UA127771C2 - ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЯКА МІСТИТЬ ЗЛИТИЙ ПРОТЕЇН РЕЦЕПТОРА TGF-<font face="Symbol">b, </font>ТА ЇЇ ЗАСТОСУВАННЯ - Google Patents

ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЯКА МІСТИТЬ ЗЛИТИЙ ПРОТЕЇН РЕЦЕПТОРА TGF-<font face="Symbol">b, </font>ТА ЇЇ ЗАСТОСУВАННЯ Download PDF

Info

Publication number
UA127771C2
UA127771C2 UAA202102928A UAA202102928A UA127771C2 UA 127771 C2 UA127771 C2 UA 127771C2 UA A202102928 A UAA202102928 A UA A202102928A UA A202102928 A UAA202102928 A UA A202102928A UA 127771 C2 UA127771 C2 UA 127771C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
fusion protein
pharmaceutical composition
cancer
antibody
receptor
Prior art date
Application number
UAA202102928A
Other languages
English (en)
Inventor
Ченмін Тіан
Ченмин Тиан
Хао Лі
Хао Ли
Сюнь Ліу
Сюнь Лиу
Original Assignee
Джянгсу Хенгруй Медісін Ко., Лтд.
Джянгсу Хенгруй Медисин Ко., Лтд.
Шанхай Хенгруй Фармасьютікал Ко., Лтд.
Шанхай Хенгруй Фармасьютикал Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Джянгсу Хенгруй Медісін Ко., Лтд., Джянгсу Хенгруй Медисин Ко., Лтд., Шанхай Хенгруй Фармасьютікал Ко., Лтд., Шанхай Хенгруй Фармасьютикал Ко., Лтд. filed Critical Джянгсу Хенгруй Медісін Ко., Лтд.
Publication of UA127771C2 publication Critical patent/UA127771C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Винахід стосується фармацевтичної композиції, яка містить: злитий протеїн рецептора TGF-β утворений важким ланцюгом антитіла PD-L1 та TGF-βRII ECD, послідовність, яка є представленою як SEQ ID NO: 23, та легким ланцюгом антитіла PD-L1, послідовність, яка є представленою як SEQ ID NO: 13; буфер, що являє собою буфер лимонної кислоти та натрію цитрату, де концентрація буфера лимонної кислоти та натрію цитрату становить від 5 до 20 мМ; причому концентрація злитого протеїну рецептора TGF-β становить від 0,5 до 100 мг/мл; рН фармацевтичної композиції становить від 6,0 до 6,5; при цьому фармацевтична композиція також містить сахарозу, де концентрація сахарози становить від 60 до 90 мг/мл; та також містить полісорбат 80, де концентрація полісорбату 80 становить від 0,4 до 0,8 мг/мл.

Description

фармацевтичної композиції становить від 6,0 до 6,5; при цьому фармацевтична композиція також містить сахарозу, де концентрація сахарози становить від 60 до 90 мг/мл; та також містить полісорбат 80, де концентрація полісорбату 80 становить від 0,4 до 0,8 мг/мл.
Представлена заявка заявляє пріорітет за патентною заявкою 201811328326.1, поданою 9 листопада 2018 року, яка є включеною в даний документ у вигляді посилання в повному своєму обсязі.
ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
Представлене розкриття належить до галузі фармацевтичних препаратів, та зокрема стосується фармацевтичної композиції, яка містить РО-Ї 1 антитіло/ТЕЕ-ВКІЇ злитий протеїн позаклітинної ділянки, та його застосування як лікарського засоби.
ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ
Твердження в даному документі представляють тільки довідкову інформацію, яка стосується представленого розкриття, та не обов'язково складає рівень техніки. При лікуванні пухлин люди зазнавали високої токсичності, спричиненої хіміотерапією, та хіміотерапія може призвести до генерації ракових клітин, резистентних до лікарських препаратів. Навіть, якщо використовуються націлені терапії, які є спрямованими на надекспресовані або надактивовані протеїни, пов'язані із виживанням та ростом пухлини, будуть існувати ракові клітини, які мутують таким чином, щоб зменшити або уникнути залежність від шляхів, на які спрямована цільова терапія, та такі ракові клітини виживатимуть за допомогою інших шляхів.
Імунотерапії пухлин приділяється велику увагу останніми роками, та вона є центральною в галузі лікуванні раку. Непересічна перевага такої терапії полягая в більшій складності виникнення резистентності до лікарських препаратів. Імунотерапія пухлини головним чином використовує імунологічні принципи та способи покращення імуногенності пухлинних клітин та чутливості загибелі ефекторних клітин, та стимулювання та посилення протипухлинної імунної відповіді в організмі. Імунотерапія пухлини включає інфузію імунних клітин та ефекторних молекул в організм господаря, та дані два співпрацюють з імунною системою для знищення пухлин та пригнічують ріст пухлини в організмі.
Рецептор запрограмованої загибелі 1 (РО-1) являє собою член надродини СО28.. РО-1 експресується в активованих Т-клітинах, В-клітинах та мієлоїдних клітинах. РО-1 має два ліганди, ліганд запрограмованої загибелі 1 РО-І1 та РО-І2. РО-І 1 взаємодіє з рецептором РО-1 на Т-клітинах та відіграє важливу роль у негативній регуляції імунної відповіді.
Експресія протеїну РО-Ї1ї може бути виявлена в багатьох пухлинних тканинах людини.
Зо Мікросередовище в місці пухлини може індукувати експресію РО-ІЇ1 в пухлинних клітинах, та експресований РО-Ї1, в свою чергу, робить внесок у пухлиноутворення та ріст пухлини, та індукує апоптоз протипухлинних Т-клітин. Інгібітори шляху РО-1/РО-І 1 блокують зв'язування РО- 1 з РО-І1, блокують негативні регуляторні сигнали, відновлюють активність Т-клітин та посилюють імунну відповідь. Тому, імуномодуляція РО-1/РО-І 1, як мішені, має суттєве значення
З5 для пригнічення пухлини.
Трансформуючий фактор росту-рД (ТаБЕ-р) належить до надродини ТОаЕ-р, яка регулює ріст та диференціювання клітин. ТЕ-Д передає сигнали через гетеротетрамерний рецепторний комплекс, який складається з двох типів ! та двох типів ЇЇ трансмембранних серин/греонінкіназних рецепторів. тавг-р являє собою багатофункціональний цитокін, який чинить пухлино-пригнічуючий або пухлино-стимулюючий ефект в клітинно-залежній або фоно-залежній манері. Пригнічуючий пухлинний ефект сигналів ТаЕ-Д залежить від здатності індукувати експресію більшості генів.
Коли під час розвитку пухлини відбувається мутація або епігенетична модифікація, ракові клітини поступово стають толерантними до інгібуючого ефекту сигналів ТОЕ-р, що в результаті призводить до розвитку пухлин. Дослідження виявили, що блокування Таг-р сигнального шляху може зменшити метастазування пухлини. Було виявлено, що метастатична здатність пухлинних клітин інгібувалась, коли сигнальний шлях ТОЕ-В в клітинній лінії пухлини молочної залози інгібувався усіченим негативним мутантом Зтай2/3. Дослідження нестабільності мікросателіту раку товстої кишки виявили, що неактивні мутації ТОЕ-ВВІЇ зменшували метастази та більшували післяопераційний рівень виживаності пацієнтів. Однак, загалом, ефект є слабким, коли інгібітор сигнального шляху ТаЕ-Д вводиться самостійно в клінічному лікуванні, можливо, оскільки ТОБ-Д, головним чином, аномально експресується в пухлинних клітинах, тоді як складним є для інгібітора сигнального шляху ТагЕ-Д самостійно націлюватися на пухлину, що в результаті призводить до низької ефективності або низької біодоступності інгібітора.
Отже, інгібування шляху РО-1/РО-Ї1 на основі блокування та нейтралізації ТОБ-В в мікросередовищі пухлини може відновити активність Т-клітин, посилити імунну відповідь та покращити ефект інгібування пухлиноутворення та розвитку пухлини більш ефективно.
Попередня заявка РСТ заявника РСТ/СМ2016/104320 (номер публікації УМО 2017084495) передбачає РО-Ї1 антитіло. На сьогоднішній день було опубліковано злітий протеїн 60 антитіла/Та Е-В-рецептора, наприклад, в МО2006074451А2, МО2009152610А1,
МО2011109789А2, М/О2013164694А1, М/О2014164427А1, МО2015077540А2, М/09309228А1,
МО9409815А1, МО2015077540А2, М/О2015118175А2, тощо. Серед них МегскК розкриває біфункціональний злитий протеїн РО-П/ТОв-р Віпігатизр Аа (М/О2015118175, також відомий як
М7824, ЕР17022). В даний час, Віпігагизр АМа перебуває в фазі клінічних досліджень щодо пухлинних захворювань, таких як рак шлунка, рак легенів, рак стравоходу, МЗС С, рак жовчних шляхів. Однак, лікарські засоби на основі антитіла з попереднього рівня техніки стають нестабільними через великі молекулярні маси, складні структури та, які піддаються, розкладанню, полімеризації або виникненню небажаних хімічних модифікацій. Для того, щоб зробити антитіло прийнятним для введення, зберегти стабільність при зберіганні та подальшому використанні, та для досягнення кращого ефекту, особливо важливими є дослідження стабільних препаратів лікарських засобів на основі антитіла.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Представлене розкриття передбачає фармацевтичну композицію, яка містить злитий протеїн РО-І1/ТаЕ-РАЇЇ, яка є більш сприятливою для виробництва та введення, та є більш стабільною при здійсненні; де фармацевтична композиція містить: - злитий протеїн рецептора Таг-р, та - буфер, при цьому буфер вибирають з групи, яка складається з гістидинового сольового буфера, сукцинатного буфера, фосфатного буфера та цитратного буфера.
В деяких варіантах здійснення, буфер являє собою цитратний буфер. В деяких варіантах здійснення, гістидиновий сольовий буфер являє собою гістидин-гідрохлориднокислотний буфер; та сукцинатний буфер являє собою буфер бурштинова кислота-натрію сукцинат; цитратний буфер являє собою буфер лимонна кислота-натрію цитрат; в деяких варіантах здійснення, буфер являє собою буфер лимонна кислота-натрію цитрат. В альтернативному варіанті здійснення, концентрація злитого протеїна рецептора ТОБЕ-В в фармацевтичній композиції, описаній вище, становить від приблизно 0,5 мг/мл до приблизно 100 мг/мл, переважно від приблизно 30 мг/мл до приблизно 70 мг/мл. В деяких варіантах здійснення, концентрація злитого протеїна рецептора ТЯЕ-Р в фармацевтичній композиції становить від 0,5 мг/мл до 100 мг/мл, переважно від 30 мг/мл до 70 мг/мл. Необмежуючі приклади концентрації
Зо злитого протеїна рецептора ТОБЕ-Д включають: приблизно 30 мг/мл, приблизно 35 мг/мл, приблизно 40 мг/мл, приблизно 45 мг/мл, приблизно 50 мг/мл, приблизно 55 мг/мл, приблизно 60 мг/мл, приблизно 65 мг/мл, приблизно 70 мг/мл, переважно приблизно 50 мг/мл.
В деяких варіантах здійснення, концентрація злитого протеїна рецептора ТОБ-Д в фармацевтичній композиції становить 30 мг/мл, 35 мг/мл, 40 мг/мл, 45 мг/мл, 50 мг/мл, 55 мг/мл, 60 мг/мл, 65 мг/мл, 70 мг/мл, більш переважно 50 мг/мл.
В альтернативному варіанті здійснення, значення рН буфера в фармацевтичній композиції, описаній вище, становить від приблизно 5,0 до приблизно 7,5, переважно від приблизно 6,0 до приблизно 6,5, та необов'язково приблизно 6,0, приблизно 6,1, приблизно 6,2, приблизно 6,3, приблизно 6,4, приблизно 6,5, більш переважно приблизно 6,2.
В деяких варіантах здійснення, значення рН буфера становить від 5,0 до 7,5, або від 6,0 до 6,5, переважно 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 або 6,5, більш переважно 6,2.
В альтернативному варіанті здійснення, концентрація буфера становить від приблизно 5 мМ до приблизно 30 мМ, переважно від приблизно 5 мМ до приблизно 20 мМ, їх необмежуючі приклади включають 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ, 12 мМ, 14 мМ, 16 мм, 18 мМ, 20 мм, більш переважно 10 мм.
В деяких варіантах здійснення, концентрація буфера становить від 5 мМ до 30 мМ, переважно від 5 мМ до 20 мМ; та в деяких варіантах здійснення, концентрація буфера становить приблизно 10 мМ, приблизно 12 мМ, приблизно 14 мМ, приблизно 16 мМ, приблизно 18 мМ, приблизно 20 мМ, та більш переважно приблизно 10 мМ.
В альтернативному варіанті здійснення, фармацевтична композиція, описана вище, також містить сахарид. "Сахарид" в представленому розкритті включає загальноприйняті сполуки/композиції (СНгО); або їх похідні, які містять моносахариди, дисахариди, трисахариди, полісахариди, цукрові спирти, відновлюючі сахариди, невідновлюючі сахариди, та подібні. В деяких варіантах здійснення, сахарид вибирають з групи, яка складається з: глюкози, сахарози, трегалози, лактози, фруктози, декстрану, гліцерину, еритриту, гліцерину, арабітолу, ксиліту, сорбіту, манітолу, мелібіози, мелезітози, мелітріози, манотріози, стахіози, мальтози, лактулози, мальтулози, сорбіту, мальтиту, лактитолу, ізомальтулози тощо. Переважний сахарид являє собою невідновлюючий дисахарид, більш переважно трегалозу або сахарозу, та найбільш переважно сахарозу.
В альтернативному варіанті здійснення, концентрація сахарида в фармацевтичній композиції, описаній вище, становить від приблизно 50 мг/мл до приблизно 100 мг/мл, переважно від приблизно 60 мг/мл до приблизно 90 мг/мл; необмежуючі приклади включають 60 мг/мл, 65 мг/мл, 70 мг/мл, 75 мг/мл, 80 мг/мл, 85 мг/мл, 90 мг/мл, найбільш переважно 80 мг/мл.
В деяких варіантах здійснення, концентрація сахаридастановить від 50 мг/мл до 100 мг/мл, переважно від 60 мг/мл до 90 мг/мл; та в деяких варіантах здійснення, концентрація сахарида становить приблизно 60 мг/мл, приблизно 65 мг/мл, приблизно 70 мг/мл, приблизно 75 мг/мл, приблизно 80 мг/мл, приблизно 85 мг/мл або приблизно 90 мг/мл.
В альтернативному варіанті здійснення, фармацевтична композиція, описана вище, додатково містить поверхнево-активну речовину, яка може бути вибрана з групи, яка складається 3 полісорбату 20, полісорбату 80, полігідроксіалкілену, Тритону, натрію додецилсульфонату, натрію лаурилсульфонату, натрію октилглікозиду, лаурил-сульфобетаїну, міристил-сульфобетаїну, лінолеіл-сульфобетаіну, стеарил-сульфобетаіну, лаурил-саркозину, міристил-саркозину, лінолеіл-саркозину, стеарил-саркозину, лінолеіл-бетаіну, міристил-бетаїну, цетил-бетаіну, лауреламідопропіл-бетаіну, кокаамідопропіл-бетаіну, ліноламідопропіл-бетаїну, міристамідопропіл-бетаїну, пальмітамідопропіл-бетаїну, ізостеариламідопропіл-бетаїну, міристамідопропіл-диметиламіну, пальмамідопропіл-диметиламіну, ізостеарамідопропіл- диметиламіну, натрію метилкокоїл, натрію метилолеїлтаурат, полієтилен гліколь, поліпропіленгліколь, співполімер етилен- та пропіленгліколю, тощо. Переважна поверхнево- активна речовина являє собою полісорбат 80 або полісорбат 20, більш переважно полісорбат 80.
В іншому альтернативному варіанті здійснення, концентрація поверхнево-активної речовини в фармацевтичній композиції, описаній вище, становить від приблизно 0,1 мг/мл до приблизно 0,8 мг/мл, більш переважно від приблизно 0,4 мг/мл до приблизно 0,8 мг/мл.
В деяких варіантах здійснення, концентрація поверхнево-активної речовини становить від 0,1 мг/мл до 0,8 мг/мл, переважно від 0,4 мг/мл до 0,8 мг/мл, більш переважно приблизно 0,4 мг/мл, приблизно 0,45 мг/мл, приблизно 0,5 мг/мл, приблизно 0,55 мг/мл, приблизно 0,6 мг/мл, приблизно 0,7 мг/мл, приблизно 0,8 мг/мл.
В деяких варіантах здійснення, концентрація поверхнево-активної речовини становить 0,4 мг/мл, 0,45 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,55 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,7 мг/мл або 0,8 мг/мл, більш конкретно 0,4 мг/мл.
В альтернативному варіанті здійснення, фармацевтична композиція, описана вище, містить: (а) від приблизно 0,5 мг/мл до приблизно 100 мг/мл злитого протеїна рецептора ТОБ-ВД, (Б) від приблизно 5 мМ до приблизно 30 мМ цитратного буфера, (с) від приблизно 50 мг/мл до приблизно 100 мг/мл сахарози, та (0) від приблизно 0,1 мг/мл до приблизно 0,8 мг/мл полісорбатуу 80, переважно рН фармацевтичної композиції становить від приблизно 5,0 до приблизно 7,5, більш переважно від приблизно 6,0 до приблизно 6,5.
В альтернативному варіанті здійснення, фармацевтична композиція, описана вище, містить: від 0,5 мг/мл до 100 мг/мл злитий протеїн рецептора ТаБ-В від 5 мМ до ЗО мМ цитратного буфера від 50 мг/мл до 100 мг/мл сахарози, та від 0,1 мг/мл до 0,8 мг/мл полісорбату 80; переважно, рН фармацевтичної композиції становить від 5,0 до 7,5, більш переважно від 6,0 до 6,5.
В альтернативному варіанті здійснення, фармацевтична композиція, описана вище, містить: (а) від приблизно 30 мг/мл до приблизно 70 мг/мл злитого протеїну рецептора ТОагЕ-р, (Б) від приблизно 5 мМ до приблизно 20 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, (с) від приблизно 60 мг/мл до приблизно 90 мг/мл сахарози, та (4) від приблизно 0,4 мг/мл до приблизно 0,8 мг/мл полісорбатуу 80, переважно, рН фармацевтичної композиції становить від приблизно 6,0 до приблизно 6,5.
В альтернативному варіанті здійснення, фармацевтична композиція, описана вище, містить: від ЗО мг/мл до 70 мг/мл злитого протеїну рецептора ТагЕ-р від 5 мМ до 20 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату від 60 мг/мл до 90 мг/мл сахарози, та від 0,4 мг/мл до 0,8 мг/мл полісорбату 80; рН фармацевтичної композиції становить від приблизно 6,0 до приблизно 6,5.
В альтернативному варіанті здійснення, фармацевтична композиція містить: (а) приблизно 50 мг/мл злитого протеїну рецептора ТОаЕ-Д, (5) приблизно 10 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, (с) приблизно 80 мг/мл сахарози, та (й) приблизно 0,4 мг/мл полісорбатуу 80, рН фармацевтичної композиції переважно становить приблизно 6,2.
В альтернативному варіанті здійснення, фармацевтична композиція містить: 50 мг/мл злитого протеїну рецептора ТаЕ-р мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату 80 мг/мл сахарози, та 0,4 мг/мл полісорбату 80; переважно, рН фармацевтичної композиції становить від приблизно 6,2. В альтернативному варіанті здійснення, злитий протеїн рецептора ТЯЕ-р в фармацевтичній композиції, описаній 10 вище, описуєтьмя загальною формулою (1):
Ар-І-Таг-РА ЕСО (1) при цьому, ТаЕ-ВВІЇ ЕСО являє собою усічену форму позаклітинної ділянки ТИЕ-РАЇ!; Ар являє собою РО-І1 антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент; Ї являє собою лінкерну послідовність.
В альтернативному варіанті здійснення, лінкерна послідовність в фармацевтичній композиції, описаній вище, являє собою (С145)х2, де х являє собою ціле число від З до 6. В альтернативному варіанті здійснення, х дорівнює 3, 4, 5 або 6, переважно 4.
В альтернативному варіанті здійснення, усічена форма позаклітинної ділянки ТОаг-РНВЇЇ являє собою послідовність позаклітинного домена ТОаБ-РВВІЇ (показана як 5ЕО ІО МО: 14) з делецією 26 найбільш консервативних амінокислотних залишків на аміно-кінці (який також називається як М-кінець). В деяких варіантах здійснення, усічена форма позаклітинної ділянки такг-рВІї! являє собою послідовність позаклітинного домена ТОаЕ-РрВЇї з делецією 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або 26 консервативних амінокислотних залишків на М-кінці. В деяких варіантах здійснення, послідовність ТОЕ-ВВІИ ЕСО в фармацевтичній композиції, описаній вище, є показаною як 5ЕО ІЮО МО: 14, 15, 16 або 17; переважно, послідовність показана як 5ЕО ІО МО: 15.
В альтернативному варіанті здійснення, РО-І1 антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент в фармацевтичній композиції, описаній вище, містить:
НОСОВІ, НСОН2 та НСОНВЗ, показану як 5БЕО 10 МО: 1, 5ЕО І МО: 2 та БЕО ІЮО МО: 3, відповідно; та
ІЇСОВ1, СО082 та І СОВЗ, показану як БЕО ІЮ МО: 4, 5ЕБЕО ІО МО: 5 та 5БО ІО МО: 6, відповідно.
В альтернативному варіанті здійснення, РО-І1 антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент в фармацевтичній композиції, описаній вище, містить:
НОСОВІ, НСОВ2 та НСОВЗ, показану як БЕО ІО МО: 1, 5ЕО ІО МО: 10 та 5ЕО ІО МО: 3, відповідно, та
ІЇСОВ1, СО082 та І СОВЗ, показану як БЕО ІЮ МО: 4, 5ЕБЕО ІО МО: 5 та 5БО ІО МО: 6, відповідно.
В альтернативному варіанті здійснення, РО-І1 антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент в фармацевтичній композиції, описаній вище, містить: варіабельну ділянку важкого ланцюга, показану як 5ЕО ІЮО МО: 7 та варіабельну ділянку легкого ланцюга, показану як 5ЕО ІЮО МО: 8; або, містить: варіабельну ділянку важкого ланцюга, показану як 5ЕО ІЮО МО: 9 та варіабельну ділянку легкого ланцюга, показану як 5ХЕО ІЮ МО: 11.
В альтернативному варіанті здійснення, амінокислотна послідовність важкого ланцюга РО-
Ї1 антитіла в фармацевтичній композиції, описаній вище, є показаною як 5ЕО ІО МО: 12 або має щонайменше 85 то, 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до амінокислотної послідовності, показаної як
ЗЕО ІЮ МО: 12; амінокислотна послідовність легкого ланцюга РО-Ї 1 антитіла є показаною як
ЗЕО ІО МО: 13 або має щонайменше 85 то, 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 965, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до амінокислотної послідовності, показаної як ЗЕО ІО МО: 13.
В альтернативному варіанті здійснення фармацевтичної композиції, описаної вище, в злитому протеїні рецептора ТОЯБЕ-Д, ТаБ-ВВІЇ ЕСО є злитим з карбоксильним кінцем важкого ланцюга РО-І 1-антитіла через лінкерну послідовність.
В деяких варіантах здійснення, злитий протеїн рецептора Таг-Д містить:
- злитий пептид, утворений важким ланцюгом РО-11 антитіла, злитим з ТОЕ-ВВІИ ЕСО, послідовність якого є показаною як 5ЕО ІО МО: 23 або має щонайменше 85 95, 86 95, 87 Об, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до послідовності, показаної як ЗЕО ІЮ МО: 23, та - легкий ланцюг РО-11 антитіла, послідовність якого є показаною як 5ЕО ІЮ МО: 13 або має щонайменше 85 то, 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 925, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до послідовності, показаної як ЗЕО ІЮ МО: 13.
В інших варіантах здійснення, злитий протеїн рецептора ТОБ-Р містить: - злитий пептид, утворений важким ланцюгом РО-ІЇ1 антитіла, злитим з ТОЕ-ВВИ ЕСО, послідовність якого є показаною як 5ЕО І МО: 24 або має щонайменше 85 95, 86 95, 87 Об, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до послідовності, показаної як ЗЕО ІЮ МО: 24, та - легкий ланцюг РО-11 антитіла, послідовність якого є показаною як 5ЕО ІЮ МО: 13 або має щонайменше 85 то, 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 925, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до послідовності, показаної як ЗЕО ІЮ МО: 13.
Представлене розкриття також передбачає спосіб отримання фармацевтичної композиції, описаної вище, який включає стадію контактування злитого протеїну рецептора ТОаБ-Др з буфером, наприклад, здійснення заміни буфера на стоковий розчин злитого протеїну рецептора такг-р, та буфер переважно являє собою цитратний буфер; більш переважно буфер лимонної кислоти та натрію цитрату, концентрація буфера переважно становить від приблизно 5 мМ до приблизно 20 мМ; необмежуючі приклади включають 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ, 12
ММ, 14 мМ, 16 мм, 18 мМ, 20 мМ, більш переважно 10 мМ; рН буфера становить від приблизно 6,0 до приблизно 6,5, необмежуючі приклади включають 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, переважно 6,2. В альтернативному варіанті здійснення, концентрація буфера становить від 5 мМ до 20 мМ, необмежуючі приклади включають приблизно 5 мМ, приблизно б мМ, приблизно 7 мМ, приблизно 8 мМ, приблизно 9 мМ, приблизно 10 мМ, приблизно 12 мМ, приблизно 14 мМ, приблизно 16 мМ, приблизно 18 мМ, приблизно 20 мМ, більш переважно приблизно 10 мМ; рн буфера становить від 6,0 до 6,5, необмежуючі приклади включають приблизно 6,0, приблизно 6,1, приблизно 6,2, приблизно 6,3, приблизно 6,4, приблизно 6,5, переважно приблизно 6,2.
Зо Представлене розкриття також передбачає спосіб отримання фармацевтичної композиції, описаної вище, який включає наступні стадії після контактування злитого протеїну рецептора
Такг-р з буфером: додавання сахарози та полісорбату 80 до отриманого розчину (не існує порядку черговості між ними), та потім регулювання об'єму буфером, при цьому концентрація буферного розчину переважно становить від приблизно 5 мМ до приблизно 20 мМ, більш переважно від 5 мМ до 20 мМ, необмежуючі приклади включають 5 мМ, 8 мМ, 10 мМ, 12 мМ, 14
ММ, 16 мМ, 18 мМ, 20 мМ; рН буфера становить від приблизно 6,0 до приблизно 6,5, необмежуючі приклади включають 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5.
Представлене розкриття також передбачає спосіб отримання ліофілізованого препарата, який містить злитий протеїн рецептора ТОБ-Д, який включає стадію ліофілізування фармацевтичної композиції, описаної вище.
В альтернативному варіанті здійснення, спосіб отримання ліофілізованого препарата, описаного вище, яка містить злитий протеїн рецептора ТОРЕ-Д, в якому ліофілізацію здійснюють відповідно до способу, відомого в даній галузі, такому як, який включає стадії, але не обмежується цим, попереднього заморожування, первинного висушування та вторинного висушування. Кваліфіковані фахівці розуміють, що будь-який спосіб видалення води з фармацевтичної композиції в представленому розкритті є можливим для застосування в представленому розкритті.
Представлене розкриття також передбачає ліофілізований препарат, який містить злитий протеїн рецептора ТОаЕ-р, який отримують за способом отримання ліофілізованого препарата, описаним вище.
Представлене розкритая також передбачає ліофілізований препарат, який містить злитий протеїн рецептора ТОИБЕ-Д, який може бути відновлений до утворення фармацевтичної композиції, описаної вище.
В деяких варіантах здійснення, ліофілізований препарат може бути стабільним при від 2 С до 8"С протягом щонайменше З місяців, щонайменше б місяців, щонайменше 12 місяців, щонайменше 18 місяців, або щонайменше 24 місяців. В деяких варіантах здійснення, ліофілізований препарат може бути стабільним при 40 "С протягом щонайменше 7 днів, щонайменше 14 днів, або щонайменше 28 днів.
Представлене розкриття також передбачає відновлений розчин, який містить злитий протеїн рецептора ТОБ-Д, який отримують за рахунок повторного відновлення ліофілізованого препарата, який містить злитий протеїн рецептора ТаЕ-р, описаний вище.
Представлене розкриття також передбачає спосіб отримання відновленого розчину, який містить злитий протеїн рецептора ТОЯЕ-ВД, описаний вище, який включає: стадію повторного відновлення ліофілізованого препарата, описаного вище, де розчин, який використовують для відновлення містить, але не обмежується цим, воду для ін'єкції, фізіологічний сольовий розчин або розчин глюкози, переважно воду для ін'єкції.
Представлене розкриття, крім того, передбачає виріб виробництва або набір, який містить: фармацевтичну композицію відповідно до представленого розкриття; та контейнери).
В деяких варіантах здійснення, контейнер являє собою скляну ємність, таку як, але не обмежуючись цим, ємність для ін'єкції, зроблену з нейтрального борсилікатного скла для віал.
Представлене розкриття також передбачає виріб виробництва, який містить контейнери), який/які містить/містять фармацевтичну композицію, описану вище, або її ліофілізований препарат, або відновлений розчин ліофілізованого препарата.
Представлене розкриття також передбачає застосування будь-якого одного, вибраного з наступних з препарата лікарського засоба: фармацевтичної композиції описаної вище, або ліофілізованого препарата, або відновленого розчину ліофілізованого препарата, або виробу виробництва; при цьому лікарський засіб використовують для лікування або пригнічення розвитку захворювання/захворювань або розладу/розладів проліферації пухлинної клітини або метастаз.
В деяких варіантах здійснення, захворювання або розлад/розлади являє/являють собою пухлину.
В деяких варіантах здійснення, захворювання або розлад/розлади вибирають з групи, яка складається з: раку товстої та прямої кишки, раку молочної залози, раку яєчників, раку підшлункової залози, раку шлунка, раку передміхурової залози, раку нирки, раку шийки матки, меланоми, лімфоми, лейкемії, раку щитоподібної залози, раку ендометрію, раку матки, раку сечового міхура, нейроендокринного раку, раку голови та шиї, раку печінки, назофарингеальної карциноми, раку яєчка, раку легені, дрібноклітинного раку легені, недрібноклітинного раку
Зо легені, меланоми, базально-клітинної карциноми шкіри, плоскоклітиної карциноми шкіри, вибухаючої дерматофібросаркоми, карциноми з клітин Меркеля, гліобластоми, гліоми, саркоми, мезотеліоми, та мієлодиспластичного синдрому.
Представлене розкриття також передбачає спосіб лікування або пригнічення розвитку захворювання/захворювань або розладу /розладі в, пов'язаного з проліферацією або метастазами ракової клітини, який включає введення терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, описаної вище, або ліофілізованого препарата, або відновленого розчину, або виробу виробництва, суб'єкту, який цього потребує. В деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту одиничної дози композиції, яка містить: від 0,1 мг до 3000 мг злитого протеїна рецептора ТОЕ-Д, як описується вище, фармацевтичної композиції, або ліофілізованого препарата, або відновленого розчину, або виробу виробництва. В деяких варіантах здійснення, захворювання або розлад/розлади являє/являють собою пухлину. В деяких варіантах здійснення, захворювання або розлад/розлади вибирають з групи, яка складається з: раку товстої та прямої кишки, раку молочної залози, раку яєчників, раку підшлункової залози, раку шлунка, раку передміхурової залози, раку нирки, раку шийки матки, меланоми, лімфоми, лейкемії, раку щитоподібної залози, раку ендометрію, раку матки, раку сечового міхура, нейроендокринного раку, раку голови та шиї, раку печінки, назофарингеальної карциноми, раку яєчка, раку легені, дрібноклітинного раку легені, недрібноклітинного раку легені, меланоми, базально-клітинної карциноми шкіри, плоскоклітиної карциноми шкіри, вибухаючої дерматофібросаркоми, карциноми з клітин Меркеля, гліобластоми, гліоми, саркоми, мезотеліоми, та мієлодиспластичного синдрому.
Представлений винахід також передбачає злитий протеїн рецептора ТЯЕ-В, фармацевтичну композицію, або ліофілізований препарат, або відновлений розчин, або виріб виробництва, описані вище, лікування або пригнічення розвитку захворювання/захворювань або розладу/розладів, пов'язаного(их) з проліферацією або метастазами ракової клітини. В деяких варіантах здійснення, захворювання або розлад/розлади являє/являють собою пухлину. В деяких варіантах здійснення, захворювання або розлад/розлади вибирають з групи, яка складається з: раку товстої та прямої кишки, раку молочної залози, раку яєчників, раку підшлункової залози, раку шлунка, раку передміхурової залози, раку нирки, раку шийки матки, меланоми, лімфоми, лейкемії, раку щитоподібної залози, раку ендометрію, раку матки, раку бо сечового міхура, нейроендокринного раку, раку голови та шиї, раку печінки, назофарингеальної карциноми, раку яєчка, раку легені, дрібноклітинного раку легені, недрібноклітинного раку легені, меланоми, базально-клітинної карциноми шкіри, плоскоклітиної карциноми шкіри, вибухаючої дерматофібросаркоми, карциноми з клітин Меркеля, гліобластоми, гліоми, саркоми, мезотеліоми, та мієлодиспластичного синдрому. Як є добре відомо кваліфікованому фахівцю в даній галузі, одна, декілька або всі ознаки різних варіантів здійснення, описаних в представленому розкритті можуть бути додатково поєднаними для створення інших варіантів здійснення представленого розкриття. Зазначені вище варіанти здійснення представленого розкриття та інші варіанти здійснення, отримані за рахунок поєднання додатково ілюструються наступним детальним описом.
ОПИС КРЕСЛЕНЬ
Фігура 1: Схематична діаграма, яка показує структуру злитого протеїна.
Фігура 2: Результати, які показують зв'язування злитих протеїнів з людським ТИаЕ-рРІ1 іп міо.
Фігура 3: Результати, які показують зв'язування злитих протеїнів з людським ТИаЕ-рРІ1 іп міо.
Фігура 4: Результати, які показують зв'язування злитих протеїнів з людським РО-Ї 1 іп міо.
Фігура 5: Результати, які показують детектування шляху РО-1/РО-11, який блокується злитими протеїнами іп міїго.
Фігура 6: Злиті протеїни інгібують ТОаЕр-індуковану активність репортера ромМАЮЗ за залежним від дози способом.
Фігура 7: Всі зразки злитих протеїнів посилюють секрецію цитокіну ІЕМ-у за рахунок активованих Т лімфоцитів.
Фігура 8: Вплив злитих протеїнів на масу пухлини мишей, які несуть пухлину.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Термінологія
Для того, щоб легше було зрозуміти винахід, деякі технічні та наукові терміни конкретно є визначеними нижче. Якщо їх конкретно не визначено в даному документі, всі інші технічні та наукові терміни, які використовуються в даному документі, мають значення, які зазвичай розуміються кваліфікованим фахівцем в галузі техніки, до якої належить дане розкриття. "Буфер" стосується розчину, який є толерантним до зміни рН під дією кислотно-лужних кон'югатних компонентів. Прикладиів, які можуть регулювати рН у відповідному діапазоні, включають ацетатний, сукцинатний, глюконатний, гістидиновий, оксалатний, лактатний, фосфатний, цитратний, тартратний, фумаратний та гліцилгліциновий буфер. "Гістидиновий сольовий буфер" являє собою буфер, який містить іони гістидинового радикалу. Приклади гістидинових сольових буферів включають гістидин-гідрохлоридний, "гістидин-ацетатний, гістидин-фосфатний, гістидин-сульфатний, та подібний буфер; переважно - гістидин- гідрохлоридний буфер. Гістидин-гідрохлоридний буфер отримують з гістидину та гідрохлоридної кислоти. "Цитратний буфер" являє собою буфер, який містить іони цитратного радикалу. Приклади цитратних буферів включають буфер лимонної кислоти-натрію цитрату, лимонної кислоти-калію цитрату, лимонної кислоти-кальцію цитрату, лимонної кислоти-магнію цитрату, та подібний.
Переважний цитратний буфер являє собою буфер лимонної кислоти-натрію цитрату. "Сукцинатний буфер" являє собою буфер, який містить іони сукцинатного радикалу.
Приклади сукцинатних буферів включають буфер бурштинової кислоти-натрію сукцинату, бурштинової кислоти-калію сукцинату, бурштинової кислоти-сукцинату кальцію, та подібний.
Переважний сукцинатний буфер являє собою буфер бурштинової кислоти-натрію сукцинату. "Фосфатний буфер" являє собою буфер, який містить іони фосфатного радикалу. Приклади фосфатних буферів включають буфер динатрію гідрофосфату-натрію дигідрофосфату, динатрію гідрофосфату-калію дигідрофосфату, та подібний. Переважний фосфатний буфер являє собою буфер динатрію гідрофосфату-натрію дигідрофосфату. "Ацетатний буфер" являє собою буфер, який містить іони ацетатного радикалу. Приклади ацетатних буферів включають буфер оцтової кислоти-натрію ацетат, гістидин-ацетату, оцтової кислоти-калію ацетату, оцтової кислоти-кальцію ацетату, оцтової кислоти-магнію ацетату, та подібний. Переважний ацетатний буфер являє собою буфер оцтової кислоти-натрію ацетату. "Фармацевтична композиція" стосується суміші, яка включає одну або декілька сполук, описаних в даному документі, або їх фізіологічно/фармацевтично прийнятні солі або їх проліки, та інші хімічні компоненти, такі як фізіологічнол/фармацевтично прийнятний(і) носій(її) та ексципієнт(и). Призначення фармацевтичної композиції полягає у збереженні стабільності активного інгредієнта антитіла, щоб сприяти введенню в організм та полегшенню всмоктування активного інгредієнта для здійснення біологічної активності. "Фармацевтична композиція" та "препарат", які використовуються в даному документі, не є вваємовиключними.
Якщо не зазначено інше, коли йдеться про форму розчину фармацевтичної композиції, описану в представленому розкритті, розчинником у ній є вода. "Ліофілізований препарат" стосується препарату або фармацевтичної композиції, отриманої після стадії ліофілізування (наприклад, стадії вакуумної сушки при заморожуванні) фармацевтичної композиції, в рідкій формі або формі розчину, або ліофілізування препарату в рідкій формі або формі розчину.
Термін "близько" або "приблизно", як використовується в представленому розкритті, означає, що значення знаходиться в межах допустимого діапазону похибок конкретного значення, визначеного фахівцями в даній галузі техніки, та значення частково залежить від того, як воно вимірюється або визначається (тобто обмеження системи вимірювання).
Наприклад, "близько" або "приблизно" в даній галузі техніки стосується стандартного відхилення менше, ніж один або більше, ніж один. Альтернативно, "близько" або "приблизно" або "по суті яка містить" стосується діапазону до 20 95. Крім того, особливо для біологічних систем або процесів, цей термін означає порядок величини до одного або до 5 разів вищий ніж значення. Якщо не зазначено інше, значення "Слизько ХХ", або "приблизно ХХ", або "по суті, який містить ХХ", які використовуються в представленому розкритті, стосуються значення в межах прийнятного діапазону помилок конкретного значення "ХХ" (включаючи саме значення "ХХ", а також значення в межах прийнятного діапазону похибок значення, визначеного фахівцями, звичайними в даній галузі техніки). Фармацевтична композиція, описана в представленому розкритті є здатною досягти стабільного ефекту: злитий протеїн рецептора таквг-р або його фармацевтична композиція по суті зберігає фізичну стабільність, та/або хімічну стабільність, та/або біологічну активність після зберігання; переважно, фармацевтична композиція по суті зберігає фізичну та хімічну стабільність та свою біологічну активність після зберігання. Термін придатності, як правило, визначається виходячи із заздалегідь визначеного терміну придатності фармацевтичної композиції. В даний час існує багато аналітичних методик для вимірювання стабільності активних інгредієнтів, які дозволяють виміряти стабільність після зберігання при певній температурі протягом певного періоду часу.
Стабільний фармацевтичний препарат антитіла або протеїна являє собою такий препарат, для якого не спостерігається ніяких суттєвих змін за таких умов: зберігання при охолодженій
Зо температурі (2-8 "С) протягом щонайменше 3 місяців, переважно протягом 6 місяців, більш переважно протягом 1 року, та ще більш переважно до 2 років. Крім того, стабільні рідкі препарати включають рідкі препарати, які демонструють бажані характеристики після зберігання при температурі (включаючи 25 С) протягом 1 місяця, З місяців, б місяців або зберігання при температурі 40 "С протягом періоду в 28 днів. Типовими прийнятними стандартами стабільності є наступними: як виміряно з використанням ексклюзіонної ВЕРХ, як правило, не більше, ніж приблизно 10 95, переважно не більше, ніж приблизно 5 95 активних інгредієнтів (таких як протеїни, антитіла) розкладаються. При візуальному огляді фармацевтичний препарат являє собою блідо-жовту, майже безбарвну, прозору або безбарвну рідину, або прозору до злегка молочно-білу, або блідо-жовту майже безбарвну прозору рідину.
Зміна концентрації, рН та осмоляльності препарату становить не більше, ніж -10 95. Як правило, спостерігається усічення не більше, ніж приблизно 10 95, переважно не більше, ніж приблизно 5 95. Зазвичай утворюється не більше, ніж приблизно 10 95, переважно не більше, ніж приблизно 5 95 агрегатів. Вважається, що активний інгредієнт фармацевтичного препарату "зберігає свою фізичну стабільність", якщо антитіло не виявляє суттєвого збільшення агрегації, осадження та/або денатурації за допомогою візуального контролю кольору та/або прозорості, або розсіювання Уф світла, ексклюзіонної хроматографії за розміром (ЗЕС) та динамічного розсіювання світла (015). Зміни конформації протеїна можуть оцінюватися за допомогою флуоресцентної спектроскопії (яка визначає третинну структуру протеїна) та за допомогою
ЕТІВ-спектроскопії (яка визначає вторинну структуру протеїна). Активний інгредієнт (такий як протеїн або антитіло) в фармацевтичному препараті, як вважається "зберігає свою хімічну стабільність", якщо активний інгредієнт (такий як протеїн або антитіло) не виявляє ніякої суттєвої хімічної зміни. Виявляючи та кількісно визначаючи хімічно змінені форми протеїнів або антитіл, може бути оцінена хімічна стабільність. Процеси розкладання, які часто призводять до зміни хімічної структури протеїнів включають гідроліз або укорочення (оцінюють за способами, такими як ексклюзіонна хроматографія за розміром та 505-РАСЕ), окиснення (оцінюють за способами, такими як картування пептидів, поєднане з мас-спектрометрією або МАЇ 0О1/ТОР/М5, тощо), дезамідування (оцінюють за способами, такими як іонообмінна хроматографія, капілярне ізоелектричне фокусування, картування пептидів, вимірювання вмісту ізоаспарагінової кислоти, тощо) та ізомеризація (оцінюють шляхом вимірювання вмісту ізоаспарагінової кислоти, бо картування пептидів, тощо).
Активний інгредієнт (наприклад, протеїн або антитіло) "зберігає свою біологічну стабільність" в фармацевтичному препараті, якщо активний інгредієнт (наприклад, протеїн або антитіло), протягом певного періоду часу, демонструє біологічну активність в межах попередньо визначеного діапазону від того, коли отримують фармацевтичний препарат.
Біологічна активність активного інгредієнта (такого як протеїн або антитіло) може бути визначена, наприклад, з використанням антигензв'язуючого аналізу.
Як використовується в розкритті, трьох-літерний код та одно-літерний код для амінокислот є такими, як описується в У. Вісі. Спет, 243, р3558 (1968).
Як використовується в представленому розкритті, "антитіло" стосується імуноглобуліну, чотирипептидної ланцюгової структури, утвореної двома однаковими важкими ланцюгами та двома однаковими легкими ланцюгами, з'єднаними міжланцюговим дисульфідним(ими) зв'язком(ами).
В представленому розкритті, легкий ланцюг антитіла, описаний в представленому розкритті, додатково містить константну(ї) ділянку(и) легкого ланцюга, яка/які містить/містять людський або мишачий к-, Х-ланцюг або його варіант(и).
В представленому розкритті, важкий ланцюг антитіла, описаний в представленому розкритті, додатково містить константну(ї) ділянкуди) важкого ланцюга, яка/які містить/містять людський або мишачий Іда1, дае, аз, ща або його варіанти).
На М-кінці важкого ланцюга та легкого ланцюга антитіла, ділянка з приблизно 110 амінокислот сильно варіює, яка є відомою як варіабельна ділянка (Ем ділянка); амінокислотна послідовність на С-кінці є відносно стабільною, яка є відомою як константна ділянка.
Варіабельна ділянка містить три гіперваріабельні ділянки (НМА) та чотири ЕВ ділянки (ЕЕ) з відносно консервативною послідовністю. Три гіперваріабельні ділянки визначають специфічність антитіла, також відомі як ділянка визначення комплементарності (СОН). Кожна варіабельна ділянка легкого ланцюга (СУА або МІ) та кожна варіабельна ділянка важкого ланцюга (НСУВ або МН) складається з трьох СОЕ ділянок та чотирьох ЕЕ ділянок, послідовно розташованих від амінокінця до карбоксильного кінця в такому порядку: ЕВІТ, СОВІ, ЕНг2, СОН,
ЕВЗ, СОВЗ, та ЕН4. Три СОВ-ділянки легкого ланцюга відносяться до СОН, І СОР2, та
ІЇСОВЗ3; три СОВ-ділянки важкого ланцюга відносяться до НСОНІ, НСОВ2 та НСОНВЗ. Кількості
Зо та положення СОВ-ділянки амінокислотних залишків в | СУА та НСМЕ в ділянках антитіло або антиген-зв'язуючого фрагмента в даному документі відповідають відомим критеріям нумерації
Кебат 1 СОВ1-3, НСОР1-3), або відповідають критеріям нумерації Кебат та Чотіа; критеріям нумерації Кебат (дивіться КарБбаї еї а!. (1991), Зедиепсез ої Ргоївіпв ої Іттипоіодісаї! Іпіегеві, Те
Бій еййіоп, Рибіїс Неайй бегмісе, Маїйопа! Іпвійцієз ої Неайй, ВеїШезаа, МО), та критеріям нумерації Чотіа (дивіться АЇ!-І агікапі єї а. (1997) "МВ 273: 927-948).
Антитіло за представленим розкриттям включає мишаче антитіло, химерне антитіло та гуманізоване антитіло, переважно гуманізоване антитіло.
Як використовується в представленому розкритті, "антитіло або його зв'язуючий фрагмент" або "функціональний фрагмент" стосується Гар-фрагмента, Рар'-фрагмента, К(аб)2-фрагмента, який має антиген-зв'язуючу активність, а також Ем-фрагмента, зсЕм-фрагмента, який зв'язується з антигеном. Ем-фрагмент являє собою мінімальний фрагмент антитіла, який містить всі антиген-зв'язуючі сайти. Ем-фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга та варіабельну ділянку легкого ланцюга, але без константної(их) ділянки(ок). Загалом, Ем-антитіло додатково містить поліпептидний лінкер між доменами МН та МІ, які утворюють структуру, необхідну для зв'язування антигена. Також, різні лінкери можуть використовуватися для з'єднання варіабельної ділянки з двома антитілами з утворенням поліпептидного ланцюга, який називається одноланцюговим антитілом або одноланцюговим (5Ем). Як використовується в представленому розкритті, термін "зв'язування з РО-І1" означає здатність взаємодіяти з людським РО-11. Як використовується в представленому розкритті, термін "антиген-зв'язуючий сайт" стосується непослідовні або послідовні тривимірні сайти на антитілі або на його антиген- зв'язуючому фрагменті, які розпізнають цільовий антиген та специфічно зв'язуються з антигеном.
Термін "мишаче антитіло" в представленому розкритті стосується анти-людського РО-Ї 1 моноклонального антитіла, отриманого відповідно до знань та навичок в даній галузі. Під час отримання, об'єкт дослідження може ін'єкційно вводитись з РЮО-І|1-антигеном, та потім виділяють гібридому, яка експресує антитіло, яке має бажану послідовність або функціональні характеристики.
Термін "химерне антитіло" являє собою антитіло, яке є утвореним шляхом злиття варіабельної ділянки нелюдського (такого як мишаче) антитіла із константною ділянкою 60 людського антитіла, таким чином, щоб пом'якшити імунну відповідь, індуковану нелюдським
(таким як мишаче) антитілом. Для того, щоб адаптувати химерне антитіло, спочатку може бути встановлена гібридома, яка секретує специфічне моноклональне антитіло, потім гени варіабельної ділянки клонуються з гібридомних клітин, та потім гени константної ділянки людського антитіла клонуються за необхідності, гени варіабельної ділянки нелюдського (такого як мишаче) антитіла лігуються з генами людської константної ділянки з утворенням химерного гена, який може бути вставлений в людський вектор, та молекула химерного антитіла кінцево експресується в еукаріотичній або прокаріотичній промисловій системі. В переважному варіанті здійснення представленого розкриття, легсий ланцюг химерного антитіла РО-Ї1 додатково містить константну(ї) ділянку(и) легкого ланцюга, яка походить з людського к-, Х-ланцюга або його варіанта(ів). Важкий ланцюг химерного антитіла РО-ІЇ1 додатково містить константну(і) ділянку(їи) важкого ланцюга, яка походить з людського ІДС, Ідс2, ІдсЗ, ІдС4 або його варіанта(ів). Константнайї) ділянка(и) людського антитіла може бути вибрана з константної(их) ділянки(ок) важкого ланцюга, яка походить з людського ІДСІ1, ІдСе2, Ідш2З, Ідс24 або його варіанта(ів), переважно містить константну ділянку важкого ланцюга, яка походить з людського
ІС2 або Ідс24, або Ідс4 без АОСС (антитіло-залежна клітинно-опосередкована цитотоксичність) через амінокислотну мутацію.
Термін "гуманізоване антитіло", також відомий як СОВ-прищеплене антитіло, стосується антитіла, яке генерується нелюдськими (такими як мишачі) послідовностями СОН, прищепленими до каркасу варіабельної ділянки людського антитіла, тобто антитіла, яке генерується з різних типів послідовностей каркасу антитіла зародкової лінії людини.
Гуманізоване антитіло долає сильну анти-антитільну відповідь, індуковану химерним антитілом, яке несе велику кількість нелюдських (таких як мишачі) компонентів. Такі каркасні послідовності можуть бути отримані із загальнодоступної бази даних ДНК або опублікованих посилань, які охоплюють послідовності генів антитіл зародкової лінії. Наприклад, послідовності ДНК зародкових ліній генів людської варіабельної ділянки важкого та легкого ланцюга можуть бути знайдені в базі даних послідовностей зародкових ліній людини "УВазе" (доступна на веб-сайті мм. тгссре.сот.ас.иК/у/разє), а також у Караї, ЕА єї а). 1991, бедуепсе5 ої Ргоїєїп5 ої
Іттипоіодіса! Іпіегеві, Ше 5Ійп Ед. Для того, щоб уникнути зниження активності, спричиненого зниженням імуногенності, каркас варіабельної ділянки антитіла людини піддається мінімальній
Зо зворотній мутації для підтримування активності. Гуманізоване антитіло за представленим розкриттям також стосується гуманізованого антитіла, яке додатково отримують шляхом фагового дисплею з метою дозрівання афінності СОВ.
Як використовується в представленому розкритті, термін "АОСС", а саме антитіло-залежна клітинно-опосередкована цитотоксичність, стосується клітин, які експресують Ес-рецептори, які безпосередньо знищують клітини-мішені, покриті антитілом, за рахунок розпізнавання Ес- сегмента антитіла. АОСС-ефекторні функції антитіла можуть бути зменшені або усунені шляхом модифікування Ес-сегмента Іда. Модифікація стосується мутацій в константній ділянці важкого ланцюга антитіла, таких як мутації, які вибирають з групи, яка складається з М297А, І 234А,
І 235А в ІдДСа1; химері Іда2/4; або мутацій Е2З34А/ 235А в Ідаа4.
Як використовується в представленому розкритті, "ідентичність" вказує на ступінь подібності між послідовностями двох полінуклеотидів або двох поліпептидів. Ідентичність послідовності в представленому розкритті становить щонайменше 8595, 9095 або 9595, переважно щонайменше 95 95. Необмежуючі приклади включають, але не обмежуються цим 85 95, 86 9, 87 95, 88 95, 89 95, 90 95, 91 95, 92 95, 93 ую, 94 95, 9595, 96 95, 97 Ую, 98 90, 99 95, або 100 9».
Порівняння та визначення відсотку ідентичності між двома послідовностями може здійснюватися з використанням налаштувань за замовчуванням для алгоритму
ВІ А5ТМ/ВІА5ТР, доступного на веб-сайті Національного центру біотехнологічного інституту (Майопаї! Сепієг Рог Віотесппоіоду Іпвійше).
Термін "Таг-р-рецептор ІІ" або "ТОЕРрВІ!" або "рецептор ІЇ трансформуючого фактора росту
Р" стосується зв'язування лігандів (включаючи, але не обмежуючись цим, ТИЕрі, Тагр2 та
ТаРВЗ, за допомогою яких клітинно-поверхні рецептори запускають внутрішньоклітинний сигнальний шлях трансдукції.
Термін "РО-Ї 1" стосується ліганда запрограмованої смерті 1, також відомого як СО274 та
ВНІ. РО-11 являє собою протеїн із 290 амінокислот, який має позаклітинний ІдМ-подібний та
Ід4С-подібний домен (амінокислоти 19-239 повнодовжинного РО-І 1), трансмембранний домен, та внутрішньоклітинний домен із приблизно 30 амінокислот. РО-І 1 конститутивно експресується на багатьох клітинах, таких як антиген-презинтуючі клітини (такі як, дендритні клітини, макрофаги, та В-клітини), а також гематопоетичні та негематопоетичні клітини (такі як, мудинно- ендотеліальні клітини, панкреатичні острівці, та імунологічно привілігійована ділянка). РО-І 1 бо також експресується в різних пухлинних та інфікованих вірусом клітини, та є членом імуносупресивного навколишнього оточення (Нібаз 2012, МЕМ 366: 2517-2519). РБО-І1 зв'язується з одним з двох зі Т-клітинних спів-інгібіторів (РО-1 таВ7-1). "РО-Ї1 антитіло або його антиген-зв'язуючий протеїн" за представленим розкриттям включають будь-яке з анти-РО-11 антитіл або його антиген-зв'язуючих фрагментів, описаних в рівні техніки. Анти-РО-І| 1 антитіло може являти собою комерційно доступне антитіло РО-1 1, або антитіло РО-І1, розкрите в літературі; включаючи але не обмежуючись цим, ВМ5-936559,
МРОЇ 3280А, МЕ0І4736, М5ВО0107185 (дивіться О5 2014341917, 05 20130034559, 05 8779108) та подібні. Антитіло може являти собою моноклональне антитіло, химерне антитіло, гуманізоване антитіло, або людське антитіло. Фрагмент антитіла включає Рар-фрагмент, Рабр'- фрагмент, Е(аб')»-фрагмент, який має антиген-зв'язуючу активність, та Ем-фрагмент та 5сгЕм- фрагмент, які зв'язуються з антигеном.
Ілюстративний спосіб отримання антитіла РО-І1 за представленим розкриттям був опублікований в заявці РСТ РСОТ/СМ2016/104320 (публикація Мо. УМО 2017084495), де антитіло
РО-Ї1 містить послідовноті СОМ у варіабельних ділянках важкого ланцюга, як описується нижче: нео: З'МУМН ЗЕОІЮОМО: 1 неОвг: ВІ ХІРМБа Хх2Т5УМЕКЕКМ ЗЕОІОМО: 2
НСОВЗ: саввУруври ЗЕОІОМО: 3.
В альтернативному варіанті здійснення, Хі вибирають з Н або С; та Х2 вибирають з С або ЕК.
В іншому варіанті здійснення, ілюстративне РО-Ї1 антитіло за представленим розкриттям додатково містить послідовноті СОВА варіабельної ділянки легкого ланцюга, як описується нижче:
ІСОВІ1: ВАБЗЕБЗУБІНОТНІ МН ЗЕОІЮОМО: 4 сов: ААБМІ ЕБ5 ЗЕОІОМО: 5
ІСОВЗ: ОСОБЕЕОРІТ ЗЕОІОМО: 6.
В іншому варіанті здійснення, зазначені вище ділянки СОМ є гуманізованими за СОВ стратегією щеплення, та ЕК гуманізованих темплат легких ланцюгів являють собою ІСбкКмМ7-3701 та П)К2,1, ЕВ гуманізованих темплат важких ланцюгів являють собою ІСНМ1-46701 та Н|Нб 1, та гуманізовані послідовності варіабельних ділянок є наступними: Варіабельна ділянка важкого ланцюга гуманізованого антитіла РО-ІЇ 1:
ОРОГКО5СЯЕКККРСЯХКРУСКАО ТЕТУ МИ ЕКОАРООСТЕТМ ВІКО ХТО
ХМЕКЕК МАСТИТ ОТУТУТКУМЕТАХЕ КХЕОТАКУКСАКОСЗ5ХОХЕОвУ Я ТТ ЕТ й
Зо ЗЕО ІО МО: 7, де Хі вибирають з Н або С; та Хо вибирають з С або Е. Варіабельна ділянка легкого ланцюга гуманізованого антитіла РО-І 1:
ІТЕГТОХРАУГА ТАС ОКА ТІСТА ЗЕ УНСО НМ НИ ТООКРООРРКЕИ ТТ АДМ ЕОР:
АНЕБОжОвО ТОК ПЛІКРЕАМОТА М то Е ЕОРСТАСОС ТКТЕЇК
ЗЕОЇІОМ О: 8;
ПРИМІТКА: Порядок являє собою ЕН1-СОВ1-ЕН2-СОВ2-ЕНЗ-СОВЗ-ЕНА4, частина, виділена курсивом, представляє собою ЕВ-послідовність, та підкреслена частина представляє собою
СОВ-послідовність (амінокислотні залишки СОВА є визначеними та зазначеними на основі критеріїв нумерації Кебат).
В іншому варіанті здійснення, дизайн зворотної(их) мутації(ій) здійснюють на гуманізованому антитілі за представленим розкриттям, та сконструйовані зворотні мутації є показаними в
Таблиці нижче:
Таблиця 1
Дизайн зворотної мутації
Мн
МІЛА У9Е МН, 1А т74К
МС 1в МЕ, ат72Е МН, 18 Т74К, 72, Ма8І, М70І.
Таблиця 1
Дизайн зворотної мутації 211 мн 00000 Моє КОМ мові, воно, вве; уввк є ДК РМК ТВ тає
МН. ТЕ
М7ЗА
Примітка: Наприклад, М91Е вказує на зворотну мутацію від МУ до Е в положенні 91, відповідно до природної нумерації. "Прищеплений" вказує на те, що мишаче антитіло СОМ є імплантованим в послідовність зародкової лінії людини ЕВ.
Нові гуманізовані антитіла можуть бути отримані за допомогою комбінації різних мутацій у важкому ланцюзі та легкому ланцюзі, показаних в Таблиці 1.
В іншому аспекті розкриття, варіант здійснення щодо конструювання гуманізованого клону забезпечується наступним чином:
Розробленими були праймери, та фрагменти генів МН/УК кожного гуманізованого антитіла були сконструйовані з використанням ПЛР, та потім вставлені в вектор експресії рНг (який має сигнальний пептид та фрагмент гена константної ділянки (СНІ-Ес/СІ)) для здійснення гомологічної рекомбінації, для того, щоб сконструювати повнодовжинний вектор експресії антитіла: МН-СНІ-Ес-рНІ/МК-СІ -рнг. 1. Дизайн праймеру:
Програмне забезпечення ЮОМАМУогк5 (му3.2.2) он-лайн (пир//пеїхуеб.пін.доу/Япамжогкв/) використовувалось для розробки декількох праймерів для синтезу фрагментів генів, які містять
МН/УК, необхідні для рекомбінації: сигнальний пептид-5' з 30 п. о. (пар основ) 4 МН/УК х 30 п.о.
СНТІ/СІ -3". 2. Сплайсинг фрагмента:
Відповідно до інструкції з експлуатації полімераза ДНК РііїтегЗТАВ Хі від компонії ТаКаНВа
Сотрап, з використанням праймерів, сконструйованих вище, були отримані фрагменти генів, які містять МН/УК, необхідні для рекомбінації, шляхом двостадійної ПЛР-ампліфікації.
З. Конструювання та ферментативне розщеплення вектора експресії рНі (який має сигнальний пептид та фрагмент гена (СНІ-ЕС/СІ) константної ділянки):
Вектор експресії рНі (який має сигнальний пептид та фрагмент гена (СНІ-ЕС/СІ) константної ділянки) був розроблений та сконструйований з використанням деякої спеціальної ендонуклеази рестрикції, такої як В5тВІ, яка розпізнає відмітну ознаку між послідовністю та сайтом рестрикції. Вектор був розщеплений з використанням В5тВі, та потім розщеплені фрагменти були екстраговані з використанням гелю та зберігалися для використання.
Зо 4. Рекомбінантне конструювання вектора експресії МН-СНІ1-Ес-рНІ/УК-СІ -рНг фрагменти генів, які містять МН/УК, необхідні для рекомбінації, та вектор експресії рНг (який має сигнальний пептид та фрагмент гена (СНІ1-ЕС/СІ) константної ділянки), який був розщеплений з використанням В5тВі додавали в компетентні клітини ОН5Н у співвідношенні 3:1, інкубували при 0"С на кризі протягом 30 хв., піддавали тепловому шоку при 42 "С протягом 90 сек., додавали 5 об'ємів середовища ІВ, та потім інкубували при 37 "С протягом 45 хв., потім висівали на планшет І В-Атр, культивували при 37 "С протягом ночі. Одиничний клон відбирали для секвенування, та отримували клон, який викликає зацікавленість. 5. Плазміда була сконструйована відповідно до дизайну в представленому прикладі, потім очищений протеїн експресувався, та афінність отриманого протеїну була виміряна шляхом детектування, описаного в прикладі 5Р В. 6. Нарешті, афінність гуманізованого(их) зі зворотною мутацією мутанта(ів) або гібридомного антитіла до людського РО-ЇІ-пів вимірювали з використанням ВІАСОНЕ, гуманізовані зі зворотною мутацією сайти та комбінації послідовностей, отримані зі скринінгу є наступними:
Варіабельна ділянка важкого ланцюга антитіла 0-1 1:
ОРОГРОХСЯЕЕККРОЯХКККУСКАХОС ТЕТУ УМ ТРОС ОСТЕР КІСРУЗОКІВУ
МЕКЕКМАРТА КОТУ ТК ЕМЕТКК ЯКЕ ОТАКККСАКООБОО УВУ ТО ОСТТЕТиКХ
ЗЕОІЮ МО: 9; де НОСОВА є таким, як показано в ВІРМОСЕТЗММЕКЕКМ 5ЕО ІО МО: 10, тобто, Х2 в ЗЕО ІЮ
МО: 7 являє собою С, та Х2 в БЕО ІЮО МО: 7 являє собою Е;
Варіабельна ділянка легкого ланцюга антитіла РО-Ї 1:
ОР ТОХРА ЗБАРУРООКАТІ ТКАЗЕБУВІНСТНІ МН УООКРООРРКЕЧУДАВМІЕЗСКР
АКЕХОВСХСТОКПЛІХРЕБАБОТАМУУСООВЕЕОРІТЕСОСТКЕ ВІК
ЗЕОІЮ МО: 11;
ПРИМІТКА: Порядок являю собою ЕНІ1-СОВ1-ЕН2-СОВ2-ЕВ3-СОВ3-ЕНА, частина, виділена курсивом, представляє собою послідовність ЕР, та підкреслена частина представляє собою послідовність СОВА (амінокислотні залишки СОВ є визначеними та зазначеними на основі критеріїв нумерації Кебат).
В іншому аспекті представленого розкриття, передбаченим є варіант здійснення щодо конструювання та експресії анти-РО-Ї1 людського 4014 типу антитіла, та додатково передбаченим є антитіло РО-11, яке використовується для конструювання злитого протеїна.
Антитіло РО-Ї1ї може також використовуватися як контрольна молекула в Прикладах дослідження представленого розкриття.
Оскільки РО-Ї1 також експресується в активованих Т-клітинах, тому застосування константних ділянок немутантного типу (ДС1 може викликати Ес-опосередковані ефекти (такі як
АрСС та СОС), які можуть в результаті привести до зменшення активованих Т-клітин. В представленому розкритті вибирають мутований ІД24 для отримання антитіл без АОСС та
СОС. Клон, отриманий шляхом дозрівання за афінністю, був перетворений в тип Ід(с4, та шарнірна ділянка ядра да містить мутацію 5228Р (яка відповідає положенню 227 в природній послідовності 5ЕО ІО МО: 12). Додатково були введені мутація ЕБ234А (яка відповідає положенню 233 в природній послідовності ФЕО ІЮ МО: 12) та мутація І 235А (яка відповідає положенню 234 в природній послідовності ФЕО ІЮ МО: 12) (тАбБз 4:3, 310-318; травень/червень 2012). В той же час, для того, щоб уникнути обриву, який стався на С-кінці важкого ланцюга антитіла, коли вводився лінкерний пептид (який використовується для зв'язування позаклітинного домену ТОаЕ-РВВЇ|), К в кінцевому положенні важкого ланцюга антитіла РО-І 1 був додатково мутований до А (що відповідає останньому положенню в природній послідовності
ЗЕО ІО МО: 12), таким чином, щоб збільшити стабільність злитого протеїна. Послідовність антитіла РО-І 1 за представленим розкриттям, яка використовується для конструювання злитого протеїна, є наступною: важкий ланцюг антитіла РО-І 1: Ідс4 (АА) (5228Р) зо ПУ МОСАСУККРОАЗУКУЗСЕА УТ ІЗУ У МНУ УКОАРООСІ ЕМ МГЕВІСРМО
Т5УМЕКРКМЕУТМТВОТ5Т5 ТУ УМ 581 К5БОТАУ У У САВООУУОЖЕОИУСОСТТУ
ТУ5ЗАЗІКОРЗУТРГАРСЯКУТУСЗТААГОСТУКОУКРЕРУТУВ УМСА СУ НТЕРАХКІ;
ОБ5ОИ1 БІБ У ТУРА КТУТСМУПНЕРЯОМІКУККЕМУВКХУССЕРСРАСРАРГААСО
РУУЕЕТРРЕРКОТІМІЗКЕТРЕУ ТУ УВУ о МОРЕМ СОМ УЖУВОУКУНМА КТКРКЕБОК
МТУ ВУ УМ МІ. НОЖІ СКЕЖКСКУЯМКОЇ РУЯЕКТЕКА кООоРКЕ ВОУ УТ 5О
ЕЕМІТКМОМВ ТСІУКб ЕУРАТАУ БЖ ЕЗМООРЕММУКТТРЕМСОЗОО5ЕВ УВК У ПК
ККОБОИМУББСВУМНЕАСНИНУ ТОК ОЯ ЗЕОІО КО 12;
ПРИМІТКА: підкреслена частина являє собою послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, та непідкреслена частина являє собою послідовність константної ділянки важкого ланцюга (частина, виділена курсивом, являє собою сайт мутації); легкий ланцюг антитіла РО-Ї 1:
ПІМСТО5РАБІАУВРООВА ТТ СКАБСВУЗ ШОСТЕ МН ХООКРООРРКЦУААяМЬЕВО
МВАКЕВОБОИВО ГОЕТІЛІМВУБАБОТА Ж СООС ОРГ ЕООСН КЕ МААРЗУКЕР
ВВЕ КБОТАВУ МСС ММЕУРКАКУСЄСУКМОМАГООМОВОМУ ТЕО
ІЛІЗКАОУЄКНКУТУАСЕУТНОСІ З5РУТКВЕМКОСЕС
ЗБ 5БО 10 МО: 13;
ПРИМІТКА: підкреслена частина являє собою послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, та непідкреслена частина являє собою послідовність константної ділянки легкого ланцюга.
Як використовується в представленому розкритті, злитий протеїн, описаний в представленому розкритті, являє собою протеїновий продукт, отриманий шляхом спів-експресії двох генів з використання ДНК рекомбінантної технології. Способи отримання та очищення антитіл та антиген-зв'язуючих фрагментів є добре відомими в даній галузі та можуть бути знайдені (наприклад, в Апіїродієв, А І арогаїгу Мапиаї, Соїа Зргіпд Нагброг Ргезв, спарієгв 5-8 та 15). Наприклад, миші можуть бути імунізованими людським РО-І1 або його фрагментами, та отримані в результаті антитіла потім можуть бути ренатуровані, очищені, та секвенсовані щодо амінокислотних послідовностей шляхом застосування загальноприйнятих способів, добре відомих в даній галузі. Антиген-зв'язуючі фрагменти також можуть бути отримані, використовуючи загальноприйняті способи. Антитіло або антиген-зв'язуючі фрагменти за представленим розкриттям є сконструйованими таким чином, щоб прищепити СОН, які походять із нелюдського антитіла в одному або декількох людських ЕН. Шляхом вирівнювання бази даних ІМСТ варіабельної зародкової лінії людських антитіл з використанням програмного забезпечення МОЕ, послідовності людської каркасної зародкової лінії можуть бути отримані з
ІтМипосьепетісз (ІМГТ) веб-сайту пир://таї.сіпев. її, або з Те Іттиподіориїййп Расів Воок, 2001,
ІЗВМ 012441351. Сконструйовані антитіла або антиген-зв'язуючі фрагменти за представленим розкриттям можуть бути отримані та очищені із застосуванням відомих способів. Наприклад, послідовності КДНК, які кодують важкий ланцюг та легкий ланцюг, можуть бути клоновані та сконструйовані в Сб-векторі експресії. Сконструйований імуноглобуліновий вектор експресії потім може бути стабільно трансфікований в клітини СНО. Як більш рекомендований спосіб, добре відомий в даній галузі, система експресії ссавців в результаті буде призводити до глікозилювання антитіла, як правило, на високо консервативних М-термінальних сайтах на ділянці Ес. Стабільні клони можуть бути отримані шляхом експресії антитіла, яке специфічно зв'язується з людським РО-Ї1. Позитивні клони можуть бути поширені в безсироватковому культуральному середовищі в біореакторах для продукування антитіла. Культуральне середовище, в якому секретується антитіло, може бути очищене, використовуючи загальноприйняті методики. Наприклад, середовище може бути завантажене у сефарозну колону ЕЕ з протеїном А або С, яка є врівноваженою сумісним буфером. Колонку промивають для видалення компонентів неспецифічного зв'язування. Зв'язане антитіло елююють градієнтом
Зо РН, та фракції з антитілом детектують з використанням 505-РАСЕ, та потім збирають. Антитіло може бути відфільтрованим та концентрованим із застосуванням загальноприйнятих методик.
Розчинні агрегати та мультимери можуть бути ефективно видалені із застосуванням загальноприйнятих методик, включаючи гель-фільтрацію або іонний обмін. Продукт може бути негайно замороженим, наприклад, при -70 "С, або може бути ліофілізованим. "Імуномодуляторна молекула" за представленим розкриттям може використовуватися для ослаблення імунної толерантності ракових клітин. Представлене розкриття використовує усічену форму позаклітинного домена ТОЕ-РВІИЇ як імуномодуляторну молекулу в злитому протеїні. "ТБ-Д рецептор Ії (ТаБ-РВІ)" зв'язується з лігандами ТОЕ-В1 та ТОБ-ДЗ з високою афінністю. Комплекс Таг-ВАП/ТОИв-р залучає ТаБЕ-ВВІ для формування комплексу сигнальної трансдукції (УУ/оп єї аї., Сапсег Не. 1999; 59: 1273-7). Позаклітинний домен ТОЕ-РВІЇ являє собою пептид зі 136 амінокислотних залишків з М-кінця позаклітинного ТОЕ-РНАЇЇ, ілюстративний приклад якого є показаним в 5ЕО ІО МО: 14. Інші варіанти з приблизно 136 амінокислот в довжину та похідні людського ТОИЕ-ВВІЇ позаклітинного домен, які є здатними зв'язуватися з тТав-р1і та ТагР-ДЗ, також належать до позаклітинного домену ТОЕ-РАВЇЇ за розкриттям.
Представлене розкриття виявило, що структура та функція М-термінальної послідовної усіченої форми позаклітинного домена ТОИЕ-ВВІЇ є більш стабільною, ніж та, що у неусіченою молекулою. Злитий протеїн, який містить М-термінальну неусічену форму позаклітинного домена ТОаЕ-РВЇЇ (поліпептид показаний як ак. 1-136 з 5БО ІО МО: 14) є чутливим до розщеплення. Зокрема, позаклітисний домен ТОЕ-РВІЇ, який є усіченим на менше, ніж 26 послідовних амінокислот з М-кінця, є більш стабільним; переважно, позаклітинний домен ТОаг-
РВІЇ, який є усіченим на 14-26, та більш переважно, усіченим на 14-21 послідовних амінокислот з М-кінця, має більш високий рівень експресії; та найбільш переважно, усіченим на 19 або 21 послідовних амінокислот.
Термін "злитий протеїн рецептора ТОЕ-В" являє собою злитий протеїн, який містить рецептор ТОБЕ-Д. В деяких варіантах здійснення, злитий протеїн рецептора ТОБ-В за представленим розкриттям являє собою злитий протеїн рецептора ТОИБ-Д, описаний в міжнародній патентній заявці РСТ/СМ2018/086451 (МО 2018205985 АТ). Повний зміст МО 2018205985 Аї є повністю включеним в представлене розкриття. В деяких варіантах здійснення, злитий протеїн рецептора ТОИЕ-ВД являє собою антитіло РО-І1/злитий протеїн позаклітинного домена ТаЕ-РрАЇїЇ (вловлювач РО-Ї 1/ТОЕ-Д), з позаклітинним доменом Тав-РВЇЇ, який служить як частини імуномодуляторної молекули злитого протеїна, антитіло РО-Ї1 подається як цільова частина злитого протеїна, позаклітинний домен ТаЕ-РВІ!Ї (наприклад, показаний як 5ЕО ІО МО: 14, 15, 16 або 17) є з'єднаним з С-кінцем (також відомим як карбоксильний кінець) важкого ланцюга антитіла РО-Ї1 через лінкерну послідовність (наприклад, (С45)х С, х дорівнює 3-6), утворюючи злиту послідовність, та злита послідовність є з'єднаною з легким ланцюгом антитіла РО-І 1 через міжланцюговий дисульфідниййі) зв'язок(и) з утворенням злитого протеїна вловлювача РО-І1/ТаЕ-р, назавершення, структура є показаною на Фігурі 1. В деяких варіантах здійснення, злитий протеїн рецептора ТОЯБЕ-Р являє собою злитий протеїн, описаний в Таблиці 2 з Приклада 1 розкриття.
Термін "лінкер" або "лінкерна послідовність" стосується з'єднуючої пептидної послідовності, яка використовується для з'єднання протеїнових доменів, як правило, з певним ступенем пластичності, та застосування лінкерів не буде призводити до втрати вихідної функції протеїнового домена. В деяких варіантах здійснення представленого розкриття, лінкерна послідовність являє собою (Сі45)хОї, де х дорівнює 3-6, наприклад, лінкерна послідовність являє собою поліпептид, такий як: (С45)з(0, (С45)403, (С45)з30, або (С45)6(21. "Консервативна модифікація", або "консервативне заміщення", або "заміщення" стосується заміщень амінокислот в протеїні на інші амінокислоти, які мають подібні характеристики (наприклад, заряд, розмір бічного ланцюга, гідрофобність/гідрофільність, скелетну конформацію та жорсткість тощо), таким чином, що зміни часто можуть бути зроблені без зміни біологічної активності протеїна. Фахівці в даній галузі визнають, що, як правило, одиничне амінокислотне заміщення в несуттєвих ділянках поліпептиду суттєво не змінює біологічну активність (дивіться, наприклад, Уаїзоп еї а!. (1987) МоїІесшіаг Віоіоду ої Ше Сепе, Те Вепіатіп/Ситтіпдв Риб. Со., р. 224 (АД єдійоп)). Крім того, заміщення на структурно або функціонально подібні амінокислоти мають меншу ймовірність змінити біологічну активність. "Необов'язковий" або "необов'язково" означає, що подія або ситуація, яка є наступною, може відбутися, але не обов'язково, та опис включає випадки, коли подія або обставина відбувається або не відбувається. Наприклад, "необов'язково включаючи 1-3 варіабельнаїї) ділянка(и) важкої ланцюга антитіла" означає, що варіабельна ділянка важкого ланцюга антитіла із конкретною послідовністю може бути присутня, але не обов'язково. "Введення", "який вводиться" або "обробка, " коли це стосується тварини, людини, експериментального суб'єкта, клітини, тканини, органу, або біологічної рідини, стосується контактування екзогенного, фармацевтичного, терапевтичного, діагностичного агента або композиції із твариною, людиною, суб'єктом, клітиною, тканиною, органом, або біологічною рідиною. "Введення", "який вводиться" або "обробка" може стосуватися, наприклад, терапевтичного, фармакокінетичного, діагностичного, дослідницького та експериментального способів. Обробка клітини охоплює контактування реагента з клітиною, а також контактування реагента з рідиною, де рідина знаходиться в контакті з клітиною. "Введення", "який вводиться" або "обробка, " також означає ії міо та ех мімо обробки, наприклад, клітини, реагентом, діагностичною, зв'язуючою композицією, або іншою клітиною. "Введення" або "обробка", коли це стосується людини, ветеринарії або суб'єкта дослідження, стосується терапевтичного лікування, профілактичних або попереджуючих вимірювань, досліджень та діагностичних застосувань. "Лікування" означає введення терапевтичного агента, такого як композиція за представленим розкриттям, внутрішньо або зовнішньо, суб'єкту, який має один або декілька симптомів захворювання, для якого агент має відому терапевтичну активність. Як правило, агент вводиться в кількості, ефективній для полегшення одного або декількох симптомів захворювання у суб'єкта або населення, яке підлягає лікуванню, шляхом індукування регресії або попередження прогресування такого симптому(ів) будь-якою мірою, яка може вимірюватися клінічно. Кількість терапевтичного агента, яка є ефективною для полегшення будь-якого конкретного симптому захворювання (яка також називається як "терапевтично ефективна кількість") може змінюватися в залежності від чинників, таких як стан захворювання, вік та вага суб'єкта, та здатність агента викликати бажану відповідь у суб'єкта. Чи полегшувався симптом захворювання, може бути оціненим за рахунок будь-якого клінічного вимірювання, як правило, яке використовується лікарями або іншими кваліфікованими медичними працівниками для оцінки тяжкості або статусу прогресування такого симптому. Хоча варіант здійснення представленого винаходу (наприклад, спосіб лікування або виробництва) може не бути ефективним для полегшення цільового(их) симптому(ів) захворювання у кожного пацієнта, він повинен полегшити цільовий(ї) симптом(и) захворювання в статистично значущій кількості пацієнтів, як визначається за будь-яким статистичним методом, відомим в даній галузі, таким як параметричний І-критерій Стьюдента, бо хі-квадрат критерій, О-критерій Манна-Уїтні, критерій Краскела-Уолліса (Н-критерій), критерій
Джонкхієра-Терпстра та критерій Уілкоксона. "Ефективна кількість" включає кількість, достатню для полегшення або попередження симптому або ознаки медичного стану. Ефективна кількість також означає кількість, достатню для того, щоб дозволити або полегшити діагностику.
Ефективна кількість для конкретного суб'єкта або ветеринарного суб'єкта може змінюватись в залежності від таких чинників, як стан, який лікується, загальний стан здоров'я суб'єкта, спосіб та доза введення та ступінь тяжкості побічних ефектів. Ефективна кількість може представляти собою максимальну дозу або протокол дозування, який дозволяє уникнути значних побічних ефектів або токсичних ефектів. "Значення Тт" стосується температури, при якій відбувається термічна денатурація протеїна, тобто, температури, при якій половина протеїна розкривається. В цей час руйнується просторова структура протеїна. Отже, чим вище значення Тт, тим вища термічна стабільність протеїна. "Заміщення" стосується до заміни системи розчинників, яка розчиняє протеїн антитіла.
Наприклад, система з високим вмістом солі або гіпертонічним розчинником, яка містить протеїн антитіла, замінюється за допомогою фізичної дії проти буферної системи для стабільного приготування, так що протеїн антитіла може бути присутнім в стабільному препараті. Фізична операція включає, але не обмежується цим, ультрафільтрацію, діаліз або відновлення після центрифугування.
Детальний опис винаходу
Далі в даному документі, представлене розкритая додатково описується з посиланням на приклади, приклади дослідження або приклади отримання. Однак, приклади, приклади дослідження або приклади отримання наводяться тільки з ілюстративною метою, обсяг прав за представленим розкриттям не обмежується ними.
В прикладах, прикладах дослідження або прикладах отримання за представленим розкриттям, в яких не описуються конкретні умови, зазвичай, їх проводять в загальноприйнятих умовах або в умовах, запропонованих виробниками матеріалів або продуктів. Де джерело реагентів конкретно не вказується, реагенти є комерційно доступними, загальноприйнятими реагентами.
ПРИКЛАДИ
Зо Приклад 1: Клонування та експресія вловлювача злитого протеїна РО-І 1/ТаБ-р
Позаклітинний домен ТОавБ-РАВІЇ (повнодовжинна або усічена форма 5ЕО ІЮ МО: 14) використовувався як частина імуномодуляторної молекули в злитому протеїні, та антитіло РО-
Її використовувалось як цільова частина злитого протеїна з утворенням антитіла РО-
ЇТ/злитого протеїна позаклітинного домена Таг-рАЇЇ (вловлювач РО-І1/Тав-р). Неочікувано було виявлено, що усічена форма позаклітинного домена ТОЕ-РВЇЇ є відносно стабільною, зокрема, особливо більш стабільною після того, як є усіченою на 26 амінокислот з її М-кінця, переважно, більш високий рівень експресії та більш стабільна структура отримуються після того, як є усіченою на 14-26 амінокислот, більш переважно є усіченою на 14-21 послідовних амінокислот з М-кінця, та більш переважно є усіченою на 14, 19 або 21 послідовних амінокислот з М-кінця.
Послідовності необмежуючих прикладів позаклітинного домена ТОаЕ-РВІЇ та його усіченої форми в представленому розкритті є наступними: Послідовність позаклітинного домена Таг-
РА: ЕСО (1-136)
ІРВНУОКУММОМІУ ТОММОАУКЕРОССКЕСОУ ВЕЗТСОКОКУСМаМОСУЧТЯСЕКРОВУ
СУА ККМОВМ ПЕТУСНОРКІРУНОКЕВААЗРКЕСІМКЕКККРОБТЕЕМСВСЯЗОКС
МОМНЕЗЕБ МТМ
ОМС А:
Послідовність позаклітинного домена ТОРЕ-РВВЇЇ, з усіченням або делецією з 19 амінокислот на М-кінці: ЕСО (20-136)
САУКЕРОСККСВУКРВТСОКОКЗСМУМСО ТЯ СЕКРОБУЄСУАУЖМКЕМОВМ ТЬЕТУСН
ОВКСРУНОЕЕрААЗРКСІМКТЕККРСЕТЕЕМСЗСОВСМОМНЕЗЕЕ МТМО
ЗО НУМО: 15;
Послідовність позаклітинного домена Таг-РрНАЇїЇ, з усіченням або делецією 21 амінокислоти на М-кінці: ЕСО (22-136)
УКЕРОССКеСОВУКЕВ ТСОМОКУЄММСВ ТБІСЕКРОЕУСУАУ У КАМОЕМТЬЕТУЄСНОг
КВОТ ЕПВААУРКСІМКЕКККРОЕТЕЕМСЗСУОЕСМОМИЕЗЕЕ МТМО
СО ТО МО: 16:
Послідовність позаклітинного домена ТОЕ-РВІЇ, з усіченням або делецією 14 амінокислот на
М-кінці: ЕСО (15-136)
У ТОМКОСАУКЕРОССКРСВУКРУТСОМОКеСМЕМСЯІТЗІСЕКРОЕУСУАУ У ВКМОЕМІТ
ГЕТУЄНОВКЕРУНОЕЕВААЗРКЕСІМКЕКККЕРОЕТЕЕМССЗОЕСМОМНЕЕЕ МТМ
РО
ЗЕОІОМО: 17.
Як приклад, С-термінальна амінокислота важкого ланцюга антитіла РО-ІЇ 1 за представленим розкриттям (антитіло РО-І 1, в якому важкий ланцюг, показаний як 5ЕО ІЮО МО: 12, та легкий ланцюг; показаний як 5ЕО ІО МО: 13) лігували до позаклітинного домену ТОБЕ-РВЇ з використанням лінкера різних довжин (СабЗ)хО (х дорівнює 3-6), за способом гомологічної рекомбінації, та загальноприйнято експресувався в експресійній системі 293 разом із легким ланцюгом антитіла РО-І 1, та отримані злиті протеїни є показаними в Таблиці 2:
Таблиця 2
Злитий протеїн антитіла РО-І 1/позаклітинний домен ТаЕ-РВІЇ кількість послідовних кінця
Примітка: АБ являє собою антитіло РО-Ї1 за представленим розкриттям (важкий ланцюг показаний як 5ЕО ІЮ МО: 12, та легкий ланцюг показаний як ЗЕО ІЮО МО: 13); ЕСО (п-136) в описі послідовності представляють собою повнодовжинну або усічену форму позаклітинного домена
Таг-ВВІИ; п представляє собою вихідне число амінокислоти після усічення позаклітинного домена ТОагЕ-РАЇЇ. Структура злитого протеїна за представленим розкриттям є показаною на
Фігурі 1; МІЗА означає, що амінокислота в положенні 19 повнодовжинного позаклітинного домена ТОаг-РВП (ЗЕО ІЮ МО: 14) мутується від М до А. Нуклеотидна послідовність, яка кодує антитіло РО-І1, нуклеотидна послідовність, яка кодує позаклітинний домен ТОавЕ-РрРВАЇї, та нуклеотидна послідовність фрагмента лінкерного протеїна ((Сб45)хО) були отримані за загальноприйнятою в рівні техніки методикою. С-термінальний нуклеотид антитіла РО-Ї1 лігували з використанням лінкерного протеїна з М-термінальним нуклеотидом позаклітинного домена ТаОаР-ВВІЇ з різною довжиною за способом гомологічної рекомбінації, та потім клонували у вектор Риї-Ветрі. Рекомбінантний вловлювач РО-І 1/ТаЕ-р експресувався в клітинах 293 та очищали, як описується в Прикладі 2. Очищений протеїн може використовуватися в експериментах наступних прикладів.
Приклад 2: Очистка злитого протеїна вловлювача РО-Ї 1/ТаБ-В
Клітинне культуральне середовище центрифугували з високою швидкістю, та супернатант збирали, та перша стадія очистки проводилась з використанням афінної хроматографії.
Хроматографічне середовище являє собою протеїна А або похідний наповнювач, який взаємодіє з Ес, такий як МарзеЇєсї СЕ. Рівноважний буфер являв собою 1хРВ5 (137 ммоль/л
Масі, 2,7 ммоль/л КСІ, 10 ммоль/л Маг?НРО», 2 ммоль/л КНеРоОх, рН 7,4). Після врівноваження 5х об'ємів колонки, клітинний супернатант завантажували для зв'язування, та регулювали швидкість потоку таким чином, щоб зразку дозволялося залишатися на колонці протягом 21 хв.
Після завантаження зразка, колонку промивали їхРВ5 (рН 7,4) до тих пір, доки поглинання УФ
А280 не зменшувалось до вихідного рівня. Потім, колонку промивали 0,1 М гліциновим (рН 3,0) буфером для елюювання, та елюйований пік збирали відповідно до піку поглинання УФ А280, та зіораний елюйований зразок нейтралізували 1 М Тіз (рН 8,5).
Нейтралізований елюйований зразок концентрували ультрафільтрацією, та потім піддавали ексклюзіонній хроматографії за розміром, буфер являв собою іхРВ5, та колонка являла собою 15. ХК26/60 Зирегаєх 200 (СЕ). Швидкість потоку регулювали на 4 мл/хв., завантажувальний об'єм становив менше, ніж 5 мл, та пік цільового протеїна об'єднували відповідно до поглинання УФ на А280. Чистота зібраного протеїна перевищувала 95 95 як ідентифікували з використанням ексклюзіонної ВЕРХ, та перевіряли з використанням РХ-МС. Перевірений зразок аліквотували для використання. Отримували вловлювач РО-Ї1/ТаЕ-рД. Ефективність та сприятливий ефект злитого протеїна вловлювача РО-Ї1/ТаЕ-Д в представленому розкритті перевіряється за способами біохімічного дослідження, як зазначено нижче.
Приклад дослідження (Біологічна оцінка іп мімо, іп мітго)
Приклад дослідження 1: Детектування ЕГІБ5А іп міо зв'язування вловлювача РО-Ї 1/Тав-р з такв-р1
Спосіб детектування описується наступним чином: а. 9б-лункові планшети покривали 100 мкл/лунка людського ТОЕ-РІ (891510, С5Т) в концентрації 1 мкг/мл при 4 "С протягом ночі. р. Промивали З рази 250 мкл їх РВ5Т, 250 мкл 5 95 молока, РВ5 додавали для блокування при 37 "С протягом 2 годин.
Зо с. Промивали З рази 250 мкл 1хРВ5Т, додавали градієнтні розбавлення вловлювача РО-
ІЇ1/гаБ-Д, та вловлювач ТОЕ-Д використовувався як позитивний контроль та інкубували протягом 1 години при 37 "С. й. Промивали З рази 250 мкл їх РВ5Т. е. 100 мкл анти-людського Ес-антитіла-НЕАР (1:4000) додавали до кожної лунки та інкубували протягом 40 хвилин при 37 "С.
Ї. 100 мкл ТМВ додавали до кожної лунки, інкубували протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, та реакцію зупиняли додаванням 100 мкл 1 М Не5О». 9. Поглинання на 450 нм вимірювали на мікропланшетному рідері, та дані аналізували з використанням Старнраай Р'гізт 5.
Результати зв'язування злитих протеїнів з лодським ТОаг-рІ1 іп міо є показаними на Фігурах 2 та 3. ЕПІЗА показала, що злитий протеїн 1 в Таблиці 2 не зберігав активність зв'язування з людським Таг-р1. Мас-спектрометричний аналіз показав, що злитий протеїн 1 (тобто, неусічена форма позаклітинного домена ТОаЕ-ВВІЇ (1-136)) був нестабільним, та легко руйнувався у важкого ланцюга ТОаЕ-РВЇЇ, та позитивний контроль мав такий самий дефект. Злиті протеїни, які містять М-термінальну усічену форму позаклітинного домена ТОЕРНВІЇ, такі як злиті протеїни 7, 9, 10, 12-15, специфічно зв'язуються з людським Таг-р1.
Приклад дослідження 2: Детектування іп мійго з використанням ЕЇІ5БА зв'язування вловлювача РО-Г1/Гакв-р з РО-І 1
Антиген, який використовується для детектування: РО-1Ї 1-Нів
ЕТУТУРКО Ж УУЄЖОЗНУМ ПЕСКЕРМ ЕК ОСОААМУУЖКЕМЕВКИНОКУНОВЕНЖКУСО
НяЗУКОКА КІ КВОС М ОМАА ЦИТ ОВУКОБАОУУКСМІУОИАОУККТУКУМАРУМ
БО КІМОКНУУВРУТВЕНЕ ТСОЛЕСУРКАВУР КУТОМ ОК МУКВЕЕКТЕМУТУ
ТЕМУ ТУ ШЧЕХУСТЕКАСОРЕЄМА ТА ВЕСМРЕСРСАНРРМЕК ОКО ЕЕВСННА НН А
ЕС МО: 18;
Спосіб детектування описується наступним чином:
а. 96-лункові планшети покривали 100 мкл/лунка людського РО-І1-Нів (ЗЕО ІЮО МО: 18) в концентрації 5 мкг/мл при 4 "С протягом ночі. р. Промивали З рази 250 мкл їх РВ5Т, 250 мкл 5 95 молока, РВ5 додавали для блокування при 37 "С протягом 2 годин. с. Промивали З рази 250 мкл 1хРВ5Т, додавали градієнтні розбавлення вловлювача РО-
Іл1/гаг-р, та антитіло РО-Ї1 як позитивний контроль, та інкубували протягом 1 години при 376. й. Промивали З рази 250мкл 1х РВ5Т. є. 100 мкл анти-людського Ес-антитіла-НАР(1:4000) додавали до кожної лунки та інкубували протягом 40 хвилин при 37 "С.
Її. 100 мкл ТМВ додавали до кожної лунки, інкубували протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, та реакцію зупиняли додаванням 100 мкл 1 М Не5О». 9. Поглинання на 450 нм вимірювали на мікропланшетному рідері, та дані аналізували з використанням Старпраай Р'гізт 5.
Результати зв'язування злитих протеїнів за представленим розкриттям з людським РО-І1 іп мійго є показаними на фігурі 4. ЕГІЗА показала, що всі злиті протеїни зберігали активність зв'язування з людським РО-1 1.
Приклад дослідження 3: Детектування блокування шляху РО-1/РО-ІЇ 1 іп мйко 1. Мета дослідження:
З метою дослідження ефекта блокування вловлювача РО-І 1/ТаЕ-Др на сигнальному шляху
РО-1/РО-11, експеримент блокування антитіла на клітинній основі проводився на клітинах, які несуть молекули людського рецептора РО-1 та РО-11, які були сконструйованими Рготада, відповідно. 2. Зразки дослідження: 1. РО-І1 антитіло з важким ланцюгом, показаним як 5ЕО І МО: 12, та легким ланцюгом, показаним як 5ЕО 10 МО: 13; 2. Контроль 1 (20Т-ЕРс): ЕСО(20-136)-Ес, фрагмент ЕСО усіченого позаклітинного домена такг-рВІЇ, який містить злитий протеїн (20-136), та Ес, та де послідовність є наступною:
САМ КЕРОССЬЕСОВУКРУ ТСОКОКаСММСВІТВІСЕКРОЕУЄУАУ УККМОЕМН ТЕТУЄН
ОРКСРУ НОМ ПВААЗРЕСІМКЕКККРОСЕТРЕМСВСЯВЕСМЕОМИЕЗЕЕ У МТУ МРОАЕЗЕ
ХОРРСЕРОСРАРЕЛАСОСРОУЕСЕРРКЕОК ОТ МАК ТРЕУ ТСУУУВУВОВОРЕ ОМ УМО
УБЕМНМАКТКЕРКЕСОВКМАТ КУМ УСНОВУКОКЕЖКСКУЗККОСРЗМЕК ТУКА
ОСОРКЕРОУ УТ РРО МТКМОУ КТС УКОЕУРУСНАМУ Ж ЕЗМООРЕММУКТТЕРУТЮ5
РОКІВ ТУЮК БК МОБОМУКЯСЗУМНЕАІНМНУ ТОК ВІ Я жо во 0010 МО; 3. Контроль 2 (22Т-Ес): ЕСО(22-136)-Ес, злитий протеїн фрагмента ЕСО усіченого позаклітинного домена Таг-РВІІ (22-136) та Ес, та послідовність є наступною:
УКР ЄКЕСОВУКЕВ ТСОМОКаСМУМСВІ ТЗІСЕКРОЄЕУСУАУ МУ ККМОВМПЕТУЄНОК
КЕРУНОКЦЕБВАЛУРКСТІМКЕКККРОЕТЕЕМСЬСЬВОЕСМОМНЕЗЕЕУМТУМРОЗАВЕЗКУО
ЕРСРЕСРАРЕЛ АСОМ ЕРВКРКІТТ МІК ТРЕУТСУУМПУ чо ЕВРЕУОВМЖУУУПОСУЕК,
УНВАКТКЕВЕБОРМТУКУУУ СТУСНООМ Смак КСЕ УКОСУ МЕКТІВКАКОЮ
РКЕЕРОУЄ ТП РРАОБЕМ ТК МОУ ТСТУКОСЕУРУМАУ ЕМ КЗМООРЕММУКТТЕРУСОВОЮ
ЗЕ КТ УК ВАЖКОГО МУ СУ МНЕАКНМНУ ТОКІО 5ЕО ОО МО 20; 4. злитий протеїн рецептора ТОЕ-Д, отриманий в Прикладі 1 представленого розкриття: злитий протеїн 9, злитий протеїн 15:
В злитому протеїні 9, послідовність злитого пептида важкого ланцюга РО-11 антитіла- (Са5)40-ТаБ-р ВІЇ ЕСО (20-136) є наступною:
ОО МОСК СУККРОАЗУКУВСКАЗТ ТЕТ КМИНУ УКОАРООССЕМ МКС
Т5ЖМЕКЕК МЕМ ТМ УМСА КЗЕОТАУУХСАКОСЗУОУЕВУ ЖСОСТТУ
ТУБЗБАЗІКОРУУКРІАРСЗКУТЗЕВТААГСОСТУКОХЕРЕРУТУЄМУМЯСАГТОИУНТЕРАМІ.
ОЗБОІЖВІ МУ ТУ РУБІАТК ТУ ТСМУОНКРУМІКУЖКУЕЗКУОРРСРРСРАРЕАХА СЮ
РЗУБКБЕКРРКРЕВ ПП. МІЗКТРЕУТСУУУВУБЗОБОРЕУОРН КУ УУВОСУБУНМАКТКРКЕБОВ
МТ УКУ УВУ ЛТУСНОВЖ СМОКЕКСЮУ МКС РЕК ТІЗКАКОСОРКЕРОУ УТРО
ЕЕМТКМОУ МЛС УКОТУРЕНАМУЕУБЗМСОРЕММЖУЕТТРРУБОВООВЕРЕ УВС КВ
КУОБОМУКЗСУУМНЕАІНМНУТОК ІМ ОА обо схвообохОСОуСПАУК
ЕРОЇ Є КРЕПСУВЕЗТСОМОКУСМУМСВІТЯТСЕКРОБУЄУАУ М ВЕМОЕМІТЬЕТУЄНОРКІ,
РУНОЕЕБААЯРКСІМКЕКККРОЕТРЕМСяСяВОВБОСМОЧИЕЗЕЕ УТМР
Оз МО
ПРИМІТКА. Регулярний шрифт являє собою послідовність важкої ланцюга антитіла РО-І11, курсивний шрифт являє собою лінкерну послідовність, підкресленний шрифт являє собою послідовність усіченого фрагмента ЕСО (20-136) позаклітинної ділянки ТаЕ-РВАЇ.
Послідовність легкого ланцюга антитіла РО-І 1 в злитому протеїні 9 є наступною:
Ж СТОЗРАБІАХЗРООКАТ СКАЗУ М НОТНЕМН У УООКРООЮОРЕКИ ГА АВМ ЕБО
УРАКЕВОЗОВО ТОК ПЛІМРУБАЕІЛАМНУХСООЗЕЕОРІЛТЕООСТКІЕКЕТУААРЯМКІВР
РУБОК ВОТАЗМ УСТЯ МЕУ РЕВА КУ ЖКМУОМАГОБИМОУТЕОО5КОТ УВІ
ІЛІЗКАВУЄКНКУТАСЕМТНОСІ З5ЕУТКВЕМВОВС
БО На МО
Послідовність злитого пептида важкого ланцюга РО-І 1 антитіла-(С45)5 С1- ТЕБЕ-ВАВІЇ ЕСО (22- 136) в злитому протеїні 15 є наступною:
УМ ОБОСАБУККРОАЗУКУВСКАО ЕТО МНКУКОАРОСОСЬЕ МУ МІК ЮРМВОСЕ
Т5УКЕКЕКМАУТМТКО ТТГ МУ МЕС КХЕОТАМ САКОСВВУ ОВУ КСО СТТУ
ТУ5ВАЗТКОРУМУЕРІАРСУКЗТЗЕТААСОСІУКОУЕРЕВУ ТУ МБОАСТЯОСУНТЕРАМ,
ОБО УВІ УУ ТУРУ ОО ТКТУТСМУЮНЕРЯУМТКУОКАУККЖОР РСРРСРАРЕААЛОЮ
РУМЕСЕЕРКРКОТІЬМІЗЕТРЕУТСУУУВУЗОЕОРЕМОРМ Ж У УВОУВУНМАКТЕРЕБВОВ
МУ УКУУБУ ТУ НОВЕ КСЕМУЗУКОСРУВЕКТПЗКАКОСОРКЕРОМУТСРРІО
ЕСМ'КМОУ ВТС У КИГУ РОЕТНАМ ЕМ УМООРЕКМУУ КТ ТЕРИ ОБО УВКТУЮКУ
Коссак УкСВУМнЕАгикнУТОК КА СосокоаоооцовО соусах
СУКЕРОБСКЕСОУВЕВТСОКОКСМКСВ ГИПСЕКРОБУСУАУ УВККМОБЕМПЕТУСНО
РКЕСРЖНОБИЕВААВ РКС КЕКККРОСЕТРЕМО Се5ОЕсМ ОМНЕ ЗБЕУМТЗМРО т ЗВО ПхМО: 24;
ПРИМІТКА. Регулярний шрифт являє собою послідовність важкої ланцюга антитіла РО-І11, курсивний шрифт являє собою лінкерну послідовність, підкресленний шрифт являє собою послідовність усіченого фрагмента ЕСО (22-136) позаклітинної ділянки ТаЕ-РВАЇ.
Послідовність легкого ланцюга антитіла РО-І1 в злитому протеїні 15 є наступною:
РУТ ОЗРАБАМУЗРООКАТСКА ЧЕ5УЧНОТНІМИМУ ООКРООРРКІ ДА АЗМІЕЯО
МРАКЕЗОВОВО ГОКЕТЕТІМРУАВОТАКУ УСООЗРЕОРЕТЕООСТКЦЕКЕКЕТУААРУМ ЕР
РМЗОКБОСКЗОСТАВУХУСТЬМУЕХРЕБАКОМУКУЮМАТОВИМЗОСУ ТОК ХВО
ІІЗКАПТЕКНКУТАСЕМТНОСТО5РУТКЕМКОВС жо кОо іх б. людський ІдСи: порожній контроль, людський імуноглобулін, отриманий зі змішаної нормальної людської сироватки шляхом очистки з використанням загальноприйнятого способу афінної хроматографії, такого як Протеїн А; б. Позитивний контроль (ЕР17022): злитий протеїн антитіла РО-1/1 2/позаклітинний домен такнг-рВІЇ;
Амінокислотна послідовність легкого ланцюга антитіла РО-1І 1 2 в злитому протеїні ЕР17022:
ОБАГТОРАБУЗОВРООМ ПЕСТОТ55ВУООСУМУ ЗУ УООНРОКАРКОМІ ОМВК КРУСУ
УМКЕЗИЗКОМТАЗІТІВОГОАЕОЕА У КСВ гОТОТКУТУ СОРКАМЕТ УТ
ТГЕРРУЗЕВІОАМКАТ УСТ У РОАУТУАЖКАВОЯРУКАСУКТТКРУКОЗММК ТАЛУ
УСБУ ТРЕОУКУНКЗУЗСОУТНЕСЯТУЄЕКТУАРТЕСЬ
ЗО МО
Амінокислотна послідовність злитого пептида антитіла РО-І1 2 важкого ланцюга/Позаклітинний домен Тав-РрНАїІ (1-136) іп ЕР17022 злитий протеїн:
ЕМО ЕКО МОРОК ВСАА ЗАЕТЕЗАХІМУУ УКОАРСОКССЕ КМ УЖ Р5ОСИТЕУ
АБТУКОКЕТВК ОМАН МОМ КАБОТАУУ УСАКІКСОТУТТ УВУ УСОСТІ МТУ
5ВАЗІКОРХУКРГСАРУЗКУТОТААГОССУКОУТРЕРУТУКУМВОА ТВО УНТЕРАМУСО5
ХО 5155 У ТУРУ ОТОТУІСМУМЧНЕРУЮТКУЮКАУЕРКУСОКТНТСРРСРАРЕСО
ОРУУЕСЕРРКЕРКОТЬМІ5АТРЕУТСУУМОУЗНЕОРЕУКР У УУВОСУБУНМАКТЕРЕЕКО
УЧЕТ ВУХ НОСА ЛМОКЕТЕСКУЗМКАСРАРІЕКТІЗКАКОСОРКЕРОУ УТРРЕ
КЕЕМТК МОУ ВСУ КОРОНА ЕМ ЕЗМООРЕМЧУКТТРВУ СОВОК У ЯК МОК
ЗЕМ ООСММЕ5СВУ МНЕА ЯН У ТОК ВІЗА ОВ НС МКК ОК ВС РН
МОКЗУМКО МІУ ТОМУ САУКЕРОГСКЕСВУКЕТСТМОКЗСМеМСЯП МСЕКРОКУСМУА
УЖВКЕМЧОЕМТЕТУСНОРКОЕУНОВНЕОААЗРКСІМКЕКККРОЕЄТЕЕМСОСВСВЯВЕСМО
МНЕЗЕЕЖМТ5МРО 5ЕО ОО МО; 3. Спосіб дослідження
Клітини СНО/РО-І1 (05187108, Рготеда) розщеплювали та повторно суспендували в повному середовищі поживної суміші Е-12 (Хама). Щільність клітин регулювали до 4 х 105/мл, використовуючи повне середовище відповідно до результатів щодо кількості клітин. Клітинну суспензію переносили в завантажувальний резервуар, додавали до 96-лункового планшета в кількості 100 мкл/лунка, використовуючи багатоканальну піпетку, та інкубували в інкубаторі при 37"С, 595 бО» протягом 20-24 год.; клітинну суспензію диїкаиРО-1 (05187102, Рготеда) отримували на наступний день, та клітини повторно суспендували відповідно до результатів щодо кількості клітин, використовуючи середовище для аналізу, та щільність клітин регулювали до 1,25 х 1065/мл; планшети для клітинної культури, які містять клітини СНО/РО-І 1 виймали з інкубатора, 95 мкл культурального розчину вилучали з лунок, використовуючи багатоканальну піпетку, та градієнтно розбавлений злитий протеїн, антитіло РО-Ї1 та позитивний контроль (ЕР17022), відповідно, додавали в кількості 40 мкл/лунка. Потім клітинну суспензію УикамиРор-1 переносили в завантажувальний резервуар, додавали (0 Ше планшета з клітинною культурою в кількості 40 мкл/лунка, та інкубували при 37 "С, 5 95 СО» протягом 5-6 год. Під час інкубування з протеїном, реагент Віо-Сіо"М видаляли та давали можливість повернутися до кімнатної температури. Виймали планшети для клітинної культури та поміщали їх при кімнатній
Зо температурі протягом 5-10 хв. Потім 40 мкл реагента Віо-сіо"М додавали до кожної лунки,
інкубували в безпечній шафі протягом 5-10 хвилин, та значення сигналу хемілюмінесценції зчитували з використанням багатофункціонального мікропланшетного рідера. 4. Результати
Як показано в фігурі 5, подібно до молекули позитивного контролю, злитий протеїн 9 за представленим розкриттям міг ефективно блокувати зв'язування клітин УшигКаї, які експресують
РО-1, з клітинами СНО/РО-1 1, та існувала концентрація лікарського засобу та залежний від дози ефект. Злитий протеїн 15 має таку саму здатність блокування, як і у злитого протеїна 9.
Приклад дослідження 4: Детектування афінності та кінетик зв'язування іп мйО з використанням Віасоге
Афінність досліджуваної молекули з людським або мишачим ТОаБ-В1ї або людським протеїном РО-1 1 визначали з використанням Віасоге 1200 (СЕ). Експериментальна процедура описується наступним чином:
Певна кількість вловлювача РО-Ї1/гаБ-Д захоплювалась чіпом протеїна А, та потім людський або мишачий ТавЕ-рВ1 (8915І С, С5Т) або людський РО-Ї 1 (біпо ВіоіодісаЇ) пропускали через поверхню біочіпа. Сигнал реакції детектувався в реальному часі, використовуючи Віасоге щоб отримати криві асоціації та дисоціації. Біочіп потім промивали та регенерували сумішшю гліцин-гідрохлоридна кислота (рН 1,5, СЕ). Буферний розчину, який використовувався в експерименті, являв собою буфер НВ5-ЕР (СЕ). Експериментальні дані пристосовували до (1:1) моделі Ленгмюра з використанням програмного забезпечення ВіАемаїнчаїйоп версії 4.1 вопмаге (СЕ), та отримували значення афінності, та як показано в Таблиці 3.
Таблиця З
Афінності злитих протеїнів за представленим розкриттям до ТЯЕ-В1 або людського РО-Ї 1 іп мійо тавг-рі тавг-рі й х Форма злитого протешу є показаною в Таблиці 2.
Активність зв'язування злитого протеїна є показаною в Таблиці 3. Результати показують, що злитий протеїн 9 та злитий протеїн 15 за представленим розкриттям мають надзвичайно високу афінність до людського, мишачого ТаЕ-Др1 та людського РО-І 1.
Приклад дослідження 5: аналіз інгібування репортерного гена ФМАОЗ 1. Мета дослідження:
В даному експерименті, елемент зв'язування ЗтаайЗ (З5ВЕ) з репортерним геном люциферази експресувався в клітинах Нерс2 для вивчення інгібіторного ефекта вловлювача
РО-ІЛ/ТаБ-В на Такг-р1-індуковану активацію таз, та активність вловлювача РО-І 1/Гав-р оцінювали іп міпо відповідно до значення ІСво. 2. Зразок дослідження: злитий протеїн 9, позитивний контроль (ЕР17022). 3. Спосіб дослідження
Клітини Нерй2 культивували в повному середовищі МЕМ (СЕ, 5НЗО243.01), яке містить 10945 ЕВ5 та пересівали кожні З дні. В перший день експеримента, 25 000 клітин на лунку інокулювали в 9б-лункові планшети (Согпіпу, 3903), та культивували при 37 С, 595 002 протягом 24 годин. На наступний день, середовище в планшетах для клітинної культури відкидали, та 100 нг плазміди ЗТР-І их переносили в лунку. Клітини додатково культивували при 37 "С, 5 95 СО» протягом 24 годин. За шість годин перед додаванням зразка дослідження, повне середовище в 96-лунковому планшеті відкидали, та 80 мкл неповного середовища (МЕМ--0,5 95
ЕВ5) додавали до кожної лунки. Через 6 годин, додавали 10 мкл людського Такв-вВ1 (Ва, 240-
В-010) розчину, отриманого в неповному середовищі (кінцева концентрація 2 нг/мл), та 10 мкл зразка дослідження (кінцева концентрація становить 500, 50, 5, 0,5, 0,05, 0,005, 0,0005 та 0 нм), розчинник людського ТЯЕ-В1 використовувався як контроль, та клітини культивували при 37 "С, 5 96 СО» протягом інших 18 год. Потім, 100 мкл отриманого субстрату люціферази системи для аналізу люціферази І исітегазе Аззау ОМЕ-С1о М (рготеда, Еб6110) додавали до кожної лунки, та інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин в темряві, та потім значення люмінесцентного сигналу зчитували, використовуючи багатопланшетний рідер Місіог З (Реткіп
ЕІтею. Значення ІСво зразка дослідження отримували шляхом обчислення з використанням програмного забезпечення даних Старпраа Р'гізт 5.0.
Фігура 6 показала, що злитий протеїн 9 інгібував ТаЕр-індуковану активність репортера рОоМАОЮЗ за залежним від дози способом, та мав ефективність та ІСво (концентрація, необхідна для інгібування 50 95 від максимальної активності), співставиму з тією, що у позитивного контроля ЕР17022. Результати досліджень антитіла РО-І1 показали, що воно не демонструвало ніякого інгібіторного ефекту (ІСзо»500 нм).
Приклад дослідження 6: Іп міго ЮОеєїесіоп ої ІЄМу зестейоп бу РВМСО диє ю туберкуліном (ТВ) вітшайоп 1. Мета дослідження
Для того, щоб дослідити активацію Т-лімфоцитів з використанням вловлювача РО-Ї 1/ТавБ-рД, моноядерні клітини периферичної крові людини (РВМС) збирали та очищували, та стимулювали іп міго туберкуліном (ТВ) протягом 5 днів для того, щоб детектувати рівень секреції цитокіну
ІЕМУу. 2. Зразок дослідження 1 Людський да; 2 Антитіло РО-І 1;
З Злитий протеїн 9; 4 Контроль 1 (20Т-Ес): ЕСО (20-136)-Ес; 5 Антитіло РО-І 1 «контроль 1 (20Т-Ес). 3. Спосіб дослідження 20 мкл туберкуліну додавали до свіже виділеного та очищеного РВМС, 15 мл, приблизно
Зх107, та культивували в інкубаторі протягом 5 днів при 37 "С, 5595 СО». На 6-й день, культивовані клітини збирали та центрифугували, промивали один раз РВ5 та повторно суспендували в свіжому середовищі зі щільністю, доведеною до 1 х 106 клітин/мл, 90 мкл повторно суспендованих клітин додавали в 9б-лунковий планшет. 10 мкл/лунка різних концентрацій антитіл додавали окремо до відповідних лунок вищезазначеного 96-лункового
Зо планшета з клітинною культурою, 10 мкл РВ5 додавали в контрольну та порожню групу, відповідно. Потім, планшет з клітинною культурою інкубували в інкубаторі протягом трьох днів при 37 "С, 595 СО». Планшет з клітинною культурою видаляли, та супернатант відбирали з кожної лунки після центрифугування (4000 оборотів за хвилину, 10 хвилин). Після 10-кратного розбавлення, секреція ІЕМ-у детектувалася за допомогою ЕГІЗА (набір для детектування людського ІЄМ-у, МЕОВІОЗБСІЕМСЕ, ЕНС 102а4.96), відповідно до інструкцій щодо використання реагентів для конкретних операцій. Як показано в Таблиці 4, всі зразки злитого протеїна вловлювача РО-Ї1/ТСЯЕ-В були здатні посилювати секрецію цитокіну ІЕМ-у активованими Т- лімфоцитами, та існував ефект, залежний від концентрації дози лікарського засобу.
Таблиця 4
Результат секреції цитокіну ТЕМ-у
Максимальна Мінімальна Кратність
Антитіло ЕС5О(нНМ)) секреція ІРМу секреція ІЄМу (секреція ІЕМУ) (пг/мл) (пг/мл) рец 7 4. Результати
Як показано на Фігурі 7 та в Таблиці 4, злитий протеїн 9 був здатний посилювати активований Т-лімфоцит щодо секретування цитокінів ІЕМ-у за залежним від дози способом, та мав сильніший ефект активації, ніж у антитіла РО-1 1 та 20Т-Еб.
Приклад дослідження 7: Рпагтаєокіпеїйс емаІчайоп
Три щури 50, самки, були придбані у Ле 5і Ле І абогайгу Апітаї Со., | КЗ. та утримувались в 12/12-годинному циклі світло-т-емрява (температура становила 2453 "С, відносна вологість становила 50-60 95), щури мали вільний доступ до води та їжі. В день проведення експеримента, щурам 50 ін'єкційно вводили злитий протеїн в хвостову вену в дозі 6 мг/кг та об'єм ін'єкції становив 5 мл/кг.
Кров збирали в моменти часу: 15 хв., 7 год. (в перший день), 24 год. (2-й день), 3-й день, 4-й день, 6-й день, 8-й день, 10-й день, та 15-й день після введення, 200 мкл крові (що еквівалентно 100 мкл сироватки) було взято з нижньої частини вени щура. Зразок крові витримували при кімнатній температурі протягом 30 хв., щоб дозволити аглютинацію, та потім центрифугували при 10000 д протягом 10 хвилин при 4 "С. Супернатант одразу відбирали та зберігали при - 80 "С. Концентрація злитого протеїна в сироватці вимірювалась з використанням ЕГІЗА.
Спосіб вимірювання описується наступним чином: а. 9б-лункові планшети покривали в кількості 100 мкл/лунка людського РО-І1-Ніб в концентрації 2 мкг/мл, протягом ночі при 4 "С. р. Промивали 4 рази 250 мкл їхРВ5Т, 250 мкл 5 95 молока РВ5 додавали для блокування при 37 "С протягом З годин. с. Промивали 4 рази 250 мкл 1хРВ5Т, додавали 100 мкл градієнтно розбавленого зразка сироватки, та інкубували при 37 "С протягом 1 години, злитий протеїн 9 служив як позитивний контроль.
Ї. Промивали 5 рази 250 мкл іїхРВ5Т. е. Додавали 100 мкл/лунка біотинельованого анти-людського антитіла ТОБЕ-РВІ (820), та інкубували протягом 1 години при 37 "С.
Ї. Промивали 5 рази 250 мкл їх РВ5Т. 9. Додавали 100 мкл/лунка ГМВ, інкубували протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, та реакцію зупиняли шляхом додавання 100 мкл 1 М Н25Ох.
А. Поглинання при 450 нм вимірювали на мікропланшетному рідері, та дані аналізували з використанням прорамного забезпечення Старпраай Р'гізт 5.
Таблиця 5
Т1/2 злитого протеїна у щура 50
Зо Результати ФК аналізу показали, що період напіввиведення злитого протеїна 9 за представленим розкриттям у щурів становив приблизно 236 год. (9,8 днів), дивіться таблицю 5.
Приклад дослідження 8: Ефект вловлювача РО-ІЇ1/ТаБ-Д на мишачий підшкірний ксенотрансплантат людського раку молочної залози МОА-МВ-231
Лінія мишей, яка використовуються в даному експерименті, являла собою самки мишей
МОБ/5ЗСІОЮ (Самепв). Моноядерні клітини периферичної крові людини, які використовуються в експерименті, екстрагували зі свіже зібраної крові, та спосіб екстракції відбувався наступним чином: Гепариновий антикоагулянт венозної крові змішували з таким самим об'ємом РВ5, який містить 295 ЕВ5, та після змішування, 25 мл розбавленої крові повільно додавали до центрифужної пробірки, яка містить 15 мл розчину для розділення лімфоцитів, та центрифугували при 1200 9 протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Лімфоцитний шар відбирали піпеткою в іншу центрифужну пробірку; клітини промивали РВ5 та центрифугували при 300 уд протягом 8 хвилин при кімнатній температурі. Після повторення один раз, клітини повторно суспендували в середовищі АРМІ-1640, яке містить 10 95 ЕВ5, та клітини додавали в б-лунковий планшет, який попередньо покривали антитілом СОЗ (ОКТЗ, 40 нг/мл) в кількості 2х105 клітин/лунка (2 мл), та потім розташовували в інкубаторі при 37 "С протягом 4 днів. Зразок дослідження: 1 порожній контроль: РВ5; 2 злитий протеїн 9: 4,8 мг/кг;
З злитий протеїн 9: 24 мг/кг; 4 РО-І1 антитіло: 4 мг/кг; 5 РО-Ї 1 антитіло: 20 мг/кг; 6 РО-Ї 1 антитіло 4 мг/кг я контроль 1 (20Т-Ес) 2,14 мг/кг; 7 Контроль 1 (20Т-Ре):2,14 мг/кг.
Клітини МОА-МВ-231 повторно суспендували в безсироватковому середовищі АЕРМІ-1640, та змішували з таким самим об'ємом Матрігелю, 100 мкл (2,3х109) інокулювали підшкірно в правий бік мишей МОБ/5СІЮ. Через 11 днів по тому, тварини, які несуть надвеликий розмір або надмалий розмір пухлини були виключені, мишей рандомізували на групи, по 9 тварин в кожній групі. 5х105 стимульованого РВМС (60 мкл) ін'єкційно вводили в тканини пухлини, та РВМС, який залишився, додатково культивували без стимулювання. Через тиждень, 5х106 РВМС (100 мкл) внутрішньочеревно ін'єкційно вводили мишам, які несуть пухлину, як перший раунд ін'єкції.
Протягом експериментального періоду, 2 з половиною раундів, було зроблено в цілому 5 ін'єкцій РВМО. В день першої внутрішньопухлинної ін'єкції, проводили внутрішньочеревне введення, яке здійснювали три рази на тиждень, в цілому було 14 введень. Режим введення представлений в Таблиці б. Об'єм пухлини та масу тіла вимірювали двічі на тиждень.
Експериментальні результати є показаними в Таблиці 7. В кінці експеримента, мишей, які несуть пухлину, піддавали евтаназії, та пухлину видаляли та зважували.
Таблиця 6
Дослідження групування та введення 1 Порожній контроль: РВ5 01 2 Зпитий протеїн 9-4,8 мг/кг
З Зпитий протеїн 9-24 мг/кг 4 Антитіло РО-І-1-4 мг/кг 5 Антитіло РО-І-1-20 мг/кг б Антитіло РО-І.1-4 мг/кг - контроль 1-2,14 мг/кг 4 мг/кг 2,14 мг/кг 7 Контроль 1-2,14 мг/кг 2,14 мг/кг
Таблиця 7
Ефект злитого протеїна 9 на мишачий підшкірний трансплантат МОА-МВ-231
Середнє Середнє Середнє Середнє
Р (проти значення | значення ж «у, Тс | значення ї «тс | значення ї РВО) я ЗЕМ ЗЕМ о ЗЕМ о ЗЕМ ! овал в2,вж2,9 | 62344433 941,1554,9 0,859:20,063 контроль: РВ5 2 Злитий 372 протеїн 9-4,8і 62,653,5 йИ14,6б:17,1759 4 о, 618,9ж228,7736,68 950,45420,025774 2,06Е-05
МГ/КГ о
З литий протеїн) в2,7ж3,3 829,8ж22,Б 523 95, 3442,67450,76 950,3670,026777 2,20Е-06 9-24 мг/кг 8 90
ОО РОІ в3м435 |45а дови 02 | 72284658» |24,91 9510,59240,05277| 0,0050 антитіло - 4 мг/кг 4 до 500 вав, ідвванітоя ВО 1741, вж32,учні22,70 9510,65020,03377). 0,0100 антитіло-20 мг/кг 1 до б РО-І 1 антитіло - 4 626533 |447,5х2ов| ЗІЗ |вбо, 245,3 30,96 9510,56620,03972| 0,0012 мг/кг-контроль 8 90 1-2,14 мг/кг 7, Контроль 1- в0,743,3 | 601,5430,9 3,58 95| 861,7234,2 | 8,83 95 | 0,65220,0417) 0,0178 2,14 мг/кг
День 0: час для першого введення; "р«е0,05 ""р«е0,01 "ра«0,001, в порівнянні з РВ5 за Іі-критерієм
Ст'юдента.
Результати є показаними на Фігурі 8, злитий протеїн 9 антитіла (4,8 мг/кг, 24 мг/кг) може в значній мірі інгібувати ріст мишачого підшкірного трансплантату людського раку молочної залози МОА-МВ-231. Виявлено дозозалежне співвідношення між високими та низькими дозами, та воно перевищувало значення еталонного лікарського засобу антитіла РО-І1 (4 мг/кг, 20 мг/кг), контрольної молекули Таг-РВ|І 20Т-ЕС (2,14 мг/кг) та комбінованої групи (РО-І 1 антитіло -4 мг/кг ж 20 Т-ЕС-2,14 мг/кг) в еквівалентній молярній дозі, відповідно. Кожна доза злитого протеїна 9 підтримувала бажаний протипухлинний ефект, починаючи з 14-ого дня після введення; в порівнянні з антитілом РО-І 1-20 мг/кг, злитий протеїн 9 в високій дозі мав очевидну перевагу (р«0,05). Через 25 днів після введення, протипухлинний ефект кожного антитіла досягав оптимального рівня. Протипухлинний показник низької та високої дози злитого протетїна 9, та антитіло РОІ-1, та комбінованої групи становив 37,24 95, 52,38 95, 30,24 95, 28,01 95, та 31,38 95, відповідно. Через 32 дні після введення, протипухлинний ефект злитого протеїна 9 був ще більш значним. 95 ТО низької та високої дози в групі становив 36,68 95 та 50,76 95, відповідно, та об'єм пухлини статистично відрізнявся, в порівнянні з контрольною групою (р«е0,05).
Приклад дослідження 9: Фізична стабільність вловлювача ВО-Ї 1/ТаБ-В
Даний приклад дослідження використовувався для того, щоб детектувати стабільність злитого протеїна 9 та злитого протеїна 15.
ДСК (диференціальна скануюча калориметрія) використовувалась для того, щоб детектувати термічну стабільність різних антитіл, та стабільність порівнювалась в різних буферних системах. Буферні системи включають такі як 10 мМ ацетат/135 мМ Масі (рН 5,5) та 10 мМ ацетат/9 95 трегалози (рН 5,5).
Зразок розчиняли в відповідних буферах, та концентрація контролювалась на приблизно 50 мг/мл. детектування проводилась з використанням МістоСа!" МР-Сарійагу О52С (Маїмет). Перед дослідженням, кожен зразок та порожній буфер дегазували протягом від 1 до 2 хв., використовуючи пристрій вакуумної дегазації. В кожну лунку планшета додавали 400 мкл зразка або порожнього буфера (завантажувана кількість становила 300 мкл). Нарешті, до двох пар лункових планшетів додавали 1495 ЮОесоп 90 та аанго, відповідно, та були готові для промивання. Зразки завантажували в планшет, та потім планшет герметизували пластиковою кришкою. Сканування починалося при температурі 25"С та закінчувалося при 100 С, та швидкість сканування становить 60 "С/год. Результати є показаними в таблиці 8, яка вказує, що
Зо як злитий протеїн 9, так і злитий протеїн 15, показують гарну термічну стабільність в даних двох системах дослідження.
Таблиця 8
Дослідження термічної стабільності
Періодичну стабільність в певній концентрації досліджували шляхом моніторингу чистоти з використанням ексклюзіонної ВЕРХ, ілюстративні умови, наприклад, концентрація зразка контролюється на приблизно 50 мг/мл, в 10 мМ ацетат/135 мМ Масі (рН 5,5), та стабільність порівнювали в умовах, таких як 5 циклів заморожування та відтавання при -807С по відношенню до після зберігання при 40 "С протягом одного місяця. Колонка ВЕРХ Хргідає з протеїном ВЕН 5ЕС 200А (Маїег5) використовувалась для детектування. Наступні результати є показаними в таблиці 9, дані два злиті протеїни показали гарну стабільність.
Таблиця 9
Стабільність 00111111 | Злитийпротеїно(ле | ЗлитийпротеїніБ(ло) відтавання
Примітка: Лоо означає швидкість зміни.
Приклад дослідження 10: Хімічну стабільність злитого протеїна
Дезамідування являє собою спільну хімічну модифікацію, яка буде впливати на стабільність антитіла на пізній стадії, особливо зазвичай її вибирають для уникнення або зменшення сильно дезамідованої модифікації деяких амінокислот в ділянках СОН, наскільки це є можливим через мутацію. 1600 мкг антитіла, яке слід досліджувати, розчиняли в 200 мкл 10 мМ ацетату/135 мМ
Масі (рН 5,5), та розташовували в інкубаторі при 40 "С. Зразки відбирали на день 0, 14 та 28 для ферментативного аналізу гідролізу. 100 мкг кожного зразка, відібрані в різні моменти часу, розчиняли в 100 мкл 0,2 М Нів-НСЇ, 8 М Сиа-НСЇІ розчину, рН 6,0; додавали З мкл 0,1 а/мл ОТ, та потім зразок інкубували на водяній бані при 50 "С протягом 1 години. Потім зразок піддавали ультрафільтрації два рази з 0,02М Нів-НСЇ (рН 6,0), та розщеплювали протягом ночі при 37 "С на водяній бані шляхом додавання З мкл 0,25 мг/мл трипсину. Модифікацію дезамідування досліджували, використовуючи РХ-МС Адіепі 6530 О-ТОЕ, та результати є показаними в
Таблиці 10 нижче.
Таблиця 10
Модифікація дезамідування
Важкий - код ланцюг ланцюг
ПРИМІТКА: М являє собою здатний до виявлення модифікований аспарагин, та число представляє собою положення в легкому ланцюзі або важкому ланцюзі від М-кінця.
Відсотковий вміст являє собою співвідношення модифікації дезамідування, яке детектується
РХ-МС, до сигналу всіх пептидів в такому сайті.
Результати мас-спектрометрії показали, що два злиті протеїни не мають очевидних сайтів модифікації дезамідування, припускаючи, що злиті протеїни мають гарну хімічну стабільність.
Приклад отримання
Ілюстративний спосіб отримання фармацевтичної композиції (препарата) злитого протеїна
Перша стадія: брали певну кількість вихідного розчину очищеного злитого протеїну ТОаг-р- рецептора, та заміна розчинника (переважно ультрафільтрацією) проводилась, використовуючи буфер, який не містить протеїн (такий як 10 мМ, рН 6,2 буфер лимонної кислоти та натрію цитрату) пропускаючи через ультрафільтраційну мембрану щонайменше 6б-кратний об'єм, потім протеїн концентрували до приблизно 70 мг/мл. До вихідного розчину додавали певний об'єм сахарози, та змішували до досягнення кінцевої концентрації сахарози 80 мг/мл. До вихідного
Зо розчину додавали певний об'єм Ту'еєп-80, та змішували до досягнення кінцевої концентрації
Тмжеєп-80 0,4 мг/мл. 10 мМ цитратний буфер з рН 6,2 додавали до досягнення конкретного об'єму таким чином, щоб отримати концентрацію протеїна 50 мг/мл (інші препарати, які слід досліджувати, або стабільні препарати отримували відповідно до подібних стадій).
Після того, як продукт був відфільтрований, відбирали зразки для дослідження на стерильність з метою контролю середовища. Вихідний розчин пропускали через фільтр РМОБ- 0,22 мкм, та фільтрат збирали.
Друга стадія: об'єм наповнення регулювали до 6,3 мл, фільтрат завантажували в б мл ємність, яку потім закупорювали пробкою, та зразки відбирали на початку, в середині та в кінці наповнення для того, щоб виявити різницю в об'ємі наповнення, з метою контролю середовища.
Третя стадія: запустили машину для укупорки, укупорювали алюмінієвими ковпачками.
Четверта стадія: проводився візуальний огляд, щоб підтвердити, що продукт немає ніяких дефектів, таких як неточне завантаження. Етикетки друкували та маркували на ємностях; картонні етикетки друкували, картонні коробки складали, завантажували ємностями та маркували.
Приклад отримання 1. Скринінг значення рН для буферної системи препарату злитого протеїна рецептора ТаБ-р
Препарати злитого протеїна рецептора ТОБ-р (злитий протеїн 9) отримували, використовуючи наступні буфери, з концентрацією протеїна 50 мг/мл: 1) 10 мМ гістидин-оцтової кислоти, рН 5,0; 2) 10 мМ гістидин-оцтової кислоти, рН 6,0;
З) 10 мМ гістидин-оцтової кислоти, рН 6,5; 4) 10 мМ натрію дигідрофосфат-динатрію гідрофосфат, рн 7,0; 5) 10 мМ натрію дигідрофосфат-динатрію гідрофосфат, рН 7,5.
Кожен препарат відфільтровували та додавали 1,2 мл/ємність в 2 мл ємність для ін'єкцій, виготовлену з нейтрального боросилікатного скла. Ємність для ін'єкцій забезпечувалась пробкою, закупорювалась та герметувалась. Зразки відбирали та піддавали високій температурі 40"С та експериментам щодо струшуванні. Експериментальні результати є показаними в
Таблиці 11. Результати показують, що злиті протеїни рецептора ТОБЕ-В мають кращу стабільність при рН 6,0-6,5.
Таблиця 11
Результати скринінгу експерименту з примусовим розкладанням ния ЗЕС (до
Мо. Точка часу Зовнішній вигляд 40'сМ2 прозорий та безбарвний 40 с М2 прозорий та безбарвний прозорий та безбарвний 27 | 969 | 03
З 07 струшуванням! ведика кількість флокулентного осаду 40 с М2 прозорий та безбарвний безбарвний та дрібні частинки 4 07 струшуванням ведука кількість флокулентного осаду 40 с М2 прозорий та безбарвний безбарвний та дрібні частинки 5 07 струшуванням! ведика кількість флокулентного осаду 4076 Ма прозорий та безбарвний
Примітка: Умови струшування являли собою: 01: 130 об./хв., 02: 200 об./хв., 03-07: 300 об./хв.; О означає день, Т означає час, та М означає місяць.
Приклад отримання 2. Скринінг буферної системи для препаратів злитого протеїна рецептора ТаБ-В
Препарати злитого протеїну рецептора ТОБ-Рр (злитий протеїн 9) отримували, використовуючи наступні буфери, з концентрацією протеїна 50 мг/мл: 1) 10 мМ бурштинової кислоти-натрію сукцинату, рН 6,0; 2) 10 мМ лимонної кислоти-натрію цитрату, рН 6,0; 3) 10 мМ лимонної кислоти-натрію цитрату, рн 6,5; 4) 10 мМ натрію дигідрофосфату-динатрію гідрофосфату, рн 6,5; 5) 10 мМ гістидину-гідрохлориду, рН 6,5.
Кожен препарат фільтрували, та додавали по 1,2 мл/ємність в 2 мл ємність для ін'єкцій, виготовлену з нейтрального боросилікатного скла. Ємність для ін'єкцій забезпечувалась пробкою, закупорювалась та герметизувалась. Зразки відбирали для експеримента щодо струшування (при 25 "С, 300 об./хв.). Експериментальні результати є показаними в Таблиці 12.
Результати показують, що велика кількість дрібних частинок спостерігалася в групі натрію дигідрофосфату-динатрію гідрофосфату на б-ий день при струшуванні, та агрегати досягали 1,8 95, виявлені з використанням 5ЕС. Однак, в інших групах іноді спостерігалися лише крихітні частинки. Може бути видно, що стабільність злитого протеїна рецептора ТаЕ-р в буферних системах з лимонної кислоти, гістидину та сукцинату є кращою, ніж у фосфатних буферних системах.
Таблиця 12
Скринінг результатів експеримента для буферної системи та значення рн
Мо Тожачюу | Зовнішнйситяш «регу мономер Крани
Мо Точка часу Зовнішній вигляд 1100 1111 прозорийтабезбаррвний.07/-:/ | 16 | 981 | 03 о І|зіструшуванням Об зрідкакрихтнічастинки.д | 7 | 977 | 06 2 100 0 прозорийтабезбаррвний,.7/-:/ | 175 | 9850 | 05 о І|зіструшуванням Об зрідкакрихтнічастинки.д | 15 | 978 | 0,7 3 100 0 прозорийтабезбаррвний.0//-:/ | 16 | 9850 | 04 о ІзіструшуваннямОб зрідкакрихітнічастинки.д//-/- | 7 | 977 | 06 4 100 0 прозорийтабезбаррвний.07/-:/ | 16 | 9850 | 04 о |зіструшуваннямОб (великакількістькрихітнихчастинок | 1,8 | 976 | 0,7
Щ|00 0 прозорийтабезбаррвний,.7/-:/ | 175 | 9850 | 05 (| Ізіструшуванням Об |зрідкакрихітнічастинки.д | 16 | 978 | 0,7
Примітка: О представляє собою дні.
Приклад отримання 3. Додатковий скринінг буферної системи для препарата злитого протеїна рецептора ТаБ-р 5 Буфер з рН 6,2, який містить 10 мМ гістидину-гідрохлориду або 10 мМ лимонної кислоти- натрію цитрату використовувався для отримання препарата, який містить 80 мг/мл сахарози, 0,4 мг/мл полісорбату 80, злитий протеїн рецептора ТОаЕ-р (злитий протеїн 9) в концентрації 50 мг/мл. Кожен препарат фільтрували, та додавали по 1,2 мл/ємність в 2 мл ємність для ін'єкцій, виготовлену з нейтрального боросилікатного скла. Ємність для ін'єкцій забезпечувалась пробкою, закупорювалась та герметизувалась. Зразки зберігали при 25 "С для аналіза на стабільність, б-місячне детектування з використанням 5ЕС або невідновлюючого СЕ-505.
Експериментальні результати є показаними в Таблиці 13. Результати показують, що система лимонної кислоти-натрію цитрату є кращою, ніж гістидин-гідрохлоридна система (Мб 5ЕС агрегат: 1,895 проти 2,2 90; невідновлюючий СЕ-505: 94,5 95 проти 92,2 965); Таким чином, система лимонної кислоти може бути вибрана як буферна система для злитого протеїна рецептора Таг-р.
Таблиця 13
Результати дослідження щодо прискореної стабільності для буферної системи скринінгу при 2576
Буферна ше невідновлюючий цитратна М2 о |проворий./// | 1,77 | 975 | 08 | на буферна ор" »|» |» каламутних 1,68 97,9 0,4 94,5 частинок то |прогорий,//// | 15 | 97,7 | 08 | 93 істидинова буферна система велика кількість каламутних 22 97,3 0,5 922 «ши |»| |» | »
Примітка: Т означає час; О означає день; М означає місяць.
Приклад отримання 4. Скринінг стабілізаторів для препаратів злитого протеїна рецептора такг-р
Препарати злитого протеїна рецептора ТОБ-р (злитий протеїн 9) отримували, використовуючи наступні буфери з різними сахаридами, з концентрацією протеїна 50 мг/мл: 1) 10 мМ лимонної кислоти-натрію цитрату, 80 мг/мл сахарози, рН 6,2; 2) 10 мМ лимонної кислоти-натрію цитрату, 80 мг/мл с, с-трегалози дигідрату, рН 6,2. Кожен препарат фільтрували, та додавали по 1,2 мл/ємність в 2 мл ємність для ін'єкцій, виготовлену з нейтрального боросилікатного скла. Ємність для ін'єкцій забезпечувалась пробкою, закупорювалась та герметизувалась. Зразки відбирали для експериментів щодо довготривалого зберігання при кімнатній температурі, 25 "С, та при пониженій температурі, 2-8 "С.
Експериментальні результати є показаними в Таблиці 14. Результати показують, що сахароза та трегалоза мають подібні ефекти на стабільність злитого протеїна рецептора ТИБ-В (злитий протеїн 9). Сахароза була вибрана як стабілізатор злитого протеїна рецептора ТаБ-р (злитий протеїн 9). Коли концентрація сахарози становить 80 мг/мл, осмотичний тиск становить від приблизно 300 мосмоль/кг, який є близьким до ізотонічного, тому концентрація сахарози може становити 80 мг/мл.
Таблиця 14
Результати експериментів щодо скринінгу типів сахарида 11101771 (агрегат |мономер |фрагмент| СЕ-505 (95) прозорий та зе ше) мів 2576 Мб каламутних 1,68 97,9 0,4 94,5 частинок о прозорий та частинки о прозорий та
Примітка: Т означає час; та М означає місяць.
Приклад отримання 5. Скринінг поверхнево-активних речовин для препаратів злитого протеїна рецептора ТаБ-р
Препарати злитого протеїна рецептора ТОБ-р (злитий протеїн 9) отримували, використовуючи наступні буфери з різними типами поверхнево-активних речовин в різних концентраціях, з концентрацією протеїна 50 мг/мл: 1) 10 мМ гістидину-гідрохлорида, 0,1 мг/мл полісорбату 20, рн 62; 2) 10 мМ гістидину-гідрохлорида, 0,2 мг/мл полісорбату 20, рн 62; 3) 10 мМ гістидину-гідрохлорида, 0,4 мг/мл полісорбату 20, рн 62; 4) 10 мМ гістидину-гідрохлорида, 0,6 мг/мл полісорбату 20, рн 62; 5) 10 мМ гістидину-гідрохлорида, 0,8 мг/мл полісорбату 20, рн 62; 6) 10 мМ гістидину-гідрохлорида, 0,1 мг/мл полісорбату 80, рн 62; 7) 10 мМ гістидину-гідрохлорида, 0,2 мг/мл полісорбату 80, рн 62; 8) 10 мМ гістидину-гідрохлорида, 0,4 мг/мл полісорбату 80, рн 62; 9) 10 мМ гістидину-гідрохлорида, 0,6 мг/мл полісорбату 80, рн 62; 10) 10 мМ гістидину-гідрохлорида, 0,8 мг/мл полісорбату 80, рн 6 2.
Кожен препарат фільтрували, 0,5 мл препарата ін'єкційно вводили в 50 мл сольового розчину для ін'єкції або в 5 95 ін'єкційного розчину глюкози, для того, щоб досягти концентрацію протеїна 0,5 мг/мл після розбавлення. Спостерігали стабільність зразка після розбавлення.
Результати експеримента є показаними в Таблиці 15. Результати показують, що коли концентрація полісорбата 20 в препараті досягала більше, ніж 0,2 мг/мл, кількість нерозчинних частинок в значній мірі зменшувалась після розбавлення; як і для полісорбата 80, нерозчинні частинки, які утворюються внаслідок розбавлення натрію хлоридом, зменшувались разом із
Зо збільшенням концентрації полісорбату 80. Коли концентрація полісорбата 80 досягала 0,4 мг/мл або більш, частинки більші, ніж 10 мкм зменшувались до менше, ніж 10 частинок/мл.
Таблиця 15
Результати експеримента щодо скринінгу полісорбата - розбавлення та струшування
Нерозчинні частинки після розбавлення (частинок/мл)
Мо. 0,9 зо масі 1454 | 18 | 0 | зі8 | 10 | 0 772 | 48 | 1 | 0 | 04 | 2 | 0 73 | 65 | 2 | 0 | 17 | з ! 0 774 | 25 | 1 | 0 | 02 | 1 Ї 0 | 12 | з | 0 | 8 | 2 | 0 76 | 58 | 936 | 1 | 46 | 1 | 0 77 | 668 | 14 | 0 | 30 | 1 /! 0 '- 778 | 7135 | з | 0 | 9 | 4 | 0 7И57Зв8 5БЮБИМ.| 623 | 8 | 0 | 30 | 1 ! 0 70 | ліз | 2 | 0 19 | 6 0 5 Приклад отримання 6. Додатковий скринінг поверхнево-активних речовин для препаратів злитого протеїна рецептора Таг-р
Препарати злитого протеїна рецептора ТОБ-Рр о (злитий протеїн 9) отримували, використовуючи наступні буфери з різними типами поверхнево-активних речовин, з концентрацією протеїна 50 мг/мл: 1) 10 мМ лимонної кислоти-натрію цитрату, 0,4 мг/мл полісорбату 80, рН 6.2; 2) 10 мМ лимонної кислоти-натрію цитрату, 0,6 мг/мл полісорбату 20, рН 6,2. Кожен препарат фільтрували, та додавали по 1,2 мл/ємність в 2 мл ємність для ін'єкцій, виготовлену з нейтрального боросилікатного скла. Ємність для ін'єкцій забезпечувалась пробкою, закупорювалась та герметизувалась. Зразки відбирали для експериментів щодо довготривалого зберігання при пониженій температурі, 2-8 С.
Експериментальні результати є показаними в Таблиці 16. Результати показують, що полісорбат 80 має кращий ефект стабільності на злитий протеїн рецептора ТОаЕ-р (злитий протеїн 9). Тому, полісорбат 80 був вибраний як поверхнево-активна речовина для злитого протеїна рецептора ТОР-Р (злитий протеїн 9).
Таблиця 16
Результати експеримента щодо довготривалої стабільності при 2-8 "С для скринінга полісорбату
Мо. |Гочка часу| Зовнішній вигляд ЗЕС (Се Невідновлюючий ! СЕ-5О (95) прозорий та прозорий та прозорий та прозорий та ме З(веюарний 1 | ом 1 мо1вве
Продовження таблиці 16 прозорий та то З(беюарний 6 | 9061 ее ян зх | 5) 81 частинок частинок велика кількість частинок та 1,7 97,8 04 96,7 каламутність
Примітка: Т означає час; О означає день; М означає місяць.
Приклад отримання 7. Дослідження сумісності мембранних фільтрів для препаратів злитого протеїна рецептора ТаБ-р
Злитий протеїн рецептора Таг-Д (злитий протеїн 9) формулювали в концентрації 50 мг/мл в мМ буфері лимонної кислоти та натрію цитрату, 80 мг/мл сахарози, 0,4 мг/мл полісорбату 80, рН 6,2. Препарати пропускали через мембранний фільтр РЕ5 0,22 мкм та мембранний фільтр
РМОРЕ, відповідно, та зразки відбирали напочатку, в середині та в кінці дослідження.
Експериментальні результати є показаними в Таблиці 17. Вміст протеїна, зовнішній вигляд 10 та аналіз щодо чистоти показують, що злитий протеїн рецептора ТОаг-р (злитий протеїн 9) був стабільним під час контактування з мембранним фільтром, та препарат порівнювали з як РЕ5, так і РХМОЕ мембранними фільтрами.
Таблиця 17
Результати дослідження щодо сумісності з мембранними фільтрами
Концентрація невіднов- Вміст
Мембранний потен ЗЕС 96 люючий СЕ- | полісорбату фільтр Р ЗОЗ о мг/мл мг/мл агрегат |мономер (фрагмент! //-:/ ЇЇ ( то 777777 1 508 | 08 1 989 | 03 | 981 | 046
РЕВ, початковий буд 98,9 0,2 98,0 0,46 фільтрат
РЕБ, середній 98 98,9 03 98,0 0,46 фільтрат
РЕЗ, кінцевий 50 98,9 0,2 98,0 046 фільтрат
РМОР, початковий доб 98,7 04 97,9 0,46 фільтрат
РМОР, середній 50 98,8 0,3 98,0 046 фільтрат
РМОР, кінцевий 50,0 98,8 0,3 97,9 045 фільтрат
Примітка: Т означає час.
Приклад отримання 8. Ліофілізація препарата злитого протеїна рецептора ТаБ-р
Препарат злитого протеїна рецептора Таг-р (злитий протеїн 9) який містить концентрацію 50 мг/мл злитого протеїну рецептора ТагЕ-р (злитий протеїн 9), 80 мг/мл сахарози, та 0,4 мг/мл полісорбату 80, отриманого з буфера рН 6,2, який містить 10 мМ лимонної кислоти-натрію цитрату. Антитіло додавали в кількості 6,3 мл/ємність в 20 мл ємність, та розташовували в морозильній камері для глибокого заморожування для висушування при заморожуванні.
Процедури ліофілізації включають попереднє заморожування, первинне висушування та вторинне висушування. Після завершення процеса ліофілізації, ємності закупорювали в вакуумі.
Зразки відновлювали, та порівняння робилось між перед та після висушування при заморожуванні. Результати показують, що відновлений розчин може зберігатися прийнятну ефективність в порівнянні з розчином препарата.
Таблиця 18
Стадії ліофілізації препаратів
Приклад отримання 9. Інші необов'язкові композиції препарата
Крім того, представлене розкриття також передбачає інші композиції фармацевтичних препаратів злитого протеїна рецептора ТОаЕ-р (злитий протеїн 9): (1) 70 мг/мл злитого протеїну 9, 75 мг/мл сахарози, 0,4 мг/мл полісорбату 80, та 20 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, кінцевий рН становить 6,4; (2) 80 мг/мл злитого протеїну 9, 85 мг/мл сахарози, 0,5 мг/мл полісорбату 80, та 15 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, кінцевий рН становить 6.2; (3) 60 мг/мл злитого протеїну 9, 90 мг/мл сахарози, 0,6 мг/мл полісорбату 80, та 5 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, кінцевий рН становить 6.2; (4) 30 мг/мл злитого протеїну 9, 60 мг/мл сахарози, 0,3 мг/мл полісорбату 80, та 30 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, кінцевий рН становить 6,3; (5) 90 мг/мл злитого протеїну 9, 95 мг/мл сахарози, 0,2 мг/мл полісорбату 80, та 10 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, кінцевий рН становить 6,0; (6) 100 мг/мл злитого протеїну 9, 70 мг/мл сахарози, 0,1 мг/мл полісорбату 80, та 25 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, кінцевий рН становить 6,5; (7) 50 мг/мл злитого протеїну 9, 80 мг/мл сахарози, 0,4 мг/мл полісорбату 80, та 10 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, кінцевий рН становить 7,0; (8) 50 мг/мл злитого протеїну 9, 80 мг/мл сахарози, 0,4 мг/мл полісорбату 80, та 10 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, кінцевий рН становить 7,5; (9) 50 мг/мл злитого протеїну 9, 80 мг/мл сахарози, 0,4 мг/мл полісорбату 80, та 10 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, кінцевий рН становить 5,0; (10) 60 мг/мл злитого протеїну 9, 70 мг/мл сахарози, 0,5 мг/мл полісорбату 80, та 15 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, кінцевий рН становить 5,5; (11) 40 мг/мл злитого протеїну 9, 80 мг/мл сахарози, 0,5 мг/мл полісорбату 80, та 10 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, кінцевий рН становить 6.2;
Зо (12) 55 мг/мл злитого протеїну 9, 75 мг/мл сахарози, 0,3 мг/мл полісорбату 80, та 5 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, кінцевий рН становить 6,0; (13) 65 мг/мл злитого протеїну 9, 90 мг/мл сахарози, 0,7 мг/мл полісорбату 80, та 30 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, кінцевий рН становить 7,5; (14) 70 мг/мл злитого протеїну 9, 75 мг/мл сахарози, 0,8 мг/мл полісорбату 80, та 30 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, кінцевий рН становить 7,0; (15) 50 мг/мл злитого протеїну 9, 80 мг/мл сахарози, 0,8 мг/мл полісорбату 80, та 10 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, кінцевий рН становить 7,0.

Claims (17)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Фармацевтична композиція, яка містить: злитий протеїн рецептора ТОБ-РД, та буфер; при цьому злитий протеїн рецептора ТОЕ-ВД містить злитий пептид, утворений важким ланцюгом 45 антитіла РО-Ї1 та ТОБ-ВКІЇ ЕСО, послідовність, яка є представленою як 5ЕО ІЮ МО: 23, та легким ланцюгом антитіла РО-1І 1, послідовність, яка є представленою як 5ЕО ІЮ МО: 13; буфер являє собою буфер лимонної кислоти та натрію цитрату, де концентрація буфера лимонної кислоти та натрію цитрату становить від 5 до 20 мМ; концентрація злитого протеїну рецептора ТОЕ-ВД становить від 0,5 до 100 мг/мл;
рН фармацевтичної композиції становить від 6,0 до 6,5; при цьому фармацевтична композиція також містить сахарозу, де концентрація сахарози становить від 60 до 90 мг/мл; та також містить полісорбат 80, де концентрація полісорбату 80 становить від 0,4 до 0,8 мг/мл.
2. Фармацевтична композиція за п. 1, в якій концентрація буфера становить 10 мм.
3. Фармацевтична композиція за п. 1 або 2, в якій концентрація злитого протеїну рецептора ТОРЕ-В8 становить від 30 до 70 мг/мл.
4. Фармацевтична композиція за п. 3, в якій концентрація злитого протеїну рецептора ТОБ-В становить 50 мг/мл.
5. Фармацевтична композиція за будь-яким одним з пп. 1-4, в якій рН фармацевтичної композиції становить 6,2.
6. Фармацевтична композиція за п. 1, в якій концентрація сахарози становить 80 мг/мл.
7. Фармацевтична композиція за п. 1, в якій концентрація полісорбату 80 становить 0,4 мг/мл.
8. Фармацевтична композиція за будь-яким одним з пп. 1-7, яка містить: від 30 до 70 мг/мл злитого протеїну рецептора ТОБ-ВД, від 5 до 20 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, від 60 до 90 мг/мл сахарози, та від 0,4 до 0,8 мг/мл полісорбату 80; рН фармацевтичної композиції становить від 6,0 до 6,5.
9. Фармацевтична композиція за будь-яким одним з пп. 1-7, яка містить: 50 мг/мл злитого протеїну рецептора ТОБ-ВД, 10 мМ буфера лимонної кислоти та натрію цитрату, 80 мг/мл сахарози, та 0,4 мг/мл полісорбату 80; рН фармацевтичної композиції становить 6,2.
10. Спосіб отримання фармацевтичної композиції за будь-яким одним з пп. 1-7, що включає стадію контактування злитого протеїну рецептора ТОЕ-ВД з буфером; де буфер являє собою буфер лимонної кислоти та натрію цитрату, концентрація буфера становить від 5 до 20 мМ, та рН буфера становить від 6,0 до 6,5. Зо
11. Ліофілізований препарат, який містить злитий протеїн рецептора ТОБЕ-Д, який отримують шляхом ліофілізування фармацевтичної композиції за будь-яким одним з пп. 1-9.
12. Ліофілізований препарат, який містить злитий протеїн рецептора ТОБ-ВД, який може бути відновлений з утворенням фармацевтичної композиції за будь-яким одним з пп. 1-9.
13. Відновлений розчин, який містить злитий протеїн рецептора ТОЕ-Д, який отримують шляхом відновлення ліофілізованого препарату за п. 11 або 12.
14. Застосування будь-якого одного, вибраного з наступних в складі лікарського засобу: фармацевтичної композиції за будь-яким одним з пп. 1-9 або ліофілізованого препарату, який містить злитий протеїн рецептора ТОБЕ-РД за п. 11 або 12, або відновленого розчину, який містить злитий протеїн рецептора ТОБ-В за п. 13; при цьому лікарський засіб застосовують для лікування або пригнічення розвитку захворювання або розладу, пов'язаного з проліферацією пухлинних клітин або метастазами пухлинних клітин.
15. Застосування за п. 14, за яким захворювання або розлад являє собою пухлину.
16. Застосування за п. 14, за яким захворювання або розлад вибирають з групи, яка складається з: раку голови та шиї, гліобластоми, гліоми, назофарингеальної карциноми, раку щитоподібної залози, раку легені, меланоми, мієлодиспластичного синдрому, нейроендокринного раку, лімфоми, лейкемії, меланоми, базально-клітинної карциноми шкіри, плоскоклітиної карциноми шкіри, вибухаючої дерматофібросаркоми, карциноми з клітин Меркеля, саркоми, мезотеліоми, раку шлунка, раку печінки, раку підшлункової залози, раку нирки, раку сечового міхура, раку товстої та прямої кишки, раку молочної залози, раку ендометрія, раку матки, раку шийки матки, раку яєчників, раку передміхурової залози та раку яєчка.
17. Застосування за п. 16, за яким рак легені вибирають з групи, яка складається з: дрібноклітинного раку легені та недрібноклітинного раку легені.
т, ни, їх у : ОК х В з. я х . до 3 Явтрий ; й Ж Легкий 00 : к. ох лашшюет о ; в. МК що З й МЕЖ Р ЕТ о Я її з г ск Б . Двсуль-осї й . -к х з З х Важхини . Жіннй ож ланцюг зв'язне їв їх Ж Б ще З Х. я З ж ох - УМ, Кх 3 нове МЕЖ ой 0 Мнннонкннння Мр КК их, доми я пики Я Еш інкер ек КЕН х а я ще с Зсічена бопма позаклітниної ділянки СВК Фіг: 1 ще ов що ! ! Е ! | є ш З Ж ікмитнанех контроль ЕЕ Х ш щщая антитю: пл З І З Зплитий проте як з ке ОВО ЖН МОНТЕНЬ кої х об. ва ше з я х ; - ! ЗХ У оно Ефес дні» ша К 2 Ж Ж Кк В 3 Хо
Фіг. 2 зв биту ! сей В ши і АК ; ЕК м і; НЯ В ВЕЖА ; Же х ТЕ ДНК у ! зву з ЕЕ і Оу ; щЇ й ї ко у ЖК д ! ТЕ - і ТЕ вв хх : - . СЕ Е і; з: ЛВТЯЦВ ЯкрухКеВи т. Е ї і ЗЕ ш і т Злити шротевн я ау Ж З 5 Злвтяв жвотена ВУ ТЕ Кс В в пе код ТК А х і; ж Злата шротене ЕХ де ЖЕ х - З зт Зюятив яке КЗ ВЕ т я зе Злитвй яке ВА аж ; Злити яротенв ВЕ. Б КУ ; се ЖЕ ; сей ЕКОН БощТрОяЯь киЕ ; ЖЕ В ХК В о і ШЕ В одн ов нив я ; У ОДА ин кас т ЯК у ЗА. а «Ж їм ї ж сі а БГащи фіг. З я і кш чн з г - . ' Е / ов яВя ДЕКО со очна ж хх ж я Гу й З г і Х НК; я Антито ТІЇ хо МК з Злитий протеїн 7 Е і Й з Злитий протеїн Я ва і й я Злитнй протеїн 5 в НЯ ж Злитий протеєн 1 і ї в ще . - : ! па я Злиютий протеїн 14 Вк ї І ж Злитин протеїн ЇЖ ! гі ж Злитий протеїн 13 Ж Я ГУ « Влити пратеїн ІЗ ди НУ ж БПоресжній контроле їЧ рф руку Гоа
Фіг. 4 1вооо . 7 ж Антитіле РІКА Б з вк ж злитий протеїн 9 г Я - п останля. З зв жо ях Е. ї Ж Шеетнвний контроль БЕРІЗ 5 й «а Кентроль НІК 5 де -в Людський Я хво що у З. т Ф : В ення : Е як «й «й я Ко ї 2 а І овіконцентрація) я фіг. 5
Во Нозитневний кантроль ЕРЕЯЮУ : че Ж й зЗлнтин протеїн З ши м що А - КН Кк я : їх ЗОВ м : ява ве я : З З «В о! зак в а Я їсеіконнентраніні нії
Фіг. зах Ї ж клський Її -- з І Фошшюннй х Ван РнТтТіло РЕНІ ко До. ож Злитий протеїн 9 є ЩЕ ший ж Контроль НІОТ-КЄ) Що ЖК А з Антнтіло РЕГІ Контроль НІОЗТ-ЕсІ о. ща й ке а 2 іохіконнентрацдія! ну
Фіг. 7 но зо ут тет тт стот тт уст степ сте те стсте сет стсте сего стсте ст сте те стете сети стете сего стетестстестстетестстестстетестетестстетестстох шо ям ВТ Е йо ро Код од в в рю Ен Я ві ШИ к ВЕ 4 у у : В - ; В : ! 4 203858 ї є в Е т БВ Б - ж її : я З З «ріг. 8 00000 КомпютернаверсткаО.
Гергіль 00000000 "ДО "Український національний офіс інтелектуальної власності та інновацій", вул.
Дмитра Годзенка, 1, м.
Київ -- 42, 01601.
UAA202102928A 2018-11-09 2019-11-08 ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЯКА МІСТИТЬ ЗЛИТИЙ ПРОТЕЇН РЕЦЕПТОРА TGF-<font face="Symbol">b, </font>ТА ЇЇ ЗАСТОСУВАННЯ UA127771C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811328326 2018-11-09
PCT/CN2019/116593 WO2020094122A1 (zh) 2018-11-09 2019-11-08 一种TGF-β受体融合蛋白药物组合物及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA127771C2 true UA127771C2 (uk) 2023-12-27

Family

ID=70611696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA202102928A UA127771C2 (uk) 2018-11-09 2019-11-08 ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЯКА МІСТИТЬ ЗЛИТИЙ ПРОТЕЇН РЕЦЕПТОРА TGF-<font face="Symbol">b, </font>ТА ЇЇ ЗАСТОСУВАННЯ

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20220017601A1 (uk)
EP (1) EP3878461A4 (uk)
JP (1) JP7436477B2 (uk)
KR (1) KR20210090643A (uk)
CN (1) CN112512550B (uk)
AU (1) AU2019374363A1 (uk)
BR (1) BR112021008288A2 (uk)
CA (1) CA3118415A1 (uk)
MX (1) MX2021005018A (uk)
TW (1) TWI829799B (uk)
UA (1) UA127771C2 (uk)
WO (1) WO2020094122A1 (uk)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11802145B2 (en) 2019-10-21 2023-10-31 Nanjing Leads Biolabs Co., Ltd. Recombinant protein targeting PD-1 and TGFß
CN113754777A (zh) * 2020-06-02 2021-12-07 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抗PD-L1/TGF-β融合蛋白
JP2023534738A (ja) * 2020-07-24 2023-08-10 ▲邁▼威（上海）生物科技股▲フン▼有限公司 ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体及びその融合タンパク質
TW202214287A (zh) * 2020-08-24 2022-04-16 大陸商江蘇恒瑞醫藥股份有限公司 TGF-β受體的融合蛋白與多靶點酪胺酸激酶抑制劑聯合在製備治療腫瘤藥物中的用途
CN115884989A (zh) * 2020-08-31 2023-03-31 杭州九源基因工程有限公司 靶向PD-L1和TGFβ的双功能融合蛋白及其制备方法与应用
CN114437204A (zh) * 2020-10-30 2022-05-06 苏州盛迪亚生物医药有限公司 一种抗体或Fc融合蛋白的纯化方法
CN112940134B (zh) * 2021-05-11 2021-09-03 正大天晴药业集团南京顺欣制药有限公司 针对PD-1和TGF-β的双功能蛋白
CN113289029B (zh) * 2021-05-20 2023-09-05 上海赛金生物医药有限公司 一种单克隆抗体-细胞因子融合蛋白制剂
WO2023072043A1 (zh) * 2021-10-26 2023-05-04 正大天晴药业集团股份有限公司 治疗肿瘤的联用药物
CN116688115B (zh) * 2022-03-18 2024-02-06 上海齐鲁制药研究中心有限公司 一种PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白制剂及其用途
WO2024179553A1 (zh) * 2023-03-01 2024-09-06 广东菲鹏制药股份有限公司 靶向TGFβ的融合蛋白及其应用

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2191007T3 (es) 1991-10-31 2003-09-01 Whitehead Biomedical Inst Receptor tipo iii de tgf-beta, cdna que lo codifica y sus usos.
DE69332026T2 (de) 1992-10-29 2002-10-31 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Typ ii tgf-beta-bindendes rezeptorfragment als therapeutisches mittel
EP1846039A2 (en) 2005-01-10 2007-10-24 Research Development Foundation Targeted chimeric molecules for cancer therapy
CN100567325C (zh) * 2006-03-31 2009-12-09 成都康弘生物科技有限公司 Vegf受体融合蛋白及其在制备治疗眼睛疾病的药物中的应用
WO2009152610A1 (en) 2008-06-20 2009-12-23 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Interleukin-2/soluble tgf-beta type ii receptor b conjugates and methods and uses thereof
AU2010324757C1 (en) 2009-11-24 2018-05-17 Medimmune Limited Targeted binding agents against B7-H1
IL300733A (en) 2010-03-05 2023-04-01 Univ Johns Hopkins Compositions and methods for antibodies and fusion proteins targeting immune modulation
DK2785375T3 (da) 2011-11-28 2020-10-12 Merck Patent Gmbh Anti-pd-l1-antistoffer og anvendelser deraf
CN104334573A (zh) 2012-04-30 2015-02-04 比奥孔有限公司 靶向/免疫调节性融合蛋白及其制造方法
NZ711445A (en) * 2013-03-12 2018-06-29 Biocon Ltd Fusion immunomodulatory proteins and methods for making same
EP3036262A4 (en) * 2013-08-22 2017-03-01 Acceleron Pharma Inc. Tgf-beta receptor type ii variants and uses thereof
EP4417255A2 (en) 2013-11-21 2024-08-21 The Brigham and Women's Hospital Inc. Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
DK3105246T3 (da) * 2014-02-10 2021-06-14 Merck Patent Gmbh Målrettet TGF-beta-inhibering
US20170190778A1 (en) * 2014-05-27 2017-07-06 Trustees Of Boston University Inhibitors of fibroproliferative disorders and cancer
WO2016036678A1 (en) * 2014-09-02 2016-03-10 Medimmune, Llc Formulations of bispecific antibodies
CN105435222B (zh) * 2014-09-25 2018-05-29 信达生物制药(苏州)有限公司 重组融合蛋白制剂
WO2017037634A1 (en) * 2015-08-31 2017-03-09 National Research Council Of Canada Tgf-β-receptor ectodomain fusion molecules and uses thereof
WO2017084495A1 (zh) * 2015-11-17 2017-05-26 江苏恒瑞医药股份有限公司 Pd-l1抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2017134592A1 (en) * 2016-02-03 2017-08-10 Biocon Limited Anti-cd20/immunomodulatory fusion proteins and methods for making same
CN107513107B (zh) * 2016-06-15 2022-03-15 上海南方模式生物科技股份有限公司 抗肿瘤融合蛋白及其制法和应用
SG11201906157YA (en) * 2017-01-07 2019-08-27 Merck Patent Gmbh Dosing regimens and dosage forms for targeted tgf-b inhibition
BR112019023184A2 (pt) 2017-05-12 2020-05-19 Jiangsu Hengrui Medicine Co proteína de fusão contendo o receptor de tgf-¿ e o uso farmacêutico da mesma
CA3154413A1 (en) * 2019-11-01 2021-05-06 Yan Lan Combined inhibition of pd-1, tgf.beta. and atm together with radiotherapy for the treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
EP3878461A1 (en) 2021-09-15
BR112021008288A2 (pt) 2021-08-10
JP7436477B2 (ja) 2024-02-21
CN112512550B (zh) 2024-09-13
WO2020094122A1 (zh) 2020-05-14
MX2021005018A (es) 2021-06-15
US20220017601A1 (en) 2022-01-20
CN112512550A (zh) 2021-03-16
KR20210090643A (ko) 2021-07-20
TWI829799B (zh) 2024-01-21
AU2019374363A1 (en) 2021-06-03
CA3118415A1 (en) 2020-05-14
TW202031279A (zh) 2020-09-01
EP3878461A4 (en) 2022-08-17
JP2022512862A (ja) 2022-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA127771C2 (uk) ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЯКА МІСТИТЬ ЗЛИТИЙ ПРОТЕЇН РЕЦЕПТОРА TGF-&lt;font face=&#34;Symbol&#34;&gt;b, &lt;/font&gt;ТА ЇЇ ЗАСТОСУВАННЯ
TW202039575A (zh) 新穎之抗ｃｃｒ８抗體
EP3797121B1 (en) Antibodies specific for cd3 and uses thereof
EP3904382A1 (en) Anti-il-23p19 antibody and uses thereof
AU2021284273A1 (en) Antibodies to TIGIT
KR20160138309A (ko) Cd147에 결합하는 항체 치료제
CN115093483A (zh) Il-17ra融合蛋白、药物组合物、注射剂及其应用
EP3101035B1 (en) Bifunctional fusion protein, preparation method therefor, and use thereof
EP3904384A1 (en) Fully humanized anti-gitr antibody and preparation method therefor
EP3848049A1 (en) Anti-tim3 antibody pharmaceutical composition and use thereof
AU2020333023A1 (en) Aqueous pharmaceutical composition of anti-PD1 antibody prolgolimab and the use thereof
CN117043188A (zh) Gp130结合分子及使用方法
RU2791683C2 (ru) Фармацевтическая композиция слитого белка рецептора трансформирующего фактора роста бета и ее применение
US11773160B1 (en) Immune-stimulating IL-2 fusion proteins
RU2780537C2 (ru) Cd3-специфические антитела и их применение
CN118480130A (zh) 靶向msln的抗体、嵌合抗原受体及其应用
CN114316046A (zh) 一种稳定的抗体组合物