BR112020011343A2

BR112020011343A2 - muteínas de il-2 e seus usos

Info

Publication number: BR112020011343A2
Application number: BR112020011343-3A
Authority: BR
Inventors: Nathan Higginson-Scott; Joanne L. Viney; Jyothsna Visweswaraiah; Erik Robert Sampson; Kevin Lewis Otipoby
Original assignee: Pandion Therapeutics, Inc.
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2020-11-17
Also published as: WO2019112854A1; EP3720470A4; CN111432831A; AU2018378078A1; JP2021507690A; MX2020005208A; KR20200097275A; KR20240039201A; IL274844A; SG11202003965VA; EP3720470A1; CA3083941A1; JP7250790B2

Abstract

O presente pedido de patente descreve terapêuticos que podem modular (por exemplo, aumentar) a proliferação, sobrevivência, ativação e/ou função das células Treg. Em algumas modalidades, a modulação é seletiva ou específica para as células Treg. O presente pedido de patente fornece muteínas de IL-2, composições compreendendo as mesmas e métodos para usá-las. Em outro aspecto, as modalidades fornecem composições, por exemplo, composições farmaceuticamente aceitáveis, as quais incluem um composto terapêutico (muteína de IL-2) aqui descrito, formulado em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Um kit que compreende um composto terapêutico aqui descrito também se encontra do escopo da presente invenção.

Description

“MUTEÍNAS DE IL-2 E SEUS USOS”.

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório Norte-Americano nº 62/721,644, depositado em 23 de agosto de 2018, ao Pedido Provisório Norte-Americano nº 62/675,972, depositado em 24 de maio de 2018, ao Pedido Provisório Norte-Americano nº 62/595,357, depositado em 06 de dezembro de 2017, ao Pedido Não Provisório Norte-Americano nº 16/109,875, depositado em 23 de agosto de 2018 e ao Pedido Não Provisório Norte-Americano nº 16/109,897, depositado em 23 de agosto de 2018, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] As modalidades aqui fornecidas referem-se às proteínas identificadas como muteínas de IL-2, composições compreendendo as mesmas e métodos de uso das mesmas.

ANTECEDENTES

[0003] A IL-2 se liga a três subunidades de receptores transmembranares: IL-2R e IL-2R que juntas ativam eventos de sinalização intracelular após ligação a IL-2, e CD25 (IL- 2R), que serve para apresentar IL-2 às outras 2 subunidades de receptores. Os sinais transmitidos pela IL-2R incluem aqueles de PI3-quinase, Ras-MAP-quinase e vias STAT5.

[0004] As células T requerem a expressão de CD25 para responder às baixas concentrações de IL-2 que normalmente existem nos tecidos. As células T que expressam CD25 incluem células T reguladoras CD4+ FOXP3+ (células T-reg) - que são essenciais para suprimir a inflamação autoimune - e células T FOXP3- que foram ativadas para expressar CD25. Células T efetoras FOXP3- CD4+ (T-eff) podem ser células CD4+ ou CD8+, que podem ser pró-inflamatórias e podem contribuir para a autoimunidade e outras doenças, nas quais o sistema imunológico do indivíduo ataca um órgão ou outros tecidos.

A sinalização STAT5 estimulada por IL-2 é crucial para o crescimento e sobrevivência normais das células T-reg e para a alta expressão de FOXP3.

[0005] Devido à baixa afinidade que IL-2 possui para cada uma das três cadeias de IL-2R, uma redução adicional na afinidade para IL-2R e IL-2R poderia ser compensada através de uma afinidade aumentada para CD25. Variações mutacionais de IL-2 foram geradas. Estes mutantes de IL-2 podem ser identificados como muteínas de IL-2 e foram considerados úteis no tratamento de várias doenças. No entanto, ainda são necessárias muteínas de IL-2 adicionais que possam ser utilizadas em várias aplicações e composições. As modalidades aqui apresentadas satisfazem essas necessidades, bem como outras.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] Em algumas modalidades, são fornecidos peptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 1, em que o peptídeo compreende uma mutação na posição 73, 76, 100 ou 138.

[0007] Em algumas modalidades, são fornecidos peptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que o peptídeo compreende uma mutação na posição 53, 56, 80 ou 118.

[0008] Em algumas modalidades, os peptídeos compreendem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, em que pelo menos um dentre X1, X2, e X3 e X4 é I e os restantes são L ou I.

[0009] Também são fornecidas composições farmacêuticas compreendendo as mesmas e moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas aqui descritas. Também são aqui fornecidos vetores compreendendo a molécula de ácido nucleico que codifica as proteínas aqui descritas. Em algumas modalidades, são fornecidos plasmídeos compreendendo o ácido nucleico que codifica as proteínas aqui descritas. Em algumas modalidades, são fornecidas células compreendendo as moléculas de ácido nucleico, vetores ou plasmídeos que codificam as proteínas aqui descritas.

[0010] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de ativação de células T reguladoras. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o contato de uma célula T reguladora com um peptídeo aqui descrito ou uma composição farmacêutica aqui descrita.

[0011] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de um distúrbio inflamatório em um indivíduo.

Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração a um indivíduo, incluindo, mas não se limitando a um indivíduo em necessidade do mesmo, de um peptídeo (por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo).

[0012] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para promover ou estimular a fosforilação de STAT5 em células T reguladoras. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração, a um indivíduo, de um peptídeo (por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo).

BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA

[0013] A Figura 1 ilustra uma modalidade não limitativa de uma muteína de IL-2 prevista no presente documento.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0014] O presente documento descreve terapêuticos que podem modular (por exemplo, aumentar) a proliferação, sobrevivência, ativação e/ou função das células T-reg. Em algumas modalidades, a modulação é seletiva ou específica para as células T-reg.

[0015] Tal como usado no presente documento, o termo “seletivo” refere-se ao terapêutico ou à proteína que modula a atividade nas células T-reg, mas que possui capacidade limitada ou ausência de capacidade para promover a atividade em células T não reguladoras.

[0016] Em algumas modalidades, o terapêutico é um mutante de IL-2. Um mutante de IL-2 pode ser identificado como uma muteína de IL-2. A IL-2 pode existir em duas formas diferentes, uma forma imatura e uma forma madura. A forma madura é onde a sequência líder foi removida. Isso é feito durante um processo pós-tradução. A sequência de tipo selvagem da IL-2 imatura é a seguinte:

MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNP

KLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIV LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO: 1).

[0017] A sequência do tipo selvagem da IL-2 madura é a seguinte:

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELK

HLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETAT IVEFLNRWITFCQSIISTLT (sequência de IL-2 madura) (SEQ ID NO: 2).

[0018] Uma molécula de muteína de IL-2 pode ser preparada por mutação de um ou mais dos resíduos de IL-2.

Exemplos não limitativos de muteínas de IL-2 podem ser encontrados nos documentos WO2016/164937, US9580486, US7105653, US9616105, US 9428567, US2017/0051029, US2014/0286898A1, WO2014153111A2, WO2010/085495,

WO2016014428A2, WO2016025385A1 e US20060269515, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade.

[0019] Em algumas modalidades, a alanina na posição 1 da sequência acima (SEQ ID NO: 2) é excluída. Em algumas modalidades, a molécula de muteína de IL-2 compreende uma serina substituída por cisteína na posição 125 da sequência madura de IL-2. Outras combinações de mutações e substituições que são moléculas de muteína de IL-2 são descritas no documento US20060269515, o qual é incorporado por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, a cisteína na posição 125 também é substituída por uma valina ou alanina. Em algumas modalidades, a molécula de muteína de IL-2 compreende uma substituição V91K. Em algumas modalidades, a molécula de muteína de IL-2 compreende uma substituição N88D. Em algumas modalidades, a molécula de muteína de IL-2 compreende uma substituição N88R. Em algumas modalidades, a molécula de muteína de IL-2 compreende uma substituição de H16E, D84K, V91N, N88D, V91K ou V91R, e qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, essas moléculas de muteína de IL-2 também compreendem uma substituição na posição 125, tal como aqui descrito. Em algumas modalidades, a molécula de muteína de IL-2 compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em: T3N, T3A, L12G, L12K, L12Q, L12S, Q13G, E15A, E15G, E15S, H16A, H16D, H16G, H16K, H16M, H16N, H16R, H16S,

H16T, H16V, H16Y, L19A, L19D, L19E, L19G, L19N, L19R, L19S,

L19T, L19V, D20A, D20E, D20H, D20I, D20Y, D20F, D20G, D20T,

D20W, M23R, R81A, R81G, R81S, R81T, D84A, D84E, D84G, D84I,

D84M, D84Q, D84R, D84S, D84T, S87R, N88A, N88D, N88E, N88I,

N88F, N88G, N88M, N88R, N88S, N88V, N88W, V91D, V91E, V91G,

V91S, I92K, I92R, E95G e Q126. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da molécula de muteína de IL-2 difere da sequência de aminoácidos estabelecida na sequência madura de IL-2 com uma substituição C125A ou C125S e com uma substituição selecionada a partir de T3N, T3A, L12G, L12K,

L12Q, L12S, Q13G, E15A, E15G, E15S, H16A, H16D, H16G, H16K,

H16M, H16N, H16R, H16S, H16T, H16V, H16Y, L19A, L19D, L19E,

L19G, L19N, L19R, L19S, L19T, L19V, D20A, D20E, D20F, D20G,

D20T, D20W, M23R, R81A, R81G, R81S, R81T, D84A, D84E, D84G,

D84I, D84M, D84Q, D84R, D84S, D84T, S87R, N88A, N88D, N88E,

N88F, N88I, N88G, N88M, N88R, N88S, N88V, N88W, V91D, V91E,

V91G, V91S, I92K, I92R, E95G, Q126I, Q126L e Q126F.

Em algumas modalidades, a molécula de muteína de IL-2 difere da sequência de aminoácidos estabelecida na sequência madura de

IL-2 com uma substituição C125A ou C125S e com uma substituição selecionada a partir de D20H, D20I, D20Y, D20E,

D20G, D20W, D84A, D84S, H16D, H16G, H16K, H16R, H16T, H16V,

I92K, I92R, L12K, L19D, L19N, L19T, N88D, N88R, N88S, V91D,

V91G, V91K e V91S.

Em algumas modalidades, a muteína de IL-

2 compreende mutações N88R e/ou D20H.

[0020] Em algumas modalidades, a molécula de muteína de IL-2 compreende uma mutação na sequência polipeptídica em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em aminoácido 30, aminoácido 31, aminoácido 35, aminoácido 69 e aminoácido 74. Em algumas modalidades, a mutação na posição 30 é N30S. Em algumas modalidades, a mutação na posição 31 é Y31H. Em algumas modalidades, a mutação na posição 35 é K35R. Em algumas modalidades, a mutação na posição 69 é V69A.

Em algumas modalidades, a mutação na posição 74 é Q74P. Em algumas modalidades, a muteína não compreende uma mutação na posição 30, 31 e/ou 35.

[0021] Em algumas modalidades, a molécula de muteína de IL-2 compreende uma substituição selecionada a partir do grupo que consiste em: N88R, N88I, N88G, D20H, D109C, Q126L, Q126F, D84G ou D84I em relação à sequência de IL-2 humana madura fornecida acima. Em algumas modalidades, a molécula de muteína de IL-2 compreende uma substituição de D109C e uma ou ambas de uma substituição N88R e uma substituição C125S. Em algumas modalidades, a cisteína que está na molécula de muteína de IL-2 na posição 109 está ligada a uma fração de polietilenoglicol, em que a fração de polietilenoglicol possui um peso molecular de cerca de 5 kDa a cerca de 40 kDa. Em algumas modalidades, a muteína não compreende uma mutação na posição 109, 126 ou 84.

[0022] Em algumas modalidades, qualquer uma das substituições aqui descritas é combinada com uma substituição na posição 125. A substituição pode ser uma substituição C125S, C125A ou C125V. Em algumas modalidades, a muteína não compreende uma mutação na posição 125.

[0023] A numeração aqui identificada, salvo indicação em contrário para as muteínas de IL-2, refere-se à sequência madura. Se uma sequência ou posição se refere à SEQ ID NO: 1, esta é a sequência imatura. No entanto, para transpor as posições da sequência imatura (SEQ ID NO: 1) para a sequência madura (SEQ ID NO: 2), tudo o que precisa ser feito é subtrair 20 unidades a partir da posição identificada na SEQ ID NO: 1 para obter a posição correspondente na SEQ ID NO: 2.

[0024] Além das substituições ou mutações descritas aqui, em algumas modalidades, a muteína de IL-2 possui uma substituição/mutação em uma ou mais das posições 73, 76, 100 ou 138 que correspondem à SEQ ID NO: 1 ou posições em uma ou mais das posições 53, 56, 80 ou 118 que correspondem à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação nas posições 73 e 76; 73 e 100; 73 e 138; 76 e 100; 76 e 138; 100 e 138; 73, 76 e 100; 73, 76 e 138; 73, 100 e 138; 76, 100 e 138; ou em cada um de 73, 76, 100 e 138 que correspondem à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação nas posições 53 e 56; 53 e 80; 53 e 118; 56 e 80; 56 e 118; 80 e 118; 53, 56 e 80; 53, 56 e 118; 53, 80 e 118; 56, 80 e

118; ou em cada uma de 53, 56, 80 e 118 que correspondem à SEQ ID NO: 2. Como a IL-2 pode ser fundida ou amarrada a outras proteínas, conforme usado no presente documento, o termo correspondente a uma referência a SEQ ID NOs: 6 ou 15 se refere ao modo em que as sequências se alinhariam com as configurações padrão do software de alinhamento, tal como pode ser usado com o site da NCBI. Em algumas modalidades, a mutação é leucina para isoleucina. Assim, a muteína de IL- 2 pode compreender mais de uma isoleucina nas posições 73, 76, 100 ou 138 que correspondem à SEQ ID NO: 1 ou posições em uma ou mais das posições 53, 56, 80 ou 118 que correspondem à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a muteína compreende uma mutação em L53 que corresponde à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a muteína compreende uma mutação em L56 que corresponde à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a muteína compreende uma mutação em L80 que corresponde à SEQ ID NO:

2. Em algumas modalidades, a muteína compreende uma mutação em L118 que corresponde à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a mutação é leucina para isoleucina. Em algumas modalidades, a muteína também compreende uma mutação na posição 69, 74, 88, 125 ou qualquer combinação das mesmas nessas muteínas que correspondem à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a mutação é uma mutação V69A. Em algumas modalidades, a mutação é uma mutação Q74P. Em algumas modalidades, a mutação é uma mutação N88D ou N88R. Em algumas modalidades, a mutação é uma mutação C125A ou C125S.

[0025] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação em mais de uma das posições 49, 51, 55, 57, 68, 89, 91, 94, 108 e 145 que correspondem à SEQ ID NO: 1 ou uma ou mais das posições 29, 31, 35, 37, 48, 69, 71, 74, 88 e 125 que correspondem à SEQ ID NO: 2. As substituições podem ser usadas sozinhas ou em combinação umas com as outras. Em algumas modalidades, a muteína de IL- 2 compreende substituições em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou em cada uma das posições 49, 51, 55, 57, 68, 89, 91, 94, 108, e 145. Exemplos não limitativos de tais combinações incluem, mas não estão limitados a, uma mutação nas posições 49, 51, 55, 57, 68, 89, 91, 94, 108 e 145; 49, 51, 55, 57, 68, 89, 91, 94 e 108; 49, 51, 55, 57, 68, 89, 91 e 94; 49, 51, 55, 57, 68, 89 e 91; 49, 51, 55, 57, 68 e 89; 49, 51, 55, 57 e 68; 49, 51, 55 e 57; 49, 51 e 55; 49 e 51; 51, 55, 57, 68, 89, 91, 94, 108 e 145; 51, 55, 57, 68, 89, 91, 94 e 108; 51, 55, 57, 68, 89, 91 e 94; 51, 55, 57, 68, 89 e 91; 51, 55, 57, 68 e 89; 55, 57 e 68; 55 e 57; 55, 57, 68, 89, 91, 94, 108 e 145; 55, 57, 68, 89, 91, 94 e 108; 55, 57, 68, 89, 91 e 94; 55, 57, 68, 89, 91 e 94; 55, 57, 68, 89 e 91; 55, 57, 68 e 89; 55, 57 e 68; 55 e 57; 57, 68, 89, 91, 94, 108 e 145; 57, 68, 89, 91, 94 e 108; 57, 68, 89, 91 e 94; 57, 68, 89 e 91; 57, 68 e 89; 57 e 68; 68, 89, 91, 94, 108 e 145; 68, 89, 91, 94 e 108; 68, 89, 91 e 94; 68, 89 e 91; 68 e 89;

89, 91, 94, 108 e 145; 89, 91, 94 e 108; 89, 91 e 94; 89 e 91; 91, 94, 108 e 145; 91, 94 e 108; 91 e 94; ou 94 e 108.

Cada mutação pode ser combinada com outra. As mesmas substituições podem ser feitas na SEQ ID NO: 2, mas a numeração seria ajustada de forma apropriada como fica claro a partir da presente divulgação (20 unidades a menos que a numeração para a SEQ ID NO: 1 corresponde às posições na SEQ ID NO: 2).

[0026] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação em uma ou mais posições 35, 36, 42, 104, 115 ou 146 que correspondem à SEQ ID NO: 1 ou as posições equivalentes na SEQ ID NO: 2 (por exemplo, posições 15, 16, 22, 84, 95 e 126). Essas mutações podem ser combinadas com as outras mutações de leucina para isoleucina descritas aqui ou a mutação nas posições 73, 76, 100 ou 138 que correspondem à SEQ ID NO: 1 ou em uma ou mais das posições 53, 56, 80 ou 118 que correspondem à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a mutação é uma E35Q, H36N, Q42E, D104N, E115Q ou Q146E, ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, uma ou mais dessas substituições são do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a muteína compreende um resíduo do tipo selvagem em uma ou mais das posições 35, 36, 42, 104, 115 ou 146 que correspondem à SEQ ID NO: 1 ou posições equivalentes na SEQ ID NO: 2 (por exemplo, posições 15, 16, 22, 84, 95 ou 126).

[0027] As mutações nessas posições podem ser combinadas com qualquer uma das outras mutações aqui descritas, incluindo, mas não limitadas a, substituições nas posições 73, 76, 100 ou 138 que correspondem à SEQ ID NO: 1 ou posições em uma ou mais das posições 53, 56, 80 ou 118 que correspondem à SEQ ID NO: 2 aqui descrita. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação N49S que corresponde à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação Y51S ou Y51H que corresponde à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação K55R que corresponde à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação T57A que corresponde à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação K68E que corresponde à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação V89A que corresponde à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação N91R que corresponde à SEQ ID NO: 1.

Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação Q94P que corresponde à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação N108D ou N108R que corresponde à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação C145A ou C145S que corresponde à SEQ ID NO: 1.

[0028] Essas substituições podem ser usadas sozinhas ou em combinação umas com as outras. Em algumas modalidades,

a muteína compreende cada uma dessas substituições. Em algumas modalidades, a muteína compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 dessas mutações. Em algumas modalidades, a muteína compreende um resíduo de tipo selvagem em uma ou mais das posições 35, 36, 42, 104, 115 ou 146 que correspondem à SEQ ID NO: 1 ou as posições equivalentes na SEQ ID NO: 2 (por exemplo, posições 15, 16, 22, 84, 95, 126 e 126).

[0029] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação N29S que corresponde à SEQ ID NO: 2.

Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação Y31S ou Y31H que corresponde à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação K35R que corresponde à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação T37A que corresponde à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação K48E que corresponde à SEQ ID NO: 2.

Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação V69A que corresponde à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação N71R que corresponde à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação Q74P que corresponde à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação N88D ou N88R que corresponde à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação C125A ou C125S que corresponde à SEQ ID NO: 2.

Essas substituições podem ser usadas sozinhas ou em combinação umas com as outras. Em algumas modalidades, a muteína compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 dessas mutações.

Em algumas modalidades, a muteína compreende cada uma dessas substituições. Em algumas modalidades, a muteína compreende um resíduo do tipo selvagem em uma ou mais das posições 35, 36, 42, 104, 115 ou 146 que correspondem à SEQ ID NO: 1 ou as posições equivalentes na SEQ ID NO: 2 (por exemplo, posições 15, 16, 22, 84, 95 e 126).

[0030] Para qualquer uma das muteínas de IL-2 aqui descritas, em algumas modalidades, uma ou mais das posições 35, 36, 42, 104, 115 ou 146 que correspondem à SEQ ID NO: 1 ou as posições equivalentes na SEQ ID NO: 2 (por exemplo, posições 15, 16, 22, 84, 95 e 126) é do tipo selvagem (por exemplo, conforme mostrado nas SEQ ID NO: 1 ou 2). Em algumas modalidades, 2, 3, 4, 5, 6 ou cada uma das posições 35, 36, 42, 104, 115 ou 146 que correspondem à SEQ ID NO: 1 ou as posições equivalentes na SEQ ID NO: 2 (por exemplo, posições 15, 16, 22, 84, 95 e 126) são do tipo selvagem.

[0031] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma sequência de:

MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNP

RLARMLTFKFYMPEKATEIKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIV LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO: 3)

[0032] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma sequência de:

MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNP

RLARMLTFKFYMPEKATELKHIQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIV LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO: 4)

[0033] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma sequência de:

MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNP

RLARMLTFKFYMPEKATELKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHIRPRDLISDINVIV LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO: 5)

[0034] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma sequência de:

MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNP

RLARMLTFKFYMPEKATELKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIV LELKGSETTFMCEYADETATIVEFINRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO: 6)

[0035] Em algumas modalidades, as sequências de muteína de IL-2 aqui descritas não compreendem a sequência líder de IL-2. A sequência líder de IL-2 pode ser representada pela sequência de MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 7). Portanto, em algumas modalidades, as sequências ilustradas acima também podem incluir peptídeos sem a sequência líder. Embora as SEQ ID NOs: 3 a 6 sejam ilustradas apenas com mutação em uma das posições 73, 76, 100 ou 138 que correspondem à SEQ ID NO: 1 ou posições em uma ou mais das posições 53, 56, 80 ou 118 que correspondem à SEQ ID NO: 2, os peptídeos podem compreender 1, 2, 3 ou 4 das mutações nessas posições. Em algumas modalidades, a substituição em cada posição é isoleucina ou outro tipo de substituição conservadora de aminoácidos. Em algumas modalidades, a leucina nas posições citadas é substituída, independentemente, por isoleucina, valina, metionina ou glicina, alanina, glutamina ou ácido glutâmico.

[0036] Em algumas modalidades, a proteína de IL-2 de SEQ ID NO: 2 compreende as seguintes mutações: V69A, Q74P, N88D e C125S ou C125A e uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em L53I, L56I, L80I e L118I. Em algumas modalidades, a proteína de IL-2 compreende duas mutações selecionadas a partir do grupo que consiste em L53I, L56I, L80I e L118I. Em algumas modalidades, a proteína de IL-2 compreende três ou cada uma das mutações selecionadas a partir do grupo que consiste em L53I, L56I, L80I e L118I. Em algumas modalidades, a proteína de IL-2 compreende L53I e L56I, L53I e L80I, L53I e L118I, L56I e L80I, L56I e L118I, L80I e L118I, L53I, L56I e L80I, L53I, L56I e L118I, L56I, L80I e L118I ou L53I, L56I, L80I e L118I. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 não compreende mutações L53I, L56I, L80I ou L118I. Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 compreende uma mutação T3A.

[0037] Em algumas modalidades, a proteína de IL-2 de SEQ ID NO: 2 compreende as seguintes mutações: V69A, Q74P, N88D e C125S ou C125A e uma ou mais mutações, tais como, mas não limitadas a, substituições conservadoras, em regiões de 45 a 55, de 50 a 60, de 52 a 57, de 75 a 85, de 100 a 130, de 115 a 125 da SEQ ID NO: 2.

[0038] Em algumas modalidades, a molécula de muteína de IL-2 é fundida com uma região Fc ou outra região de ligação, conforme descrito aqui. Exemplos de tais proteínas de fusão podem ser encontrados nos documentos US9580486, US7105653, US9616105, US9428567, US2017/0051029, WO2016/164937, US2014/0286898A1, WO2014153111A2, WO2010/085495, WO2016014428A2, WO2016025385A1, US2017/0037102 e US2006/0269515, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[0039] Em algumas modalidades, a região Fc compreende o que é conhecido nas mutações LALA. Em algumas modalidades, a região Fc compreende mutações L234A e L235A (numeração EU). Em algumas modalidades, a região Fc compreende uma G237A (numeração EU). Em algumas modalidades, a região Fc não compreende uma mutação na posição G237 (numeração EU). Usando a numeração de Kabat, isso corresponderia a L247A, L248A e/ou G250A. Em algumas modalidades, usando o sistema de numeração EU, a região Fc compreende uma mutação L234A, uma mutação L235A e/ou uma mutação G237A. Independentemente do sistema de numeração utilizado, em algumas modalidades, a porção de Fc pode compreender mutações que correspondem a um ou mais destes resíduos. Em algumas modalidades, a região Fc compreende mutações N297G ou N297A (numeração de Kabat). A numeração de Kabat é baseada em uma sequência completa, mas seria usada em um fragmento baseado em um alinhamento tradicional usado por um versado na técnica para a região Fc (consulte, por exemplo, Kabat et al. (“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publicação No. 91, o qual é aqui incorporada por referência). Em algumas modalidades, a região Fc compreende uma sequência de:

DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.

(SEQ ID NO: 8)

[0040] Em algumas modalidades, a região Fc compreende uma sequência de:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE

KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 15)

[0041] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 está ligada à região Fc. Exemplos não limitativos de ligantes são ligantes glicina/serina. Por exemplo, um ligante glicina/serina pode ser, ou compreender, uma sequência de

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9) ou ser, ou compreender uma sequência de GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 16). Este é simplesmente um exemplo não limitativo e o ligante pode possuir um número variável de repetições de GGGGS (SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o ligante compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 das repetições de GGGGS (SEQ ID NO: 10).

[0042] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 é ligada à região Fc usando um ligante flexível, rígido ou clivável. O ligante pode ser como descrito aqui ou como ilustrado na tabela a seguir: Tipo Sequência flexível GGGGS (SEQ ID NO: 10) flexível (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 16) flexível (GGGGS)n, (n = 1, 2, 3, 4) (SEQ ID NO: 10) flexível (Gly)8 (SEQ ID NO: 44) flexível (Gly)6 (SEQ ID NO: 45) rígido (EAAAK)3 (SEQ ID NO: 46) rígido (EAAK)n, (n = 1 a 3) (SEQ ID NO: 47) rígido A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4ª (SEQ ID NO: 48) rígido AEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 49) rígido PAPAP (SEQ ID NO: 50)

rígido (Ala-Pro)n (10-34 aa) clivável dissulfeto clivável VSQTSKLTRAETVFPDV (SEQ ID NO: 51) clivável PLGLWA (SEQ ID NO: 52) clivável RVLAEA (SEQ ID NO: 53) clivável EDVVCCSMSY (SEQ ID NO: 54) clivável GGIEGRGS (SEQ ID NO: 55) clivável TRHRQPRGWE (SEQ ID NO: 56) clivável AGNRVRRSVG SEQ ID NO: 57) clivável RRRRRRRRR (SEQ ID NO: 58) clivável GFLG (SEQ ID NO: 59) dipeptídeo LE

[0043] Assim, a fusão IL-2/Fc pode ser representada pela fórmula de ZIL-2M-Lgs-ZFc, em que ZIL-2M é uma muteína de IL-2, conforme descrito aqui, Lgs é um sequência ligante, tal como aqui descrito (por exemplo, ligante glicina/serina) e ZFc é uma região Fc descrita aqui ou conhecida por um versado na técnica. Em algumas modalidades, a fórmula pode estar na orientação inversa ZFc-Lgs-ZIL-2M.

[0044] Em algumas modalidades, a fusão IL-2/Fc compreende uma sequência de:

MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNP RLARMLTFKFYMPEKATEIKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIV LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS

KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 11)

[0045] Em algumas modalidades, a fusão IL-2/Fc compreende uma sequência de:

MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNP RLARMLTFKFYMPEKATELKHIQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIV LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS

KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 12)

[0046] Em algumas modalidades, a fusão IL-2/Fc compreende uma sequência de:

MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNP RLARMLTFKFYMPEKATELKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHIRPRDLISDINVIV LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID

NO: 13)

[0047] Em algumas modalidades, a fusão IL-2/Fc compreende uma sequência de:

MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNP RLARMLTFKFYMPEKATELKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIV LELKGSETTFMCEYADETATIVEFINRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS

KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 14).

[0048] Em algumas modalidades, a região Fc da SEQ ID NO: 8 é substituída pela SEQ ID NO: 15.

[0049] As proteínas aqui descritas também podem ser fundidas com outra proteína, tal como um anticorpo ou outro tipo de molécula terapêutica.

[0050] Em algumas modalidades, a sequência de muteína de IL-2 ou fusão IL-2/Fc é conforme mostrada na tabela a seguir: SEQ ID Descrição Sequência de Aminoácidos NO: breve

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR IL-2 humana

MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSK 17 com mutação

NFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI C125S

VEFLNRWITFSQSIISTLT

IL-2 humana APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR com MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSK 18 mutações NFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI C125S e T3A VEFLNRWITFSQSIISTLT

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR IL-2 humana

MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSK 19 com N88R e

NFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI C125S

VEFLNRWITFSQSIISTLT IL-2 humana

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR com

MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEALNLAPSK 20 mutações

NFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI V69A, Q74P

VEFLNRWITFSQSIISTLT e C125S IL-2 humana com APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR mutações MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEALNLAPSK 21 V69A, Q74P, NFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI N88D e VEFLNRWITFSQSIISTLT C125S IL-2 humana com APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR mutações MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEALNLAPSK 22 V69A, Q74P, NFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI N88R e VEFLNRWITFSQSIISTLT C125S

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR IL-2 humana

MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSK 23 com N88D e

NFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI C125S

VEFLNRWITFSQSIISTLT IL-2 humana com APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR mutações MLTFKFYMPKKATEIKHLQCLEEELKPLEEALNLAPSK 24 L53I, V69A, NFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI Q74P, N88D VEFLNRWITFSQSIISTLT e C125S IL-2 humana com APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR mutações MLTFKFYMPKKATELKHIQCLEEELKPLEEALNLAPSK 25 L56I, V69A, NFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI Q74P, N88D VEFLNRWITFSQSIISTLT e C125S IL-2 humana com APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR mutações MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEALNLAPSK 26 V69A, Q74P, NFHIRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI L80I, N88D VEFLNRWITFSQSIISTLT e C125S IL-2 humana APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR 27 com MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEALNLAPSK mutações NFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI

V69A, Q74P, VEFINRWITFSQSIISTLT N88D, L118I e C125S IgG1 Fc humana

DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE (fusões N-

VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY terminais)

NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK 28 com

TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF mutações

YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL L234A,

TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG L235A e G237A

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE IgG1 Fc

VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY humana

GSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK 29 (truncada)

TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF com mutação

YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL N297G

TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSK

NFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI IL-2 C125S- 30 VEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTH G4Sx3-Fc

TCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSK NFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI

VEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTH IL-2 T3A,

TCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV 31 C125S-

VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY G4Sx3-Fc

RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSK NFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI

VEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTH IL-2 N88R,

TCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV 32 C125S-

VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY G4Sx3-Fc

RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK

SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG IL-2 V69A, APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR 33 Q74P, MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEALNLAPSK

C125S,- NFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI G4Sx3-Fc VEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTH

TCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEALNLAPSK

NFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI IL-2 N88D VEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTH V69A, Q74P, TCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV 34 C125S- VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY G4Sx3-Fc RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK

AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR

MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEALNLAPSK IL-2 N88R

NFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI V69A, Q74P, 35 VEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTH C125S-

TCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV G4Sx3-Fc

VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSK NFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI

VEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTH IL-2 N88D,

TCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV 36 C125S-

VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY G4Sx3-Fc

RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR MLTFKFYMPKKATEIKHLQCLEEELKPLEEALNLAPSK

NFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI IL-2 L53I,

VEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGG N88D, V69A,

SDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTP 37 Q74P,

EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ C125S-

YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE G4Sx4-Fc

KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK

LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG IL-2 L56I APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR 38 N88D, V69A, MLTFKFYMPKKATELKHIQCLEEELKPLEEALNLAPSK

Q74P, NFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI C125S- VEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGG G4Sx4-Fc SDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTP

EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEALNLAPSK

NFHIRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI IL-2 L80I

VEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGG N88D V69A,

SDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTP 39 Q74P,

EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ C125S-

YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE G4Sx4-Fc

KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR IL-2 L118I MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEALNLAPSK N88D V69A, NFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI 40 Q74P, VEFINRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGG C125S- SDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTP G4Sx4-Fc EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ

YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEALNLAPSK

NFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI IL-2 N88D VEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGG V69A, Q74P, SDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTP 41 C125S- EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ G4Sx4-Fc YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE

KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY GSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK

TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF Fc-G4S-IL-2

YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL 42 N88D V69A,

TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGG Q74P

GGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPK LTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEALNLA PSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADET

ATIVEFLNRWITFAQSIISTLT IL-2 N88D APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR 43 V69A, Q74P, MLTFKFYMPKKATEX1KHX2QCLEEELKPLEEALNLAP

C125S- SKNFHX3RPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADET G4Sx4-Fc, ATIVEFX4NRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGS em que pelo GGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMI menos um SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP dentre X1, REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP X2, X3, e X4 APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC representa LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF I e o LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL restante SPG representa L ou I

[0051] Cada uma das proteínas também pode ser considerada como tendo as mutações C125S e LALA e/ou G237A, conforme fornecido neste documento. A substituição C125 também pode ser C125A, tal como descrito ao longo do presente pedido.

[0052] Em algumas modalidades, as sequências mostradas na tabela ou ao longo do presente pedido compreendem ou não compreendem uma ou mais mutações que correspondem às posições L53, L56, L80 e L118. Em algumas modalidades, as sequências mostradas na tabela ou ao longo do presente pedido compreendem ou não compreendem uma ou mais mutações que correspondem às posições L59I, L63I, I24L, L94I, L96I ou L132I ou outras substituições nas mesmas posições. Em algumas modalidades, a mutação é leucina para isoleucina. Em algumas modalidades, a muteína não compreende outra mutação além da mostrada ou descrita aqui. Em algumas modalidades, o peptídeo compreende uma sequência de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 43.

[0053] Em algumas modalidades, a porção Fc da fusão não está incluída. Em algumas modalidades, o peptídeo consiste essencialmente em uma muteína de IL-2 prevista no presente documento. Em algumas modalidades, a proteína está livre de uma porção Fc.

[0054] Em algumas modalidades, um polipeptídeo fornecido compreendendo a SEQ ID NO: 43, em que pelo menos um dentre X1, X2, X3 e X4 representa I e os restantes são L ou I. Em algumas modalidades, X1, X2 e X3 são L e X4 é I. Em algumas modalidades, X1, X2 e X4 são L e X3 é I. Em algumas modalidades, X2, X3 e X4 são L e X1 é I. Em algumas modalidades, X1, X3 e X4 são L e X2 é I. Em algumas modalidades, X1 e X2 são L e X3 e X4 são I. Em algumas modalidades, X1 e X3 são L e X2 e X4 são I. Em algumas modalidades, X1 e X4 são L e X2 e X3 são I. Em algumas modalidades, X2 e X3 são L e X1 e X4 são I. Em algumas modalidades, X2 e X4 são L e X1 e X3 são I. Em algumas modalidades, X3 e X4 são L e X1 e X2 são I. Em algumas modalidades, X1, X2 e X3 são L e X4 é I. Em algumas modalidades, X2, X3 e X4 são L e X1 é I. Em algumas modalidades, X1, X3 e X4 são L e X2 é I. Em algumas modalidades, X1, X2 e X4 são L e X3 é I.

[0055] Em algumas modalidades, a muteína de IL-2 pode estar no formato conforme ilustrado na Figura 1. Mas, como descrito aqui, a muteína de IL-2 pode, em algumas modalidades, ser usada sem um domínio Fc ou o domínio Fc está vinculado ao N-terminal da muteína de IL-2 em oposição ao domínio Fc que está sendo vinculado ao C-terminal da muteína de IL-2. Os polipeptídeos aqui descritos também abrangem variantes dos peptídeos descritos. Em algumas modalidades, variantes de IL-2 compreendem uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% substancialmente semelhantes às sequências aqui previstas.

As variantes incluem aquelas que são descritas aqui com as várias substituições descritas. Em algumas modalidades, a variante possui 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições adicionais. Em algumas modalidades, a substituição é G para A, L para I, G para S, K para R ou outros tipos de substituições conservadoras.

Em algumas modalidades, a substituição conservadora é selecionada com base nas seguintes tabelas:

Básico (grupos R arginina com carga lisina positiva): histidina

Ácido (grupos R com ácido glutâmico carga negativa): ácido aspártico glutamina asparagina

Polares (grupos R serina não carregados): treonina cisteína prolina glicina alanina

Não polares (grupos valina

R alifáticos): metionina leucina isoleucina fenilalanina Não polares (grupos triptofano R aromáticos): tirosina

Resíduo original Substituições

Ala Gly; Ser;Thr

Arg Lys; Gln

Asn Gln; His; Ser

Asp Glu; Asn

Cys Ser, Sec

Gln Asn; Ser; Asp; Glu

Glu Asp; Gln; Lys

Gly Ala; Pro; Asn

His Asn; Gln; Tyr; Phe

Ile Leu; Val; Met; Phe

Leu Ile; Val; Met; Phe

Lys Arg; Gln;

Leu; Tyr; Ile; Met norleucina; Val; Phe

Beta-homoprolina;

Pro Ser; Thr; Ala; Gly;

alfa-homoprolina

Phe Met; Leu; Tyr; Trp

Ser Thr; Gly; Asn; Asp

Thr Ser; Asn

Trp Tyr; Phe

Tyr Trp; Phe;

Val Ile; Leu; Met; Phe

[0056] A identidade percentual de duas sequências de aminoácidos, ou de duas sequências de ácidos nucleicos, pode ser determinada por inspeção visual e cálculo matemático ou, por exemplo, a comparação é feita comparando-se informações de sequência usando um programa de computador. Um exemplo de programa de computador é o Genetics Computer Group (GCG; Madison, Wis.), programa de versão 10.0 do pacote Wisconsin, GAP (Devereux et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12: 387-95).

Os parâmetros padrão preferenciais para o programa GAP incluem: (1) a implementação GCG de uma matriz de comparação unária (contendo um valor igual a 1 para identidades e igual a 0 para não identidades) para nucleotídeos e a matriz de comparação de aminoácidos ponderada de Gribskov e Burgess, ((1986) Nucleic Acids Res. 14: 6745) como descrito em “Atlas of Polypeptide Sequence and Structure”, Schwartz e Dayhoff, eds., National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) ou outras matrizes comparativas comparáveis; (2) uma penalidade de 8 para cada intervalo e uma penalidade adicional de 2 para cada símbolo em cada intervalo para sequências de aminoácidos, ou uma penalidade de 50 para cada intervalo e uma penalidade adicional de 3 para cada símbolo em cada intervalo para sequências de nucleotídeos; (3) nenhuma penalidade por intervalos finais; e (4) nenhuma penalidade máxima para intervalos longos. Também podem ser utilizados outros programas empregados pelos versados na técnica de comparação de sequências.

[0057] Em algumas modalidades, as muteínas de IL-2 aqui fornecidas incluem proteínas que têm sinalização alterada através de certas vias ativadas por IL-2 de tipo selvagem através de IL-2R e resultam na proliferação/ sobrevivência/ativação preferencial de T-regs.

[0058] As muteínas de IL-2 aqui fornecidas podem ser produzidas usando qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo os descritos na Patente Norte-Americana No. 6,955,807 para a produção de variantes de IL-2, a qual é aqui incorporada por referência. Tais métodos incluem a construção de uma sequência de DNA que codifica a variante de IL-2 e a expressão dessas sequências em um hospedeiro adequadamente transformado, tal como uma célula hospedeira.

A utilização destes métodos produzirá proteínas recombinantes, tal como aqui fornecido. As proteínas também podem ser produzidas sinteticamente, ou uma combinação de fragmentos sintéticos e produzidos de forma recombinante em uma célula e, em seguida, combinando-se os fragmentos para criar a proteína inteira de interesse.

[0059] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA) é preparada isolando-se ou sintetizando-se uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína de interesse. Alternativamente, a sequência de IL-2 de tipo selvagem pode ser isolada e mutada usando-se técnicas de rotina, tal como a mutagênese específica de sítio.

[0060] Outro método de construção de uma sequência de DNA que codifica a variante de IL-2 seria a síntese química.

Esta, por exemplo, inclui a síntese direta (por meios químicos) de um peptídeo da sequência proteica que codifica uma variante de IL-2 que exibe as propriedades aqui descritas. Este método pode incorporar aminoácidos naturais e não naturais, em várias posições. Alternativamente, uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína desejada pode ser sintetizada por meios químicos usando um sintetizador de oligonucleotídeo. Os oligonucleotídeos são projetados com base na sequência de aminoácidos da proteína desejada, que também pode ser selecionada usando códons que são favorecidos na célula na qual a variante recombinante será produzida. É bem reconhecido que o código genético é degenerado, e que um aminoácido pode ser codificado por mais de um códon. Consequentemente, será apreciado que, para uma dada sequência de DNA que codifica uma proteína de IL-2 específica, haverá muitas sequências degeneradas de DNA que codificarão essa variante de IL-2. De acordo com algumas modalidades, é fornecida uma molécula de ácido nucleico que codifica as proteínas aqui descritas. A molécula de ácido nucleico pode ser DNA ou RNA.

[0061] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificará uma sequência de sinal. Uma sequência de sinal pode ser escolhida com base na célula que será expressa. Em algumas modalidades, se a célula hospedeira é procariótica, a molécula de ácido nucleico não compreende uma sequência de sinal. Em algumas modalidades, se a célula hospedeira é uma célula eucariótica, a sequência de sinal pode ser usada. Em algumas modalidades, a sequência de sinal é a sequência de sinal de IL-2.

[0062] Uma molécula de ácido nucleico “codifica” uma proteína, tal como aqui entendido, se a molécula de ácido nucleico, ou o seu complemento, compreende os códons que codificam a proteína.

[0063] O termo “recombinante” tal como se aplica a polipeptídeos ou proteínas, significa que a produção de proteína é dependente de pelo menos uma etapa em que os ácidos nucleicos, os quais podem ou não codificar a proteína, são introduzidos em uma célula em que não são encontrados naturalmente.

[0064] Vários hospedeiros (animais ou sistemas celulares) podem ser utilizados para produzir as proteínas aqui descritas. Exemplos de células hospedeiras adequadas incluem, mas não estão limitados a, bactérias, fungos (incluindo leveduras), plantas, insetos, mamíferos ou outras células de animais ou linhagens celulares de animais apropriadas, bem como animais ou plantas transgênicas. Em algumas modalidades, esses hospedeiros podem incluir hospedeiros eucarióticos e procarióticos bem conhecidos, tais como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungos, leveduras, células de insetos, tais como Spodoptera frugiperda (Sf9), células animais, tais como ovário de hamster chinês (CHO) e células de camundongo, tais como NS/O, células de macacos verdes africanos, tais como COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 e BNT 10 e células humanas, bem como células vegetais em cultura de tecidos. Para expressão de células animais, podem ser usadas células CHO e células COS 7 em culturas, e particularmente a linhagem celular CHO (DHFR-) ou a linhagem HKB.

[0065] Deverá ser entendido que nem todos os vetores e sequências de controle de expressão funcionarão igualmente bem para expressar as sequências de DNA aqui descritas. Nem todos os hospedeiros funcionarão igualmente bem com o mesmo sistema de expressão. No entanto, um técnico no assunto pode fazer uma seleção entre esses vetores, sequências de controle de expressão e hospedeiros sem experimentação indevida. Por exemplo, ao selecionar um vetor, o hospedeiro deve ser considerado, pois o vetor deve replicar no mesmo. O número de cópias do vetor, a capacidade de controlar esse número de cópias e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, tal como marcadores de antibióticos, também devem ser considerados. Por exemplo, vetores preferenciais para utilização na presente invenção incluem aqueles que permitem que o DNA, o qual codifica as variantes de IL-2, seja amplificado em número de cópias. Tais vetores amplificáveis são bem conhecidos na técnica.

Vetores e Células Hospedeiras

[0066] Consequentemente, em algumas modalidades, são fornecidos vetores que codificam as proteínas aqui descritas, bem como células hospedeiras transformadas com esses vetores. Quaisquer ácidos nucleicos que codificam as proteínas aqui descritas podem estar contidos em um vetor, que pode, por exemplo, compreender um marcador selecionável e uma origem de replicação para propagação em um hospedeiro.

Em algumas modalidades, os vetores adicionalmente incluem sequências reguladoras de transcrição ou tradução adequadas, tais como aquelas derivadas de genes de mamíferos, microbianos, virais ou de insetos, operacionalmente ligados à molécula de ácido nucleico que codifica a proteína.

Exemplos de tais sequências reguladoras incluem promotores, operadores ou intensificadores de transcrição, sítios de ligação ribossômica do mRNA e sequências apropriadas que controlam a transcrição e tradução. As sequências nucleotídicas estão operacionalmente ligadas quando a sequência reguladora se relaciona funcionalmente ao DNA que codifica a proteína alvo. Assim, uma sequência nucleotídica promotora está operacionalmente ligada a uma molécula de ácido nucleico se a sequência nucleotídica promotora direcionar a transcrição da molécula de ácido nucleico.

[0067] As células hospedeiras que podem ser usadas conforme aqui descrito.

Composições farmacêuticas

[0068] Em outro aspecto, as presentes modalidades fornecem composições, por exemplo, composições farmaceuticamente aceitáveis, as quais incluem um composto terapêutico (muteína de IL-2) aqui descrito, formuladas em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal como usado no presente documento, “veículo farmaceuticamente aceitável” inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, agentes isotônicos e de retardamento de absorção, e similares que são fisiologicamente compatíveis. O veículo pode ser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, retal, local, tópica, espinhal ou epidérmica (por exemplo, através de injeção ou infusão).

[0069] As composições da presente invenção podem estar em uma variedade de formas. Isso inclui, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semissólidas e sólidas, bem como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, lipossomos e supositórios. A forma preferencial depende do modo de administração pretendido e da aplicação terapêutica. As composições típicas estão na forma de soluções injetáveis ou infusíveis. Em uma modalidade, o modo de administração é parenteral (por exemplo, intravenoso, subcutâneo, intraperitoneal, intramuscular). Em uma modalidade, a molécula terapêutica é administrada por infusão ou injeção intravenosa. Em outra modalidade, a molécula terapêutica é administrada por injeção intramuscular ou subcutânea. Em outra modalidade, a molécula terapêutica é administrada localmente, por exemplo, através de injeção ou aplicação tópica em um local alvo.

[0070] As frases “administração parenteral” e “administrada parenteralmente”, conforme usadas no presente documento, significam modos de administração diferentes da administração enteral e tópica, geralmente por injeção, e incluem, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.

[0071] As composições terapêuticas normalmente devem ser estéreis e estáveis nas condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de molécula terapêutica. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando-se o composto ativo (isto é, molécula terapêutica) na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima conforme necessário, seguido de esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando-se o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso dos pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparação são secagem em vácuo e liofilização, os quais produzem um pó do ingrediente ativo além de qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução do mesmo previamente filtrada de maneira estéril. A fluidez adequada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser conseguida incluindo-se na composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

[0072] Como será apreciado pelo técnico no assunto, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados. Em certas modalidades, o composto ativo pode ser preparado com um veículo que protegerá o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de entrega microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tais como etileno acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos pelos técnicos no assunto. Ver, por exemplo, “Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1978.

[0073] Em certas modalidades, um composto terapêutico pode ser administrado por via oral, por exemplo, com um diluente inerte ou um veículo comestível assimilável. O composto (e outros ingredientes, se desejado) também pode ser encapsulado em cápsulas gelatinosas duras ou moles, comprimido em comprimidos, ou incorporado diretamente na dieta do indivíduo. Para administração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados com excipientes e utilizados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias e similares. Para administrar um composto da invenção por outra administração que não seja a parenteral, pode ser necessário revestir o composto, ou coadministrar o composto,

com um material para impedir sua inativação. As composições terapêuticas também podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos no estado da técnica.

[0074] Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformidade da dosagem. A forma de unidade de dosagem como aqui utilizada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. A especificação para as formas de unidade de dosagem da presente invenção é ditada e diretamente dependente de: (a) as características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico específico a ser alcançado; e (b) as limitações inerentes à técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.

[0075] Um intervalo exemplificativo e não limitativo para uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um composto terapêutico é de 0,1 mg/kg a 30 mg/kg,

mais preferivelmente de 1 mg/kg a 25 mg/kg.

As dosagens e regimes terapêuticos do composto terapêutico podem ser determinados por um técnico no assunto.

Em certas modalidades, o composto terapêutico é administrado por injeção (por exemplo, por via subcutânea ou intravenosa) a uma dose de cerca de 1 mg/kg a 40 mg/kg, por exemplo, de 1 mg/kg a 30 mg/kg, por exemplo, cerca de 5 mg/kg a 25 mg/kg,

cerca de 10 mg/kg a 20 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a 5 mg/kg, de

1 mg/kg a 10 mg/kg, de 5 mg/kg a 15 mg/kg, de 10 mg/kg a 20 mg/kg, de 15 mg/kg a 25 mg/kg ou cerca de 3 mg/kg.

O cronograma de dosagem pode variar, por exemplo, de uma vez por semana a uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas, ou, em algumas modalidades, o cronograma de dosagem pode ser, uma vez por mês, a cada 2 meses, a cada 3 meses ou a cada 6 meses.

Em uma modalidade, o composto terapêutico é administrado em uma dose de cerca de 10 mg/kg a 20 mg/kg a cada duas semanas.

O composto terapêutico pode ser administrado por infusão intravenosa a uma taxa de mais de 20 mg/min, por exemplo, de

20 mg/min a 40 mg/min, e tipicamente maior ou igual a 40 mg/min para atingir uma dose de cerca de 35 mg/m2 a 440 mg/m2,

tipicamente cerca de 70 mg/m2 a 310 mg/m2, e mais tipicamente,

cerca de 110 mg/m2 a 130 mg/m2. Nas modalidades, a taxa de infusão de cerca de 110 mg/m2 a 130 mg/m2 atinge um nível de cerca de 3 mg/kg. Em outras modalidades, o composto terapêutico pode ser administrado por infusão intravenosa a uma taxa inferior a 10 mg/min, por exemplo, taxa inferior ou igual a 5 mg/min para atingir uma dose de cerca de 1 mg/m2 a 100 mg/m2, por exemplo, cerca de 5 mg/m2 a 50 mg/m2, cerca de 7 mg/m2 a 25 mg/m2 ou cerca de 10 mg/m2. Em algumas modalidades, o composto terapêutico é infundido durante um período de cerca de 30 minutos. Deverá ser observado que os valores de dosagem podem variar de acordo com o tipo e a gravidade da condição a ser aliviada. Deverá ser entendido ainda que, para qualquer indivíduo em particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo, de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que os intervalos de dosagem aqui apresentados são apenas exemplificativos e não se destinam a limitar o escopo ou a prática da composição reivindicada.

[0076] As composições farmacêuticas da presente invenção podem incluir uma “quantidade terapeuticamente eficaz” ou uma “quantidade profilaticamente eficaz” de uma molécula terapêutica da presente invenção. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz em dosagens e períodos de tempo necessários para alcançar o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula terapêutica pode variar de acordo com fatores, tais como o estado da doença, a idade, o sexo e o peso do indivíduo, e a capacidade do composto terapêutico de provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais de uma molécula terapêutica são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma “dosagem terapeuticamente eficaz” inibe preferivelmente um parâmetro mensurável, por exemplo, ataque imunológico pelo menos cerca de 20%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 40%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 60% e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% em relação aos indivíduos não tratados. A capacidade de um composto para inibir um parâmetro mensurável, por exemplo, ataque imunológico, pode ser avaliada em um sistema de modelo animal preditivo de eficácia na rejeição de transplantes ou distúrbios autoimunes. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando-se a capacidade de inibição do composto, tal inibição in vitro pode ser avaliada por ensaios conhecidos pelos técnicos no assunto.

[0077] Uma “quantidade profilaticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz em dosagens e períodos de tempo necessários para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indivíduos antes ou em uma fase anterior da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.

[0078] Também dentro do escopo da invenção está um kit que compreende um composto terapêutico aqui descrito. O kit pode incluir um ou mais elementos, incluindo: instruções de uso; outros reagentes, por exemplo, um marcador, um agente terapêutico ou um agente útil para quelar ou acoplar, de outra forma, uma molécula terapêutica a um marcador ou outro agente terapêutico ou uma composição radioprotetora; dispositivos ou outros materiais para preparar a molécula terapêutica para administração; veículos farmaceuticamente aceitáveis; e dispositivos ou outros materiais para administração a um indivíduo.

Combinações

[0079] As proteínas aqui descritas também podem ser administradas em conjunto com outros agentes úteis para o tratamento da condição com a qual o paciente está sofrendo.

Exemplos de tais agentes incluem fármacos proteicos e não proteicos. Quando múltiplas terapêuticas são coadministradas, as dosagens podem ser ajustadas em conformidade, tal como é reconhecido na técnica pertinente.

A “coadministração” e a terapia combinada não se limitam à administração simultânea, mas também incluem regimes de tratamento nos quais uma proteína de IL-2 seletiva para T-

reg é administrada pelo menos uma vez durante um curso de tratamento que envolve a administração de pelo menos outro agente terapêutico ao paciente.

[0080] Em algumas modalidades, uma proteína de IL-2 seletiva para T-reg é administrada em combinação com um inibidor da via PI3-K/AKT/mTOR, por exemplo, rapamicina (rapamune, sirolimus). Os inibidores dessa via em combinação com IL-2 favorecem o enriquecimento de T-reg. Em algumas modalidades, a proteína de IL-2 é administrada sem outra terapêutica que não seja diretamente fundida ou ligada à proteína de IL-2.

Métodos Terapêuticos

[0081] O “tratamento” de qualquer doença mencionada no presente documento engloba um alívio de pelo menos um sintoma da doença, uma redução na gravidade da doença ou o atraso ou prevenção da progressão da doença para sintomas mais graves que podem, em alguns casos, acompanhar a doença ou pelo menos outra doença. A necessidade de tratamento não significa que a doença seja totalmente curada. Um agente terapêutico útil precisa apenas reduzir a gravidade de uma doença, reduzir a gravidade do(s) sintoma(s) associado(s) à doença ou ao seu tratamento, ou retardar o aparecimento de sintomas mais graves ou de uma doença mais grave que pode ocorrer com alguma frequência após a condição tratada. Por exemplo, se a doença é uma doença inflamatória intestinal, um agente terapêutico pode reduzir o número de locais distintos de inflamação no intestino, a extensão afetada total do intestino, reduzir a dor e/ou o inchaço, reduzir sintomas, tais como diarreia, constipação, ou vômito, e/ou prevenir a perfuração do intestino. A condição de um paciente pode ser avaliada por técnicas padrão, tais como uma radiografia realizada após um enema opaco ou enteróclise, endoscopia, colonoscopia e/ou uma biópsia. Os procedimentos adequados variam de acordo com a condição e os sintomas do paciente.

[0082] Em algumas modalidades, as proteínas são usadas para tratar distúrbios inflamatórios. Em algumas modalidades, o distúrbio inflamatório é inflamação, doença autoimune, doenças atópicas, doenças autoimunes paraneoplásicas, inflamação de cartilagem, artrite, artrite reumatoide (por exemplo, ativa), artrite juvenil, artrite reumatoide juvenil, artrite reumatoide juvenil pauciarticular, artrite reumatoide juvenil poliarticular, artrite reumatoide juvenil com início sistêmico, espondilite anquilosante juvenil, artrite enteropática juvenil, artrite reativa juvenil, síndrome de Reiter juvenil, síndrome de SEA (soronegatividade, entesopatia e artropatia), dermatomiosite juvenil, artrite psoriática juvenil, esclerodermia juvenil, lúpus eritematoso sistêmico juvenil, vasculite juvenil, artrite reumatoide pauciarticular, artrite reumatoide poliarticular, artrite reumatoide de início sistêmico,

espondilite anquilosante, artrite enteropática, artrite reativa, síndrome de Reiter, síndrome de SEA

(soronegatividade, entesopatia e artropatia),

dermatomiosite, artrite psoriática, esclerodermia,

vasculite, miolite, polimiolite, dermatomiolite,

poliarterite nodosa, granulomatose de Wegener, arterite,

polimialgia reumática, sarcoidose, esclerose, esclerose biliar primária, colangite esclerosante, síndorme de

Sjogren, psoríase, psoríase em placas, psoríase gutata,

psoríase inversa, psoríase pustular, psoríase eritrodérmica,

dermatite, dermatite atópica, dermatite herpetiforme, doença de Behcet, incluindo, mas não limitada, aos efeitos sobre a pele, alopecia, alopecia areata, alopecia total,

aterosclerose, lúpus, doença de Still, lúpus eritematoso sistêmico (LES) (por exemplo: ativo), miastenia gravis,

doença inflamatória intestinal (DII), doença de Crohn,

colite ulcerosa, doença celíaca, esclerose múltipla (EM),

asma, DPOC, rinossinusite, rinossinusite com pólipos,

esofogite eosinofílica, bronquite eosinofílica, doença de

Guillain-Barre, diabetes mellitus tipo I, tireoidite (por exemplo, doença de Graves), doença de Addison, fenômeno de

Raynaud, hepatite autoimune, doença de enxerto contra hospedeiro, doença de enxerto contra hospedeiro crônica esteroides-refratária, rejeição de transplante (por exemplo,

transplante de rim, pulmão, coração, pele e similares), lesão renal, vasculite induzida por hepatite C, perda espontânea de gravidez, alopecia, vitiligo, glomerulosclerose segmentar focal (GESF), doença de alteração mínima, nefropatia membranosa, glomerulonefropatia associada a ANCA, glomerulonefrite membranoproliferativa, nefropatia por IgA, nefrite lúpica e similares. Em algumas modalidades, as proteínas são usadas para tratar a doença de enxerto contra hospedeiro crônica esteroides-refratária. Em algumas modalidades, as proteínas são usadas para tratar o lúpus eritematoso sistêmico ativo. Em algumas modalidades, as proteínas são usadas para tratar a artrite reumatoide ativa.

[0083] Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração de uma composição farmacêutica que compreende as proteínas aqui descritas para o indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo que necessita da mesma. Qualquer uma das proteínas terapêuticas descritas acima pode ser administrada na forma de composições (por exemplo, composições farmacêuticas) que são aqui descritas.

Por exemplo, uma composição pode compreender uma proteína de IL-2, tal como aqui descrita, além de um tampão, um antioxidante, tal como ácido ascórbico, um polipeptídeo de baixo peso molecular (tal como aqueles com menos de 10 aminoácidos), uma proteína, aminoácidos, carboidratos, tais como glicose, sacarose ou dextrinas, um agente quelante, tal como EDTA, glutationa e/ou outros estabilizadores,

excipientes e/ou conservantes. A composição pode ser formulada como um líquido ou um liofilizado. Outros exemplos de componentes que podem ser empregados em formulações farmacêuticas são apresentados em “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 16.sup.th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1980) e outros, tal como aqui descrito.

[0084] Para tratar a doença de interesse, as composições compreendendo as moléculas terapêuticas aqui descritas podem ser administradas através de qualquer método apropriado, incluindo, mas não limitado a, administração parenteral, tópica, oral, nasal, vaginal, retal ou pulmonar (por inalação). Se injetadas, a(s) composição(composições) pode(m) ser administrada(s) intra-articularmente, intravenosamente, intra-arterialmente, intramuscularmente, intraperitonealmente ou subcutaneamente por injeção em bolus ou infusão contínua. A administração localizada, isto é, no local da doença, é contemplada, assim como a liberação transdérmica e a liberação sustentada a partir de implantes, adesivos de pele ou supositórios. A liberação por inalação inclui, por exemplo, inalação nasal ou oral, uso de um nebulizador, inalação na forma de aerossol e similares. A administração através de um supositório inserido em uma cavidade corporal pode ser realizada, por exemplo, inserindo-se uma forma sólida da composição em uma cavidade corporal escolhida e permitindo que este se dissolva.

Alternativas incluem colírios, preparações orais, tais como pílulas, pastilhas, xaropes e chicletes, e preparações tópicas, tais como loções, géis, sprays e pomadas. Na maioria dos casos, moléculas terapêuticas que são polipeptídeos podem ser administradas topicamente, por injeção ou inalação.

[0085] Na execução dos métodos de tratamento, as moléculas terapêuticas descritas acima podem ser administradas como descrito aqui e acima. Por exemplo, a composição pode ser administrada em qualquer dosagem, frequência e duração que possam ser eficazes para tratar a condição a ser tratada. A dosagem depende da natureza molecular da molécula terapêutica e da natureza do distúrbio a ser tratado. O tratamento pode ser continuado pelo tempo necessário para alcançar os resultados desejados. As moléculas terapêuticas da presente invenção podem ser administradas como uma dosagem única ou como uma série de dosagens periódicas, incluindo várias vezes ao dia, diariamente, a cada dois dias, duas vezes por semana, três vezes por semana, semanalmente, a cada duas semanas e mensalmente, entre outros possíveis regimes posológicos. A periodicidade do tratamento pode ou não ser constante durante toda a duração do mesmo. Por exemplo, o tratamento pode ocorrer, inicialmente, em intervalos semanais e,

posteriormente, a cada duas semanas. Tratamentos com durações de dias, semanas, meses ou anos são abrangidos pela presente invenção. O tratamento pode ser descontinuado e depois reiniciado. As doses de manutenção podem ou não ser administradas após um tratamento inicial.

[0086] A dosagem pode ser medida como miligramas por quilograma de peso corporal (mg/kg) ou como miligramas por metro quadrado da superfície da pele (mg/m2) ou como uma dose fixa, independentemente da altura ou peso. Todas estas são unidades de dosagem padrão na técnica. A área da superfície da pele de um indivíduo é calculada a partir da sua altura e peso, usando uma fórmula padrão.

[0087] Também são aqui fornecidos métodos para promover a estimulação da fosforilação de STAT5 em células T reguladoras. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração, a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo aqui descrito ou de uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo.

[0088] Tal como aqui utilizada, a frase “em necessidade do(s) mesmo(s)” significa que o indivíduo (animal ou mamífero) foi identificado como tendo necessidade do método ou tratamento específico. Em algumas modalidades, a identificação pode ser feita através de qualquer meio de diagnóstico. Em qualquer um dos métodos e tratamentos descritos no presente documento, o animal ou mamífero pode precisar do mesmo. Em algumas modalidades, o animal ou mamífero está em um ambiente ou viajará para um ambiente em que uma doença, distúrbio ou condição específica é predominante.

[0089] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos têm o mesmo significado que é comumente entendido por um técnico no assunto ao qual pertencem as modalidades divulgadas.

[0090] Conforme usado neste documento, os termos “um” ou “uma” significam “pelo menos um” ou “um ou mais”, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0091] Como aqui utilizado, o termo “cerca” significa que o valor numérico é aproximado, e pequenas variações não afetariam significativamente a prática das modalidades divulgadas. Onde uma limitação numérica é usada, a menos que indicado de outra forma pelo contexto, “cerca” significa que o valor numérico pode variar em ± 10% e permanecer dentro do escopo das modalidades divulgadas.

[0092] Conforme usado aqui, o termo “indivíduo” ou “paciente” usado de forma intercambiável significa qualquer animal, incluindo mamíferos, tais como ratos, camundongos, outros roedores, coelhos, cães, gatos, suínos, gado, ovelhas, cavalos ou primatas, tais como seres humanos.

[0093] Conforme usado no presente documento, os termos

“compreendendo” (e qualquer forma de compreender, tal como, “compreende” e “compreendido”), “possuindo” (e qualquer forma de possuir, tal como “possui” e “possuem”), “incluindo” (e qualquer forma de incluir, tal como “inclui” e “incluem”) ou “contendo” (e qualquer forma de conter, tal como “contém” e “contêm”) são inclusivos ou abertos e não excluem elementos ou etapas de métodos não enumerados, adicionais. Qualquer etapa ou composição que use a frase de transição de “compreende” ou “compreendendo” também pode ser dita para descrever o mesmo com a frase de transição de “consistindo em” ou “consiste”.

[0094] Tal como usado aqui, o termo “entrar em contato” significa reunir dois elementos em um sistema in vitro ou em um sistema in vivo. Por exemplo, “entrar em contato” com um peptídeo ou composição aqui descrito com uma célula T-reg ou com um indivíduo ou paciente ou célula inclui a administração do composto a um indivíduo ou paciente, tal como um humano, bem como, por exemplo, introduzir um composto em uma amostra contendo uma preparação celular ou purificada contendo a célula T-reg.

[0095] Conforme aqui utilizado, o termo “fundido” ou “ligado”, quando usado em referência a uma proteína com diferentes domínios ou sequências heterólogas, significa que os domínios proteicos fazem parte da mesma cadeia peptídica que estão conectados entre si com ligação peptídica ou outra ligação covalente. Os domínios ou seções podem ser ligados ou fundidos diretamente entre si, ou outro domínio ou sequência peptídica pode estar entre os dois domínios ou sequências e essas sequências ainda seriam consideradas fundidas ou ligadas entre si. Em algumas modalidades, os vários domínios ou proteínas aqui fornecidos estão ligados ou fundidos diretamente entre si ou com sequências de ligação, tais como as sequências de glicina/serina descritas no presente documento vinculam os dois domínios.

[0096] Algumas modalidades fornecidas no presente documento também incluem, mas não estão limitadas, a:

1. Peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, em que o peptídeo compreende uma mutação na posição 73, 76, 100 ou 138.

2. Peptídeo da modalidade 1, em que a mutação é uma mutação de L para I na posição 73, 76, 100 ou 138.

3. Peptídeo da modalidade 1, em que o peptídeo adicionalmente compreende uma mutação em uma ou mais das posições 49, 51, 55, 57, 68, 89, 91, 94, 108 e 145.

4. Peptídeo da modalidade 1, que adicionalmente compreende uma mutação em uma ou mais das posições E35, H36, Q42, D104, E115 ou Q146 ou 1, 2, 3, 4, 5 ou cada uma de E35, H36, Q42, D104, E115 ou Q146 é do tipo selvagem.

5. Peptídeo da modalidade 4, em que a mutação é um ou mais dentre E35Q, H36N, Q42E, D104N, E115Q ou Q146E.

6. Peptídeo de qualquer uma das modalidades de 1 a 5, em que o peptídeo compreende uma mutação N49S.

7. Peptídeo de qualquer uma das modalidades de 1 a 6, em que o peptídeo compreende uma mutação Y51S ou Y51H.

8. Peptídeo de qualquer uma das modalidades de 1 a 7, em que o peptídeo compreende uma mutação K55R.

9. Peptídeo de qualquer uma das modalidades de 1 a 8, em que o peptídeo compreende uma mutação T57A.

10. Peptídeo de qualquer uma das modalidades de 1 a 9, em que o peptídeo compreende uma mutação K68E.

11. Peptídeo de qualquer uma das modalidades de 1 a 10, em que o peptídeo compreende uma mutação V89A.

12. Peptídeo de qualquer uma das modalidades de 1 a 11, em que o peptídeo compreende uma mutação N91R.

13. Peptídeo de qualquer uma das modalidades de 1 a 12, em que o peptídeo compreende uma mutação Q94P.

14. Peptídeo de qualquer uma das modalidades de 1 a 13, em que o peptídeo compreende uma mutação N108D ou N108R.

15. Peptídeo de qualquer uma das modalidades de 1 a 14, em que o peptídeo compreende uma mutação C145A ou C145S.

15.1 Peptídeo de qualquer uma das modalidades de 1 a 15, em que o peptídeo compreende V89A, Q94P, N108R ou N108D e uma ou mais das mutações L73I, L76I, L100I, L118I e, opcionalmente, mutação C145A ou C145S.

16. Peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que o peptídeo compreende uma mutação na posição 53, 56, 80 ou 118.

17. Peptídeo da modalidade 16, em que a mutação é uma mutação de L para I na posição 53, 56, 80 ou 118.

18. Peptídeo da modalidade 16 ou 17, em que o peptídeo adicionalmente compreende uma mutação em uma ou mais das posições 29, 31, 35, 37, 48, 69, 71, 74, 88 e 125.

19. Peptídeo da modalidade 16, que adicionalmente compreende uma mutação em uma ou mais das posições E15, H16, Q22, D84, E95 ou Q126 ou 1, 2, 3, 4, 5 ou cada uma das posições E15, H16, Q22, D84, E95 ou Q126 é do tipo selvagem.

20. Peptídeo da modalidade 19, em que a mutação é uma ou mais dentre E15Q, H16N, Q22E, D84N, E95Q ou Q126E.

21. Peptídeo de qualquer uma das modalidades 16 a 20, em que o peptídeo compreende uma mutação N29S.

22. Peptídeo de qualquer uma das modalidades 16 a 21, em que o peptídeo compreende uma mutação Y31S ou Y51H.

23. Peptídeo de qualquer uma das modalidades 16 a 22, em que o peptídeo compreende uma mutação K35R.

24. Peptídeo de qualquer uma das modalidades 16 a 23, em que o peptídeo compreende uma mutação T37A.

25. Peptídeo de qualquer uma das modalidades 16 a 24, em que o peptídeo compreende uma mutação K48E.

26. Peptídeo de qualquer uma das modalidades 16 a 25, em que a peptídeo compreende uma mutação V69A.

27. Peptídeo de qualquer uma das modalidades 16 a 26, em que a peptídeo compreende uma mutação N71R.

28. Peptídeo de qualquer uma das modalidades 16 a 27, em que o peptídeo compreende uma mutação Q74P.

29. Peptídeo de qualquer uma das modalidades 16 a 28, em que o peptídeo compreende uma mutação N88D ou N88R.

30. Peptídeo de qualquer uma das modalidades 16 a 29, em que o peptídeo compreende uma mutação C125A ou C125S.

31. Peptídeo de qualquer uma das modalidades 16 a 30, em que o peptídeo compreende V69A, Q74P, N88R ou N88D e uma ou mais das mutações L53I, L56I, L80I, L118I e, opcionalmente, mutação C125A ou C125S.

32. Peptídeo de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o peptídeo não compreende uma mutação que corresponde às posições 30, 31 e/ou 35.

33. Peptídeo de qualquer uma das modalidades anteriores, que adicionalmente compreende um peptídeo Fc.

33A. Peptídeo da modalidade 33, em que o peptídeo Fc compreende uma mutação, usando a numeração Kabat, nas posições L247, L248 e G250, ou usando a numeração EU, nas posições L234, L235 e G237.

33B. Peptídeo da modalidade 33, em que o peptídeo Fc compreende as seguintes mutações: L247A, L248A e G250A (Numeração Kabat) ou L234A, L235A e G237A (numeração EU).

34. Peptídeo da modalidade 33, em que o peptídeo Fc compreende a sequência de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 15.

35. Peptídeo de qualquer uma das modalidades anteriores, que adicionalmente compreende um peptídeo ligante que liga o peptídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 e o peptídeo Fc.

36. Peptídeo da modalidade 35, em que o ligante compreende uma sequência GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 19) ou GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 16).

37. Peptídeo de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o peptídeo compreende uma sequência de SEQ ID NO: 17 a 43.

38. Peptídeo, que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

39. Peptídeo da modalidade 38, que adicionalmente compreende um peptídeo líder N-terminal que possui a sequência de SEQ ID NO: 7.

40. Peptídeo da modalidade 1, que adicionalmente compreende um peptídeo ligante no C-terminal.

41. Peptídeo da modalidade 40, em que o peptídeo ligante compreende a sequência de (GGGGS)n (SEQ ID NO: 10), em que n é 1, 2, 3 ou 4.

42. Peptídeo da modalidade 41, em que n é 1.

43. Peptídeo da modalidade 41, em que n é 2.

44. Peptídeo da modalidade 41, em que n é 3.

45. Peptídeo da modalidade 41, em que n é 4.

46. Peptídeo de qualquer uma das modalidades 40 a 45, que adicionalmente compreende um peptídeo Fc.

47. Peptídeo da modalidade 46, em que o peptídeo Fc compreende a sequência de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 15.

48. Peptídeo da modalidade 47, que adicionalmente compreende um peptídeo líder que possui a sequência de SEQ ID NO: 7 no N-terminal.

49. Peptídeo da modalidade 46, em que o peptídeo Fc está no C-terminal do peptídeo que compreende SEQ ID NO: 27.

50. Peptídeo da modalidade 46, em que o peptídeo Fc está no N-terminal do peptídeo que compreende SEQ ID NO: 27.

51. Peptídeo da modalidade 1, que adicionalmente compreende um peptídeo ligante que liga o peptídeo da SEQ ID NO: 27 e um peptídeo Fc.

52. Peptídeo da modalidade 51, em que o peptídeo ligante é (GGGGS)n (SEQ ID NO: 10), em que n é 1, 2, 3 ou 4.

53. Peptídeo da modalidade 52, em que n é 4.

54. Peptídeo das modalidades 51 a 53, em que o peptídeo Fc compreende a sequência de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 15.

55. Peptídeo das modalidades 51 a 54, em que o peptídeo Fc está no C-terminal do peptídeo que compreende SEQ ID NO:

27.

56. Peptídeo das modalidades 51 a 54, em que o peptídeo Fc está no N-terminal do peptídeo que compreende SEQ ID NO:

27.

57. Peptídeo da modalidade 14, em que o peptídeo compreende um peptídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NOs: 37, 38, 39 ou 40.

58. Composição farmacêutica que compreende um peptídeo de qualquer uma das modalidades anteriores.

59. Método de ativação de células T reguladoras, que compreende o contato de uma célula T reguladora com um peptídeo de qualquer uma das modalidades 1 a 57 ou a composição farmacêutica da modalidade 58.

60. Método de tratamento de um distúrbio inflamatório em um indivíduo, que compreende a administração, a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo de qualquer uma das modalidades 1 a 57 ou da composição farmacêutica da modalidade 58.

61. Método da modalidade 60, em que o distúrbio inflamatório é inflamação, doença autoimune, doenças atópicas, doenças autoimunes paraneoplásicas, inflamação de cartilagem, artrite, artrite reumatoide, artrite juvenil, artrite reumatoide juvenil, artrite reumatoide juvenil pauciarticular, artrite reumatoide juvenil poliarticular, artrite reumatoide juvenil com início sistêmico, espondilite anquilosante juvenil, artrite enteropática juvenil, artrite reativa juvenil, síndrome de Reiter juvenil, síndrome de SEA (soronegatividade, entesopatia e artropatia), dermatomiosite juvenil, artrite psoriática juvenil, esclerodermia juvenil,

lúpus eritematoso sistêmico juvenil, vasculite juvenil,

artrite reumatoide pauciarticular, artrite reumatoide poliarticular, artrite reumatoide de início sistêmico,

(soronegatividade, entesopatia e artropatia),

dermatomiosite, artrite psoriática, esclerodermia,

vasculite, miolite, polimiolite, dermatomiolite,

poliarterite nodosa, granulomatose de Wegener, arterite,

polimialgia reumática, sarcoidose, esclerose, esclerose biliar primária, colangite esclerosante, síndrome de

Sjogren, psoríase, psoríase em placas, psoríase gutata,

psoríase inversa, psoríase pustular, psoríase eritrodérmica,

dermatite, dermatite atópica, aterosclerose, lúpus, doença de Still, lúpus eritematoso sistêmico (LES), miastenia gravis, doença inflamatória intestinal (DII), doença de

Crohn, colite ulcerosa, doença celíaca, esclerose múltipla

(EM), asma, DPOC, rinossinusite, rinossinusite com pólipos,

esofogite eosinofílica, bronquite eosinofílica, doença de

Raynaud, hepatite autoimune, doença de enxerto contra hospedeiro (DECH), doença de enxerto contra hospedeiro crônica esteroides-refratária, rejeição de transplante (por exemplo, transplante de rim, pulmão, coração, pele e similares), lesão renal, vasculite induzida por hepatite C, perda espontânea de gravidez, alopecia, vitiligo, glomerulosclerose segmentar focal (GESF), doença de alteração mínima, nefropatia membranosa, glomerulonefropatia associada a ANCA, glomerulonefrite membranoproliferativa, nefropatia por IgA, nefrite lúpica e similares.

62. Método para promover ou estimular a fosforilação de STAT5 em células T reguladoras, administrando-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo de qualquer uma das modalidades 1 a 57 ou a composição farmacêutica da modalidade 58 a um indivíduo em necessidade do mesmo.

63. Uso de um peptídeo de qualquer uma das modalidades 1 a 57 ou da composição farmacêutica da modalidade 58 na preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio inflamatório.

64. Uso da modalidade 63, em que o distúrbio inflamatório é inflamação, doença autoimune, doenças atópicas, doenças autoimunes paraneoplásicas, inflamação da cartilagem, artrite, artrite reumatoide, artrite juvenil, artrite reumatoide juvenil, artrite reumatoide juvenil pauciarticular, artrite reumatoide juvenil poliarticular, artrite reumatoide juvenil com início sistêmico, espondilite anquilosante juvenil, artrite enteropática juvenil, artrite reativa juvenil, Síndrome de Reiter juvenil, síndrome de SEA

(soronegatividade, entesopatia e artropatia), dermatomiosite juvenil, artrite psoriática juvenil, esclerodermia juvenil,

lúpus eritematoso sistêmico juvenil, vasculite juvenil,

(soronegatividade, entesopatia e artropatia),

dermatomiosite, artrite psoriática, esclerodermia,

vasculite, miolite, polimiolite, dermatomiolite,

poliarterite nodosa, granulomatose de Wegener, arterite,

Sjogren, psoríase, psoríase em placas, psoríase gutata,

psoríase inversa, psoríase pustular, psoríase eritrodérmica,

Crohn, colite ulcerativa, doença celíaca, esclerose múltipla

(EM), asma, DPOC, rinossinusite, rinossinusite com pólipos,

esofogite eosinofílica, bronquite eosinofílica, doença de

Raynaud, hepatite autoimune, doença de enxerto contra hospedeiro (DECH), doença de enxerto contra hospedeiro crônica esteroides-refratária, rejeição de transplante (por exemplo, transplante de rim, pulmão, coração, pele e similares), dano renal, vasculite induzida por hepatite C, perda espontânea de gravidez, alopecia, vitiligo, glomerulosclerose segmentar focal (GESF), doença de mudança mínima, nefropatia membranosa, glomerulonefropatia associada a ANCA, glomerulonefrite membranoproliferativa, nefropatia por IgA, nefrite lúpica e similares.

65. Molécula de ácido nucleico que codifica um peptídeo de qualquer uma das modalidades 1 a 57.

66. Vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico da modalidade 65.

67. Plasmídeo compreendendo a molécula de ácido nucleico da modalidade 65.

68. Célula compreendendo a molécula de ácido nucleico da modalidade 65.

69. Célula compreendendo o plasmídeo da modalidade 67.

70. Célula compreendendo o vetor da modalidade 66.

71. Célula compreendendo ou expressando um peptídeo de qualquer uma das modalidades 1 a 57 ou um peptídeo conforme descrito neste documento.

[0097] Os exemplos a seguir são ilustrativos, mas não limitativos dos compostos, composições e métodos aqui descritos. Outras modificações e adaptações adequadas conhecidas pelos técnicos no assunto estão dentro do escopo das modalidades seguintes.

EXEMPLOS Exemplo 1

[0098] Uma composição terapêutica compreendendo uma proteína de SEQ ID NOs: 11, 12, 13 ou 14 é administrada a um indivíduo que sofre de DII. O sistema imunológico do indivíduo é regulado para baixo e os sintomas da DII são aliviados.

Exemplo 2

[0099] Uma composição terapêutica compreendendo uma proteína de SEQ ID NOs: 3, 4, 5 ou 6, com ou sem a sequência líder, é administrada a um indivíduo que sofre de DII. O sistema imunológico do indivíduo é regulado para baixo e os sintomas da DII são aliviados.

Exemplo 3: Geração de muteínas de IL

[00100] Um vetor pTT5 contendo o gene único que codifica o polipeptídeo de IL-2M humana fundido N-terminalmente (SEQ ID NO: 40) ou C-terminalmente (SEQ ID NO: 41) ao domínio Fc de IgG1 humana foi transfectado em células Expi HEK293. Após 5 a 7 dias, os sobrenadantes das culturas celulares que expressam IL-2Ms foram colhidos, clarificados por centrifugação e filtrados através de um dispositivo de filtragem de 0,22 µm. IL-2Ms foram capturadas em resina proA.

A resina foi lavada com PBS (pH 7,4) e a proteína capturada foi eluída usando ácido acético a 0,25% (pH 3,5), com neutralização utilizando um décimo volume de Tris 1M (pH 8,0). A proteína foi substituída com tampão em 30 mM de HEPES, 150 mM de NaCl (pH 7), e analisada por cromatografia de exclusão de tamanho em uma coluna Superdex 200 3,2/300.

Foi conduzida a análise de 5 µg do material purificado por SDS-PAGE redutora e não redutora em um gel Bis-Tris 4-12%.

As IL-2Ms foram expressas acima de 10 mg/L e foram mais de 95% monodispersas após purificação, tal como mostrado por cromatografia de exclusão de tamanho e SDS-PAGE redutora/não redutora.

Exemplo 4: Moléculas de IL-2M podem se ligar a CD25

[00101] Uma placa de imunossorvente foi revestida com CD25 a uma concentração de 0,5 g/mL em PBS (pH 7,4), 75 µL/poço, e incubada durante a noite a 4°C. Os poços foram lavados com PBS (pH 7,4) contendo 0,05% de Tween-20 (tampão de lavagem) três vezes e depois bloqueados com 200 µL/poço de BSA a 1% em PBS (pH 7,4) (tampão de bloco) por duas horas à temperatura ambiente. Após três lavagens com tampão de lavagem, as moléculas de IL-2M foram diluídas para onze- duas vezes a diluição em série em PBS contendo 1% de BSA e 0,05% de Tween-20 (tampão de ensaio) com 2 nM sendo a concentração mais alta. O material diluído foi adicionado à placa revestida com CD25 a 75 µL/poço durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de três lavagens com tampão de lavagem, um anticorpo biotinilado anti-IL-2 policlonal de cabra, diluído para 0,05 g/mL em tampão de ensaio, foi adicionado à placa a 75 µL/poço durante 1 hora à temperatura ambiente. Após três lavagens com tampão de lavagem, estreptavidina-HRP diluída em tampão de ensaio a 1:5000 foi adicionada à placa a 75 µL/poço durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após três lavagens com tampão de lavagem e 1 lavagem com tampão de lavagem (sem Tween-20), o ensaio foi desenvolvido com TMB e parado com HCl 1N. OD 450nm foi medido. O experimento incluiu controles apropriados para ligação não específica de moléculas de IL-2M à placa/bloco na ausência de CD25 e uma molécula de controle negativo que é incapaz de se ligar a CD25.

[00102] Os resultados indicam que, em concentrações de 2nM-1,9pM, as moléculas de IL-2M são capazes de se ligar a CD25 com EC50s sub-nanomolares. Além disso, não houve detecção de nenhum composto em nenhuma concentração testada quando CD25 não estava presente na superfície da placa, indicando que nenhum dos compostos de teste estava interagindo não especificamente com a superfície da placa (dados não mostrados).

Exemplo 5: Ensaio de P-STAT5 in vitro para determinar a potência e a seletividade de moléculas de IL-2M

[00103] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram preparadas usando tubos FICOLL-PAQUE Premium e Sepmate a partir de sangue total humano heparinizado isolado fresco. As PBMCs foram cultivadas em meio RPMI de soro fetal bovino a 10% na presença de IL-2 ou IL-2M de tipo selvagem do Exemplo 12 durante 20 minutos e depois fixadas durante 10 minutos com BD Cytofix.

[00104] As células fixadas foram permeabilizadas de forma sequencial com BD Perm III e, em seguida, com o tampão de permeabilização BioLegend FOXP3. Após o bloqueio com soro humano por 10 minutos, as células foram coradas por 30 minutos com anticorpos para fosfo-STAT5 FITC, CD25 PE, FOXP3 AF647 e CD4 PerCP Cy5.5 e depois adquiridas em um Attune NXT com leitor de placas. A IL-2M da SEQ ID NO: 23 induz de forma potente e seletiva a fosforilação de STAT5 em T-regs, mas não em T-effs.

Exemplo 6: Imunogenicidade de muteínas de IL-2

[00105] As sequências mutantes de muteína de IL-2 foram analisadas usando o software NetMHCIIPan 3.2, que pode ser encontrado em www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/. Redes neurais artificiais foram usadas para determinar a afinidade peptídica aos alelos de MHC classe II. Nessa análise, peptídeos de 9 resíduos com interação potencialmente direta com as moléculas de MHC de classe II foram reconhecidos como núcleos de ligação. Os resíduos adjacentes aos núcleos de ligação com potencial para influenciar indiretamente a ligação também foram examinados como resíduos de mascaramento. Os peptídeos que compreendem ambos os núcleos de ligação e resíduos de mascaramento foram marcados como ligantes fortes quando seu KD previsto para a molécula de MHC de classe II foi mais baixo do que 50 nM. Ligantes fortes têm maior chance de introduzir imunogenicidade de células T.

[00106] Um total de 9 alelos de MHCII que são altamente representados na América do Norte e Europa foram incluídos na análise in silico. O painel das moléculas de IL-2M (muteínas de IL-2) testadas incluiu as muteínas de IL-2 com mutações L53I, L56I, L80I ou L118I. Apenas alelos de MHCII DRB1_1101, DRB1_1501, DRB1_0701, e DRB1_0101 produziram acertos com qualquer uma das moléculas avaliadas. Os acertos peptídicos para DRB_1501 foram idênticos entre todos os constructos testados, incluindo IL-2 de tipo selvagem com a mutação C125S. A adição de L80I remove um epítopo de célula T para DRB1-0101 [ALNLAPSKNFHLRPR (SEQ ID NO: 60)] e reduz modestamente a afinidade de dois outros epítopos de célula T [EEALNLAPSKNFHLR (SEQ ID NO: 61) e EALNLAPSKNFHLRP (SEQ ID NO: 62)]. Para o alelo de MHCII DRB1-0701, L80I remove um epítopo de célula T [EEALNLAPSKNFHLR (SEQ ID NO: 63)].

Portanto, os dados demonstram que uma muteína de IL-2 que compreende a mutação L80I deve ser menos imunogênica, o que é um resultado surpreendente e inesperado da análise in silico.

Exemplo 7: Geração de muteínas de IL-2 adicionais

[00107] Um vetor pTT5 contendo o gene único que codifica o polipeptídeo único de IL-2M (muteína de IL-2) SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 (e IL-2M de controle; SEQ ID NO: 34) com IL-2M humana ou IL-2M fundido N-terminalmente no domínio Fc de IgG1 humana foi transfectado para células Expi HEK293. Após 5 a 7 dias, os sobrenadantes das culturas celulares que expressam SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 (e IL-2M de controle; SEQ ID NO: 34) foram colhidos, e clarificados por centrifugação e filtração através de um dispositivo de filtragem de 0,22 µm. As SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 (e IL-2M de controle; SEQ ID NO: 34) foram capturadas em resina proA. A resina foi lavada com PBS (pH 7,4) e a proteína capturada foi eluída usando ácido acético a 0,25% (pH 3,5), com neutralização utilizando um décimo volume de Tris 1M (pH 8,0). A proteína teve o tampão substituído por 30 mM de HEPES, 150 mM de NaCl (pH 7), e analisada por cromatografia de exclusão por tamanho em uma coluna Superdex 200 3,2/300. Foi conduzida a análise de 5 µg do material purificado por SDS-PAGE redutora e não redutora em um gel Bis-Tris 4-12%.

[00108] IL-2Ms de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 (e IL-2M de controle; SEQ ID NO: 34) foram expressas acima de 45 mg/L, e foram mais de 95% monodispersas após purificação, tal como mostrado por cromatografia de exclusão de tamanho e SDS-PAGE redutora e não redutora.

Exemplo 8: IL-2Ms podem ligar CD25

[00109] Uma placa imunossorvente foi revestida com CD25 a uma concentração de 0,5 g/mL em PBS (pH 7,4), 75 µL/poço, e incubada durante a noite a 4°C. Os poços foram lavados com PBS (pH 7,4) contendo 0,05% de Tween-20 (tampão de lavagem) três vezes e depois bloqueada com 200 µL/poço de BSA a 1% em PBS (pH 7,4) (tampão de bloco) por duas horas à temperatura ambiente. Após três lavagens com tampão de lavagem, as IL- 2Ms de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 foram diluídas para onze-duas vezes a diluição em série em PBS contendo 1% de BSA e 0,05% de Tween-20 (tampão de ensaio) com 2 nM sendo a concentração mais alta. O material diluído foi adicionado à placa revestida com CD25 a 75 µL/poço durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de três lavagens com tampão de lavagem, um anticorpo biotinilado anti-IL-2 policlonal de cabra diluído a 0,05 g/mL em tampão de ensaio, foi adicionado à placa a 75 µL/poço durante 1 hora à temperatura ambiente. Após três lavagens com tampão de lavagem, estreptavidina-HRP de alta sensibilidade diluída em tampão de ensaio a 1:5000 foi adicionada à placa a 75 µL/poço durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após três lavagens com tampão de lavagem e uma lavagem com tampão de lavagem (sem Tween-20),

o ensaio foi desenvolvido com TMB e parado com HCl 1N. OD 450nm foi medido. O experimento incluiu controles apropriados para ligação não específica das moléculas à placa/bloco na ausência de CD25. Os resultados indicam que, em concentrações de 2nM-1,9pM, as muteínas do Exemplo 7 foram capazes de se ligar a CD25 com EC50s sub-nanomolares. Além disso, não houve detecção de nenhum composto em nenhuma concentração testada quando a CD25 não estava presente na superfície da placa, indicando que nenhum dos compostos de teste estava interagindo não especificamente com a superfície da placa. Assim, as muteínas do Exemplo 7 podem se ligar a CD25.

Exemplo 9: Muteínas de IL-2 do Exemplo 7 são potentes e seletivas

[00110] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram preparadas usando tubos FICOLL-PAQUE Premium e Sepmate a partir de sangue total humano heparinizado isolado fresco. As PBMCs foram cultivadas em meio RPMI de soro fetal bovino a 10% na presença de IL-2 de tipo selvagem ou das muteínas do Exemplo 7 durante 20 minutos e depois fixadas durante 10 minutos com BD Cytofix. As células fixadas foram permeabilizadas de forma sequencial com BD Perm III e depois com tampão de permeabilização BioLegend FOXP3. Após bloqueio com soro humano por 10 minutos, as células foram coradas por 30 minutos com anticorpos para fosfo-STAT5 FITC

(CST), CD25 PE, FOXP3 AF647 e CD4 PerCP Cy5.5 (todos BD) e depois adquiridas em um Attune NXT com leitor de placas. As muteínas de IL-2 do Exemplo 7 mostraram-se potentes e têm seletividade contra Treg em relação a Teff. Verificou-se que a muteína que compreende a mutação L118I apresenta atividade e seletividade aumentadas em comparação com as outras muteínas.

Exemplo 10: Muteínas de IL-2 expandem T-regs em camundongos humanizados

[00111] Camundongos NSG humanizados com células-tronco hematopoiéticas CD34+ humanas foram adquiridos do Jackson Labs. Nos dias 0 e 7, os camundongos foram dosados por via subcutânea com 1 µg de muteína de IL-2 (SEQ ID NO: 34) ou outras muteínas de IL-2 (SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 40). No dia 7, os camundongos foram sacrificados e o sangue total e o baço foram coletados. O sangue total foi dividido em alíquotas em uma placa de poços profundos com 96 poços e fixado por 10 minutos usando BD Fix Lyse. Os esplenócitos foram isolados usando filtros de 70 µm (BD) e os glóbulos vermelhos foram lisados usando tampão de lise RBC da BioLegend. Após lavagem com PBS de soro fetal bovino a 2%, os esplenócitos foram marcados com corante live/dead próximo ao infravermelho (Invitrogen) por 20 minutos e depois fixados por 20 minutos usando o tampão de fixação BioLegend. As células sanguíneas inteiras e os esplenócitos foram permeabilizados usando o tampão de permeabilização BioLegend FOXP3, bloqueadas com soro humano e coradas por 30 minutos com anticorpos contra CD8a FITC humano (BL), CD25 PE humano (BD), FOXP3 AF647 humano (BD), CD4 PerCP Cy5.5 humano (BD), Siglec-8 PE Cy7 humano (BL), CD3 BV421 humano (BL), CD45 BV605 humano (BL), CD56 BV785 humano (BL) e CD45 de camundongo (BV711) e adquiridos em um Attune NXT com leitor de placas.

[00112] Em comparação ao controle de veículo, IL-2Ms de SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40 induziram T-regs humanas seletivamente em baços de camundongos e sangue total em camundongos humanizados. Não houve alterações significativas nas frequências de células NK CD56pos humanas, células T CD3pos, linfócitos T citotóxicos CD8pos, células T auxiliares CD4pos ou T efetoras CD25lo/FOXP3neg. Estes resultados demonstram que as muteínas de IL-2 aumentam a frequência das células T reguladoras.

Exemplo 11: Durabilidade da sinalização induzida por muteínas de IL-2

[00113] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram preparadas usando tubos FICOLL-PAQUE Premium e Sepmate a partir de sangue total humano heparinizado isolado fresco. As PBMCs foram cultivadas em meio RPMI de soro fetal bovino a 10% na presença de IL-2M por 60 minutos.

As células foram, então, lavadas 3 vezes e incubadas por mais 3 horas. As células foram, em seguida, fixadas por 10 minutos com BD Cytofix. As células fixadas foram permeabilizadas de forma sequencial com BD Perm III e depois com o tampão de permeabilização BioLegend FOXP3. Após o bloqueio com soro humano por 10 minutos, as células foram coradas por 30 minutos com anticorpos para fosfo-STAT5 FITC, CD25 PE, FOXP3 AF647 e CD4 PerCP Cy5.5 e depois adquiridas em um Attune NXT com leitor de placas. Todas as quatro muteínas de IL-2 do Exemplo 19 induziram sinalização duradoura em T-reg, mas não em T-eff, em comparação com o controle. A SEQ ID NO: 40 é superior à SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 37. Estes resultados demonstram que a IL-2 pode induzir sinalização duradoura e seletiva em T-reg, o que deve levar a uma maior expansão de T-reg in vivo e permitir doses menos frequentes para alcançar a expansão de T-reg.

[00114] Os exemplos aqui fornecidos demonstram o resultado surpreendente e inesperado de que uma muteína de IL-2 pode funcionar para ativar seletivamente e potentemente T-regs em comparação à T-effs, o que demonstra que as moléculas podem ser usadas para tratar ou melhorar as condições aqui descritas. As muteínas de IL-2, conforme aqui fornecidas, também podem ser geradas e usadas com ou sem fusão com um domínio Fc ou um ligante, conforme aqui fornecido.

[00115] As modalidades foram descritas com referência a exemplos específicos. Estes exemplos não se destinam a limitar as modalidades de forma alguma. Entender-se-á que, para os fins desta divulgação, várias alterações e modificações podem ser feitas dentro do escopo da presente divulgação. Numerosas outras alterações podem ser feitas, as quais serão prontamente sugeridas aos técnicos no assunto e que estão incluídas no escopo da invenção divulgada neste documento e conforme definidas nas reivindicações anexas.

Exemplo 12: Muteínas exibem POI geral e agregação menor.

[00116] Muteínas de IL-2 com as mutações de V69A, Q74P, N88D e C125S e uma das seguintes mutações L53I, L56I, L80I ou L118I ligadas a uma região Fc compreendendo as mutações L234A, L235A e G237A, conforme fornecido neste documento, foram expressas em um vetor pTT5 por transfecção do vetor em células Expi HEK293. A muteína da IL-2 foi ligada ao N- terminal da região Fc com 4 repetições GGGGS (SEQ ID NO: 10). Após 5 a 7 dias, os sobrenadantes das culturas celulares que expressam as diferentes muteínas de IL-2 foram colhidos e clarificados por centrifugação e filtração através de um dispositivo de filtragem de 0,22 µm. As muteínas de IL-2 foram capturadas em resina proA. A resina foi lavada com PBS (pH 7,4) e a proteína capturada foi eluída usando ácido acético a 0,25% (pH 3,5), com neutralização utilizando um décimo volume de Tris 1M (pH 8,0). A proteína teve o tampão substituído por 30 mM de HEPES, 150 mM de NaCl (pH 7) e analisada por cromatografia de exclusão por tamanho em uma coluna SEC AdvanceBio quanto ao percentual de pico de interesse (POI). Os resultados demonstraram que as diferentes muteínas foram expressas acima de 60 mg/L. No entanto, foi surpreendentemente descoberto que as muteínas com a mutação L80I ou L118I foram mais de 90% monodispersas, enquanto as muteínas com as mutações L53I ou L56I não foram, conforme mostrado pela cromatografia de exclusão por tamanho. Assim, as muteínas com a substituição L80I ou L118I tiveram menos agregação. As diferenças na agregação entre as quatro moléculas (muteínas de IL-2 compreendendo L80I, L118I, L53I e L56I) foram surpreendentes devido ao tipo de mutação que estava sendo feita. Portanto, as muteínas com a mutação L80I ou L118I têm uma vantagem surpreendente sobre outras muteínas, pois não agregam tanto quanto outras muteínas.

Exemplo 13: Muteínas de IL-2 têm aumento inesperado de potência

[00117] As muteínas descritas no Exemplo 12 foram analisadas quanto à potência em um ensaio in vitro.

Resumidamente, PBMCs foram isoladas a partir de sangue humano inteiro heparinizado e estimuladas com as diferentes muteínas em uma concentração durante 30 minutos a 37°C. A estimulação foi parada por meio da fixação. Após permeabilização, PBMCs foram coradas para níveis intracelulares de FoxP3 e de fosfo-STAT5 e expressão superficial de CD4 e CD25 e analisadas por citometria de fluxo. As células T reguladoras (T-regs) e as células T efetoras (T-effs) foram bloqueadas como CD4+CD25hiFoxP3+ ou CD4+CD25loFoxP3-, respectivamente. A porcentagem de células que foram positivas para fosfo-STAT5 é mostrada. Este ensaio mede a capacidade das muteínas de estimular especificamente T-regs sem estimular T-effs. Uma curva dose-resposta mais adequada para cada artigo de teste foi usada para calcular um valor de EC50.

[00118] Surpreendentemente, as muteínas com as mutações de L118I, L80I, L56I, ou L53I tinham uma potência aumentada (estimulando T-regs), em comparação com uma muteína de IL-2 sem qualquer destas mutações. A muteína de IL-2 sem uma mutação de L118I, L80I, L56I ou L53I, mas possuindo as mutações V69A, Q74P e N88D, foi de aproximadamente 51 pM.

Cada um dos EC50 para as muteínas compreendendo um de L118I, L80I, L56I ou L53I tinha EC50 de aproximadamente 30, 40, 41 e 45, respectivamente. As diferenças em EC50 para estimular Tregs (sem alterações na estimulação de Teff) foram surpreendentes e não teriam sido previstas para as muteínas possuindo uma das mutações descritas neste exemplo. Os dados também podem ser avaliados comparando-se a razão das muteínas de IL-2 parentais (compreendendo V69A, Q74P, N88D e C125S)

com as muteínas que também compreendem uma das mutações L118I, L80I, L56I ou L53I. O uso dessa proporção normaliza diferentes populações de células que são usadas para diferentes experimentos. Usando esta razão, L118I teve um aumento médio de aproximadamente 25% na potência (erro padrão da média igual a 0,16) em comparação com o controle parental, enquanto as outras mutações tiveram uma diminuição da atividade em comparação com o controle parental usando esta razão.

[00119] Os dados in vitro foram confirmados in vivo para as muteínas possuindo uma das mutações L118I, L80I, L56I ou L53I. Verificou-se que L118I era mais potente que uma muteína sem a mutação L118I in vivo. Resumidamente, os camundongos deficientes em Nod-Scid-IL-2Rgamma (NSG) reconstituídos com células-tronco CD34+ hematopoiéticas humanas foram injetados subcutaneamente com 1 micrograma do artigo ou veículo de teste indicado nos dias 0 e 7. No dia 11, os camundongos foram sacrificados e o sangue foi coletado por punção cardíaca em tubos contendo heparina. Os leucócitos do sangue periférico (PBLs) foram isolados por lise de glóbulos vermelhos e corados com anticorpos reativos aos marcadores humanos CD45, CD3, CD8, CD4, FoxP3, CD25 e CD56. O percentual de células T reguladoras humanas (Tregs, CD45+CD3+CD4+CD25+FoxP3+), células T efetoras ativadas (act Teff, CD45+CD3+CD4+CD25+FoxP3-) e células NK (CD45+CD56+)

foi determinada por citometria de fluxo. A frequência de células CD45+ totais, CD4+ totais e CD8+ totais não mudou.

Resultados semelhantes foram observados nos baços de camundongos. A potência in vivo conforme medida neste ensaio da muteína de IL-2 com a mutação L80I aumentou ligeiramente em comparação com uma muteína sem a mutação L80I e a potência in vivo conforme medida neste ensaio das muteínas com a mutação L56I ou L53I foi quase a mesma de uma muteína sem as mutações. As muteínas foram ligadas pelo N-terminal a uma região Fc, conforme aqui descrito, com um ligante de 20 aminoácidos (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 9). Esse é o ligante que ligou o C-terminal da muteína de IL-2 ao N-terminal da região Fc.

Exemplo 14: Orientação Fc de N-terminal com um ligante de 20 aminoácidos é mais eficaz na estimulação de Tregs.

[00120] Uma muteína de IL-2 com V69A, Q74P e N88D foi fundida a uma região Fc compreendendo as mutações L234A, L235A e G237A usando diferentes comprimentos de repetições de GGGGS (SEQ ID NO: 10). Moléculas de muteína de IL-2 fundidas através do C-terminal da muteína ao N-terminal de IgG1 Fc humana com ligantes compreendendo 3 e 4 repetições de GGGGS (SEQ ID NO: 10) foram testadas para determinar se o comprimento do ligante afetou a potência da muteína de IL-

2. Uma muteína fundida através do seu N-terminal ao C- terminal de IgG1 Fc humana com uma única repetição de GGGGS

(SEQ ID NO: 10) também foi testada. Resumidamente, camundongos deficientes em Nod-Scid-IL-2Rgamma (NSG) reconstituídos com células-tronco hematopoiéticas CD34+ humanas foram injetados subcutaneamente com 1 micrograma das diferentes muteínas de Il-2 com diferentes comprimentos de ligante ou veículo no dia 0. No dia 7, os camundongos foram sacrificados e o sangue foi coletado por punção cardíaca em tubos contendo heparina. Os leucócitos no sangue periférico (PBLs) foram isolados por lise de glóbulos vermelhos e corados com anticorpos reativos aos marcadores humanos CD45, CD3, CD8, CD4, FoxP3, CD25 e CD56. Determinou-se a porcentagem de células T reguladoras humanas (Tregs, CD45+CD3+CD4+CD25+FoxP3+), células T efetoras ativadas (act Teff, CD45+CD3+CD4+CD25+FoxP3-) e células NK (CD45+CD56+) por citometria de fluxo. A frequência das células CD45+ totais, CD4+ totais e CD8+ totais não mudou. Resultados semelhantes foram observados nos baços de camundongos.

[00121] Verificou-se que a muteína fundida ao N- terminal de IgG1 Fc humana com um ligante compreendendo 4 repetições de GGGGS (SEQ ID NO: 10) era a mais potente em comparação com uma muteína com um ligante que tinha apenas 3 repetições de GGGGS (SEQ ID NO: 10) ou uma muteína fundida ao C-terminal de IgG1 Fc humana com uma única repetição de GGGGS (SEQ ID NO: 10). Além disso, embora a proteína com as 4 repetições de GGGGS (SEQ ID NO: 10) tenha sido mais eficaz na expansão de Tregs, a configuração não desencadeou nenhuma expansão diferencial das células NK CD56+. Não se poderia prever que a proteína com muteína Fc fundida N-terminalmente com o ligante mais longo seria a mais potente e também não desencadearia nenhuma expansão diferencial das células NK CD56+.

Exemplo 15: Tratamento de pacientes com artrite reumatoide ativa

[00122] Uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de muteína de IL-2 que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 37, 38, 39 ou 40 foi administrada a pacientes com artrite reumatoide ativa. Verificou-se que as muteínas de IL-2 são eficazes no tratamento de artrite reumatoide ativa nos pacientes.

Exemplo 16: Tratamento de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico ativo

[00123] Uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de muteína de IL-2 que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 37, 38, 39, ou 40 foi administrada a pacientes com lúpus eritematoso sistêmico ativo. Verificou-se que as muteínas de IL-2 são eficazes no tratamento de lúpus eritematoso sistêmico ativo.

Exemplo 17: Tratamento de pacientes com doença do enxerto contra hospedeiro crônica esteroides-refratária

[00124] Uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de muteína de IL-2 que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 37, 38, 39 ou 40 foi administrada a pacientes com doença do enxerto contra hospedeiro crônica esteroides- refratária. Verificou-se que as muteínas da IL-2 são eficazes no tratamento da doença do enxerto contra hospedeiro crônica esteroides-refratária.

Exemplo 18: Muteínas de IL-2 induzem pSTAT5 em Tregs humanas

[00125] PBMCs purificadas a partir de sangue total heparinizado de seis doadores saudáveis foram tratadas com diluições em série de uma proteína de muteína de IL-2 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 39 ou 40 a 37°C por 30 minutos. As células foram fixadas, lavadas, permeabilizadas e lavadas. As células foram coradas com anticorpos que detectam marcadores de superfície e marcadores intracelulares/nucleares (pSTAT5 e FOXP3). Os dados foram coletados em citômetro Attune NxT. As Tregs foram bloqueadas como mononucleares, singletos, CD3pos, CD4pos, CD25hi, FoxP3pos. O percentual de Tregs bloqueadas que expressam STAT5 fosforilada foi medida. As curvas de melhor ajuste foram ajustadas à dose-resposta de pSTAT5 e os valores de EC50 foram determinados. Os valores médios de EC50 de todos os seis doadores foram determinados para IL-2 de SEQ ID NO 39 (37,26 ± 7,30; n = 16) e para IL-2 de SEQ ID NO: 40 (23,11 ± 5,35; n = 15). Os dados demonstram que as muteínas de IL-2 podem induzir pSTAT5 em Tregs humanas. A IL-2 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 40 é mais potente que a sequência de IL-2 compreendendo a SEQ ID NO: 39, mas ambas são ativas em várias populações de células.

Exemplo 19: Muteínas de IL-2 induzem pSTAT5 em PBMCs de macaco in vitro

[00126] PBMCs purificadas a partir de sangue total heparinizado de três macacos saudáveis foram tratadas com diluições em série de uma proteína de muteína de IL-2 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 39 ou 40 a 37°C durante 60 minutos. Fluoróforos anti-CD25 e anti-CD4 conjugados foram adicionados para os 30 minutos finais de tratamento de muteínas de IL-2. As células foram fixadas, lavadas, permeabilizadas e lavadas. As células foram coradas com anticorpos remanescentes que detectam marcadores de superfície e marcadores intracelulares/nucleares (pSTAT5 e FOXP3). Os dados foram coletados em citômetro Attune NxT. As Tregs foram bloqueadas como mononucleares, singletos, CD4pos, CD25hi, FoxP3pos. O percentual de Tregs bloqueadas que expressam STAT5 fosforilada foi medido. Verificou-se que as muteínas de IL-2 induzem pSTAT5 em macacos.

Exemplo 20: Muteínas de IL-2 induzem expansão de células Treg e induzem a proliferação de Treg in vivo

[00127] O sangue total venoso foi coletado em tubos K2EDTA a partir de macacos (cynomolgus) antes da dosagem com muteínas de IL-2 de SEQ ID NO: 39 ou 40 (2 instantes de tempo/cyno, 5 cynos) e após a dosagem com SEQ ID NO: 39 (5 instantes de tempo)/cyno, 2 cynos) ou SEQ ID NO: 40 (5 instantes de tempo/cyno, 3 cynos). Amostras foram divididas em dois e coradas para dois painéis FACS separadamente.

Um era um “painel Treg” e o outro era um painel geral de imunofenotipagem.

As RBCs foram lisadas e as células foram coradas com marcadores de superfície e intracelulares após fixação e permeabilização.

Para a análise de FACs, o número total de células/µL foi determinado por ADVIA.

O número de células de uma dada subpopulação/µL foi, então, calculado com o número total/µL e o percentual do total.

Para cada macaco, o número médio de um determinado tipo de célula/µL dos dois sangramentos pré-dose foi calculado e utilizado para normalizar os sangramentos pós-dose, de modo que foi determinada a “mudança de dobra da pré-dose”. Para analisar citocinas e quimiocinas do soro, o plasma a partir de sangue total K2EDTA foi congelado até a final do estudo.

As quantidades de quimiocina e citocina foram mensuradas por um ensaio MSD multiplex usando diluições em série de um controle padrão.

A média e o intervalo de MCP-1 e IP-10 foram determinados em sangramentos pré-dose.

Verificou-se que ambas as muteínas expandem Treg e induzem a proliferação de

Treg em macacos.

Estes resultados demonstram que as muteínas de IL-2 funcionam em um modelo animal in vivo que é semelhante aos seres humanos. Verificou-se também que as moléculas não expandiram significativamente células Tconv, células CD4 (Tnaive) ou células CD8 (T citotóxicas), células NK nos macacos (primata não humano). Verificou-se também que as moléculas não induziram significativamente quimiocina no soro. Estes dados demonstram que as muteínas de IL-2 podem expandir células Treg e induzir a proliferação de células Treg sem expansão indesejada ou ativação de outras vias.

Assim, as muteínas de IL-2 são surpreendentemente potentes, eficazes e seletivas para expansão e proliferação de Treg.

[00128] Em resumo, as modalidades e exemplos aqui fornecidos demonstram que as muteínas de IL-2 podem funcionar como pretendido e serem usadas para tratar as doenças e condições aqui descritas.

[00129] O presente relatório descritivo contém numerosas citações de patentes, pedidos de patente e publicações. Cada um/uma é incorporado(a) por referência para todos os fins.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Peptídeo caracterizado por compreender uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.

2. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ainda compreender um peptídeo líder N- terminal que possui a sequência da SEQ ID NO: 7.

3. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ainda compreender um peptídeo ligante no C-terminal.

4. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o peptídeo ligante compreender a sequência de (GGGGS)n, em que n é 1, 2, 3 ou 4.

5. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por n ser 1.

6. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por n ser 2.

7. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por n ser 3.

8. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por n ser 4.

9. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ainda compreender um peptídeo Fc.

10. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o peptídeo Fc compreender a sequência de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 15.

11. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por ainda compreender um peptídeo líder que possui a sequência de SEQ ID NO: 7 no N-terminal.

12. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o peptídeo Fc estar no C-terminal.

13. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o peptídeo Fc estar no N-terminal.

14. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ainda compreender um peptídeo ligante que liga o peptídeo de SEQ ID NO: 27 e um peptídeo Fc.

15. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por ainda compreender um peptídeo líder que possui a sequência de SEQ ID NO: 7 no N-terminal.

16. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o peptídeo ligante ser (GGGGS)n, em que n é 1, 2, 3 ou 4.

17. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por n ser 4.

18. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o peptídeo Fc compreender a sequência de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 15.

19. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o peptídeo Fc estar no C-terminal.

20. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o peptídeo Fc estar no N-terminal.

21. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o peptídeo compreender um peptídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 40.

22. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um peptídeo conforme definido na reivindicação

1.

23. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um peptídeo conforme definido na reivindicação

14.

24. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um peptídeo conforme definido na reivindicação

19.

25. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um peptídeo conforme definido na reivindicação

24.

26. Peptídeo caracterizado por compreender uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.

27. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por ainda compreender um peptídeo líder N- terminal que possui a sequência de SEQ ID NO: 7.

28. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por ainda compreender um peptídeo ligante no C-terminal.

29. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o peptídeo ligante compreender a sequência de (GGGGS)n, em que n é 1, 2, 3 ou 4.

30. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por n ser 1.

31. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por n ser 2.

32. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por n ser 3.

33. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por n ser 4.

34. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por ainda compreender um peptídeo Fc.

35. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por o peptídeo Fc compreender a sequência de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 15.

36. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por ainda compreender um peptídeo líder que possui a sequência de SEQ ID NO: 7 no N-terminal.

37. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por o peptídeo Fc estar no C-terminal.

38. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por o peptídeo Fc estar no N-terminal.

39. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por ainda compreender um peptídeo ligante que liga o peptídeo de SEQ ID NO: 26 e um peptídeo Fc.

40. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 39,

caracterizado por ainda compreender um peptídeo líder que possui a sequência de SEQ ID NO: 7 no N-terminal.

41. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por o peptídeo ligante ser (GGGGS)n, em que n é 1, 2, 3 ou 4.

42. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por n ser 4.

43. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por o peptídeo Fc compreender a sequência de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 15.

44. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por o peptídeo Fc estar no C-terminal.

45. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por o peptídeo Fc estar no N-terminal.

46. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por o peptídeo compreender um peptídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 39.

47. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um peptídeo conforme definido na reivindicação

25.

48. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um peptídeo conforme definido na reivindicação

39.

49. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um peptídeo conforme definido na reivindicação

43.

50. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um peptídeo conforme definido na reivindicação

46.

51. Método para ativação de células T reguladoras caracterizado por compreender o contato de uma célula T reguladora com um peptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 ou com a composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 47 a

50.

52. Método para tratar um distúrbio inflamatório em um indivíduo caracterizado por compreender a administração, a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 ou da composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 50.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por o distúrbio inflamatório ser alopecia areata, dermatite atópica, dermatite herpetiforme, psoríase, lúpus, doença do enxerto contra hospedeiro (DECH), inflamação, doença autoimune, doenças atópicas, doenças autoimunes paraneoplásicas, inflamação de cartilagem, artrite, artrite reumatoide, artrite juvenil, artrite reumatoide juvenil, artrite reumatoide juvenil pauciarticular, artrite reumatoide juvenil poliarticular,

artrite reumatoide juvenil com início sistêmico, espondilite anquilosante juvenil, artrite enteropática juvenil, artrite reativa juvenil, síndrome de Reiter juvenil, síndrome de SEA

(síndrome de soronegatividade, entesopatia e artropatia),

dermatomiosite juvenil, artrite psoriática juvenil,

esclerodermia juvenil, lúpus eritematoso sistêmico juvenil,

vasculite juvenil, artrite reumatoide pauciarticular,

artrite reumatoide poliarticular, artrite reumatoide de início sistêmico, espondilite anquilosante, artrite enteropática, artrite reativa, síndrome de Reiter, síndrome de SEA (síndrome de soronegatividade, entesopatia e artropatia), dermatomiosite, artrite psoriática,

esclerodermia, vasculite, miolite, polimiolite,

dermatomiolite, poliarterite nodosa, granulomatose de

Wegener, arterite, polimialgia reumática, sarcoidose,

esclerose, esclerose biliar primária, colangite esclerosante, síndorme de Sjogren, psoríase em placas,

psoríase gutata, psoríase inversa, psoríase pustular,

psoríase eritrodérmica, dermatite, aterosclerose, doença de

Still, lúpus eritematoso sistêmico (LES), miastenia gravis,

doença inflamatória intestinal (DII), doença de Crohn,

colite ulcerosa, doença celíaca, esclerose múltipla (EM),

asma, DPOC, rinossinusite, rinossinusite com pólipos,

esofogite eosinofílica, bronquite eosinofílica, doença de

Guillain-Barre, diabetes mellitus tipo I, tireoidite (por exemplo, doença de Graves), doença de Addison, fenômeno de Raynaud, hepatite autoimune, doença de enxerto contra hospedeiro crônica esteroides-refratária, rejeição de transplante (por exemplo, transplante de rim, pulmão, coração, pele e similares), lesão renal, vasculite induzida por hepatite C, perda espontânea de gravidez, alopecia, vitiligo, glomerulosclerose segmentar focal (GESF), doença de alteração mínima, nefropatia membranosa, glomerulonefropatia associada a ANCA, glomerulonefrite membranoproliferativa, nefropatia por IgA, nefrite lúpica e similares.

54. Método para promover ou estimular fosforilação de STAT5 em células T reguladoras caracterizado por compreender administrar, a um indivíduo em necessidade do mesmo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 ou da composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 50.

55. Uso de um peptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 ou da composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 50 caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio inflamatório.

56. Uso, de acordo com a reivindicação 55,

caracterizado por o distúrbio inflamatório ser alopecia areata, dermatite atópica, dermatite herpetiforme, psoríase,

lúpus, doença de enxerto contra hospedeiro (DECH),

inflamação, doença autoimune, doenças atópicas, doenças autoimunes paraneoplásicas, inflamação da cartilagem,

artrite, artrite reumatoide, artrite juvenil, artrite reumatoide juvenil, artrite reumatoide juvenil pauciarticular, artrite reumatoide juvenil poliarticular,

lúpus eritematoso sistêmico juvenil, vasculite juvenil,

(soronegatividade, entesopatia e artropatia),

dermatomiosite, artrite psoriática, esclerodermia,

vasculite, miolite, polimiolite, dermatomiolite,

poliarterite nodosa, granulomatose de Wegener, arterite,

Sjogren, psoríase em placas, psoríase gutata, psoríase inversa, psoríase pustular, psoríase eritrodérmica, dermatite, aterosclerose, doença de Still, lúpus eritematoso sistêmico (LES), miastenia gravis, doença inflamatória intestinal (DII), doença de Crohn, colite ulcerativa, doença celíaca, esclerose múltipla (EM), asma, DPOC, rinossinusite, rinossinusite com pólipos, esofogite eosinofílica, bronquite eosinofílica, doença de Guillain-Barre, diabetes mellitus tipo I, tireoidite (por exemplo, doença de Graves), doença de Addison, fenômeno de Raynaud, hepatite autoimune, doença de enxerto contra hospedeiro crônica esteroides-refratária, rejeição de transplante (por exemplo, transplante de rim, pulmão, coração, pele e similares), dano renal, vasculite induzida por hepatite C, perda espontânea de gravidez, alopecia, vitiligo, glomerulosclerose segmentar focal (GESF), doença de mudança mínima, nefropatia membranosa, glomerulonefropatia associada a ANCA, glomerulonefrite membranoproliferativa, nefropatia por IgA, nefrite lúpica e similares.

57. Molécula de ácido nucleico caracterizada por codificar um peptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47.

58. Vetor caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 57.

59. Plasmídeo caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 57.

60. Célula caracterizada por compreender a molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 57.

61. Célula caracterizada por compreender o plasmídeo conforme definido na reivindicação 59.

62. Célula caracterizada por compreender o vetor conforme definido na reivindicação 58.

63. Célula caracterizada por compreender ou expressar um peptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 ou um peptídeo conforme aqui descrito.