BRPI0613001A2 - composiÇÕes farmacÊuticas de toxina clostrÍdica estabilizada por uma nço-proteÍna - Google Patents

Abstract

Patente de Invenção: COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DE TOXINA CLOSTRÍDICA ESTABILIZADA POR UMA NçO-PROTEÍNA. A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica de toxina clostrídica compreendendo uma toxina clostrídica, tal como umatoxina botulínica, em que a toxina clostrídica presente na composição farmacêutica é estabilizada por um excipiente que não é de proteína, tal como uma polivinilpirrolidona, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um polissacarídeo, um álcool, um metal, um aminoácido, um tensoativo e/ou um polietileno glicol.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DE TOXINA CLOSTRÍDICA ESTABILIZADAPOR UMA NÃO-PROTEÍNA".

Referência Cruzada

Este pedido de patente é um pedido de patente de utilidade nãoprovisório, o qual reivindica a prioridade ao pedido de patente provisório re-lacionado número 60/725.125, depositado em 6 de outubro de 2005, o con-teúdo inteiro desse pedido de patente sendo incorporado nesse documentopor referência.

Antecedentes

A presente invenção refere-se às composições farmacêuticas detoxina clostrídica. Em particular, a presente invenção refere-se às composi-ções farmacêuticas de toxina clostrídica com um excipiente que não é umaproteína, que funciona para estabilizar a toxina clostrídica (tal como uma to-xina botulínica) presente na composição farmacêutica.

Uma composição farmacêutica é uma formulação que contémpelo menos um ingrediente ativo (tal como uma toxina clostrídica), bem co-mo, por exemplo, um ou mais excipientes, tampões, veículos, estabilizado-res, conservantes e/ou agentes de massa, e é adequada para a administra-ção a um paciente para obter um resultado diagnóstico ou efeito terapêuticodesejado. As composições farmacêuticas descritas nesse documento têmutilidade diagnostica, terapêutica e/ou de pesquisa.

Para a estabilidade na armazenagem e a conveniência de ma-nuseio, uma composição farmacêutica pode ser formulada como um pó Iiofi-Iizado (isto é, secado por congelamento) ou secado a vácuo, o qual pode serreconstituído com um fluido adequado, tal como solução salina ou água, an-tes da administração a um paciente. Alternativamente, a composição farma-cêutica pode ser formulada como uma solução ou suspensão aquosa. Umacomposição farmacêutica pode conter um ingrediente ativo proteináceo. Infe-lizmente, um ingrediente ativo protéico pode ser muito difícil de estabilizar(isto é, mantido em um estado onde a perda de atividade biológica seja mi-nimizada), resultando, portanto, em uma perda de proteína e/ou perda deatividade de proteína durante a formulação, a reconstituição (se requerida) edurante o período de armazenagem antes do uso de uma composição far-macêutica contendo proteína. Os problemas de estabilidade podem ocorrerpor causa da desnaturação, da degradação, da dimerização, e/ou da polime-rização da proteína. Diversos excipientes, tais como a albumina e a gelatina,têm sido usados, com diferentes graus de sucesso, para experimentar e es-tabilizar um ingrediente ativo protéico presente em uma composição farma-cêutica. Adicionalmente, os crioprotetores, tais como os álcoois, têm sidousados para reduzir a desnaturação da proteína sob as condições de conge-lamento da liofilização.

Excipientes Protéicos

Diversas proteínas, tais como a albumina e a gelatina, têm sidousadas para estabilizar uma toxina botulínica presente em uma composiçãofarmacêutica. As albuminas são proteínas plasmáticas pequenas, abundan-tes. A soro albumina humana tem um peso molecular de cerca de 69 quilo-Dáltons (kD) e tem sido usada como um ingrediente não ativo em uma com-posição farmacêutica, onde ela pode servir como um veículo de massa eestabilizador de certos ingredientes ativos protéicos presentes em uma com-posição farmacêutica.

A função de estabilização da albumina em uma composição far-macêutica pode estar presente tanto durante a formulação de múltiplas eta-pas da composição farmacêutica, quanto na reconstituição posterior dacomposição farmacêutica formulada. Assim, a estabilidade pode ser conferi-da pela albumina a um ingrediente ativo proteináceo em uma composiçãofarmacêutica através de, por exemplo, (1) redução da adesão (comumentereferida como "pegajosidade") dos ingredientes ativos protéicos às superfí-cies, tais como as superfícies de artigos de vidro de laboratórios, vasos, dofrasco pequeno no qual a composição farmacêutica é reconstituída e as su-perfícies de dentro de uma seringa usada para injetar a composição farma-cêutica. A adesão de um ingrediente ativo protéico às superfícies pode resul-tar em perda de ingrediente ativo e na desnaturação do ingrediente ativoprotéico retido restante, ambas as quais reduzem a atividade total do ingre-diente ativo presente na composição farmacêutica, e; (2) redução da desna-turação do ingrediente ativo, a qual pode ocorrer na preparação de uma so-lução de baixa diluição do ingrediente ativo.

Assim como é capaz de estabilizar um ingrediente ativo protéicoem uma composição farmacêutica, a soro albumina humana também tem avantagem da imunogenicidade geralmente insignificante quando injetada emum paciente humano. Um composto com uma imunogenicidade apreciávelpode causar a produção de anticorpos contra ele, o que pode resultar emuma reação anafilática e/ou no desenvolvimento de resistência ao fármaco,com a doença ou o distúrbio a ser tratado desse modo tornando-se potenci-almente resistente à composição farmacêutica que tem um componente i-munogênico.

A albumina recombinante foi proposta como um estabilizador emuma composição farmacêutica de toxina botulínica. Assim, o pedido de pa-tente U.S. publicado número 2003 0118598 (Hunt) descreve os usos de di-versos excipientes, tais como uma albumina recombinante, o colágeno ouum amido, para estabilizar uma toxina botulínica presente em uma composi-ção farmacêutica.

O colágeno é a proteína mais abundante nos mamíferos, com-preendendo cerca de um quarto de toda a proteína no corpo e é o constituin-te principal dos tecidos conjuntivos, tais como a pele, os Iigamentos e ostendões. O colágeno nativo é uma hélice tripla de três proteínas de altos pe-sos moleculares. Cada uma das três cadeias protéicas que compreendem ahélice do colágeno tem mais do que 1400 aminoácidos. Pelo menos vinte ecinco tipos distintos de colágenos foram identificados em seres humanos.

O colágeno tem sido usado cosmeticamente como um materialde enchimento para o tratamento de problemas de contorno da pele, taiscomo suavizar os sulcos da linha do sorriso e as linhas de franzimento, asdobras entre as sobrancelhas, as rugas nos cantos dos olhos e as rugas ver-ticais acima e abaixo dos lábios. O colágeno é também útil na suavização decertas cicatrizes traumáticas pós-cirúrgicas ou de acne e marcas de pústulasvirais, tais como as marcas de catapora. Para tais propósitos, o colágeno éinjetado na pele para elevar a pele.

A gelatina pode ser obtida pela hidrólise do colágeno. A gelatinatem sido usada em algumas composições farmacêuticas de ingredientesativos protéicos como um substituto da albumina. Notavelmente, a gelatina éuma proteína derivada de animal e, portanto, carrega o mesmo risco de infe-tuosidade potencial que pode ser possuída pela soro albumina humana.

A patente chinesa CN 1215084 discute uma toxina botulínica sem albuminatipo A, formulada com gelatina nativa (um hidrolisado de colágeno), uma pro-teína derivada de animal, dextrano e sacarose. A patente U. S. número6.087.327 também descreve uma composição de toxina botulínica tipos A eB formulada com gelatina nativa.

Infelizmente, apesar de seus efeitos estabilizadores conhecidos,existem desvantagens significativas para o uso de excipientes protéicos, taiscomo a albumina ou a gelatina, em uma composição farmacêutica. Porexemplo, a albumina e a gelatina são onerosas e cada vez mais difíceis deobter. Além disso, os produtos sangüíneos ou os produtos derivados de a-nimais, tais como a albumina e a gelatina, quando administrados a um paci-ente, podem submeter o paciente a um risco potencial de receber patógenoscontidos no sangue ou agentes infecciosos. Assim, sabe-se que existe apossibilidade que a presença de um excipiente protéico derivado de animalem uma composição farmacêutica possa resultar na incorporação descuida-da de elementos infecciosos na composição farmacêutica. Por exemplo, foidescrito que o uso de soro albumina humana pode transmitir priônios parauma composição farmacêutica. Um priônio é uma partícula infecciosa protei-nácea que é concluída por hipótese surgir como uma isoforma conformacio-nal anormal a partir da mesma seqüência de ácidos nucléicos que produz aproteína normal. Foi adicionalmente concluído por hipótese que a infectuosi-dade reside em uma "reação de recrutamento" da proteína de isoforma nor-mal com a isoforma de proteína de priônio em um nível pós-traducional. Apa-rentemente, a proteína celular endógena normal é induzida a uma duplica-ção incorreta em uma conformação de priônio patogênica.

Assim, é desejável encontrar um excipiente adequado que possaser usado para estabilizar a toxina botulínica presente em uma composiçãofarmacêutica de toxina botulínica. De preferência, o estabilizador de toxinabotulínica não é uma proteína derivada de uma fonte de animal (isto é, ma-mífero).

Toxina botulínica

O gênero Clostridium tem mais do que cento e vinte e sete es-pécies agrupadas por morfologia e função. A bactéria gram-positiva, anaeró-bica, Clostridium botulinum, produz uma neurotoxina polipeptídica potente, atoxina botulínica, que causa uma doença neuroparalítica em seres humanose animais, referida como botulismo. O Clostridium botulinum e os seus espo-ros são comumente encontrados no solo e a bactéria pode desenvolver-seem recipientes alimentícios inadequadamente esterilizados e vedados defábricas de enlatados de base doméstica, que são a causa de muitos doscasos de botulismo. Os efeitos do botulismo tipicamente aparecem 18 a 36horas após comer os gêneros alimentícios infectados com uma cultura deClostridium botulinum ou esporos. A toxina botulínica pode aparentementepassar não atenuada através do revestimento do intestino e atacar os neu-rônios motores periféricos. Os sintomas de intoxicação por toxina botulínicapodem progredir de dificuldade de andar, engolir, e falar até a paralisa dosmúsculos respiratórios e a morte.

A toxina botulínica tipo A é o agente biológico natural mais letalconhecido para o homem. Aproximadamente 50 picogramas de toxina botu-línica (complexo de neurotoxina purificado) tipo A são uma LD50 em camun-dongos. De modo interessante, em uma base molar, a toxina botulínica tipoA é 1,8 bilhão de vezes mais letal do que a difteria, 600 milhões de vezesmais letal do que o cianeto de sódio, 30 milhões de vezes mais letal do quea cobrotoxina e 12 milhões de vezes mais letal do que o cólera. Singh, Criti-cai Aspects ofBacterial Protein Toxins, páginas 63-84 (capítulo 4) de NaituralToxins II, editado por B.R. Singh et al., Plenum Press, Nova York (1976)(onde a LD50 estabelecida da toxina botulínica tipo A de 0,3 ng é igual a 1 Ué corrigida pelo fato de que cerca de 0,05 ng de BOTOX® é igual a 1 unida-de). Uma unidade (U) de toxina botulínica é definida como a LD50 com a in-jeção intraperitoneal em camundongos fêmeas Swiss Webster pesando 18-20 gramas, cada. Em outras palavras, uma unidade de toxina botulínica é aquantidade de toxina botulínica que mata 50% de um grupo de camundon-gos fêmeas Swiss Webster. Sete neurotoxinas botulínicas em geral imunolo-gicamente distintas foram caracterizadas, essas sendo respectivamente aneurotoxina botulínica sorotipos A, B, C-i, D, E, F, e G,cada uma das quais édistinguida por neutralização com anticorpos específicos para o tipo. Os dife-rentes sorotipos de toxina botulínica variam nas espécies de animais queeles afetam e na gravidade e na duração da paralisia que eles provocam.

Por exemplo, foi determinado que a toxina botulínica tipo A é 500 vezes maispotente, como medido pela taxa de paralisia produzida no rato, do que é atoxina botulínica tipo B. Adicionalmente, a toxina botulínica tipo B foi deter-minada ser não tóxica em primatas em uma dose de 480 U/kg, que é cercade 12 vezes a LD50 em primata para a toxina botulínica tipo A. As toxinasbotulínicas aparentemente ligam-se com alta afinidade aos neurônios moto-res colinérgicos, são translocadas no neurônio e bloqueiam a liberação pré-sináptica de acetilcolina.

As toxinas botulínicas têm sido usadas em indicações clínicaspara o tratamento de distúrbios neuromusculares caracterizados por múscu-los esqueléticos hiperativos. A toxina botulínica tipo A foi aprovada pela U.S.Food and Drug Administration, em 1989, para o tratamento de blefaroes-pasmo essencial, estrabismo e espasmo hemifacial em pacientes acima daidade de doze anos. Os efeitos clínicos da injeção periférica (isto é, intra-muscular ou subcutânea) da toxina botulínica tipo A são normalmente vistosdentro de uma semana da injeção, e freqüentemente dentro de algumas ho-ras após a injeção. A duração típica do alívio sintomático (isto é, paralisia domúsculo flácido) a partir de uma única injeção intramuscular de toxina botulí-nica pode ser cerca de três meses a cerca de seis meses.

Embora todos os sorotipos de toxinas botulínicas aparentementeinibam a liberação da acetilcolina neurotransmissora na junção neuromuscu-lar, eles assim o fazem afetando diferentes proteínas neurossecretoras e/ouclivando essas proteínas em diferentes locais. A toxina botulínica A é umazinco endopeptidase que pode hidrolisar especificamente uma ligação peptí-dica da proteína associada à vesícula, intracelular, SNAP-25. O tipo E botu-línico também cliva a proteína associada sinaptossômica de 25 quiloDáltons(kD) (SNAP-25), porém alveja diferentes seqüências de aminoácidos dentrodessa proteína, em comparação com a toxina botulínica tipo A. A toxina bo-tulínica tipos B, D, F e G atua sobre a proteína associada à vesícula (VAMP,também chamada sinaptobrevina), com cada sorotipo clivando a proteína emum local diferente. Finalmente, a toxina botulínica tipo Ci foi mostrada clivartanto a sintaxina quanto a SNAP-25. Essas diferenças no mecanismo deação podem afetar a potência relativa e/ou a duração de ação dos diversossorotipos de toxina botulínica.

Independente do sorotipo, o mecanismo molecular de intoxica-ção por toxina parece ser similar e envolver pelo menos três etapas ou está-gios. Na primeira etapa do processo, a toxina se liga à membrana pré-sináptica do neurônio-alvo através de uma interação específica entre a ca-deia pesada (cadeia H) e um receptor da superfície celular; o receptor é a-creditado ser diferente para cada sorotipo de toxina botulínica e para a toxi-na tetânica. O segmento de extremidade de carboxila da cadeia H, Hc, pare-ce ser importante para o alvejamento da toxina à superfície celular.

Na segunda etapa, a toxina cruza a membrana plasmática dacélula envenenada. A toxina é primeiramente engolida pela célula através daendocitose mediada por receptor, e um endossoma contendo a toxina é for-mado. A toxina então escapa do endossoma para o citoplasma da célula.Essa última etapa é acreditada ser mediada pelo segmento de extremidadede amino da cadeia Η, Hn, que desencadeia uma alteração conformacional datoxina em resposta a um pH de cerca de 5,5 ou menor. Os endossomas sãosabidos possuírem uma bomba de prótons que diminui o pH intra-endossômico. A mudança conformacional expõe os resíduos hidrofóbicós natoxina, o que permite que a toxina se incruste na membrana endossômica.A toxina então transloca-se através da membrana endossômica para o citos-sol.

A última etapa do mecanismo de atividade da toxina botulínicaparece envolver a redução da ligação de dissulfeto que une as cadeias H eL. A atividade tóxica inteira das toxinas botulínica e tetânica está contida nacadeia L da holotoxina; a cadeia L é uma zinco (Zn++) endopeptidase queseletivamente cliva as proteínas essenciais para o reconhecimento e o cortede vesículas contendo neurotransmissores com a superfície citoplásmica damembrana plasmática, e a fusão das vesículas com a membrana plasmática.A neurotoxina tetânica, a toxina botulínica B1 D, F, e G causam a degrada-ção da sinaptobrevina (também chamada proteína de membrana associadaà vesícula (VAMP)), uma proteína de membrana sinaptossômica. A maioriada VAMP presente na superfície citosólica da vesícula sináptica é removidacomo um resultado de qualquer um desses eventos de clivagem. Cada toxi-na cliva especificamente uma ligação diferente.

O peso molecular da molécula protéica de toxina botulínica, paratodos os sete dos sorotipos conhecidos de toxina botulínica, é aproximada-mente 150 kD. As toxinas botulínicas são liberadas pela bactéria clostrídicacomo complexos compreendendo a molécula protéica de toxina botulínica de150 kD, juntamente com proteínas associadas que não são toxinas. Assim, ocomplexo de toxina botulínica tipo A pode ser produzido pela bactéria clos-trídica como formas de 900 kD, 500 kD e 300 kD. Os tipos B e C1 de toxinabotulínica são aparentemente produzidos como somente um complexo de500 kD. O tipo D da toxina botulínica é produzido como complexos tanto de300 kD, quanto de 500 kD. Finalmente, os tipos E e F de toxina botulínicasão produzidos como somente complexos de aproximadamente 300 kD. Oscomplexos (isto é, peso molecular maior do que cerca de 150 kD) são acre-ditados conterem uma proteína de hemaglutinina que não é uma toxina euma proteína que não é de hemaglutinina que não é uma toxina e não é tó-xica. Essas duas proteínas que não são toxinas (as quais, juntamente com amolécula de toxina botulínica, podem compreender o complexo de neuroto-xina relevante) podem atuar para proporcionar estabilidade contra a desna-turação para a molécula de toxina botulínica e proteção contra os ácidos di-gestivos quando a toxina for ingerida. Adicionalmente, é possível que oscomplexos de toxina botulínica maiores (mais do que cerca de 150 kD depeso molecular) possam resultar em uma taxa mais lenta de difusão da toxi-na botulínica para longe de um local de injeção intramuscular de um comple-xo de toxina botulínica. Os complexos de toxina podem ser dissociados emproteína de toxina e proteínas de hemaglutinina por tratamento do complexocom as células sangüíneas vermelhas em pH 7,3. A proteína de toxina temuma instabilidade marcada com a remoção da proteína de hemaglutinina.

Todos os sorotipos de toxina botulínica são produzidos pelasbactérias Clostridium botulinum como proteínas inativas de cadeias individu-ais, as quais devem ser clivadas ou cortadas por proteases para tornarem-seneuroativas. As cepas bacterianas que produzem os sorotipos A e G de toxi-na botulínica possuem proteases endógenas e os sorotipos AeG podem,portanto, ser recuperados de culturas bacterianas predominantemente emsua forma ativa. Em contraste, os sorotipos C1, D, e E da toxina botulínicasão sintetizados por cepas não proteolíticas e estão, portanto, tipicamenteinativados quando recuperados da cultura. Os sorotipos BeF são produzi-dos por cepas proteolíticas e não proteolíticas e, portanto, podem ser recu-perados na forma ativa ou inativa. Entretanto, mesmo as cepas proteolíticasque produzem, por exemplo, o sorotipo de toxina botulínica tipo B somenteclivam uma porção da toxina produzida. A proporção exata de moléculascortadas ou não cortadas depende da duração da incubação e da tempera-tura da cultura. Portanto, certa porcentagem de qualquer preparação da, porexemplo, toxina botulínica tipo B é provável de ser inativa, possivelmentesendo responsável pela potência significativamente menor conhecida da to-xina botulínica tipo B em comparação com a toxina botulínica tipo A. A pre-sença de moléculas de toxina botulínica inativas em uma preparação clínicacontribuirá para a carga protéica global da preparação, que tenha sido ligadaá antigenicidade aumentada, sem contribuir para a sua eficácia clínica. Adi-cionalmente, sabe-se que a toxina botulínica tipo B tem, com a injeção in-tramuscular, uma duração mais curta de atividade e é também menos poten-te do que a toxina botulínica tipo A, no mesmo nível de dose.

Os estudos in vitro indicaram que a toxina botulínica inibe a libe-ração induzida pelo cátion potássio tanto da acetilcolina quanto da norepine-frina a partir de culturas de células primárias do tecido do tronco cerebral.Adicionalmente, foi descrito que a toxina botulínica inibe a liberação provo-cada tanto da glicina quanto do glutamato em culturas primárias de neurô-nios do cordão espinhal e que a toxina botulínica de preparações de sinap-tossoma do cérebro inibe a liberação de cada um dos neurotransmissoresacetilcolina, dopamina, norepinefrina, CGRP e glutamato.

A toxina botulínica tipo A cristalina, de alta qualidade, pode serproduzida a partir da cepa Hall A de Clostridium botulinum com característi-cas de £3 X 107 U/mg, um A26o/A278 de menos do que 0,60 e um padrão dis-tinto de banda sobre eletroforese em gel. O processo de Schantz conhecidopode ser usado para obter a toxina botulínica tipo A cristalina, como descritoem Schantz, E.J., et al., Properties and use of Botulinum toxin and OtherMi-crobial Neurotoxins in Medicine, Microbiol Rev. 56: 80-99 (1992). Geralmen-te, o complexo de toxina botulínica tipo A pode ser isolado e purificado deuma fermentação anaeróbica por cultivo de Ciostridium botulinum tipo A emum meio adequado. A toxina bruta pode ser coletada por precipitação comácido sulfúrico e concentrada por ultramicrofiltração. A purificação pode serrealizada por dissolução do precipitado ácido em cloreto de cálcio. A toxinapode então ser precipitada com etanol gelado. O precipitado pode ser dis-solvido em tampão de fosfato de sódio e centrifugado. Na secagem, podeentão ser obtido um complexo de toxina botulínica tipo A cristalino de apro-ximadamente 900 kD, com uma potência específica de 3 X 107 LD50 U/mg oumaior. Esse processo conhecido pode também ser usado, com a separaçãodas proteínas que não são toxinas, para obter toxinas botulínicas puras, taiscomo, por exemplo: a toxina botulínica tipo A purificada, com um peso mole-cular de aproximadamente 150 kD, com uma potência específica de 1-2 X108 LD50 U/mg ou mais; a toxina botulínica tipo B purificada, com um pesomolecular de aproximadamente 156 kD, com uma potência específica de 1-2X 108 LD5O U/mg ou maior, e; a toxina botulínica tipo F purificada, com umpeso molecular de aproximadamente 155 kD, com uma potência específicade 1 -2 X 107 LD50 U/mg ou maior.

As toxinas botulínicas e os complexos de toxinas podem ser ob-tidos a partir, por exemplo, da List Biological Laboratories, Inc., Campbell,Califórnia; do Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down,U.K.; Wako (Osaka, Japão), bem como da Sigma Chemicals de St Louis,Missouri. As composições farmacêuticas contendo a toxina botulínica co-mercialmente disponíveis incluem o BOTOX® (complexo de neurotoxina detoxina botulínica tipo A com soro albumina humana e cloreto de sódio), dis-ponível da Allergan, Inc., de Irvine1 Califórnia, em frascos pequenos de 100unidades, como um pó Iiofilizado a ser reconstituído com cloreto de sódio a0,9% antes do uso), o Dysport® (complexo de toxina de Clostridium botuli-num tipo A hemaglutinina, com soro albumina humana e Iactose na formula-ção), disponível da Ipsen Limited, Berkshire, U.K., como um pó a ser recons-tituído com cloreto de sódio a 0,9% antes do uso), e o MyoBloc® (uma solu-ção injetável compreendendo a toxina botulínica tipo B, a soro albumina hu-mana, o succinato de sódio, e o cloreto de sódio em torno de pH 5,6, dispo-nível da Solstice Neurosciences, Inc., South San Francisco, Califórnia).

O sucesso da toxina botulínica tipo A em tratar uma variedadede condições clínicas resultou no interesse em outros sorotipos de toxinabotulínica. Adicionalmente, a toxina botulínica pura tem sido usada para tra-tar seres humanos. Vide, por exemplo, Kohl A., et al., Comparison of the ef-fect of botulinum toxin A (Botox (R)) with the highly-purified neurotoxin (NT201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000; 15 (Supl.3): 165. Portanto, uma composição farmacêutica pode ser preparada usandouma toxina botulínica pura.

Sabe-se que a toxina botulínica tipo A é solúvel em soluçõesaquosas diluídas em pH 4-6,8. Em pH acima de cerca de 7, as proteínas nãotóxicas estabilizadoras dissociam-se da neurotoxina, resultando em umaperda gradual de toxicidade, particularmente à medida que o pH e a tempe-ratura elevam -se. Schantz E.J., et al., Preparation and characterization ofbotulinum toxin type A for human treatment(em particular as páginas 44-45),sendo o capítulo 3 de Jankovic, J., et al., Therapy with Botulinum Toxin.Mareei Dekker, Inc (1994).

A patente européia EP1112082 ("Stable liquid formulations ofbotulinum toxin"), expedida em 31 de julho de 2002, reivindica uma formula-ção farmacêutica líquida estável de toxina botulínica compreendendo umtampão (pH 5-6) e uma toxina botulínica, onde a formulação de toxina é es-tável como um líquido por pelo menos um ano em temperaturas entre0-10°C ou pelo menos 6 meses em temperaturas entre 10 e 30°C. Tal for-mulação farmacêutica de toxina botulínica (uma sua modalidade sendo ven-dida comercialmente sob a marca de fábrica MyoBloc® ou NeuroBloc® pelaSolstice Neurosciences, Inc., de San Diego, Califórnia) é preparada comouma solução líquida (nenhuma liofilização ou secagem a vácuo é efetuada),a qual não requer reconstituição antes do uso.

A patente U.S. 5.512.547 (Johnson et al.), intitulada "Pharma-ceutical Composition of Botulinum Neurotoxin and Method of Preparation",expedida em 30 de abril de 1996, reivindica uma formulação botulínica tipo Apura compreendendo albumina e trealose, estável na armazenagem a 37°C.

A patente U.S. 5.756.468 (Johnson et al.), expedida em 26 demaio de 1998 ("Pharmaceutical Compositions of Botulinum Toxin or Botuli-num Neurotoxin and Method of Preparation"), reivindica uma formulação detoxina botulínica Iiofilizada compreendendo uma tioalquila, albumina e trea-lose, que pode ser armazenada entre 25°C e 42°C.

A patente U.S. 5.696.077 (Johnson et al.), intitulada "Pharma-ceutical Composition Containing Botulinum B Complex", expedida em 9 dedezembro de 1997, reivindica uma formação de complexo botulínico tipo Bsem cloreto de sódio, liofilizado, compreendendo um complexo de tipo B eum excipiente protéico.

Goodnough M.C., et al., Stabilization of botulinum toxin type Aduring lyophilization, Appl Environ Microbiol 1992; 58(10):3426-3428, e;Goodnouth M.C., et al., Recovery of type-A botulinal toxin following lyophili-zation, Acs Symposium Series 1994;567(-): 193-203, descrevem.

O pedido de patente chinês CN 1215084A discute uma toxinabotulínica tipo A sem albumina, formulada com gelatina, uma proteína deri-vada de animal. A patente U. S. número 6.087.327 também descreve umacomposição de toxina botulínica tipos AeB formulada com gelatina. Essasformulações, portanto, não eliminam o risco de transmitir um elemento infec-cioso derivado de, ou que acompanha, uma proteína animal.

Foi descrito que a BoNt/A tem sido usada em diversas indica-ções clínicas, incluindo como a seguir:

(1) cerca de 75-125 unidades de BOTOX®1 por injeção intramus-cular (múltiplos músculos) para tratar a distonia cervical;

(2) 5-10 unidades de BOTOX® por injeção intramuscular paratratar linhas da glabela (sulcos do supercílio) (5 unidades injetadas intramus-cularmente no músculo prócero e 10 unidades injetadas intramuscularmenteem cada músculo corrugador do supercílio);

(3) cerca de 30-80 unidades de BOTOX® para tratar constipaçãopor injeção intra-esfíncter do músculo puborretal;

(4) cerca de 1-5 unidades por músculo de BOTOX® injetado in-tramuscularmente, para tratar blefaroespasmo, por injeção do músculo orbi-cular pré-társico lateral do olho da pálpebra superior e o orbicular pré-társicolateral do olho da pálpebra inferior.

(5) para tratar estrabismo, os músculos extra-oculares têm sidoinjetados intramuscularmente com entre cerca de 1-5 unidades de BOTOX®,a quantidade injetada variando com base tanto no tamanho do músculo a serinjetado, quanto no grau de paralisia muscular desejada (isto é, a quantidadede correção da dioptria desejada).

(6) para tratar espasticidade do membro superior após acidentevascular cerebral, por injeções intramusculares de BOTOX® nos cinco dife-rentes músculos flexores dos membros superiores, como se segue:

(a) flexor profundo dos dedos: 7.5 U a 30 U

(b) flexor superficial dos dedos: 7,5 U a 30 U

(c) flexor ulnar do punho: 10 U a 40 U

(d) flexor radial do punho: 15 U a 60 U

(e) bíceps do braço: 50 U a 200 U. Cada um dos cinco músculosindicados foi injetado na mesma sessão de tratamento, de modo que opaciente receba de 90 U a 360 U de BOTOX® nos músculos flexores dos

1 Disponível da Allergan, Inc, de Irvine, Califórnia, sob o nome comercial BOTOX®.membros superiores por injeção intramuscular em cada sessão de tratamento.

(7) para tratar enxaqueca, uma injeção injetada pericranial (inje-tada simetricamente nos músculos da glabela, frontal e temporal) de 25 U deBOTOX® mostrou benefício significativo como um tratamento profilático deenxaqueca, comparado ao veículo, conforme medido pelos graus diminuídosde freqüência da enxaqueca, gravidade máxima, vômito associado e uso agu-do de medicação, durante o período de três meses após a injeção de 25 U.

Sabe-se que a toxina botulínica tipo A pode ter uma eficácia poraté 12 meses (European J. Neurology 6 (Sup. 4):S111-S1150:1999), e, emalgumas circunstâncias, por tanto quanto 27 meses. The Laryngoscope109:1344-1346:1999. Entretanto, a duração comum de uma injeção intra-muscular de Botox® é tipicamente cerca de 3 a 4 meses.

O sucesso da toxina botulínica tipo A em tratar uma variedadede condições clínicas resultou no interesse em outros sorotipos de toxinabotulínica. Adicionalmente, a toxina botulínica pura tem sido usada em sereshumanos. Vide, por exemplo, Kohl A., et al., Comparison of the effect of bo-tulinum toxin A (Botox (R)) with the highly-purified neurotoxin (NT 201) in theextensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000; 15 (Supl. 3): 165.Portanto, uma composição farmacêutica pode ser preparada usando umatoxina botulínica pura.

A molécula de toxina botulínica (cerca de 150 kDa), bem comoos complexos de toxina botulínica (cerca de 300-900 kDa), tais como o com-plexo de toxina tipo A, são também extremamente suscetíveis à desnatura-ção devido à desnaturação da superfície, calor, e condições alcalinas. A to-xina inativada forma proteínas toxóides, as quais podem ser imunogênicas.Os anticorpos resultantes podem tornar um paciente resistente à injeção detoxina.

Como com as enzimas em geral, as atividades biológicas dastoxinas botulínicas (que são peptidases intracelulares) são dependentes,pelo menos em parte, de sua conformação tridimensional. Assim, a toxinabotulínica tipo A é destoxificada por calor, diversas substâncias químicasque estendem a superfície e secam a superfície. Adicionalmente, sabe-seque a diluição do complexo de toxina obtido pelo cultivo, pela fermentação epela purificação conhecidos até concentrações de toxina muito, muito meno-res, usadas para a formulação da composição farmacêutica, resulta na des-toxificação rápida da toxina, a não ser que um agente estabilizador adequa-do esteja presente. A diluição da toxina a partir de quantidades de miligra-mas até uma solução contendo nanogramas por mililitro apresenta dificulda-des significativas por causa da rápida perda de toxicidade específica em talgrande diluição. Visto que a toxina pode ser usada meses ou anos após acomposição farmacêutica contendo toxina ser formulada, a toxina deve serestabilizada com um agente estabilizador. Até o momento, o único agenteestabilizador bem-sucedido para esse propósito tem sido as proteínas deri-vadas de animais, soro albumina humana e gelatina.

Uma composição farmacêutica contendo toxina botulínica co-mercialmente disponível é vendida sob a marca comercial BOTOX® (dispo-nível da Allergan, Inc., de Irvine, Califórnia). O BOTOX® consiste em umcomplexo de toxina botulínica tipo A purificado, soro albumina humana, ecloreto de sódio, acondicionados na forma secada a vácuo, estéril. A toxinabotulínica tipo A é feita a partir de uma cultura da cepa Hall de Clostridiumbotulinum, desenvolvida em um meio contendo N-Z amina e extrato de Ieve-dura. O complexo de toxina botulínica tipo A é purificado da solução de cul-tura por uma série de precipitações ácidas até um complexo cristalino con-sistindo na proteína de toxina de alto peso molecular ativa e uma proteína dehemaglutinina associada. O complexo cristalino é dissolvido novamente emuma solução contendo salina e albumina e filtrado estéril (0,2 mícron) antesda secagem a vácuo. O BOTOX® pode ser reconstituído com solução salinanão conservada, estéril, antes da injeção intramuscular. Cada frasco peque-no de BOTOX® contém cerca de 100 unidades (U) de complexo de toxinatipo A de Clostridium botulinum, 0,5 miligrama de soro albumina humana e0,9 miligrama de cloreto de sódio em uma forma secada à vácuo, estéril,sem um conservante.

Para reconstituir o BOTOX® seco a vácuo, a solução salina nor-mal estéril, sem um conservante (injeção de Cloreto de Sódio a 0,9%), éusada por preparação da quantidade adequada de diluente na seringa detamanho apropriado. Visto que o BOTOX® é desnaturado por borbulhamentoou agitação violenta similar, o diluente é suavemente injetado no frasco pe-queno. Por razões de esterilidade, o BOTOX® deve ser administrado dentrode quatro horas após a reconstituição. Durante esse período de tempo, oBOTOX® reconstituído é armazenado em um refrigerador (2o a 8°C). O BO-TOX® reconstituído é claro, incolor e isento de matéria particulada. O produ-to secado a vácuo é armazenado em um freezer a, ou abaixo de, -5°C.

Foi descrito que uma alternativa adequada para a soro albuminahumana como um estabilizador de toxina botulínica pode ser uma outra pro-teína ou, alternativamente, um composto de baixo peso molecular (que nãoseja uma proteína). Carpender et al., Interactions of Stabilizing Additives withProteins During Freeze-Thawing and Freeze-Drying, International Symposi-um on Biological Product Freeze-Drying and Formulation, 24-26 de outubrode 1990; Karger (1992), 225-239.

Muitas substâncias comumente usadas como veículos e agentesde massa nas composições farmacêuticas provaram ser inadequadas, comoexcipientes que não sejam de proteínas, para estabilizar a toxina botulínicapresente em uma composição farmacêutica. Por exemplo, o dissacarídeocelobiose foi verificado ser inadequado como um estabilizador de toxina bo-tulínica. Assim, sabe-se que o uso de celobiose como um excipiente, emconjunção com a albumina e o cloreto de sódio, resulta em um nível muitomenor de toxicidade (10% de recuperação) após a liofilização da toxina botu-línica tipo A cristalina com esses excipientes, em comparação com a toxici-dade após a liofilização com somente a soro albumina humana (>75% a>90% de recuperação). Goodnough et al., Stabilization of Botulinum ToxinType A During Lyophilization, App & Envir. Micro. 58 (10) 3426-3428 (1992).

Além disso, os sacarídeos, incluindo os polissacarídeos, são, emgeral, candidatos insatisfatórios para servir como estabilizadores de proteí-nas. Assim, sabe-se que uma composição farmacêutica contendo um ingre-diente ativo de proteína é inerentemente instável se a formulação de proteí-na compreender um sacarídeo (tal como a glicose ou um polímero de glico-se) ou carboidratos, porque as proteínas e a glicose são sabidas interagiremconjuntamente e sofrerem a reação de Maillard bem descrita, devido à natu-reza redutora da glicose e dos polímeros de glicose. Muito trabalho tem sidodedicado a tentativas, na maioria das vezes mal-sucedidas, na prevençãodessa reação entre proteína-sacarídeo através de, por exemplo, redução daumidade ou uso de açúcares não redutores. De modo significativo, a via dedegradação da reação de Maillard pode resultar em uma insuficiência tera-pêutica do ingrediente ativo protéico. Uma formulação farmacêutica compre-endendo proteína e um sacarídeo, carboidrato ou açúcar redutor, tal comoum polímero de glicose, é, portanto, inerentemente instável e não pode serarmazenada por um período de tempo longo, sem perda significativa da ati-vidade biológica desejada da proteína ingrediente ativo.

Os polissacarídeos de altos pesos moleculares (amidos) particu-lares, tais como o hetaamido, têm sido propostos como estabilizadores datoxina botulínica presente em uma composição farmacêutica de toxina botu-línica. Vide, por exemplo, a patente européia EP 1 253 932, expedida em 27de abril de 2005.

Notavelmente, uma das razões que a albumina ou a gelatinapode funcionar efetivamente como um estabilizador de um ingrediente ativoprotéico, em uma composição farmacêutica, é porque, sendo proteínas, es-ses estabilizadores não sofrem a reação de Maillard com o ingrediente ativoprotéico em uma composição farmacêutica. Portanto, esperar-se-ia encon-trar e procurar um substituto para esses excipientes protéicos usados paraestabilizar a toxina botulínica presente em uma composição farmacêutica detoxina botulínica entre outras proteínas.

As características únicas da toxina botulínica e a sua formulaçãoem uma composição farmacêutica adequada obrigam e atrapalham e tornamproblemática a busca por uma substituição por um estabilizador protéico emuma formulação farmacêutica contendo toxina botulínica. Seguem exemplosde quatro dessas características únicas.

Primeiramente, a toxina botulínica é uma proteína relativamentegrande para a incorporação em uma formulação farmacêutica (o peso mole-cular do complexo de toxina botulínica tipo A é 900 kD) e é, portanto, ineren-temente frágil e instável. O tamanho do complexo de toxina a torna muitomais friável e instável do que as proteínas menos complexas, menores, des-se modo a mistura da formulação e as dificuldades de manuseio, se a esta-bilidade da toxina for para ser mantida. Portanto, um estabilizador de toxinabotulínica deve ser capaz de interagir com a toxina em um modo que nãodesnature, fragmente ou, de outro modo, destoxifique a molécula de toxinaou cause dissociação das proteínas que não sejam toxinas presentes nocomplexo de toxina.

Em segundo lugar, como o produto biológico conhecido maisletal, uma segurança, uma precisão, e uma exatidão excepcionais são re-queridas em todas as etapas da formulação de uma composição farmacêuti-ca contendo toxina botulínica. Assim, um estabilizador de toxina botulínicanão deve, ele próprio, ser tóxico ou difícil de manusear, de modo a não exa-cerbar as exigências já extremamente severas da formulação de composi-ção farmacêutica contendo toxina botulínica.

Em terceiro lugar, visto que a toxina botulínica foi a primeira to-xina microbiana a ser aprovada (pela FDA em 1989) para injeção para o tra-tamento de doença humana, protocolos específicos têm de ser desenvolvi-dos e aprovados para o cultivo, a produção em massa, a formulação emuma substância farmacêutica e o uso da toxina botulínica. As consideraçõesimportantes são a pureza da toxina e a dose para a injeção. A produção porcultivo e a purificação devem ser realizadas de modo que a toxina não sejaexposta a qualquer substância que poderia contaminar o produto final, emquantidades mesmo mínimas, e causar reações indevidas no paciente. Es-sas restrições requerem cultivo em meio simplificado, sem o uso de produtosde carne animal, e purificação por procedimentos que não envolvam solven-tes ou resinas sintéticas. A preparação da toxina usando enzimas, diversostrocadores, tais como aqueles presentes em colunas de cromatografia, esolventes sintéticos pode introduzir contaminantes e está, portanto, excluídadas etapas preferidas de formulação. Além disso, a toxina botulínica tipo A érapidamente desnaturada em temperaturas acima de 40°C, perde a toxicida-de quando bolhas se formam na interface ar/líquido, e desnatura na presen-ça de nitrogênio ou dióxido de carbono.

Em quarto lugar, existem dificuldades particulares de estabilizara toxina botulínica tipo A, porque o tipo A consiste em uma molécula de toxi-na de aproximadamente 150 kD em associação não covalente com as prote-ínas que não são toxinas pesando cerca de 750 kD. As proteínas que nãosão toxinas são acreditadas conservar ou auxiliar a estabilizar as estruturassecundárias e terciárias das quais a toxicidade é dependente. Os procedi-mentos ou os protocolos aplicáveis à estabilização com não-proteínas ou àsproteínas relativamente menores não são aplicáveis aos problemas ineren-tes com a estabilização dos complexos de toxina botulínica, tais como ocomplexo de toxina botulínica tipo A de 900 kD. Assim, embora a partir dopH 3,5 até 6,8 a toxina tipo A e as proteínas que não são toxinas sejam liga-das conjuntamente, de modo não covalente, sob condições ligeiramente al-calinas (pH > 7,1), a toxina muito instável é liberada do complexo de toxina.Conforme estabelecido anteriormente, a toxina botulínica pura (isto é, a mo-lécula de 150 kD) foi proposta como o ingrediente ativo em uma composiçãofarmacêutica.

Levando em consideração a natureza única da toxina botulínicae as exigências apresentadas acima, a probabilidade de encontrar um esta-bilizador que não seja protéico, adequado, para os estabilizadores de proteí-nas usados nas composições farmacêuticas contendo toxina botulínica deverealisticamente ser vista aproximar-se de zero. Antes da presente invenção,somente as proteínas derivadas de animais, a soro albumina humana e a ge-latina, eram sabidas terem utilidade como estabilizadores adequados da toxi-na botulínica presente em uma formulação farmacêutica. Assim, sabe-se quea albumina, sozinha ou com uma ou mais substâncias adicionais, tais como ofosfato de sódio ou o citrato de sódio, permite alta recuperação de toxicidadeda toxina botulínica tipo A após a liofilização. Infelizmente, como já descrito, asoro albumina humana, como um produto sangüíneo reunido, pode, pelo me-nos potencialmente, carregar elementos infecciosos ou que causam doenças,quando presente em uma composição farmacêutica. De fato, qualquer produ-to ou proteína animal, tal como a soro albumina humana ou a gelatina, podetambém potencialmente conter pirogênios ou outras substâncias que podemcausar reações adversas na injeção em um paciente.

O que é necessário, portanto, é uma composição farmacêuticade toxina clostrídica, onde a toxina clostrídica (tal como uma toxina botulíni-ca) é estabilizada por um excipiente que não seja uma proteína.

Sumário

A presente invenção atende essa necessidade e proporcionauma composição farmacêutica de toxina botulínica que é estabilizada por umexcipiente que não é uma proteína.

Definições

Conforme usadas nesse documento, as palavras ou os termosapresentados abaixo têm as definições a seguir.

"Cerca de" significa que o item, parâmetro ou termo assim quali-ficado inclui uma faixa de mais ou menos dez por cento acima e abaixo dovalor do item, parâmetro ou termo estabelecido.

A "administração" ou "administrar" significa a etapa de dar (istoé, administrar) uma composição farmacêutica a um paciente. As composi-ções farmacêuticas descritas nesse documento são "administradas Iocal-mente" através de, por exemplo, administração intramuscular (i.m.), intra-dérmica, subcutânea, administração intratecal, administração intraperitoneal(i.p.), rotas de administração tópicas (transdérmicas) e por implantação (istoé, de um dispositivo de liberação lenta, tal como um implante polimérico oubomba miniosmótica).

"Sem proteína animal" significa a ausência de produtos ou com-postos derivados do sangue, reunidos no sangue e outros produtos ou com-postos derivados de animais. O "animal" significa um mamífero (tal como umser humano), ave, réptil, peixe, inseto, aranha ou outra espécie animal. O"animal" exclui os microorganismos, tais como as bactérias. Assim, umacomposição farmacêutica sem proteína animal, dentro do escopo dA inven-ção, pode incluir uma neurotoxina clostrídica. Por exemplo, uma composiçãofarmacêutica sem proteína animal significa uma composição farmacêuticaque está substancialmente livre, ou essencialmente livre, ou inteiramentelivre, de uma albumina derivada do soro, gelatina e outras proteínas deriva-das de animais, tais como as imunoglobulinas. Um exemplo de uma compo-sição farmacêutica sem proteína animal é uma composição farmacêuticaque compreende, ou a qual consiste em, uma toxina botulínica (como o in-grediente ativo) e um polissacarídeo adequado como um estabilizador ouexcipiente.

A "toxina botulínica" significa uma neurotoxina produzida porClostridium botulinum, bem como uma toxina botulínica (ou a cadeia leve oua cadeia pesada da mesma) feita de modo recombinante por uma espécienão clostrídica. A expressão "toxina botulínica", como usada nesse docu-mento, inclui os sorotipos de toxina botulínica A, B, C, D, E, F e G. A toxinabotulínica, como usada nesse documento, também inclui tanto um complexode toxina botulínica (isto é, os complexos de 300, 600 e 900 kDa), quanto atoxina botulínica purificada (isto é, cerca de 150 kDa). A "toxina botulínicapurificada" é definida como uma toxina botulínica que é isolada, ou substan-cialmente isolada, das outras proteínas, incluindo as proteínas que formamum complexo de toxina botulínica. Uma toxina botulínica purificada pode sermais do que 95% pura, e preferivelmente é mais do que 99% pura. As cito-toxinas botulínicas C2 e C3, não sendo neurotoxinas, estão excluídas do es-copo da presente invenção.

A "neurotoxina clostrídica" significa uma neurotoxina produzida apartir de, ou nativa a, uma bactéria clostrídica, tal como o Clostridium botuli-num, o Clostridium butyricum ou o Clostridium beratti, bem como uma neuro-toxina clostrídica feita de modo recombinante por uma espécie não clostrídica.

"Inteiramente livre" (isto é, a terminologia "consistindo em") signi-fica que, dentro da faixa de detecção do instrumento ou do processo queestá sendo usado, a substância não pode ser detectada ou a sua presençanão pode ser confirmada.

"Essencialmente livre" (ou "consistindo essencialmente em") sig-nifica que somente quantidades mínimas da substância podem ser detectadas.Uma "toxina botulínica modificada" significa uma toxina botulíni-ca que tenha tido pelo menos um de seus aminoácidos removido, modifica-do, ou substituído, em comparação com uma toxina botulínica nativa. Adi-cionalmente, a toxina botulínica modificada pode ser uma neurotoxina pro-duzida de modo recombinante, ou um derivado ou fragmento de uma neuro-toxina preparada de modo recombinante. Uma toxina botulínica modificadaconserva pelo menos uma atividade biológica da toxina botulínica nativa, talcomo, a capacidade de ligar-se a um receptor de toxina botulínica, ou a ca-pacidade de inibir a liberação do neurotransmissor a partir de um neurônio.

Um exemplo de uma toxina botulínica modificada é uma toxina botulínicaque tenha uma cadeia leve a partir de um sorotipo de toxina botulínica (talcomo o sorotipo A), e uma cadeia pesada a partir de um sorotipo diferentede toxina botulínica (tal como o sorotipo B). Um outro exemplo de uma toxinabotulínica modificada é uma toxina botulínica acoplada a um neurotransmis-sor, tal como a substância P.

A "composição farmacêutica" significa uma formulação na qualum ingrediente ativo pode ser uma neurotoxina clostrídica, tal como umatoxina botulínica. A palavra "formulação" significa que há pelo menos umingrediente adicional na composição farmacêutica, além de um ingredienteativo de neurotoxina clostrídica. Uma composição farmacêutica é, portanto,uma formulação que é adequada para a administração diagnostica ou tera-pêutica (isto é, por injeção intramuscular ou subcutânea ou por inserção deum depósito ou implante) a um paciente, tal como um paciente humano. Acomposição farmacêutica pode estar: em uma condição Iiofilizada ou secadaa vácuo; uma solução formada após a reconstituição da composição farma-cêutica Iiofilizada ou secada a vácuo com solução salina ou água, ou: comouma solução que não requer reconstituição. O ingrediente ativo de neuroto-xina pode ser um dos sorotipos da toxina botulínica A, B, Ci, D, E, F ou G ouuma toxina tetânica, todos os quais podem ser feitos nativamente pelas bac-térias clostrídicas. Conforme estabelecido, uma composição farmacêuticapode ser líquida ou sólida, por exemplo, secada a vácuo. Os ingredientesconstituintes de uma composição farmacêutica podem ser incluídos em umaúnica composição (ou seja, todos os ingredientes constituintes, exceto porqualquer fluido de reconstituição requerido, estão presentes na hora dacombinação inicial da composição farmacêutica) ou como um sistema dedois componentes, por exemplo, uma composição secada a vácuo, reconsti-tuída com um diluente, tal como solução salina, diluente este que contém umingrediente não presente na combinação inicial da composição farmacêutica.

Um sistema de dois componentes proporciona o benefício de permitir a in-corporação de ingredientes que não sejam suficientemente compatíveis, du-rante a armazenagem em prateleira de longa duração, com o primeiro com-ponente do sistema de dois componentes. Por exemplo, o veículo ou o dilu-ente de reconstituição pode incluir um conservante que proporcione proteçãoadequada contra o crescimento microbiano durante o período de uso, porexemplo, uma semana de armazenagem refrigerada, porém não esteja pre-sente durante o período de armazenagem em freezer por dois anos, durantecujo tempo ele poderia degradar a toxina. Outros ingredientes, os quais po-dem não ser compatíveis com uma toxina clostrídica ou com outros ingredi-entes por períodos longos de tempo, podem ser incorporados nessa manei-ra; ou seja, adicionados em um segundo veículo (isto é, o fluido de reconsti-

O "estabilizador" (ou "estabilizador primário") é um agente quí-mico que auxilia a conservar ou manter a estrutura biológica (isto é, a con-formação tridimensional) e/ou a atividade biológica de uma proteína (tal co-mo uma neurotoxina clostrídica, tal como uma toxina botulínica). Os estabili-zadores usados nesse documento não são proteínas. O estabilizador primá-rio pode ser um agente sintético que não produziria uma resposta imunogê-nica (ou produz uma resposta imune atenuada) em um paciente que rece-besse uma composição contendo o estabilizador primário. Estabilizadoresadicionais podem também ser incluídos em uma composição farmacêutica.

Esses estabilizadores adicionais ou secundários podem ser usados sozinhosou em combinação com os estabilizadores primários. Os estabilizadores se-cundários ilustrativos incluem, porém não estão limitados aos derivados deaminoácidos não oxidantes (tais como um derivado de triptofano, tal como oN-acetil-triptofano ("NAT")), caprilato (isto é, o caprilato de sódio), um polis-sorbato (isto é, o P80), aminoácidos, e cátions de metais divalentes, tais co-mo o zinco. Uma composição farmacêutica pode também incluir agentesconservantes, tais como o álcool benzílico, o ácido benzóico, o fenol, os pa-rabenos e o ácido sórbico.

"Estabilizando", "estabiliza" ou "estabilização" significa que umingrediente ativo farmacêutico ("PAI") conserva pelo menos 20% e até 100%de sua atividade biológica (que pode ser avaliada como potência ou comotoxicidade por uma medida de LD50 ou ED50 in vivo), na presença de umcomposto que está estabilizando, estabiliza ou que proporciona estabilizaçãoao PAI. Por exemplo, na (1) preparação de diluições em série a partir deuma solução em massa ou de estoque, ou (2) na reconstituição com soluçãosalina ou água de uma composição farmacêutica contendo toxina botulínicaliofilizada, ou secada a vácuo, que tenha sido armazenada em, ou abaixo de,cerca de -2°C, por entre seis meses e quatro anos, ou (3) para uma compo-sição farmacêutica contendo toxina botulínica em solução aquosa que tenhasido armazenada entre cerca de 2o e cerca de 8°C, por de seis meses atéquatro anos, a toxina botulínica presente na composição farmacêutica re-constituída ou em solução aquosa tem (na presença de um composto queesteja estabilizando, estabilize ou que proporcione estabilização ao PAI)mais do que cerca de 20% e até cerca de 100% da potência ou da toxicida-de que a toxina botulínica biologicamente ativa tinha antes de ser incorpora-da na composição farmacêutica.

"Substancialmente livre" significa presente em um nível de me-nos do que um por cento em peso da composição farmacêutica.

Uma "formulação terapêutica" significa uma formulação que po-de ser usada para tratar e, desse modo, aliviar um distúrbio ou uma doença,tal como um distúrbio ou uma doença caracterizada por hiperatividade (istoé, espasticidade) de um músculo periférico.

A toxina botulínica pode estar presente como um complexo detoxina botulínica (isto é, como um complexo de aproximadamente 300 a cer-ca de 900 quiloDáltons, dependendo do sorotipo particular da toxina botulíni-ca) ou a toxina botulínica pode estar presente como uma toxina botulínicapura ou purificada (isto é, como a molécula de toxina botulínica de cerca de150 quiloDáltons).

As composições farmacêuticas descritas nesse documento po-dem ter um pH de entre cerca de 5 e 7,3, quando reconstituídas ou na injeção.

A invenção pode ser praticada utilizando uma composição quecompreende uma toxina botulínica tipo A. Em outras modalidades da inven-ção, os métodos precedentes podem ser praticados com uma composiçãoque compreende a toxina botulínica tipo B. Nas modalidades adicionais dainvenção, os métodos podem ser praticados com uma composição quecompreende uma pluralidade de sorotipos da toxina botulínica, tais como ossorotipos da toxina botulínica selecionados a partir do grupo que consistenos sorotipos da toxina botulínica A, B, C1, D, E, F e G. Em certas modalida-des da invenção, as toxinas botulínicas purificadas podem ser usadas. Emoutras modalidades, as toxinas botulínicas modificadas podem ser usadas.

Nas modalidades ainda adicionais da invenção, as composiçõesusadas nos métodos precedentes podem ser administradas intramuscular-mente ao paciente. Nas outras modalidades, as composições podem seradministradas de modo subcutâneo e/ou intratecal.

A invenção inclui uma composição farmacêutica compreendendo(ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulíni-ca e uma polivinilpirrolidona. A toxina botulínica é uma toxina botulínica bio-Iogicamente ativa e a toxina botulínica é selecionada a partir do grupo queconsiste nas toxinas botulínicas tipos A, B, C, D, E, F e G. De preferência, atoxina botulínica é uma toxina botulínica tipo A. Uma função da polivinilpirro-lidona presente na composição farmacêutica é estabilizar a toxina botulínica.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) umatoxina botulínica, e entre cerca de 5 gramas e cerca de 20 gramas de umapolivinilpirrolidona para cada cerca de 100 unidades da toxina botulínica.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) umatoxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipi-ente protéico, e uma polivinilpirrolidona, onde a potência da toxina botulínicaé pelo menos cerca de 40% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) umatoxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipi-ente protéico, e uma polivinilpirrolidona, onde a potência da toxina botulínicaé pelo menos cerca de 50% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) umatoxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipi-ente protéico, uma polivinilpirrolidona, e um dissacarídeo, onde a potênciada toxina botulínica é pelo menos cerca de 40% da potência máxima teóricada toxina botulínica.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) umatoxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipi-ente protéico, uma polivinilpirrolidona, e um dissacarídeo, onde a potênciada toxina botulínica é pelo menos cerca de 50% da potência máxima teóricada toxina botulínica.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) umatoxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipi-ente protéico, uma polivinilpirrolidona, e um dissacarídeo, onde a potênciada toxina botulínica é pelo menos cerca de 60% da potência máxima teóricada toxina botulínica.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) umatoxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipi-ente protéico, uma polivinilpirrolidona, e um dissacarídeo, onde a potênciada toxina botulínica é pelo menos cerca de 70% da potência máxima teóricada toxina botulínica.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) umatoxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipi-ente protéico, uma polivinilpirrolidona, e um polietileno glicol, onde a potên-cia da toxina botulínica é pelo menos cerca de 40% da potência máxima teó-rica da toxina botulínica.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) umatoxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipi-ente protéico, um composto selecionado a partir do grupo que consiste emum primeiro monossacarídeo, um primeiro dissacarídeo, um primeiro trissa-carídeo, e um primeiro álcool feito por redução do primeiro monossacarídeo,e um composto selecionado a partir do grupo de compostos consistindo emum polietileno glicol, um segundo monossacarídeo, um segundo dissacarí-deo, um segundo trissacarídeo, um metal, um segundo álcool, e um aminoá-cido, onde o segundo monossacarídeo, o segundo dissacarídeo e o segundotrissacarídeo são diferentes, respectivamente, do primeiro monossacarídeo,do primeiro dissacarídeo, e do primeiro trissacarídeo, onde a potência datoxina botulínica é pelo menos cerca de 40% da potência máxima teórica datoxina botulínica.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) umatoxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipi-ente protéico, um polietileno glicol, e um composto selecionado a partir dogrupo de compostos consistindo em um monossacarídeo, um dissacarídeo,um trissacarídeo, um metal, um álcool, e um aminoácido, onde a potência datoxina botulínica é pelo menos cerca de 20% da potência máxima teórica datoxina botulínica.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) umatoxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipi-ente protéico, um polietileno glicol, e um composto selecionado a partir dogrupo de compostos consistindo em um monossacarídeo, um dissacarídeo,um trissacarídeo, um metal, um álcool, e um aminoácido, onde a potência datoxina botulínica é pelo menos cerca de 30% da potência máxima teórica datoxina botulínica.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) umatoxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipi-ente protéico, um polietileno glicol, e um composto selecionado a partir dogrupo de compostos consistindo em um monossacarídeo, um dissacarídeo,um trissacarídeo, um metal, um álcool, e um aminoácido, onde a potência datoxina botulínica é pelo menos cerca de 40% da potência máxima teórica datoxina botulínica.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) umatoxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipi-ente protéico, um polietileno glicol, e um composto selecionado a partir dogrupo de compostos consistindo em um monossacarídeo, um dissacarídeo,um trissacarídeo, um metal, um álcool, e um aminoácido, onde a potência datoxina botulínica é pelo menos cerca de 50% da potência máxima teórica datoxina botulínica.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) umatoxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipi-ente protéico, um polietileno glicol, e um composto selecionado a partir dogrupo de compostos consistindo em um monossacarídeo, um dissacarídeo,um trissacarídeo, um metal, um álcool, e um aminoácido, onde a potência datoxina botulínica é pelo menos cerca de 60% da potência máxima teórica datoxina botulínica.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) umatoxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipi-ente protéico, um polietileno glicol, e um composto selecionado a partir dogrupo de compostos consistindo em um monossacarídeo, um dissacarídeo,um trissacarídeo, um metal, um álcool, e um aminoácido, onde a potência datoxina botulínica é pelo menos cerca de 70% da potência máxima teórica datoxina botulínica.

Descrição

A presente invenção é baseada na descoberta que uma compo-sição farmacêutica de toxina clostrídica, com uma toxina clostrídica estabili-zada, pode ser feita usando um excipiente que não seja uma proteína comoo estabilizador primário da toxina clostrídica.

Descobriu-se que uma substituição adequada para um excipienteprotéico, tal como a albumina ou a gelatina, em uma composição farmacêuticade toxina clostrídica pode ser um composto que não seja uma proteína.

O excipiente que não é uma proteína, usado na presente inven-ção, pode conferir estabilidade a um ingrediente ativo de neurotoxina, talcomo uma toxina botulínica, presente na composição farmacêutica, por: (1)redução da adesão (comumente referida como "pegajosidade") da toxinabotulínica às superfícies, tais como as superfícies de artigos de vidro de la-boratórios, vasos, do frasco pequeno no qual a composição farmacêutica éreconstituída e a superfície de dentro da seringa usada para injetar a com-posição farmacêutica. A adesão da toxina botulínica às superfícies pode re-sultar em perda de toxina botulínica e na desnaturação da toxina botulínicaretida, ambas as quais reduzem a toxicidade da toxina botulínica presentena composição farmacêutica, (2) redução da desnaturação da toxina botulí-nica e/ou da dissociação da toxina botulínica de outras proteínas que nãosejam toxinas, presentes no complexo de toxina botulínica, cujas atividadesde desnaturação e/ou de dissociação podem ocorrer por causa da baixa dilu-ição da toxina botulínica presente na composição farmacêutica (isto é, antesda liofilização ou da secagem a vácuo) e na composição farmacêutica re-constituída, (3) redução da perda de toxina botulínica (isto é, devida à des-naturação ou à dissociação de proteínas que não sejam toxinas no comple-xo) durante as mudanças consideráveis de pH e concentração que ocorremdurante a preparação, o processamento e a reconstituição da composiçãofarmacêutica.

Os três tipos de estabilizações da toxina botulínica proporciona-dos pelos estabilizadores que não são de proteínas, descritos nesse docu-mento, conservam e preservam a toxina botulínica com a sua toxicidade na-tiva antes da injeção da composição farmacêutica.

Em certas modalidades da invenção, as composições farmacêu-ticas da invenção podem compreender uma pluralidade de sorotipos da toxi-na botulínica. Em outras palavras, a composição pode incluir dois ou maissorotipos diferentes da toxina botulínica. Por exemplo, uma composição po-de incluir os sorotipos da toxina botulínica A e B. Em uma outra modalidade,uma composição pode incluir os sorotipos da toxina botulínica A e E. A utili-zação de uma combinação de sorotipos da toxina botulínica permitirá que osprofissionais da saúde adaptem a composição, para atingir um efeito dese-jado com base na condição que está sendo tratada. Em uma modalidadeadicional da invenção, a composição pode compreender uma toxina botulíni-ca modificada. A toxina botulínica modificada preferencialmente inibirá a libe-ração de neurotransmissor de um neurônio, porém pode ter uma potênciamaior ou menor do que a toxina botulínica nativa, ou pode ter um efeito bio-lógico maior ou menor do que a toxina botulínica nativa. Porque as composi-ções da invenção podem ser usadas para o tratamento de animais com du-ração relativamente longa, as composições podem ser proporcionadas emuma forma relativamente pura. Em uma modalidade, as composições são deum grau farmacêutico. Em certas modalidades, a neurotoxina clostrídica temuma pureza maior do que 95%. Nas modalidades adicionais, a neurotoxinaclostrídica tem uma pureza maior do que 99%.

A invenção também inclui a adição de um conservante, no dilu-ente ou na formulação propriamente dita, para permitir a armazenagem pro-longada. Um conservante preferido é o álcool benzílico contendo soluçãosalina conservada.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser adminis-tradas usando modos convencionais de administração. Nas modalidadespreferidas da invenção, as composições são administradas de modo intra-muscular ou subcutâneo ao paciente. Em outras modalidades, as composi-ções da invenção podem ser administradas de modo intratecal. Além disso,as composições da invenção podem ser administradas com um ou mais a-gentes analgésicos ou anestésicos.

O modo mais efetivo de administração e regime de dosagempara as composições dessa invenção depende do tipo, da gravidade, e docurso da condição que está sendo tratada, da saúde e da resposta do animalao tratamento, e do julgamento do médico que está tratando. Desse modo,os métodos e as dosagens das composições devem ser regulados para opaciente individual.

Como forma de exemplo, e não como forma de limitação, podeser preferido administrar a composição da invenção intramuscularmente,para reduzir um espasmo muscular.

A invenção também inclui uma composição farmacêutica com-preendendo uma toxina botulínica e um colágeno, para uso para tratar umavariedade de condições, onde a toxina botulínica atua para paralisar ummúsculo e o colágeno atua para proporcionar um enchimento dérmico.

As composições que contêm outros sorotipos de toxina botulíni-ca podem conter diferentes dosagens da toxina botulínica. Por exemplo, atoxina botulínica tipo B pode ser proporcionada em uma composição emuma dose maior do que uma composição contendo toxina botulínica tipo A.

Em uma modalidade da invenção, a toxina botulínica tipo B pode ser admi-nistrada em uma quantidade entre cerca de 1 U/kg e 150 U/kg. A toxina bo-tulínica tipo B pode também ser administrada em quantidades de até 20.000U (unidades no camundongo, conforme descrito acima). Em uma outra mo-dalidade da invenção, a toxina botulínica tipos E ou F pode ser administradaem concentrações entre cerca de 0,1 U/kg e 150 U/kg. Além disso, nascomposições contendo mais do que um tipo de toxina botulínica, cada tipode toxina botulínica pode ser proporcionado em uma dose relativamentemenor do que a dose tipicamente usada para um sorotipo de toxina botulíni-ca individual. A combinação de sorotipos de toxina botulínica pode entãoproporcionar um grau e uma duração de paralisia adequados, sem um au-mento na difusão das neurotoxinas (por exemplo, vide a Patente U.S. N26.087.327).

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir descrevem modalidades específicas dapresente invenção e não são pretendidos para limitar o escopo da invenção.

Nos Exemplos abaixo, o ensaio de dose Ietalso ern camundongo(o "ensaio de MLD50") bem-conhecido foi usado para determinar a potênciada toxina botulínica. Dependendo das circunstâncias, a "potência" pode sig-nificar a potência recuperada da toxina botulínica ou a potência da toxinabotulínica antes da liofilização. A potência recuperada é sinônimo com a po-tência de reconstituição, a potência de recuperação e com a potência na re-constituição. O ensaio de MLD50 proporciona uma determinação da potên-cia de uma toxina botulínica em termos de sua dose letal a 50% ou "LD50"em camundongo. Assim, uma unidade (U) de uma toxina botulínica é defini-da como a quantidade de toxina botulínica que, na injeção intraperitoneal,mata 50% (isto é, uma LD50) de um grupo de camundongos fêmeas SwissWeber, pesando 17-22 gramas cada um, no início do ensaio. O ensaio deMLD50 é um método validado para medir a potência de uma toxina botulíni-ca reconstituída ou de uma formulação de toxina botulínica reconstituída.Cada camundongo é mantido em uma posição de costas com a sua cabeçainclinada para baixo e é injetado de modo intraperitoneal no abdômen direitoinferior, em um ângulo de cerca de 30 graus, usando uma agulha de 0,95 cma 1,59 cm (3/8" a 5/8"), de escala 25 a 27 gauge, com uma das diversasdiluições em série da toxina botulínica em solução salina normal. As taxasde morte durante as 72 horas seguintes, para cada diluição, são registradas.Prepara-se um mínimo de seis diluições em intervalos de dose de 1,33 e,tipicamente, dez animais são usados em cada grupo de dosagem (portanto,60 camundongos empregados). Dois ensaios padrão de referência são reali-zados simultaneamente (60 camundongos adicionais empregados). As dilui-ções são preparadas de modo que a diluição mais concentrada produza umataxa de morte de pelo menos 80% dos camundongos injetados, e a diluiçãode menor concentração produza uma taxa de morte não maior do que 20%do camundongo injetado. Deve haver um mínimo de quatro diluições queincidam na faixa decrescente uniforme das taxas de morte. A faixa decres-cente uniforme começa com uma taxa de morte de não menos do que 80%.

Dentro das quatro ou mais taxas decrescentes uniformes, as duas taxasmaiores e as duas menores devem ser decrescentes (isto é, não equivalen-tes). A diluição na qual 50% dos camundongos morrem dentro do período deobservação de três dias após a injeção é definida como uma diluição quecompreende uma unidade (1 U) da toxina botulínica. Um ensaio de MLD50apurado foi desenvolvido, o qual utiliza poucas diluições (cinco em vez deseis), em intervalos de dose de 1,15, e poucos camundongos (seis em vezde dez) por diluição testada.

Exemplo 1

Composição Farmacêutica de Toxina Botulínica Contendo Soro AlbuminaHumana (Técnica Anterior)

Um complexo de toxina botulínica tipo A foi obtido de uma cultu-ra da cepa Hall de Clostridium botulinum, desenvolvida em um meio conten-do N-Z amina e extrato de levedura. O complexo de toxina botulínica tipo Afoi purificado da solução de cultura por uma série de precipitações ácidas atéum complexo cristalino consistindo na proteína de toxina de alto peso mole-cular ativa e uma proteína de hemaglutinina associada. O complexo cristali-no foi então dissolvido novamente em uma solução contendo salina e albu-mina e filtrado estéril (0,2 mícron) antes da secagem a vácuo. A composiçãosecada a vácuo foi reconstituída com solução salina não conservada, estéril,antes da injeção. Cada frasco pequeno de composição secada a vácuo con-tém cerca de 100 unidades (U) de complexo de toxina tipo A de Clostridiumbotulinum, 0,5 miligrama de soro albumina humana e 0,9 miligrama de clore-to de sódio em uma forma secada à vácuo, estéril, sem um conservànte.Esta composição farmacêutica é vendida comercialmente sob o nome co-mercial BOTOX® em frascos pequenos de 100 unidades para a reconstitui-ção com solução salina antes da injeção.Exemplo 2

Formulações de Toxina Botulínica Estabilizada por uma Não-Proteína

Foram realizados experimentos para preparar múltiplas formula-ções de toxina botulínica com um ou mais excipientes estabilizadores quenão são de proteína, diferentes. Todas as formulações foram combinadas,liofilizadas, reconstituídas e a potência avaliada no mesmo modo, e com omesmo tipo de toxina botulínica usada em cada formulação, supondo quecada formulação fosse preparada com um excipiente, ou excipientes, dife-rente que não era de proteína, ou com uma quantidade diferente do excipi-ente que não era de proteína ou dos excipientes que não eram de proteínas,presentes na formulação de toxina botulínica.

Os excipientes que não eram de proteína, usados (separada-mente ou em combinação) nas formulações preparadas nesses experimen-tos, incluíram: uma polivinilpirrolidona (também chamada povidona, tal comoKollidon 17); diversos dissacarídeos (tais como a Iactose e a trealose); umtrissacarídeo (tal como a rafinose); um polissacarídeo (tal como a inulina);um álcool (tal como um álcool feito por redução de um monossacarídeo [talcomo a frutose] ou tal como o manitol); um metal (tal como o zinco); um ami-noácido (tal como a glicina), e; um polietileno glicol (tal como o poloxâmero188 e/ou o PEG 3350). Visto que uma proteína é um poliaminoácido, o usode um ou mais aminoácidos individuais nas formulações descritas nessedocumento não proporcionou um excipiente de proteína nessas formulações.

As formulações descritas nesse Exemplo foram preparadas pri-meiramente adicionando-se a quantidade indicada do(s) excipiente(s) quenão é(são) de proteína(s) à água estéril para injeção, para formar uma solu-ção. A seguir, entre 100 a 200 unidades de um complexo de toxina botulínicatipo A (obtido por fermentação anaeróbica da cepa Hall de Clostridium botu-linum, seguida por purificação da toxina botulínica liberada para o, e removi-da do, meio de fermentação. Vide, por exemplo, o Exemplo 1 acima descritoe Schantz E.J., et al., Properties and use of botulinum toxin and other micro-bial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev., março de 1992; 56(1):80-99)foram adicionadas à solução, para, desse modo, formar uma formulação detoxina botulínica, que pode ser sinonimamente referida como uma composi-ção farmacêutica de toxina botulínica, ou simplesmente como uma formula-ção. A potência antes da liofilização da toxina botulínica usada foi determi-nada pelo ensaio de LD50 em camundongo, antes da adição da toxina botu-línica à solução, e era entre cerca de 100 unidades e cerca de 200 unidades.

As formulações foram então Iiofilizadas (ou secadas por conge-lamento ou secadas a vácuo), seguido por reconstituição com solução salinanormal. A potência recuperada da toxina botulínica presente na formulaçãoreconstituída foi determinada por aplicação do mesmo ensaio de LD50 emcamundongo.

A "% de Recuperação" nas Tabelas 1 a 5 é a potência da toxinabotulínica antes da reconstituição (portanto, a "potência recuperada"), ex-pressa como uma porcentagem da potência da toxina botulínica antes daliofilização da formulação. Assim, por exemplo, uma % de Recuperação de60% significa que a potência da toxina botulínica após a reconstituição era60% da potência da toxina botulínica antes da liofilização. A potência recu-perada teórica máxima é 100%. Os valores da % de Recuperação foram ob-tidos por reconstituição exatamente após a formulação ser liofilizada.

As Tabelas 1 a 6 apresentam os resultados dos experimentosefetuados nesse Exemplo, onde as formulações foram preparadas conformedescrito acima.Tabela 1 Formulações de Toxina Botulínica com um Único Excipiente que

Não é de Proteína e Nenhuma Potência Recuperada

<table>table see original document page 37</column></row><table>Tabela 2 Formulações de Toxina Botulínica com um Único Excipiente queNão é de Proteína e uma Potência Recuperada

<table>table see original document page 38</column></row><table>

Tabela 3 Formulações de Toxina Botulínica com Dois Excipientes que Nãosão de Proteínas e Nenhuma Potência Recuperada

<table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table>Tabela 4 Formulações de Toxina Botulínica com Dois Excipientes que Nãosão de Proteínas e uma Potência Recuperada

<table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table>

A Tabela 5 mostra os resultados dos experimentos com as for- mulações de toxina botulínica contendo dois excipientes que não são de pro-teína e com ou sem o tampão especificado. A potência da toxina botulínicafoi medida: (1) após liofilização e reconstituição imediata ("Potência Inicial"),e; (2) após liofilização, armazenagem por três meses sob uma de duas con-dições diferentes de armazenagem (a -40°C ou a 20°C) e reconstituição.

Os resultados da Tabela 5 mostram que uma composição far-macêutica de toxina botulínica contendo um excipiente que não é de proteí-na de PVP não tem estabilidade significativa na temperatura ambiente, a nãoser que formulada com um tampão de citrato. Verificou-se que até no mes-mo pH, um tampão de fosfato não proporcionaria a estabilidade desejada natemperatura ambiente para tal formulação.Tabela 5 Formulações de Toxina Botulínica com Dois Excipientes que Nãosão de Proteínas

<table>table see original document page 42</column></row><table>A Tabela 6 mostra os resultados dos experimentos com as for-mulações de toxina botulínica contendo três excipientes que não são de pro-teínas e com ou sem o tampão especificado. A potência da toxina botulínicafoi medida após liofilização, seguida por reconstituição imediata ("PotênciaInicial").

Os resultados da Tabela 6 mostram que uma composição far-macêutica de toxina botulínica pode ser estabilizada por uso de três excipi-entes que não são de proteínas, presentes na mesma formulação, e que ouso de um tampão de citrato na formulação aperfeiçoa a potência inicial. Fo-ram também preparadas composições farmacêuticas de toxina botulínicaestabilizadas com outros três excipientes que não são de proteínas, diferen-tes, e com potência recuperada significativa.

Tabela 6 Formulações de Toxina Botulínica com Três Excipientes que Nãosão de Proteínas

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Entre as descobertas feitas a partir desses experimentos esta-vam as que seguem:

1. Uma formulação de toxina botulínica preparada com concen-trações particulares de um único excipiente que não é de proteína, o qual éuma polivinilpirrolidona (tal como o Kollidon 17), pode não mostrar nenhumapotência recuperada (vide as linhas 1-4 da Tabela 1).

2. Uma formulação de toxina botulínica preparada com diferen-tes concentrações particulares de um único excipiente que não é de proteí-na, o qual é uma polivinilpirrolidona (tal como o Kollidon 17), pode mostraruma potência recuperada entre 39% e 52% (vide as linhas 1-3 da Tabela 2).Levando-se em consideração o item 1. acima, essa é uma descoberta sur-preendente e inesperada.

3. Uma formulação de toxina botulínica preparada com dois ex-cipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes quenão são de proteínas é uma polivinilpirrolidona (tal como o Kollidon 17), podenão mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 1-7 da Tabela 3).

4. Uma formulação de toxina botulínica preparada com dois ex-cipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes quenão são de proteínas é uma polivinilpirrolidona (tal como o Kollidon 17), podemostrar uma potência recuperada tão alta quanto 65% (vide as linhas 1-18da Tabela 4). Levando-se em consideração os itens 1 e 3 acima, essa é umadescoberta surpreendente e inesperada.

5. Uma formulação de toxina botulínica preparada com umaconcentração particular de um único excipiente que não é de proteína, o qualé um dissacarídeo (tal como a lactose), pode não mostrar nenhuma potênciarecuperada (vide a linha 5 da Tabela 1).

6. Uma formulação de toxina botulínica preparada com diferen-tes concentrações particulares de um único excipiente que não é de proteí-na, o qual é um dissacarídeo (tal como a lactose), pode mostrar uma potên-cia recuperada entre 15% e 35% (vide as linhas 4-5 da Tabela 2). Levando-se em consideração o item 5 acima, essa é uma descoberta surpreendente einesperada.

7. Uma formulação de toxina botulínica preparada com dois ex-cipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes quenão são de proteínas é um dissacarídeo (tal como a lactose), pode não mos-trar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 1-3 da Tabela 3).

8. Uma formulação de toxina botulínica preparada com dois ex-cipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes quenão são de proteínas é um dissacarídeo (tal como a lactose), pode mostraruma potência recuperada tão alta quanto 65% (vide as linhas 1-8 e 19-22 daTabela 4). Levando-se em consideração os itens 5 e 7 acima, essa é umadescoberta surpreendente e inesperada.

9. Uma formulação de toxina botulínica preparada com um únicoexcipiente que não é de proteína, o qual é um dissacarídeo (tal como a saca-rose), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 6-10da Tabela 1).

10. Uma formulação de toxina botulínica preparada com doisexcipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientesque não são de proteínas é um dissacarídeo (tal como a sacarose), podenão mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 4-8, 11-12, e 19-27 da Tabela 3).

11. Uma formulação de toxina botulínica preparada com doisexcipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientesque não são de proteínas é um dissacarídeo (tal como a sacarose), podemostrar uma potência recuperada tão alta quanto 59% (vide as linhas 9-17, 20, 23, 26 e 30-35 da Tabela 4). Levando-se em consideração os itens 9 e 10 acima, essa é uma descoberta surpreendente e inesperada.

12. Uma formulação de toxina botulínica preparada com um úni-co excipiente que não é de proteína, o qual é um aminoácido (tal como aglicina), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 11 - 13 da Tabela 1).

13. Uma formulação de toxina botulínica preparada com doisexcipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientesque não são de proteínas é um aminoácido (tal como a glicina), pode nãomostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 19-21, 28-30, 38, - 42- 44 e 46-48 da Tabela 3).

14. Uma formulação de toxina botulínica preparada com diferen-tes concentrações particulares de dois excipientes que não são de proteínas,diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um aminoá-cido (tal como a glicina), pode mostrar uma potência recuperada tão altaquanto 33% (vide as linhas 38-39 da Tabela 4). Levando-se em considera-ção os itens 12-13 acima, essa é uma descoberta surpreendente e inespe-rada.

15. Uma formulação de toxina botulínica preparada com um úni-co excipiente que não é de proteína, o qual é um metal (tal como o zinco),pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 14-16 daTabela 1).

16. Uma formulação de toxina botulínica preparada com doisexcipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes

que não são de proteínas é um metal (tal como o zinco), pode não mostrarnenhuma potência recuperada (vide as linhas 8-9, 13-15, 22-24, e 28-37 daTabela 3).

17. Uma formulação de toxina botulínica preparada com diferen-tes concentrações particulares de dois excipientes que não são de proteínas,diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um metal(tal como o zinco), pode mostrar uma potência recuperada tão alta quanto38% (vide as linhas 21 e 36-37 da Tabela 4). Levando-se em consideraçãoos itens 15-16 acima, essa é uma descoberta surpreendente e inesperada.

18. Uma formulação de toxina botulínica preparada com um úni-co excipiente que não é de proteína, o qual é um álcool (tal como o manitol),pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 17-19 daTabelai).

19. Uma formulação de toxina botulínica preparada com doisexcipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientesque não são de proteínas é um álcool (tal como o manitol), pode não mostrarnenhuma potência recuperada (vide as linhas 9-18 da Tabela 3).

20. Uma formulação de toxina botulínica preparada com diferen-tes concentrações particulares de dois excipientes que não são de proteínas,diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um álcool(tal como o manitol), pode mostrar uma potência recuperada tão alta quanto35% (vide as linhas 22-29 da Tabela 4). Levando-se em consideração ositens 17-18 acima, essa é uma descoberta surpreendente e inesperada.

21. Uma formulação de toxina botulínica preparada com um úni-co excipiente que não é de proteína, o qual é um dissacarídeo (tal como atrealose), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas23-25 da Tabela 1).22. Uma formulação de toxina botulínica preparada com doisexcipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientesque não são de proteínas é um dissacarídeo (tal como a trealose), pode nãomostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 16-18, 25-27, 33-35 e42-45 da Tabela 3).

23. Uma formulação de toxina botulínica preparada com diferen-tes concentrações particulares de dois excipientes que não são de proteínas,diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um dissaca-rídeo (tal como a trealose), pode mostrar uma potência recuperada tão altaquanto 75% (vide as linhas 40-44 da Tabela 4). Levando-se em considera-ção os itens 21-22 acima, essa é uma descoberta surpreendente e inespe-rada.

24. Uma formulação de toxina botulínica preparada com um úni-co excipiente que não é de proteína, o qual é um polietileno glicol (tal como oPEG 3350 ou o poloxâmero 188), pode não mostrar nenhuma potência re-cuperada (vide as linhas 29-30 da Tabela 1).

25. Uma formulação de toxina botulínica preparada com doisexcipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientesque não são de proteínas é um polietileno glicol (tal como o PEG 3350 ou opoloxâmero 188), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide aslinhas 10, 31 -32, 36-41 e 45-48 da Tabela 3).

26. Uma formulação de toxina botulínica preparada com diferen-tes concentrações particulares de dois excipientes que não são de proteínas,diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um polieti-Ieno glicol (tal como o PEG 3350 ou o poloxâmero 188), pode mostrar umapotência recuperada tão alta quanto 75% (vide as linhas 18-19, 24-25, 27-44da Tabela 4). Levando-se em consideração os itens 24-25 acima, essa éuma descoberta surpreendente e inesperada.

27. Os estabilizadores que não são de proteínas Iactose e polivi-nilpirrolidona ("PVP") (isto é, o Kollidon 17), cada um, proporcionaram potên-cia de recuperação significativa quando usados como um estabilizador quenão é de proteína da toxina botulínica, presente em uma composição farma-cêutica de toxina botulínica (vide a Tabela 2).

28. Quando a Iactose e a PVP usadas foram ambas usadas co-mo estabilizadores que não são de proteínas da mesma composição farma-cêutica de toxina botulínica, a potência de recuperação melhorou, em com-paração com a potência de recuperação observada quando a Iactose e aPVP foram usadas separadamente como um estabilizador que não é de pro-teína (vide, por exemplo, a Tabela 4, linhas 1-8).

29. A potência de recuperação (da toxina botulínica presente emuma composição farmacêutica de toxina botulínica reconstituída) melhorouquando a Iactose e/ou a PVP foram usadas com um ou mais dos outros ex-cipientes que não eram de proteínas, descritos acima (vide, respectivamen-te, a Tabela 4, linhas 19-22, e a Tabela 4, linhas 9-18).

30. O uso de certas combinações de excipientes (como estabili-zadores que não são de proteínas da toxina botulínica presente em umacomposição farmacêutica de toxina botulínica reconstituída) proporcionouuma potência de recuperação significativa, mesmo onde nenhuma potênciade recuperação foi obtida quando tal excipiente que não era de proteína foiusado sozinho, como um estabilizador que não era de proteína da toxinabotulínica presente em uma composição farmacêutica de toxina botulínica.

Por exemplo, comparar: (1) a Tabela 1, linhas 1-4, e a Tabela 1, linhas 6-10,com a Tabela 4, linhas 9-17, e; (2) a Tabela 1, linhas 23-25, e a Tabela 1,linha 29, com a Tabela 4, 43-44.

31. A potência de recuperação era algumas vezes dependenteda concentração do estabilizador que não era de proteína, presente na com-posição farmacêutica de toxina botulínica.

32. A adição de um tampão pôde melhorar a potência de recupe-ração e a estabilidade na armazenagem. Os tampões individuais diferiramem sua capacidade de exercer esse efeito. Os tampões atuam para obterum pH ótimo, manter o pH ótimo e, em algumas situações (por exemplo, ocitrato), proteger contra a oxidação.

As conclusões gerais a partir desses experimentos incluem asobservações que:(a) a toxina botulínica presente em uma composição farmacêuti-ca de toxina botulínica pode ser estabilizada (e demonstrado por uma boapotência de recuperação) por formulação da composição com dois ou maisexcipientes que não são de proteínas, comuns.

(b) Uma polivinilpirrolidona (tal como o Kollidon 17) e um dissa-carídeo (tal como a lactose) podem atuar como um estabilizador (excipiente)que não é de proteína em uma formulação de toxina botulínica, sem a pre-sença de qualquer outro estabilizador que não é de proteína.

(c) Com o mesmo estabilizador, ou estabilizadores, que não é deproteína, a potência recuperada pode ser dependente da razão, e/ou daconcentração, do estabilizador, ou estabilizadores, que não é de proteínausado na formulação de toxina botulínica.

(d) Certos estabilizadores que não são de proteínas (tais como apolivinilpirrolidona [tal como o Kollidon 17] e um dissacarídeo [tal como alactose]) não somente podem atuar para estabilizar a toxina botulínica emuma formulação de toxina botulínica, quando utilizados juntos, como podemproporcionar uma estabilização aumentada quando usados juntos, comodeterminado por uma potência recuperada mais elevada da formulação re-constituída.

(e) Os excipientes farmacêuticos comumente usados (tais comoa polivinilpirrolidona, a lactose, a sacarose etc.) não funcionaram quandousados como estabilizadores, ou somente funcionam como um estabilizadorde uma toxina botulínica em uma formulação de toxina botulínica sem prote-ína quando usados em concentrações particulares, uma polivinilpirrolidona(tal como o Kollidon 17) e um dissacarídeo (tal como a lactose).

(f) Muitos excipientes funcionaram ou funcionaram como melho-res estabilizadores de uma toxina botulínica, em uma formulação de toxinabotulínica não proteína, quando combinados com uma polivinilpirrolidona (talcomo o Kollidon 17) e um dissacarídeo (tal como a lactose).

(g) Embora a PVP específica "Kollidon 17" fosse usada nas di-versas formulações de toxina botulínica preparadas, outras PVPs estão den-tro do escopo da presente invenção.(h) Embora o poloxâmero específico "polioxâmero 188" fosseusado nas diversas formulações de toxina botulínica preparadas, outros po-loxâmeros estão dentro do escopo da presente invenção.

(i) Verificou-se que o tensoativo polissorbato (Tween) pode serusado em vez do poloxâmero 188, com resultados similares.

Os outros excipientes que não são de proteínas, que podem serusados em uma composição farmacêutica de toxina botulínica, dentro doescopo da presente invenção, incluem os antioxidantes, tais como o Hidroxi-tolueno butilado (BHT) e o Hidroxianisol butilado (BHA), e os aminoácidos,tais como a cisteína e a metionina. A formulação de toxina botulínica Iiofili-zada pode ser reconstituída com solução salina, água ou com um diluentepersonalizado, para afetar o desempenho após a reconstituição ou a injeção.

Exemplo 3

Uso de uma Composição Farmacêutica de Toxina Botulínica

Um homem de 48 anos de idade é diagnosticado com uma con-dição de músculo espástico, tal como a distonia cervical. Entre cerca de 10"3U/kg e cerca de 35 U/kg de uma composição farmacêutica de toxina botulí-nica tipo A da formulação contendo Iactose e PVP são injetadas intramuscu-Iarmente no paciente. Dentro de 1-7 dias, os sintomas da condição de mús-culo espástico são aliviados e o alívio dos sintomas persiste por pelo menosde cerca de 2 meses a cerca de 6 meses.

Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção, des-crita nesse documento, tem muitas vantagens, incluindo as seguintes:

1. a composição farmacêutica pode ser preparada livre de qual-quer produto sangüíneo, tal como a albumina, e, portanto, livre de qualquer

elemento infeccioso do produto sangüíneo, tal como um priônio.

2. A composição farmacêutica tem estabilidade e alta % de re-cuperação da potência da toxina, comparável ou superior àquela obtida comas composições farmacêuticas atualmente disponíveis.

3. Toxicidade reduzida, como avaliada por administração intra-muscular ou intravenosa.

4. Antigenicidade reduzida.Diversas publicações, patentes e/ou referências foram citadasnesse documento, cujos conteúdos, em suas totalidades, são incorporadosaqui por referência.

Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhe comrelação a certos métodos preferidos, são possíveis outras modalidades, ver-sões, e modificações dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo,uma ampla variedade de polissacarídeos e aminoácidos estabilizadores estádentro do escopo da presente invenção.

Desse modo, o espírito e o escopo das reivindicações a seguirnão devem ser limitados às descrições das modalidades preferidas apresen-tadas acima.

Claims (14)

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende:(a) uma toxina botulínica, em que a toxina botulínica não é esta-bilizada por um excipiente protéico;(b) uma polivinilpirrolidona, e;(c) um dissacarídeo,em que a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de-40% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a toxina botulínica é selecionada do grupoque consiste em toxinas botulínicas dos tipos A, B1 C, D, E, F e G.

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a toxina botulínica é uma toxina botulínica tipo A.

4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende:(a) uma toxina botulínica, em que a toxina botulínica não é esta-bilizada por um excipiente protéico;(b) uma polivinilpirrolidona, e;(c) um dissacarídeo,em que a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de-50% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que a potência da toxina botulínica é pelo menoscerca de 60% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que a potência da toxina botulínica é pelo menoscerca de 70% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende:(a) uma toxina botulínica, em que a toxina botulínica não é estabilizada por um excipiente protéico;(b) uma polivinilpirrolidona, e;(c) um polietileno glicol,em que a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de-40% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende:(a) uma toxina botulínica, em que a toxina botulínica não é esta-bilizada por um excipiente protéico;(b) um composto selecionado do grupo que consiste em um pri-meiro monossacarídeo, um primeiro dissacarídeo, um primeiro trissacarídeo,e um primeiro álcool feito por redução do primeiro monossacarídeo, e;(c) um composto selecionado do grupo de compostos que con-siste em um polietileno glicol, um segundo monossacarídeo, um segundodissacarídeo, um segundo trissacarídeo, um metal, um segundo álcool, e umaminoácido, em que o segundo monossacarídeo, o segundo dissacarídeo eo segundo trissacarídeo são diferentes, respectivamente, do primeiro mo-nossacarídeo, do primeiro dissacarídeo, e do primeiro trissacarídeo,em que a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de-40% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende:(a) uma toxina botulínica, em que a toxina botulínica não é esta-bilizada por um excipiente protéico;(b) um polietileno glicol, e;(c) um composto selecionado do grupo de compostos consistin-do em um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um metal,um álcool, e um aminoácido,em que a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de-20% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que a potência da toxina botulínica é pelo menoscerca de 30% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que a potência da toxina botulínica é pelo menoscerca de 40% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que a potência da toxina botulínica é pelo menoscerca de 50% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12,caracterizada pelo fato de que a potência da toxina botulínica é pelo menoscerca de 60% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de que a potência da toxina botulínica é pelo menoscerca de 70% da potência máxima teórica da toxina botulínica.