CN107988292B - 提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺。所述工艺将重组毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，经过甘油流加和甲醇流加诱导表达阶段，在甲醇诱导84h后，向发酵罐中一次性添加0.2～0.5M L‑赖氨酸或L‑精氨酸。本发明能有效防止目的产物被蛋白酶降解，使用的氨基酸分子量小，后续提取易除去，而且成本比酪蛋白水解物低，为规模化生产减少损失，带来实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，涉及一种提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺。
背景技术
目前，食品、化妆品、医疗领域的胶原蛋白，大多来自动物如猪、牛、鱼等动物皮肤、骨骼等组织。这类原料主要通过酸、碱、加热等物理化学方法处理得到，但是上述方法得到的胶原蛋白成分复杂，批差异性大，存在病毒隐患，如疯牛病毒携带隐患，屠宰过程的环境控制、交叉污染的局限性，动物与人体的异源性导致需要增加去除免疫原性，影响了胶原蛋白在医药方面的应用。
随着DNA重组技术的迅速发展，各种宿主细胞被选为基因工程菌用于表达胶原蛋白。中国专利201110327865.5构建了一种重组人源胶原蛋白的巴氏毕赤酵母基因工程菌，基因工程菌经发酵培养得到重组人源胶原蛋白，发酵周期为136小时，蛋白表达量为16g/L，但在发酵末期，产物浓度批次有不增长或者被降低至3g/L，为实际生产造成了人力、能源、财物等重大损失，为后续提取带来较多困难。因此，在发酵末期，稳定产物不被蛋白酶降解，至关重要。
毕赤酵母发酵手册上提到，用1％酪蛋白水解物酸(casamino acids)可以减少目的蛋白被降解。但是，酪蛋白水解物酸市场价格约3300元/kg，成本较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降低生产成本的提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺。该工艺通过在甲醇诱导阶段中加入L-赖氨酸(L-Lys)或L-精氨酸(L-Arg)，有效防止目的产物重组人源胶原蛋白被蛋白酶降解。
本发明的技术方案如下：
提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺，包括以下步骤：
将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，经过甘油流加和甲醇流加诱导表达阶段，在甲醇诱导84h后，一次性向发酵罐添加0.2～0.5M L-Lys或0.2～0.5M L-Arg。
本发明所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，已于2011年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5021，并在中国专利201110327865.5中充分公开。
本发明所述的毕赤酵母发酵培养基采用现有配方，可以是：85％H3PO46.6～26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.3～1.175g/L，K2SO4 4.5～18.2g/L，MgSO4·7H2O3.7～14.9g/L，KOH 1.0～4.13g/L，甘油10.0～40.0g/L，PTM1溶液0.435～4.35mL/L。
本发明的发酵工艺中，毕赤酵母菌种液的接种量为8～12％，发酵温度为28～30℃，氨水调节pH为5.2～5.4，溶氧不低于20％，甲醇诱导时间为90～120小时。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明在发酵过程中，通过在甲醇诱导发酵84h时，一次性向发酵罐添加0.2-0.5ML-Lys或0.2-0.5M L-Arg，使得大罐发酵产物重组人源胶原蛋白稳定保留90％以上。同时L-Lys市场价格约240元/kg，L-Arg约70元/kg，明显降低了生产用的氨基酸成本，减少企业人力、物力的损失，稳定供货，为企业产生巨大的经济价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详述。
实施例1
发酵培养基为基础盐培养基(BSM，参考CN102443057B)：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.3。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，在甲醇诱导发酵84h时，一次性向发酵罐添加0.2M L-Arg，发酵末期，每4h取样检测，诱导发酵至产物水平连续2次增加小于1mg/ml后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.6g/L，为模拟1T罐分批提取，罐内10℃保持罐压8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为16.76g/L，保留了95.2％。模拟后续提取一批耗时，再需要放置10h，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为15.18g/L，保留了86.3％。
实施例2
发酵培养基为基础盐培养基(BSM，参考CN102443057B)：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.3。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，在甲醇诱导发酵84h时，一次性向发酵罐添加0.5M L-Lys，发酵末期，每4h取样检测，诱导发酵至产物水平连续2次增加小于1mg/ml后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为16.8g/L，为模拟1T罐分批提取，罐内10℃保持罐压8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为16.3g/L，保留了97％。模拟后续提取一批耗时，再需要放置10h，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为15.3g/L，保留了91％。
实施例3
发酵培养基为基础盐培养基(BSM，参考CN102443057B)：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.3。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，在甲醇诱导发酵84h时，一次性向发酵罐添加0.5M L-Arg，发酵末期，每4h取样检测，诱导发酵至产物水平连续2次增加小于1mg/ml后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.8g/L，为模拟1T罐分批提取，罐内10℃保持罐压8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为17.4g/L，保留了98％。模拟后续提取一批耗时，再需要放置10h，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为16.4g/L，保留了92％。
实施例4
发酵培养基为基础盐培养基(BSM，参考CN102443057B)：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.3。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，在甲醇诱导发酵84h时，一次性向发酵罐添加0.2M L-Lys，发酵末期，每4h取样检测，诱导发酵至产物水平连续2次增加小于1mg/ml后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.0g/L，为模拟1T罐分批提取，罐内10℃保持罐压8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为16.32g/L，保留了96％。模拟后续提取一批耗时，再需要放置10h，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为15.3g/L，保留了90％。
对比例1
发酵培养基为基础盐培养基(BSM，参考CN102443057B)：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.3。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，在甲醇诱导发酵0h时，一次性向发酵罐添加0.2M L-Lys，发酵末期，每4h取样检测，诱导发酵至产物水平连续2次增加小于1mg/ml后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为16.3g/L，为模拟1T罐分批提取，罐内10℃保持罐压8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为10.46g/L，保留了64.2％。模拟后续提取一批耗时，再需要放置10h，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为7.47g/L，保留了45.8％。
对比例2
发酵培养基为基础盐培养基(BSM，参考CN102443057B)：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.3。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，发酵末期，每4h取样检测，诱导发酵至产物水平不再升高后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为18.2g/L，发酵周期108小时，发酵生产水平为0.169g/L·h。为模拟1T罐需要分批提取，罐内10℃保持罐压8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为3.2g/L，保留了16.08％。模拟后续提取一批耗时，再需要放置10h，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为0.5g/L，保留了2.74％。
对比例3
发酵培养基为基础盐培养基(BSM，参考CN102443057B)：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.3。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，在甲醇诱导发酵84h，一次性向发酵罐添加0.1M L-Lys，发酵末期，每4h取样检测，诱导发酵至产物水平连续2次增加小于1mg/ml后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为18.0g/L，为模拟1T罐分批提取，罐内10℃保持罐压8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为4.3g/L，保留了23.8％。模拟后续提取一批耗时，再需要放置10h，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为0.74g/L，保留了4.11％。
Claims (1)
1. 提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：将保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母菌种种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转 速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧＞30％，发酵过程中用氨水控制pH5.3；当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时；甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧＞20％，在甲醇诱导发酵84h时，一次性向发酵罐添加0.5M L-Arg，发酵末期，每4h 取样检测，诱导发酵至产物水平连续2次增加小于1mg/ml后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，其中，所述的发酵培养基的配方为：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO4 18.2g/L； MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
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