CN1562352A - 治疗用a型肉毒毒素冻干粉针剂生产工艺及冻干保护剂的配方 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肉毒毒素冻干粉针剂及其冻干保护剂，该制品属于一种微生物毒素，用于神经科、眼科等领域的肌张障碍性疾病，如：眼睑痉挛、面肌痉挛、斜视及痉挛性斜颈等的治疗，所述冻干保护剂由选自明胶、右旋糖苷、山梨醇或甘露醇其中之一或任何组合的物质和水制成。

Description

治疗用A型肉毒毒素冻干粉针剂生产工艺及冻干保护剂的配方

技术领域：

本发明涉及一种新的医药制剂，特别是一种肉毒毒素冻干粉针制剂，该制品属于一种微生物毒素，用于神经科、眼科等领域的肌张障碍性疾病，如：眼睑痉挛、面肌痉挛、斜视及痉挛性斜颈等的治疗。

背景技术：

肉毒毒素系肉毒梭菌生长繁殖过程中产生的一种毒力极强的神经毒素，它能作用于运动神经末梢神经肌肉接点，抑制突触前膜释放乙酰胆碱，从而引起肌肉松弛性麻痹。这种独特的药理作用，80年代被美国学者列入临床，对斜视、眼睑痉挛、面肌痉挛及痉挛性斜视等疾病进行试验性治疗，并取得满意的疗效。

肉毒毒素，特别是肉毒毒素A性已经显示出对肌肉痉挛症的疗效。单一的治疗法(其中包括多点肌肉注射)在长达数月期间，能使无法控制的肌肉痉挛得到缓解。例如，美国食品和药品管理局核准“BOTOX^”(肉毒毒素A型)用于局部注射的眼眶中，以便治疗眼睑痉挛。其他适应症包括别的局部肌张力障碍，例如，喉性呼吸困难、Meige’s综合症(颌颞肌张力障碍；颌面运动障碍)、痉挛性斜颈(Hardmandeng，1996)、肢体肌张力障碍、肛门痉挛和泌尿逼肌-括约肌协同困难，眼睑痉挛、斜视、半面肌痉挛以及鼻漏、中耳炎、过度唾液分泌、哮喘、痉挛性结肠炎、过度胃酸分泌(参见，例如，US5,766,005)，伴随偏头痛的头痛、脉管障碍、神经痛或神经病(US5,714,468；WO953041)，关节炎痛(WO9517904)，涉及横纹肌和平滑肌的胃肠道紊乱(US5,674,205)，生产时松弛会阴(US5,562,899)，或减缓颌咬紧(US5,298,019)。肉毒毒素A型也被局部注射，以便获得肌紧张性的美容性缓减，以及获得“举眉(browlift)”(Frankel，1998)，该肌紧张性引起面部“皱眉纹”，而且已经发现，当为了治疗病灶多汗症(过度排汗；WO9528171；US5,766,605)，以及为了治疗青少年脊柱弯曲(US5,053,005)、成人和青少年脑瘫(US5,298,019；WO9305800)、以及脑瘫引起的痉挛和不随意收缩，多发性硬化或帕金森氏症(US5,183,462)而皮内注射时，肉毒毒素A型是有用的。

1989年12月，美国FDA正式批准A型肉毒毒素作为新药投产上市。1993年10月卫生部批准我国兰州生物制品研究所生产的注射用A型肉毒毒素作为新药上市。目前美国产品采用：以人血白蛋白作保护液冷冻干燥毒素，存在血源污染的危险，冻干过程中的毒素力(即单位)损失高达50-90％；冻干成品的稳定性差，有效期短；产品价格昂贵(100单位/支的成品、售价275美元)。兰州生物制品研究所采用蔗糖作为冻干保护剂，蔗糖作为注射用辅料在制造技术上存在困难，导致生产难度大，合格产品少，目前在使用时存在生产及使用的安全隐患，同时作为冻干保护剂效果也不确定。本发明的目的是针对上述背景技术的不足及存在的问题和局限性，结合自身的现有条件，设计并优选一种用于A型肉毒结晶毒素稀释、冻干的冻干保护液，以避免和克服人血白蛋白作稀释、冻干保护液所致的危险性，比现有产品更具先进性及优势。

发明内容：

本发明提供一种肉毒毒素的治疗制剂，特别是A型肉毒毒素(也称为：A型肉毒结晶毒素、肉毒毒素A型)的制剂，该制剂能于-25℃-4℃以冻干粉针剂的固体形式稳定贮藏至少1～2年。为达到发明目的，本发明还提供一种做成该制剂的冻干保护剂。

本发明的肉毒毒素制剂，由药学上可接受的冻干保护剂和肉毒毒素组成，其特征在于，其中的冻干保护剂由选自明胶、右旋糖苷、山梨醇或甘露醇其中之一或任何组合的物质和水制成。

本发明的优选的冻干保护剂配方如下：

明胶              0.5％～5％

右旋糖苷          1％～10％

山梨醇或甘露醇    1％～20％

其余为注射用水

本发明的冻干保护剂配方，更优选的为以下配方：

明胶               1％～3％

右旋糖苷           2％～10％

山梨醇或甘露醇     2％～10％

其余为注射用水

本发明的冻干保护剂配方，最优选的为以下配方：

明胶                      1％

右旋糖酐                  5％

山梨醇或甘露醇            5％

其余为注射用水

配方中的右旋糖苷属于药用右旋糖苷-10、右旋糖苷-20及右旋糖苷-40。本发明的冻干保护剂可通过以下方法制备，取配方量的明胶、右旋糖苷、山梨醇或甘露醇或它们的任意组合，加入配方量的注射用水将它们混合在一起，溶解成为冻干保护液。

优选的配制方法如下：

a.称取明胶1g，加热溶化后，90℃下用1％活性炭吸附处理30分钟；

b.称取右旋糖酐及山梨醇各5g，溶化后加入0.8％活性炭90℃下吸附处理30分钟；

c.用0.45um微孔滤膜过滤上述液体于同一容器，加注射用蒸馏水混合，113℃，45min高压灭菌，冷却，调pH值到5.6，加入A型肉毒毒素稀释液，用0.22um微孔滤膜过滤，按照1.0±0.05ml/支分装于西林瓶中。

本发明的制剂可通过以下方法制备，将肉毒毒素与本发明的冻干保护剂混合，制成药液，将药液分装为小包装后，经过常规的冷冻干燥技术进行冻干，即可制成本发明的制剂。其中肉毒毒素是选自血清型A、B、C1、C2、D、E、F和G的肉毒毒素，优选的是A型肉毒毒素。

本发明的A型肉毒结晶毒素制剂，具体可以通过以下方法制备：

I、产毒培养基成份

蛋白胨        1～20％

酵母浸粉      1～10％

硫代乙醇酸钠  0.025％

葡萄糖        1～2％

II、产毒培养基形成

(1)、将蛋白蛋白胨和酵母浸粉溶于蒸馏水，用NaOH溶液校正pH7.2-7.4；

(2)、煮沸，过滤后加入硫代乙醇酸钠，分装立瓶于113℃30分钟灭菌备用；

(3)、另配50％葡萄糖溶液于113℃30分钟灭菌，接种前按2％加入；

III、产毒培养

将经过适应培养后的A型肉毒梭菌(KW-0201株)菌种，接种于18,000-36,000ml的产毒培养基中，35℃培养5天；

IV、除菌过滤

经镜检为纯培养后，用无石棉除菌板或除菌滤膜过滤，得原毒素液，用小白鼠测定毒力，毒力应高于10⁵LD₅₀/ml；

V、毒素的精制提纯

(1)、酸沉淀：原毒素液加六偏磷酸钠，使最终浓度达0.2％，用3当量盐酸调PH至3.5左右，2-8℃过夜；

(2)、毒素提纯：弃上清，沉淀用蒸馏水洗一次，加适量PH6.0、0.2磷酸盐缓冲液，分两次溶解、提取、每次置室温1小时，离心后分别取上清液合并之；

(3)、酶处理及浓缩：提取液按100mg/ml加入核糖核酸酶，35℃温育3小时，加硫酸铵至60％饱和，2-8℃过夜，离心，沉淀用适量PH5.5、0.05M柠檬酸缓冲液溶解后，透析；

(4)、层析：透析液经DEAE-A50离子交换层析，收集、合并OD₂₆₀~OD₂₈₀为0.5-0.6的过柱液；

(5)、结晶：合并液加硫酸铵至60％饱和，2-8℃过夜，离心，沉淀用适量PH6.8、0.05M磷酸缓冲液溶解，再在含0.9M硫酸铵的上述缓冲液中透析，自然形成结晶，亦可重复上述过程，以形成第二次结晶；

VI、毒素的稀释、冻干

(1)、稀释

a、用磷酸盐缓冲液溶解吉透析结晶毒素，除菌过滤后测定毒力；

b、用磷酸盐缓冲液将已知毒力的毒素溶液稀释至适当浓度(10⁵-10⁶LD₅₀/ml)

c、将适量的稀释毒素加入到定量的冻干保护液中，使每毫升冻干保护液中毒素含量在效价要求的范围(20-2000LD₅₀/ml)；

(2)分装、冻干

每安瓶定量分装上述含冻干保护液的毒素稀释液1毫升，以蛋白质制品的冻干曲线对其进行冻干，冻干成品去菌、水份含量不超过3％。

本发明的药用制剂可用于许多其中希望抑制或阻断胆碱能神经传导的适应症，尤其是，与平滑肌或骨骼肌控制有关的胆碱能传递，但又不限于此。对这些适应症中的某些适应症，其代表性的给药剂量和途径描述于下面。

给药的剂量和方式：

本发明的制剂，其中肉毒毒素是以20～2000U/ml范围浓度存在的肉毒毒素A型，也可以是以100-20000U/ml范围浓度存在的肉毒毒素B型。

已知肉毒毒素是一种对动物有力的并且有时致命的毒素。尽管如此，如下述，当足够谨慎地调节给药方式和剂量时，该药能安全地用于人体。各种形式的肉毒素的剂量会根据所用毒素的血清型改变。例如，通过对鼠LD50单位进行比较，已经发现，当以电生理学测量对选定的骨骼肌进行评估时，肉毒毒素A型(“BOTOX^”)比肉毒毒素B型在诱导猴子麻痹上，效力高约4-6倍(CN1316906A)。

给药的适当方法包括，会导致活性毒素成分向利害组织输送，又不对患者产生严重副作用的任何方法。这些方法非限定地包括：肌肉注射(i.m.)、局部给药、皮下、神经轴施用、离子电渗给药等等。本领域熟知肉毒毒素的具体给药程序，这包括了限制活性组分全身性分布的手法。可用肌电图仪式识别并更精确定位具体的肌群，特别是对涉及难以分辨肌肉的治疗，例如，眼眶、喉和翼状区中的那些肌肉以及肥胖主体的肌肉。

完成肉毒毒素治疗通常是将毒素给药到患病肌肉的神经分布区域附近，常常使用皮下注射器针头进行肌肉注射。一般情况，造成的局部麻痹能缓减患者长达3或4个月的病痛。可让患者试验更低剂量并使各自达到最佳剂量，以便获得足够的神经肌肉阻滞，从而纠正任何机能障碍，而不产生单纯的麻痹。如果患者对毒素产生抗药性，可能意味着改变剂量。

已经确定了许多适应症的肉毒毒素A型推荐剂量，并且本领域公知这些剂量。例如，治疗斜视时，对小于20屈光度的水平斜视，建议给予垂直肌1.25-2.5U肉毒毒素A型，而对屈光度大于20棱镜屈光度的水平斜视，建议给予垂直肌2.5-5U肉毒毒素A型，(医生案头手册，第51版(Physician’s Desk Reference，51”Edition))。

肉毒毒素A型还用于治疗眼睑痉挛，注射剂量为1.25-2.5U，使用27-30号针头，注射到上眼睑中间和侧面眼睑软骨前的眼轮匝肌中，并注射到下眼睑侧面眼睑软骨前的眼轮匝肌中。预计治疗持续约3个月；当重复治疗时，可将该剂量加至2倍，这取决于患者的反应。推荐30天当中应当给予累计剂量不超过200U的肉毒毒素A型(医生案头手册，第51版(Physician’s Desk Reference，51”Edition))。

简言之，可变剂量的毒素通过肌内(i.m.)注射到2-4颈和/或肩浅层肌群中而给予患者，其更具临床医生对涉及紊乱的肌肉的估计确定。在一项研究中，在整个长达398天的时间里，给出个体单次剂量的范围为100-1200U，累计剂量界于270-2280U。研究期间，所有患者病情改善，并且在研究过程中未观察到制剂效力降低。

按照“多伦多西方痉挛性斜颈等级评定量表”(Toronto Western SpasmodicTorticollis Rating Scale)(TWSTRS；Consky，1994)，参与研究的患者对肉毒素A反应下降，并且如果治疗后，和基准分相比，他们呈现出至少25％的总分下降(下降＝改善)，则认为治疗成功。在全程长达117天里，将肉毒毒素B型制剂给药，单次剂量界于150-1430U，累计剂量范围为300-12000单位。总的说来，在该项研究中，患者病情改善，特别是以较高剂量给药。并且既没有发现对肉毒毒素B型的抗体的阻断，也没有发现制剂效力降低。如上述，进一步的研究中，在长达203天期间，以0、400、1200和2400U肉毒毒素B型的单次剂量定期给药，治疗斜颈获得成功。

本发明的肉毒毒素制剂的稳定性测试：

用本发明实施例的方法制备的肉毒毒素A型制剂稀释到120单位/毫升浓度，并按1毫升等分量装入2ml西林瓶中，按照蛋白质的冻干曲线冻干，于4℃贮藏长达并包括36个月。从开始贮藏起的0、1、3、6、9、12、18、24和36个月，随即选区等分试样，并做鼠LD50分析以测试效力及无菌、热原、水分。

下表列出不同时间点取出的等分试样的测试结果。这些结果显示，根据本发明制备的制剂是稳定的，表1说明，当在4℃贮藏至少36个月时，效力在贮藏时间为零时所记录的效价范围内(120±20％U/支)。

表1 4℃时制剂的稳定性

贮藏时间(月)

效价(U/支)

无菌

热原

水分

0	120	合格	合格	合格
					1	124	合格	合格	合格
3	121	合格	合格	合格
					6	126	合格	合格	合格
9	119	合格	合格	合格
					12	122	合格	合格	合格
18	123	合格	合格	合格
					24	118	合格	合格	合格
36	116	合格	合格	合格

表2显示A型肉毒毒素冻干粉针制剂在25℃贮藏的稳定性。结果显示，在该制剂下25℃稳定至少1年，其证据是，在25℃贮藏6个月后，平均效价仍在规定之内(300±20％U/支，即240~360U/支之间)。

表2 25℃时制剂的稳定性

贮藏时间(月)	效价(U/支)	无菌	热原	水分
					0	320	合格	合格	合格
1	325	合格	合格	合格
					3	318	合格	合格	合格
6	326	合格	合格	合格
					9	329	合格	合格	合格
12	320	合格	合格	合格
					18	311	合格	合格	合格
24	310	合格	合格	合格
					36	306	合格	合格	合格

本发明的冻干保护剂能提供介于pH5和pH6.8之间的缓冲范围及由液体溶液冻干制成可贮藏的粉针剂时使肉毒毒素效价损失低于40％。本发明的药物制剂能以固体形式，在介于-20℃～7℃的温度下保持稳定至少1年。

本发明的制剂，与现有技术相比，具有稳定性更强，副作用更少，配制简单，原料易得，使用方便，减少疼痛，疗效更加优良。

具体实施方式：

用以下实施例举例说明本发明，但绝非要对其进行限定。除非做不同说明，在此描述的所有试剂可从任何出售化学、生物化学、生物技术或制药用试剂的供应商处获得。

实施例1：

肉毒毒素制剂的制备

(1)、冻干保护液成分

明胶              1g

右旋糖酐          5g

山梨醇            5g

注射用蒸馏水      加至100ml

(2)、配制方法

a、按配制量称取明胶，加热溶化后，1％活性炭吸附处理90℃，30min；

b、按配制量称取右旋糖酐及山梨醇，溶化后加入0.8％活性炭吸附处理90℃，30min；

c、0.45um为孔滤膜过滤a和b于同一容器，加注射用蒸馏水溶解，113℃，45min高压灭菌，冷却调pH值于5.6，加入备好的一定量(LD50为10000±2000U)的A型肉毒毒素稀释液(以便获得约100±20U/支的A型肉毒毒素冻干粉针剂)，0.22um微孔滤膜过滤，按照1.0±0.05ml/支分装于西林瓶中。

d、以蛋白质制品的冻干曲线对其进行冻干，冻干成品无菌、热原合格，水份含量不超过3％。

实施例2：

肉毒毒素制剂的制备

(1)、冻干保护液成分

明胶          1g

右旋糖酐      5g

甘露醇        5g

注射用蒸馏水         加至100ml

(2)、配制方法

e、按配制量称取明胶，加热溶化后，1％活性炭吸附处理90℃，30min；

f、按配制量称取右旋糖酐及甘露醇，溶化后加入0.8％活性炭吸附处理90℃，30min；

g、0.45um为孔滤膜过滤e和f于同一容器，加注射用蒸馏水溶解，113℃，45min高压灭菌，冷却调pH值于5.6，加入备好的一定量(LD50为10000±2000U)的A型肉毒毒素稀释液(以便获得约100±20U/支的A型肉毒毒素冻干粉针剂)，0.22um微孔滤膜过滤，按照1.0±0.05ml/支分装于西林瓶中。

h、以蛋白质制品的冻干曲线对其进行冻干，冻干成品无菌、热原合格，水份含量不超过3％。

实施例3：

A型肉毒结晶毒素制备：

I、产毒培养基成份

蛋白胨         1～20％

酵母浸粉       1～10％

硫代乙醇酸钠   0.025％

葡萄糖         1～2％

其余为水

II、产毒培养基形成

(1)、将蛋白蛋白胨和酵母浸粉溶于蒸馏水，用NaOH溶液校正pH7.2-7.4；

(2)、煮沸，过滤后加入硫代乙醇酸钠，分装立瓶于113℃30分钟灭菌备用；

(3)、另配50％葡萄糖溶液于113℃30分钟灭菌，接种前按2％加入；

III、产毒培养

将经过适应培养后的A型肉毒梭菌(KW-0201株)菌种，接种于18,000-36,000ml的产毒培养基中，35℃培养5天；

IV、除菌过滤

经镜检为纯培养后，用无石棉除菌板或除菌滤膜过滤，得原毒素液，用小白鼠测定毒力，毒力应高于10⁵LD₅₀/ml；

V、毒素的精制提纯

(1)、酸沉淀：原毒素液加六偏磷酸钠，使最终浓度达0.2％，用3当量盐酸调PH至3.5左右，2-8℃过夜；

(2)、毒素提纯：弃上清，沉淀用蒸馏水洗一次，加适量PH6.0、0.2磷酸盐缓冲液，分两次溶解、提取、每次置室温1小时，离心后分别取上清液合并之；

(3)、酶处理及浓缩：提取液按100mg/ml加入核糖核酸酶，35℃温育3小时，加硫酸铵至60％饱和，2-8℃过夜，离心，沉淀用适量PH5.5、0.05M柠檬酸缓冲液溶解后，透析；

(4)、层析：透析液经DEAE-A50离子交换层析，收集、合并OD₂₆₀~OD₂₈₀为0.5-0.6的过柱液；

(5)、结晶：合并液加硫酸铵至60％饱和，2-8℃过夜，离心，沉淀用适量PH6.8、0.05M磷酸缓冲液溶解，再在含0.9M硫酸铵的上述缓冲液中透析，自然形成结晶，亦可重复上述过程，以形成第二次结晶；

VI、毒素的稀释

(1)、稀释

a、用磷酸盐缓冲液溶解吉透析结晶毒素，除菌过滤后测定毒力；

b、用磷酸盐缓冲液将已知毒力的毒素溶液稀释至适当浓度(10⁵-10⁶LD₅₀/ml)

c、将适量的稀释毒素加入到定量的冻干保护液中，使每毫升冻干保护液中毒素含量在效价要求的范围(20-2000LD₅₀/ml)；

Claims (10)

1、一种肉毒毒素制剂，由药学上可接受的冻干保护剂和肉毒毒素组成，其特征在于，其中的冻干保护剂由选自明胶、右旋糖苷、山梨醇或甘露醇其中之一或任何组合的物质和水制成。

2、权利要求1的制剂，其中的冻干保护剂由明胶，右旋糖苷，山梨醇或甘露醇，和水制成，各组分之间的重量配比如下：

明胶              0.5％～5％

右旋糖苷          1％～10％

山梨醇或甘露醇    1％～20％

其余为水

3、权利要求1的制剂，其中的冻干保护剂各组分之间的重量配比如下：

明胶            1％～3％

右旋糖苷        2％～10％

山梨醇或甘露醇  2％～10％

其余为水

4、权利要求1的制剂，其中的冻干保护剂各组分之间的重量配比如下：

明胶            1％

右旋糖苷        5％

山梨醇或甘露醇  5％

其余为水

5、权利要求1的制剂，其特征在于，其中的冻干保护剂能提供介于pH5和pH6.8之间的缓冲范围及由液体溶液冻干制成可贮藏的粉针剂时使肉毒毒素效价损失低于40％。

6、权利要求1的制剂，是冻干粉针剂，其中所述制剂能以固体形式，在介于-20℃～7℃的温度下保持稳定至少1年。

7、权力要求1-6的制剂，其中所述肉毒毒素选自血清型A、B、C1、C2、D、E、F和G的肉毒毒素血清型。

8、权利要求7的制剂，其中所述肉毒毒素是以20～2000U/ml范围浓度存在的肉毒毒素A型。

9、权利要求1的制剂，其中所述肉毒毒素是以100-20000U/ml范围浓度存在的肉毒毒素B型

10、权利要求1的制剂的制备方法，其特征在于，经过以下步骤，

a.称取明胶1g，加热溶化后，90℃下用1％活性炭吸附处理30分钟；

b.称取右旋糖酐及山梨醇各5g，溶化后加入0.8％活性炭90℃下吸附处理30分钟；

c.用0.45um微孔滤膜过滤上述液体于同一容器，加注射用蒸馏水混合，113℃，45min高压灭菌，冷却，调pH值到5.6，加入A型肉毒毒素稀释液，用0.22um微孔滤膜过滤，按照1.0±0.05ml/支分装于西林瓶中。