TW202345889A - ＩＬ２突變體－抗體Ｆｃ嵌段融合蛋白的藥物組合物及其應用 - Google Patents

ＩＬ２突變體－抗體Ｆｃ嵌段融合蛋白的藥物組合物及其應用 Download PDF

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Abstract

本發明涉及IL2突變體-Fc融合蛋白的藥物組合物及其應用。具體而言，本發明公開一種包含IL2突變體融合蛋白的藥物組合物及其製備方法、凍乾製劑及其製備或複溶方法以及根據所述複溶方法獲得的複溶溶液，相應的製藥用途，治療自身免疫性疾病的製品和製備方法，本發明所述藥物組合物包括包含IL2突變體的Fc融合蛋白、緩衝液、滲透壓調節劑和表面活性劑，具有較好的穩定性。

Description

IL2突變體-抗體Fc嵌段融合蛋白的藥物組合物及其應用
本發明涉及藥物製劑領域，具體而言，涉及IL2突變體-抗體Fc嵌段融合蛋白的藥物組合物及其應用。
白血球介素2(interleukin-2，IL2)，最初被鑒定為T細胞生長因數(TCGF)，研究發現IL-2可結合其受體，啟動T細胞、NK細胞等免疫細胞的增殖和活化。IL-2受體包括IL-2Rα亞基(CD25)、IL-2Rβ亞基(CD122)和IL-2Rγ亞基(CD132)，不同的亞基之間可形成親和力不同的受體複合物，包括高親和力受體IL-2Rαβγ，中間親和力受體IL-2Rβγ，低親和力受體IL-2Rα或IL-2Rαβ。不同細胞表達的IL-2R亞基類型有所不同，例如，靜息條件下的傳統T細胞CD4+T、CD8+T表面一般表達IL-2受體β(IL-2Rβ，CD122)、IL-2受體γ(IL-2Rγ，CD132)，幾乎不表達IL-2受體α(IL-2Rα，CD25)，而調節性T細胞(Treg)除了表達IL-2Rβ、IL-2Rγ之外，組成性高表達IL-2Rα。
目前，研究人員透過IL2或其突變體啟動免疫細胞或某個亞群的免疫細胞，治療腫瘤或自身免疫性疾病。例如，高劑量的IL2被批准用於治療惡 性黑色素瘤或轉移性腎細胞癌，IL2聚乙二醇偶聯藥物NKTR-358被批准開展自身免疫性疾病的臨床試驗。進一步開發新的IL2突變體，提高其穩定性、產量和/或改變其與某類受體複合物的結合能力，對IL-2類型藥物的開發具有重要意義。同時，IL2屬於大分子蛋白，在溶液中容易出現顆粒和聚集等穩定性態樣的問題。因此，在獲得新型IL2突變體後，開發獲得適合該新型IL2突變體的製劑體系，確保新型IL2突變體在溶液中的穩定性具有重要意義。
本發明提供一種藥物組合物及其製備方法、凍乾製劑及其製備或複溶方法以及根據所述複溶方法獲得的複溶溶液、相應的製藥用途、治療自身免疫性疾病方法和製品。
第一態樣，本發明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包括包含IL2突變體的抗體Fc嵌段融合蛋白、緩衝液、滲透壓調節劑和表面活性劑；
較佳地，所述IL2突變體與野生型IL2相比，至少包括Y31V、A73L和H79Q突變；
較佳地，所述IL2突變體還進一步包括V91R突變、H16E突變和D20A突變中的一個或多個突變，例如還進一步包括H16E突變和V91R突變；
更佳地，所述IL2突變體具有與SEQ ID NO：3、8~11任一項所示序列相比至少80%同一性的胺基酸序列，例如至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。
所述野生型IL2的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在一些具體實施方式中，所述融合蛋白從N端到C端，依序包括：
(1)IL2突變體、連接子(linker)和抗體Fc嵌段，或
(2)抗體Fc嵌段、連接子和IL2突變體；
較佳的，所述融合蛋白透過抗體Fc嵌段二聚化形成同源二聚體；
較佳地，所述連接子具有(G4S)n的胺基酸序列，n選自1，2，3，4，5或6；
較佳地，所述連接子具有與SEQ ID NO：12所示序列相比至少80%同一性的胺基酸序列，例如至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性；
較佳地，所述抗體Fc嵌段包括N297G突變；
較佳地，所述抗體Fc嵌段具有與SEQ ID NO：13所示序列相比至少80%同一性的胺基酸序列，例如至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性；
更佳地，所述融合蛋白具有與SEQ ID NO：14~18所示序列相比至少80%同一性的胺基酸序列，例如至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。
在一些具體的實施方式中，所述野生型IL2具有入SEQ ID NO：1或2所示的胺基酸序列。
在一些具體實施方式中，所述融合蛋白的濃度約為1~50mg/mL；
例如，所述融合蛋白的濃度約為1~40mg/mL、1~30mg/mL、1~20mg/mL、1~15mg/mL、1~10mg/mL、5~50mg/mL、5~40mg/mL、5~30mg/mL、5~20mg/mL、5~19mg/mL、5~18mg/mL、5~17mg/mL、5~16mg/mL、5~15mg/mL、5~14mg/mL、5~13mg/mL、5~12mg/mL、5~11mg/mL、5~10mg/mL、5~9mg/mL、5~8mg/mL、5~6mg/mL、10~50mg/mL、10~40mg/mL、10~30mg/mL、10~20mg/mL、 10~15mg/mL、20~50mg/mL、20~40mg/mL、20~30mg/mL、30~50mg/mL、30~40mg/mL、40~50mg/mL；
例如，所述融合蛋白的濃度約為1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、30mg/mL、31mg/mL、32mg/mL、33mg/mL、34mg/mL、35mg/mL、36mg/mL、37mg/mL、38mg/mL、39mg/mL、40mg/mL、41mg/mL、42mg/mL、43mg/mL、44mg/mL、45mg/mL、46mg/mL、47mg/mL、48mg/mL、49mg/mL或50mg/mL；或者上述濃度值之間組成的濃度範圍值。
較佳地，所述融合蛋白的濃度約為2mg/mL或5mg/mL。
在一些具體實施方式中，所述緩衝液選自醋酸-醋酸鈉緩衝液、枸檢酸-枸檢酸鈉緩衝液、組胺酸-鹽酸組胺酸、琥珀酸-琥珀酸鈉、或磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液，較佳為醋酸-醋酸鈉緩衝液；和/或，
所述緩衝液的濃度約為1~100mM；
例如，緩衝液的濃度約為1~90mM、1~80mM、1~70mM、1~60mM、1~50mM、1~40mM、1~30mM、1~20mM、1~10mM、10~90mM、10~80mM、10~70mM、10~60mM、10~50mM、10~40mM、10~30mM、10~20mM、20~90mM、20~80mM、20~70mM、20~60mM、20~50mM、20~40mM、20~30mM、30~90mM、30~80mM、30~70mM、30~60mM、30~50mM、30~40mM、40~90mM、40~80mM、40~70mM、40~60mM、40~50mM、50~90mM、50~80mM、50~70mM、50~60mM、60~90mM、60~80mM、60~70mM、70~90mM、80~90mM；
例如，緩衝液的濃度約為1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM；或者上述濃度值之間組成的濃度範圍值；
較佳地，所述緩衝液的濃度約為20mM；和/或，
所述緩衝液的pH值約為4.5~8.0；
例如所述緩衝液的pH值約為4.5~7.5、4.5~7.0、4.5~6.5、4.5~6.0、4.5~5.5、4.5~5.0、5.0~8.0、5.0~7.5、5.0~7.0、5.0~6.5、5.0~6.0、5.0~5.5、5.5~8.0、6~7.5、6.5~7.5、7.0~7.5或7.5~8.0；
例如所述緩衝液的pH值約為，約為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0，或者上述pH值之間組成的濃度範圍值；
較佳地，所述緩衝液的pH值約為5.5。
在一些具體實施方式中，所述滲透壓調節劑選自鹽、胺基酸、糖或糖醇或其組合；較佳地，所述鹽選自氯化鈉、氯化鉀或鹽酸精胺酸；較佳地，所述胺基酸選自甘胺酸、精胺酸、組胺酸、穀胺酸或甲硫胺酸；較佳地，所述糖或糖醇選自蔗糖、海藻糖、甘露醇或山梨醇；
較佳地，所述滲透壓調節劑選自氯化鈉、甘胺酸、鹽酸精胺酸、蔗糖、海藻糖、甘露醇或山梨醇，更佳為蔗糖或鹽酸精胺酸；
更佳地，所述糖或糖醇的濃度約為1~15% w/v，所述鹽的濃度約為50~200mM；例如，所述糖或糖醇的濃度約為1~10% w/v、1~5%w/v或5~10%w/v；例如，所述糖或糖醇的濃度約為1%w/v、1.5% w/v、2% w/v、2.5% w/v、3% w/v、3.5% w/v、4% w/v、4.5% w/v、5ww/v、5.5% w/v、6% w/v、6.5% w/v、7% w/v、 7.5% w/v、8% w/v、8.5% w/v、9% w/v、9.5% w/v、10% w/v、10.5% w/v、11% w/v、11.5% w/v、12% w/v、12.5% w/v、13% w/v、13.5% w/v、14% w/v、14.5% w/v、15% w/v，或者上述濃度值之間組成的濃度範圍值。較佳為4.5%w/v或8%w/v。
更佳地，所述胺基酸的濃度約為1~15%w/v，例如所述胺基酸的濃度約為1~10% w/v、1~5%w/v或5~10%w/v；例如，所述胺基酸的濃度約為1%w/v、1.5% w/v、2% w/v、2.5% w/v、3% w/v、3.5% w/v、4% w/v、4.5% w/v、5% w/v、5.5% w/v、6% w/v、6.5% w/v、7% w/v、7.5% w/v、8% w/v、8.5% w/v、9% w/v、9.5% w/v、10% w/v、10.5% w/v、11% w/v、11.5% w/v、12% w/v、12.5% w/v、13% w/v、13.5% w/v、14% w/v、14.5% w/v、15% w/v，或者上述濃度值之間組成的濃度範圍值。較佳為2%w/v。
更佳地，所述鹽的濃度約為50~200mM；例如，所述鹽的濃度約為50~150mM、50~100mM或100~150mM；例如，所述鹽的濃度約為50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM，或者上述濃度值之間組成的濃度範圍值。較佳為140mM。
更佳地，所述滲透壓調節劑為蔗糖或鹽酸精胺酸。
在一些具體實施方式中，所述表面活性劑為聚山梨酯-80(PS-80)、聚山梨酯20(PS-20)或泊洛沙姆；和/或，
所述表面活性劑的濃度約為0.01~0.1% w/v，例如，0.01% w/v-0.05% w/v、0.05% w/v-0.1% w/v、0.02% w/v-0.08% w/v，例如約為0.01% w/v、0.02% w/v、0.03% w/v、0.04% w/v、0.05% w/v、0.06% w/v、0.07% w/v、0.08% w/v、0.09% w/v或1% w/v，或者上述濃度值之間組成的濃度範圍值。較佳約為0.04% w/v。
在一些具體實施方式中，所述藥物組合物包括所述融合蛋白、醋酸-醋酸鈉緩衝液、蔗糖和聚山梨酯-80；較佳地，所述藥物組合物包括約1~50mg/mL所述融合蛋白、約1~100mM醋酸-醋酸鈉緩衝液、約1~15% w/v蔗糖和約0.01~0.1% w/v聚山梨酯-80，pH值約為4.5~6.0；
更佳地，所述藥物組合物包括約1~30mg/mL、5~30mg/mL、10~30mg/mL、10~25mg/mL、10~20mg/mL、10~15mg/mL、15~20mg/mL、15~30mg/mL或20~30mg/mL所述融合蛋白，約10~50mM或10~30mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，約1~15% w/v、1~10%w/v、5~15%w/v、5~10%w/v或10~15%w/v蔗糖和約0.01~0.1% w/v、0.02~0.06% w/v聚山梨酯-80，pH值約為4.5~6.0或4.5~5.5；
更佳地，所述藥物組合物包括約1~10mg/mL所述融合蛋白、約10~30mM醋酸-醋酸鈉緩衝液、約5~10% w/v蔗糖和約0.01~0.1% w/v聚山梨酯-80，pH值約為4.5~6.0；
更佳地，所述藥物組合物包括約2mg/mL或5mg/mL所述融合蛋白，約20mM醋酸-醋酸鈉緩衝液、約8% w/v蔗糖和約0.04% w/v聚山梨酯-80，pH約為5.5。
在一些具體實施方式中，所述藥物組合物包括融合蛋白、醋酸-醋酸鈉緩衝液、鹽酸精胺酸和聚山梨酯-80；較佳地，所述藥物組合物包括約1~50mg/mL所述融合蛋白、約1~100mM醋酸-醋酸鈉緩衝液、約50~200mM鹽酸精胺酸和約0.01~0.1% w/v聚山梨酯-80，pH值約為4.5~6.0；
更佳地，所述藥物組合物包括約1~30mg/mL、5~30mg/mL、10~30mg/mL、10~25mg/mL、10~20mg/mL、10~15mg/mL、15~20mg/mL、15~30mg/mL或20~30mg/mL所述融合蛋白，約10~50mM或10~30mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，約 50~200mM、50~150mM、100~150mM鹽酸精胺酸和約0.01~0.1% w/v、0.02~0.06% w/v聚山梨酯-80，pH值約為4.5~6.0或4.5~6.0；
更佳地，所述藥物組合物包括約1~10mg/mL所述融合蛋白、約10~30mM醋酸-醋酸鈉緩衝液、約120~150mM鹽酸精胺酸和約0.01~0.1% w/v聚山梨酯-80，pH值約為4.5~6.0。
更佳地，所述藥物組合物包括約2mg/mL或5mg/mL所述融合蛋白、約20mM醋酸-醋酸鈉緩衝液、約140mM鹽酸精胺酸和約0.04% w/v或0.06% w/v聚山梨酯-80，pH值約為5.5。
在一些具體實施方式中，所述藥物組合物為靜脈、肌內或皮下注射液，較佳為皮下注射液。
第二態樣，本發明還提供前述藥物組合物的製備方法，所述方法包括將所述融合蛋白與所述緩衝液、滲透壓調節劑和表面活性劑混合配置的步驟；較佳地，所述方法包括將所述融合蛋白的原液透過超濾濃縮置換到所述緩衝液中的步驟。
第三態樣，本發明還提供一種凍乾製劑，其中，所述凍乾製劑由前述藥物組合物凍乾後形成。
第四態樣，本發明還提供製備前述凍乾製劑的方法，其中，所述方法包括冷凍乾燥前述藥物組合物的步驟。
第五態樣，本發明還提供製備含IL2突變體的抗體Fc嵌段融合蛋白的複溶溶液的方法，其中包括將前述凍乾製劑用溶劑複溶，較佳地，所述溶劑為注射用水。
第六態樣，本發明還提供根據前述方法製備得到的含IL2突變體的抗體Fc嵌段融合蛋白的複溶溶液。
第七態樣，本發明還提供前述藥物組合物、凍乾製劑或複溶溶液在製備用於治療自身免疫性疾病或增生性疾病的藥物中的應用；
較佳地，所述自身免疫性疾病選自類風濕關節炎、僵直性脊椎炎、系統性紅斑狼瘡、皮膚紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、IgA腎病、乾燥症候群、多肌炎、皮肌炎、硬皮病、銀屑病、斑塊狀銀屑病、斑禿、多發性硬化症、肌萎縮側索硬化症、炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫肝炎、I型糖尿病、自身免疫性血管炎、濕疹或哮喘；
較佳地，所述增生性疾病選自贅生物、實體瘤、血液瘤、惡性腹水或惡性胸水；其中，所述實體瘤可為良性或惡性，原發性或轉移性，所述惡性實體瘤可為癌或肉瘤，例如，上皮細胞癌、內皮細胞癌、鱗狀細胞癌、畸胎瘤、肺部腫瘤、乳頭瘤病毒引起的癌、腺癌、癌腫、黑色素瘤、血管肉瘤、神經母細胞瘤、轉移性肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、Merkel細胞癌、卵巢癌、腎細胞癌、轉移性腎癌、頭頸癌、膀胱癌、非肌層浸潤性膀胱癌；所述血液瘤可選自白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤，例如B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、T細胞大顆粒淋巴細胞白血病。
第八態樣，本發明還提供前述藥物組合物、凍乾製劑或複溶溶液，用於治療自身免疫性疾病或增生性疾病；
較佳地，所述自身免疫性疾病選自類風濕關節炎、僵直性脊椎炎、系統性紅斑狼瘡、皮膚紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、IgA腎病、乾燥症候群、多肌炎、皮肌炎、硬皮病、銀屑病、斑塊狀銀屑病、斑禿、多發性硬化症、肌萎縮側索硬化 症、炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫肝炎、I型糖尿病、自身免疫性血管炎、濕疹或哮喘；
較佳地，所述增生性疾病選自贅生物、實體瘤、血液瘤、惡性腹水或惡性胸水；其中，所述實體瘤可為良性或惡性，原發性或轉移性，所述惡性實體瘤可為癌或肉瘤，例如，上皮細胞癌、內皮細胞癌、鱗狀細胞癌、畸胎瘤、肺部腫瘤、乳頭瘤病毒引起的癌、腺癌、癌腫、黑色素瘤、血管肉瘤、神經母細胞瘤、轉移性肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、Merkel細胞癌、卵巢癌、腎細胞癌、轉移性腎癌、頭頸癌、膀胱癌、非肌層浸潤性膀胱癌；所述血液瘤可選自白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤，例如B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、T細胞大顆粒淋巴細胞白血病。
第九態樣，本發明還提供一種治療自身免疫性疾病的方法，其中，所述方法包括給予受試者有效量的前述藥物組合物或複溶溶液；較佳地，所述自身免疫性疾病選自類風濕關節炎、僵直性脊椎炎、系統性紅斑狼瘡、皮膚紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、IgA腎病、乾燥症候群、多肌炎、皮肌炎、硬皮病、銀屑病、斑塊狀銀屑病、斑禿、多發性硬化症、肌萎縮側索硬化症、炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫肝炎、I型糖尿病、自身免疫性血管炎、濕疹或哮喘。
在一些具體的實施方式中，所述有效量為0.001~10mpk，例如0.001mpk、0.002mpk、0.003mpk、0.004mpk、0.005mpk、0.006mpk、0.007mpk、0.008mpk、0.009mpk、0.01mpk、0.02mpk、0.03mpk、0.04mpk、0.05mpk、0.06mpk、0.07mpk、0.08mpk、0.09mpk、0.1mpk、0.2mpk、0.3mpk、0.4mpk、0.5mpk、 0.6mpk、0.7mpk、0.8mpk、0.9mpk、1mpk、2mpk、3mpk、4mpk、5mpk、6mpk、7mpk、8mpk、9mpk或10mpk，或者上述有效量之間組成的有效量範圍值。
第十態樣，本發明還提供一種治療增生性疾病地方法，其中所述方法包括給予受試者有效量的前述藥物組合物或複溶溶液；較佳地，所述增生性疾病選自贅生物、實體瘤、血液瘤、惡性腹水或惡性胸水；其中，所述實體瘤可為良性或惡性，原發性或轉移性，所述惡性實體瘤可為癌或肉瘤，例如，上皮細胞癌、內皮細胞癌、鱗狀細胞癌、畸胎瘤、肺部腫瘤、乳頭瘤病毒引起的癌、腺癌、癌腫、黑色素瘤、血管肉瘤、神經母細胞瘤、轉移性肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、Merkel細胞癌、卵巢癌、腎細胞癌、轉移性腎癌、頭頸癌、膀胱癌、非肌層浸潤性膀胱癌；所述血液瘤可選自白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤，例如B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、T細胞大顆粒淋巴細胞白血病。
第十一態樣，本發明還提供一種製品，其包括容器，所述容器裝有前述藥物組合物、凍乾製劑或複溶溶液。
術語定義和說明
除非本發明另外定義，與本發明相關的科學和技術術語應具有本領域普通技術人員所理解的含義。
除非另有說明，本發明所述術語“IL2”或“IL-2”，是指來自任何脊椎動物源，包括哺乳動物例如靈長類(例如人)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)和馴養或農業哺乳動物的任何天然或重組IL-2。本發明所述“IL2”或“IL-2”包括未加工成熟的IL-2(例如包含N端信號肽的IL-2)以及產生在細胞中加工成熟的IL-2的任何形式。本發明所述“IL2”或“IL-2”還包括IL-2的天然變體和片段，例如剪切變體 或等位基因變體。本發明所述“IL2”或“IL-2”還包括非天然存在的突變體，例如透過基因工程人工改造的IL-2突變體。
“野生型IL-2”是在其他態樣與IL-2突變體相同，只是在IL-2突變體的每個突變胺基酸位置保持野生型胺基酸的IL-2形式。示例性地，如果IL-2突變體是未加工成熟的IL-2，那麼該突變體的野生型形式是未加工成熟的IL-2；如果IL-2突變體是加工成熟的IL-2，那麼該突變體的野生型形式是加工成熟的IL-2；如果IL-2突變體是IL-2的截短形式，那麼該突變體的野生型形式是具有野生型序列的相應的IL-2截短形式。示例性地，本發明所述“野生型IL-2”可具有如下所示胺基酸序列：
Figure 112107617-A0202-12-0012-1
Figure 112107617-A0202-12-0012-2
(SEQ ID NO：1)；其中第125位胺基酸殘基“X”代表C、S、A或V。
本發明術語“突變”包含胺基酸取代、缺失、插入或其任意組合。本發明所述“突變”可以使用本領域公知的遺傳學或化學方法生成胺基酸突變，包括但不限於定點誘變、PCR、基因合成等方法。
本發明所述IL-2突變體的“突變位點”編號從SEQ ID NO：1所示“野生型IL-2”的第1位胺基酸殘基A開始計數。示例性地，本發明“Y31突變”是指IL-2突變體在SEQ ID NO：1所示野生型IL-2第31位胺基酸殘基(Tyr，Y)處發生突變。示例性地，本發明“Y31V突變”是指IL-2突變體在SEQ ID NO：1所示野生型IL-2第31位處胺基酸殘基由Y(Tyr)突變位V(Val)。
本發明用於突變位點間的術語“/”表示“和”的意思，是指“/”前後的突變在同一個IL-2突變體中同時存在。示例性地，“Y31/A73/H79”是指在同一個IL-2突變體同時在Y31位點、A73位點和H79位點發生突變，“Y31V/A73L/H79Q”是指在同一個IL-2突變體同時存在Y31V、A73L和H79Q突變。
本發明術語“融合蛋白”(fusion protein)是指，透過基因重組方法、化學方法或其它適當方法將兩個或多個基因的編碼區連接，在同一調控序列控制下表達基因重組所得的蛋白質產物。本發明的融合蛋白中，兩個或多個基因的編碼區之間可由編碼連接肽的序列於一個或數個位置融合。連接肽可用於構建本發明的融合蛋白。
本發明術語“連接子(Linker)”是指，在本發明中用於連接IL-2與另一蛋白分子或蛋白片段，以保證蛋白的正確折疊和穩定性的肽。所述另一分子包括但不限於抗體Fc嵌段。本發明的“連接子”較佳為(GGGGS)n，其中n可以為0、1、2、3、4、5或6。
本發明術語“抗體Fc嵌段”是指，免疫球蛋白鏈恆定區，特別是免疫球蛋白重鏈恆定區的羧基端或其中的一部分，無抗原結合活性，是抗體分子與效應分子或細胞相互作用的部位。本發明所述“Fc”可以是任何Fc或其變體，來源於人或非人哺乳動物。例如，免疫球蛋白Fc可包括重鏈CH1、CH2、CH3、CH4的兩個或更多結構域與免疫球蛋白鉸鏈區的組合。Fc可以來源於不同的種屬，較佳人的免疫球蛋白。根據重鏈恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類，主要有5類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中一些還可進一步分成亞類(同種型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4；IgA-1和IgA-2。“Fc”較佳包括至少一個免疫球蛋白鉸鏈區，以及IgG的CH2和CH3結構域。更佳包括 IgG1的一個CH2結構域，一個CH3結構域和一個免疫球蛋白鉸鏈區，鉸鏈區起始胺基酸位置可以變動。除非另外說明，否則本發明所述Fc、恆定區或抗體中的胺基酸殘基根據如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interes，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU編號體系，也稱作EU索引，進行編號。
本發明術語“藥物組合物”是指含有一種或多種本發明所述IL-2突變體、融合蛋白、核酸片段、載體或宿主細胞的混合物，所述混合物還含有其他組分，所述其他組分包括但不限於其在藥學上可接受的運載體、稀釋劑或助劑。本發明所述藥物組合物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
本發明術語“治療”是指外科手術或藥物處理(surgical or therapeutic treatment)，其目的是預防、減緩(減少)治療物件中不希望的生理變化或病變，如自身免疫性疾病(如系統性紅斑狼瘡)的進展。有益的或所希望的臨床結果包括但不限於症狀的減輕、疾病程度減弱、疾病狀態穩定(即，未惡化)、疾病進展的延遲或減慢、疾病狀態的改善或緩和、以及緩解(無論是部分緩解或完全緩解)，無論是可檢測的或不可檢測的。需要治療的物件包括已患有病症或疾病的物件以及易於患上病症或疾病的物件或打算預防病症或疾病的對象。當提到減緩、減輕、減弱、緩和、緩解等術語時，其含義也包括消除、消失、不發生等情況。
本發明術語“受試者”是指接受對如本發明所述的特定疾病或病症(如自身免疫性疾病)的治療的生物體。物件和患者的實例包括接受疾病或病症治 療的哺乳動物，如人、靈長類動物、豬、山羊、兔、倉鼠、貓、狗、豚鼠、牛或其他牛科家族成員、綿羊和馬等。
本發明術語“有效量”指單獨給予或與另一治療劑組合給予細胞、組織或物件時能有效防止或緩解疾病病症或該疾病進展的治療劑用量。“有效量”還指足以緩解症狀，例如治療、治癒、防止或緩解相關醫學病症，或治療、治癒、防止或緩解這些病症的速度增加的化合物用量。當將活性成分單獨給予個體時，治療有效劑量單指該成分。當應用某一組合時，治療有效劑量指產生治療作用的活性成分的組合用量，而無論是組合、連續或同時給予。
本發明術語“自身免疫病”指特徵是物件對其自身的細胞、組織和/或器官產生免疫反應而引起的細胞、組織和/或器官損傷的物件病症。示例性地，自身免疫病包括但不限於類風濕關節炎、僵直性脊椎炎、系統性紅斑狼瘡、皮膚紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、IgA腎病、乾燥症候群、多肌炎、皮肌炎、硬皮病、銀屑病、斑塊狀銀屑病、斑禿、多發性硬化症、肌萎縮側索硬化症、炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫肝炎、I型糖尿病、自身免疫性血管炎、濕疹或哮喘。
本發明術語“增生性疾病”指細胞或組織的生長不受調節和/或異常生長，可導致發展不需要的病況或疾病的病況，可為或可不為癌性的，其包括但不限於贅生物、實體瘤、血液瘤、惡性腹水或惡性胸水。本發明“實體瘤”可為良性(benign)或惡性(maligant)，原發性(Primary)或轉移性(metastatic)；惡性實體瘤可為癌(carcinomas)或肉瘤(sarcomas)。示例性地，本發明“實體瘤”包括但不限於上皮細胞癌、內皮細胞癌、鱗狀細胞癌、畸胎瘤、肺部腫瘤、乳頭瘤病毒引起的癌、腺癌、癌腫、黑色素瘤、血管肉瘤、神經母細胞瘤、轉移性肺癌、 非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、Merkel細胞癌、卵巢癌、腎細胞癌、轉移性腎癌、頭頸癌、膀胱癌、非肌層浸潤性膀胱癌。示例性地，本發明“血液瘤”包括但不限於白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤，例如B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、T細胞大顆粒淋巴細胞白血病。
本發明術語“IL-2受體α亞基”(IL-2Rα)，又稱“CD25”，指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物如靈長類(例如人)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)的任何天然IL-2受體α亞基或其突變體，包括“全長”的未加工的IL-2受體α亞基以及源自細胞中的加工的任何形式的IL-2受體α亞基，還包括天然存在的IL-2受體α亞基變體，例如剪接變體或等位變體，還包括在天然IL-2受體α亞基基礎上經過人工改造的突變體。
本發明術語“IL-2受體β亞基”(IL-2Rβ)，又稱“CD122”，指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物如靈長類(例如人)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)的任何天然IL-2受體β亞基或其突變體，包括“全長”的未加工的IL-2受體β亞基以及源自細胞中的加工的任何形式的IL-2受體β亞基，還包括天然存在的IL-2受體β亞基變體，例如剪接變體或等位變體，還包括在天然IL-2受體β亞基基礎上經過人工改造的突變體。
本發明術語“IL-2受體γ亞基”(IL-2Rγ)，又稱“CD132”，指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物如靈長類(例如人)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)的任何天然IL-2受體γ亞基或其突變體，包括“全長”的未加工的IL-2受體γ亞基以及源自細胞中的加工的任何形式的IL-2受體γ亞基，還包括天然存在的IL-2受體γ亞基變體，例如剪接變體或等位變體，還包括在天然IL-2受體γ亞基基礎上經過人工改造的突變體。
本發明術語“Treg”，又稱“調節性T細胞”或“T調節細胞”，是指一種能抑制其它T細胞的應答的特殊化CD4+T細胞類型。Treg的特徵在於表達IL-2受體α亞基(CD25)和轉錄因數叉頭框P3(Forkhead box protein P3，FOXP3)，並在誘導和維持對抗原的外周自體耐受中起著關鍵作用。Treg需要IL-2來實現其功能和發育以及其抑制性特徵的誘導。
如本文所用，術語“百分比(%)序列一致性”和“百分比(%)序列同一性”可互換，是指在為達到最大百分比序列一致性而比對序列和引入空位(如果需要)(例如，為了最佳比對，可以在候選和參比序列中的一個或兩個中引入空位，並且出於比較的目的，可以忽略非同源序列)之後，候選序列的胺基酸(或核苷酸)殘基與參比序列的胺基酸(或核苷酸)殘基相同的百分比。出於確定百分比序列一致性的目的，可以用本領域技術人員熟知的多種方式來實現比對，例如使用公眾可得的電腦軟體，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAIi)軟體。本領域技術人員可以確定用於測量比對的適當參數，包括需要在被比較序列的全長範圍實現最大比對的任何演算法。例如，用於與候選序列進行比較而比對的參比序列可以顯示候選序列在候選序列的全長或候選序列的連續胺基酸(或核苷酸)殘基的選定部分上表現出從50%至100%的序列同一性。出於比較目的而比對的候選序列的長度可以是例如參比序列的長度的至少30%(例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%)。當候選序列中的位置被與在參比序列中的相應位置相同的胺基酸(或核苷酸)殘基佔據時，則這些分子在那個位置是相同的。
圖1 小鼠體重變化曲線DTH模型小鼠給予CsA，AMG592和IL2-1-2注射液後的體重變化曲線，每組10只小鼠。資料點代表組內動物平均體重，誤差線代表標準誤(SEM)。
圖2 小鼠體重變化率曲線DTH模型小鼠在給予CsA，AMG592和IL2-1-2注射液後的體重變化率。每組10只小鼠。資料點代表組內動物平均體重變化率，誤差線代表標準差(SEM)。
圖3 DTH模型小鼠耳片厚度變化曲線DTH模型小鼠在給予CsA，AMG592和IL2-1-2注射液後的耳片厚度變化曲線。每組10只小鼠。資料點代表組內平均耳片厚度變化值，誤差線代表標準誤(SEM)。****P<0.0001，與vehicle control組相比。
圖4 DTH模型小鼠在給予CsA，AMG592和IL2-1-2注射液後的耳片厚度變化率曲線。每組10只小鼠。資料點代表組內平均耳片厚度變化值，誤差線代表標準誤(SEM)。****P<0.0001，與vehicle control組相比。
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以透過市售購買獲得的常規產品。
本發明實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
關於實施例1-5的說明
1.超濾濃縮換液
如無特別說明，下述實施例中的超濾濃縮換液是指：將蛋白原液加入到對應超濾管中，使用離心機進行超濾濃縮，蛋白被截留，蛋白原液的緩衝液從超濾膜流穿，達到蛋白濃縮的目的，然後加入需替換的目標溶液，原蛋白原液的緩衝液被稀釋，繼續超濾濃縮，濃縮完畢後繼續加入需替換的目標溶液，繼續超濾濃縮，重複操作，直到換液完畢。
2.英文縮寫及其含義
如無特別說明，下述英文縮寫具有如下表所示的含義：
Figure 112107617-A0202-12-0019-3
Figure 112107617-A0202-12-0020-4
3.實施例5涉及的IL2突變體融合蛋白的結合活性檢測方法
(1)包被：選擇pH9.6的碳酸鹽緩衝液(50mM Na2CO3-NaHCO3,pH9.6)作為包被液，將人IL-2R alpha蛋白(Acro，ILA-H52H9)用包被液稀釋至0.5μg/mL，100μl/孔加入ELISA盤，2~8℃包被過夜(>16h)。
(2)封閉：洗盤，之後，按300μl/孔加入含3%BSA的PBS，37℃封閉1h，之後洗盤。
(3)樣品稀釋：IL2突變體融合蛋白以200ng/mL作為起始濃度進行稀釋(詳見表2)。
Figure 112107617-A0202-12-0020-5
注：取120μL配置好的樣品1，加入280μL樣品稀釋液，混勻後，即得樣品2；取120μL配置好的樣品2，加入280μL樣品稀釋液，混勻後，即得樣品3。樣品4~8的稀釋依序類推。
(4)按100μl/孔加入IL2突變體融合蛋白的稀釋樣品，37℃孵育40~80min。
(5)洗滌後，加入按1：10000(v/v)進行稀釋的鼠抗人IgG Fc γ-HRP(Jackson Immuno，209-035-098)，100μl/孔，37℃孵育40~80min。
(6)洗滌後，顯色液TMB(Thermo，34029)以100μl/孔加至ELISA盤中，室溫避光反應5~9min後100μl/孔加入1M硫酸終止反應，2min內使用酵素免疫分析儀進行讀盤，測量波長為450nm，參比波長為630nm。
(7)用Molecular Devices酵素免疫分析儀自帶的軟體SoftMax Pro或GraphPad Prism或同類型分析軟體，採用四參數回歸分別計算供試品和對照品的EC50。按以下公式計算供試品相對活性：供試品相對結合活性(%)=對照品EC50/供試品EC50×100，供試品相對活性在70%~130%範圍之間時，判為合格。
實施例1 IL2突變體融合蛋白的製備和純化
1.IL2突變體融合蛋白的設計
(1)使用多種演算法，設計提高IL2熱穩定性的突變位點Y31V/A73L/H79Q。
(2)使用多種演算法，設計減弱IL2與IL2受體βγ亞基複合物相互作用的功能性突變位點V91R、H16E、D20A或H16E/V91R。
(3)組合上述熱穩定性突變和功能性突變，獲得分別包含以下組合突變的IL2突變體：
Y31V/A73L/H79Q/V91R；
Y31V/A73L/H79Q/H16E；
Y31V/A73L/H79Q/D20A；
Y31V/A73L/H79Q/H16E/V91R。
為延長半衰期，進一步透過連接子將IL2熱穩定突變體或組合突變體與Fc連接，構成融合蛋白(下稱IL2突變體融合蛋白)，各元件及其整體序列如表3所示。
與野生型IL2融合蛋白(SEQ ID NO：19)相比，本發明所述IL2突變體融合蛋白具有以下特點：
(1)經DSF法分析，與野生型IL2融合蛋白相比，含熱穩定性突變的IL2突變體融合蛋白的Tm值均升高：IL2突變體1-連接子-Fc的Tm值上升約8~9℃，IL2突變體1-2-連接子-Fc的Tm值升高12℃以上，IL2突變體1-3-連接子-Fc的Tm值上升8~9℃，IL2突變體1-4-連接子-Fc的Tm值上升約9~10℃，IL2突變體1-5-連接子-Fc的Tm值上升約11~12℃。
(2)與野生型IL2融合蛋白相比，含功能性突變的IL2突變體融合蛋白與細胞表面的人源IL2受體βγ二聚體的結合活性被抑制，CD4+CD25-FoxP3-T細胞或者CD8+T細胞內的STAT5磷酸化水準的啟動顯著降低，對Treg細胞增殖的影響與野生型IL2融合蛋白相似，對NK細胞的增殖水準顯著降低。
(3)與野生型IL2融合蛋白或Fc-連接子-IL2突變體6相比，IL2突變體1-2-連接子-Ec在藥效(DTH模型小鼠和GVHD小鼠模型)態樣顯示更好的療效，在藥代態樣顯示更高的暴露量和生物利用度，以及更長的半衰期，其中皮下給藥表現更為明顯。
(4)選擇IL2突變體1-2-連接子-Fc(Y31V/A73L/H79Q/V91R，SEQ ID NO：15)進行後續的製程開發。
Figure 112107617-A0202-12-0022-6
Figure 112107617-A0202-12-0023-7
Figure 112107617-A0202-12-0024-8
Figure 112107617-A0202-12-0025-9
2. IL2突變體融合蛋白的表達
IL2突變體融合蛋白利用CHO作為宿主細胞進行表達，在OPM-CHO CD063培養基(廠家：奧浦邁，貨號：C483260)中進行培養，培養週期不超過14天，反應器控制參數為pH 6.8~7.2，溶解氧(DO)為20%~80%，轉速75RPM~80RPM，初始培養溫度36.0℃~37.0℃；當培養至第6天時，降低培養溫度至34.0±0.5℃直到收穫。
3. IL2突變體融合蛋白的純化
IL2突變體融合蛋白的純化採用多步驟層析、濃縮和過濾單元操作依序對IL2突變體融合蛋白進行純化：發酵收穫液上清經過Protein A親和層析(AT ProteinA Diamond Plus)進行捕獲。捕獲後的IL2突變體融合蛋白溶液採用低pH孵育處理以滅活潛在的病毒。IL2突變體融合蛋白溶液中和後透過深層過濾除去沉澱。然後依序進行陽離子交換層析(Diamond S)以去除HCP和聚集體等雜質，以及陰離子交換層析(POROS 50HQ)以去除HCD,HCP和脫落Protein A等雜質。透過納濾膜包過濾以去除潛在的內外源病毒。然後用超濾膜包對IL2突變體融合蛋白溶液進行濃縮和緩衝液置換。最後添加輔料並調節濃度，過濾，獲得IL2突變體融合蛋白原液。在後續實施例中，透過超濾濃縮換液處理，將原液置換至對應的製劑體系。
實施例2~5 針對實施例1中的IL2突變體1-2-連接子-Fc(V91R/Y31V/A73L/H79Q,SEQ ID NO：15)開發維持其穩定性的製劑處方
實施例2 緩衝體系的篩選
1.篩選方案
(1)設計12種不同的緩衝液處方體系F1-F12，具體處方體系如表4所示。(2)透過超濾濃縮換液處理，將實施例1獲得的IL2突變體融合蛋白原液置換至F1-F12中，調整蛋白濃度為2mg/mL。(3)透過25℃加速穩定性試驗和40℃加速穩定性試驗，綜合考察IL2突變體融合蛋白在12種緩衝體系中的穩定性，篩選出最優的緩衝體系，用於後續輔料和表面活性劑的篩選。考察指標包括外觀、pH值、蛋白濃度、純度(SEC-HPLC)、CE-SDS(NR)、CE-SDS(R)、動態光散射(DLS)。考察方案詳見表4。
表4 製劑緩衝體系和篩選考察方案
Figure 112107617-A0202-12-0027-10
注：X=外觀，pH，蛋白濃度，DLS，SEC-HPLC，CE-SDS(NR &R)。
2.緩衝體系的篩選結果
緩衝體系篩選主要結果匯總如下所示：
Figure 112107617-A0202-12-0027-11
Figure 112107617-A0202-12-0028-12
Figure 112107617-A0202-12-0028-13
Figure 112107617-A0202-12-0028-14
Figure 112107617-A0202-12-0029-15
Figure 112107617-A0202-12-0029-16
Figure 112107617-A0202-12-0029-17
Figure 112107617-A0202-12-0030-18
Figure 112107617-A0202-12-0030-19
Figure 112107617-A0202-12-0030-20
Figure 112107617-A0202-12-0031-21
Figure 112107617-A0202-12-0031-22
Figure 112107617-A0202-12-0032-23
Figure 112107617-A0202-12-0032-24
Figure 112107617-A0202-12-0032-25
Figure 112107617-A0202-12-0033-26
3.考察結果
(1)外觀優劣排序：F1、F3>F2、F7、F8、F9、F11>F10、F12>F4、F5、F6。
(2)pH值：12種緩衝體系的pH值穩定，無顯著性變化。
(3)蛋白濃度優劣排序：F1、F2、F3、F6、F7、F8、F9、F11、F12>F5>F4、F10。
(4)DLS優劣排序：F1、F5、F9>F6、F7、F8>F3、F4、F10、F11、F12>F2。
(5)SEC-HPLC優劣排序：F2、F3、F5、F6、F7、F8、F9>F4、F10>F1>F11、F12。
(6)CE-SDS(NR)優劣排序：F2、F3、F6>F1、F5、F7、F8、F9>F4、F10>F11、F12。
(7)CE-SDS(R)優劣排序：F8、F9>F3、F6>F2、F7、F10>F1、F4、F5、F11、F12。
總結：經過綜合考量25℃加速穩定性試驗和40℃加速穩定性試驗中檢測到的各指標，處方F3(20mM醋酸-醋酸鈉，pH5.5)優於其他處方，顯示出更好的穩定性，因此選擇F3進行下一步開發。
實施例3 輔料的篩選
1.篩選方案
在實施例2篩選得到的最優緩衝體系(20mM醋酸-醋酸鈉，pH5.5)基礎上，設計7個處方，獨立考察加入氯化鈉、甘胺酸、鹽酸精胺酸、蔗糖、海藻糖、甘露 醇或山梨醇後，IL2突變體融合蛋白(IL2突變體融合蛋白濃度為2mg/mL)的穩定性，篩選出1個最優製劑處方進行後續的表面活性劑篩選。考察指標包括：外觀、pH值、濃度、SEC-HPLC、DLS、CE-SDS(NR&R)，具體處方組成和考察方案見表15。
Figure 112107617-A0202-12-0034-27
注：X=外觀、pH值、濃度、DLS、SEC-HPLC、CE-SDS(NR&R)。
2.輔料的篩選結果
輔料篩選主要結果匯總如下所示。
Figure 112107617-A0202-12-0034-28
Figure 112107617-A0202-12-0035-29
Figure 112107617-A0202-12-0035-30
Figure 112107617-A0202-12-0035-31
Figure 112107617-A0202-12-0035-32
Figure 112107617-A0202-12-0036-33
Figure 112107617-A0202-12-0036-34
Figure 112107617-A0202-12-0036-35
Figure 112107617-A0202-12-0037-36
Figure 112107617-A0202-12-0037-38
Figure 112107617-A0202-12-0037-39
Figure 112107617-A0202-12-0037-40
Figure 112107617-A0202-12-0038-41
3.考察結果
外觀優劣排序：F3-2>F3-1>F3-3>F3-5>F3-4、F3-6>F3-7。
pH值優劣排序：各組之間資料無顯著差異。
濃度優劣排序：各組之間資料無顯著差異。
DLS優劣排序：F3-2>F3-1>F3-3、F3-4、F3-5、F3-6>F3-7。
SEC-HPLC優劣排序：F3-1、F3-3、F3-4、F3-5、F3-6>F3-7>F3-2。
CE-SDS(R)優劣排序：F3-1、F3-3、F3-4、F3-5、F3-6>F3-7>F3-2。
CE-SDS(NR)優劣排序：F3-2、F3-3>F3-4>F3-5>F3-7>F3-6>F3-1。
總結：根據外觀的表現，首先排除在長期穩定性2~8℃中外觀出現顆粒的組別F3-4、F3-5、F3-6和F3-7。含有甘胺酸的F3-1處方，在40℃-4W時，CE-SDS(NR)檢測到的低聚體含量高於F3-2和F3-3，說明IL-2蛋白在F3-1處方中，更易於降解。F3-2的SEC-HPLC檢測指標與其他組別差異不大，CE-SDS(R)在40℃-4W 時其他峰比例較高，但在長期穩定性2~8℃和25℃中與其他組別無顯著差異。因此，綜合考慮穩定性考察資料，F3-2處方和F3-3處方優於其他處方，表現出良好的穩定性。選擇F3-2處方(含140mM鹽酸精胺酸)和F3-3處方(含8% w/v蔗糖)進一步考察加入表面活性劑後處方的穩定性。
實施例4 表面活性劑的考察
1.考察方案
在F3-2處方和F3-3處方的基礎上，考察加入表面活性劑PS-80後處方的穩定性。處方情況詳見表22。考察方案詳見表23。考察指標包括外觀、pH、蛋白濃度、DLS、SEC-HPLC、CE-SDS(NR &R)、不溶性微粒(MFI)。根據考察結果選擇合適的製劑處方，用於處方穩定性確認。
Figure 112107617-A0202-12-0039-43
Figure 112107617-A0202-12-0039-44
Figure 112107617-A0202-12-0040-45
注：
X=外觀，pH，蛋白濃度，DLS，SEC，CE-SDS(NR &R)，不溶性微粒(MFI)。
振搖試驗(300rpm，25℃)：25℃，300rpm，持續振搖。
凍融試驗(-80~25℃)：連續多輪凍融，每輪凍融：將樣品放置到-80℃下，到凍結為止，之後放置到25℃下，到完全融化，形成1輪凍融。
2.篩選結果
主要結果匯總如下所示：
Figure 112107617-A0202-12-0040-46
Figure 112107617-A0202-12-0041-47
Figure 112107617-A0202-12-0041-48
Figure 112107617-A0202-12-0042-49
Figure 112107617-A0202-12-0042-50
Figure 112107617-A0202-12-0042-51
Figure 112107617-A0202-12-0042-52
Figure 112107617-A0202-12-0043-54
Figure 112107617-A0202-12-0043-55
Figure 112107617-A0202-12-0044-56
Figure 112107617-A0202-12-0044-57
Figure 112107617-A0202-12-0045-58
Figure 112107617-A0202-12-0046-59
Figure 112107617-A0202-12-0046-60
3.考察結果
本實施例考察表面活性劑聚山梨酯80(PS80)對蛋白在pH5.5醋酸體系中的保護作用。根據結果顯示，蛋白在20mM醋酸-醋酸鈉，140mM精胺酸鹽酸鹽，0.04%或0.06% PS80(w/v)條件下，2mg/mL及5mg/mL的濃度，對於高溫、反復凍融和振搖均有良好的耐受性；蛋白在20mM醋酸-醋酸鈉，8%蔗糖(w/v)，0.04% PS80(w/v)條件下，2mg/mL的蛋白濃度，對於高溫、反復凍融和振搖也有良好的耐受性。各處方之間在外觀、pH、濃度、蛋白粒徑(DLS)、SEC-HPLC、CE(NR)無明顯差異；處方F3-3-1使用8%蔗糖作為輔料，與其他使用鹽酸精胺酸的處方相比，40℃-4W時，在蛋白純度態樣CE-SDS(R)的結果更優，其他峰中占比為2.68%，低於其他處方的4.25%~5.05%。綜上所述，PS80可有效保護蛋白耐受環境和生產過程中的剪切力，防止蛋白聚集。
4.成藥性研究
考察5mg/mL IL-2突變體融合蛋白在20mM醋酸-醋酸鈉、pH5.2、8%蔗糖(w/v)、0.02% PS80(w/v)體系中的穩定性，結果顯示，5mg/mL IL2突變體融合蛋白在成藥性研究的處方中表現出的良好的成藥性，詳見表32。
Figure 112107617-A0202-12-0047-61
Figure 112107617-A0202-12-0048-62
5.結論
考慮到在篩選表面活性劑時，與其他處方相比，處方F3-3-1在CE-SDS(R)態樣顯示更佳的結果，同時考慮到2mg/mL和5mg/mL均屬於低濃度蛋白，且5mg/mL IL2突變體融合蛋白在與F3-3-1相似處方的成藥性研究中顯示良好的穩定性，因此，選取5mg/mL，20mM醋酸-醋酸鹽、pH5.5、8%蔗糖(w/v)、0.04% PS80(w/v)作為下一步處方確認穩定性研究的目標處方。
實施例5 處方確認穩定性
1.處方確認穩定性方案
選擇目標處方(5mg/mL IL2突變體融合蛋白、20mM醋酸-醋酸鈉、pH5.5、8%蔗糖(w/v)、0.04% PS80(w/v))進行處方確認穩定性研究：將1mL液體製劑分裝至2mL西林瓶中，使用膠塞和鋁塑蓋組成密閉的包裝系統，分別正置和倒置，考察其穩定性，考察方案見表33。
Figure 112107617-A0202-12-0048-63
備註：X=外觀、pH值、蛋白濃度、icIEF、SEC-HPLC、CE-SDS(NR)、CE-SDS(R)、不溶性顆粒(MFI)、結合活性試驗。
2.處方確認穩定性結果
處方確認穩定性主要結果匯總見下表。
Figure 112107617-A0202-12-0049-64
Figure 112107617-A0202-12-0050-65
Figure 112107617-A0202-12-0050-66
3處方確認穩定性研究結論
2-8℃低溫放置3個月和25℃加速穩定性考察3個月，正置和倒置樣品在常規檢測指標、不溶性微粒、純度、電荷異質體、活性等態樣均沒有顯著改變，且正置和倒置樣品之間無明顯差異。40℃加速穩定性考察4周，電荷變體的主峰下降9.2%，主要趨於酸性峰值，純度和電荷變體發生顯著變化。
綜上，在低溫(2-8℃)即時穩定性和25℃加速試驗的考察過程中，樣品的常規檢測指標、不溶性微粒、純度、電荷異質體、活性等均沒有顯著改變，各指標均在品質標準範圍內，說明IL2突變體融合蛋白在本處方中具有較好的穩定性。在高溫40℃加速穩定性考察實驗中，純度、電荷異質體態樣有下降趨勢，說明本發明所示製劑對高溫敏感。
實施例6 IL2突變體融合蛋白注射液在DTH模型小鼠單藥藥效學研究
本實施例在KLH誘導的遲發性超敏反應(DTH)模型小鼠上評價IL2突變體融合蛋白注射液的單藥藥效，其中IL2突變體融合蛋白為IL2突變體1-2-連接子-Fc(V91R/Y31V/A73L/H79Q)，下稱IL2-1-2，序列如SEQ ID NO：15所示。陽性對照採用Fc-連接子-IL2突變體6(V91K)，即AMG592，序列如SEQ ID NO：20所示。所述IL2-1-2和AMG592的注射液處方均為5mg/mL IL2-1-2或AMG592、20mM醋酸-醋酸鈉、pH5.5、8%蔗糖(w/v)、0.04% PS80(w/v)。
6.1 動物分組
使用6-8周齡的BALB/c小鼠，稱量每只小鼠的體重，以小鼠體重隨機分組分配到G0-G7組8個實驗組中，每組10只，分組當天開始給藥，記為Day 0，IL2-1-2和AMG592各劑量組均每三天皮下注射給一次藥，CsA每天一次腹腔注射給藥，給藥持續到實驗終點。
6.2 動物模型構建方案
6.2.1 試劑配製
(1)3mg/ml KLH：稱取凍乾粉，以PBS配置成3mg/ml KLH溶液。
(2)1mg/ml KLH乳劑：將KLH(3mg/ml)：IFA：CFA體積比為1：1：1，用連通管注射器法將抗原乳化，可使抗原充分乳化形成粘稠的乳劑。
(3)1mg/ml KLH溶液：3mg/ml KLH用PBS 3倍稀釋為1mg/ml。
6.2.2 DTH模型造模方法
取BALB/c小鼠，第0天在偏右側背部兩點注射總量100μl濃度為1mg/ml的KLH乳劑(KLH、IFA、CFA體積比1：1：1乳化)致敏；正常對照組注射等體積不含KLH的乳劑；第5天，每只小鼠右耳皮內注射10μl濃度為1mg/ml KLH溶液刺激小鼠，使模型小鼠局部皮膚組織產生遲發性超敏反應症狀。在右耳局部注射KLH前及注射後24h、48h、72h、96h，使用千分尺測量小鼠右耳厚度，以評價不同處理組小鼠局部遲發性超敏反應程度。
6.3 分組給藥方案如表35所示
Figure 112107617-A0202-12-0052-67
6.4 檢測指標
6.4.1 體重檢測：分組前稱取動物體重，動物分組後每三天一次稱取小鼠體重，以g為單位，保留小數點後一位。
6.4.2 小鼠耳片厚度測量：
(1)刺激前，用數顯外徑千分尺測量每只小鼠右耳片厚度，作為本底值
(2)刺激後，在24h、48h、72h、96h測定小鼠耳片厚度。
6.4.3 一般臨床觀察：適應性飼養期和實驗期間每週最少觀察2次，觀察內容包括但不限於動物精神狀態、飲食情況等，如有意外情況，必須在實驗記錄本(紙)上進行記錄。
6.5 實驗終止
6.5.1給藥間隔時間應注意觀察動物健康狀態，若出現以下任何一項或多項情況時，應暫停給藥，直至動物恢復正常狀態：
(1)動物體重低於開始藥物處理時體重的81%停止給藥，恢復至開始藥物處理時體重的90%繼續給
(2)給藥後，動物行動遲緩或異常，或有急性應激現象的發生；
6.5.2 實驗動物人道終點，在實驗過程中，當動物狀態出現異常時，對動物的健康狀態進行評估，決定是否進行治療，是否可以繼續進行實驗，或是否實施安樂死。
6.5.3安樂死，小鼠刺激後96h結束實驗或實施人道終點時，使用過量CO2將動物窒息安樂死。
6.6 統計學分析方法
測定和觀察的原始資料必須進行記錄。基於原始資料進行分析處理，結果分析用平均數和標準誤表示(Mean±SEM)。同時，對資料進行統計學分析，對小鼠耳朵厚度變化的分析採用Two-way ANOVA進行分析，對小鼠在第10天時的體重分析採用One-way ANOVA分析，P<0.05認為有統計學意義。
6.7結果與討論
6.7.1 IL2-1-2注射液在DTH模型上對小鼠體重的影響
實驗動物的體重作為間接測定藥物毒性的參考指標。給予CsA、AMG592和不同劑量的IL2-1-2後小鼠體重及體重變化率見圖1、2及表36。三天一次皮下注射給予DTH模型小鼠各治療藥物，在實驗週期內的觀察中，小鼠體重有所波動，除激素給藥CsA組小鼠體重有所下降，但是未有小鼠體重下降超過10%，其他給藥組小鼠體重均呈上升趨勢。所有小鼠狀態均無異常，無其他發病或死亡現象，可見CsA在10mg/kg、AMG592在1mg/kg以及IL2突變體1-2在0.03mg/kg，0.1mg/kg，0.3mg/kg和1mg/kg劑量下，治療均可耐受。
Figure 112107617-A0202-12-0054-68
a平均值±標準誤(SEM),**P<0.005。
6.7.2 IL2-1-2注射液對DTH模型小鼠耳片厚度變化的影響
各治療組DTH模型小鼠耳片厚度的變化見圖3-4。DTH模型發病在KLH刺激後48h達到頂峰，模型組小鼠在發病高峰時耳片厚度變化值為15.7mm×10-2，比小鼠初始耳片厚度增加了74.1%，模型構建成功，IL2-1-2注射液在1、0.3、0.1和0.03mg/kg治療組小鼠耳片厚度增加2.45，4.01，9.09和12.26mm×10-2，比KLH刺激前小鼠耳片變化了10.2%，22.0%，41.3%和53.6%。陽性藥物CsA 10mg/kg和AMG592 1mg/kg對該模型也具有明顯的治療作用，與溶媒對照組相比，顯示 出一定的治療效果(P<0.0001)，但兩者的治療效果不如0.3和1mg/kg IL2-1-2。綜上所述，IL2-1-2在KLH誘導的DTH模型小鼠上具有明顯的治療效果。
實施例7 IL2突變體融合蛋白注射液在BALB/c小鼠上藥效動力學研究
本實施例在BALB/c小鼠上評價IL2突變體融合蛋白注射液的藥效動力學特性，其中IL2突變體融合蛋白為IL2突變體1-2-連接子-Fc(V91R/Y31V/A73L/H79Q)，下稱IL2-1-2，序列如SEQ ID NO：15所示。陽性對照採用Fc-連接子-IL2突變體6(V91K)，即AMG592，序列如SEQ ID NO：20所示。所述IL2-1-2和AMG592的注射液處方均為5mg/mL IL2-1-2或AMG592、20mM醋酸-醋酸鈉、pH5.5、8%蔗糖(w/v)、0.04% PS80(w/v)。
7.1 動物分組
將6-8周齡的BALB/c小鼠適應性飼養後，稱量每只小鼠的體重，使用EXCEL以小鼠體重基於亂數字的隨機分組分配到G1-G5組5個實驗組中，每組5只，分組當天開始給藥，記為Day 1。
7.2 分組給藥方案，如表37所示。
Figure 112107617-A0202-12-0055-69
7.3 檢測指標
7.3.1 體重檢測：分組前稱取動物體重，動物分組後，取血前稱量體重，以g為單位。
7.3.2 流式細胞術對小鼠周邊血進行免疫細胞分型
在給藥後第4天，安樂死小鼠後心臟穿刺，收集周邊血。免疫細胞表面標誌物(CD3+、CD4+、CD25+)及核內因數(Foxp3+、Ki-67+)螢光標籤抗體進行標記。透過如下FACS方法進行免疫細胞計數及分群分析：
(1)終點安樂死小鼠後，心臟穿刺，收集小鼠周邊血至EDTA-2K抗凝管內。輕柔倒轉抗凝管，使血液與抗凝劑充分混合以防止其凝固。(2)將300μl未凝結的全血轉移到流式管內。向流式管內加入細胞表面標誌物(CD3+、CD4+、CD25+)的抗體混合物，室溫避光孵育20分鐘。(3)向流式管內加入1ml裂解液來裂解紅細胞，室溫避光孵育5分鐘。20℃ 400g/rcf離心6分鐘，棄去上清。(4)重複步驟(3)，再次裂解紅細胞。(5)用4ml清洗液(PBS)重懸細胞。將細胞懸液經濾膜過濾後轉移到新的流式管內。(6)邊振盪邊向流式管內逐滴滴加500μl固定液，4℃避光孵育過夜。(7)向流式管內加入2ml穿膜穿核液並振盪，4℃ 500g/rcf離心流式管5分鐘，棄去上清。(8)重複步驟(7)，用3ml穿膜穿核液再次處理細胞。(9)向流式管內加入核內因數(Foxp3+、Ki-67+)的抗體混合物，4℃避光孵育40分鐘，每隔20分鐘將流式管振盪一次。(10)向流式管內加入4ml清洗液並振盪，4℃ 500g/rcf離心流式管5分鐘，棄去上清並用200μl PBS重懸細胞。(11)室溫下渦旋平衡計數微球至少30秒。向流式管內加入50μl計數微球，在流式細胞儀上進行FACS檢測，每個流式管在上機前都需要充分振盪。(12)根據FACS結果用FlowJo軟體分析免疫細胞的類型，根據計數微球的說明計算細胞數量。
7.3.3 一般臨床觀察：適應性飼養期和實驗期間每週最少觀察2次，觀察內容包括但不限於動物精神狀態、飲食情況等，如有意外情況，必須在實驗記錄本(紙)上進行記錄。
7.4 實驗終止
7.4.1 給藥間隔時間應注意觀察動物健康狀態，若出現以下任何一項或多項情況時，應暫停給藥，直至動物恢復正常狀態：
Figure 112107617-A0202-12-0057-80
動物體重低於開始藥物處理時體重的81%停止給藥，恢復至開始藥物處理時體重的90%繼續給藥；
Figure 112107617-A0202-12-0057-81
給藥後，動物行動遲緩或異常，或有急性應激現象的發生；
7.4.2 實驗動物人道終點，在實驗過程中，當動物狀態出現異常時，對動物的健康狀態進行評估，決定是否進行治療，是否可以繼續進行實驗，或是否實施安樂死。
7.4.3 安樂死，致敏後第26天實驗終點時，使用過量CO2將動物窒息安樂死。
7.5 統計學分析方法
測定和觀察的原始資料必須進行記錄。基於原始資料進行分析處理，結果分析用平均數和標準誤表示(Mean±SEM)。
7.6 結果與討論
7.6.1 IL2-1-2注射液對BALB/c小鼠周邊血免疫細胞的影響
BALB/c小鼠接受不同劑量IL2-1-2給藥處理後，周邊血免疫細胞計數相比於溶媒對照組小鼠變化倍數如表38所示：皮下注射IL2-1-2可觀察到對小鼠Treg細胞增殖的顯著促進作用。相比於溶媒對照組，IL2-1-2或AMG592給藥3天後，顯 著刺激了Treg細胞。0.1，0.3，1mg/kg IL2-1-2皮下給藥後，小鼠周邊血Treg細胞計數變化的倍數分別為13.73，35.27和12.05。1mg/kg AMG592給藥組小鼠Treg細胞計數增高程度高於1mg/kg IL2-1-2給藥組小鼠，但低於0.3mg/kg給藥組小鼠，該結果表明IL2-1-2只需在相對較低的劑量即可對Treg細胞有較好促進作用。Treg/CD4+比例變化倍數展現在表39中。實驗中觀察到CD4+Foxp3細胞或CD3+CD4-細胞未被啟動或輕度活化。
Figure 112107617-A0202-12-0058-70
Figure 112107617-A0202-12-0058-71
7.7 結論
結果表明皮下注射IL2-1-2注射液可顯著促進BALB/c小鼠周邊血中Treg細胞增殖，且小鼠對受試分子給藥劑量明顯耐受。
實施例8 IL2突變體融合蛋白注射液在SD大鼠上藥效動力學研究
本實施例在SD大鼠上評價IL2突變體融合蛋白注射液的藥效動力學特性，其中IL2突變體融合蛋白為IL2突變體1-2-連接子-Fc(V91R/Y31V/A73L/H79Q)，下稱IL2-1-2，序列如SEQ ID NO：15所示。所述IL2-1-2的注射液處方均為5mg/mL IL2-1-2、20mM醋酸-醋酸鈉、pH5.5、8%蔗糖(w/v)、0.04% PS80(w/v)。
8.1 動物分組
將6-8周齡的SD大鼠適應性飼養後，隨機分配到6個實驗組中，每組3只雄性和3只雌性。分組當天開始給藥(記為第1天)，IL2-1-2注射液分別於第1天、第8天、第15天和第22天經皮下或尾靜脈注射給藥4次。
8.2 分組給藥方案如表40所示。
Figure 112107617-A0202-12-0059-72
注：s.c.：皮下注射，i.v.：靜脈注射
8.3 觀測指標
8.3.1 體重監測
分組後及每次給藥前稱取動物體重，以g為單位記錄。
8.3.2 大鼠周邊血內免疫細胞表型流式分析
分別於第1天給藥前及給藥後第4天、第11天和第25天收取大鼠周邊血。免疫細胞表面標誌物(CD3+、CD4+、CD25+)及核內因數(Foxp3+、Ki-67+)用 螢光標籤抗體進行標記。免疫細胞數量透過下面的螢光啟動細胞分選方法(FACS)進行計算：
(1)從大鼠頸靜脈收集全血到含有EDTA-2K的抗凝管內。輕柔倒轉抗凝管，使血液與抗凝劑充分混合以防止其凝固。(2)將300μl未凝結的全血轉移到流式管內。向流式管內加入細胞表面標誌物(CD3+、CD4+、CD25+)的抗體混合物，室溫避光孵育20分鐘。(3)向流式管內加入1ml裂解液來裂解紅細胞，室溫避光孵育5分鐘。20℃ 400g/rcf離心流式管，棄去上清。(4)重複步驟(3)，再次裂解紅細胞。(5)用4ml清洗液(PBS)重懸細胞。將細胞懸液經濾膜過濾後轉移到新的流式管內。(6)邊振盪邊向流式管內逐滴滴加500μl固定液，4℃避光孵育過夜。(7)向流式管內加入2ml穿膜穿核液並振盪，4℃ 500g/rcf離心流式管5分鐘，棄去上清。(8)重複步驟(7)，用3ml穿膜穿核液再次處理細胞。(9)向流式管內加入核內因數(Foxp3+、Ki-67+)的抗體混合物，4℃避光孵育40分鐘，每隔20分鐘將流式管振盪一次。(10)向流式管內加入4ml清洗液並振盪，4℃ 500g/rcf離心流式管5分鐘，棄去上清並用200μl PBS重懸細胞。(11)室溫下渦旋平衡計數微球至少30秒。向流式管內加入50μl計數微球，在流式細胞儀上進行FACS檢測，每個流式管在上機前都需要充分振盪。(12)
根據FACS結果用FlowJo軟體分析免疫細胞的類型，根據計數微球的說明計算細胞數量。
8.3.3 一般臨床觀察
適應性飼養期和實驗期間每週最少進行2次臨床觀察，觀察內容包括但不僅限於動物的健康狀態、表現、日常活動、精神狀態、飲食情況等。如有意外情況，必須在實驗記錄本(紙)上進行記錄。
8.4 實驗終止
8.4.1 實驗過程中及給藥間隔內應注意觀察動物的健康狀態。若出現以下任何一項或多項情況時，應暫停給藥，直至動物恢復正常狀態：
(1)動物體重低於藥物處理前體重的81%時應停止給藥，恢復至藥物處理前體重的90%時可以繼續給藥；
(2)給藥後，動物行動遲緩或異常，或有急性應激現象發生。
8.4.2 人道終點
透過對動物的健康狀況進行評估來決定治療或實驗是否繼續進行，或是出現以下任何一項或多項情況時是否實施安樂死：
(1)動物行動異常或癱瘓；
(2)動物體重低於分組前體重的20%；
(3)動物體溫過低，處於瀕死狀態等。
8.4.3 安樂死
人道終點或實驗結束時，用過量CO2使動物安樂死。
8.5.統計學分析
結果分析用平均數和標準誤表示(Mean±SEM)。
8.6 結果
8.6.1 IL2-1-2對大鼠PBMC內免疫細胞數量和比例的影響
SD大鼠在IL2-1-2給藥處理後周邊血內免疫細胞的數量比例變化見表41。IL2-1-2經皮下和尾靜脈注射到SD大鼠體內後均能引起Treg細胞的擴增。與對照相比，低劑量的IL2-1-2(0.005mg/kg皮下注射或0.002mg/kg尾靜脈注射)在給藥後第4天到第25天內表現出輕微的促進Treg細胞擴增的作用。皮下注射中等劑 量的IL2-1-2(0.05mg/kg)後，大鼠周邊血中的Treg細胞的數量在第4天時增加到了基線值的9.55倍，並在第25天時維持在基線值的3.16倍。皮下注射高劑量的IL2-1-2(1mg/kg)後，大鼠周邊血內Treg細胞的數量在第11天時達到峰值(基線值的13.8倍)，並在第25天時降低至基線值的3.18倍。尾靜脈注射高劑量的IL2-1-2(1mg/kg)後，大鼠周邊血內Treg細胞的數量在第4天和第11天時均有顯著升高，分別為基線值的21.25倍和30.13倍。但與其他處理組相似的是，Treg細胞的數量在第25天時同樣降低到了基線值的3.26倍。這一現象有可能是大鼠經多次給藥後體內產生了抗藥抗體(ADA)所引起。Treg細胞中Ki-67+細胞的擴增模式也與Treg細胞數量增加的趨勢一致。
Treg/CD4+細胞的數量比例變化見表42。低劑量(0.005mg/kg皮下注射或0.002mg/kg尾靜脈注射)和中等劑量(0.05mg/kg皮下注射)的IL2-1-2對大鼠周邊血內CD4+ Foxp3-細胞和CD3+CD4-細胞數量不具有或有輕微的啟動作用，但觀察到了高劑量(1mg/kg皮下注射或1mg/kg尾靜脈注射)的IL2-1-2能夠輕微啟動上述細胞的擴增。
Figure 112107617-A0202-12-0062-73
Figure 112107617-A0202-12-0063-74
注：結果以平均值±標準誤表示
Figure 112107617-A0202-12-0063-75
注：結果以平均值±標準誤表示
8.7 結論
以上實驗結果表明，IL2-1-2經皮下和尾靜脈注射到SD大鼠體內均能夠引起Treg細胞的增殖，並且SD大鼠對各個劑量的IL2-1-2均表現出良好的耐受性。

Claims (19)

  1. 一種藥物組合物，其特徵在於，所述藥物組合物包括：包含IL2突變體和抗體Fc嵌段的融合蛋白、緩衝液、滲透壓調節劑和表面活性劑；所述融合蛋白從N端到C端依序包括：
    (1)IL2突變體、連接子(linker)和抗體Fc嵌段，或
    (2)抗體Fc嵌段、連接子(linker)和IL2突變體；
    較佳地，所述IL2突變體與野生型IL2相比，至少包括Y31V、A73L和H79Q突變；更佳地，所述IL2突變體還進一步包括V91R突變、H16E突變和D20A突變中的一個或多個突變，例如進一步包括H16E突變和V91R突變；所述野生型IL2的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示；更佳地，所述IL2突變體具有與SEQ ID NO：3、8~11任一項所示序列相比至少80%同一性的胺基酸序列。
  2. 如請求項1所述的所述的藥物組合物，其中，
    所述連接子具有與SEQ ID NO：12所示序列相比至少80%同一性的胺基酸序列，或所述連接子具有(G4S)n所示序列，其中，n選自1，2，3，4，5或6；所述抗體Fc嵌段具有N297G突變，或所述抗體Fc嵌段具有與SEQ ID NO：13所示序列相比至少80%同一性的胺基酸序列；
    較佳地，所述融合蛋白具有與SEQ ID NO：14~18任一項所示序列相比至少80%同一性的胺基酸序列；
    更佳的，所述融合蛋白透過抗體Fc嵌段二聚化形成同源二聚體。
  3. 如請求項1~2任一項所述的藥物組合物，其中，所述融合蛋白的濃度為1~50mg/mL。
  4. 如請求項1~3任一項所述的藥物組合物，其中，所述緩衝液選自：醋酸-醋酸鈉緩衝液、枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液、組胺酸-鹽酸組胺酸、琥珀酸-琥珀酸鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液，較佳為醋酸-醋酸鈉緩衝液；所述緩衝液的濃度為1~100mM；所述緩衝液的pH值為4.5~8.0。
  5. 如請求項1-4任一項所述的藥物組合物，其中，所述滲透壓調節劑選自：鹽、胺基酸、糖或糖醇或其組合；較佳地，所述鹽選自氯化鈉、氯化鉀或鹽酸精胺酸；較佳地，所述胺基酸選自甘胺酸、精胺酸、組胺酸、穀胺酸或甲硫胺酸；較佳地，所述糖或糖醇選自蔗糖、海藻糖、甘露醇或山梨醇；更佳地，所述滲透壓調節劑選自氯化鈉、甘胺酸、鹽酸精胺酸、蔗糖、海藻糖、甘露醇或山梨醇，最較佳為蔗糖或鹽酸精胺酸；所述糖或糖醇的濃度為1~15% w/v，所述鹽的濃度為50~200mM。
  6. 如請求項1-5任一項所述的藥物組合物，其中，所述表面活性劑選自：聚山梨酯80(PS-80)、聚山梨醋20(PS-20)或泊洛沙姆；所述表面活性劑的濃度為0.01~0.1% w/v。
  7. 如請求項1~6任一項所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括：所述融合蛋白、醋酸-醋酸鈉緩衝液、蔗糖和聚山梨酯-80；較佳地，所述藥物組合物包括：1~50mg/mL所述融合蛋白、1~100mM醋酸-醋酸鈉緩衝液、1~15% w/v蔗糖和0.01~0.1% w/v聚山梨酯-80，pH值為4.5~6.0。
  8. 如請求項1~6任一項所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括：融合蛋白、醋酸-醋酸鈉緩衝液、鹽酸精胺酸和聚山梨酯-80；較佳地，所述藥物組合物包括1~50mg/mL所述融合蛋白、1~100mM 醋酸-醋酸鈉緩衝液、50~200mM鹽酸精胺酸和0.01~0.1% w/v聚山梨酯-80，pH值為4.5~6.0。
  9. 如請求項1~8任一項所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為靜脈、肌內或皮下注射液，較佳為皮下注射液。
  10. 一種如請求項1~9任一項所述藥物組合物的方法，其中，所述方法包括將所述融合蛋白與所述緩衝液、滲透壓調節劑和表面活性劑混合配置的步驟；較佳地，所述方法包括將所述融合蛋白的原液透過超濾濃縮置換到所述緩衝液中的步驟。
  11. 一種凍乾製劑，其中，所述凍乾製劑由請求項1~9任一項所述藥物組合物凍乾後形成。
  12. 一種如請求項11所述凍乾製劑的方法，其中，所述方法包括冷凍乾燥請求項1~9任一項所述的藥物組合物的步驟。
  13. 一種如請求項11所述的凍乾製劑的複溶溶液的方法，其中包括將請求項12所述凍乾製劑用溶劑複溶，較佳地，所述溶劑為注射用水。
  14. 一種如請求項13所述方法製備得到的含IL2突變體的Fc融合蛋白的複溶溶液。
  15. 一種請求項1~9任一項所述藥物組合物、請求項11所述凍乾製劑或請求項14所述複溶溶液在製備用於治療自身免疫性疾病或增生性疾病的藥物中的應用；
    較佳地，所述自身免疫性疾病選自類風濕關節炎、僵直性脊椎炎、系統性紅斑狼瘡、皮膚紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、IgA腎病、乾燥症候群、多肌炎、皮肌炎、硬皮病、銀屑病、斑塊狀銀屑病、斑禿、多發性硬化症、肌萎縮側索硬化症、炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅 恩病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫肝炎、I型糖尿病、自身免疫性血管炎、濕疹或哮喘；
    較佳地，所述增生性疾病選自贅生物、實體瘤、血液瘤、惡性腹水或惡性胸水；其中，所述實體瘤可為良性或惡性，原發性或轉移性，所述惡性實體瘤可為癌或肉瘤，例如，上皮細胞癌、內皮細胞癌、鱗狀細胞癌、畸胎瘤、肺部腫瘤、乳頭瘤病毒引起的癌、腺癌、癌腫、黑色素瘤、血管肉瘤、神經母細胞瘤、轉移性肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、Merkel細胞癌、卵巢癌、腎細胞癌、轉移性腎癌、頭頸癌、膀胱癌、非肌層浸潤性膀胱癌；所述血液瘤可選自白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤，例如B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、T細胞大顆粒淋巴細胞白血病。
  16. 一種請求項1~9任一項所述藥物組合物、請求項11所述凍乾製劑或請求項14所述複溶溶液，用於治療自身免疫性疾病或增生性疾病的應用；
    較佳地，所述自身免疫性疾病選自類風濕關節炎、僵直性脊椎炎、系統性紅斑狼瘡、皮膚紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、IgA腎病、乾燥症候群、多肌炎、皮肌炎、硬皮病、銀屑病、斑塊狀銀屑病、斑禿、多發性硬化症、肌萎縮側索硬化症、炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫肝炎、I型糖尿病、自身免疫性血管炎、濕疹或哮喘；
    較佳地，所述增生性疾病選自贅生物、實體瘤、血液瘤、惡性腹水或惡性胸水；其中，所述實體瘤可為良性或惡性，原發性或轉移性，所述惡性實體瘤可為癌或肉瘤，例如，上皮細胞癌、內皮細胞癌、鱗狀細胞癌、畸胎瘤、肺部腫瘤、乳頭瘤病毒引起的癌、腺癌、 癌腫、黑色素瘤、血管肉瘤、神經母細胞瘤、轉移性肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、Merkel細胞癌、卵巢癌、腎細胞癌、轉移性腎癌、頭頸癌、膀胱癌、非肌層浸潤性膀胱癌；所述血液瘤可選自白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤，例如B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、T細胞大顆粒淋巴細胞白血病。
  17. 一種治療自身免疫性疾病的方法，其中，所述方法包括給予受試者有效量的如請求項1~9任一項所述藥物組合物或請求項14所述複溶溶液；較佳地，所述自身免疫性疾病選自類風濕關節炎、僵直性脊椎炎、系統性紅斑狼瘡、皮膚紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、IgA腎病、乾燥症候群、多肌炎、皮肌炎、硬皮病、銀屑病、斑塊狀銀屑病、斑禿、多發性硬化症、肌萎縮側索硬化症、炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫肝炎、I型糖尿病、自身免疫性血管炎、濕疹或哮喘；較佳地，所述有效量為0.001~10mpk。
  18. 一種治療增生性疾病地方法，其中所述方法包括給予受試者有效量的如請求項1~9任一項所述藥物組合物或請求項14所述複溶溶液；較佳地，所述增生性疾病選自贅生物、實體瘤、血液瘤、惡性腹水或惡性胸水；其中，所述實體瘤可為良性或惡性，原發性或轉移性，所述惡性實體瘤可為癌或肉瘤，例如，上皮細胞癌、內皮細胞癌、鱗狀細胞癌、畸胎瘤、肺部腫瘤、乳頭瘤病毒引起的癌、腺癌、癌腫、黑色素瘤、血管肉瘤、神經母細胞瘤、轉移性肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、Merkel細胞癌、卵巢癌、腎細胞癌、轉移性腎癌、頭頸癌、膀胱癌、非肌層浸潤性膀胱癌；所述 血液瘤可選自白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤，例如B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、T細胞大顆粒淋巴細胞白血病。
  19. 一種製品，其包括容器，所述容器裝有請求項1~9任一項所述藥物組合物、請求項11所述凍乾製劑或請求項14所述複溶溶液。
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CN115073581A (zh) * 2016-05-04 2022-09-20 美国安进公司 用于扩增t调节性细胞的白细胞介素-2突变蛋白
EP3720470A4 (en) * 2017-12-06 2021-09-15 Pandion Operations, Inc. IL-2 MUTEINS AND THEIR USES
JP2021515599A (ja) * 2018-03-09 2021-06-24 アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッドＡｓｋＧｅｎｅ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ． 新規のサイトカインプロドラッグ
BR112023004040A2 (pt) * 2020-09-04 2023-04-04 Shandong Simcere Biopharmaceutical Co Ltd Mutante de il-2 e sua aplicação

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