CN100577149C - 一种治疗用a型肉毒毒素冻干粉针剂新型冻干保护剂配方 - Google Patents

Abstract

本发明涉及A型肉毒毒素的药物制剂，在加入优选的一种冻干保护剂以冻干粉针剂的固体形式在室温下可稳定贮藏至少12个月，在4℃可稳定储存36个月。冻干保护剂由人用人血白蛋白、蔗糖或者人用人血白蛋白、乳糖按一定比例和水制成。A型肉毒毒素的药物制剂应用于对斜视、眼睑痉挛、面肌痉挛及痉挛性斜视等疾病进行治疗。与以前配方相比，利用本发明获得的A型肉毒毒素的制品质量好，稳定性高。

Description

一种治疗用A型肉毒毒素冻干粉针剂新型冻干保护剂配方

技术领域

本发明涉及A型肉毒毒素的药物制剂，在加入优选的一种冻干保护剂以冻干粉针剂的固体形式在室温下可稳定贮藏至少12个月，在4℃可稳定储存36个月。

背景技术：

肉毒神经毒素(botulinum neurotoxin，BoNT)，也称肉毒毒素(botulinumtoxin)，是肉毒梭菌在厌氧条件下分泌的多肽神经毒素。神经毒素通过抑制神经肌肉接合处的神经递质乙酰胆碱的释放，影响神经冲动的传递，导致肌肉松弛性麻痹。

A型BoNT是目前已知的最剧毒物质之一，但是近年来，已经将其应用于对斜视、眼睑痉挛、面肌痉挛及痉挛性斜视等疾病进行治疗，并取得满意疗效。1989年A型BoNT被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于12岁以上12岁以上的由肌肉张力障碍引起的斜视、眼睑痉挛等疾病(http://www.garlandscience.com/cbl/pdflibrary/botox_timeline.pdf)。这是世界上第1个被批准为治疗药物的微生物毒素。

在自然状态下或人工培养基上A型BoNT通常以一种复合体形式存在，即神经毒素和血凝素或非血凝活性蛋白的复合体。象许多生物活性蛋白一样，BoNT的生物活性与它的空间形态结构有关，血凝素在保持BoNT三维结构及稳定性起着重要作用(Sugiyama 1980；Schantz & Johnson 1992)。BoNT很容易被80℃以上的高温所破坏，特别是在碱性条件下；空气/液体界面形成的气泡能引起神经毒素的伸展和形态改变，进而使BoNT溶液失去毒性，在有氮气和二氧化碳的环境中也能使BoNT变性，稀释至过低浓度(ng/ml)能使BoNT的稳定性降低，失去部分活性。由于BoNT是一个约150kDa的大分子物质，失去活性的BoNT即成为无毒的类毒素蛋白，该类毒素蛋白是一种很好的免疫原性物质，使注射者产生抗体，进而影响BoNT制剂的进一步治疗效果。如何在稀释过低浓度BoNT制剂过程中保证其稳定性，便成为一个十分重要的措施。试验研究表明，通过用含其它蛋白如明胶、牛或人血清白蛋白的缓冲液(pH＜6.8)稀释BoNT原液才能增强其稳定性(Goodnough & Johnson 1992)。

在我国现有的注射用A型BoNT冻干制剂中都采用了明胶作为制剂中的活性物质保护剂(杨仲1997)，但明胶主要来源于牛对人来说属于异源物质，同时还存在着有病毒污染的危险(例如疯牛病)日本及一些欧美国家已经禁止此类产品进口。本发明是针对以明胶作为注射用A型BoNT冻干制剂中的保护剂存在的不足设计了一种新型的配方用来作为A型BoNT的的冻干保护液，使产品安全性更高，更具有市场竞争力。人血白蛋白是人的血浆中富含的蛋白，人血清白蛋白的分子量约69kDa，经常被用做蛋白药物保护剂(Kurono 1982；Tarelli1998)，白蛋白主要是通过：(1)减少蛋白活性成分与表面的粘附(2)减少活性成分低稀释度溶液制备过程中可发生的活性成分变性来稳定蛋白活性成分，除了能够稳定药物组合中的蛋白活性成分，与明胶及牛血白蛋白相比，人血白蛋白还具有注射给患者时，通常可忽略其免疫原性的和使用更加安全等优点。

发明内容

本发明通过在A型BoNT的药物制剂中，加入一种经过优选的冻干保护剂，达到稳定A型BoNT的目的，与已上市的A型BoNT药物制剂不同，本发明制品是由药学上可接受的冻干保护剂和A型BoNT结晶复合物组成，其特征在于，其中的冻干保护剂由人用人血白蛋白和乳糖、或由人用人血白蛋白和蔗糖按一定比例组成。

本发明优先的冻干保护剂的配方如下：

人用人血白蛋白            0.5％～10％

乳糖或蔗糖                0.5％～10％

其余为注射用水

本发明的冻干保护剂的配方，更优选的为以下配方：

人用人血白蛋白            1％～5％

乳糖或蔗糖                1％～5％

其余为注射用水

本发明的冻干保护剂的配方，最优选的为以下配方

人用人血白蛋白            2.5％

乳糖或蔗糖                2.5％

其余为注射用水

配方中的人用人血白蛋白选择经过国家食品药品监督管理局批准的可以在市场上流通的人用人血白蛋白，乳糖和蔗糖选择选择经过国家食品药品监督管理局批准的药用乳糖或蔗糖。

本发明中所涉及的BoNT可以选自A、B、C、D、E、F、G血清型，可通过文献所报道的办法来制备，具体可以通过以下一种方法制备：

I、产毒培养基成分：

酶水解酪素                1％～10％

酵母浸粉                  1％～10％

硫代乙醇酸钠              0.01％～0.05％

半胱氨酸盐酸盐            0.01％～0.1％

葡萄糖                    1％～2％

II、产毒培养基形成：

(1)将酪蛋白水解物、酵母浸粉、硫代硫乙醇酸钠、半胱氨酸盐酸盐溶于蒸馏水，调节pH至7.1-7.5，121℃灭菌30分钟备用。

(2)另配20％葡萄糖溶液112℃灭菌30分钟。接种前按比例加入。

III、产毒培养：

将经适应培养后的A型肉毒梭菌接种在产毒培养基中，37℃培养4天，培养结束后用小白鼠测毒力，其毒力不低于1×10⁵LD₅₀/ml.

IV、毒素的提纯：

(1)酸沉淀：将产毒培养液用3N硫酸调pH至3.4左右。2～8℃过夜。

(2)毒素提纯：弃上清，沉淀用蒸馏水洗两次。加适量pH6.0、0.2M磷酸盐缓冲液，分两次溶解、提取。离心后将上清合并。

(3)酶处理及浓缩：加入核糖核酸酶34℃温育3小时。加硫酸铵至60％饱和，2～8℃过夜，离心，沉淀用适量pH5.5、0.05M柠檬酸缓冲液溶解后，透析。

(4)层析：透析液经DEAE-A50离子交换层析，收集、合并OD₂₆₀/OD₂₈₀为0.5～0.6的过柱液。

(5)结晶：合并液家硫酸铵至60％饱和，2～8℃过夜，离心，沉淀用适量pH6.8、0.05M磷酸盐缓冲液溶解，再在含0.9M硫酸铵的上述缓冲液中透析，自然形成结晶，亦可重复上述过程，以形成第二次结晶；

V、毒素的稀释、冻干：

(1)稀释

a)用磷酸盐缓冲液溶解及透析结晶毒素，除菌过滤后测定毒力；

b)用磷酸盐缓冲液将已知毒力的毒素溶液稀释至适当溶度(10⁵～10⁶LD₅₀/ml)；

c)将适量的稀释毒素液加入到定量的冻干保护液中，使每毫升冻干保护液中毒素含量在效价要求的范围(100-800LD₅₀/ml)；

(2)分装、冻干

每瓶定量分装上述含冻干保护液的毒素稀释液0.5ml，以蛋白质制品的冻干曲线对其进行冻干，冻干成品应无菌、水分含量不超过3％。

用本发明实例的方法制备的A型BoNT制剂稀释到240LD₅₀/ml，并按0.5毫升等分量装入2ml西林瓶中，按照蛋白质的冻干曲线冻干，于4℃贮藏长达并包括36个月。从开始贮藏起的0、6、12、18、24、30、36个月，随机取样，并作小鼠LD₅₀分析以测试效力及无菌、水分。

表1、表2列出不同时间点取出的样品的测定结果。这些结果显示，根据本发明制备的A型BoNT制剂是稳定的。表1说明，当根据本发明制备的A型BoNT制剂，在4℃贮藏至少36个月时，A型BoNT制剂效价还在贮藏时间为0时所记录的效价范围内。(在分装前按240U/ml稀释，理论上应为120U/0.5ml即一瓶为120U，冻干后测量的实际值为110U/瓶，这是因为冻干过程中所造成的损失，另外由于用动物来测定效价，因此其测定值在一定范围内变动)。

表14℃时A型BoNT制剂的稳定性(1U＝1LD₅₀)

表2说明，当根据本发明制备的A型BoNT制剂，在25℃贮藏至少12个月时，A型BoNT制剂效价还在贮藏时间为0时所记录的效价范围内。(在分装前按240U/ml稀释，理论上应为120U/0.5ml即一瓶为120U，冻干后测量的实际值为110U/瓶，这是因为冻干过程中所造成的损失，由于用动物来测定效价，因此其测定值在一定范围内变动)。

表225℃时A型BoNT制剂的稳定性

本发明的冻干保护剂能提供pH6.8缓冲范围及由液体溶液冻干制成可贮藏的粉针剂时使A型BoNT制剂在冻干时效价损失率为(120-110)/120＝8.3％远远低于文献报道中40％的损失率。本发明的药物制剂能以固体形式在在4℃贮藏至少36个月时，25℃贮藏至少12个月A型BoNT制剂效价还在贮藏时间为0时所测定的效价范围内(110U±20％，即88U-132U)。

本发明的制剂，与现有技术相比，具有稳定性更强，副作用更少，配制简单，原料易得，使用方便，安全性更高，疗效更加优良。

具体实施方式：

下列实例以本发明范围内特别优选的方法供给本领域普通熟练人员以便实施本发明，并不是有意限制本发明人的发明范围。

实施例1

本发明的A型BoNT，具体可以通过以下方法制备：

I、产毒培养基成分

酶水解酪素            1％～10％

酵母浸粉              1％～10％

硫代乙醇酸钠          0.01％～0.05％

半胱氨酸盐酸盐        0.01％～0.1％

葡萄糖                1％～2％

其余为水

II、产毒培养基形成

(1)将酪蛋白水解物、酵母浸粉、硫代硫乙醇酸钠、半胱氨酸盐酸盐溶于蒸馏水，调节pH至7.2-7.3。121℃灭菌30分钟备用。

(2)另配20％葡萄糖溶液112℃灭菌30分钟，接种前按比例加入。

III、产毒培养

将经适应培养后的A型肉毒梭菌接种在产毒培养基中，37℃培养4天。

IV、毒素的精致提纯

(1)酸沉淀：将毒素液用3N硫酸调pH至3.4左右。2～8℃过夜。

(2)毒素提纯：弃上清，沉淀用蒸馏水洗两次。加适量pH6.0、0.2M磷酸盐缓冲液，分两次溶解、提取。离心后将上清合并。

(3)酶处理及浓缩：加入核糖核酸酶30℃～34℃温育3小时。加硫酸铵至60％饱和，2～8℃过夜，离心，沉淀用适量pH5.2-5.8、0.05M柠檬酸缓冲液溶解后，透析。

(4)层析：透析液经DEAE-A50离子交换层析，收集、合并OD₂₆₀/OD₂₈₀为0.5～0.6的过柱液。

(5)结晶：合并液加硫酸铵至60％饱和，2～8℃过夜，离心，沉淀用适量pH6.8、0.05M磷酸盐缓冲液溶解，再在含0.9M硫酸铵的上述缓冲液中透析，自然形成结晶，亦可重复上述过程，以形成第二次结晶；

V、毒素的稀释、冻干

(1)稀释

a)用磷酸盐缓冲液溶解及透析结晶毒素，除菌过滤后测定毒力；

b)用磷酸盐缓冲液将已知毒力的毒素溶液稀释至适当浓度(10⁵～10⁶LD₅₀/ml)；

c)将适量的稀释毒素加入到定量的冻干保护液中，使每毫升冻干保护液中毒素含量在效价要求的范围(240LD₅₀/ml)；

实施例2

(1)冻干保护液成份：

20％人用人血白蛋白        125ml

蔗糖                      25g

注射用水                  加水至875ml

(2)配置方法：

a)按配制量量取人血白蛋白；

b)按配制量称取蔗糖，加入注射用水溶解后，调pH为6.8，121℃，20分钟高压灭菌。

a)将a与b溶液混匀后，然后加入一定量的A型BoNT稀释液，用0.22微孔滤膜过滤，按照0.5ml/支分装于西林瓶中。

b)以蛋白质制品的冻干曲线对其进行冻干，冻干成品无菌合格，水分含量不超过3％。

实施例3

(1)冻干保护液成分：

20％人用人血白蛋白        125ml

乳糖                      25g

注射用                    水加至875ml

(2)配置方法

a)按配制量量取人血白蛋白；

b)按配制量称取乳糖，加注射用水溶解后，调pH为6.8，121℃，20分钟高压灭菌；

c)将a与b溶液混匀后，然后加入一定量的A型BoNT稀释液，用0.22微孔滤膜过滤，按照0.5ml/支分装于西林瓶中；

d)以蛋白质制品的冻干曲线对其进行冻干，冻干成品无菌，水分含量不超过3％。

主要参考文献

Goodnough MC and Johnson EA.Stabilization of botulinum toxin type A duringlyophilization.Appl Environ Microbiol，1992，58：3426-3428.

Kurono Y，Ohta N，lkeda K.Utilization of human serum albumin as drug additives I.Stabilizer of prostacyclin.Chem Pharm Bull(Tokyo).1982，30：2635-2638.

Schantz EJ and Johnson EA.Properties and use of botulinum toxin and other microbialneurotoxins in medicine.Microbiol.Rev.1992，56：80-92.

Sugiyama H.Clostridium botulinum neurotoxin.Microbiol.Rev.1980，44：419-448.

Tarelli E，Mire-Sluis A，Tivnann HA，et al.Recombinant human albumin as a stabilizer forbiological materials and for the preparation of international reference reagents.

Biologicals.1998，26：331-346.

杨仲，薛峰，肖在滢等.治疗用A型肉毒毒素的制备及其质量控制.微生物学免疫学进展.1997，27(3)：41-44.

Claims (4)

1、A型肉毒毒素(BoNT)的药物制剂，是由药学上可接受的冻干保护剂和肉毒毒素组成，其特征在于，其中冻干保护剂各组分之间的重量配比如下：

人血白蛋白            2.5％

蔗糖或乳糖            2.5％

其余为注射用水，pH为  6.8。

2、如权利要求1的制剂，其特征在于，所述BoNT是以100-400LD₅₀/ml范围浓度存在的A型BoNT。

3、如权利要求2所述的制剂，其特征在于，BoNT的浓度为240LD₅₀/ml。

4、权利要求1的制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)按配置量量取人血白蛋白；

b)按配置量称取乳糖和蔗糖，加入注射用水溶解后，调pH为6.8，121℃，20分钟高压灭菌；

c)将a与b混匀，然后加入A型BoNT稀释液，使其终浓度为100-400LD₅₀/ml，用0.22微孔滤膜过滤后，按照0.5/支分装于西林瓶中；

d)以蛋白质制品的冻干曲线对其进行冻干，冻干成品无菌、热原合格，水分含量不超过3％。