CN103611162B - 人凝血因子ⅷ冻干保护剂及其制备方法 - Google Patents
人凝血因子ⅷ冻干保护剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种不含人血白蛋白不含糖的人凝血因子Ⅷ冻干保护剂配方，该冻干保护剂组成(浓度mol/L)：氯化钠10-200、枸橼酸钠2-50、甘氨酸50-600、氯化钙1-30、盐酸赖氨酸1-200。采用本配方，应用干热法可有效灭活人凝血因子Ⅷ制品中指示病毒，且在冻干热灭活过程中及长期储存过程中有效保护血源性人凝血因子Ⅷ的活性，具有病毒灭活效果好、未添加人血白蛋白其它动物源性成分可避免隐性污染、配方成份简单能有效降低生产成本、氯化钠浓度及制品渗透压与人体相容性好、本配方中氯化钠浓度有利于冻干及制品长期储存、赋型甘氨酸有氨基和羧基而使冻干及制品具有强缓冲性、不含糖、耐热性好和复溶时间短等优点。
Description
技术领域
本发明属于医药和生物技术领域，具体属于属于血液制品生产技术领域，内容涉及人凝血因子Ⅷ冻干保护剂。
技术背景
人凝血因子Ⅷ（FⅧ）是正常血浆的一种糖蛋白，在正常人血浆中的含量为100-200ng/ml,相当于1nM。其功能异常或缺失将导致血友病A（血友病甲）。全世界约有400,000血友病患者，血友病在男性中有1/5000-1/10000的发病率。由正常人血浆分离纯化制备的人凝血因子Ⅷ制品主要用于血友病的治疗。由于FⅧ不稳定，冻干时通常需要加入保护剂，Gringeri,A.的研究数据显示全球血浆来源的29个FⅧ制品中有17个采用含白蛋白的稳定剂（Mark Brooker.Registry of Clotting Factor Concentrates.Eighth Edition,2008,World Federation of Hemophilia）。国内亦有采用人白蛋白和或糖醇类作为人凝血因子Ⅷ冻干保护剂的专利，但是，出于制品安全角度考虑，稳定剂的发展方向是尽量避免使用生物源性成分。目前，各种成分如盐类、糖类醇类、聚体、氨基酸等引入冻干配方，尤其是氨基酸类备受亲睐。
2012年1月9日，中国健康教育中心公布的“中国慢病监测及糖尿病专题调查”结果显示，我国18岁及以上居民糖尿病患病率为9.7%，60岁以上老年人患病率高达19.6%，目前，全国约有成年糖尿病患者已经达到1.14亿。占全球患者三分之一。因此，研究和探索不含白蛋白，不含糖的冻干保护剂配方具有积极意义。
发明内容
本发明的任务是提供一种人凝血因子Ⅷ冻干保护剂，使其具有不含人血白蛋白、不含糖、不含其它动物源性成分，能有效避免由于人血白蛋白可能对制品造成的隐性污染问题等特点。
本发明的另一个任务是提供这种一种人凝血因子Ⅷ冻干保护剂的制备方法。
本发明的又一个任务是提供一种冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法。即使用本发明人凝血因子Ⅷ冻干保护剂制备冻干人凝血因子Ⅷ的方法。
实现本发明的具体方案是：
本发明提供的这种人凝血因子Ⅷ冻干保护剂，是在注射用水中溶解有下浓度组分形成的缓冲液：
氯化钠 10-200mol/L
枸橼酸钠 2-50mol/L
甘氨酸 50-600mol/L
氯化钙 1-30mol/L
盐酸赖氨酸 1-200mol/L。
上述人凝血因子Ⅷ冻干保护剂的pH为6.5-7.5。
上述人凝血因子Ⅷ冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将氯化钠、枸橼酸钠、甘氨酸、氯化钙、盐酸赖氨酸充分溶解于灭菌注射用水中,使各成分终浓度为：氯化钠10-200mol/L；枸橼酸钠2-50mol/L；甘氨酸50-600mol/L；氯化钙1-30mol/L；盐酸赖氨酸1-200mol/L；
步骤二：调整pH至6.5-7.5定容，具体可用6mol/L盐酸溶液调整pH；除菌过滤即得人凝血因子Ⅷ冻干保护剂。如可采用0.22μm的微孔滤膜进行除菌过滤。
采用上述本发明提供的人凝血因子Ⅷ冻干保护剂制备冻干人凝血因子Ⅷ的方法是：用上述本发明提供的人凝血因子Ⅷ冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ原液进行超滤透析得到人凝血因子Ⅷ半成品，经除菌过滤、分装、冻干后，进行热灭活。热灭活具体可采用100℃30分钟灭活。采用该方法制备的冻干人凝血因子Ⅷ可用灭菌注射用水作稀释剂进行复溶。
本发明提供的人凝血因子Ⅷ冻干保护剂不含人血白蛋白，可避免由于人血白蛋白可能对制品造成的隐性污染问题。本发明提供的人凝血因子Ⅷ冻干保护剂不含糖，可避免糖尿病患者使用时可能对患者血糖造成负担问题。本发明提供的人凝血因子Ⅷ冻干保护剂玻璃转化温度为大于140℃，故可避免在100℃30min灭活过程中冻干微观结构发生变化，在加热灭活的条件下即有效保护了目的蛋白的活性，又使指示病毒得以有效地灭活；
本发明公开一种不含人血白蛋白不含糖的人凝血因子Ⅷ冻干保护剂配方，该冻干保护剂组成(浓度mol/L)：氯化钠10-200、枸橼酸钠2-50、甘氨酸50-600、氯化钙1-30、盐酸赖氨酸1-200。采用本配方，应用干热法可有效灭活人凝血因子Ⅷ制品中指示病毒，且在冻干热灭活过程中及长期储存过程中有效保护血源性人凝血因子Ⅷ的活性。本发明的冻干保护剂配方的创新点在于以下几个方面：1.病毒灭活效果好，采用本冻干保护配方应用干热法可有效灭活人凝血因子Ⅷ制品中指示病毒HIV-1达到4.00log以上，且经细胞培养盲传三代，均未出现细胞病变（中国人民解放军艾滋病检测确认实验室检测报告.报告编号：B2012MH018）。采用本冻干保护配方应用干热法可有效灭活三批人凝血因子Ⅷ制品中指示病毒PPV分别为大于4.18LgTCID50/0.1ml,4.24LgTCID50/0.1ml和4.26LgTCID50/0.1ml，灭活三批人凝血因子Ⅷ制品中指示病毒EMCV分别为大于4.75LgTCID50/0.1ml，4.68LgTCID50/0.1ml和4.68LgTCID50/0.1ml（中国食品药品检定研究院中检生检函[2013]924号关于人凝血因子Ⅷ病毒灭活验证结果的函）；2.未添加人血白蛋白其它动物源性成分，白蛋白在冻干配方中具有良好的支架作用，能有效地保护目的蛋白活性，加入人白蛋白成分是传统配方选择方式，但是白蛋白同时具有保护病毒的作用，干扰病毒灭活效果，在成为产品方面存在缺陷，本配方还避免了由于人血白蛋白等可能对制品造成的隐性污染问题；3.本发明的冻干保护剂配方成份简单，能有效降低生产成本。4.本配方中合理调节氯化钠浓度及制品渗透压，使制品与人体相容性好，避免给合并有心脏疾病的患者增加心功能负担；5.本配方中氯化钠浓度有利于冻干及制品长期储存，高氯化钠浓度会在制品的长期储存中吸收水分，使残留水分含量增加，影响制品的稳定性，因此合理的氯化钠浓度，可增强冻干制品在长期储存时的稳定性；6.配方中的主要赋型成分为甘氨酸，是20种蛋白氨基酸中分子量最小的一个，因甘氨酸为具有氨基和羧基的两性离子，有很强的缓冲性，故提升了对活性不稳定的目的蛋白的保护作用；7.本冻干保护剂配方不含糖，便于合并有糖尿病的患者使用，避免由于输注含糖制剂引起的糖尿病患者血糖水平升高；8.耐热性好，经检测本冻干配方玻璃转化温度大于140℃，故可避免在100℃30min灭活过程中冻干微观结构发生变化，在加热灭活的条件下有效保护了目的蛋白的活性，且指示病毒得以有效地灭活；9.复溶时间短，采用本配方的人凝血因子Ⅷ成品，用灭菌注射用水溶解时间<1min,远优于药典30min内溶解的要求。
附图说明
图1：热灭活前人凝血因子Ⅷ制品；
图2：热灭活后人凝血因子Ⅷ制品；
图3：实验例4之各配方（共15组）冻干后外观，配方编号（每排编号从左到右）：第一排：10、11；第二排：7、8、9、15、12；第三排：1、2、3、4、5、6、13、14。
图4：干热法灭活人凝血因子Ⅷ制品中PPV动力曲线；
图5：干热法灭活人凝血因子Ⅷ制品中EMCV动力曲线；
图6：干热法灭活人凝血因子Ⅷ制品中HIV动力曲线。
具体实施方式
实施例1
1.配制冻干保护剂缓冲液。使用灭菌注射用水充分溶解氯化钠、枸橼酸钠、甘氨酸、氯化钙、盐酸赖氨酸,并用6mol/L盐酸溶液调整pH至6.9，定容。使各成分终浓度为：氯化钠102mmol/L、枸橼酸钠10mmol/L、甘氨酸266mmol/L、氯化钙1mmol/L、盐酸赖氨酸34mmol/L，除菌过滤即得本冻干保护剂缓冲液。
2.得到人凝血因子Ⅷ原液，采用上述冻干保护剂缓冲液进行超滤透析得到人凝血因子Ⅷ半成品
3.步骤2所得人凝血因子Ⅷ半成品除菌过滤、分装、冻干。
4.步骤3所得样品，进行100℃30min灭活。
以下实验例表明本发明的积极效果。
实验例1
制备人凝血因子Ⅷ原液，将原液分为2份，其中一份以实施例1步骤1、2制备1批人凝血因子Ⅷ半成品（表7中以配方M代表）；另一份采用一种含有人血白蛋白的冻干保护剂配方（表7以配方N代表）制备成半成品。参照实施例1步骤3进行冻干,进行80℃72小时灭活，留取冻干后（即热灭活前）和灭活后样品。比较外观，结果见图1和图2。
由实验结果可知，含白蛋白组在干热灭活后明显萎缩（见图2），而本专利配方组制品灭活后依然是乳白色疏松体。（见图2）
测定两组配方的玻璃转化温度，经检测：配方M的玻璃转化温度测定结果<80℃；配方N的玻璃转化温度测定结果为>140℃。
冻干后制品的微观结构有玻璃状态、粘弹状态和熔融状态。随着加热进行，将从玻璃状态转换为粘弹状态和熔融状态。期间变换点分别为玻璃转化温度（Tg）和熔点(Tm)。其中玻璃态是最为坚固的状态，分子不能自由移动。而粘弹状态时非结晶部分可以有一定的流动性（可以变形），但玻璃态和粘弹状态在宏观表现均为固态。这也就解释了为什么配方M在灭活后会发生变形，即当加热到大于配方M的Tg温度（<80℃）后，配方M的微观结构由玻璃状态转变为粘弹状态，样品具有一定流动性和变形性。微观结构不再稳定，微观改变引起宏观变化，即发生萎缩，导致制品不易复溶或复溶后外观不合格，而复溶后外观是产品质量的重要考核指标。但是本发明的配方经检测其Tg>140℃，保证其在灭活过程中，不会引起微观结构变化，复溶后外观完好。因此证明了本配方的优越性。
实验例2
制备人凝血因子Ⅷ原液，将原液分为2份，其中一份以实施例1步骤1、2制备1批人凝血因子Ⅷ半成品（表1中以配方M代表）；另一份采用一种含有人血白蛋白的冻干保护剂配方（表1以配方N代表）制备成半成品。两组样品均按照样品：指示病毒（9:1）的比例加入指示病毒PRV，留取冻干前样品。参照实施例1步骤3进行冻干,进行80℃72小时灭活，留取冻干后和灭活后样品。所得样品进行残余病毒滴度检测，评价病毒灭活效果，结果见表1。
表180℃72h灭活人凝血因子Ⅷ中指示病毒PRV的效果
由表1结果可知，含配方M的制品病毒灭活效果优于含配方N的制品,提示白蛋白在此配方中对病毒可能存在保护作用。因此含人白蛋白的配方在成为产品方面可能存在缺陷。本发明的配方因不含人白蛋白，可以避免其病毒保护作用。因此，亦体现本发明配方的优越性。
实验例3
以实施例1制备3批人凝血因子Ⅷ成品，观察制品外观，检测真空度、水分；将成品置于2-8℃保存，按规定时间取样，监测人凝血因子Ⅷ效价。结果见表2、3
表2本公司人凝血因子Ⅷ外观、水分和真空度
| 本公司产品 | |
| 冻干后外观 | 乳白色疏松体 |
| 溶解时间（分钟） | <1分钟 |
| 水分 | 合格 |
| 真空度 | 合格 |
由表2结果可知，制品外观、溶解时间、真空度、水分均达到2010版《中国药典》人凝血因子Ⅷ的相关要求。
表3.人凝血因子Ⅷ效价（IU/瓶）
由表3结果可知，人凝血因子Ⅷ制品在2-8℃常规保存条件下的稳定性良好。
实验例4
制备15种冻干配方，以实施例1步骤3进行冻干，各组冻干后外观见图3。配方编号（每排编号从左到右）：第一排：10、11；第二排：7、8、9、15、12；第三排：1、2、3、4、5、6、13、14。
表4.各组配方成分比例及冻干后外观
由以上图3和表4结果可知，15组配方冻干后外观提示：在仅一种氨基酸的前提下，盐浓度对样品外观起主导作用；当有二种氨基酸存在时，盐浓度对外观不产生明显影响，而含糖与否则对外观有一定的负面影响；白蛋白含量直接影响外观，含量太低样品不易成型，太高不易冻干，而盐浓度则对外观无明显影响；本发明配方的优越性在于提炼了氨基酸的配方种类及与盐浓度的配比，规避了传统配方成分的隐性风险。
实验例5
以实施例1步骤1、2制备3批人凝血因子Ⅷ半成品，按样品：指示病毒（9:1）的比例加入指示病毒PPV，留取冻干前样品。参照实施例1步骤3、4进行冻干和灭活，留取冻干后和灭活后样品。所得样品送中国食品药品检定研究院，进行残余病毒滴度检测，评价病毒灭活效果，结果见表5和图4（图4数据来源于表5）
表5.干热法灭活人凝血因子Ⅷ制品中PPV结果
表6.本公司与国内其他厂家人凝血因子Ⅷ制品的干热病毒灭活效果比较
(企业A和企业C数据来源：杨立宏,岳广智.终端干热法灭活凝血因子类制品中细小病毒的工艺验证.［J］中国生物制品学杂志2010,23(9):1018-1019)
由以上图4和表6的结果可知，含本配方的人凝血因子Ⅷ干热灭活PPV病毒达到国家规定的标准，灭活效果优于国内另外两个厂家。
实验例6
以实施例1步骤1、2制备3批人凝血因子Ⅷ半成品，按样品：指示病毒（9:1）的比例加入指示病毒EMCV，留取冻干前样品。参照实施例1步骤3、4进行冻干和灭活，留取冻干后和灭活后样品。所得样品送中国食品药品检定研究院，进行残余病毒滴度检测，结果见表7和图5（图5数据来源于表7）
表7.干热法灭活人凝血因子Ⅷ制品中EMCV结果
由以上图5和表7的结果可知，含本配方的人凝血因子Ⅷ干热灭活EMCV病毒达到国家规定的标准，灭活效果好。
实验例7
以实施例1步骤1、2制备3批人凝血因子Ⅷ半成品，样品送北京军事医学科学院，进行干热灭活HIV验证，结果见表8和图6（图6数据来源于表8）
表8.干热法灭活人凝血因子Ⅷ制品中HIV结果
注：残余病毒滴度小于或者等于3.50LgTCID50/ml表示未见细胞病变
由以上图和表的结果可知，含本配方的人凝血因子Ⅷ干热灭活HIV病毒达到国家规定的标准，灭活效果好，保证制品的安全性。
综上所述，本发明人凝血因子Ⅷ保护配方在干热灭活中有良好的病毒灭活效果，同时可以保护人凝血因子Ⅷ的活性。本发明配方中未添加人血白蛋白其它动物源性成分，避免人血白蛋白等可能对制品造成的隐性污染和病毒保护问题。本发明配方玻璃转化温度大于140℃，故可避免在100℃30min灭活过程中冻干微观结构发生变化。采用本发明配方的人凝血因子Ⅷ制品外观良好、复溶时间短，在2-8℃条件下稳定性好，是一种新的成本低，安全性高、有效性好的人凝血因子Ⅷ，应用前景良好。
Claims (3)
1.一种人凝血因子Ⅷ冻干保护剂，其特征在于，它是在注射用水中溶解以下浓度组分形成的pH6.9的缓冲液：
氯化钠102mmol/L、枸橼酸钠10mmol/L、甘氨酸266mmol/L、氯化钙1mmol/L、盐酸赖氨酸34mmol/L。
2.一种权利要求1所述的人凝血因子Ⅷ冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将氯化钠、枸橼酸钠、甘氨酸、氯化钙、盐酸赖氨酸充分溶解于灭菌注射用水中；
步骤二：用6mol/L盐酸调整pH至6.9定容，0.22μm微孔滤膜除菌过滤即得人凝血因子Ⅷ冻干保护剂。
3.一种冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征在于，用权利要求1所述的人凝血因子Ⅷ冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ原液进行超滤透析得到人凝血因子Ⅷ半成品，经除菌过滤、分装、冻干后采用100℃，30分钟灭活即得。
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