CN103432569A - 重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的水溶液及其制备方法 - Google Patents

重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的水溶液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的水溶液，属于生物制剂技术领域。一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，它包括重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白与药学上可接受的稳定性辅料溶于药学上可接受的缓冲液得到，其特征在于，所述药学上可接受的稳定性辅料为精氨酸，浓度为5～30g/L。本发明的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的水溶液能够充分防止重组融合蛋白的聚集、降解、氧化或变性等，从而保持其生物学活性，适合于临床使用。

Description

重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的水溶液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的水溶液，属于生物制剂技术领域。
背景技术
干扰素属于蛋白质家族的细胞因子，自然存在于人体中。细胞因子可控制细胞的生长、激活、迁移和衰老。干扰素α也是一种细胞因子，但干扰素α（IFNα）准确的作用机制尚不十分清楚，研究表明IFNα具有抗病毒活性如治疗丙型肝炎，同时具有免疫调节和针对特定的癌症具有直接的抗肿瘤效应。IFNα已成为临床上广泛应用的药物之一，可治疗人的病毒性肝炎（乙型和丙型）、肿瘤和其它病毒感染等相关疾病。然而，IFNα分子量约为19KD，作为一个小分子蛋白，IFNα从血浆中清除的速度较快，其半衰期为4～6h，24h后在血浆中就已检测不到IFNα的存在，患者需要每日注射1次或每周3次，疗程长达4～6个月。这种长期大剂量频繁用药增加了病人的痛苦和治疗费用，而且易产生发烧、疲乏、食欲减退及抑郁等毒副作用。
为了延长IFNα在体内的半衰期，广泛采用的是聚乙二醇修饰法，目前已有40KD左右聚乙二醇修饰的IFNα2a（派罗欣，罗氏公司）和12KD左右聚乙二醇修饰的IFNα2b（佩乐能，先灵葆雅）应用于临床。这两种产品均可明显延长IFNα在体内的半衰期，患者只需每周注射1次。
近年来，研究较热的是重组人血清白蛋白-干扰素融合蛋白。人血清白蛋白（HSA）是存在于人循环系统中的最普遍的血液蛋白，它是体内因子和药物转运的天然载体，半衰期约为19天。研究表明将治疗性蛋白基因与人血清白蛋白基因融合所表达的融合蛋白可明显降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期。白蛋白-干扰素融合蛋白是人血清白蛋白和干扰素α基因融合的产物。HGS公司（人类基因科学公司）开发的克鲁维氏酵母表达的HSA-IFNα2b的融合蛋白(albuferon)在猕猴体内的半衰期比单独的IFNα延长了大约18倍，即重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在体内的半衰期长达148h左右，仅需每2～4周注射一次，被称为最长效的干扰素。研究表明，它比聚乙二醇修饰的干扰素显示出更强的抗病毒活性，目前正处于III期临床阶段。国内目前在研的也有重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白和重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白，简称HSA-IFNα2a和HSA-IFNα2b。
重组人血清白蛋白-干扰素融合蛋白比普通干扰素的稳定性有所提高，但作为蛋白类药物，其稳定性还是无法与常规化学药物相比。根据以往的重组干扰素临床使用经验，在治疗病毒性肝炎等疾病需要3～6个月的连续给药周期。因为给药时间较长，活性药物需要有较好的稳定性。众所周知，一般重组蛋白质的稳定性比较差，在保存过程中会受到多种环境因素的影响，例如温度、湿度、氧、光照和紫外线等都可能使蛋白发生多种物理或化学变化，造成蛋白质的聚集、降解、氧化或变性等。这些变化使蛋白质活性丧失从而降低治疗效果，并且严重的可能引起毒副作用。因此，研究出一种能稳定保存的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白，并适合于实际临床使用的制剂处方是很有意义的。
中国专利CN101099722A（申请号200610052365.4）公开了一种含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂，所述注射用水剂由重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白与药学上可接受的稳定性辅料溶于pH5～8的药学上可接收的缓冲液中得到，所述重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白浓度为0.1～5mg/ml，所述的稳定性辅料为甘氨酸或甲硫氨酸。中国专利CN101234193A（申请号200810033915.7）公开了一种重组人血清白蛋白融合干扰素的稳定水溶液，含有磷酸盐和焦亚硫酸钠、L-抗坏血酸、半胱氨酸等还原性物质，pH为6.5～7.5。但根据这两个专利申请公开的技术方案制备的制剂的稳定性仍有待提高。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种能稳定保存的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的水溶液，该水溶液能够充分防止重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的聚集、降解、氧化或变性等，从而保持其有效组分的生物学活性，适合于临床使用。
发明概述
为了达到发明目的，发明人对稳定剂进行了大量的研究，发现精氨酸不仅可以作为稳定剂，还可以用作营养剂，治疗肝脏疾病的治疗药物；在药物制剂中用作助溶剂，与一些酸性药物成盐，提高药物溶解度，增强药物的药理作用或减少副作用。精氨酸用作肝脏疾病治疗药物的特点是其他氨基酸所不具备的，比如甘氨酸、甲硫氨酸等。另外，由于重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白主要用于病毒性肝炎的治疗，发明人除了考虑利用精氨酸稳定药物的作用外，还考虑利用其具有保肝护肝的作用，可恢复受损的肝功能，增强人体免疫能力，因此，选择了精氨酸作为稳定剂。
发明详述
本发明采用的技术方案是：
一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，它包括重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白与药学上可接受的稳定性辅料溶于药学上可接受的缓冲液得到，其特征在于，所述药学上可接受的稳定性辅料为精氨酸，浓度为5～30g/L。优选的，所述精氨酸的浓度为10～25g/L。
所述的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的浓度为0.2～2g/L。
所述的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白选自重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白、重组人血清白蛋白-干扰素α1b融合蛋白、重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白或重组人血清白蛋白-干扰素αcon融合蛋白；进一步优选重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白。
所述药学上可接受的缓冲液为磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、组氨酸-盐酸缓冲液；进一步优选的，药学上可接受的缓冲液为磷酸盐缓冲液。
所述药学上可接受的缓冲液的浓度为5～100mmol/L，pH为5.0～8.0。
所述稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液还包括浓度为0.05～0.2g/L的表面活性剂；优选非离子型表面活性剂；进一步优选吐温-80。
所述稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液还包括浓度为0.5～10g/L无机盐；优选氯化钠、氯化钾、磷酸盐、醋酸盐、巴比妥盐、三羟甲基氨基甲烷、硼酸盐之一或任意比的组合；进一步优选氯化钠。
上述稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液的制备方法，步骤如下：
（1）配制药学上可接受的缓冲液，pH5.0～8.0，浓度为5～100mmol/L；
（2）向步骤（1）制得的缓冲液中添加精氨酸，使溶液中精氨酸终浓度达到5～30g/L，得混合液；
（3）向步骤（2）制得的混合液中加入重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白，使其终浓度达到0.2～2g/L，即得稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液。
优选的，步骤（2）中所述精氨酸的浓度为10～25g/L。
优选的，步骤（2）中添加精氨酸前，先向缓冲液中添加无机盐，使溶液中无机盐终浓度达到0.5～10g/L。
优选的，步骤（2）中添加精氨酸后，向缓冲液中添加表面活性剂，使溶液中表面活性剂终浓度达到0.05～0.2g/L。
优选的，步骤（2）中添加精氨酸前，先向缓冲液中添加无机盐，使溶液中无机盐终浓度达到0.5～10g/L，；添加精氨酸后，再向缓冲液中添加表面活性剂，使溶液中表面活性剂终浓度达到0.05～0.2g/L。
上述稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液在制备用于治疗病毒性肝炎、肿瘤和其它病毒感染相关疾病的药物中的应用。
上述试剂如无特别说明，均为市售产品；缓冲液的配制均可采用本领域常用技术。
本发明提供的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白克服了传统的干扰素治疗过程中多次给药的缺点，并具备以下几个优点：
（1）降低了干扰素α在体内药物的清除速率，延长生物半衰期，减少注射给药频率；
（2）添加表面活性剂，可以抑制摇晃导致的蛋白二聚体的产生，则可进一步改善融合蛋白的稳定性。经试验检测，加入吐温-80的融合蛋白溶液的非还原电泳纯度为99.1%，而不加吐温-80的融合蛋白溶液的非还原电泳纯度仅为97.5%，且电泳图谱中有明显的寡聚体的条带。
附图说明
图1、25℃条件下放置6个月，重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液的非还原SDS-PAGE结果；
其中：1、Marker，2、实施例1的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，3、实施例2的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，4、实施例3的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，5、实施例4的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，6、实施例5的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，7、实施例6的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，8、实施例7的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，9、实施例8的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，10、实施例9的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液。
图2、4℃条件下放置12个月，重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液的非还原SDS-PAGE结果；
其中：1、Marker，2、实施例1的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，3、实施例2的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，4、实施例3的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，5、实施例4的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，6、实施例5的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，7、实施例6的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，8、实施例7的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，9、实施例8的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，10、实施例9的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液。
图3、25℃条件下放置6个月，重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液的非还原SDS-PAGE结果；
其中：1、实施例10的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，2、实施例11的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，3、Marker。
图4、4℃条件下放置12个月，重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液的非还原SDS-PAGE结果；
其中：1、Marker，2、实施例10的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，3、实施例11的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液。
图5、摇晃试验中，重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液的非还原SDS-PAGE结果；
其中：1、Marker，2、实施例12中R1组结果，3、实施例12中R2组结果。
具体实施方式
本发明所涉及的稳定剂、表面活性剂、缓冲液和无机盐类在实际应用时是几种物质组合使用。在本发明的基础上改变其浓度或加入其它一些物质，但对提高重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白稳定性没有显著作用的改变，仍被视为本发明的一部分。
实施例中，采用下述方法确定重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的生物学活性。
1、重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的生物学活性检测方法（细胞病变抑制法）
1.1原理：本法依据干扰素可以保护人羊膜细胞（WISH细胞）免受水泡性口炎病毒（VSV）破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，于波长570nm处测定其吸光度，可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素的生物学活性。
1.2试剂、材料：
1）重组人干扰素α2a和重组人干扰素α2b活性测定国家标准品，均购自中国药品生物制品检定所。
2）RPMI1640培养液：取RPMI1640培养基粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105IU和链霉素105IU，再加NaHCO32.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。
3）完全培养液：量取新生牛血清100ml，加入RPMI1640培养液900ml中。4℃保存。
4）测定培养液：量取新生牛血清7ml，加入RPMI1640培养液93ml中。4℃保存。
5）攻毒培养液：量取新生牛血清3ml，加入RPMI1640培养液97ml中。4℃保存。
6）消化液：取EDTA0.2g、NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，加水溶解至1000ml，121℃，15min灭菌。
7）染色液：取结晶紫50mg，加入无水乙醇20ml溶解后，加水稀释至100ml。
8）脱色液：取无水乙醇50ml、冰乙酸0.1ml，加水稀释至100ml。
上述RPMI1640培养基粉末和新生牛血清，均购自Invitrogen公司。
1.3操作方法：
1.3.1标准品溶液的制备：
取重组人干扰素生物学活性测定国家标准品按照产品说明书复溶后，用测定培养液稀释至每1ml含1000IU。然后，在96孔细胞培养板中，进行4倍系列稀释，即稀释4、42、43、44、45、46、47、48倍，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔，以上操作在无菌条件下进行。1.3.2供试品溶液的制备：
将待测样品用测定培养液稀释至每1ml含1000IU。然后，在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个复孔，以上操作均在无菌条件下进行。
1.3.3测定法：
WISH细胞用完全培养液培养，使其贴壁至生长状态良好，按体积比1：2～1：4传代，每周2～3次。取培养的细胞弃去培养液，用0.04wt%EDTA消化，细胞计数并调成浓度为2.5～3.5×105个/ml的细胞悬液，100μl/孔接种于96孔培养板上，37℃，5%CO2，培养4～6小时。
将配制完成的标准品溶液和待测样品溶液移入接种WISH细胞的培养板中，每孔加入100μl。37℃，5%CO2，培养18～24小时。
弃去细胞培养板中的上清液。将-70℃保存的疱疹性口炎病毒（VSV）用攻毒培养液稀释至100CCID50，每孔100μl，37℃,5%CO2,培养24小时（镜检标准品溶液的50%病变点在1IU/ml）。
染色：弃去上清，每孔加入100μl染色液，室温放置30分钟后，用自来水洗净染色液，并吸干残留水分。
脱色：每孔加入50μl脱色液，室温下放置3～5分钟，570nm，参比波长630nm下，测定OD值。记录测定结果。
试验数据采用计算机程序进行处理，并按下式计算结果：
供试品生物学活性 ( IU / ml ) = Pr × Ds × Er Dr × Es
式中Pr为标准品生物学活性，IU/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释度；
Er为标准品半效稀释度。
以下列举具体实施例来阐明本发明，应理解这些例子仅仅是为了说明本发明，而非限制本发明的范围。
实施例1
一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，其成分如下表：
表1.HSA-IFNα2a溶液1
原辅料 浓度
HSA-IFNα2a 0.2mg/ml
氯化钠 5.85mg/ml
精氨酸 10mg/ml
吐温-80 0.05mg/ml
磷酸盐缓冲液 10mM，pH5.0
制备方法如下：
首先，配制磷酸盐缓冲液，然后先后向磷酸盐缓冲液中添加氯化钠、精氨酸和吐温-80，最后再加入重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白，即得稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液。
对上述溶液进行了加速试验和长期稳定性试验，考察指标为外观、纯度（非还原SDS-PAGE）和生物学活性。试验结果如表2所示。
表2.HSA-IFNα2a制剂处方1的稳定性研究试验结果
Figure BDA0000376530350000062
Figure BDA0000376530350000071
实施例2
一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，其成分如下表：
表3.HSA-IFNα2a溶液2
原辅料 浓度
HSA-IFNα2a 0.2mg/ml
氯化钠 2.93mg/ml
精氨酸 20mg/ml
吐温-80 0.1mg/ml
组氨酸-盐酸缓冲液 20mM，pH5.5
制备方法如下：
首先，配制组氨酸-盐酸缓冲液，然后先后向组氨酸-盐酸缓冲液中添加氯化钠、精氨酸和吐温-80，最后再加入重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白，即得稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液。
对上述溶液进行了加速试验和长期稳定性试验，考察指标为外观、纯度（非还原SDS-PAGE）和生物学活性。试验结果如表4所示。
表4.HSA-IFNα2a制剂处方2的稳定性研究试验结果
Figure BDA0000376530350000072
实施例3
一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，其成分如下表：
表5.HSA-IFNα2a溶液3
原辅料 浓度
HSA-IFNα2a 0.2mg/ml
氯化钠 0.585mg/ml
精氨酸 25mg/ml
吐温-80 0.2mg/ml
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 5mM，pH5.5
制备方法如下：
首先，配制柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，然后先后向柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中添加氯化钠、精氨酸和吐温-80，最后再加入重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白，即得稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液。
对上述溶液进行了加速试验和长期稳定性试验，考察指标为外观、纯度（非还原SDS-PAGE）和生物学活性。试验结果如表6所示。
表6.HSA-IFNα2a制剂处方3的稳定性研究试验结果
Figure BDA0000376530350000081
实施例4
一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，其成分如下表：
表7.HSA-IFNα2a溶液4
原辅料 浓度
HSA-IFNα2a 1mg/ml
氯化钠 5.85mg/ml
精氨酸 10mg/ml
吐温-80 0.2mg/ml
组氨酸-盐酸缓冲液 10mM，pH6.5
制备方法同实施例2。
对上述溶液进行了加速试验和长期稳定性试验，考察指标为外观、纯度（非还原SDS-PAGE）和生物学活性。试验结果如表8所示。
表8.HSA-IFNα2a制剂处方4的稳定性研究试验结果
Figure BDA0000376530350000091
实施例5
一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，其成分如下表：
表9.HSA-IFNα2a溶液5
原辅料 浓度
HSA-IFNα2a 1mg/ml
氯化钠 2.93mg/ml
精氨酸 20mg/ml
吐温-80 0.05mg/ml
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 20mM，pH5.0
制备方法同实施例3。
对上述溶液进行了加速试验和长期稳定性试验，考察指标为外观、纯度（非还原SDS-PAGE）和生物学活性。试验结果如表10所示。
10.HSA-IFNα2a制剂处方5的稳定性研究试验结果
Figure BDA0000376530350000092
Figure BDA0000376530350000101
实施例6
一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，其成分如下表：
表11.HSA-IFNα2a溶液6
原辅料 浓度
HSA-IFNα2a 1mg/ml
氯化钠 0.585mg/ml
精氨酸 25mg/ml
吐温-80 0.1mg/ml
磷酸盐缓冲液 5mM，pH7.0
制备方法同实施例1。
对上述溶液进行了加速试验和长期稳定性试验，考察指标为外观、纯度（非还原SDS-PAGE）和生物学活性。试验结果如表12所示。
表12.HSA-IFNα2a制剂处方6的稳定性研究试验结果
Figure BDA0000376530350000102
实施例7
一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，其成分如下表：
表13.HSA-IFNα2a溶液7
原辅料 浓度
HSA-IFNα2a 2mg/ml
氯化钠 5.85mg/ml
精氨酸 10mg/ml
吐温-80 0.1mg/ml
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 10mM，pH5.5
制备方法同实施例3。
对上述溶液进行了加速试验和长期稳定性试验，考察指标为外观、纯度（非还原SDS-PAGE）和生物学活性。试验结果如表14所示。
表14.HSA-IFNα2a制剂处方7的稳定性研究试验结果
Figure BDA0000376530350000111
实施例8
一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，其成分如下表：
表15HSA-IFNα2a溶液8
原辅料 浓度
HSA-IFNα2a 2mg/ml
氯化钠 2.93mg/ml
精氨酸 20mg/ml
吐温-80 0.2mg/ml
磷酸盐缓冲液 20mM，pH6.5
制备方法同实施例1。
对上述溶液进行了加速试验和长期稳定性试验，考察指标为外观、纯度（非还原SDS-PAGE）和生物学活性。试验结果如表16所示。
表16.HSA-IFNα2a制剂处方8的稳定性研究试验结果
Figure BDA0000376530350000121
实施例9
一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，其成分如下表：
表17.HSA-IFNα2b溶液9
原辅料 浓度
HSA-IFNα2b 2mg/ml
氯化钠 0.585mg/ml
精氨酸 25mg/ml
吐温-80 0.05mg/ml
组氨酸-盐酸缓冲液 5mM，pH6.0
制备方法同实施例2。
对上述溶液进行了加速试验和长期稳定性试验，考察指标为外观、纯度（非还原SDS-PAGE）和生物学活性。试验结果如表18所示。
表18.HSA-IFNα2b制剂处方9的稳定性研究试验结果
Figure BDA0000376530350000122
Figure BDA0000376530350000131
实施例10
一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，其成分如下表：
表19.HSA-IFNα2a溶液10
原辅料 浓度
HSA-IFNα2a 1mg/ml
氯化钠 0.585mg/ml
甘氨酸 25mg/ml
吐温-80 0.1mg/ml
磷酸盐缓冲液 5mM，pH7.0
制备方法同实施例1。
对上述溶液进行了加速试验和长期稳定性试验，考察指标为外观、纯度（非还原SDS-PAGE）和生物学活性。试验结果如表20所示。
表20.HSA-IFNα2a制剂处方10的稳定性研究试验结果
Figure BDA0000376530350000132
实施例11
一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，其成分如下表：
表21.HSA-IFNα2a溶液11
原辅料 浓度
HSA-IFNα2a 1mg/ml
氯化钠 0.585mg/ml
甲硫氨酸 25mg/ml
吐温-80 0.1mg/ml
磷酸盐缓冲液 5mM，pH7.0
制备方法同实施例1。
对上述溶液进行了加速试验和长期稳定性试验，考察指标为外观、纯度（非还原SDS-PAGE）和生物学活性。试验结果如表22所示。
表22.HSA-IFNα2a制剂处方11的稳定性研究试验结果
Figure BDA0000376530350000141
实施例12
重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白在剧烈震荡、摇晃等条件下容易形成多聚体，吐温-80、吐温-20及其它非离子型表面活性剂对多聚体的形成有抑制作用。通过模拟实际运输条件，对样品进行摇晃试验。试验条件为：室温下，在恒温培养摇床中，150rpm/min，摇晃2小时。通过将添加吐温-80的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液（R1组）与不加吐温-80的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液（R2组）作对照，考察吐温-80的作用。
重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，其成分如下表：
表23.HSA-IFNα2a溶液12
Figure BDA0000376530350000151
R1组制备方法同实施例1，R2组制备方法如下：
首先，配制磷酸盐缓冲液，然后先后向磷酸盐缓冲液中添加氯化钠和精氨酸，最后再加入重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白，即得稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液。
对上述两种溶液进行了摇晃试验，考察指标为外观、纯度（非还原SDS-PAGE）和生物学活性。试验结果如表24所示。
表24.摇晃试验的结果
处方 外观 非还原电泳(%) 剩余生物学活性(%)
R1 澄清 99.1 100.3
R2 澄清 97.5；2.2（寡聚体） 98.8
从表24中的数据可以看出，吐温-80能够明显抑制因摇晃、震荡等条件导致的蛋白寡聚体的产生。吐温-80的加入，可以进一步提高融合蛋白的稳定性。
综合以上试验数据可以看出，以精氨酸作为稳定剂的制剂处方的稳定性要明显优于以甘氨酸或甲硫氨酸作为稳定剂的制剂处方，因此，最终选用精氨酸作为稳定剂。本发明公开的HSA-IFNα2a和HSA-IFNα2b的制剂处方具有良好的稳定性，同样可以作为HSA-IFNα1b和HSA-IFNαcon的制剂处方使用。
本发明公开的制剂处方1～9与CN101099722A专利中公开的处方相比，结果如表25和26所示。
表25.4℃条件下放置4个月，本发明公开的处方RP-HPLC的检测结果
Figure BDA0000376530350000152
表26.4℃条件下放置4个月，CN101099722A专利中公开的处方RP-HPLC的检测结果
Figure BDA0000376530350000153
从表25和26中的数据可以看出，本发明公开的HSA-IFNα2a的制剂处方的稳定性优于CN101099722A专利中公开的处方。综合以上试验数据可以看出，本发明公开的HSA-IFNα2a融合蛋白的制剂具有良好的稳定性，适合于临床使用。
实施例13：含有重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白的制剂的药效学研究
HSA-IFNα2a和IFNα2a的体外活性比较表明，尽管HSA-IFNα2a比IFNα2a的比活性低，但二者具有相似的抗病毒和抗增殖特性。融合蛋白在猕猴体内的药代和药效学活性增强了。单次静脉注射（50μg/kg）后，清除率为0.93ml/h/kg，半衰期是64h。皮下注射50μg/kg后，表观清除率（生物利用度表现的清除率）为1.6ml/h/kg，半衰期是88h，生物利用度是58%。猕猴皮下注射给药，HSA-IFNα2a的清除率比IFNα2a慢，约140倍，半衰期比IFNα2a长18倍。基于体外生物检定的HSA-IFNα2a处理的猕猴血清检测显示剂量相关的抗病毒活性≥8天，然而IFNα2a处理的动物抗病毒活性相对于0天的赋形剂只有略微的提高。HSA-IFNα2a药代动力学的改善伴随着药效学的改善，这样以来HSA-IFNα2a相对于IFNα2a就具有低给药频率和潜在药效改善的优势。

Claims (2)

1.一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，它包括重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白与药学上可接受的稳定性辅料溶于药学上可接受的缓冲液得到，
所述重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白为重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白，浓度为0.2～2g/L；
所述药学上可接受的稳定性辅料为精氨酸，浓度为10～25g/L；
所述药学上可接受的缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为5～100mmol/L，pH为5.0～8.0；
所述重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白溶液中还包括浓度为0.05～0.2g/L的吐温-80作为表面活性剂和浓度为0.5～10g/L的氯化钠。
2.权利要求1所述稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液的制备方法，包括如下步骤：
（1）配制药学上可接受的缓冲液磷酸盐缓冲液，pH5.0～8.0，浓度为5～100mmol/L；
（2）向步骤（1）制得的磷酸盐缓冲液中添加精氨酸、氯化钠和吐温-80，使溶液中精氨酸终浓度达到10～25g/L，氯化钠终浓度达到0.5～10g/L，吐温-80终浓度达到0.05～0.2g/L，得混合液；
（3）向步骤（2）制得的混合液中加入重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白，使其终浓度达到0.2～2g/L，即得稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液。
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