BRPI0613001B1 - Composições farmacêuticas de toxina clostrídica estabilizada por uma não-proteína - Google Patents

Abstract

patente de invenção: composições farmacêuticas de toxina clostrídica estabilizada por uma não-proteína. a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica de toxina clostrídica compreendendo uma toxina clostrídica, tal como umatoxina botulínica, em que a toxina clostrídica presente na composição farmacêutica é estabilizada por um excipiente que não é de proteína, tal como uma polivinilpirrolidona, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um polissacarídeo, um álcool, um metal, um aminoácido, um tensoativo e/ou um polietileno glicol.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DE TOXINA CLOSTRÍDICA ESTABILIZADA POR UMA NÃO-PROTEÍNA.

Referência Cruzada [0001] Este pedido de patente é um pedido de patente de utilidade não provisório, o qual reivindica a prioridade ao pedido de patente provisório relacionado número 60/725.125, depositado em 6 de outubro de 2005, o conteúdo inteiro desse pedido de patente sendo incorporado nesse documento por referência.

Antecedentes [0002] A presente invenção refere-se às composições farmacêuticas de toxina clostrídica. Em particular, a presente invenção refere-se às composições farmacêuticas de toxina clostrídica com um excipiente que não é uma proteína, que funciona para estabilizar a toxina clostrídica (tal como uma toxina botulínica) presente na composição farmacêutica.

[0003] Uma composição farmacêutica é uma formulação que contém pelo menos um ingrediente ativo (tal como uma toxina clostrídica), bem como, por exemplo, um ou mais excipientes, tampões, veículos, estabilizadores, conservantes e/ou agentes de massa, e é adequada para a administração a um paciente para obter um resultado diagnóstico ou efeito terapêutico desejado. As composições farmacêuticas descritas nesse documento têm utilidade diagnostica, terapêutica e/ou de pesquisa.

[0004] Para a estabilidade na armazenagem e a conveniência de manuseio, uma composição farmacêutica pode ser formulada como um pó liofilizado (isto é, secado por congelamento) ou secado a vácuo, o qual pode ser reconstituído com um fluido adequado, tal como solução salina ou água, antes da administração a um paciente. Alternativamente, a composição farmacêutica pode ser formulada como uma solução ou suspensão aquosa. Uma composição farmacêutica pode conter um ingrediente ativo proteináceo. Infelizmente, um ingrediente ativo proteico pode ser muito difícil de estabilizar (isto é, mantido em um estado onde a perda de atividade biológica seja minimizada), resultando, portanto, em uma perda de proteína e/ou perda de atividade de proteína durante a formulação, a reconstituição (se requerida) e durante o período de armazenagem antes do uso de uma composição farmacêutica contendo

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2/47 proteína. Os problemas de estabilidade podem ocorrer por causa da desnaturação, da degradação, da dimerização, e/ou da polimerização da proteína. Diversos excipientes, tais como a albumina e a gelatina, têm sido usados, com diferentes graus de sucesso, para experimentar e estabilizar um ingrediente ativo protéico presente em uma composição farmacêutica. Adicionalmente, os crioprotetores, tais como os álcoois, têm sido usados para reduzir a desnaturação da proteína sob as condições de congelamento da liofilização.

Excipientes Proteicos [0005] Diversas proteínas, tais como a albumina e a gelatina, têm sido usadas para estabilizar uma toxina botulínica presente em uma composição farmacêutica. As albuminas são proteínas plasmáticas pequenas, abundantes. A soro albumina humana tem um peso molecular de cerca de 69 quilo-Dáltons (kD) e tem sido usada como um ingrediente não ativo em uma composição farmacêutica, onde ela pode servir como um veículo de massa e estabilizador de certos ingredientes ativos proteicos presentes em uma composição farmacêutica.

[0006] A função de estabilização da albumina em uma composição farmacêutica pode estar presente tanto durante a formulação de múltiplas etapas da composição farmacêutica, quanto na reconstituição posterior da composição farmacêutica formulada. Assim, a estabilidade pode ser conferida pela albumina a um ingrediente ativo proteináceo em uma composição farmacêutica através de, por exemplo, (1) redução da adesão (comumente referida como pegajosidade) dos ingredientes ativos proteicos às superfícies, tais como as superfícies de artigos de vidro de laboratórios, vasos, do frasco pequeno no qual a composição farmacêutica é reconstituída e as superfícies de dentro de uma seringa usada para injetar a composição farmacêutica. A adesão de um ingrediente ativo protéico às superfícies pode resultar em perda de ingrediente ativo e na desnaturação do ingrediente ativo protéico retido restante, ambas as quais reduzem a atividade total do ingrediente ativo presente na composição farmacêutica, e; (2) redução da desnaturação do ingrediente ativo, a qual pode ocorrer na preparação de uma solução de baixa diluição do ingrediente ativo.

[0007] Assim como é capaz de estabilizar um ingrediente ativo protéico em uma composição farmacêutica, a soro albumina humana também tem a

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3/47 vantagem da imunogenicidade geralmente insignificante quando injetada em um paciente humano. Um composto com uma imunogenicidade apreciável pode causar a produção de anticorpos contra ele, o que pode resultar em uma reação anafilática e/ou no desenvolvimento de resistência ao fármaco, com a doença ou o distúrbio a ser tratado desse modo tornando-se potencialmente resistente à composição farmacêutica que tem um componente imunogênico.

[0008] A albumina recombinante foi proposta como um estabilizador em uma composição farmacêutica de toxina botulínica. Assim, o pedido de patente U.S. publicado número 2003 0118598 (Hunt) descreve os usos de diversos excipientes, tais como uma albumina recombinante, o colágeno ou um amido, para estabilizar uma toxina botulínica presente em uma composição farmacêutica.

[0009] O colágeno é a proteína mais abundante nos mamíferos, compreendendo cerca de um quarto de toda a proteína no corpo e é o constituinte principal dos tecidos conjuntivos, tais como a pele, os ligamentos e os tendões. O colágeno nativo é uma hélice tripla de três proteínas de altos pesos moleculares. Cada uma das três cadeias proteicas que compreendem a hélice do colágeno tem mais do que 1400 aminoácidos. Pelo menos vinte e cinco tipos distintos de colágenos foram identificados em seres humanos.

[0010] O colágeno tem sido usado cosmeticamente como um material de enchimento para o tratamento de problemas de contorno da pele, tais como suavizar os sulcos da linha do sorriso e as linhas de franzimento, as dobras entre as sobrancelhas, as rugas nos cantos dos olhos e as rugas verticais acima e abaixo dos lábios. O colágeno é também útil na suavização de certas cicatrizes traumáticas pós-cirúrgicas ou de acne e marcas de pústulas virais, tais como as marcas de catapora. Para tais propósitos, o colágeno é injetado na pele para elevar a pele.

[0011] A gelatina pode ser obtida pela hidrólise do colágeno. A gelatina tem sido usada em algumas composições farmacêuticas de ingredientes ativos protéicos como um substituto da albumina. Notavelmente, a gelatina é uma proteína derivada de animal e, portanto, carrega o mesmo risco de infetuosidade potencial que pode ser possuída pelo soro albumina humana. A patente chinesa CN 1215084 discute uma toxina botulínica sem albumina tipo A, formulada com gelatina nativa (um hidrolisado de colágeno), uma proteína derivada de animal,

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4/47 dextrano e sacarose. A patente U. S. número 6.087.327 também descreve uma composição de toxina botulínica tipos A e B formulada com gelatina nativa.

[0012] Infelizmente, apesar de seus efeitos estabilizadores conhecidos, existem desvantagens significativas para o uso de excipientes proteicos, tais como a albumina ou a gelatina, em uma composição farmacêutica. Por exemplo, a albumina e a gelatina são onerosas e cada vez mais difíceis de obter. Além disso, os produtos sanguíneos ou os produtos derivados de animais, tais como a albumina e a gelatina, quando administrados a um paciente, podem submeter o paciente a um risco potencial de receber patógenos contidos no sangue ou agentes infecciosos. Assim, sabe-se que existe a possibilidade que a presença de um excipiente proteico derivado de animal em uma composição farmacêutica possa resultar na incorporação descuidada de elementos infecciosos na composição farmacêutica. Por exemplo, foi descrito que o uso de soro albumina humana pode transmitir priônios para uma composição farmacêutica. Um priônio é uma partícula infecciosa proteinácea que é concluída por hipótese surgir como uma isoforma conformacional anormal a partir da mesma sequência de ácidos nucléicos que produz a proteína normal. Foi adicionalmente concluído por hipótese que a infectuosidade reside em uma reação de recrutamento da proteína de isoforma normal com a isoforma de proteína de priônio em um nível pós-traducional. Aparentemente, a proteína celular endógena normal é induzida a uma duplicação incorreta em uma conformação de priônio patogênica.

[0013] Assim, é desejável encontrar um excipiente adequado que possa ser usado para estabilizar a toxina botulínica presente em uma composição farmacêutica de toxina botulínica. De preferência, o estabilizador de toxina botulínica não é uma proteína derivada de uma fonte de animal (isto é, mamífero).

Toxina botulínica [0014] O gênero Clostridium tem mais do que cento e vinte e sete espécies agrupadas por morfologia e função. A bactéria gram-positiva, anaeróbica, Clostridium botulinum, produz uma neurotoxina polipeptídica potente, a toxina botulínica, que causa uma doença neuroparalítica em seres humanos e animais, referida como botulismo. O Clostridium botulinum e os seus esporos são comumente encontrados no solo e a bactéria pode desenvolver-se em

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5/47 recipientes alimentícios inadequadamente esterilizados e vedados de fábricas de enlatados de base doméstica, que são a causa de muitos dos casos de botulismo. Os efeitos do botulismo tipicamente aparecem 18 a 36 horas após comer os gêneros alimentícios infectados com uma cultura de Clostridium botulinum ou esporos. A toxina botulínica pode aparentemente passar não atenuada através do revestimento do intestino e atacar os neurônios motores periféricos. Os sintomas de intoxicação por toxina botulínica podem progredir de dificuldade de andar, engolir, e falar até a paralisa dos músculos respiratórios e a morte.

[0015] A toxina botulínica tipo A é o agente biológico natural mais letal conhecido para o homem. Aproximadamente 50 picogramas de toxina botulínica (complexo de neurotoxina purificado) tipo A são uma LDso em camundongos. De modo interessante, em uma base molar, a toxina botulínica tipo A é 1,8 bilhão de vezes mais letal do que a difteria, 600 milhões de vezes mais letal do que o cianeto de sódio, 30 milhões de vezes mais letal do que a cobrotoxina e 12 milhões de vezes mais letal do que o cólera. Singh, Criticai Aspects of Bacterial Protein Toxins, páginas 63-84 (capítulo 4) de Natural Toxins II, editado por B.R. Singh et al., Plenum Press, Nova York (1976) (onde a LD50 estabelecida da toxina botulínica tipo A de 0,3 ng é igual a 1 U é corrigida pelo fato de que cerca de 0,05 ng de BOTOX® é igual a 1 unidade). Uma unidade (U) de toxina botulínica é definida como a LDso com a injeção intraperitoneal em camundongos fêmeas Swiss Webster pesando 18-20 gramas, cada. Em outras palavras, uma unidade de toxina botulínica é a quantidade de toxina botulínica que mata 50% de um grupo de camundongos fêmeas Swiss Webster. Sete neurotoxinas botulínicas em geral imunologicamente distintas foram caracterizadas, essas sendo respectivamente a neurotoxina botulínica sorotipos A, B, C1, D, E, F, e G, cada uma das quais é distinguida por neutralização com anticorpos específicos para o tipo. Os diferentes sorotipos de toxina botulínica variam nas espécies de animais que eles afetam e na gravidade e na duração da paralisia que eles provocam. Por exemplo, foi determinado que a toxina botulínica tipo A é 500 vezes mais potente, como medido pela taxa de paralisia produzida no rato, do que é a toxina botulínica tipo B. Adicionalmente, a toxina botulínica tipo B foi determinada ser não tóxica em primatas em uma dose de 480 U/kg, que é cerca de 12 vezes a LDso em primata para a toxina botulínica

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6/47 tipo A. As toxinas botulínicas aparentemente ligam-se com alta afinidade aos neurônios motores colinérgicos, são translocadas no neurônio e bloqueiam a liberação pré-sináptica de acetilcolina.

[0016] As toxinas botulínicas têm sido usadas em indicações clínicas para o tratamento de distúrbios neuromusculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperativos. A toxina botulínica tipo A foi aprovada pela U.S. Food and Drug Administration, em 1989, para o tratamento de blefaroespasmo essencial, estrabismo e espasmo hemifacial em pacientes acima da idade de doze anos. Os efeitos clínicos da injeção periférica (isto é, intramuscular ou subcutânea) da toxina botulínica tipo A são normalmente vistos dentro de uma semana da injeção, e freqüentemente dentro de algumas horas após a injeção. A duração típica do alívio sintomático (isto é, paralisia do músculo flácido) a partir de uma única injeção intramuscular de toxina botulínica pode ser cerca de três meses a cerca de seis meses.

[0017] Embora todos os sorotipos de toxinas botulínicas aparentemente inibam a liberação da acetilcolina neurotransmissora na junção neuromuscular, eles assim o fazem afetando diferentes proteínas neurossecretoras e/ou clivando essas proteínas em diferentes locais. A toxina botulínica A é uma zinco endopeptidase que pode hidrolisar especificamente uma ligação peptídica da proteína associada à vesícula, intracelular, SNAP-25. O tipo E botulínico também cliva a proteína associada sinaptossômica de 25 quiloDaltons (kD) (SNAP-25), porém alveja diferentes sequências de aminoácidos dentro dessa proteína, em comparação com a toxina botulínica tipo A. A toxina botulínica tipos B, D, F e G atua sobre a proteína associada à vesícula (VAMP, também chamada sinaptobrevina), com cada sorotipo clivando a proteína em um local diferente. Finalmente, a toxina botulínica tipo C1 foi mostrada clivar tanto a sintaxina quanto a SNAP-25. Essas diferenças no mecanismo de ação podem afetar a potência relativa e/ou a duração de ação dos diversos sorotipos de toxina botulínica.

[0018] Independente do sorotipo, o mecanismo molecular de intoxicação por toxina parece ser similar e envolver pelo menos três etapas ou estágios. Na primeira etapa do processo, a toxina se liga à membrana présináptica do neurônio-alvo através de uma interação específica entre a cadeia pesada (cadeia H) e um receptor da superfície celular; o receptor é acreditado

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7/47 ser diferente para cada sorotipo de toxina botulínica e para a toxina tetânica. O segmento de extremidade de carboxila da cadeia H, HC, parece ser importante para o alvejamento da toxina à superfície celular.

[0019] Na segunda etapa, a toxina cruza a membrana plasmática da célula envenenada. A toxina é primeiramente engolida pela célula através da endocitose mediada por receptor, e um endossoma contendo a toxina é formado. A toxina então escapa do endossoma para o citoplasma da célula. Essa última etapa é acreditada ser mediada pelo segmento de extremidade de amino da cadeia Η, HN, que desencadeia uma alteração conformacional da toxina em resposta a um pH de cerca de 5,5 ou menor. Os endossomas são sabidos possuírem uma bomba de prótons que diminui o pH intra-endossômico. A mudança conformacional expõe os resíduos hidrofóbicos na toxina, o que permite que a toxina se incruste na membrana endossômica. A toxina então transloca-se através da membrana endossômica para o citossol.

[0020] A última etapa do mecanismo de atividade da toxina botulínica parece envolver a redução da ligação de dissulfeto que une as cadeias H e L. A atividade tóxica inteira das toxinas botulínica e tetânica está contida na cadeia L da holotoxina; a cadeia L é uma zinco (Zn++) endopeptidase que seletivamente cliva as proteínas essenciais para o reconhecimento e o corte de vesículas contendo neurotransmissores com a superfície citoplásmica da membrana plasmática, e a fusão das vesículas com a membrana plasmática. A neurotoxina tetânica, a toxina botulínica B, D, F, e G causam a degradação da sinaptobrevina (também chamada proteína de membrana associada à vesícula (VAMP)), uma proteína de membrana sinaptossômica. A maioria da VAMP presente na superfície citosólica da vesícula sináptica é removida como um resultado de qualquer um desses eventos de divagem. Cada toxina cliva especificamente uma ligação diferente.

[0021] O peso molecular da molécula protéica de toxina botulínica, para todos os sete dos sorotipos conhecidos de toxina botulínica, é aproximadamente 150 kD. As toxinas botulínicas são liberadas pela bactéria clostrídica como complexos compreendendo a molécula protéica de toxina botulínica de 150 kD, juntamente com proteínas associadas que não são toxinas. Assim, o complexo de toxina botulínica tipo A pode ser produzido pela bactéria clostrídica como formas de 900 kD, 500 kD e 300 kD. Os tipos B e C1 de toxina

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8/47 botulínica são aparentemente produzidos como somente um complexo de 500 kD. O tipo D da toxina botulínica é produzido como complexos tanto de 300 kD, quanto de 500 kD. Finalmente, os tipos E e F de toxina botulínica são produzidos como somente complexos de aproximadamente 300 kD. Os complexos (isto é, peso molecular maior do que cerca de 150 kD) são acreditados conterem uma proteína de hemaglutinina que não é uma toxina e uma proteína que não é de hemaglutinina que não é uma toxina e não é tóxica. Essas duas proteínas que não são toxinas (as quais, juntamente com a molécula de toxina botulínica, podem compreender o complexo de neurotoxina relevante) podem atuar para proporcionar estabilidade contra a desnaturação para a molécula de toxina botulínica e proteção contra os ácidos digestivos quando a toxina for ingerida. Adicionalmente, é possível que os complexos de toxina botulínica maiores (mais do que cerca de 150 kD de peso molecular) possam resultar em uma taxa mais lenta de difusão da toxina botulínica para longe de um local de injeção intramuscular de um complexo de toxina botulínica. Os complexos de toxina podem ser dissociados em proteína de toxina e proteínas de hemaglutinina por tratamento do complexo com as células sanguíneas vermelhas em pH 7,3. A proteína de toxina tem uma instabilidade marcada com a remoção da proteína de hemaglutinina.

[0022] Todos os sorotipos de toxina botulínica são produzidos pelas bactérias Clostridium botulinum como proteínas inativas de cadeias individuais, as quais devem ser clivadas ou cortadas por proteases para tornarem-se neuroativas. As cepas bacterianas que produzem os sorotipos A e G de toxina botulínica possuem proteases endógenas e os sorotipos A e G podem, portanto, ser recuperados de culturas bacterianas predominantemente em sua forma ativa. Em contraste, os sorotipos C1, D, e E da toxina botulínica são sintetizados por cepas não proteolíticas e estão, portanto, tipicamente inativados quando recuperados da cultura. Os sorotipos B e F são produzidos por cepas proteolíticas e não proteolíticas e, portanto, podem ser recuperados na forma ativa ou inativa. Entretanto, mesmo as cepas proteolíticas que produzem, por exemplo, o sorotipo de toxina botulínica tipo B somente clivam uma porção da toxina produzida. A proporção exata de moléculas cortadas ou não cortadas depende da duração da incubação e da temperatura da cultura. Portanto, certa porcentagem de qualquer preparação da, por exemplo, toxina botulínica tipo B é

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9/47 provável de ser inativa, possivelmente sendo responsável pela potência significativamente menor conhecida da toxina botulínica tipo B em comparação com a toxina botulínica tipo A. A presença de moléculas de toxina botulínica inativas em uma preparação clínica contribuirá para a carga protéica global da preparação, que tenha sido ligada à antigenicidade aumentada, sem contribuir para a sua eficácia clínica. Adicionalmente, sabe-se que a toxina botulínica tipo B tem, com a injeção intramuscular, uma duração mais curta de atividade e é também menos potente do que a toxina botulínica tipo A, no mesmo nível de dose.

[0023] Os estudos in vitro indicaram que a toxina botulínica inibe a liberação induzida pelo cátion potássio tanto da acetilcolina quanto da norepinefrina a partir de culturas de células primárias do tecido do tronco cerebral. Adicionalmente, foi descrito que a toxina botulínica inibe a liberação provocada tanto da glicina quanto do glutamato em culturas primárias de neurônios do cordão espinhal e que a toxina botulínica de preparações de sinaptossoma do cérebro inibe a liberação de cada um dos neurotransmissores acetilcolina, dopamina, norepinefrina, CGRP e glutamato.

[0024] A toxina botulínica tipo A cristalina, de alta qualidade, pode ser produzida a partir da cepa Hall A de Clostridium botulinum com características de >3 X 10⁷ U/mg, um A260/A278 de menos do que 0,60 e um padrão distinto de banda sobre eletroforese em gel. O processo de Schantz conhecido pode ser usado para obter a toxina botulínica tipo A cristalina, como descrito em Schantz, E.J., et al., Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine, Microbiol Rev. 56: 80-99 (1992). Geralmente, o complexo de toxina botulínica tipo A pode ser isolado e purificado de uma fermentação anaeróbica por cultivo de Clostridium botulinum tipo A em um meio adequado. A toxina bruta pode ser coletada por precipitação com ácido sulfúrico e concentrada por ultramicrofiltração. A purificação pode ser realizada por dissolução do precipitado ácido em cloreto de cálcio. A toxina pode então ser precipitada com etanol gelado. O precipitado pode ser dissolvido em tampão de fosfato de sódio e centrifugado. Na secagem, pode então ser obtido um complexo de toxina botulínica tipo A cristalino de aproximadamente 900 kD, com uma potência específica de 3 X 10⁷ LD50 U/mg ou maior. Esse processo conhecido pode também ser usado, com a separação das proteínas que não são

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10/47 toxinas, para obter toxinas botulínicas puras, tais como, por exemplo: a toxina botulínica tipo A purificada, com um peso molecular de aproximadamente 150 kD, com uma potência específica de 1-2 X 10⁸ LDso U/mg ou mais; a toxina botulínica tipo B purificada, com um peso molecular de aproximadamente 156 kD, com uma potência específica de 1-2 X 10⁸ LDso U/mg ou maior, e; a toxina botulínica tipo F purificada, com um peso molecular de aproximadamente 155 kD, com uma potência específica de 1-2 X 10⁷ LDso U/mg ou maior.

[0025] As toxinas botulínicas e os complexos de toxinas podem ser obtidos a partir, por exemplo, da List Biological Laboratories, Inc., Campbell, Califórnia; do Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, U.K.; Wako (Osaka, Japão), bem como da Sigma Chemicals de St Louis, Missouri. As composições farmacêuticas contendo a toxina botulínica comercialmente disponíveis incluem ο ΒΟΤΟΧ® (complexo de neurotoxina de toxina botulínica tipo A com soro albumina humana e cloreto de sódio), disponível da Allergan, Inc., de Irvine, Califórnia, em frascos pequenos de 100 unidades, como um pó liofilizado a ser reconstituído com cloreto de sódio a 0,9% antes do uso), o Dysport® (complexo de toxina de Clostridium botulinum tipo A hemaglutinina, com soro albumina humana e lactose na formulação), disponível da Ipsen Limited, Berkshire, U.K., como um pó a ser reconstituído com cloreto de sódio a 0,9% antes do uso), e o MyoBloc® (uma solução injetável compreendendo a toxina botulínica tipo B, a soro albumina humana, o succinato de sódio, e o cloreto de sódio em torno de pH 5,6, disponível da Solstice Neurosciences, Inc., South San Francisco, Califórnia).

[0026] O sucesso da toxina botulínica tipo A em tratar uma variedade de condições clínicas resultou no interesse em outros sorotipos de toxina botulínica. Adicionalmente, a toxina botulínica pura tem sido usada para tratar seres humanos. Vide, por exemplo, Kohl A., etal., Comparison ofthe effect of botulinum toxin A (Botox (R)) with the highly-purified neurotoxin (NT 201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000; 15 (Supl. 3):165. Portanto, uma composição farmacêutica pode ser preparada usando uma toxina botulínica pura.

[0027] Sabe-se que a toxina botulínica tipo A é solúvel em soluções aquosas diluídas em pH 4-6,8. Em pH acima de cerca de 7, as proteínas não tóxicas estabilizadoras dissociam-se da neurotoxina, resultando em uma perda

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11/47 gradual de toxicidade, particularmente à medida que o pH e a temperatura elevam-se. Schantz E.J., et al., Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment (em particular as páginas 44-45), sendo o capítulo 3 de Jankovic, J., et al., Therapy with Botulinum Toxin, Marcei Dekker, lnc(1994).

[0028] A patente europeia EP 1112082 (Stable liquid formulations of botulinum toxin), expedida em 31 de julho de 2002, reivindica uma formulação farmacêutica líquida estável de toxina botulínica compreendendo um tampão (pH

5-6) e uma toxina botulínica, onde a formulação de toxina é estável como um líquido por pelo menos um ano em temperaturas entre 0-10°Cou pelo menos 6 meses em temperaturas entre 10e30°C. Tal formulação farmacêutica de toxina botulínica (uma sua modalidade sendo vendida comercialmente sob a marca de fábrica MyoBloc® ou NeuroBloc® pela Solstice Neurosciences, Inc., de San Diego, Califórnia) é preparada como uma solução líquida (nenhuma liofilização ou secagem a vácuo é efetuada), a qual não requer reconstituição antes do uso.

[0029] A patente U.S. 5.512.547 (Johnson et al.), intitulada Pharmaceutical Composition of Botulinum Neurotoxin and Method of Preparation, expedida em 30 de abril de 1996, reivindica uma formulação botulínica tipo A pura compreendendo albumina e trealose, estável na armazenagem a 37°graus C.

[0030] A patente U.S. 5.756.468 (Johnson et al.), expedida em 26 de maio de 1998 (Pharmaceutical Compositions of Botulinum Toxin or Botulinum Neurotoxin and Method of Preparation), reivindica uma formulação de toxina botulínica liofilizada compreendendo uma tioalquila, albumina e trealose, que pode ser armazenada entre 25°C e 42°C.

[0031] A patente U.S. 5.696.077 (Johnson et al.), intitulada Pharmaceutical Composition Containing Botulinum B Complex, expedida em 9 de dezembro de 1997, reivindica uma formação de complexo botulínico tipo B sem cloreto de sódio, liofilizado, compreendendo um complexo de tipo B e um excipiente proteico.

[0032] Goodnough M.C., et al., Stabilization of botulinum toxin type A during lyophilization, Appl Environ Microbiol 1992; 58(10):3426-3428, e;

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Goodnouth M.C., etal., Recovery of type-A botulinal toxin following lyophilization, Acs Symposium Series 1994;567(-): 193-203, descrevem.

[0033] O pedido de patente chinês CN 1215084A discute uma toxina botulínica tipo A sem albumina, formulada com gelatina, uma proteína derivada de animal. A patente U. S. número 6.087.327 também descreve uma composição de toxina botulínica tipos A e B formulada com gelatina. Essas formulações, portanto, não eliminam o risco de transmitir um elemento infeccioso derivado de, ou que acompanha, uma proteína animal.

[0034] Foi descrito que a BoNt/A tem sido usada em diversas indicações clínicas, incluindo como a seguir:

(1) cerca de 75-125 unidades de BOTOX®¹ por injeção intramuscular (múltiplos músculos) para tratar a distonia cervical;

(2) 5-10 unidades de BOTOX® por injeção intramuscular para tratar linhas da glabela (sulcos do supercílio) (5 unidades injetadas intramuscularmente no músculo prócero e 10 unidades injetadas intramuscularmente em cada músculo corrugador do supercílio);

(3) cerca de 30-80 unidades de BOTOX® para tratar constipação por injeção intra-esfíncter do músculo puborretal;

(4) cerca de 1-5 unidades por músculo de BOTOX® injetado intramuscularmente, para tratar blefaroespasmo, por injeção do músculo orbicular pré-társico lateral do olho da pálpebra superior e o orbicular pré-társico lateral do olho da pálpebra inferior.

(5) para tratar estrabismo, os músculos extra-oculares têm sido injetados intramuscularmente com entre cerca de 1-5 unidades de BOTOX®, a quantidade injetada variando com base tanto no tamanho do músculo a ser injetado, quanto no grau de paralisia muscular desejada (isto é, a quantidade de correção da dioptria desejada).

(6) para tratar espasticidade do membro superior após acidente vascular cerebral, por injeções intramusculares de BOTOX® nos cinco diferentes músculos flexores dos membros superiores, como se segue:

(a) flexor profundo dos dedos: 7.5 U a 30 U (b) flexor superficial dos dedos: 7,5 U a 30 U ¹ Disponível da Allergan, Inc, de Irvine, Califórnia, sob o nome comercial BOTOX®.

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13/47 (c) flexor ulnar do punho: 10 U a 40 U (d) flexor radial do punho: 15 U a 60 U (e) bíceps do braço: 50 U a 200 U. Cada um dos cinco músculos indicados foi injetado na mesma sessão de tratamento, de modo que o paciente receba de 90 U a 360 U de BOTOX® nos músculos flexores dos membros superiores por injeção intramuscular em cada sessão de tratamento.

(7) para tratar enxaqueca, uma injeção injetada pericranial (injetada simetricamente nos músculos da glabela, frontal e temporal) de 25 U de BOTOX® mostrou benefício significativo como um tratamento profilático de enxaqueca, comparado ao veículo, conforme medido pelos graus diminuídos de freqüência da enxaqueca, gravidade máxima, vômito associado e uso agudo de medicação, durante o período de três meses após a injeção de 25 U.

[0035] Sabe-se que a toxina botulínica tipo A pode ter uma eficácia por até 12 meses (European J. Neurology 6 (Sup. 4):S111-S1150:1999), e, em algumas circunstâncias, por tanto quanto 27 meses. The Laryngoscope 109:1344-1346:1999. Entretanto, a duração comum de uma injeção intramuscular de Botox® é tipicamente cerca de 3 a 4 meses.

[0036] O sucesso da toxina botulínica tipo A em tratar uma variedade de condições clínicas resultou no interesse em outros sorotipos de toxina botulínica. Adicionalmente, a toxina botulínica pura tem sido usada em seres humanos. Vide, por exemplo, Kohl A., et al., Comparison ofthe effect of botulinum toxin A (Botox (R)) with the highly-purified neurotoxin (NT 201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000; 15 (Supl. 3):165. Portanto, uma composição farmacêutica pode ser preparada usando uma toxina botulínica pura.

[0037] A molécula de toxina botulínica (cerca de 150 kDa), bem como os complexos de toxina botulínica (cerca de 300-900 kDa), tais como o complexo de toxina tipo A, são também extremamente suscetíveis à desnaturação devido a desnaturação da superfície, calor, e condições alcalinas. A toxina inativada forma proteínas toxóides, as quais podem ser imunogênicas. Os anticorpos resultantes podem tomar um paciente resistente à injeção de toxina.

[0038] Como com as enzimas em geral, as atividades biológicas das toxinas botulínicas (que são peptidases intracelulares) são dependentes,

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14/47 pelo menos em parte, de sua conformação tridimensional. Assim, a toxina botulínica tipo A é destoxificada por calor, diversas substâncias químicas que estendem a superfície e secam a superfície. Adicionalmente, sabe-se que a diluição do complexo de toxina obtido pelo cultivo, pela fermentação e pela purificação conhecidos até concentrações de toxina muito, muito menores, usadas para a formulação da composição farmacêutica, resulta na destoxificação rápida da toxina, a não ser que um agente estabilizador adequado esteja presente. A diluição da toxina a partir de quantidades de miligramas até uma solução contendo nanogramas por mililitro apresenta dificuldades significativas por causa da rápida perda de toxicidade específica em tal grande diluição. Visto que a toxina pode ser usada meses ou anos após a composição farmacêutica contendo toxina ser formulada, a toxina deve ser estabilizada com um agente estabilizador. Até o momento, o único agente estabilizador bemsucedido para esse propósito tem sido as proteínas derivadas de animais, soro albumina humana e gelatina.

[0039] Uma composição farmacêutica contendo toxina botulínica comercialmente disponível é vendida sob a marca comercial BOTOX® (disponível da Allergan, Inc., de Irvine, Califórnia). O BOTOX® consiste em um complexo de toxina botulínica tipo A purificado, soro albumina humana, e cloreto de sódio, acondicionados na forma secada a vácuo, estéril. A toxina botulínica tipo A é feita a partir de uma cultura da cepa Hall de Clostridium botulinum, desenvolvida em um meio contendo N-Z amina e extrato de levedura. O complexo de toxina botulínica tipo A é purificado da solução de cultura por uma série de precipitações ácidas até um complexo cristalino consistindo na proteína de toxina de alto peso molecular ativa e uma proteína de hemaglutinina associada. O complexo cristalino é dissolvido novamente em uma solução contendo salina e albumina e filtrado estéril (0,2 mícron) antes da secagem a vácuo. O BOTOX® pode ser reconstituído com solução salina não conservada, estéril, antes da injeção intramuscular. Cada frasco pequeno de BOTOX®contém cerca de 100 unidades (U) de complexo de toxina tipo A de Clostridium botulinum, 0,5 miligrama de soro albumina humana e 0,9 miligrama de cloreto de sódio em uma forma secada à vácuo, estéril, sem um conservante.

[0040] Para reconstituir o BOTOX® secado a vácuo, a solução salina normal estéril, sem um conservante (injeção de Cloreto de Sódio a 0,9%),

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15/47 é usada por preparação da quantidade adequada de diluente na seringa de tamanho apropriado. Visto que o BOTOX® é desnaturado por borbulhamento ou agitação violenta similar, o diluente é suavemente injetado no frasco pequeno. Por razões de esterilidade, o BOTOX® deve ser administrado dentro de quatro horas após a reconstituição. Durante esse período de tempo, o BOTOX® reconstituído é armazenado em um refrigerador (2^o a 8°C). O BOTOX® reconstituído é claro, incolor e isento de matéria particulada. O produto secado a vácuo é armazenado em um freezer a, ou abaixo de, -5°C.

[0041] Foi descrito que uma alternativa adequada para a soro albumina humana como um estabilizador de toxina botulínica pode ser uma outra proteína ou, alternativamente, um composto de baixo peso molecular (que não seja uma proteína). Carpender et al., Interactions of Stabilizing Additives with Proteins During Freeze-Thawing andFreeze-Drying, International Symposium on Biological Product Freeze-Drying and Formulation, 24-26 de outubro de 1990; Karger (1992), 225-239.

[0042] Muitas substâncias comumente usadas como veículos e agentes de massa nas composições farmacêuticas provaram ser inadequadas, como excipientes que não sejam de proteínas, para estabilizar a toxina botulínica presente em uma composição farmacêutica. Por exemplo, o dissacarídeo celobiose foi verificado ser inadequado como um estabilizador de toxina botulínica. Assim, sabe-se que o uso de celobiose como um excipiente, em conjunção com a albumina e o cloreto de sódio, resulta em um nível muito menor de toxicidade (10% de recuperação) após a liofilização da toxina botulínica tipo A cristalina com esses excipientes, em comparação com a toxicidade após a liofilização com somente a soro albumina humana (>75% a >90% de recuperação). Goodnough et al., Stabilization of Botulinum Toxin TypeA During Lyophilization, App & Envir. Micro. 58 (10) 3426-3428 (1992).

[0043] Além disso, os sacarídeos, incluindo os polissacarídeos, são, em geral, candidatos insatisfatórios para servir como estabilizadores de proteínas. Assim, sabe-se que uma composição farmacêutica contendo um ingrediente ativo de proteína é inerentemente instável se a formulação de proteína compreender um sacarídeo (tal como a glicose ou um polímero de glicose) ou carboidratos, porque as proteínas e a glicose são sabidas interagirem conjuntamente e sofrerem a reação de Maillard bem descrita, devido à natureza

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16/47 redutora da glicose e dos polímeros de glicose. Muito trabalho tem sido dedicado a tentativas, na maioria das vezes malsucedidas, na prevenção dessa reação entre proteína-sacarídeo através de, por exemplo, redução da umidade ou uso de açúcares não redutores. De modo significativo, a via de degradação da reação de Maillard pode resultar em uma insuficiência terapêutica do ingrediente ativo proteico. Uma formulação farmacêutica compreendendo proteína e um sacarídeo, carboidrato ou açúcar redutor, tal como um polímero de glicose, é, portanto, inerentemente instável e não pode ser armazenada por um período de tempo longo, sem perda significativa da atividade biológica desejada da proteína ingrediente ativo.

[0044] Os polissacarídeos de altos pesos moleculares (amidos) particulares, tais como o hetaamido, têm sido propostos como estabilizadores da toxina botulínica presente em uma composição farmacêutica de toxina botulínica. Vide, por exemplo, a patente europeia EP 1 253 932, expedida em 27 de abril de 2005.

[0045] Notavelmente, uma das razões que a albumina ou a gelatina pode funcionar efetivamente como um estabilizador de um ingrediente ativo proteico, em uma composição farmacêutica, é porque, sendo proteínas, esses estabilizadores não sofrem a reação de Maillard com o ingrediente ativo proteico em uma composição farmacêutica. Portanto, esperar-se-ia encontrar e procurar um substituto para esses excipientes proteicos usados para estabilizar a toxina botulínica presente em uma composição farmacêutica de toxina botulínica entre outras proteínas.

[0046] As características únicas da toxina botulínica e a sua formulação em uma composição farmacêutica adequada obrigam e atrapalham e tornam problemática a busca por uma substituição por um estabilizador proteico em uma formulação farmacêutica contendo toxina botulínica. Seguem exemplos de quatro dessas características únicas.

[0047] Primeiramente, a toxina botulínica é uma proteína relativamente grande para a incorporação em uma formulação farmacêutica (o peso molecular do complexo de toxina botulínica tipo A é 900 kD) e é, portanto, inerentemente frágil e instável. O tamanho do complexo de toxina a torna muito mais friável e instável do que as proteínas menos complexas, menores, desse modo a mistura da formulação e as dificuldades de manuseio, se a estabilidade

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17/47 da toxina for para ser mantida. Portanto, um estabilizador de toxina botulínica deve ser capaz de interagir com a toxina em um modo que não desnature, fragmente ou, de outro modo, destoxifique a molécula de toxina ou cause dissociação das proteínas que não sejam toxinas presentes no complexo de toxina.

[0048] Em segundo lugar, como o produto biológico conhecido mais letal, uma segurança, uma precisão, e uma exatidão excepcionais são requeridas em todas as etapas da formulação de uma composição farmacêutica contendo toxina botulínica. Assim, um estabilizador de toxina botulínica não deve, ele próprio, ser tóxico ou difícil de manusear, de modo a não exacerbar as exigências já extremamente severas da formulação de composição farmacêutica contendo toxina botulínica.

[0049] Em terceiro lugar, visto que a toxina botulínica foi a primeira toxina microbiana a ser aprovada (pela FDA em 1989) para injeção para o tratamento de doença humana, protocolos específicos têm de ser desenvolvidos e aprovados para o cultivo, a produção em massa, a formulação em uma substância farmacêutica e o uso da toxina botulínica. As considerações importantes são a pureza da toxina e a dose para a injeção. A produção por cultivo e a purificação devem ser realizadas de modo que a toxina não seja exposta a qualquer substância que poderia contaminar o produto final, em quantidades mesmo mínimas, e causar reações indevidas no paciente. Essas restrições requerem cultivo em meio simplificado, sem o uso de produtos de carne animal, e purificação por procedimentos que não envolvam solventes ou resinas sintéticas. A preparação da toxina usando enzimas, diversos trocadores, tais como aqueles presentes em colunas de cromatografia, e solventes sintéticos pode introduzir contaminantes e está, portanto, excluída das etapas preferidas de formulação. Além disso, a toxina botulínica tipo A é rapidamente desnaturada em temperaturas acima de 40°C, perde a toxicidade quando bolhas se formam na interface ar/líquido, e desnatura na presença de nitrogênio ou dióxido de carbono.

[0050] Em quarto lugar, existem dificuldades particulares de estabilizar a toxina botulínica tipo A, porque o tipo A consiste em uma molécula de toxina de aproximadamente 150 kD em associação não covalente com as proteínas que não são toxinas pesando cerca de 750 kD. As proteínas que não

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18/47 são toxinas são acreditadas conservar ou auxiliar a estabilizar as estruturas secundárias e terciárias das quais a toxicidade é dependente. Os procedimentos ou os protocolos aplicáveis à estabilização com não-proteínas ou às proteínas relativamente menores não são aplicáveis aos problemas inerentes com a estabilização dos complexos de toxina botulínica, tais como o complexo de toxina botulínica tipo A de 900 kD. Assim, embora a partir do pH 3,5 até 6,8 a toxina tipo A e as proteínas que não são toxinas sejam ligadas conjuntamente, de modo não covalente, sob condições ligeiramente alcalinas (pH > 7,1), a toxina muito instável é liberada do complexo de toxina. Conforme estabelecido anteriormente, a toxina botulínica pura (isto é, a molécula de 150 kD) foi proposta como o ingrediente ativo em uma composição farmacêutica.

[0051] Levando em consideração a natureza única da toxina botulínica e as exigências apresentadas acima, a probabilidade de encontrar um estabilizador que não seja proteico, adequado, para os estabilizadores de proteínas usados nas composições farmacêuticas contendo toxina botulínica deve realisticamente ser vista aproximar-se de zero. Antes da presente invenção, somente as proteínas derivadas de animais, a soro albumina humana e a gelatina, eram sabidas terem utilidade como estabilizadores adequados da toxina botulínica presente em uma formulação farmacêutica. Assim, sabe-se que a albumina, sozinha ou com uma ou mais substâncias adicionais, tais como o fosfato de sódio ou o citrato de sódio, permite alta recuperação de toxicidade da toxina botulínica tipo A após a liofilização. Infelizmente, como já descrito, a soro albumina humana, como um produto sanguíneo reunido, pode, pelo menos potencialmente, carregar elementos infecciosos ou que causam doenças, quando presente em uma composição farmacêutica. De fato, qualquer produto ou proteína animal, tal como a soro albumina humana ou a gelatina, pode também potencialmente conter pirogênios ou outras substâncias que podem causar reações adversas na injeção em um paciente.

[0052] O que é necessário, portanto, é uma composição farmacêutica de toxina clostrídica, onde a toxina clostrídica (tal como uma toxina botulínica) é estabilizada por um excipiente que não seja uma proteína. Sumário [0053] A presente invenção atende essa necessidade e proporciona uma composição farmacêutica de toxina botulínica que é estabilizada por um

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19/47 excipiente que não é uma proteína.

Definições [0054] Conforme usadas nesse documento, as palavras ou os termos apresentados abaixo têm as definições a seguir.

[0055] Cerca de significa que o item, parâmetro ou termo assim qualificado inclui uma faixa de mais ou menos dez por cento acima e abaixo do valor do item, parâmetro ou termo estabelecido.

[0056] A administração ou administrar significa a etapa de dar (isto é, administrar) uma composição farmacêutica a um paciente. As composições farmacêuticas descritas nesse documento são administradas localmente através de, por exemplo, administração intramuscular (i.m.), intradérmica, subcutânea, administração intratecal, administração intraperitoneal (i.p.), rotas de administração tópicas (transdérmicas) e por implantação (isto é, de um dispositivo de liberação lenta, tal como um implante polimérico ou bomba miniosmótica).

[0057] Sem proteína animal significa a ausência de produtos ou compostos derivados do sangue, reunidos no sangue e outros produtos ou compostos derivados de animais. O animal significa um mamífero (tal como um ser humano), ave, réptil, peixe, inseto, aranha ou outra espécie animal. O animal exclui os microorganismos, tais como as bactérias. Assim, uma composição farmacêutica sem proteína animal, dentro do escopo dA invenção, pode incluir uma neurotoxina clostrídica. Por exemplo, uma composição farmacêutica sem proteína animal significa uma composição farmacêutica que está substancialmente livre, ou essencialmente livre, ou inteiramente livre, de uma albumina derivada do soro, gelatina e outras proteínas derivadas de animais, tais como as imunoglobulinas. Um exemplo de uma composição farmacêutica sem proteína animal é uma composição farmacêutica que compreende, ou a qual consiste em uma toxina botulínica (como o ingrediente ativo) e um polissacarídeo adequado como um estabilizador ou excipiente.

[0058]A toxina botulínica significa uma neurotoxina produzida por Clostridium botulinum, bem como uma toxina botulínica (ou a cadeia leve ou a cadeia pesada da mesma) feita de modo recombinante por uma espécie não clostrídica. A expressão toxina botulínica, como usada nesse documento, inclui os sorotipos de toxina botulínica A, B, C, D, E, F e G. A toxina botulínica, como

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20/47 usada nesse documento, também inclui tanto um complexo de toxina botulínica (isto é, os complexos de 300, 600 e 900 kDa), quanto a toxina botulínica purificada (isto é, cerca de 150 kDa). A toxina botulínica purificada é definida como uma toxina botulínica que é isolada, ou substancialmente isolada, das outras proteínas, incluindo as proteínas que formam um complexo de toxina botulínica. Uma toxina botulínica purificada pode ser mais do que 95% pura, e preferivelmente é mais do que 99% pura. As citotoxinas botulínicas C2 e C3, não sendo neurotoxinas, estão excluídas do escopo da presente invenção.

[0059] A neurotoxina clostrídica significa uma neurotoxina produzida a partir de, ou nativa a, uma bactéria clostrídica, tal como o Clostridium botulinum, o Clostridium butyricum ou o Clostridium beratti, bem como uma neurotoxina clostrídica feita de modo recombinante por uma espécie não clostrídica.

[0060]lnteiramente livre (isto é, a terminologia consistindo em) significa que, dentro da faixa de detecção do instrumento ou do processo que está sendo usado, a substância não pode ser detectada ou a sua presença não pode ser confirmada.

[0061]Essencial mente livre (ou consistindo essencial mente em) significa que somente quantidades mínimas da substância podem ser detectadas.

[0062] Uma toxina botulínica modificada significa uma toxina botulínica que tenha tido pelo menos um de seus aminoácidos removido, modificado, ou substituído, em comparação com uma toxina botulínica nativa. Adicionalmente, a toxina botulínica modificada pode ser uma neurotoxina produzida de modo recombinante, ou um derivado ou fragmento de uma neurotoxina preparada de modo recombinante. Uma toxina botulínica modificada conserva pelo menos uma atividade biológica da toxina botulínica nativa, tal como, a capacidade de ligar-se a um receptor de toxina botulínica, ou a capacidade de inibir a liberação do neurotransmissor a partir de um neurônio. Um exemplo de uma toxina botulínica modificada é uma toxina botulínica que tenha uma cadeia leve a partir de um sorotipo de toxina botulínica (tal como o sorotipo A), e uma cadeia pesada a partir de um sorotipo diferente de toxina botulínica (tal como o sorotipo B). Um outro exemplo de uma toxina botulínica modificada é uma toxina botulínica acoplada a um neurotransmissor, tal como a substância P.

[0063] A composição farmacêutica significa uma formulação na qual um

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21/47 ingrediente ativo pode ser uma neurotoxina clostrídica, tal como uma toxina botulínica. A palavra formulação significa que há pelo menos um ingrediente adicional na composição farmacêutica, além de um ingrediente ativo de neurotoxina clostrídica. Uma composição farmacêutica é, portanto, uma formulação que é adequada para a administração diagnostica ou terapêutica (isto é, por injeção intramuscular ou subcutânea ou por inserção de um depósito ou implante) a um paciente, tal como um paciente humano. A composição farmacêutica pode estar: em uma condição liofilizada ou secada a vácuo; uma solução formada após a reconstituição da composição farmacêutica liofilizada ou secada a vácuo com solução salina ou água, ou: como uma solução que não requer reconstituição. O ingrediente ativo de neurotoxina pode ser um dos sorotipos da toxina botulínica A, B, Ci, D, E, F ou G ou uma toxina tetânica, todos os quais podem ser feitos nativamente pelas bactérias clostrídicas. Conforme estabelecido, uma composição farmacêutica pode ser líquida ou sólida, por exemplo, secada a vácuo. Os ingredientes constituintes de uma composição farmacêutica podem ser incluídos em uma única composição (ou seja, todos os ingredientes constituintes, exceto por qualquer fluido de reconstituição requerido, estão presentes na hora da combinação inicial da composição farmacêutica) ou como um sistema de dois componentes, por exemplo, uma composição secada a vácuo, reconstituída com um diluente, tal como solução salina, diluente este que contém um ingrediente não presente na combinação inicial da composição farmacêutica. Um sistema de dois componentes proporciona o benefício de permitir a incorporação de ingredientes que não sejam suficientemente compatíveis, durante a armazenagem em prateleira de longa duração, com o primeiro componente do sistema de dois componentes. Por exemplo, o veículo ou o diluente de reconstituição pode incluir um conservante que proporcione proteção adequada contra o crescimento microbiano durante o período de uso, por exemplo, uma semana de armazenagem refrigerada, porém não esteja presente durante o período de armazenagem em freezer por dois anos, durante cujo tempo ele poderia degradar a toxina. Outros ingredientes, os quais podem não ser compatíveis com uma toxina clostrídica ou com outros ingredientes por períodos longos de tempo, podem ser incorporados nessa maneira; ou seja, adicionados em um segundo veículo (isto é, o fluido de reconstituição) no tempo aproximado de uso.

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22/47 [0064] O estabilizador (ou estabilizador primário) é um agente químico que auxilia a conservar ou manter a estrutura biológica (isto é, a conformação tridimensional) e/ou a atividade biológica de uma proteína (tal como uma neurotoxina clostrídica, tal como uma toxina botulínica). Os estabilizadores usados nesse documento não são proteínas. O estabilizador primário pode ser um agente sintético que não produziria uma resposta imunogênica (ou produz uma resposta imune atenuada) em um paciente que recebesse uma composição contendo o estabilizador primário. Estabilizadores adicionais podem também ser incluídos em uma composição farmacêutica. Esses estabilizadores adicionais ou secundários podem ser usados sozinhos ou em combinação com os estabilizadores primários. Os estabilizadores secundários ilustrativos incluem, porém não estão limitados aos derivados de aminoácidos não oxidantes (tais como um derivado de triptofano, tal como o N-acetil-triptofano (NAT)), caprilato (isto é, o caprilato de sódio), um polissorbato (isto é, ο P80), aminoácidos, e cátions de metais divalentes, tais como o zinco. Uma composição farmacêutica pode também incluir agentes conservantes, tais como o álcool benzílico, o ácido benzóico, o fenol, os parabenos e o ácido sórbico.

[0065] Estabilizando, estabiliza ou estabilização significa que um ingrediente ativo farmacêutico (PAI) conserva pelo menos 20% e até 100% de sua atividade biológica (que pode ser avaliada como potência ou como toxicidade por uma medida de LDso ou EDso in vivo), na presença de um composto que está estabilizando, estabiliza ou que proporciona estabilização ao PAI. Por exemplo, na (1) preparação de diluições em série a partir de uma solução em massa ou de estoque, ou (2) na reconstituição com solução salina ou água de uma composição farmacêutica contendo toxina botulínica liofilizada, ou secada a vácuo, que tenha sido armazenada em, ou abaixo de, cerca de 2°C, por entre seis meses e quatro anos, ou (3) para uma composição farmacêutica contendo toxina botulínica em solução aquosa que tenha sido armazenada entre cerca de 2^o e cerca de 8°C, por de seis meses até quatro anos, a toxina botulínica presente na composição farmacêutica reconstituída ou em solução aquosa tem (na presença de um composto que esteja estabilizando, estabilize ou que proporcione estabilização ao PAI) mais do que cerca de 20% e até cerca de 100% da potência ou da toxicidade que a toxina botulínica biologicamente ativa tinha antes de ser incorporada na composição

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23/47 farmacêutica.

[0066] Substancialmente livre significa presente em um nível de menos do que um por cento em peso da composição farmacêutica.

[0067] Uma formulação terapêutica significa uma formulação que pode ser usada para tratar e, desse modo, aliviar um distúrbio ou uma doença, tal como um distúrbio ou uma doença caracterizada por hiperatividade (isto é, espasticidade) de um músculo periférico.

[0068] A toxina botulínica pode estar presente como um complexo de toxina botulínica (isto é, como um complexo de aproximadamente 300 a cerca de 900 quiloDaltons, dependendo do sorotipo particular da toxina botulínica) ou a toxina botulínica pode estar presente como uma toxina botulínica pura ou purificada (isto é, como a molécula de toxina botulínica de cerca de 150 quiloDáltons).

[0069] As composições farmacêuticas descritas nesse documento podem ter um pH de entre cerca de 5 e 7,3, quando reconstituídas ou na injeção.

[0070] A invenção pode ser praticada utilizando uma composição que compreende uma toxina botulínica tipo A. Em outras modalidades da invenção, os métodos precedentes podem ser praticados com uma composição que compreende a toxina botulínica tipo B. Nas modalidades adicionais da invenção, os métodos podem ser praticados com uma composição que compreende uma pluralidade de sorotipos da toxina botulínica, tais como os sorotipos da toxina botulínica selecionados a partir do grupo que consiste nos sorotipos da toxina botulínica A, B, Ci, D, E, F e G. Em certas modalidades da invenção, as toxinas botulínicas purificadas podem ser usadas. Em outras modalidades, as toxinas botulínicas modificadas podem ser usadas.

[0071] Nas modalidades ainda adicionais da invenção, as composições usadas nos métodos precedentes podem ser administradas intramuscularmente ao paciente. Nas outras modalidades, as composições podem ser administradas de modo subcutâneo e/ou intratecal.

[0072] A invenção inclui uma composição farmacêutica compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica e uma polivinilpirrolidona. A toxina botulínica é uma toxina botulínica biologicamente ativa e a toxina botulínica é selecionada a partir do grupo que consiste nas toxinas botulínicas tipos A, B, C, D, E, F e G. De preferência, a

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24/47 toxina botulínica é uma toxina botulínica tipo A. Uma função da polivinilpirrolidona presente na composição farmacêutica é estabilizar a toxina botulínica.

[0073] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica, e entre cerca de 5 gramas e cerca de 20 gramas de uma polivinilpirrolidona para cada cerca de 100 unidades da toxina botulínica.

[0074] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipiente protéico, e uma polivinilpirrolidona, onde a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de 40% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

[0075] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipiente protéico, e uma polivinilpirrolidona, onde a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de 50% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

[0076] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipiente protéico, uma polivinilpirrolidona, e um dissacarídeo, onde a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de 40% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

[0077] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipiente protéico, uma polivinilpirrolidona, e um dissacarídeo, onde a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de 50% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

[0078] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipiente protéico, uma polivinilpirrolidona, e um dissacarídeo, onde a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de 60% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

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25/47 [0079] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipiente protéico, uma polivinilpirrolidona, e um dissacarídeo, onde a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de 70% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

[0080] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipiente protéico, uma polivinilpirrolidona, e um polietileno glicol, onde a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de 40% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

[0081] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipiente protéico, um composto selecionado a partir do grupo que consiste em um primeiro monossacarídeo, um primeiro dissacarídeo, um primeiro trissacarídeo, e um primeiro álcool feito por redução do primeiro monossacarídeo, e um composto selecionado a partir do grupo de compostos consistindo em um polietileno glicol, um segundo monossacarídeo, um segundo dissacarídeo, um segundo trissacarídeo, um metal, um segundo álcool, e um aminoácido, onde o segundo monossacarídeo, o segundo dissacarídeo e o segundo trissacarídeo são diferentes, respectivamente, do primeiro monossacarídeo, do primeiro dissacarídeo, e do primeiro trissacarídeo, onde a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de 40% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

[0082] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipiente protéico, um polietileno glicol, e um composto selecionado a partir do grupo de compostos consistindo em um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um metal, um álcool, e um aminoácido, onde a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de 20% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

[0083] A invenção também inclui uma composição farmacêutica

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26/47 compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipiente protéico, um polietileno glicol, e um composto selecionado a partir do grupo de compostos consistindo em um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um metal, um álcool, e um aminoácido, onde a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de 30% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

[0084] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipiente protéico, um polietileno glicol, e um composto selecionado a partir do grupo de compostos consistindo em um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um metal, um álcool, e um aminoácido, onde a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de 40% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

[0085] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipiente protéico, um polietileno glicol, e um composto selecionado a partir do grupo de compostos consistindo em um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um metal, um álcool, e um aminoácido, onde a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de 50% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

[0086] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipiente protéico, um polietileno glicol, e um composto selecionado a partir do grupo de compostos consistindo em um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um metal, um álcool, e um aminoácido, onde a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de 60% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

[0087] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo (ou consistindo em, ou consistindo essencialmente em) uma toxina botulínica, onde a toxina botulínica não é estabilizada por um excipiente

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27/47 protéico, um polietileno glicol, e um composto selecionado a partir do grupo de compostos consistindo em um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um metal, um álcool, e um aminoácido, onde a potência da toxina botulínica é pelo menos cerca de 70% da potência máxima teórica da toxina botulínica.

Descrição [0088] A presente invenção é baseada na descoberta que uma composição farmacêutica de toxina clostrídica, com uma toxina clostrídica estabilizada, pode ser feita usando um excipiente que não seja uma proteína como o estabilizador primário da toxina clostrídica.

[0089] Descobriu-se que uma substituição adequada para um excipiente protéico, tal como a albumina ou a gelatina, em uma composição farmacêutica de toxina clostrídica pode ser um composto que não seja uma proteína.

[0090] O excipiente que não é uma proteína, usado na presente invenção, pode conferir estabilidade a um ingrediente ativo de neurotoxina, tal como uma toxina botulínica, presente na composição farmacêutica, por: (1) redução da adesão (comumente referida como pegajosidade) da toxina botulínica às superfícies, tais como as superfícies de artigos de vidro de laboratórios, vasos, do frasco pequeno no qual a composição farmacêutica é reconstituída e a superfície de dentro da seringa usada para injetar a composição farmacêutica. A adesão da toxina botulínica às superfícies pode resultar em perda de toxina botulínica e na desnaturação da toxina botulínica retida, ambas as quais reduzem a toxicidade da toxina botulínica presente na composição farmacêutica, (2) redução da desnaturação da toxina botulínica e/ou da dissociação da toxina botulínica de outras proteínas que não sejam toxinas, presentes no complexo de toxina botulínica, cujas atividades de desnaturação e/ou de dissociação podem ocorrer por causa da baixa diluição da toxina botulínica presente na composição farmacêutica (isto é, antes da liofilização ou da secagem a vácuo) e na composição farmacêutica reconstituída, (3) redução da perda de toxina botulínica (isto é, devida à desnaturação ou à dissociação de proteínas que não sejam toxinas no complexo) durante as mudanças consideráveis de pH e concentração que ocorrem durante a preparação, o processamento e a reconstituição da composição farmacêutica.

[0091] Os três tipos de estabilizações da toxina botulínica proporcionados

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28/47 pelos estabilizadores que não são de proteínas, descritos nesse documento, conservam e preservam a toxina botulínica com a sua toxicidade nativa antes da injeção da composição farmacêutica.

[0092] Em certas modalidades da invenção, as composições farmacêuticas da invenção podem compreender uma pluralidade de sorotipos da toxina botulínica. Em outras palavras, a composição pode incluir dois ou mais sorotipos diferentes da toxina botulínica. Por exemplo, uma composição pode incluir os sorotipos da toxina botulínica A e B. Em uma outra modalidade, uma composição pode incluir os sorotipos da toxina botulínica A e E. A utilização de uma combinação de sorotipos da toxina botulínica permitirá que os profissionais da saúde adaptem a composição, para atingir um efeito desejado com base na condição que está sendo tratada. Em uma modalidade adicional da invenção, a composição pode compreender uma toxina botulínica modificada. A toxina botulínica modificada preferencialmente inibirá a liberação de neurotransmissor de um neurônio, porém pode ter uma potência maior ou menor do que a toxina botulínica nativa, ou pode ter um efeito biológico maior ou menor do que a toxina botulínica nativa. Porque as composições da invenção podem ser usadas para o tratamento de animais com duração relativamente longa, as composições podem ser proporcionadas em uma forma relativamente pura. Em uma modalidade, as composições são de um grau farmacêutico. Em certas modalidades, a neurotoxina clostrídica tem uma pureza maior do que 95%. Nas modalidades adicionais, a neurotoxina clostrídica tem uma pureza maior do que 99%.

[0093] A invenção também inclui a adição de um conservante, no diluente ou na formulação propriamente dita, para permitir a armazenagem prolongada. Um conservante preferido é o álcool benzílico contendo solução salina conservada.

[0094] As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas usando modos convencionais de administração. Nas modalidades preferidas da invenção, as composições são administradas de modo intramuscular ou subcutâneo ao paciente. Em outras modalidades, as composições da invenção podem ser administradas de modo intratecal. Além disso, as composições da invenção podem ser administradas com um ou mais agentes analgésicos ou anestésicos.

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29/47 [0095] O modo mais efetivo de administração e regime de dosagem para as composições dessa invenção depende do tipo, da gravidade, e do curso da condição que está sendo tratada, da saúde e da resposta do animal ao tratamento, e do julgamento do médico que está tratando. Desse modo, os métodos e as dosagens das composições devem ser regulados para o paciente individual.

[0096] Como forma de exemplo, e não como forma de limitação, pode ser preferido administrar a composição da invenção intramuscularmente, para reduzir um espasmo muscular.

[0097] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo uma toxina botulínica e um colágeno, para uso para tratar uma variedade de condições, onde a toxina botulínica atua para paralisar um músculo e o colágeno atua para proporcionar um enchimento dérmico.

[0098] As composições que contêm outros sorotipos de toxina botulínica podem conter diferentes dosagens da toxina botulínica. Por exemplo, a toxina botulínica tipo B pode ser proporcionada em uma composição em uma dose maior do que uma composição contendo toxina botulínica tipo A. Em uma modalidade da invenção, a toxina botulínica tipo B pode ser administrada em uma quantidade entre cerca de 1 U/kg e 150 U/kg. A toxina botulínica tipo B pode também ser administrada em quantidades de até 20.000 U (unidades no camundongo, conforme descrito acima). Em uma outra modalidade da invenção, a toxina botulínica tipos E ou F pode ser administrada em concentrações entre cerca de 0,1 U/kg e 150 U/kg. Além disso, nas composições contendo mais do que um tipo de toxina botulínica, cada tipo de toxina botulínica pode ser proporcionado em uma dose relativamente menor do que a dose tipicamente usada para um sorotipo de toxina botulínica individual. A combinação de sorotipos de toxina botulínica pode então proporcionar um grau e uma duração de paralisia adequados, sem um aumento na difusão das neurotoxinas (por exemplo, vide a Patente U.S. No 6.087.327).

EXEMPLOS [0099] Os exemplos a seguir descrevem modalidades específicas da presente invenção e não são pretendidos para limitar o escopo da invenção.

[0100] Nos Exemplos abaixo, o ensaio de dose letalso em camundongo (o ensaio de MLD50) bem-conhecido foi usado para determinar a potência da

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30/47 toxina botulínica. Dependendo das circunstâncias, a potência pode significar a potência recuperada da toxina botulínica ou a potência da toxina botulínica antes da liofilização. A potência recuperada é sinônimo com a potência de reconstituição, a potência de recuperação e com a potência na reconstituição. O ensaio de MLD50 proporciona uma determinação da potência de uma toxina botulínica em termos de sua dose letal a 50% ou LD50 em camundongo. Assim, uma unidade (U) de uma toxina botulínica é definida como a quantidade de toxina botulínica que, na injeção intraperitoneal, mata 50% (isto é, uma LD50) de um grupo de camundongos fêmeas Swiss Weber, pesando 17-22 gramas cada um, no início do ensaio. O ensaio de MLD50 é um método validado para medir a potência de uma toxina botulínica reconstituída ou de uma formulação de toxina botulínica reconstituída. Cada camundongo é mantido em uma posição de costas com a sua cabeça inclinada para baixo e é injetado de modo intraperitoneal no abdômen direito inferior, em um ângulo de cerca de 30 graus, usando uma agulha de 0,95 cm a 1,59 cm (3/8 a 5/8), de escala 25 a 27 gauge, com uma das diversas diluições em série da toxina botulínica em solução salina normal. As taxas de morte durante as 72 horas seguintes, para cada diluição, são registradas. Prepara-se um mínimo de seis diluições em intervalos de dose de 1,33 e, tipicamente, dez animais são usados em cada grupo de dosagem (portanto, 60 camundongos empregados). Dois ensaios padrão de referência são realizados simultaneamente (60 camundongos adicionais empregados). As diluições são preparadas de modo que a diluição mais concentrada produza uma taxa de morte de pelo menos 80% dos camundongos injetados, e a diluição de menor concentração produza uma taxa de morte não maior do que 20% do camundongo injetado. Deve haver um mínimo de quatro diluições que incidam na faixa decrescente uniforme das taxas de morte. A faixa decrescente uniforme começa com uma taxa de morte de não menos do que 80%. Dentro das quatro ou mais taxas decrescentes uniformes, as duas taxas maiores e as duas menores devem ser decrescentes (isto é, não equivalentes). A diluição na qual 50% dos camundongos morrem dentro do período de observação de três dias após a injeção é definida como uma diluição que compreende uma unidade (1 U) da toxina botulínica. Um ensaio de MLD50 apurado foi desenvolvido, o qual utiliza poucas diluições (cinco em vez de seis), em intervalos de dose de 1,15, e poucos camundongos (seis em vez de dez) por diluição testada.

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Exemplo 1

Composição Farmacêutica de Toxina Botulínica Contendo Soro Albumina Humana (Técnica Anterior) [0101] Um complexo de toxina botulínica tipo A foi obtido de uma cultura da cepa Hall de Clostridium botulinum, desenvolvida em um meio contendo N-Z amina e extrato de levedura. O complexo de toxina botulínica tipo A foi purificado da solução de cultura por uma série de precipitações ácidas até um complexo cristalino consistindo na proteína de toxina de alto peso molecular ativa e uma proteína de hemaglutinina associada. O complexo cristalino foi então dissolvido novamente em uma solução contendo salina e albumina e filtrado estéril (0,2 mícron) antes da secagem a vácuo. A composição secada a vácuo foi reconstituída com solução salina não conservada, estéril, antes da injeção. Cada frasco pequeno de composição secada a vácuo contém cerca de 100 unidades (U) de complexo de toxina tipo A de Clostridium botulinum, 0,5 miligrama de soro albumina humana e 0,9 miligrama de cloreto de sódio em uma forma secada à vácuo, estéril, sem um conservante. Esta composição farmacêutica é vendida comercialmente sob o nome comercial BOTOX® em frascos pequenos de 100 unidades para a reconstituição com solução salina antes da injeção.

Exemplo 2

Formulações de Toxina Botulínica Estabilizada por uma Não-Proteína [0102] Foram realizados experimentos para preparar múltiplas formulações de toxina botulínica com um ou mais excipientes estabilizadores que não são de proteína, diferentes. Todas as formulações foram combinadas, liofilizadas, reconstituídas e a potência avaliada no mesmo modo, e com o mesmo tipo de toxina botulínica usada em cada formulação, supondo que cada formulação fosse preparada com um excipiente, ou excipientes, diferente que não era de proteína, ou com uma quantidade diferente do excipiente que não era de proteína ou dos excipientes que não eram de proteínas, presentes na formulação de toxina botulínica.

[0103] Os excipientes que não eram de proteína, usados (separadamente ou em combinação) nas formulações preparadas nesses experimentos, incluíram: uma polivinilpirrolidona (também chamada povidona, tal como Kollidon 17); diversos dissacarídeos (tais como a lactose e a trealose); um trissacarídeo (tal como a rafinose); um polissacarídeo (tal como a inulina); um álcool (tal como

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32/47 um álcool feito por redução de um monossacarídeo [tal como a frutose] ou tal como o manitol); um metal (tal como o zinco); um aminoácido (tal como a glicina), e; um polietileno glicol (tal como o poloxâmero 188 e/ou o PEG 3350). Visto que uma proteína é um poliaminoácido, o uso de um ou mais aminoácidos individuais nas formulações descritas nesse documento não proporcionou um excipiente de proteína nessas formulações.

[0104] As formulações descritas nesse Exemplo foram preparadas primeiramente adicionando-se a quantidade indicada do(s) excipiente(s) que não é(são) de proteína(s) à água estéril para injeção, para formar uma solução. A seguir, entre 100 a 200 unidades de um complexo de toxina botulínica tipo A (obtido por fermentação anaeróbica da cepa Hall de Clostridium botulinum, seguida por purificação da toxina botulínica liberada para o, e removida do, meio de fermentação. Vide, por exemplo, o Exemplo 1 acima descrito e Schantz E.J., et al., Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev., março de 1992; 56(1):80-99) foram adicionadas à solução, para, desse modo, formar uma formulação de toxina botulínica, que pode ser sinonimamente referida como uma composição farmacêutica de toxina botulínica, ou simplesmente como uma formulação. A potência antes da liofilização da toxina botulínica usada foi determinada pelo ensaio de LD⁵⁰ em camundongo, antes da adição da toxina botulínica à solução, e era entre cerca de 100 unidades e cerca de 200 unidades.

[0105] As formulações foram então liofilizadas (ou secadas por congelamento ou secadas a vácuo), seguido por reconstituição com solução salina normal. A potência recuperada da toxina botulínica presente na formulação reconstituída foi determinada por aplicação do mesmo ensaio de LD50 em camundongo.

[0106] A % de Recuperação nas Tabelas 1 a 5 é a potência da toxina botulínica antes da reconstituição (portanto, a potência recuperada), expressa como uma porcentagem da potência da toxina botulínica antes da liofilização da formulação. Assim, por exemplo, uma % de Recuperação de 60% significa que a potência da toxina botulínica após a reconstituição era 60% da potência da toxina botulínica antes da liofilização. A potência recuperada teórica máxima é 100%. Os valores da % de Recuperação foram obtidos por reconstituição exatamente após a formulação ser liofilizada.

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33/47 [0107] As Tabelas 1 a 6 apresentam os resultados dos experimentos efetuados nesse Exemplo, onde as formulações foram preparadas conforme descrito acima.

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Tabela 1 Formulações de Toxina Botulínica com um Único Excipiente que Não é de Proteína e Nenhuma Potência Recuperada

Excipiente	Quantidade (mg)	% de Recuperação
1. Kollidon 17	0,5	0
2. Kollidon 17	50	0
3. Kollidon 17	100	0
4. Kollidon 17	250	0
5. Lactose	5	0
6. Sacarose	5	0
7. Sacarose	10	0
8. Sacarose	50	0
9. Sacarose	100	0
10. Sacarose	250	0
11. Glicina	5	0
12. Glicina	10	0
13. Glicina	50	0
14. ZnCI	0,1	0
15. ZnCI	0,01	0
16. ZnCI	0,001	0
17. Manitol	5	0
18. Manitol	10	0
19. Manitol	50	0
20. Inulina	5	0
21. Inulina	10	0
22. Inulina	50	0
23. Trealose	5	0
24. Trealose	10	0
25. Trealose	50	0
26. Rafinose	5	0
27. Rafinose	10	0
28. Rafinose	50	0
29. PEG 3350	50	0
30. Poloxâmero 188	50	0

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Tabela 2 Formulações de Toxina Botulínica com um Único Excipiente que Não

é de Proteína e uma Potência Recuperada
Excipiente	Quantidade (mg)	% de Recuperação
1. Kollidon 17	5	48
2. Kollidon 17	10	52
3. Kollidon 17	20	39
4. Lactose	10	15
5. Lactose	50	35

Tabela 3 Formulações de Toxina Botulínica com Dois Excipientes que Não são de Proteínas e Nenhuma Potência Recuperada

	Quantidade 1	Quantidade 2	% de
Excipiente 1	Excipiente 2	mg	mg	Recuperação
1. Kollidon 17	Lactose	0,5	0,5	0
2. Kollidon 17	Lactose	50	0,5	0
3. Kollidon 17	Lactose	100	5	0
4. Kollidon 17	Sacarose	0,5	0,5	0
5. Kollidon 17	Sacarose	50	0,5	0
6. Kollidon 17	Sacarose	0,5	5	0
7. Kollidon 17	Sacarose	100	5	0
8. Sacarose	ZnCI	50	0,000005	0
9. Manitol	ZnCI	50	0,000005	0
10. Manitol	PEG 3350	5	50	0
11. Manitol	Sacarose	50	5	0
12. Manitol	Sacarose	5	50	0
13. Manitol	ZnCI	50	1	0
14. Manitol	ZnCI	50	0,1	0
15. Manitol	ZnCI	5	1	0
16. Manitol	Trealose	50	50	0
17. Manitol	Trealose	50	5	0
18. Manitol	Trealose	5	50	0
19. Sacarose	Glicina	50	50	0
20. Sacarose	Glicina	50	5	0
21. Sacarose	Glicina	5	50	0

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22. Sacarose	ZnCI	50	1	0
23. Sacarose	ZnCI	50	0,1	0
24. Sacarose	ZnCI	5	1	0
25. Sacarose	Trealose	50	50	0
26. Sacarose	Trealose	50	5	0
27. Sacarose	Trealose	5	50	0
28. ZnCI	Glicina	1	50	0
29. ZnCI	Glicina	1	5	0
30. ZnCI	Glicina	0,1	50	0
31. Poloxâmero 188	ZnCI	50	1	0
32. Poloxâmero 188	ZnCI	5	1	0
33. Trealose	ZnCI	50	1	0
34. Trealose	ZnCI	5	1	0
35. Trealose	ZnCI	50	0,1	0
36. PEG 3350	ZnCI	50	1	0
37. PEG 3350	ZnCI	50	0,1	0
38. Poloxâmero 188	Glicina	5	50	0
39. Poloxâmero 188	PEG 3350	50	50	0
40. Poloxâmero 188	PEG 3350	50	5	0
41. Poloxâmero 188	PEG 3350	5	50	0
42. Trealose	Glicina	50	50	0
43. Trealose	Glicina	50	5	0
44. Trealose	Glicina	5	50	0
45. Trealose	PEG 3350	50	50	0
46. PEG 3350	Glicina	50	50	0
47. PEG 3350	Glicina	50	5	0
48. PEG 3350	Glicina	5	50	0

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Tabela 4 Formulações de Toxina Botulínica com Dois Excipientes que Não são de Proteínas e uma Potência Recuperada

	Quantidade 1	Quantidade 2	% de
Excipiente 1	Excipiente 2	mg	mg	Recuperação
1. Kollidon 17	Lactose	5	0,5	65
2. Kollidon 17	Lactose	10	0,5	47
3. Kollidon 17	Lactose	20	0,5	65
4. Kollidon 17	Lactose	0,5	5	52
5. Kollidon 17	Lactose	5	5	57
6. Kollidon 17	Lactose	10	5	65
7. Kollidon 17	Lactose	20	5	49
8. Kollidon 17	Lactose	50	5	52
9. Kollidon 17	Sacarose	5	0,5	58
10. Kollidon 17	Sacarose	10	0,5	46
11. Kollidon 17	Sacarose	20	0,5	49
12. Kollidon 17	Sacarose	5	5	49
13. Kollidon 17	Sacarose	10	5	58
14. Kollidon 17	Sacarose	20	5	47
15. Kollidon 17	Sacarose	50	5	39
16. Kollidon 17	Sacarose	250	250	39
17. Kollidon 17	Sacarose	10	250	58
18. Kollidon 17	PEG 3350	50	50	35
19. Lactose	PEG 3350	50	50	53
20. Lactose	Sacarose	50	50	27
21. Lactose	ZnCI	50	0,000005	19
22. Lactose	Manitol	50	50	23
23. Sacarose	Manitol	50	50	24
24. Manitol	PEG 3350	50	50	26
25. Manitol	PEG 3350	50	5	30
26. Manitol	Sacarose	50	50	29
27. Manitol	Poloxâmero 188	50	50	33
28. Manitol	Poloxâmero 188	50	5	35
29. Manitol	Poloxâmero 188	5	50	30

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30. Sacarose	Poloxâmero 188	50	50	59
31. Sacarose	Poloxâmero 188	50	5	43
32. Sacarose	Poloxâmero 188	5	50	55
33. Sacarose	PEG 3350	50	50	44
34. Sacarose	PEG 3350	50	5	41
35. Sacarose	PEG 3350	5	50	35
36. Poloxâmero 188	ZnCI	50	0,1	38
37. PEG 3350	ZnCI	5	1	23
38. Poloxâmero 188	Glicina	50	50	26
39. Poloxâmero 188	Glicina	50	5	33
40. Poloxâmero 188	Trealose	50	50	53
41. Poloxâmero 188	Trealose	50	5	75
42. Poloxâmero 188	Trealose	5	50	50
43. Trealose	PEG 3350	50	5	41
44. Trealose	PEG 3350	5	50	36
[0108] A Tabela 5 mostra os	resultados	dos experimentos com	as

formulações de toxina botulínica contendo dois excipientes que não são de proteína e com ou sem o tampão especificado. A potência da toxina botulínica foi medida: (1) após liofilização e reconstituição imediata (Potência Inicial), e; (2) após liofilização, armazenagem por três meses sob uma de duas condições diferentes de armazenagem (a -40°C ou a 20°C) e reconstituição.

[0109] Os resultados da Tabela 5 mostram que uma composição farmacêutica de toxina botulínica contendo um excipiente que não é de proteína de PVP não tem estabilidade significativa na temperatura ambiente, a não ser que formulada com um tampão de citrato. Verificou-se que até no mesmo pH, um tampão de fosfato não proporcionaria a estabilidade desejada na temperatura ambiente para tal formulação.

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Tabela 5 Formulações de Toxina Botulínica com Dois Excipientes que Não são de Proteínas

Excipientes que Não são de Proteínas	Potência Inicial	Potência (3 Meses no Freezer)	Potência (3 Meses na Temperatura Ambiente)
20 mg de sacarose 10 mg de poloxâmero	101%	81%	81%
20 mg de sacarose 10 mg de poloxâmero citrato a 10 mM (pH 5,5)	77%	81%	81%
20 mg de sacarose 10 mg de poloxâmero fosfato de 10 mM (pH 5,5)	112%	113%	113%
20 mg de sacarose 10 mg de poloxâmero citrato a 10 mM (pH 6,5)	90%	Não obtida	91%
20 mg de sacarose 10 mg de poloxâmero fosfato de 10 mM (pH 6,5)	95%	119%	88%
20 mg PVP 10 mg de poloxâmero	71%	101%	<39%
20 mg PVP 10 mg de poloxâmero citrato a 10 mM (pH 5,5)	65%	101%	65%
20 mg PVP 10 mg de poloxâmero fosfato de 10 mM (pH 5,5)	71%	79%	<39%
20 mg PVP 10 mg de poloxâmero citrato a 87%10mM (pH 6,5)	87%	97%	<39%

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20 mg PVP 10 mg de poloxâmero fosfato de 10 mM (pH 6,5)

65%

63%

<39%

[0110]A Tabela 6 mostra os resultados dos experimentos com as formulações de toxina botulínica contendo três excipientes que não são de proteínas e com ou sem o tampão especificado. A potência da toxina botulínica foi medida após liofilização, seguida por reconstituição imediata (Potência Inicial).

[0111] Os resultados da Tabela 6 mostram que uma composição farmacêutica de toxina botulínica pode ser estabilizada por uso de três excipientes que não são de proteínas, presentes na mesma formulação, e que o uso de um tampão de citrato na formulação aperfeiçoa a potência inicial. Foram também preparadas composições farmacêuticas de toxina botulínica estabilizadas com outros três excipientes que não são de proteínas, diferentes, e com potência recuperada significativa.

Tabela 6 Formulações de Toxina Botulínica com Três Excipientes que Não são de Proteínas

Excipientes que Não são de Proteínas	Potência (Inicial)
20 mg de sacarose 20 PVP 20 mg de poloxâmero	67%
20 mg de sacarose 20 PVP 20 mg de poloxâmero citrato a 10 mM (pH 5,5)	98%

[0112] Entre as descobertas feitas a partir desses experimentos estavam as que seguem:

1. Uma formulação de toxina botulínica preparada com concentrações particulares de um único excipiente que não é de proteína, o qual é uma polivinilpirrolidona (tal como o Kollidon 17), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 1-4 da Tabela 1).

2. Uma formulação de toxina botulínica preparada com diferentes concentrações particulares de um único excipiente que não é de proteína, o qual

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41/47 é uma polivinilpirrolidona (tal como o Kollidon 17), pode mostrar uma potência recuperada entre 39% e 52% (vide as linhas 1-3 da Tabela 2). Levando-se em consideração o item 1. acima, essa é uma descoberta surpreendente e inesperada.

3. Uma formulação de toxina botulínica preparada com dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é uma polivinilpirrolidona (tal como o Kollidon 17), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 1-7 da Tabela 3).

4. Uma formulação de toxina botulínica preparada com dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é uma polivinilpirrolidona (tal como o Kollidon 17), pode mostrar uma potência recuperada tão alta quanto 65% (vide as linhas 1-18 da Tabela 4). Levando-se em consideração os itens 1 e 3 acima, essa é uma descoberta surpreendente e inesperada.

5. Uma formulação de toxina botulínica preparada com uma concentração particular de um único excipiente que não é de proteína, o qual é um dissacarídeo (tal como a lactose), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide a linha 5 da Tabela 1).

6. Uma formulação de toxina botulínica preparada com diferentes concentrações particulares de um único excipiente que não é de proteína, o qual é um dissacarídeo (tal como a lactose), pode mostrar uma potência recuperada entre 15% e 35% (vide as linhas 4-5 da Tabela 2). Levando-se em consideração o item 5 acima, essa é uma descoberta surpreendente e inesperada.

7. Uma formulação de toxina botulínica preparada com dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um dissacarídeo (tal como a lactose), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 1-3 da Tabela 3).

8. Uma formulação de toxina botulínica preparada com dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um dissacarídeo (tal como a lactose), pode mostrar uma potência recuperada tão alta quanto 65% (vide as linhas 1-8 e 19-22 da Tabela 4). Levando-se em consideração os itens 5 e 7 acima, essa é uma descoberta surpreendente e inesperada.

9. Uma formulação de toxina botulínica preparada com um único

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42/47 excipiente que não é de proteína, o qual é um dissacarídeo (tal como a sacarose), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 6-10 da Tabela 1).

10. Uma formulação de toxina botulínica preparada com dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um dissacarídeo (tal como a sacarose), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 4-8, 11-12, e 19-27 da Tabela 3).

11. Uma formulação de toxina botulínica preparada com dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um dissacarídeo (tal como a sacarose), pode mostrar uma potência recuperada tão alta quanto 59% (vide as linhas 9-17, 20, 23, 26 e 30-35 da Tabela 4). Levando-se em consideração os itens 9 e 10 acima, essa é uma descoberta surpreendente e inesperada.

12. Uma formulação de toxina botulínica preparada com um único excipiente que não é de proteína, o qual é um aminoácido (tal como a glicina), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 11-13 da Tabela

1)·

13. Uma formulação de toxina botulínica preparada com dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um aminoácido (tal como a glicina), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 19-21, 28-30, 38, 42-44 e 46-48 da Tabela 3).

14. Uma formulação de toxina botulínica preparada com diferentes concentrações particulares de dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um aminoácido (tal como a glicina), pode mostrar uma potência recuperada tão alta quanto 33% (vide as linhas 38-39 da Tabela 4). Levando-se em consideração os itens 12-13 acima, essa é uma descoberta surpreendente e inesperada.

15. Uma formulação de toxina botulínica preparada com um único excipiente que não é de proteína, o qual é um metal (tal como o zinco), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 14-16 da Tabela 1).

16. Uma formulação de toxina botulínica preparada com dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um metal (tal como o zinco), pode não mostrar nenhuma

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43/47 potência recuperada (vide as linhas 8-9, 13-15, 22-24, e 28-37 da Tabela 3).

17. Uma formulação de toxina botulínica preparada com diferentes concentrações particulares de dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um metal (tal como o zinco), pode mostrar uma potência recuperada tão alta quanto 38% (vide as linhas 21 e 36-37 da Tabela 4). Levando-se em consideração os itens 15-16 acima, essa é uma descoberta surpreendente e inesperada.

18. Uma formulação de toxina botulínica preparada com um único excipiente que não é de proteína, o qual é um álcool (tal como o manitol), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 17-19 da Tabela 1).

19. Uma formulação de toxina botulínica preparada com dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um álcool (tal como o manitol), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 9-18 da Tabela 3).

20. Uma formulação de toxina botulínica preparada com diferentes concentrações particulares de dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um álcool (tal como o manitol), pode mostrar uma potência recuperada tão alta quanto 35% (vide as linhas 22-29 da Tabela 4). Levando-se em consideração os itens 17-18 acima, essa é uma descoberta surpreendente e inesperada.

21. Uma formulação de toxina botulínica preparada com um único excipiente que não é de proteína, o qual é um dissacarídeo (tal como a trealose), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 23-25 da Tabela 1)·

22. Uma formulação de toxina botulínica preparada com dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um dissacarídeo (tal como a trealose), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 16-18, 25-27, 33-35 e 42-45 da Tabela 3).

23. Uma formulação de toxina botulínica preparada com diferentes concentrações particulares de dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um dissacarídeo (tal como a trealose), pode mostrar uma potência recuperada tão alta quanto 75% (vide as linhas 40-44 da Tabela 4). Levando-se em consideração os itens

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21-22 acima, essa é uma descoberta surpreendente e inesperada.

24. Uma formulação de toxina botulínica preparada com um único excipiente que não é de proteína, o qual é um polietileno glicol (tal como o PEG 3350 ou o poloxâmero 188), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 29-30 da Tabela 1).

25. Uma formulação de toxina botulínica preparada com dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um polietileno glicol (tal como o PEG 3350 ou o poloxâmero 188), pode não mostrar nenhuma potência recuperada (vide as linhas 10, 31-32, 36-41 e 45-48 da Tabela 3).

26. Uma formulação de toxina botulínica preparada com diferentes concentrações particulares de dois excipientes que não são de proteínas, diferentes, onde um dos excipientes que não são de proteínas é um polietileno glicol (tal como o PEG 3350 ou o poloxâmero 188), pode mostrar uma potência recuperada tão alta quanto 75% (vide as linhas 18-19, 24-25, 27-44 da Tabela 4). Levando-se em consideração os itens 24-25 acima, essa é uma descoberta surpreendente e inesperada.

27. Os estabilizadores que não são de proteínas lactose e polivinilpirrolidona (PVP) (isto é, o Kollidon 17), cada um, proporcionaram potência de recuperação significativa quando usados como um estabilizador que não é de proteína da toxina botulínica, presente em uma composição farmacêutica de toxina botulínica (vide a Tabela 2).

28. Quando a lactose e a PVP usadas foram ambas usadas como estabilizadores que não são de proteínas da mesma composição farmacêutica de toxina botulínica, a potência de recuperação melhorou, em comparação com a potência de recuperação observada quando a lactose e a PVP foram usadas separadamente como um estabilizador que não é de proteína (vide, por exemplo, a Tabela 4, linhas 1-8).

29. A potência de recuperação (da toxina botulínica presente em uma composição farmacêutica de toxina botulínica reconstituída) melhorou quando a lactose e/ou a PVP foram usadas com um ou mais dos outros excipientes que não eram de proteínas, descritos acima (vide, respectivamente, a Tabela 4, linhas 19-22, e a Tabela 4, linhas 9-18).

30. O uso de certas combinações de excipientes (como estabilizadores

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45/47 que não são de proteínas da toxina botulínica presente em uma composição farmacêutica de toxina botulínica reconstituída) proporcionou uma potência de recuperação significativa, mesmo onde nenhuma potência de recuperação foi obtida quando tal excipiente que não era de proteína foi usado sozinho, como um estabilizador que não era de proteína da toxina botulínica presente em uma composição farmacêutica de toxina botulínica. Por exemplo, comparar: (1) a Tabela 1, linhas 1-4, e a Tabela 1, linhas 6-10, com a Tabela 4, linhas 9-17, e; (2) a Tabela 1, linhas 23-25, e a Tabela 1, linha 29, com a Tabela 4, 43-44.

31. A potência de recuperação era algumas vezes dependente da concentração do estabilizador que não era de proteína, presente na composição farmacêutica de toxina botulínica.

32. A adição de um tampão pôde melhorar a potência de recuperação e a estabilidade na armazenagem. Os tampões individuais diferiram em sua capacidade de exercer esse efeito. Os tampões atuam para obter um pH ótimo, manter o pH ótimo e, em algumas situações (por exemplo, o citrato), proteger contra a oxidação.

[0113] As conclusões gerais a partir desses experimentos incluem as observações que:

a) a toxina botulínica presente em uma composição farmacêutica de toxina botulínica pode ser estabilizada (e demonstrado por uma boa potência de recuperação) por formulação da composição com dois ou mais excipientes que não são de proteínas, comuns.

b) Uma polivinilpirrolidona (tal como o Kollidon 17) e um dissacarídeo (tal como a lactose) podem atuar como um estabilizador (excipiente) que não é de proteína em uma formulação de toxina botulínica, sem a presença de qualquer outro estabilizador que não é de proteína.

c) Com o mesmo estabilizador, ou estabilizadores, que não é de proteína, a potência recuperada pode ser dependente da razão, e/ou da concentração, do estabilizador, ou estabilizadores, que não é de proteína usado na formulação de toxina botulínica.

d) Certos estabilizadores que não são de proteínas (tais como a polivinilpirrolidona [tal como o Kollidon 17] e um dissacarídeo [tal como a lactose]) não somente podem atuar para estabilizar a toxina botulínica em uma formulação de toxina botulínica, quando utilizados juntos, como podem

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46/47 proporcionar uma estabilização aumentada quando usados juntos, como determinado por uma potência recuperada mais elevada da formulação reconstituída.

e) Os excipientes farmacêuticos comumente usados (tais como a polivinilpirrolidona, a lactose, a sacarose etc.) não funcionaram quando usados como estabilizadores, ou somente funcionam como um estabilizador de uma toxina botulínica em uma formulação de toxina botulínica sem proteína quando usados em concentrações particulares, uma polivinilpirrolidona (tal como o Kollidon 17) e um dissacarídeo (tal como a lactose).

f) Muitos excipientes funcionaram ou funcionaram como melhores estabilizadores de uma toxina botulínica, em uma formulação de toxina botulínica não proteína, quando combinados com uma polivinilpirrolidona (tal como o Kollidon 17) e um dissacarídeo (tal como a lactose).

g) Embora a PVP específica Kollidon 17 fosse usada nas diversas formulações de toxina botulínica preparadas, outras PVPs estão dentro do escopo da presente invenção.

h) Embora o poloxâmero específico polioxâmero 188 fosse usado nas diversas formulações de toxina botulínica preparadas, outros poloxâmeros estão dentro do escopo da presente invenção.

i) Verificou-se que o tensoativo polissorbato (Tween) pode ser usado em vez do poloxâmero 188, com resultados similares.

[0114] Os outros excipientes que não são de proteínas, que podem ser usados em uma composição farmacêutica de toxina botulínica, dentro do escopo da presente invenção, incluem os antioxidantes, tais como o Hidroxitolueno butilado (BHT) e o Hidroxianisol butilado (BHA), e os aminoácidos, tais como a cisteína e a metionina. A formulação de toxina botulínica liofilizada pode ser reconstituída com solução salina, água ou com um diluente personalizado, para afetar o desempenho após a reconstituição ou a injeção.

Exemplo 3

Uso de uma Composição Farmacêutica de Toxina Botulínica [0115] Um homem de 48 anos de idade é diagnosticado com uma condição de músculo espástico, tal como a distonia cervical. Entre cerca de 103 U/kg e cerca de 35 U/kg de uma composição farmacêutica de toxina botulínica tipo A da formulação contendo lactose e PVP são injetadas intramuscularmente

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47/47 no paciente. Dentro de 1-7 dias, os sintomas da condição de músculo espástico são aliviados e o alívio dos sintomas persiste por pelo menos de cerca de 2 meses a cerca de 6 meses.

[0116] Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção, descrita nesse documento, tem muitas vantagens, incluindo as seguintes:

1. a composição farmacêutica pode ser preparada livre de qualquer produto sanguíneo, tal como a albumina, e, portanto, livre de qualquer elemento infeccioso do produto sanguíneo, tal como um priônio.

2. A composição farmacêutica tem estabilidade e alta % de recuperação da potência da toxina, comparável ou superior àquela obtida com as composições farmacêuticas atualmente disponíveis.

3. Toxicidade reduzida, como avaliada por administração intramuscular ou intravenosa.

4. Antigenicidade reduzida.

[0117] Diversas publicações, patentes e/ou referências foram citadas nesse documento, cujos conteúdos, em suas totalidades, são incorporados aqui por referência.

[0118] Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhe com relação a certos métodos preferidos, são possíveis outras modalidades, versões, e modificações dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, uma ampla variedade de polissacarídeos e aminoácidos estabilizadores está dentro do escopo da presente invenção.

[0119] Desse modo, o espírito e o escopo das reivindicações a seguir não devem ser limitados às descrições das modalidades preferidas apresentadas acima.

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 .Composição farmacêutica caracterizada por compreender:

   a) uma toxina botulínica, em que a toxina botulínica não é estabilizada por umexcipiente protéico;

   b) uma polivinilpirrolidona, e;

   c) um dissacarídeo, em que o dissacarídeo é selecionado a partir de lactose, trealose e sacarose; e em que a potência da toxina botulínica é pelo menos 40% da potência máxima teórica da toxina botulínica.
2. 2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a toxina botulínica ser selecionada do grupo que consiste em toxinas botulínicas dos tipos A, B, C, D, E, F e G.
3. 3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a toxina botulínica ser uma toxina botulínica tipo A.
4. 4. Composição farmacêutica caracterizada por compreender:

   a) uma toxina botulínica, em que a toxina botulínica não é estabilizada por umexcipiente protéico;

   b) uma polivinilpirrolidona, e;

   c) um dissacarídeo, em que o dissacarídeo é selecionado a partir de lactose, trealose e sacarose; e em que a potência da toxina botulínica é pelo menos 50% da potência máxima teórica da toxina botulínica.
5. 5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por a potência da toxina botulínica ser pelo menos 60% da potência máxima teórica da toxina botulínica.
6. 6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por a potência da toxina botulínica ser pelo menos 70% da potência máxima teórica da toxina botulínica.