題が生じ、使用される治療では、長期にわたってまたは断続的な５日間の治療過程でのいずれかでの毎日の皮下注射が用いられている。したがって、Ｔｒｅｇ細胞の数および機能を強化する、ＩＬ−２よりも特異的にＴｒｅｇ細胞を標的化する、より安全であり、より耐容性が高く、より低頻度で投与される自己免疫疾患療法が必要とされている。

ＩＬ−２に基づく療法の治療指数を改善するための１つの手法は、他の免疫細胞と比べてＴｒｅｇ細胞に対して選択的であるＩＬ−２の改変体を使用することである。ＩＬ−２受容体は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、好酸球、および単球を含めた種々の異なる免疫細胞型で発現し、この広範な発現パターンがその免疫系に対する多面的な影響および高い全身毒性に寄与する可能性がある。ＩＬ−２受容体は、３つの形態：（１）シグナル伝達を行わない低親和性受容体であるＩＬ２ＲＡ；（２）通常のＴ細胞（Ｔｃｏｎ）、ＮＫ細胞、好酸球、および単球で広範に発現する、ＩＬ２ＲＢおよびＩＬ２ＲＧで構成される中親和性受容体（ＩＬ２Ｒβγ）；ならびに（３）活性化Ｔ細胞で一過性に発現し、Ｔｒｅｇ細胞で構成的に発現する、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、およびＩＬ２ＲＧで構成される高親和性受容体（ＩＬ２Ｒαβγ）で存在する。ＩＬ２Ｒβγと比べてＩＬ２Ｒαβγに対して選択的であるＩＬ−２改変体が開発されてきた（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ， Ａ． Ｂ．ら、２０００年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８巻：１１９７〜２０２頁；Ｃａｓｓｅｌｌ， Ｄ． Ｊ．ら、２００２年、Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．、８巻：２１７１〜８３頁）。これらの改変体は、ＩＬ２ＲＢに対するそれらの親和性を低下させるアミノ酸置換を有する。ＩＬ−２はＩＬ２ＲＧに対しては検出不可能な親和性を有するので、したがって、これらの改変体は、ＩＬ２Ｒβγ受容体複合体に対する親和性が低下しており、かつ、ＩＬ２Ｒβγを発現する細胞を活性化する能力は低下しているが、ＩＬ２ＲＡに結合する能力およびＩＬ２Ｒαβγ受容体複合体に結合しそれを活性化する能力は保持する。これらの改変体のうちの１つであるＩＬ２／Ｎ８８Ｒ（Ｂａｙ５０−４７９８）は、ＩＬ２Ｒβγを発現するＮＫ細胞が毒性の主要な要因であるという仮説に基づいて、ＩＬ−２の免疫系刺激物質としての毒性が低いバージョンであるとして臨床的に試験された。Ｂａｙ５０−４７９８は、ＮＫ細胞と比べて活性化Ｔ細胞の増殖を選択的に刺激することが示され、がん患者（Ｍａｒｇｏｌｉｎ， Ｋ．ら、２００７年、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１３巻：３３１２〜９頁）およびＨＩＶ患者（Ｄａｖｅｙ， Ｒ． Ｔ．ら、２００８年、Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．、２８巻：８９〜１００頁）に関して第Ｉ／ＩＩ相臨床試験において評価された。これらの試験から、Ｂａｙ５０−４７９８がプロロイキンよりも相当に安全であり、耐容性があることが示され、また、Ｂａｙ５０−４７９８により患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のレベルが上昇することも示された。しかし、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増加ではＴｒｅｇ細胞の増加は示されない。なぜなら、Ｔｒｅｇの同定にはＣＤ４およびＣＤ２５に加えて追加のマーカーが必要であるからであり、かつＴｒｅｇ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞のうちのわずかな割合であるからである。これらの試験の後で、当該分野における研究により、Ｔｒｅｇ細胞の正体がより十分に確立され、Ｔｒｅｇ細胞がＩＬ２Ｒαβγを選択的に発現することが実証された（Ｍａｌｅｋ， Ｔ． Ｒ．ら、２０１０年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３３巻：１５３〜６５頁に概説されている）。この新しい研究に基づいて、現在では、ＩＬ２Ｒαβγ選択的アゴニストがＴｒｅｇ細胞に対して選択的であるはずであることを理解することができる。

ＩＬ−２に基づく療法の治療指数を改善するための第２の手法は、Ｔｒｅｇ細胞が最大限に刺激されるように分子の薬物動態を最適化することである。ＩＬ−２作用の初期の試験により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトＴ細胞増殖のＩＬ−２による刺激には、有効濃度のＩＬ−２に最低５〜６時間曝露させることが必要であることが実証された（Ｃａｎｔｒｅｌｌ， Ｄ． Ａ．ら、１９８４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４巻：１３１２〜１３１６頁）。ＩＬ−２をヒト患者に投与した際の血漿中半減期は、静脈内投与では８５分および皮下投与では３．３時間と非常に短い（Ｋｉｒｃｈｎｅｒ， Ｇ． Ｉ．ら、１９９８年、Ｂｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４６巻：５〜１０頁）。半減期が短いので、循環ＩＬ−２を、Ｔ細胞増殖を刺激するために必要なレベルまたはそれ超に必要な持続時間にわたって維持するには、Ｔｒｅｇ細胞に対するＥＣ５０を有意に超えるピークＩＬ−２レベルがもたらされるような高用量が必要になる、または、頻繁な投与が必要になる（図１）。これらの高いＩＬ−２ピークレベルにより、ＩＬ２Ｒβγ受容体が活性化される可能性があり、また、他の意図されたものではないまたは有害な作用が生じる可能性がある。ＩＬ−２よりも循環半減期が長いＩＬ−２類似体により、指定の期間にわたってＩＬ−２よりも低用量かつ低いピークレベルで標的薬物濃度を達成することができる。したがって、そのようなＩＬ−２類似体では、Ｔｒｅｇ細胞を有効に刺激するために、ＩＬ−２よりも低用量または低頻度の投与のいずれかが必要になる。実際に、循環半減期が１４時間であるＩｇＧ−ＩＬ２融合タンパク質を投薬したカニクイザルでは、等モル用量のＩＬ−２と比較してはるかにロバストなＴｒｅｇの増加が刺激された（Ｂｅｌｌら、２０１５年、Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ． ５６巻：６６〜８０頁）。ＩＬ−２薬物のより低頻度の皮下投与はまた、患者にとってより耐容性が高くなる。これらの特性を有する治療薬は、臨床的には、薬理学的有効性の改善、毒性の低下、および患者の療法に対するコンプライアンスの改善に変換される。

治療用タンパク質の半減期を延長するための１つの手法は、循環半減期を増大させるために、分子の治療的に活性な部分をＩｇＧのＦｃ領域などの別のタンパク質と融合することである。治療用タンパク質とＩｇＧ Ｆｃの融合は、タンパク質の流体力学的半径を増大させ、それにより、腎クリアランスを低下させ、かつ融合タンパク質の新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）媒介性再利用を通じ、それにより循環半減期を延長することによって、このことを達成する。治療用タンパク質とアルブミン（Ｓｌｅｅｐ， Ｄ．ら、２０１３年、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．、１８３０巻：５５２６〜３４頁）および非免疫原性アミノ酸ポリマータンパク質（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ， Ｍ．ら、２００７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ． ２０巻：２７３〜８４頁；Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｖ．ら、２００９年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２７巻：１１８６〜９０頁）の融合も循環半減期を増大させるために使用されている。しかし、ＩＬ２選択的アゴニスト融合パートナーのロバストな生物学的活性が確実になる様式でのそのような融合タンパク質の構築は、特に、受容体サブユニットのうちの１つとの結合に欠陥のある小さなタンパク質であり、受容体を活性化するために３つの受容体サブユニットの複合体を集合させなければならないＩＬ−２選択的アゴニストの場合では、予測不可能であり得る（Ｗａｎｇ， Ｘ．ら、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０巻：１１５９〜６３頁）。

他の研究者により、安定性を促進するために野生型ＩＬ−２またはＣ１２５Ｓ置換を伴うＩＬ−２を使用した種々のＩＬ−２融合タンパク質が創出されている。Ｍｏｒｒｉｓｏｎおよび共同研究者（Ｐｅｎｉｃｈｅｔ， Ｍ． Ｌ．ら、１９９７年、Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． ８巻：１０６〜１８頁）は、ＩＬ−２の循環半減期を増大させるため、および抗原に対する免疫応答を強化する目的でＩＬ−２を特定の抗原に標的化させるために、ＩｇＧと野生型ＩＬ−２を融合した融合タンパク質を創出した。この融合タンパク質は、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖で構成されるインタクトな抗体分子からなり、Ｎ末端Ｈ鎖部分とＣ末端ＩＬ−２タンパク質部分が融合したものであった。このＩｇＧ−ＩＬ−２融合タンパク質はＦｃエフェクター機能を有するものであった。ＩｇＧ Ｆｃタンパク質の重要なエフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。ＩｇＧ−ＩＬ−２融合タンパク質は、ＩＬ−２バイオアッセイにおいて高度に活性であり、ＣＤＣ活性を有することが示された。このように、Ｐｅｎｉｃｈｅｔらにより、抗原に対する体液性免疫応答および細胞性免疫応答を強化する目的で、ＩＬ−２活性を抗体によって認識される抗原にターゲティングするための抗体−ＩＬ２融合タンパク質の使用が教示された。同様に、Ｇｉｌｌｉｅｓおよび共同研究者により、融合タンパク質の抗体部分を腫瘍抗原の標的化のために利用し、ＩＬ−２部分を腫瘍細胞に対する免疫応答の刺激のために利用した、がん免疫療法のためのいくつかのＩｇＧ−ＩＬ−２融合タンパク質が構築された（Ｓｏｎｄｅｌ， Ｐ． Ｍ．ら、２０１２年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１巻：１４９〜７１頁に概説されている）。これらの教示は、全身曝露を増加させる目的で、免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞の成長および活性を促進するＩＬ−２選択的アゴニストをエフェクター機能欠損Ｆｃタンパク質部分と融合した本発明の技術とは全く異なる。
Ｓｔｒｏｍおよび共同研究者により、高親和性ＩＬ−２受容体を発現するＴ細胞の活性化を排除する目的で、ＩＬ−２とＦｃタンパク質のＮ末端を融合した融合タンパク質が構築された（Ｚｈｅｎｇ， Ｘ． Ｘ．ら、１９９９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９９年、１６３巻：４０４１〜８頁）。この融合タンパク質は、Ｔ１ＤのＴ細胞移入マウスモデルにおける自己免疫性糖尿病の発生を阻害することが示された。ＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｔ１Ｄにかかりやすい雌ＮＯＤマウス由来の疾患促進性Ｔ細胞の機能を、疾患にかかりにくい雄ＮＯＤマウスに移植に移植した場合に阻害することが示された。Ｓｔｒｏｍおよび共同研究者は、ＩＬ−２−Ｆｃ融合タンパク質により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて高親和性ＩＬ−２受容体を発現する細胞を死滅させるができることも実証した。当該研究者らは、さらに、エフェクター機能コンピテントＩｇＧ２ｂ Ｆｃに由来するＦｃから構築したＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質と変異したエフェクター機能欠損ＩｇＧ２ｂ Ｆｃから構築したＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質とを比較した。エフェクター機能コンピテントＦｃを含有するＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質のみが疾患の発症の予防に効果的であった。したがって、当該研究者らにより、エフェクター機能を有するＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質により、疾患を引き起こす活性化Ｔ細胞を排除できること、およびＦｃエフェクター機能がＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質の治療活性に必要であることが教示された。これらの教示は、全身曝露を増加させ、Ｔｒｅｇ増大を最適化する目的で、免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞の成長および活性を促進するＩＬ−２選択的アゴニストをエフェクター機能欠損Ｆｃタンパク質部分と融合した本発明の技術とは全く異なる。Ｓｔｒｏｍおよび共同研究者による他の研究により、移植耐容性の促進におけるＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質の使用が教示されている（Ｚｈｅｎｇ， Ｘ． Ｘ．ら、２００３年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９巻：５０３〜１４頁）。この研究では、ＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質を、それとＩＬ１５−Ｆｃ受容体アンタゴニストおよびラパマイシンを組み合わせる「三重療法」において使用する。再度、当該研究者らにより、ＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質が効果的なものになるにはＦｃエフェクター機能を有さなければならないことが教示され、さらに、このＩＬ−２−Ｆｃ融合タンパク質が効果的なものになるには２種の他の分子と組み合わせなければならないことが教示されている。

Ｐｅｎｉｃｈｅｔ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．（１９９７年）８巻：１０６〜１８頁 Ｓｏｎｄｅｌ，Ｐ．Ｍ．ら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（２０１２年）１巻：１４９〜７１頁 Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．Ｘ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００３年）１９巻：５０３〜１４頁

本発明は、Ｔｒｅｇ細胞に対するＩＬ２選択的アゴニストの高い細胞選択性と長い循環半減期を組み合わせたＩＬ２選択的アゴニスト−Ｆｃ融合タンパク質である、新規の治療剤を提供する。この分子の開発の過程で、生物活性に不可欠なタンパク質の構造要素および設計の特徴を明らかにし、また、所望の治療特性を満たすいくつかの新規のタンパク質の発見を導く、驚くべき予想外の発見があった。

本発明は、ＩＬ２αβγ選択的アゴニストタンパク質（ＩＬ２選択的アゴニスト）とＩｇＧ Ｆｃタンパク質の融合タンパク質を提供する。ＩＬ２選択的アゴニスト部分は、ＩＬ２αβγ型の受容体を選択的に活性化し、それにより、Ｔｒｅｇを選択的に刺激することによって治療活性をもたらす。Ｆｃ部分は、ＩＬ−２またはＩＬ２選択的アゴニストタンパク質の循環半減期と比較して延長された循環半減期をもたらす。Ｆｃ部分は、融合タンパク質の分子サイズを腎臓による巨大分子の糸球体濾過のおおよそのカットオフである６０，０００ダルトン超まで増大させ、ＩｇＧに結合しそれを再利用する受容体である新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）タンパク質を通じて融合タンパク質を再利用し、それにより、融合タンパク質の循環半減期を延長することによって、循環半減期を増大させる。Ｆｃ部分のＦｃエフェクター機能、例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）なども欠損させ、それにより、融合タンパク質によりＴｒｅｇを選択的に活性化させてＴｒｅｇの機能を強化し、かつＴｒｅｇの数を増加させることが可能になる。２つのタンパク質部分は、ＩＬ２選択的アゴニスト部分のロバストな生物活性が維持されるように融合し、Ｆｃ部分によって循環半減期の延長を促進し、それにより、Ｔｒｅｇの機能および数を効率的に強化することを可能にする。このＴｒｅｇの強化により、過剰増殖性自己免疫反応または炎症反応が抑制され、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療に利益がもたらされる。本発明のタンパク質は、単量体であってもよく、Ｆｃ部分またはドメインのシステイン残基を通じて二量体を形成する二量体性のものであってもよい。

より詳細には、本発明は、Ｎ末端ヒトＩＬ−２改変体タンパク質部分とＣ末端ＩｇＧ Ｆｃタンパク質部分を含む融合タンパク質であって、前記ＩＬ−２融合タンパク質が、高親和性ＩＬ−２受容体を選択的に活性化し、それにより、ヒト調節性Ｔ細胞を選択的に活性化する能力を有する融合タンパク質を提供する。ＩＬ−２の改変体は、ヒトＩＬ２タンパク質（配列番号１）と比べてＮ８８Ｒ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｑ１２６Ｌ、およびＱ１２６Ｆからなる群より選択される置換を伴うものを含む。さらに、ＩＬ−２改変体タンパク質は、任意選択で、置換Ｃ１２５Ｓを伴うヒトＩＬ−２を含む。本発明のタンパク質は融合しており、ここで、ＩＬ−２改変体タンパク質とＩｇＧ Ｆｃタンパク質の両方がＮ末端とＣ末端とを有し、前記ヒトＩＬ−２改変体タンパク質がそのＣ末端でＩｇＧ Ｆｃタンパク質のＮ末端と融合していることが好ましい。ＩＬ−２改変体ドメインとＦｃドメインは、ＩＬ−２改変体タンパク質とＩｇＧ Ｆｃタンパク質部分の間に位置するリンカーペプチドを通じて接合または融合していることがさらに好ましい。ＩｇＧ Ｆｃタンパク質部分またはドメインは、Ｆｃエフェクター機能が欠損しているまたは融合タンパク質のＦｃ部分のエフェクター機能を低下させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含有することが好ましい。

本発明の例は、ヒトＩＬ−２（配列番号１）と比べてアミノ酸置換Ｎ８８ＲおよびＣ１２５Ｓを有するＩＬ−２改変体タンパク質、配列番号１５に記載のリンカーペプチド、および配列番号２に記載のヒトＩｇＧ１ Ｆｃタンパク質を含むタンパク質であって、高親和性ＩＬ−２受容体を選択的に活性化し、それにより、ヒト調節性Ｔ細胞を選択的に活性化する能力を有する融合タンパク質である。本発明の代替タンパク質は、ヒトＩＬ−２（配列番号１）と比べてアミノ酸置換Ｎ８８ＲおよびＣ１２５Ｓを有するＩＬ−２改変体タンパク質、配列番号１５に記載のリンカーペプチド、および配列番号３に記載のヒトＩｇＧ２ Ｆｃタンパク質を含む。

本発明のその他の特定の実施形態は、２つの同一の鎖を含み、各鎖がＮ末端ヒトＩＬ−２改変体タンパク質部分とＣ末端ＩｇＧ Ｆｃタンパク質部分とを含む二量体タンパク質であって、Ｎ末端ヒトＩＬ−２改変体タンパク質部分が、Ｎ末端とＣ末端とを有し、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｑ１２６Ｌ、およびＱ１２６Ｆからなる群より選択される置換の少なくとも１つによって配列番号１のヒトＩＬ−２野生型と異なり、配列番号１に対して少なくとも９７％の配列同一性を有し、Ｔｒｅｇ細胞上のＩＬ２Ｒαβγに結合することによってＴｒｅｇ細胞を活性化する能力を有し；Ｎ末端ヒトＩＬ−２改変体タンパク質がそのＣ末端でアミノ酸残基６〜２０個のアミノ酸リンカーのＮ末端と接合しており、前記リンカーもＣ末端を有し；アミノ酸リンカーのＣ末端が、例えば配列番号３（ＩｇＧ２）または配列番号２（ＩｇＧ１Ｎ２９７Ａ）に対して９７％の配列同一性を有しかつシステイン残基を含有するＩｇＧ Ｆｃタンパク質部分のＮ末端と接合しており；２つの鎖が、ＩｇＧ Ｆｃタンパク質部分の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を通じて互いと連結している、二量体タンパク質である。本発明の二量体は、さらにＩＬ−２部分のＣ１２５Ｓの置換がなされていてよい。本発明のタンパク質は、グリシン残基、セリン残基、およびグリシン残基とセリン残基のミックスの群からなるアミノ酸リンカーを含むことが好ましい。リンカーは、１２個から１７個の間のセリン残基とグリシン残基のミックスを含んでよく、グリシン残基とセリン残基の比率は３：１〜５：１の範囲、例えば４：１の比率であることが好ましい。

本発明は、さらに、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物中の上記の組成物を提供する。

本発明は、さらに、本明細書に記載のタンパク質をコードする核酸を提供する。核酸は、宿主細胞のゲノムとの組換えのために設計するか、または独立に複製するプラスミドまたは染色体外核酸に導入することができる発現カセットに作動可能に連結していることが好ましい。

本発明は、さらに、それを必要とする患者においてヒト調節性Ｔ細胞を選択的に活性化する方法であって、記載されている組成物を含む医薬組成物を、ヒト調節性Ｔ細胞濃度が所望のレベルに達するまで、治療有効用量で投与するステップを含む方法を提供する。

ヒト血液細胞を１ｎＭから０．０１ｎＭの間の濃度の請求項１に記載の融合タンパク質
と接触させ、次いで、タンパク質と結合する細胞をフローサイトメトリーによって検出す
ることによって、ヒト血液試料中のＴｒｅｇ細胞の数を測定する方法。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ａ．Ｎ末端ヒトＩＬ−２改変体タンパク質部分と、
ｂ．Ｃ末端ＩｇＧ Ｆｃタンパク質部分と
を含む融合タンパク質であって、
前記ＩＬ−２融合タンパク質が、高親和性ＩＬ−２受容体を選択的に活性化し、それにより、ヒト調節性Ｔ細胞を選択的に活性化する能力を有する、融合タンパク質。
（項目２）
前記ＩＬ−２改変体タンパク質が、ヒトＩＬ２タンパク質（配列番号１）と比べてＮ８８Ｒ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２６Ｆ、Ｄ８４Ｇ、またはＤ８４Ｉからなる群より選択される置換を伴うヒトＩＬ−２を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目３）
前記ＩＬ−２改変体タンパク質が、置換Ｃ１２５Ｓを伴うヒトＩＬ−２を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目４）
前記ＩＬ−２改変体タンパク質と前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質の両方がＮ末端とＣ末端とを有し、前記ヒトＩＬ−２改変体タンパク質がそのＣ末端で前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質のＮ末端と融合している、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目５）
前記ＩＬ−２改変体タンパク質部分と前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質部分の間に位置するリンカーペプチドをさらに含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目６）
前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質が、前記融合タンパク質のＦｃ部分のエフェクター機能を低下させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含有する、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目７）
ａ．ヒトＩＬ−２（配列番号１）と比べてアミノ酸置換Ｎ８８ＲおよびＣ１２５Ｓを有するＩＬ−２改変体タンパク質と、
ｂ．配列番号１５に記載のリンカーペプチドと、
ｃ．配列番号２に記載のヒトＩｇＧ１ Ｆｃタンパク質と
を含む融合タンパク質であって、
高親和性ＩＬ−２受容体を選択的に活性化し、それにより、ヒト調節性Ｔ細胞を選択的に活性化する能力を有する、融合タンパク質。
（項目８）
ａ．ヒトＩＬ−２（配列番号１）と比べてアミノ酸置換Ｎ８８ＲおよびＣ１２５Ｓを有するＩＬ−２改変体タンパク質と、
ｂ．配列番号２に記載のリンカーペプチドと、
ｃ．配列番号３に記載のヒトＩｇＧ２ Ｆｃタンパク質と
を含む融合タンパク質。
（項目９）
項目１に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
（項目１０）
ヒト調節性Ｔ細胞を選択的に活性化する方法であって、ヒトＩＬ−２（配列番号１）と比べてアミノ酸置換Ｎ８８ＲおよびＣ１２５Ｓを有するＩＬ−２改変体タンパク質と、配列番号１５に記載のリンカーペプチドと、配列番号３に記載のヒトＩｇＧ１ Ｆｃタンパク質とを含む医薬組成物を投与するステップを含み、ここで前記医薬組成物は、ヒト調節性Ｔ細胞濃度が所望のレベルに達するまで、治療有効用量で投与される、方法。
（項目１１）
ヒト調節性Ｔ細胞を選択的に活性化する方法であって、項目２に記載のＩＬ−２改変体タンパク質と、
ａ．配列番号２に記載のヒトＩｇＧ１ Ｆｃタンパク質または
ｂ．配列番号３に記載のヒトＩｇＧ２ Ｆｃタンパク質
のいずれかから選択されるヒトＩｇＧ Ｆｃタンパク質とを含む医薬組成物を投与するステップを含み、ここで前記医薬組成物は、ヒト調節性Ｔ細胞濃度が所望のレベルに達するまで、治療有効用量で投与される、方法。
（項目１２）
ヒト血液細胞を１ｎＭから０．０１ｎＭの間の濃度の項目１に記載の融合タンパク質と接触させ、次いで、前記タンパク質と結合する細胞をフローサイトメトリーによって検出することによって、ヒト血液試料中のＴｒｅｇ細胞の数を測定する方法。
（項目１３）
２つの同一の鎖を含む二量体タンパク質であって、ここで各鎖がＮ末端ヒトＩＬ−２改変体タンパク質部分とＣ末端ＩｇＧ Ｆｃタンパク質部分とを含み、
前記Ｎ末端ヒトＩＬ−２改変体タンパク質部分が、
ａ．Ｎ末端とＣ末端とを有し、
ｂ．Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｑ１２６Ｌ、およびＱ１２６Ｆからなる群より選択される少なくとも１つの置換によって配列番号１のヒトＩＬ−２野生型と異なり、
ｃ．配列番号１に対して少なくとも９７％の配列同一性を有し、そして
ｄ．Ｔｒｅｇ細胞上のＩＬ２Ｒαβγに結合することによってＴｒｅｇ細胞を活性化する能力を有し、
前記Ｎ末端ヒトＩＬ−２改変体タンパク質がそのＣ末端でアミノ酸残基６〜２０個のアミノ酸リンカーのＮ末端と接合しており、前記リンカーもＣ末端を有し、そして
前記アミノ酸リンカーのＣ末端が、配列番号３に対して９７％の配列同一性を有しかつシステイン残基を含むＩｇＧ Ｆｃタンパク質部分のＮ末端と接合しており、前記２つの鎖が、前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質部分のシステイン残基を通じて互いと連結している、
二量体タンパク質。
（項目１４）
前記ＩＬ−２改変体タンパク質が、置換Ｃ１２５Ｓを伴うヒトＩＬ−２をさらに含む、項目１３に記載の二量体タンパク質。
（項目１５）
前記アミノ酸リンカーが、グリシン残基、セリン残基、およびグリシン残基とセリン残基のミックスの群より選択されるリンカーからなる、項目１３に記載のタンパク質。
（項目１６）
前記ＩＬ−２改変体タンパク質部分が、置換Ｎ８８Ｒを有する、項目１３に記載のタンパク質。
（項目１７）
前記リンカーが、１２個から１７個の間のセリン残基とグリシン残基のミックスを含む、項目１３に記載のタンパク質。
（項目１８）
前記リンカーが、４：１の比率のグリシン残基とセリン残基を含む、項目１３に記載の融合タンパク質。
（項目１９）
項目１に記載の融合タンパク質をコードする核酸。

図１は、ＩＬ−２または半減期が増大したＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質の単回用量後の、循環半減期、ピーク薬物レベル、生物学的有効濃度、およびＴｒｅｇ細胞増殖の刺激に必要な持続時間の関係を示す図である。破線は皮下注射後のＩＬ−２の時間をわたっての血中レベルを表し、実線はＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質の時間をわたっての血中レベルを表す。水平な点線は、それぞれＩＬ２ＲαβγおよびＩＬ２Ｒβγを発現する細胞を活性化するために必要な濃度（ＥＣ５０値）を示す。両端矢印は、細胞増殖を刺激するために必要なＥＣ５０でのＩＬ−２への曝露の持続時間（５〜６時間）を示す。

図２は、Ｆｃ融合タンパク質についての設計構成を示す。融合パートナー（Ｘ）をＦｃタンパク質のＮ末端（Ｘ−Ｆｃ）またはＣ末端（Ｆｃ−Ｘ）において融合することができる。ＸとＦｃの間にリンカーペプチドを挿入することができる。

図３は、フローサイトメトリーによって測定される、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２によって刺激されるＳＴＡＴ５リン酸化およびＮ８８ＲＬ９ＡＧ１によって刺激されるＳＴＡＴ５リン酸化の用量反応を示す。実施例３に記載の通り、細胞を、ＩＬ−２またはＮ８８ＲＦｃを上に示されている濃度で用いて３７℃で１０分にわたって処理し、固定し、透過処理し、抗体を用いて染色し、次いで、フローサイトメトリー分析に供した。ＣＤ４＋としてゲートをかけた（ｇａｔｅｄ）細胞が示されており、また、４つの象限のそれぞれに示されている通り、細胞に、ＣＤ２５およびｐＳＴＡＴ５に関してさらにゲートをかけた。各象限内の数字は、各ゲートにおけるＣＤ４＋細胞の百分率を示す。上の象限内の細胞は、Ｔｒｅｇ細胞が富化された集団である、最も高い１〜２％のＣＤ２５を発現する細胞を表し、右側の象限内の細胞は、ｐＳＴＡＴ５＋である。Ａ．Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１は、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞のみを高い選択性で刺激するが、ＩＬ−２は、ＣＤ２５^{−／ｌｏｗ}細胞とＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞の両方をピコモル濃度に至るまで大規模に刺激する。Ｂ．Ｄ２０ＨＬ０Ｇ２はｐＳＴＡＴ５刺激活性を有さない。２つの独立した実験においてｐＳＴＡＴ５活性化は観察されなかった。Ｃ．Ｄ２０Ｈ／ＩＬ２はＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞におけるｐＳＴＡＴ５を刺激するが、Ｄ２０ＨＬ０Ｇ２は刺激しないことを示す対照。プロットは疑似カラー方式で示されている。どちらのタンパク質も１０^−８Ｍの濃度で試験した。 図３は、フローサイトメトリーによって測定される、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２によって刺激されるＳＴＡＴ５リン酸化およびＮ８８ＲＬ９ＡＧ１によって刺激されるＳＴＡＴ５リン酸化の用量反応を示す。実施例３に記載の通り、細胞を、ＩＬ−２またはＮ８８ＲＦｃを上に示されている濃度で用いて３７℃で１０分にわたって処理し、固定し、透過処理し、抗体を用いて染色し、次いで、フローサイトメトリー分析に供した。ＣＤ４＋としてゲートをかけた（ｇａｔｅｄ）細胞が示されており、また、４つの象限のそれぞれに示されている通り、細胞に、ＣＤ２５およびｐＳＴＡＴ５に関してさらにゲートをかけた。各象限内の数字は、各ゲートにおけるＣＤ４＋細胞の百分率を示す。上の象限内の細胞は、Ｔｒｅｇ細胞が富化された集団である、最も高い１〜２％のＣＤ２５を発現する細胞を表し、右側の象限内の細胞は、ｐＳＴＡＴ５＋である。Ａ．Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１は、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞のみを高い選択性で刺激するが、ＩＬ−２は、ＣＤ２５^{−／ｌｏｗ}細胞とＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞の両方をピコモル濃度に至るまで大規模に刺激する。Ｂ．Ｄ２０ＨＬ０Ｇ２はｐＳＴＡＴ５刺激活性を有さない。２つの独立した実験においてｐＳＴＡＴ５活性化は観察されなかった。Ｃ．Ｄ２０Ｈ／ＩＬ２はＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞におけるｐＳＴＡＴ５を刺激するが、Ｄ２０ＨＬ０Ｇ２は刺激しないことを示す対照。プロットは疑似カラー方式で示されている。どちらのタンパク質も１０^−８Ｍの濃度で試験した。 図３は、フローサイトメトリーによって測定される、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２によって刺激されるＳＴＡＴ５リン酸化およびＮ８８ＲＬ９ＡＧ１によって刺激されるＳＴＡＴ５リン酸化の用量反応を示す。実施例３に記載の通り、細胞を、ＩＬ−２またはＮ８８ＲＦｃを上に示されている濃度で用いて３７℃で１０分にわたって処理し、固定し、透過処理し、抗体を用いて染色し、次いで、フローサイトメトリー分析に供した。ＣＤ４＋としてゲートをかけた（ｇａｔｅｄ）細胞が示されており、また、４つの象限のそれぞれに示されている通り、細胞に、ＣＤ２５およびｐＳＴＡＴ５に関してさらにゲートをかけた。各象限内の数字は、各ゲートにおけるＣＤ４＋細胞の百分率を示す。上の象限内の細胞は、Ｔｒｅｇ細胞が富化された集団である、最も高い１〜２％のＣＤ２５を発現する細胞を表し、右側の象限内の細胞は、ｐＳＴＡＴ５＋である。Ａ．Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１は、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞のみを高い選択性で刺激するが、ＩＬ−２は、ＣＤ２５^{−／ｌｏｗ}細胞とＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞の両方をピコモル濃度に至るまで大規模に刺激する。Ｂ．Ｄ２０ＨＬ０Ｇ２はｐＳＴＡＴ５刺激活性を有さない。２つの独立した実験においてｐＳＴＡＴ５活性化は観察されなかった。Ｃ．Ｄ２０Ｈ／ＩＬ２はＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞におけるｐＳＴＡＴ５を刺激するが、Ｄ２０ＨＬ０Ｇ２は刺激しないことを示す対照。プロットは疑似カラー方式で示されている。どちらのタンパク質も１０^−８Ｍの濃度で試験した。

図４は、Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１を用いて処理したＣＤ４＋Ｔ細胞では、高レベルのＦＯＸＰ３を発現する細胞におけるｐＳＴＡＴ５レベルの刺激が示されたことを示す。実施例３に記載の通り、細胞を４×１０^−９ＭのＩＬ−２またはＮ８８ＲＬ９ＡＧ１を用いて処理し、次いで、分析した。Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１を用いて処理したｐＳＴＡＴ５＋細胞は大多数が同様にＦＯＸＰ３＋であったが、ＩＬ−２を用いて処理したｐＳＴＡＴ５＋細胞はＦＯＸＰ３−とＦＯＸＰ３＋の両方であり、大多数がＦＯＸＰ３−であった。

図５は、ＨＥＫ２９３細胞において産生される異なるＦｃ融合構築物のタンパク質収量を示す。実施例１に記載の通り、タンパク質を最適化された一過性発現系において並行して発現させ、精製した。結果は、培養物３０ｍｌからの精製タンパク質の最終的な収量として表されている。Ａ．Ｎ８８Ｒ／ＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質収量は、ペプチドリンカーの長さが増すにしたがって増加する。Ｂ．ｗｔ ＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質の収量は、１５残基のペプチドリンカーを用いるとほんのわずかだけ増強した。Ｄ２０Ｈ／ＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質の高収量は、Ｆｃ−Ｘ構成ではなくＸ−Ｆｃ構成で得られた。 図５は、ＨＥＫ２９３細胞において産生される異なるＦｃ融合構築物のタンパク質収量を示す。実施例１に記載の通り、タンパク質を最適化された一過性発現系において並行して発現させ、精製した。結果は、培養物３０ｍｌからの精製タンパク質の最終的な収量として表されている。Ａ．Ｎ８８Ｒ／ＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質収量は、ペプチドリンカーの長さが増すにしたがって増加する。Ｂ．ｗｔ ＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質の収量は、１５残基のペプチドリンカーを用いるとほんのわずかだけ増強した。Ｄ２０Ｈ／ＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質の高収量は、Ｆｃ−Ｘ構成ではなくＸ−Ｆｃ構成で得られた。

図６は、Ｎ８８Ｒ／ＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質における、ＩＬ−２生物活性のペプチドリンカーの長さに対する依存性を示す。（Ａ）ＣＤ２５^ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）におけるｐＳＴＡＴ５シグナルはペプチドリンカーの長さが増すにしたがって増加する。（Ｂ）ＣＤ２５^{−／ｌｏｗ}細胞では、いずれのＮ８８Ｒ／ＩＬ２−Ｆｃタンパク質を用いても有意なｐＳＴＡＴ５シグナルは観察されなかった。１０^−８ＭのＩＬ−２内部対照のｐＳＴＡＴ５シグナルが両方のパネルに黒色の三角形によって示されている。 図６は、Ｎ８８Ｒ／ＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質における、ＩＬ−２生物活性のペプチドリンカーの長さに対する依存性を示す。（Ａ）ＣＤ２５^ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）におけるｐＳＴＡＴ５シグナルはペプチドリンカーの長さが増すにしたがって増加する。（Ｂ）ＣＤ２５^{−／ｌｏｗ}細胞では、いずれのＮ８８Ｒ／ＩＬ２−Ｆｃタンパク質を用いても有意なｐＳＴＡＴ５シグナルは観察されなかった。１０^−８ＭのＩＬ−２内部対照のｐＳＴＡＴ５シグナルが両方のパネルに黒色の三角形によって示されている。

図７は、ヒトＴｒｅｇにおけるＤ２０Ｈ／ＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質の生物活性を示す。Ｄ２０ＨＬ１５ＡＧ１の効力はＮ８８ＲＬ１５ＡＧ１の効力よりも実質的に低く、また、Ｄ２０ＨＬ１５ＡＧ１（Ｘ−Ｆｃ構成）およびＡＧ１Ｌ１５Ｄ２０Ｈ（Ｆｃ−Ｘ構成）は同様の効力を有する。３種のタンパク質は全て１５残基のペプチドリンカーを有する。

図８は、１５残基のペプチドリンカーを有する、および有さないｗｔ ＩＬ−２−Ｆｃ ｐＳＴＡＴ５活性の生物活性を示すグラフである。Ｔｒｅｇ細胞（Ａ）およびＣＤ２５^{−／ｌｏｗ}細胞（Ｂ）のどちらにおいても、１５残基のペプチドリンカーによるＩＬ−２生物活性の増強はわずかであった。 図８は、１５残基のペプチドリンカーを有する、および有さないｗｔ ＩＬ−２−Ｆｃ ｐＳＴＡＴ５活性の生物活性を示すグラフである。Ｔｒｅｇ細胞（Ａ）およびＣＤ２５^{−／ｌｏｗ}細胞（Ｂ）のどちらにおいても、１５残基のペプチドリンカーによるＩＬ−２生物活性の増強はわずかであった。

図９。ヒトＰＢＭＣにおける７種の異なる免疫細胞型に対するＩＬ−２およびＩＬ−２選択的アゴニストタンパク質の選択性。Ｎ８８ＲＬ１５ＡＧ１は、ｗｔ ＩＬ−２およびＷＴＬ １５ＡＧ１と比較してＴｒｅｇに対して高度に選択的であり、多数の細胞型においてＮ８８Ｒ／ＩＬ２よりも高い選択性を示す。 図９。ヒトＰＢＭＣにおける７種の異なる免疫細胞型に対するＩＬ−２およびＩＬ−２選択的アゴニストタンパク質の選択性。Ｎ８８ＲＬ１５ＡＧ１は、ｗｔ ＩＬ−２およびＷＴＬ １５ＡＧ１と比較してＴｒｅｇに対して高度に選択的であり、多数の細胞型においてＮ８８Ｒ／ＩＬ２よりも高い選択性を示す。

緒言
本発明は、３つの重要なタンパク質要素：（１）Ｔｒｅｇ細胞に対して高度に選択的になるように改変された、工学的に操作されたＩＬ−２サイトカイン、（２）タンパク質の循環半減期を増大させるエフェクター機能欠損Ｆｃタンパク質、および（３）融合タンパク質の高い生物学的活性のために必要である、２つの部分の間のリンカーペプチドを含む新規の治療用融合タンパク質である。本発明を構成する融合タンパク質は、ＩＬ−２融合タンパク質に関する先行技術の教示に反する最初の予期しない知見によって発見され、これらの分子を導いた研究により、それらの生物学的なおよび治療活性にとって重要である、鍵となる構造と活性の関連性が定義された。本発明によって定義される分子により、自己免疫性病理および炎症性病理を抑制するＴ細胞の小さな亜集団の産生を刺激する新規の機構によって自己免疫疾患を安全かつ有効に治療することが可能になる。このパラダイムを破壊する治療薬により、いくつかの異なる自己免疫疾患が治療される可能性があり得る。

定義
「配列番号１に対する少なくともあるパーセント（例えば、９７％）の配列同一性」とは、本明細書で使用される場合、２つまたはそれ超の核酸またはポリペプチドの配列が同じである程度を指す。評価のウインドウにわたる、例えば、目的の配列の長さにわたる、目的の配列と第２の配列の間のパーセント同一性は、配列をアラインメントし、同一性を最大にするためにギャップを導入し、評価のウインドウ内の、同一の残基と対向する残基（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を決定し、ウインドウ内に入る目的の配列または第２の配列の残基の総数（どちらか大きい方）で割り、１００を掛けることによって計算することができる。特定のパーセント同一性を達成するために必要な同一の残基の数を計算する場合、分数を丸めて最も近い整数にする。パーセント同一性は、種々のコンピュータプログラムを使用して算出することができる。例えば、ＢＬＡＳＴ２、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴなどのコンピュータプログラムにより、目的の配列間でアラインメントが生成され、パーセント同一性がもたらされる。ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ ９０巻：５８７３〜５８７７頁、１９９３年と同様に改変したＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ ８７巻：２２２６４〜２２６８頁、１９９０年）をＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５巻：４０３〜４１０頁、１９９０年）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み入れる。比較する目的でギャップが挿入されたアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年）に記載の通りＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの初期パラメータを使用することができる。ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を通じて公的に入手可能である。これらのプログラムに関してはＵＲＬ ワールドワイドウェブアドレス：「ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ」のウェブサイトを参照されたい。特定の実施形態では、パーセント同一性を、ＢＬＡＳＴ２を使用し、ＮＣＢＩによって提供される初期パラメータを用いて算出する。

「Ｎ末端」とは、カルボキシル酸基を有するカルボキシル末端とは対照的に、アミノ基を有するペプチドまたはポリペプチドの末端を指す。

「Ｃ末端」とは、アミノ基を有するアミノ末端とは対照的に、カルボン酸基を有するペプチドまたはポリペプチドの末端を指す。

「Ｃ末端ＩｇＧ Ｆｃタンパク質部分」とは、それぞれがＩｇＧ分子の２つの重鎖のヒンジ領域、第２の定常ドメイン、および第３の定常ドメインを有し、ヒンジ領域を通じて互いとジスルフィド結合したカルボキシ末端重鎖からなる、２つの同一のタンパク質断片に由来する融合タンパク質の一部を指す。これは、補体タンパク質Ｃ１ｑおよびＩｇＧ−Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）と相互作用し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を媒介するＩｇＧ分子の一部であると機能的に定義される。エフェクター機能が低下するように、循環半減期が増大するように、およびグリコシル化部位が排除されるように、配列を改変することができる。

ＩＬ２改変体
本発明のＩＬ−２改変体タンパク質は、ＩＬ−２αβγ選択的アゴニストである。これらは、機能的に、ＩＬ２Ｒβγ受容体複合体と比べてＩＬ２Ｒαβγ受容体複合体を選択的に活性化する。これは、配列番号１の野生型ＩＬ−２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するとして構造的に定義され、Ｔｒｅｇ細胞を優先的に活性化する能力によって機能的に定義される野生型ＩＬ−２タンパク質に由来する。タンパク質は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−／ｌｏｗ Ｔ細胞またはＮＫ細胞と比較したＴｒｅｇ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５タンパク質のレベルによって、または、ＮＫ細胞に対する、フィトヘマグルチニンにより刺激したＴ細胞の選択的活性化によって測定される、ＴｒｅｇにおけるＩＬ−２受容体シグナル伝達を選択的に活性化する能力によって機能的に定義することもできる。

「Ｎ末端ヒトＩＬ−２改変体タンパク質部分」とは、上記の通り構造的におよび機能的に定義される野生型ＩＬ−２タンパク質に由来する融合タンパク質のＮ末端ドメインを指す。

「Ｃ末端」とは、アミノ基を有するアミノ末端とは対照的に、カルボン酸基を有するペプチドまたはポリペプチドの末端を指す。

Ｔｒｅｇ
「Ｔｒｅｇ」または「Ｔｒｅｇ細胞」とは、調節性Ｔ細胞を指す。調節性Ｔ細胞は、他の免疫細胞の活性を抑制するＴ細胞のクラスであり、フローサイトメトリーを使用し、細胞マーカー表現型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋によって定義される。ＦＯＸＰ３は細胞内タンパク質であり、染色には細胞の固定および透過処理が必要であるので、生存Ｔｒｅｇを定義するためには、細胞表面表現型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−を使用することができる。Ｔｒｅｇは、ｔＴｒｅｇ（胸腺由来）およびｐＴｒｅｇ（末梢由来、末梢中のナイーブなＴ細胞から分化する）などの種々のＴｒｅｇサブクラスも包含する。Ｔｒｅｇは全てＩＬ２Ｒαβγ受容体を発現し、それら自体のＩＬ−２は産生せず、成長に関してＩＬ−２に依存し、どちらのクラスも、ＩＬ２Ｒαγβ選択的アゴニストによって選択的に活性化されることが当業者には理解されよう。

ペプチドリンカー
「ペプチドリンカー」とは、融合タンパク質を構成する２つのタンパク質の間に位置するアミノ酸配列と定義され、したがって、リンカーペプチド配列は、パートナータンパク質のいずれにも由来しない。ペプチドリンカーは、構成成分タンパク質部分の適切なタンパク質フォールディングおよび安定性を促進するため、タンパク質の発現を改善するため、または２つの融合パートナーのより良好な生物活性を可能にするために、融合タンパク質にスペーサーとして組み入れられる（Ｃｈｅｎら、２０１３年、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ． ６５巻（１０号）：１３５７〜６９頁）。ペプチドリンカーは、構造化されていない柔軟なペプチドまたは剛性の構造化されたペプチドのカテゴリーに分けることができる。

Ｆｃ融合タンパク質
「Ｆｃ融合タンパク質」は、哺乳動物ＩｇＧタンパク質のＦｃドメインの翻訳リーディングフレームを別のタンパク質（「Ｆｃ融合パートナー」）のものと融合して新規の単一の組換えポリペプチドを生じさせる組換えＤＮＡ技術によって作出されたタンパク質である。Ｆｃ融合タンパク質は、一般には、ヒンジ領域に位置するジスルフィド結合によって一緒に接合した、ジスルフィド連結二量体として作製される。

機能的活性化
「生物活性」とは、定量的な細胞に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける生物学的活性の測定値を指す。

「Ｔｒｅｇ細胞の機能的活性化」は、ＴｒｅｇにおけるＩＬ−２媒介性応答と定義される。Ｔｒｅｇ細胞の機能的活性化についてのアッセイ読み取りは、ｐＳＴＡＴ５の刺激、Ｔｒｅｇ細胞増殖、およびＴｒｅｇエフェクタータンパク質のレベルの刺激を含む。

設計および構築
Ｆｃ融合タンパク質の設計および構築には多数の選択肢があり、所望の生物学的活性および薬学的特性を有する分子の生成を可能にするために、これらの設計選択肢の中での選択を以下に示す。重要な設計選択肢は、（１）ＩＬ２選択的アゴニストの性質、（２）Ｆｃタンパク質部分の選択、（３）融合タンパク質における融合パートナーの構成、（４）Ｆｃと融合パートナータンパク質の間の接合部のアミノ酸配列である。

一般的な方法
一般に、本発明の融合タンパク質の調製は、本明細書に開示されている手順、および認められている関連する組換えＤＮＡ技法、例えば、ポリメラーゼ連鎖増幅反応（ＰＣＲ）、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素を用いたＤＮＡの切断、オリゴヌクレオチドの調製、ＤＮＡのライゲーション、ｍＲＮＡの単離、適切な細胞へのＤＮＡの導入、宿主の形質転換またはトランスフェクション、宿主の培養によって達成することができる。さらに、融合分子を、カオトロピック剤および周知の電気泳動方法、遠心分離方法およびクロマトグラフィー方法を使用して単離し、精製することができる。これらの方法に関する開示に関しては、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版（１９８９年）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９年）を参照されたい。

本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子は、所望の融合物をコードするＤＮＡを得るために使用する基本的なステップとして制限酵素消化およびライゲーションを必要とする。ライゲーション前にＤＮＡ断片の末端を修飾することが必要になる場合があり、これは、突出部を埋めること、ヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＩＩＩ）を用いて断片（複数可）の末端部分を欠失させること、部位特異的変異誘発、または、ＰＣＲにより新しい塩基対を添加することによって達成することができる。選択された断片の接合を容易にするために、ポリリンカーおよびアダプターを使用することができる。発現構築物は、一般には、複数ラウンドの制限、ライゲーション、およびＥ．ｃｏｌｉの形質転換を使用する複数段階で組み立てる。発現構築物の構築に適した多数のクローニングベクターが当技術分野で公知であり（λＺＡＰおよびｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫ−１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ｐＥＴ、Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．−Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９年に記載）、本発明には特定の選択は重大ではない。クローニングベクターの選択は、発現構築物を宿主細胞に導入するために選択する遺伝子移入系の影響を受ける。各段階の最後に、得られた構築物を制限、ＤＮＡ配列、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ分析によって分析することができる。

一般には、当技術分野で公知の方法によって本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子に特定の変異を導入するために、部位特異的変異誘発を使用する。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号；Ｓｔｏｒｉｃｉら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９巻：７７３〜７７６頁；Ｋｒｅｎら、１９９８年、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ４巻：２８５〜２９０頁；およびＣａｌｉｓｓａｎｏおよびＭａｃｉｎｏ、１９９６年、Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ． Ｎｅｗｓｌｅｔｔ． ４３巻：１５〜１６頁を参照されたい。任意の部位特異的変異誘発手順を本発明において使用することができる。本発明の改変体を調製するために使用することができる、入手可能な市販のキットが多く存在する。

種々のプロモーター（転写開始調節領域）を本発明に従って使用することができる。適切なプロモーターの選択は、提案される発現宿主に依存する。選択された宿主において機能的である限りは、異種供給源由来のプロモーターを使用することができる。

本明細書に記載のタンパク質の発現を容易にするために、種々のシグナル配列を使用することができる。発現宿主における効率的な分泌およびプロセシングのために選択または設計されたシグナル配列も使用することができる。ＴＣＲコード配列またはマウスＩＬ−２コード配列と相同なシグナル配列を哺乳動物細胞に使用することができる。他の適切なシグナル配列／宿主細胞対としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける分泌のためのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓａｃＢシグナル配列、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓでの分泌のためのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−接合因子またはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酸性ホスファターゼｐｈｏＩシグナル配列が挙げられる。シグナル配列は、シグナルペプチダーゼ切断部位をコードする配列を通じて直接タンパク質コード配列と接合することもでき、短いヌクレオチド橋を通じて接合することもできる。

真核生物のタンパク質の発現系について、転写および翻訳を増強するための要素が同定されている。例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター１０００ｂｐを異種プロモーターのどちらかの側に位置づけることにより、植物細胞における転写レベルが１０〜４００倍上昇し得る。発現構築物は、適切な翻訳開始配列を含むべきである。適切な翻訳開始のためにＫｏｚａｋコンセンサス配列を含むように発現構築物を改変することにより、翻訳のレベルが１０倍上昇し得る。

発現カセットを、使用する宿主に適合する適切なベクターに接合する。ベクターは、発現させる融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列に適応させることができるものでなければならない。適切な宿主細胞としては、真核細胞および原核細胞、好ましくは、容易に形質転換することができ、培養培地中で迅速な成長を示す細胞が挙げられる。具体的に好ましい宿主細胞としては、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｕｓなどの原核生物、ならびに動物細胞および酵母株、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの真核生物が挙げられる。一般に、哺乳動物細胞、特にＨＥＫ、Ｊ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２−ＯまたはＣＨＯが好ましい。他の適切な宿主としては、例えば、Ｓｆ９などの昆虫細胞が挙げられる。従来の培養条件を使用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい。次いで、安定に形質転換またはトランスフェクトされた細胞株を選択することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写−翻訳系も発現系として使用することができる。

所望の融合タンパク質をコードする核酸は、細胞をトランスフェクトするための標準の技法によって宿主細胞に導入することができる。「トランスフェクトすること（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ）」または「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」という用語は、リン酸カルシウム共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、微量注射、ウイルスによる形質導入および／または組み込みを含めた、核酸を宿主細胞に導入するための従来の技法の全てを包含するものとする。宿主細胞をトランスフェクトするために適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、および他の研究室教本において見いだすことができる。

あるいは、本明細書に記載のタンパク質の構築の全部または一部に関して合成遺伝子構築を使用することができる。これは、目的のポリペプチド分子をコードするように設計されたポリヌクレオチド分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を伴う。遺伝子合成は、Ｔｉａｎら（Ｔｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ４３２巻：１０５０〜１０５４頁）に記載されているマルチプレックスマイクロチップに基づく技術およびオリゴヌクレオチドを合成し、光プログラム可能なマイクロ流体チップ上に集合させる同様の技術などの、いくつかの技法を利用して実施することができる。

本発明の融合タンパク質は、収集した宿主細胞から、または培養培地から単離する。標準のタンパク質の精製技法を使用して、目的のタンパク質を培地から、または収集した細胞から単離する。特に、精製技法を使用して、ローラーボトル、スピナーフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクター、または発酵槽を含めた種々の手法から所望の融合タンパク質を大規模に（すなわち、少なくともミリグラム分量で）発現させ、精製することができる。

ＩＬ２選択的アゴニスト部分
置換Ｎ８８Ｒを伴うＩＬ−２は、ＩＬ２Ｒαβγ受容体に対するＩＬ２選択的アゴニストの代表例である（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ， Ａ． Ｂ．ら、２０００年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８巻：１１９７〜２０２頁）。ＩＬ２／Ｎ８８Ｒは、ＩＬ２Ｒβ受容体サブユニットおよびＩＬ２Ｒβγ受容体複合体への結合を欠損しているが、ＩＬ２Ｒαβγ受容体複合体には結合し、ＩＬ２Ｒαβγを発現するＰＨＡ活性化Ｔ細胞の増殖をｗｔ ＩＬ−２と同様に有効に刺激することができ、一方、ＩＬ２Ｒβγを発現するＮＫ細胞の増殖を刺激する能力は３，０００分の１に低下する。同様の活性プロファイルを有する他のＩＬ２Ｒαβγ選択的アゴニストとしては、置換Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、およびＤ２０Ｈを伴うＩＬ−２が挙げられ、また、置換Ｑ１２６ＬおよびＱ１２６Ｆ（ＩＬ２ＲＧサブユニットとの接触残基）を伴う他のＩＬ２改変体もＩＬ２Ｒαβγ選択的アゴニスト活性を有する（Ｃａｓｓｅｌｌ， Ｄ． Ｊ．ら、２００２年、Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．、８巻：２１７１〜８３頁）。これらのＩＬ２選択的アゴニスト分子のいずれかをＩＬ２／Ｎ８８Ｒ部分の代わりに使用することができ、Ｆｃ融合タンパク質が同様の活性を有することが予測されることが当業者には理解されよう。上述の変異は全て、ｗｔ ＩＬ−２、または、不対のシステイン残基を排除することによってＩＬ−２安定性を促進する置換である置換Ｃ１２５Ｓを伴うｗｔ ＩＬ−２のバックグラウンドに対して行うことができる。本発明は、ＩＬ−２受容体活性化活性に著しい影響を与えることなく産生または安定性を改善する他の変異または短縮と共に使用することもできる。

本発明の改変体は、任意選択で、アミノ酸配列と核酸配列のどちらにも適用される保存的に置換された改変体を含む。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一または基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指す、または、アミノ酸配列をコードしない核酸の場合には、基本的に同一の配列を指す。詳細には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９巻：５０８１頁（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０巻：２６０５〜２６０８頁（１９８５年）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８巻：９１〜９８頁（１９９４年））。遺伝暗号の縮重が原因で、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによりアラニンが指定されるあらゆる位置において、コドンを、コードされるポリペプチドを変更させることなく、記載されている対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は、保存的に改変された変異の１つの種である、サイレント変異である。本明細書では、ポリペプチドをコードするあらゆる核酸配列は、あらゆる可能性のある核酸のサイレント変異も記載する。核酸における各コドン（普通はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および、普通はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧ以外）を改変して機能的に同一の分子を得ることができることが当業者には理解されよう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異のそれぞれが、記載されている配列のそれぞれに含意される。

アミノ酸配列の保存的置換に関しては、コードされる配列内の単一のアミノ酸または小さな百分率のアミノ酸を変更させる、付加するまたは欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、変更により、アミノ酸が化学的に同様のアミノ酸に置換される、保存的に改変された改変体であることが当業者には理解されよう。機能的に同様のアミノ酸がもたらされる保存的置換表は当技術分野で周知である。そのような保存的に改変された改変体は、本発明の多型改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子に加わるものであり、それらを排除するものではない。

以下の群はそれぞれ、互いと保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
３）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
４）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
５）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）；
６）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；
７）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）；および
８）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

ＦＣタンパク質部分
重要な設計選択は、Ｆｃタンパク質部分の性質である。Ｆｃ融合タンパク質の主要な治療への適用は、（１）融合パートナータンパク質に免疫グロブリンＦｃエフェクター機能を付与すること；または（２）融合パートナータンパク質の循環半減期を増大させることである（Ｃｚａｊｋｏｗｓｋｙら、２０１２年、ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ． ４巻：１０１５〜２８頁）。ＩｇＧタンパク質の主要なエフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）であり、これらの機能は、それぞれ補体タンパク質Ｃ１ｑおよびＩｇＧ−Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）へのＦｃ結合によって媒介される。これらのエフェクター機能は、特定の抗原標的または細胞に対する免疫応答を導くまたは増強するために治療用タンパク質を使用する場合に重要である。本発明の融合タンパク質は、単にＩＬ２選択的アゴニスト部分の循環半減期が増大するように設計され、エフェクター機能は必要なく、さらには毒性であり得、したがって、明白に望ましくない。例えば、エフェクター機能コンピテントＦｃを有するＩＬ２選択的アゴニスト−Ｆｃ融合タンパク質により、本発明の融合タンパク質によって活性化し、増大させようとするＴｒｅｇ細胞が死滅する潜在性があり、これはまさに自己免疫疾患に対する治療目標の逆である。エフェクター機能（ＣＤＣ、ＡＤＣＣ）、循環半減期、および安定性が異なる４種のヒトＩｇＧサブクラスが存在する（Ｓａｌｆｅｌｄ， Ｊ． Ｇ．、２００７年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５巻：１３６９〜７２頁）。ＩｇＧ１は、Ｆｃエフェクター機能を有し、最も豊富なＩｇＧサブクラスであり、また、ＵＳ ＦＤＡによる認可を受けた治療用タンパク質に最も一般的に使用されているサブクラスである。ＩｇＧ２は、Ｆｃエフェクター機能が欠損しているが、他のＩｇＧ２分子との二量体を形成しやすく、また、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合がスクランブルすること（ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）に起因して不安定になりやすい。ＩｇＧ３は、Ｆｃエフェクター機能を有し、また、非常に長い、剛性のヒンジ領域を有する。ＩｇＧ４は、Ｆｃエフェクター機能が欠損しており、他のサブクラスよりも循環半減期が短く、また、ＩｇＧ４二量体はヒンジ領域における単一のジスルフィド結合のみにより異なるＩｇＧ４分子間でのＨ鎖の交換が導かれることに起因して生化学的に不安定である。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４に由来するＦｃタンパク質部分は、エフェクター機能を有さず、本発明に使用することができることが当業者には理解されよう。Ｆｃ配列の改変は当技術分野に記載されており、したがって、凝集が妨げられるようにＩｇＧ２ Ｆｃヒンジ領域を改変できること、または、二量体が安定化するようにＩｇＧ４ Ｆｃのヒンジ領域を改変できることも当業者には理解されよう。あるいは、ＩｇＧ１のエフェクター機能が欠損した改変体が生成されている。そのような改変体の１つは、Ｎ−連結グリコシル化部位の場所であるＮ２９７位にアミノ酸置換を有する。このアスパラギン残基の置換により、グリコシル化部位が除去され、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性が有意に低下する（Ｔａｏ， Ｍ． Ｈ．ら、１９８９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３巻：２５９５〜２６０１頁）。本発明ではこの改変体を代表例として使用する。別のエフェクター機能欠損ＩｇＧ１改変体は、Ｃ１ｑおよびＦｃγＲ結合部位におけるアミノ酸を変異させるＩｇＧ１（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ）（Ｏｇａｎｅｓｙａｎら、２００８年、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ６４巻：７００〜４頁）であり、エフェクターが欠損しており、かつ安定なＩＬ２ＳＡ−Ｆｃ融合タンパク質を生成するための、これらのまたは同様のＦｃ改変体の使用が当業者には検討されよう。二量体ではなく安定な単量体になるように工学的に操作されるＦｃタンパク質部分の形態も（Ｄｕｍｏｎｔ， Ｊ． Ａ．ら、２００６年、ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０巻：１５１〜６０頁；Ｌｉｕ Ｚら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１５年 ２０；２９０巻：７５３５〜６２頁）、本発明のＩＬ−２選択的アゴニストと組み合わせることができることも当業者には理解されよう。さらに、ＩＬ−２−Ｆｃ Ｈ鎖ポリペプチドとＦｃ Ｈ鎖ポリペプチドの組合せで構成され、二重特異性抗体技術（Ｚｈｕ Ｚら、１９９７年 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ６巻：７８１〜８頁）を使用して組み立てられる、機能的に単量体であるヘテロ二量体も本発明のＩＬ−２選択的アゴニストと組み合わせることができることが当業者には理解されよう。ＩｇＧ部分に抗原特異性を有する（Ｐｅｎｉｃｈｅｔ， Ｍ． Ｌ．ら，１９９７年、Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． ８巻：１０６〜１８頁）または有さない（Ｂｅｌｌら、２０１５年、Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ． ５６巻：６６〜８０頁）インタクトなＩｇＧ抗体分子を用いて、いくつかのＩＬ−２ Ｆｃ融合タンパク質が作出されている。さらに、ヒンジ領域の一部または全部を欠くＦｃ改変体を本発明と共に使用することができることが当業者には理解されよう。

Ｆｃ融合タンパク質は、本発明では、融合パートナータンパク質ＸがＮ末端にあり、ＦｃがＣ末端にあるＸ−ＦｃおよびＦｃ−Ｘ、ならびにＦｃがＮ末端にあり、融合パートナータンパク質がＣ末端にあるＦｃ−Ｘと示される２つの構成で作出することができる（図２）。文献において、異なる融合パートナーはＮ末端またはＣ末端Ｆｃ融合に対して別個の優先性を有し得ることが示されている例がある。例えば、ＦＧＦ２１は、Ｆｃ−Ｘ構成に対する強力な優先性を有することが示されている。Ｆｃ−ＦＧＦ２１はＦＧＦ２１自体と基本的に同じ受容体活性化生物活性を有するが、ＦＧＦ２１−Ｆｃの生物活性は１０００分の１に低下する（Ｈｅｃｈｔら、２０１２年、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ７巻（１１号）：ｅ４９３４５頁）。いくつかのＩＬ−２ Ｆｃ融合タンパク質が種々の適用のために作出されており、これらは、Ｆｃと、Ｆｃ−Ｘ構成（Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９９２年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、８９巻：１４２８〜３２頁；Ｂｅｌｌら、２０１５年、Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ． ５６巻：６６〜８０頁）およびＸ−Ｆｃ構成（Ｚｈｅｎｇ， Ｘ． Ｘ．ら、１９９９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３巻：４０４１〜８頁）のどちらで直接融合した場合にも良好なＩＬ−２生物活性を有することが報告されている。Ｇａｖｉｎら（ＵＳ２０１４０２８６８９８Ａ１）には、遊離のＩＬ−２サイトカインの生物活性と同様の生物活性を有する、ＩＬ−２およびある特定のＩＬ−２改変体をＦｃ−Ｘ構成で含有するＦｃ融合タンパク質が記載されているが、それとは対照的に、Ｚｈｅｎｇら（Ｚｈｅｎｇ， Ｘ． Ｘ．ら、１９９９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９９年、１６３巻：４０４１〜８頁）の結果からは、Ｘ−Ｆｃ構成のＩＬ−２改変体融合タンパク質では生物活性が低下するまたは生物活性がないことが見いだされた。したがって、Ｇａｖｉｎらは、概して、Ｎ末端ＩＬ−２ Ｆｃ融合タンパク質とは反対の事項を教示している。融合タンパク質構成の選択に影響を及ぼす別の因子は循環半減期に対する影響である。文献において再び生じた知見は、Ｆｃ−Ｘ構成のＩＬ−２融合タンパク質は、ヒトにおけるヒトＩｇＧ１の２１日の半減期または現在ＦＤＡに認可を受けているＦｃ融合タンパク質（表Ｉ）の半減期よりもかなり短い、比較的短い循環半減期を有するというものである。Ｆｃ−Ｘ構成のＩｇＧ−ＩＬ２融合タンパク質は、マウスではおよそ数時間（Ｇｉｌｌｉｅｓ Ｓ． Ｄ．、２００２年 Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、８巻：２１０〜６頁；Ｇｉｌｌｉｅｓ， Ｓ． Ｄ．、ＵＳ２００７／００３６７５２Ａ２；Ｂｅｌｌ Ｃ． Ｊ．、２０１５年 Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ． ５６巻：６６〜８０頁）、ヒトでは、およそ３．３時間（Ｒｉｂａｓ Ａ．、Ｊ ２００９年 Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ７巻：６８頁）および３．７時間（Ｋｉｎｇ Ｄ． Ｍ．、２００４年 Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．、２２巻：４４６３〜７３頁）の比較的短い循環半減期を有することが報告されており、Ｆｃ−ＩＬ２融合タンパク質は、マウスでは１２．５時間の循環半減期を有することが報告されている（Ｚｈｕ Ｅ． Ｆ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ． ２０１５ １３；２７巻（４号）：４８９〜５０１頁）。Ｆｃ部分のＣ末端とＩＬ−２部分の間でのタンパク質分解が短い循環半減期に寄与する（Ｇｉｌｌｉｅｓ Ｓ． Ｄ．、２００２年 Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、８巻：２１０〜６頁；Ｚｈｕ Ｅ． Ｆ．、２０１５年 Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ． ２７巻：４８９〜５０１頁）。これらの比較的短い半減期が原因で、本発明者らは、Ｘ−Ｆｃ構成のＩＬ２選択的アゴニストＦｃ融合タンパク質に着目してきた。

リンカー
Ｆｃと融合パートナータンパク質の間の接合部のアミノ酸配列は、（１）２つのタンパク質配列の直接融合、または（２）間に入るリンカーペプチドを伴う融合のいずれであってもよい。現在ＵＳ ＦＤＡにより臨床使用に関して認可を受けている１０種のＦｃ融合タンパク質（表Ｉ）のうち、８種が融合パートナータンパク質とＦｃの直接融合であり、２種がリンカーペプチドを有し、したがって、多くのＦｃ融合タンパク質がリンカーペプチドを伴わずに機能的であり得る。リンカーペプチドは、２つのタンパク質部分の間のスペーサーとして含まれる。リンカーペプチドにより、構成成分タンパク質部分の適切なタンパク質フォールディングおよび安定性が促進し、タンパク質の発現を改善し、また、構成成分タンパク質部分のより良好な生物活性を可能にすることができる（Ｃｈｅｎら、２０１３年、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ． ６５巻：１３５７〜６９頁）。多くの融合タンパク質に使用されるペプチドリンカーは、構造化されていない柔軟なペプチドになるように設計される。天然のタンパク質内の独立した構造的ドメイン間のリンカーペプチドの長さ、配列、およびコンフォメーションに関する試験により、柔軟なペプチドリンカーを設計するための理論的基礎がもたらされている（Ａｒｇｏｓ、１９９０年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２１１巻：９４３〜５８頁）。Ａｒｇｏｓにより、グリシンのような小さな非極性残基とセリンおよびトレオニンのような小さな極性残基で構成される長い柔軟なリンカーペプチドであり、多数のグリシン残基により高度に柔軟なコンフォメーションが可能になり、セリンまたはトレオニンによりペプチド内または構成成分である融合タンパク質部分との疎水性相互作用が限定される極性表面エリアがもたらされるリンカーペプチドの手引きがもたらされた。文献に記載されている多くのペプチドリンカーは、例えば配列ＧＧＧＧＳの反復など、グリシンおよびセリンに富むものであるが、Ａｒｇｏｓの一般的な推奨に従った他の配列（Ａｒｇｏｓ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９０年 ２０；２１１巻（４号）：９４３〜５８頁）も使用することができることが当業者には理解されよう。例えば、本明細書に記載のタンパク質のうちの１つは、グリシンとアラニンで構成されるリンカーペプチド（配列番号１５）を含有する。十分に伸長されたベータ鎖コンフォメーションを有する柔軟なリンカーペプチドは、端から端までの長さが残基当たりおよそ３．５Åである。したがって、５残基、１０残基、１５残基、または１０残基のリンカーペプチドの最大の十分に伸長された長さはそれぞれ１７．５Å、３５Å、５２．５Å、または７０Åになる。ペプチドリンカーの最大の端から端までの長さは、本発明におけるペプチドリンカーの特性を定義するための指針にもなり得る。本発明内でのリンカーペプチドの目的は、ＩＬ−２選択的アゴニスト部分とその同族受容体を会合させ、またＦｃＲｎへＦｃ部分を結合させて融合タンパク質の再利用および循環半減期の延長を可能にするために、個々の融合タンパク質部分の適切なコンフォメーションおよび配向を達成し得ることである。これらの相互作用に影響を及ぼす因子は予測することが難しいので、リンカーペプチドに対する要件およびその適切な長さは、経験的に試験し、決定しなければならない。表Ｉに列挙されているＵＳ ＦＤＡによる認可を受けたＦｃ融合タンパク質１０種のうち８種がそのようなペプチドを欠くことによって証明されるように、多くのＦｃ融合タンパク質にはリンカーペプチドは必要ない。対照的に、ＧＬＰ−１とＦｃの融合物であるデュラグルチドは、生物活性に強力に影響を及ぼす１５残基のペプチドリンカーを含有する（Ｇｌａｅｓｎｅｒ、米国特許第７，４５２，９６６Ｂ２号）。ＩＬ−２−Ｆｃ融合タンパク質に関する当技術分野における先行研究では、リンカーペプチドは生物活性に必要なものではないことが示されている。ｗｔ ＩＬ−２または置換Ｃ１２５Ｓを伴うＩＬ−２をＦｃ−Ｘ配向で含有するＩＬ−２融合タンパク質は、ペプチドリンカーを有さずに（Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９９２年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、８９巻：１４２８〜３２頁；Ｇａｖｉｎら、米国特許出願第２０１４０２８６８９８Ａ１号）またはペプチドリンカーを有して（Ｂｅｌｌら、２０１５年、Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ． ５６巻：６６〜８０頁）、遊離のＩＬ−２サイトカインのものと同様のＩＬ−２生物活性を有することが報告されている。Ｘ−Ｆｃ配向では、Ｚｈｅｎｇらにより、Ｘ−Ｆｃ構成のＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２生物活性はＩＬ−２自体のものと基本的に区別できないことが報告された（Ｚｈｅｎｇ， Ｘ． Ｘ．ら、１９９９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９９年、１６３巻：４０４１〜８頁）。この広範囲にわたる先行技術は、高いＩＬ−２生物活性を有するためには、ＩＬ−２タンパク質とＦｃの融合にリンカーペプチドは必要ではないことを教示するものである。しかし、Ｇａｖｉｎらは、受容体選択性が変更された、ある特定のＩＬ−２改変体を含有するＸ−Ｆｃ構成のＦｃ融合タンパク質では、ペプチドリンカーを有さなくても５残基のペプチドリンカーを有しても生物活性が低下したまたは生物活性がないことを報告した（Ｇａｖｉｎら、米国特許出願第２０１４０２８６８９８Ａ１号）。

バイオアッセイ
候補タンパク質の生物学的活性を特徴付けるためにはロバストな定量的バイオアッセイが必要である。これらのアッセイでは、ＩＬ２受容体の活性化の測定、Ｔｒｅｇにおける活性化の下流の機能的結果の測定、ならびに治療的に関連性のある転帰および活性化されたＴｒｅｇの機能の測定がなされるべきである。これらのアッセイは、ＩＬ２選択的アゴニスト分子の治療活性および効力を測定するために使用することができ、また、動物またはヒトにおけるＩＬ２選択的アゴニストの薬力学を測定するためにも使用することができる。１つのアッセイでは、シグナル伝達タンパク質であるＳＴＡＴ５のリン酸化を測定し、これは、リン酸化されたタンパク質（ｐＳＴＡＴ５）に特異的な抗体を用いたフローサイトメトリーで測定される。ＳＴＡＴ５のリン酸化は、ＩＬ−２シグナル伝達経路における必須のステップである。ＳＴＡＴ５は、Ｔｒｅｇの発生に必須であり、ＩＬ−２の不在下でのＴｒｅｇ細胞の産生には、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞において発現する構成的に活性された形態のＳＴＡＴ５が十分である（Ｍａｈｍｕｄ， Ｓ． Ａ．ら、２０１３年、ＪＡＫＳＴＡＴ ２巻：ｅ２３１５４頁）。したがって、Ｔｒｅｇ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）の測定は、これらの細胞におけるＩＬ−２による活性化の反映として当業者には理解され、また、適切な曝露時間および条件でなされたＩＬ−２処理の他の生物学的転帰を予測するものになる。機能的活性化に関する別のアッセイでは、ＩＬ−２により刺激されたＴｒｅｇ細胞の増殖を測定する。Ｔｒｅｇ増殖は、精製されたＴｒｅｇ細胞にトリチウム標識チミジンを組み入れることにより、フローサイトメトリーによって測定される混合細胞集団内のＴｒｅｇ細胞数の増加およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−マーカー表現型の頻度によって、Ｋｉ−６７などの増殖関連細胞周期タンパク質のＴｒｅｇ細胞における発現の増加によって、または、Ｔｒｅｇ細胞におけるフローサイトメトリーによるカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）などの生体蛍光色素の細胞分裂関連希釈の測定によって、測定できることが当業者には理解されよう。ＩＬ−２を用いたＴｒｅｇの機能的活性化に関する別のアッセイは、Ｔｒｅｇの安定性の増大である。ｐＴｒｅｇ細胞は、一部では、不安定であり、Ｔｈ１エフェクターＴ細胞およびＴｈ１７エフェクターＴ細胞に分化する潜在性があると考えられている。ＴｒｅｇのＩＬ−２による活性化により、Ｔｒｅｇを安定化し、この分化を予防することができる（Ｃｈｅｎ， Ｑ．ら、２０１１、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８６巻：６３２９〜３７頁）。ＴｒｅｇのＩＬ−２による刺激の別の転帰は、Ｔｒｅｇの免疫抑制性活性に寄与するＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＩＬ−１０、ＣＤ３９、およびＣＤ７３などのＴｒｅｇ機能的エフェクター分子のレベルの刺激である。

ＩＬ２選択的アゴニストＦｃタンパク質を開発するために、Ｆｃ−Ｘ構成のＩＬ−２融合タンパク質に関しては循環半減期が短いことが報告されているので、本発明者らは、まずＸ−Ｆｃ構成のタンパク質に着目した。１つはリンカーペプチドを有し、１つはリンカーペプチドを有さない２つのタンパク質を最初に作製し試験し、予想外に、ペプチドリンカーを有するタンパク質はＩＬ−２生物活性を有し、ペプチドリンカーを有さないタンパク質は検出可能な生物活性を有さないことが示された。どちらのタンパク質もＩＬ２ＲＡに対して高い結合親和性を示し、これにより、どちらのタンパク質も適正にフォールディングされていることが示される。これらの結果により、ＩＬ−２受容体の活性化および生物活性にはリンカーペプチドが必要であることが示唆された。次いで、他の変数を排除し、この仮説を検定するために、一連の追加の類似体を作製した。これらの試験からの結果により、この治療用タンパク質についての重要な構造と活性の関連性の発見が導かれ、所望の活性および薬学的特質を有する新規の分子が創出された。
製剤
本発明の融合タンパク質の医薬組成物は、従来の方法に従って非経口（特に、静脈内または皮下）送達用に製剤化されるものと定義される。一般に、医薬製剤は、本発明の融合タンパク質を、例えば食塩水、緩衝食塩水、水中５％デキストロースなどの薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて含む。製剤は、バイアル表面などでのタンパク質の喪失を予防するために、１種または複数種の賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、アルブミンをさらに含んでよい。製剤化の方法が当技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．、第１９版、１９９５年において開示されている。
実例として、医薬製剤は、本発明の融合タンパク質を含む容器を含むキットとして供給することができる。治療用タンパク質は、単回用量または複数回用量用の注射可能な溶液の形態で、注射前に再構成する滅菌散剤として、または充填済みシリンジとして提供することができる。そのようなキットは、医薬組成物の適応症および使用に関する書面の情報をさらに含んでよい。さらに、そのような情報は、本発明の融合タンパク質が、本発明の融合タンパク質に対する既知の過敏症を有する患者には禁忌である旨の記載を含んでよい。
本発明のＩＬ−２選択的アゴニスト融合タンパク質は、医薬組成物を含めた組成物に組み入れることができる。そのような組成物は、一般には、タンパク質および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、これだけに限定されないが、薬学的投与に適合する食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｇｅｎｔ）および吸収遅延剤などを含む。追加の活性化合物（例えば、抗生物質）も組成物に組み入れることができる。
医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化する。本発明のＩＬ−２選択的アゴニスト融合タンパク質は、非経口経路によって投与される可能性が高い。投与の非経口経路の例としては、例えば、静脈内、皮内、および皮下が挙げられる。非経口適用のために使用される溶液または懸濁物は、以下の構成成分を含んでよい：注射用水、食塩水溶液、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝液、および、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの、張度を調整するための薬剤。ｐＨは、一塩基および／または二塩基リン酸ナトリウム、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる（例えば、約７．２〜７．８、例えば、７．５のｐＨまで）。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回用量バイアルに封入することができる。
注射による使用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液または分散物、および滅菌された注射可能な溶液または分散物を即時調製するための滅菌粉末を含む。静脈内投与に関しては、適切な担体として、生理的食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌されているべきであり、また、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する限りでは流体であるべきである。組成物は、製造および保管の条件下で安定であるべきであり、また、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、および適切なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。必要な粒子サイズの維持は、分散物の場合では、界面活性剤、例えば、ポリソルベートまたはＴｗｅｅｎを使用することによって容易にすることができる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムが組成物中に含まれることが好ましい。
滅菌された注射可能な溶液は、必要量の活性化合物を、適切な溶媒中に、上に列挙されている成分の１つ、または成分の組合せと一緒に組み入れ、その後、必要に応じて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散物は、活性化合物を、基本的な分散媒および上に列挙されているものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み入れることによって調製される。滅菌された注射可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分と任意の追加的な所望の成分の粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥である。
一実施形態では、ＩＬ−２選択的アゴニスト融合タンパク質を、埋め込み物およびマイクロカプセル封入送達系を含めた制御放出製剤などのＩＬ−２選択的アゴニスト融合タンパク質を体からの迅速な排除から保護する担体を用いて調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤は、標準の技法を使用して調製することができる。
医薬組成物は、投与に関する指示と一緒に容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
投与
本発明の融合タンパク質は、非経口経路によって投与することが好ましい。好ましい経路は皮下経路であるが、静脈内、筋肉内、および真皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）投与も使用することができる。皮下または筋肉内経路に関しては、デポおよびデポ製剤を使用することができる。ある特定の疾患に対しては、特殊化された投与経路を使用することができる。例えば、炎症性眼疾患に対して、眼内注射を使用することができる。融合タンパク質は、総体積１ｍｌ当たり約０．１〜１０ｍｃｇの濃度で使用することができるが、０．０１ｍｃｇ／ｍｌ〜１００ｍｃｇ／ｍｌの範囲の濃度を使用することができる。
用量の決定は当技術分野における通常の技術のレベルの範囲内に入る。投薬は、治療期間にわたって毎日または毎週であるか、または別の断続的な頻度であってもよい。静脈内投与は、１時間〜数時間の典型的な期間にわたるボーラス注射または注入によるものである。持続放出製剤も使用することができる。一般に、本発明の融合タンパク質の治療有効量は、循環Ｔｒｅｇ細胞の臨床的に有意な変化、患部組織内に存在するＴｒｅｇ細胞の臨床的に有意な変化、または疾患症状の臨床的に有意な変化などの、治療される状態の臨床的に有意な変化を生じさせるために十分な量である。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータをヒトにおける使用のためのさまざまな投与量の製剤化に使用することができる。そのような化合物の投与量は、毒性がほとんどまたは全く伴わずに、最大半量の有効濃度（ＥＣ５０；すなわち、Ｔｒｅｇ細胞の最大半量の刺激が達成される試験化合物の濃度）を含む循環濃度の範囲内に入ることが好ましい。投与量は、使用する剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の方法において使用する化合物のいずれに関しても、最初に細胞培養アッセイから治療有効用量を推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において決定されたＥＣ５０を含む循環血漿中濃度範囲が達成されるように製剤化することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、酵素結合免疫吸着検定法によって測定することができる。
本明細書で定義されている通り、ＩＬ−２選択的アゴニスト融合タンパク質の治療有効量（すなわち、有効な投与量）は、選択されるポリペプチドおよび投薬頻度に左右される。例えば、患者の体重１ｋｇ当たりおよそ０．００１〜０．１ｍｇの範囲の単回投薬量を投与することができ、一部の実施形態では、約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇを投与することができる。組成物は、１日おきに１回を含め、１日当たり１回から１週間当たり１回もしくは複数回、または１カ月当たり１回もしくは複数回までで投与することができる。これだけに限定されないが、疾患または障害の重症度、以前の治療、被験体の全体的な健康および／または年齢、患者に存在するＴｒｅｇ細胞のレベル、ならびに存在する他の疾患を含めた、ある特定の因子が、被験体を有効に治療するために必要な投与量およびタイミングに影響を及ぼす可能性があることが当業者には理解されよう。さらに、治療有効量の本発明のＩＬ−２選択的アゴニスト融合タンパク質を用いた被験体の治療は、一連の治療になる可能性がある。

自己免疫疾患
本発明の療法から利益を受け得る疾患のいくつかが確認されている。しかし、自己免疫疾患におけるＴｒｅｇ細胞の役割は非常に活発な研究分野であり、追加の疾患が本発明によって治療可能であると同定される可能性がある。自己免疫疾患は、免疫系により自身のタンパク質、細胞、および組織が攻撃されるヒト疾患と定義される。自己免疫疾患についての包括的な一覧表および総説は、Ｔｈｅ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＲｏｓｅおよびＭａｃｋａｙ、２０１４年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に見いだすことができる。

他の融合タンパク質
本発明のＦｃタンパク質部分の目的は、単に循環半減期を増大させることであるので、分子サイズの増大および腎クリアランスの速度の低下という同じ目標を達成するために、本発明において発見された構造と活性の関連性を使用して、ＩＬ−２選択的アゴニスト部分を他のタンパク質のＮ末端と融合することができることが当業者には理解されよう。ＩＬ２選択的アゴニストを血清アルブミンのＮ末端と融合することができ（Ｓｌｅｅｐ， Ｄ．ら、２０１３年、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１８３０巻：５５２６〜３４頁）、それにより、融合タンパク質の流体力学的半径がＩＬ−２部分と比べて増大し、また、ＦｃＲＮによる再利用もなされる。本発明のＩＬ２選択的アゴニスト部分を組換え非免疫原性アミノ酸ポリマーのＮ末端と融合することができることも当業者には理解されよう。この目的のために開発された非免疫原性アミノ酸ポリマーの２つの例は、ＸＴＥＮポリマー、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、およびＴアミノ酸の鎖（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｖ．ら、２００９年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２７巻：１１８６〜９０頁））、ならびにＰＡＳポリマー、Ｐ、Ａ、およびＳアミノ酸残基の鎖（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ， Ｍ．ら、２００７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ． ２０巻：２７３〜８４頁）である。

本明細書において引用されている全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたと同じく参照により本明細書に組み込まれる。

前述の発明は、明瞭な理解のために図解および実施例により一部の詳細について記載されているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなく、それらに対してある特定の変化および改変を成すことができるは当業者には容易に明らかになろう。

以下の実施例は、単に例示として提供されるものであり、限定として提供されるものではない。基本的に同様の結果が得られるように変化または改変することができる種々の重大でないパラメータは当業者には容易に理解されよう。

（実施例１）
ＩＬ−２選択的アゴニスト−ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質のクローニング、発現、および精製
Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１（配列番号４）をコードするｃＤＮＡをＤＮＡ合成およびＰＣＲ集合によって構築した。Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１構築物は、マウスＩｇＧ１シグナル配列、置換Ｎ８８ＲおよびＣ１２５Ｓを伴う成熟ヒトＩＬ−２配列（配列番号１）、９アミノ酸リンカーペプチド配列（配列番号１５）、ならびに置換Ｎ２９７Ａを含有するヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（配列番号２）で構成されるものであった。Ｎ８８Ｒ／ＩＬ２は、ＩＬ２ＲＢへの結合およびＩＬ２Ｒαβγ受容体を発現する細胞に対する選択的アゴニスト活性が低下したＩＬ２選択的アゴニストである（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ， Ａ． Ｂ．ら、２０００年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８巻：１１９７〜２０２頁）。ＩｇＧ１ ＦｃのＮ２９７にあるＮ結合グリコシル化部位の排除により、Ｆｃエフェクター機能が低下する（Ｔａｏ， Ｍ． Ｈ．ら、１９８９年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３巻：２５９５〜２６０１頁）。Ｄ２０ＨＬ０Ｇ２は、マウスＩｇＧ１シグナル配列、置換Ｄ２０ＨおよびＣ１２５Ｓを伴うＩＬ−２（配列番号１）、ならびにヒトＩｇＧ２（配列番号３）に由来するＦｃタンパク質部分で構成されるものであった。Ｄ２０Ｈ ＩＬ−２改変体は、Ｎ８８Ｒと同様の選択的アゴニスト活性を有することが報告されている（Ｃａｓｓｅｌｌ， Ｄ． Ｊ．ら、２００２年、Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．、８巻：２１７１〜８３頁）。

これらのｃＤＮＡを、制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを使用してｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングした。構築物を含有する精製された発現ベクタープラスミドをＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションの２４時間前に振とうフラスコ中に播種し、無血清の既知組成培地を使用して成長させた。ＤＮＡ発現構築物を、０．１リットルの懸濁物のＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。２４時間後に、細胞を計数して生存度および生存細胞計数を得た。５日目に培養物を収集し、馴化培地上清を３０００×ｇで１５分遠心分離することによって清澄化した。上清をプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に流し、０．２５％酢酸（ｐＨ３．５）を用いて溶出させ、溶出したタンパク質を１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）で中和し、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、１５０ｍＭのＮａＣｌに対して透析することによってタンパク質を精製した。次いで、試料を、０．２μｍの膜フィルターを通して滅菌濾過し、還元条件下および非還元条件下のＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質はジスルフィド連結した二量体として移動した。タンパク質の濃度を、算出された吸光係数１．１１ｍｇ／ｍｌ ｃｍ^−１を使用して吸光度によって決定し、アリコートを−８０℃で保管した。

サイトカインＮ８８Ｒ／ＩＬ２およびＤ２０Ｈ／ＩＬ２は、配列番号１の改変体であり、安定性を改善するために追加の変異Ｃ１２５Ｓを付加した以外は基本的に米国特許第６，９５５，８０７Ｂ１号に記載の通りＥ ｃｏｌｉにおいて産生させた。

（実施例２）
Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１およびＤ２０ＨＬ０Ｇ２の受容体結合活性の決定。
Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１およびＤ２０ＨＬ０Ｇ２が適正にフォールディングされているかどうかを決定するために、ＩＬ−２受容体サブユニットＩＬ２ＲＡおよびＩＬ２ＲＢに対するそれらの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−２００ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。ＩＬ２ＲＡ細胞外ドメインタンパク質、ＩＬ２ＲＢ細胞外ドメインタンパク質およびＩＬ−２タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）をＣＭ−５ Ｂｉａｃｏｒｅチップ上にＮＨＳ／ＥＤＣカップリングにより、それぞれ最終的なＲＵ（共鳴単位）値３０および４８４まで固定化した。ＩＬ２ＲＡへの結合のカイネティクス（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を、ＩＬ２およびＮ８８ＲＬ９ＡＧ１を０．６ｎＭ〜４５ｎＭにわたる５つの濃度で、毎分５０μｌの流量で測定した。ＩＬ２ＲＢへの結合のカイネティクスを、ＩＬ２については１６．７ｎＭ〜４５０ｎＭ、Ｆｃ融合タンパク質については１４ｎＭ〜３７２ｎＭの５つの濃度、毎分１０μｌの流量で測定した。解離定数（Ｋｄ）を動力学定数（ｋｉｎｅｔｉｃ ｃｏｎｓｔａｎｔ）から、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアバージョン２．０を使用し、ＩＬ−２については１：１フィット、Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１およびＤ２０ＨＬ０Ｇ２については二価フィットを仮定して算出した。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアにより、定常状態の結合値を使用して平衡Ｋｄ値を算出した。

ＩＬ−２とＮ８８ＲＬ９ＡＧ１の両方についてＩＬ２ＲＡへの結合を検出した。Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１についてのＲｍａｘ値１４．４３は、ＩＬ２のＲｍａｘ値２．６２の５．５倍であり、これは、Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１（８２，９１６ｇ／Ｍ）の分子量がＩＬ−２（１５，４４４ｇ／Ｍ）よりも大きいという事実と一致した。ＩＬ−２についてのｋｏｎ値、ｋｏｆｆ値、およびＫｄ値は、公開されたＳＰＲ値から予測される範囲内であった（表ＩＩ）。動力学的方法と平衡方法の両方によって決定したところ、Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１の親和性は、ＩＬ２の親和性のおよそ２倍であった。ＩＬ２のＩＬ２ＲＢへの結合を、６．１９のＲｍａｘを用いて検出した。ｋｏｎ、ｋｏｆｆ、およびＫｄについて決定された値は、文献において報告されている範囲内であった。報告された値は、３．１×１０^−８Ｍ（ＩＬ２ＲＡ）および５．０×１０^−７Ｍ（ＩＬ２ＲＢ）（Ｍｙｓｚｋａ， Ｄ． Ｇ．ら、１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ５巻：２４６８〜７８頁）；５．４×１０^−８Ｍ（ＩＬ２ＲＡ）および４．５×１０^−７Ｍ（ＩＬ２ＲＢ）（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ， Ａ． Ｂ．ら、２０００年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８巻：１１９７〜２０２頁）；および６．６×１０^−９Ｍ（ＩＬ２ＲＡ）および２．８×１０^−７Ｍ（ＩＬ２ＲＢ）（Ｒｉｎｇ， Ａ． Ｍ．ら、２０１２年、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３巻：１１８７〜９５頁）である。Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１のＩＬ２ＲＢへの結合は基本的に検出されず、試験した最高濃度でわずかな結合が検出され（Ｒｍａｘ＝０．０６）、これは、ＩＬ２とＮ８８ＲＬ９ＡＧ１の分子量の差異、およびＩＬ２ＲＡ結合の結果に基づいて予測されたものをはるかに下回った。Ｄ２０ＨＬ０Ｇ２タンパク質もＩＬ２ＲＡへの結合について試験し、Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１のＫｄと同様である、８．３×１０^−９ＭのＫｄを有することが見いだされた。したがって、ＳＰＲ結合試験により、Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１タンパク質とＤ２０ＨＬ０Ｇ２タンパク質はどちらもＩＬ２ＲＡに結合することが示され、これにより、当該タンパク質が適正にフォールディングされていることが示される。

（実施例３）
Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１およびＤ２０ＨＬ０Ｇ２のＴ細胞に対する生物活性。
Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１およびＤ２０ＨＬ０Ｇ２のＴ細胞に対する生物活性を、特定のＴ細胞サブセットにおけるリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）レベルを測定することによって決定した。ｐＳＴＡＴ５のレベルを、固定し、透過処理した細胞において、リン酸化ＳＴＡＴ５ペプチドに対する抗体を使用してフローサイトメトリーによって測定した。Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ２５を構成的に発現し、ＣＤ２５発現レベルが上位１％の細胞では高度にＴｒｅｇ細胞が富化されている（Ｊａｉｌｗａｌａ， Ｐ．ら、２００９年、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２００９年；４巻：ｅ６５２７頁；Ｌｏｎｇ、Ｓ． Ａ．ら、２０１０年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５９巻：４０７〜１５頁）。したがって、フローサイトメトリーのデータで、ＴｒｅｇサブセットおよびＣＤ４エフェクターＴ細胞サブセットについて、それぞれＣＤ２５^ｈｉｇｈ群（ＣＤ２５を発現する細胞の上位１〜２％）およびＣＤ２５^{−／ｌｏｗ}群にゲートをかけた。

凍結保存ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を解凍し、１％ヒトＡＢ血清（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を含有するＸ−ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）培地で洗浄し、３７℃で２時間にわたって回復させた。次いで、細胞を１５×７５ｍｍのチューブ中、０．１ｍｌに１ｍｌ当たり細胞５×１０^６個の濃度で分配した。細胞を種々の濃度のＩＬ−２またはＦｃ融合タンパク質を用いて３７℃で１０分処理した。次いで、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを用いて３７℃で１０分にわたって固定し、Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて氷上で３０分にわたって透過処理し、次いで、洗浄した。次いで、細胞を、抗ＣＤ４−Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、抗ＣＤ２５−ＡＦ４８８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、および抗ｐＳＴＡＴ５−ＡＦ５４７抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の混合物を製造者によって推奨されている濃度で用いて２０℃で３０分にわたって染色し、洗浄し、ＬＳＲＩＩ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリーのデータを取得した。Ｆｌｏｗｊｏ解析ソフトウェア（Ｆｌｏｗｊｏ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用してデータを解析した。

このアッセイでＮ８８ＲＬ９ＡＧ１を用いた結果から、ＩＬ−２と比較して、Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１はＴｒｅｇ集団に対する注目すべき選択性を有することが示された（図３Ａ）。Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１により活性化されたＣＤ４＋細胞は１％未満であり、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞に対する選択性は非常に強力であった。対照的に、４０ｎＭの濃度でＩＬ−２により活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞は８０％を超え、高い割合のｐＳＴＡＴ５＋細胞がＣＤ２５を低レベルで発現するまたは発現しないものであった。試験した最低濃度の４ｐＭでさえ、依然としてＩＬ−２ではＣＤ２５^{−／ｌｏｗ}細胞とＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞のどちらにおいても有意なｐＳＴＡＴ５レベルが刺激された。

次いで、Ｄ２０ＨＬ０Ｇ２をＣＤ４＋Ｔ細胞ｐＳＴＡＴ５アッセイにおいて活性について試験した。予想外に、Ｄ２０ＨＬ０Ｇ２はこのアッセイでは活性を有さなかった（図３Ｂ）。１０^−８ＭのＤ２０Ｈ／ＩＬ２サイトカイン（Ｆｃと融合していない改変体ＩＬ−２サイトカイン）を用いた追加の対照では、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞のロバストかつ選択的なｐＳＴＡＴ５活性化が示された（図３Ｃ）。Ｄ２０ＨＬ０Ｇ２を用いた活性の欠如は、Ｄ２０ＨＬ０Ｇ２がＩＬ２ＲＡにＩＬ−２およびＮ８８ＲＬ９ＡＧ１のＫｄと同様のＫｄで結合し、それにより、Ｄ２０ＨＬ０Ｇ２が適正にフォールディングされていたことが示されることを考えると、特に驚くべきことであった。

Ｎ８８ＲＬ９ＡＧ１によって選択的に活性化されたＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞がＴｒｅｇであることを確認するために、活性化された細胞を、Ｔｒｅｇ細胞についての別の分子マーカーであるｐＳＴＡＴ５とＦＯＸＰ３の両方について共染色した。ＣＤ４＋細胞を、ｐＳＴＡＴ５染色について上記の通り、４ｎＭのＩＬ−２またはＮ８８ＲＬ９ＡＧ１を用いて処理し、固定し、透過処理し、その後、ＦＯＸＰ３ Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）１ｍｌを用いて室温で３０分処理し、次いで、洗浄し、ＦＯＸＰ３ Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁させた。透過処理した細胞を、抗ＦＯＸＰ３−ｅＦｌｕｏｒ４５０、抗ＣＤ２５−ＡＦ４８８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、および抗ｐＳＴＡＴ５−ＡＦ５４７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体の混合物を用いて２０℃で３０分にわたって染色し、洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。この実験の結果により、活性化ＳＴＡＴ５を伴うＮ８８ＲＬ９ＡＧ１処理細胞（ｐＳＴＡＴ５＋細胞）が高い割合でＦＯＸＰ３も高レベルで発現することが示された。この結果により、活性化された細胞がＴｒｅｇ細胞について高度に富化されていることのさらなる証拠がもたらされる。対照的に、ＩＬ−２で処理したｐＳＴＡＴ５＋細胞は、ＦＯＸＰ３＋とＦＯＸＰ３−の両方であり、大多数がＦＯＸＰ３−細胞であった。

（実施例４）
生物活性のために重要な構造と活性の関連性の決定。
実施例３に記載の予想外の結果により、ＩＬ２生物活性がＮ８８ＲＬ９ＡＧ１では検出されたがＤ２０ＨＬ０Ｇ２では検出されなかったことが、リンカーペプチドの存在に起因することが示唆された。この知見を検証するため、ならびにＦｃ部分のアイソタイプおよびＩＬ−２部分における選択性変異などの他の変数の寄与を排除するために、全てＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ Ｆｃを使用した類似体のパネルを設計し、作製した（表ＩＩＩ）。

全ての構築物においてＦｃのＣ末端リシン残基を欠失させたこと、および産生細胞培養物の体積を１００ｍｌの代わりに３０ｍｌにした以外は実施例１に記載の通り、ｃＤＮＡを構築し、タンパク質を発現させ、精製した。全てのタンパク質が良好な収量で回収された。実際、Ｎ８８Ｒ／ＩＬ２シリーズの分子の収量の比較により、ペプチドリンカーの長さが増すにしたがってタンパク質収量が増加する明らかな傾向が示され、Ｎ８８ＲＬ２０ＡＧ１（最長のペプチドリンカーを有する）はＮ８８ＲＬ０ＡＧ１（ペプチドリンカーを有さない）よりも６．８倍多く回収された（図５Ａ）。リンカーペプチドを含有するタンパク質の収量の増加についての基礎は未だに不明であるが、発現レベルの上昇、分泌速度の増大、タンパク質安定性の増大、または精製効率の上昇に起因する可能性がある。興味深いことに、Ｎ８８ＲＬ１５ＡＧ１の収量がＮ８８ＲＬ０ＡＧ１と比較して４．５倍であったのと比較して、ＷＴＬ１５ＡＧ１の収量はＷＴＬ０ＡＧ１の収量よりもわずかしか高くなかった（１．８倍）。Ｄ２０ＨＬ１５ＡＧ１の収量は、Ｎ８８ＲＬ１５ＡＧ１の収量と同様であり、これにより、ＩＬ−２選択性変異は収量に対して有意に影響を及ぼさないことが示され、また、これらのタンパク質の収量はどちらもＡＧ１Ｌ１５Ｄ２０Ｈよりも有意に多かった（それぞれ４．３倍および３．４倍）（図５Ｂ）。集合的に、これらの結果により、ペプチドリンカーの長さの増大が、Ｎ８８Ｒ／ＩＬ２を含有するＦｃ融合タンパク質のより高いタンパク質収量に関連すること、ｗｔ ＩＬ−２を含有するＦｃ融合タンパク質の収量はリンカーペプチドの存在に対する感受性がはるかに低いこと、およびＸ−Ｆｃ構成のＩＬ−２−Ｆｃ融合タンパク質が作製されることが示された。

これらの精製されたタンパク質を、ＣＤ４＋細胞の代わりにヒトＣＤ３＋Ｔ細胞（負に選択された）を使用し、細胞を試験タンパク質と一緒に１０分ではなく２０分インキュベートしたこと以外は基本的に実施例３に記載の通り、ヒトＴ細胞ｐＳＴＡＴ５バイオアッセイにおいて試験した。

Ｎ８８Ｒ／ＩＬ２シリーズの分子からの結果により、Ｔｒｅｇ富化集団における生物活性がペプチドリンカーの長さによって劇的に影響を受けることが示された（図６Ａ）。Ｔｒｅｇ集団内のｐＳＴＡＴ５シグナル（％ｐＳＴＡＴ５＋細胞）は、ペプチドリンカーの長さが増すにしたがって漸進的に増加した。この生物活性の増大は、１０^−８Ｍの試験タンパク質での最大ｐＳＴＡＴ５シグナルおよびＥＣ５０値の両方に反映された（表ＩＶ）。最長のペプチドリンカーを有するタンパク質であるＮ８８ＲＬ２０ＡＧ１では、Ｎ８８ＲＬ０ＡＧ１に対して最大ｐＳＴＡＴ５シグナルの４．２倍の増加が示された。Ｎ８８ＲＬ０ＡＧ１ ｐＳＴＡＴ５シグナルは、最高濃度（１０^−８Ｍ）でＩＬ−２による活性化の５０％に達しなかったので、リンカーペプチドを含有するタンパク質のＮ８８ＲＬ０ＡＧ１に対するＥＣ５０の改善倍率を決定することは不可能であった。しかし、Ｎ８８ＲＬ２０ＡＧ１のＥＣ５０および試験したＮ８８ＲＬ０ＡＧ１の最高濃度に基づいて、Ｎ８８ＲＬ２０ＡＧ１がＮ８８ＲＬ０ＡＧ１の１００分の１未満のＥＣ５０を示すことを推定することができる。

予測通り、Ｎ８８Ｒ／ＩＬ２分子のいずれもＣＤ２５^{−／ｌｏｗ}集団に対する検出可能な活性は基本的に存在しなかったが、１０^−８ＭのＩＬ−２ではＣＤ２５^{−／ｌｏｗ}細胞の５４．２％でｐＳＴＡＴ５活性が刺激された（図６Ｂ）。

ＷＴＬ０ＡＧ１とＷＴＬ１５ＡＧ１の比較から、リンカーペプチドのｗｔ ＩＬ−２−Ｆｃ融合タンパク質に対する有意な効果はＮ８８Ｒ／ＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質よりもはるかに低いことが示された（図７）。Ｔｒｅｇ亜集団では、ＷＴＬ０ＡＧ１およびＷＴＬ１５ＡＧ１はどちらも有意な生物活性を有し、実際、ｐＳＴＡＴ５リン酸化の最大レベルがＩＬ−２よりもおよそ２倍高く刺激された。しかし、ＷＴＬ０ＡＧ１およびＷＴＬ１５ＡＧ１はまた、ＣＤ２５^{−／ｌｏｗ}細胞における大きなｐＳＴＡＴ５シグナルをおよそ１０倍の濃度で刺激した。ＷＴＬ１５ＡＧ１とＷＴＬ０ＡＧ１では、ＴｒｅｇおよびＣＤ２５^{−／ｌｏｗ}細胞集団のどちらにおいてもＥＣ５０値におよそ１０倍の差異が示された。

ＴｒｅｇにおけるＤ２０ＨＬ１５ＡＧ１による最大ｐＳＴＡＴ５シグナルは、Ｎ８８ＲＬ１５ＡＧ１による最大ｐＳＴＡＴ５シグナルよりも有意に低かった（図８）。これにより、実施例３においてＤ２０ＨＬ０Ｇ２を用いていかなる検出可能な活性もなかったことが、一部において、Ｆｃ融合タンパク質の状況で、Ｄ２０Ｈ／ＩＬ２部分の活性がＮ８８Ｒ／ＩＬ２部分と比較して低いことに起因することが示唆される。ＡＧ１Ｌ１５Ｄ２０Ｈの活性は、Ｄ２０ＨＬ１５ＡＧ１の活性よりもわずかに高いだけであり、これにより、Ｆｃ融合タンパク質内のＩＬ−２部分の構成（すなわち、Ｘ−Ｆｃ対Ｆｃ−Ｘ）はＴｒｅｇ生物活性に対して重大な影響を及ぼさないことが示される。

集合的に、これらの結果から、最適な生物活性に必要なＮ８８Ｒ／ＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質の重要な特徴が定義される。Ｎ８８Ｒ／ＩＬ２−Ｆｃタンパク質には、最適なＴｒｅｇ生物活性のためにリンカーペプチドが必要であり、リンカーペプチドの長さが増すにしたがって生物活性が増大する傾向がある。第２に、他者の研究に従うと、ｗｔ ＩＬ−２を含有するＦｃ融合タンパク質の生物活性に対するリンカーペプチドの影響はよりわずかである。リンカーペプチドに関するこれらの異なる要件は、Ｎ８８Ｒ／ＩＬ２は、ＩＬ２ＲＢへの結合が欠損しており、これにより、受容体会合に関するよりストリンジェントな要件およびＦｃ融合タンパク質パートナーによる立体障害に対する感受性の増大がもたらされる可能性があり得るという事実の結果であり得る。これらの結果から、最も強力なＩＬ２選択的アゴニスト−Ｆｃ融合タンパク質も定義される。

（実施例５）
ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ２選択的アゴニスト−Ｆｃ融合タンパク質の選択性
より広範な生物学的状況でＮ８８Ｒ／ＩＬ２−Ｆｃ融合タンパク質の選択性を決定するために、粗製未分画ヒトＰＢＭＣ中の重要な免疫細胞型の全てにわたってＳＴＡＴ５活性化を測定するためのアッセイを開発した。ヒトＰＢＭＣを正常な志願者からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離によって単離した。１０^６個のＰＢＭＣを、グルコース（Ｌｏｎｚａ）および１０％ＦＢＳ（Ｏｍｅｇａ）を伴うＸ−ＶＩＶＯ１５培地に懸濁させ、１０^−８Ｍの試験タンパク質を用いて３７℃で２０分処理した。次いで、細胞をＦｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ＥＢＩＯ）を製造者の指示に従って用いて処理した。次いで、実施例３に記載の通り、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液を用いて固定し、Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩを用いて透過処理した。次いで、固定し、透過処理した細胞を１％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄し、抗体混合物を用いて室温、暗所中で６０分にわたって染色した。次いで、染色された細胞を１％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させ、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。抗体ミックスは、抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＢＤ、＃５６０６５０）、抗ｐＳＴＡＴ５−ＡＦ−４８８（ＢＤ、＃６１２５９８）、抗ＣＤ２５−ＰＥ（ＢＤ、＃５６０９８９）、抗ＣＤ５６−ＰＥ−ＣＦ５９４（ＢＤ、＃５６２３２８）、抗ＦＯＸＰ３−ＡＦ６４７（ＢＤ、＃５６０８８９）、抗ＣＤ３−Ｖ４５０（ＢＤ、５６０３６６）、および抗ＣＤ８−ＢＶ６５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０１０４１）からなるものであった。この染色手順により、７種の重要な免疫細胞型におけるｐＳＴＡＴ５レベルをモニタリングすることが可能になった。

細胞表現型を以下の通り定義した：Ｔｒｅｇ細胞：ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、Ｆｏｘｐ３＋、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ、ＣＤ８−、ＣＤ５６−；活性化ＣＤ４ Ｔｅｆｆ細胞：ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、Ｆｏｘｐ３−、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ、ＣＤ８−、ＣＤ５６−；ＣＤ４ Ｔｅｆｆ細胞：ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、Ｆｏｘｐ３−、ＣＤ２５^ｌｏｗ、ＣＤ８−、ＣＤ５６−；ＮＫＴ細胞：ＣＤ３＋、ＣＤ４−、Ｆｏｘｐ３−、ＣＤ２５^ｌｏｗ、ＣＤ８−、ＣＤ５６＋；ＮＫ細胞：ＣＤ３−、ＣＤ４−、Ｆｏｘｐ３−、ＣＤ２５^ｌｏｗ、ＣＤ８−、ＣＤ５６＋；Ｂ細胞：ＣＤ３−、ＣＤ４−、Ｆｏｘｐ３−、ＣＤ２５^ｌｏｗ、ＣＤ８−、ＣＤ５６−。

このアッセイでは、タンパク質を１０^−８Ｍの濃度で試験した。図９に示されており表Ｖに要約されている結果から、Ｎ８８ＲＬ１５ＡＧ１が、どちらも全ての細胞集団の大部分においてｐＳＴＡＴ５を活性化したｗｔ ＩＬ２およびＷＴＬ１５ＡＧ１と比較して、注目すべき選択性を示したことが示される。Ｎ８８ＲＬ１５ＡＧ１では、Ｔｒｅｇ集団におけるｐＳＴＡＴ５シグナルはｗｔ ＩＬ−２のレベル付近で刺激され、ＮＫ細胞を例外として他の細胞型の活性化はわずかであった。追加の分析（示していない）から、ｐＳＴＡＴ５＋ＮＫ細胞が、同じく免疫調節活性を有するＮＫ細胞亜集団であるＮＫ−ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞の特性であるＣＤ２５^ｈｉｇｈであったことが示された（Ｐｏｌｉ， Ａら、２００９年 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１２６巻（４号）：４５８〜６５頁）。Ｎ８８Ｒ／ＩＬ２を用いて低レベルのｐＳＴＡＴ５シグナルを有したいくつかの細胞型（活性化ＣＤ４ Ｔｅｆｆ細胞、ＣＤ４ Ｔｅｆｆ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、およびＮＫ細胞）では、Ｎ８８ＲＬ１５ＡＧ１を用いるとｐＳＴＡＴ５シグナルが示されなかったまたは低いｐＳＴＡＴ５シグナルが示された。これらの結果から、複雑な生物学的環境におけるＮ８８ＲＬ１５ＡＧ１のＴｒｅｇに対する活性および高い選択性が実証される。

Claims (21)

1. ａ．配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、Ｃ１２５Ｓの置換とＮ８８Ｒ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｑ１２６ＬおよびＱ１２６Ｆからなる群より選択される置換とを含むヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインと、
   ｂ．５から２０アミノ酸残基のペプチドリンカードメインと、
   ｃ．ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインと
   を含む融合タンパク質であって、
   各ドメインは、アミノ末端（Ｎ末端）およびカルボキシ末端（Ｃ末端）を有し、前記融合タンパク質は、前記ヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインの前記Ｃ末端がペプチド結合を介して前記ペプチドリンカードメインの前記Ｎ末端に融合され、かつ前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインの前記Ｎ末端がペプチド結合を介して前記ペプチドリンカードメインの前記Ｃ末端に融合されるように構成されている、融合タンパク質。
2. ａ．前記ペプチドリンカードメインが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
   ｂ．前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインが、配列番号２のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ改変体、および配列番号３のヒトＩｇＧ２ Ｆｃからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
   請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 前記ヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
4. 前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列と比べてＮ２９７Ａ変異を含むＩｇＧ１ Ｆｃタンパク質を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
5. 前記融合タンパク質が、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
6. ａ．配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、Ｃ１２５Ｓの置換とＮ８８Ｒ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｑ１２６ＬおよびＱ１２６Ｆからなる群より選択される置換とを含むヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインと、
   ｂ．５から２０アミノ酸残基のペプチドリンカードメインと、
   ｃ．ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインと
   を含む融合タンパク質をコードする核酸であって、
   各ドメインは、アミノ末端（Ｎ末端）およびカルボキシ末端（Ｃ末端）を有し、前記融合タンパク質は、前記ヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインの前記Ｃ末端がペプチド結合を介して前記ペプチドリンカードメインの前記Ｎ末端に融合され、かつ前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインの前記Ｎ末端がペプチド結合を介して前記ペプチドリンカードメインの前記Ｃ末端に融合されるように構成されている、核酸。
7. ２つの同一な鎖を含む二量体タンパク質であって、各鎖は、
   ａ．配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、Ｃ１２５Ｓの置換とＮ８８Ｒ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｑ１２６ＬおよびＱ１２６Ｆからなる群より選択される置換とを含むヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインと、
   ｂ．５から２０アミノ酸残基のペプチドリンカードメインと、
   ｃ．ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインと
   を含む融合タンパク質を含み、
   各ドメインは、アミノ末端（Ｎ末端）およびカルボキシ末端（Ｃ末端）を有し、前記融合タンパク質は、前記ヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインの前記Ｃ末端がペプチド結合を介して前記ペプチドリンカードメインの前記Ｎ末端に融合され、かつ前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインの前記Ｎ末端がペプチド結合を介して前記ペプチドリンカードメインの前記Ｃ末端に融合されるように構成されている、二量体タンパク質。
8. ｉ）前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインが、
   ａ．配列番号２のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ改変体、および配列番号３のヒトＩｇＧ２ Ｆｃからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
   ｂ．システイン残基を含み、
   ｉｉ）前記２つの同一な鎖が、前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインの前記システイン残基を介して互いに連結されている、
   請求項７に記載の二量体タンパク質。
9. 各鎖が、配列番号９である、請求項７に記載の二量体タンパク質。
10. ａ．配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、Ｃ１２５Ｓの置換とＮ８８Ｒ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｑ１２６ＬおよびＱ１２６Ｆからなる群より選択される置換とを含むヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインと、
    ｂ．５から２０アミノ酸残基のペプチドリンカードメインと、
    ｃ．ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインと
    を含む融合タンパク質を含む医薬組成物であって、
    各ドメインは、アミノ末端（Ｎ末端）およびカルボキシ末端（Ｃ末端）を有し、前記融合タンパク質は、前記ヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインの前記Ｃ末端がペプチド結合を介して前記ペプチドリンカードメインの前記Ｎ末端に融合され、かつ前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインの前記Ｎ末端がペプチド結合を介して前記ペプチドリンカードメインの前記Ｃ末端に融合されるように構成されている、医薬組成物。
11. ａ．前記ペプチドリンカードメインが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    ｂ．前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインが、配列番号２のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ改変体、および配列番号３のヒトＩｇＧ２ Ｆｃからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む
    、
    請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 前記ヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
13. 前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列と比べてＮ２９７Ａ変異を含むＩｇＧ１免疫グロブリンＦｃタンパク質を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
14. 前記融合タンパク質が、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
15. 自己免疫疾患を治療するための医薬組成物であって、前記組成物は、
    ａ．配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、Ｃ１２５Ｓの置換とＮ８８Ｒ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｑ１２６ＬおよびＱ１２６Ｆからなる群より選択される置換とを含むヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインと、
    ｂ．５から２０アミノ酸残基のペプチドリンカードメインと、
    ｃ．ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインと
    を含む融合タンパク質を含み、
    各ドメインは、アミノ末端（Ｎ末端）およびカルボキシ末端（Ｃ末端）を有し、前記融合タンパク質は、前記ヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインの前記Ｃ末端がペプチド結合を介して前記ペプチドリンカードメインの前記Ｎ末端に融合され、かつ前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインの前記Ｎ末端がペプチド結合を介して前記ペプチドリンカードメインの前記Ｃ末端に融合されるように構成されている、医薬組成物。
16. 前記自己免疫疾患が、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病および自己免疫性血管炎からなる群から選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 前記融合タンパク質が、配列番号９を含む、請求項１５に記載の組成物。
18. 前記組成物が２つの同一な鎖を含む二量体タンパク質を含み、各鎖は、
    ａ．配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、Ｃ１２５Ｓの置換とＮ８８Ｒ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｑ１２６ＬおよびＱ１２６Ｆからなる群より選択される置換とを含むヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインと、
    ｂ．５から２０アミノ酸残基のペプチドリンカードメインと、
    ｃ．ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインと
    を含む融合タンパク質を含み、
    各ドメインは、アミノ末端（Ｎ末端）およびカルボキシ末端（Ｃ末端）を有し、前記融合タンパク質は、前記ヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインの前記Ｃ末端がペプチド結合を介して前記ペプチドリンカードメインの前記Ｎ末端に融合され、かつ前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインの前記Ｎ末端がペプチド結合を介して前記ペプチドリンカードメインの前記Ｃ末端に融合されるように構成されている、請求項１５に記載の組成物。
19. 各鎖が、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
20. 調節性Ｔ細胞を選択的に活性化するための医薬組成物であって、前記組成物は、
    ａ．配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、Ｃ１２５Ｓの置換とＮ８８Ｒ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｑ１２６ＬおよびＱ１２６Ｆからなる群より選択される置換とを含むヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインと、
    ｂ．５から２０アミノ酸残基のペプチドリンカードメインと、
    ｃ．ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインと
    を含む融合タンパク質を含み、
    各ドメインは、アミノ末端（Ｎ末端）およびカルボキシ末端（Ｃ末端）を有し、前記融合タンパク質は、前記ヒトＩＬ−２改変体タンパク質ドメインの前記Ｃ末端がペプチド結
    合を介して前記ペプチドリンカードメインの前記Ｎ末端に融合され、かつ前記ＩｇＧ Ｆｃタンパク質ドメインの前記Ｎ末端がペプチド結合を介して前記ペプチドリンカードメインの前記Ｃ末端に融合されるように構成されており、
    前記組成物は、ヒト調節性Ｔ細胞濃度が所望のレベルに達するまで、治療有効用量で投与される、
    医薬組成物。
21. ヒト血液細胞を１ｎＭから０．０１ｎＭの間の濃度の請求項１に記載の融合タンパク質とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる工程と、次いで、前記タンパク質と結合する細胞をフローサイトメトリーによって検出する工程とを含む、ヒト血液試料中の調節性Ｔ細胞の数を測定する方法。