CN105435222B - 重组融合蛋白制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种重组融合蛋白液体制剂，包含重组融合蛋白、缓冲盐、稳定剂和表面活性剂。本发明建立了能使重组融合蛋白稳定储存的液体制剂，可以提高重组融合蛋白的物理化学稳定性，液体制剂在高温加速、长期冷藏和反复冻融等条件下均能保持重组融合蛋白稳定性，可以提高临床使用安全性。

Description

重组融合蛋白制剂
技术领域
本发明涉及生物技术药物制剂领域，具体涉及稳定的重组融合蛋白制剂及其制备方法和应用。
背景技术
年龄相关性黄斑变性(AMD)又称老年黄斑变性，为视网膜黄斑区结构的衰老性改变，主要由视网膜色素上皮细胞和视网膜退行性病变引起的不可逆的视力下降或丧失。该病在临床上分为干性(萎缩性)AMD和湿性(渗出性)AMD两种，其中，湿性AMD约占AMD总病例数的20％，不过，在西方国家，湿性AMD却是老年人失明的首要原因。眼内异常血管增生是湿性AMD发生和发展的主要原因之一，阻断异常血管增生是湿性AMD的治疗基础，它有可能减缓甚至阻止疾病的进程。血管内皮生长因子(VEGF)是一种分泌性蛋白质，它可诱发血管生成，增加血管渗透性，引发炎症，而这些因素又与湿性AMD的发展进程密切相关。因此，在开发湿性AMD治疗药物时，都将VEGF当作潜在的治疗靶标。
重组人血管内皮生长因子受体-抗体-人补体受体1融合蛋白(以下简称IBI302)就是根据以上机理而设计研发的针对AMD病症的大分子药物。它是申请人自主设计的具有全球知识产权的Ⅰ类新药，其给药途径设计为玻璃体内注射，剂量预计为0.5～2mg/眼。
自1982年第一个重组药物——人工胰岛素上市以来，应用蛋白质工程技术制造的重组融合蛋白药物已经越来越多被开发出来，其中部分已经作为常规药品被人们所接受。但是由于该类药物均为分子量较大的多肽或蛋白质，其性能很不稳定，极易变质，而且蛋白质高浓度时容易发生自我聚集。这些不利因素使得将这类药物制成稳定、安全、有效的制剂提出了巨大挑战。
重组融合蛋白为生物大分子，其结构非常复杂。在生产及储存过程中，表达的蛋白分子会发生各种物理和化学变化。物理变化有：吸附、去折叠变性、聚集和沉淀等。化学变化有：脱酰胺，异构化，氧化等。这些变化可能会对最终产品安全性和有效性产生影响。因此，建立一个合适的制剂处方以保障产品的稳定性和安全性非常重要。
IBI302是双靶点特异性融合蛋白，为国家Ⅰ类新药。由于其结构的复杂性，导致其化学性质不稳定，蛋白容易发生聚集且电荷异构体易于从碱性组分转化为酸性组分。
因此，本领域尚需研发重组蛋白制剂，保障产品的稳定性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组蛋白制剂，可以使融合蛋白在较高浓度下稳定保存，此外，制剂在高温加速、长期冷藏和反复冻融等条件下均能保持其稳定性，提高临床使用安全性。
本发明的第一方面，提供一种重组融合蛋白液体制剂，所述液体制剂包含：重组融合蛋白、缓冲盐、稳定剂、表面活性剂和无菌注射用水，其中，
所述重组融合蛋白的浓度为5～45mg/mL；
所述缓冲盐为枸橼酸盐、醋酸盐中的一种或两种以上的组合，且所述盐的浓度为5-25mmol/L，较佳地为8-22mmol/L；
所述稳定剂为氯化钠、氨基酸、多元醇中的一种或两种以上的组合，所述氨基酸为精氨酸、甘氨酸、组氨酸中的一种或两种以上的组合，所述多元醇为蔗糖、山梨醇、甘露醇中的一种或两种以上的组合，且所述氯化钠的浓度为100-200mmol/L，所述氨基酸的浓度为50-350mmol/L，所述多元醇的浓度为1重量％～15重量％，以所述液体制剂的总重量计；
所述表面活性剂为聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆188中的一种或两种以上的组合，且所述表面活性剂的浓度为0.01重量％～0.08重量％，以所述液体制剂的总重量计；
且所述液体制剂的pH为4.5～7.5。
在另一优选例中，所述重组融合蛋白为重组人血管内皮生长因子受体-抗体-人补体受体1融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:3所示。
在另一优选例中，所述稳定剂为氨基酸、多元醇中的一种或两种以上的组合。
在另一优选例中，所述氯化钠的浓度为120-180mmol/L。
在另一优选例中，所述氨基酸的浓度为70-260mmol/L
在另一优选例中，所述多元醇的浓度为3重量％～10重量％。
在另一优选例中，所述多元醇的浓度为200-300mmol/L，较佳地，为220～270mmol/L。
在另一优选例中，所述液体制剂的pH为5.0-7.2，较佳地，pH为5.5-7.0。
在另一优选例中，所述缓冲盐为枸橼酸盐；
所述氨基酸为精氨酸；
所述多元醇为蔗糖；
所述表面活性剂为聚山梨酯20。
本发明中，所述缓冲盐为枸橼酸钠、醋酸钠中的一种或两种以上的组合。
本发明的第二方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒含有第一方面所述的液体制剂，以及盛装所述液体制剂的容器。
进一步地，所述试剂盒中还含有说明书。
本发明的第三方面，提供第一方面所述的液体制剂的用途，用于制备预防和/或治疗年龄相关性黄斑变性的药物。
在另一优选例中，所述年龄相关性黄斑变性为湿性年龄相关性黄斑变性。
本发明的液体制剂，可使重组融合蛋白保持稳定，使得该重组蛋白能稳定存在于处方中，提高产品的质量，延长产品的货架期，提高临床使用安全性。液体制剂具有较佳的热稳定性，在高温加速、长期冷藏和反复冻融等条件下均能保持稳定。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次意外研发出一种重组融合蛋白制剂，在加速、长期和冻融等条件下，能保障产品的稳定性。本发明可应用的重组融合蛋白(VEGF抑制剂)还包括其他基因工程技术获得的重组融合蛋白(VEGF抑制剂)。在此基础上，完成了本发明。
重组人血管内皮生长因子受体-抗体-人补体受体1融合蛋白
本发明优选的重组融合蛋白是重组人血管内皮生长因子受体-抗体-人补体受体1融合蛋白(参见US61/629,932(PCT/US2012/067489)；专利名称：Protein inhibitors tocomplement and vegf pathways and methods of use thereof)，氨基酸序列如SEQ IDNO.:1所示。
本发明另一优选的重组融合蛋白是重组人血管内皮生长因子受体-抗体-人补体受体1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
液体制剂
本发明的重组融合蛋白液体制剂，包含：重组融合蛋白、缓冲盐、稳定剂、表面活性剂和无菌注射用水。
在另一优选例中，所述液体制剂，包含：重组融合蛋白、缓冲盐、氯化钠、表面活性剂和无菌注射用水。
在另一优选例中，所述液体制剂，包含：重组融合蛋白、缓冲盐、多元醇、表面活性剂和无菌注射用水。
在另一优选例中，所述液体制剂，包含：重组融合蛋白、缓冲盐、氨基酸、表面活性剂和无菌注射用水。
在另一优选例中，所述液体制剂，包含：重组融合蛋白、缓冲盐、多元醇、氨基酸、表面活性剂和无菌注射用水。
所述重组融合蛋白的浓度为5～45mg/mL。
所述缓冲盐为枸橼酸盐、醋酸盐中的一种或两种以上的组合，且所述盐的浓度为5-25mmol/L，较佳地为8-22mmol/L。
所述稳定剂为氯化钠、氨基酸、多元醇中的一种或两种以上的组合。
所述氨基酸为精氨酸、甘氨酸、组氨酸中的一种或两种以上的组合。所述氨基酸的浓度为50-350mmol/L，较佳地为70～260mmol/L。
所述多元醇为蔗糖、山梨醇、甘露醇中的一种或两种以上的组合。所述多元醇的浓度为1重量％～15重量％，较佳地为3重量％～10重量％。
所述氯化钠的浓度为100-200mmol/L。
所述表面活性剂为聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆188中的一种或两种以上的组合。
所述表面活性剂的浓度为0.01重量％～0.08重量％，较佳地为0.02重量％～0.06重量％，以所述液体制剂的总重量计。
所述液体制剂的pH为4.5～7.5，较佳地为5-7。
本发明的液体制剂或包含液体制剂的试剂盒，可以用于制备预防和/或治疗年龄相关性黄斑变性的药物。重组融合蛋白可以保持稳定，产品质量高，保质期长，提高临床使用安全性。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的有益之处在于：
(1)本发明提供具有较长保质期的新型制剂，可使重组融合蛋白，如重组人血管内皮生长因子受体-抗体-人补体受体1融合蛋白保持稳定，制剂在高温加速、长期冷藏和反复冻融等条件下均能保持其稳定性。
(2)本发明的液体制剂，可以提高重组融合蛋白制剂的物理化学稳定性，使得该重组蛋白能稳定存在于处方中，提高产品的质量，延长产品的货架期，提高临床使用安全性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
通用方法
SEC-HPLC方法：按照《中华人民共和国药典》(2010年版，三部)附录ⅢB进行测定，用亲水硅胶体积排阻色谱柱进行检测，面积归一化法计算样品纯度。
电荷异构(cIEF)：用涂层毛细管Neutral Capillary(50μm i.d×45cm)，通过Beckman毛细管电泳仪(型号：PA800plus)在毛细管两端加电压使样品电离，电离完成后用32Karat软件对图谱进行分析积分，用面积归一化法计算。
DSC：使用MIcroCal VP-DSC，起始温度为10℃，结束温度为110℃，扫描速率为60℃/Hr。不同样品分别扣除相应的缓冲液之后得到最终各个样品的Tm值。
实施例1
氨基酸、多元醇、氯化钠等对融合蛋白稳定性的影响
按照表1所示用无菌注射用水配置各种溶液，用配制完成的各个溶液分别对融合蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示)进行超滤置换。
将融合蛋白浓度为10mg/ml的超滤置换液用相应的溶液稀释至1.5mg/ml。然后取1.5ml稀释液，并向其中加入适量的的聚山梨酯20，使其终浓度为0.03重量％。使用0.2μm滤膜过滤后作为样品检测。
另外，各取出5ml表1所述溶液，加入适量的聚山梨酯20使得其终浓度为0.03％，然后用0.2μm滤膜过滤后作为缓冲液空白对照。使用DSC方法，检测不同蛋白稳定剂下的热融温度Tm值，实验结果见表2。
表1：不同种类蛋白稳定剂对融合蛋白稳定性影响
2：不同种类蛋白稳定剂DSC结果
编号 Tm值(℃) 编号 Tm值(℃)
1-1 57.95 2-1 53.27
1-2 58.16 2-2 53.25
1-3 58.51 2-3 57.60
1-4 58.58 2-4 58.59
1-5 57.64 2-5 52.32
1-6 58.60 2-6 58.40
1-7 58.61 2-7 57.33
将14组不同样品分别扣除相应的溶液空白之后得到最终各个样品的Tm值。研究结果显示14组样品均具有较高的热稳定性。其中样品组1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、2-3、2-4、2-6、2-7热稳定性最优，样品组2-1、2-2、2-5次之。结果表明，采用表1中的各组分与重组融合蛋白组成的重组融合蛋白制剂具有较佳的热稳定性。
实施例2
pH值稳定性
按照表3用无菌注射用水配制各个pH值的溶液，用配制完成的各个溶液分别对融合蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示)进行超滤置换。
将融合蛋白浓度为10mg/ml的超滤置换液用相应的溶液稀释至1.5mg/ml。然后取1.5ml稀释液并向其中加入适量的的聚山梨酯20，使其终浓度为0.03重量％。使用0.2μm滤膜过滤后作为样品检测。
另外，各取出5ml各个pH值得溶液，加入适量的聚山梨酯20使其终浓度为0.03重量％，然后用0.2μm滤膜过滤后作为缓冲液空白对照。使用DSC方法，检测不同pH值下的热融温度Tm值，实验结果见表4。
表3：pH值稳定性实施例样品
表4：pH稳定性DSC结果
编号 pH Tm值(℃)
1 5.5 59.58
2 6.0 59.89
3 6.0 59.75
4 6.5 59.87
5 7.0 54.85
6 7.5 52.75
6组不同样品分别扣除相应的缓冲液之后得到的Tm值表明，样品1～4具有较高的热稳定性，样品5热稳定性次之，样品6的Tm略低，表明重组融合蛋白制剂的pH在5.5～7.0之间具有较高的热稳定性。
实施例3
重组人血管内皮生长因子受体-抗体-人补体受体1融合蛋白制剂
按以下配方配制制剂，融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
处方A
将半成品无菌分装至西林瓶中，加盖橡胶塞和铝塑盖，获得成品。
处方B
将半成品无菌分装至西林瓶中，加盖橡胶塞和铝塑盖，获得成品。
实施例4
加速稳定性实验
将实施例3的样品分别置于25℃恒温箱中保存进行加速稳定性实验，一个月后将样品取出并与样品0天时检测结果进行比较，以衡量制剂在高温条件下的加速稳定性，实验结果如表5和表6所示。
表5：25℃±2℃蛋白电荷异构变化结果(PI＞8.0)
样品名称 0天 1个月
制剂处方A(10mg/ml) 68.75％ 68.87％
制剂处方B(40mg/ml) 67.82％ 68.45％
表6：25℃±2℃蛋白纯度变化结果(SEC主峰百分含量)
样品名称 0天 1个月
制剂处方A(10mg/ml) 99.23％ 99.01％
制剂处方B(40mg/ml) 99.03％ 98.51％
通过毛细管等电聚焦(cIEF)和蛋白纯度(SEC-HPLC)表征重组融合蛋白的化学稳定性。以等电点PI＞8.0的百分含量变化和蛋白纯度(SEC-HPLC)的主峰含量作为判定手段，结果表明：制剂A、B的电荷异构含量在加速1个月后没有明显变化(见表5)。同时制剂A、B的主峰含量同样没有明显变化(见表6)，而其他指标如外观、蛋白浓度、浊度等在该加速条件下均没有发生明显变化。结果表明，在25℃加速条件下两种制剂处方能保持该重组融合蛋白稳定性至少1个月。
实施例5
长期稳定性实验
该实施例中所用样品与实施例4相同，即为实施例3制备的制剂。将样品分别置于2～8℃恒温箱中保存进行长期稳定性实验，于三个月、六个月时间点将样品取出并与样品0天时检测结果进行比较，以衡量制剂在低温条件下的长期稳定性。
实验结果如表7和8所示。
表7：2～8℃蛋白电荷异构变化结果(PI＞8.0)
样品名称 0天 3个月 6个月
制剂处方A(10mg/ml) 56.68％ 56.65％ 55.20％
制剂处方B(40mg/ml) 56.42％ 55.90％ 55.27％
表8：2～8℃蛋白纯度变化结果(SEC主峰百分含量)
样品名称 0天 3个月 6个月
制剂处方A(10mg/ml) 99.23％ 99.32％ 99.09％
制剂处方B(40mg/ml) 99.03％ 99.09％ 98.64％
结果表明，在2～8℃的长期储存条件下，样品在6个月时间内电荷异构(cIEF)和蛋白纯度(SEC-HPLC)没有明显变化。同时其他指标如外观、蛋白浓度、浊度等在该加速条件下均没有发生明显变化。结果表明两种制剂在长期条件下至少能保存6个月。
实施例6
冻融稳定性
该实施例所用样品与实施例3的制剂配方基本相同，不同之处在于融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。样品在﹣80℃条件下冷冻后在室温条件下解冻，重复上述操作反复冻融3次和6次后对样品进行检测，实验结果如表9和10所示。
表9：冻融条件下蛋白电荷异构变化结果(PI＞8.0)
样品名称 0次 3次 6次
制剂处方A(10mg/ml) 56.68％ 60.18％ 60.50％
制剂处方B(40mg/ml) 56.42％ 62.58％ 60.68％
表10：冻融条件下蛋白纯度变化结果(SEC主峰百分含量)
样品名称 0次 3次 6次
制剂处方A(10mg/ml) 99.23％ 99.31％ 99.22％
制剂处方B(40mg/ml) 99.03％ 98.99％ 99.02％
结果表明，三组样品电荷异构(cIEF)和蛋白纯度(SEC-HPLC)冻融6次后均无明显变化，物理特性相关的外观、可见异物等检测指标均合格。结果表明制剂经至少6次冻融后，物理化学性质依然稳定。
以上研究结果表明，采用本发明的缓冲液和稳定剂与重组融合蛋白配制成的液体制剂，具有较佳的稳定性，可以使融合蛋白在较高浓度下稳定保存，制剂在高温加速、长期冷藏和反复冻融等条件下也均能保持稳定，可以提高临床使用安全性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种重组融合蛋白液体制剂，其特征在于，所述液体制剂的pH为5.5-7，以所述液体制剂的总重量计，包含：
以及无菌注射用水；
其中，所述重组融合蛋白为重组人血管内皮生长因子受体-抗体-人补体受体1融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:3所示。
2.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂的pH为5.5-6.5。
3.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述重组融合蛋白的浓度为10-40mg/ml。
4.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂的pH为6.2。
5.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述枸橼酸盐为枸橼酸钠。
6.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂的pH为5.5-7，包含：
以及无菌注射用水，
其中，所述重组融合蛋白为重组人血管内皮生长因子受体-抗体-人补体受体1融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-6任一项所述的液体制剂，以及盛装所述液体制剂的容器。
8.如权利要求1-6任一项所述的液体制剂或权利要求7所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗年龄相关性黄斑变性的药物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述年龄相关性黄斑变性为湿性年龄相关性黄斑变性。
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