CN1316906A

CN1316906A - 稳定的肉毒毒素液体制剂

Info

Publication number: CN1316906A
Application number: CN99810739A
Authority: CN
Inventors: 伊丽莎白·莫耶; 帕梅拉·希尔特泽尔
Original assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1998-09-11
Filing date: 1999-09-09
Publication date: 2001-10-10
Anticipated expiration: 2019-09-09
Also published as: SK3132001A3; LT4959B; JP5270594B2; AU755556B2; AP2001002108A0; BR9913585A; CU23251A3; EP1112082B1; CN100438905C; JP2010138186A; HRP20010259B1; TW574036B; ES2181473T5; JP4557426B2; PT1112082E; AR022671A1; GEP20032946B; IS5836A; DK1112082T3; JP2013144691A

Abstract

本发明包括肉毒毒素液体制剂，其能在标准冰箱温度下，以液体形式稳定贮藏至少1－2年，并能在较高温度稳定贮藏至少6个月。本发明还包括使用这些制剂的治疗方法以及这些制剂在各种治疗和美容处理用药物生产中的应用。

Description

稳定的肉毒毒素液体制剂

发明领域

本发明涉及肉毒毒素的治疗制剂，其能于0-10℃以液体形式稳定贮藏至少1-2年。

参考文献

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发明背景

肉毒毒素是厌氧肉毒梭菌的多肽产物。毒素通过阻断神经肌肉接点神经传质乙酰胆碱的突触前释放，引起哺乳类动物肌肉麻痹。尽管早已将该毒素与致命的肉毒中毒联系起来，但是近年来，已经将其用于某些不随意肌运动紊乱的治疗性处理，这些紊乱包括病灶肌张力障碍(例如斜视、原发性眼睑痉挛和半面肌痉挛)、以及节段肌张力障碍(例如斜颈、口下颌骨肌张力障碍和痉挛性发音困难)和痉挛状态。还找到该毒素在各种美容适应症中的应用，例如，非手术减少面部“额头皱纹线”，以及治疗多汗症(过度排汗)。

目前，存在两种核准可用于人体治疗的肉毒毒素(A型)制剂-“BOTOX”(Oculinum；Allergan Inc.,Irvine,CA)和“DYSPORT”(Spexwood Pharmaceuticals,Ltd.；U.K)。这两种制剂提供给临床医生的均是冻干剂型(经冷存干燥)，在临用前恢复原态。

由于患者和患者之间在需用剂量上存在个体差异，任一个体患者所需的剂量可能变化相当大。另外，对某些适应症，临床医生必须仅将制备了较长时间的小瓶中的含量的一小部分给药于患者，该时间可为数小时。虽然一份公开出版的研究报告指出，肉毒毒素液体制剂能被再冷冻和解冻而基本保持活性(Schantz and Kautter,1978)，但是，更新的研究估计，当恢复原态并在标准冰箱(约4℃)下贮藏12小时后，已证明恢复原态的毒素″BOTOX″的活性，其效力损失至少44％。而且，当恢复原态的制剂在-70℃的零度以下冰箱贮藏时，两星期后，其失去自身效力的约70％(Gartlan和Hoffman,1993)。为此，建议这样的组合物在恢复原态后的4小时内使用。这会导致药品和患者花销的严重浪费。

因此，需要现成的肉毒毒素液体制剂，其能够方便地运输、贮藏并按临床医生要求使用。本发明提供了这样的制剂。

发明概述

本发明涉及用于药物制剂的、稳定的肉毒毒素液体制剂。本发明制剂的优点是，与现有的制剂不同，它们在标准冰箱温度(大约4±2℃，或约2-8℃，或更一般地在约0-10℃范围)能以液状稳定贮藏较长的时间(1年或更长)。在与此相关的方面中，该制剂在“室温”(约25℃，或更一般地在10-30℃范围)能以液状稳定地贮藏至少6个月。这样的制剂在下列病情中特别有用，其减少或抑制胆碱能神经输入到特别是肌肉或肌群、腺或器官的区域得到改善。在此将描述这些病情的实例。

一方面，本发明包括一种稳定的药用液体制剂，其包括分离的肉毒毒素和缓冲剂，该缓冲剂能提供介于约pH5和pH6之间的pH缓冲范围。按照该一般实施方案，该毒素在缓冲液中混合形成液体制剂，其pH值介于5和6之间、特别是介于约pH5.4和pH5.8之间、并优选约pH5.5-5.6。如上述，制得的制剂至少能稳定一年，在约0-10℃温度范围能稳定至少2年，或者在更高温度稳定至少6个月。通常，按照本发明，可将任何已知的肉毒毒素血清型(例如血清型A、B、C₁、C₂、D、E、F或G)或者具有等效生物活性的其它血清型合并到本发明制剂中。在优选实施方案中，使用的肉毒毒素是肉毒毒素血清型A或B，分离自肉毒梭菌。

在优选实施方案中，制剂中肉毒毒素B型以700千道尔顿分子量的复合物存在，浓度约100-20000U/ml，且特别是介于约1000-5000U/ml。当用A型时，其一般以约20-2000U/ml，且特别是介于约100-1000U/ml的浓度存在。如果在制剂中使用不同血清型的混合物，则它们的用量或浓度范围可根据它们各自生物活性，与这里举例剂量和浓度成比例地确定。

能用于制剂的缓冲剂是生理性缓冲剂，据认为其注射到哺乳动物特别是人类的组织中是安全的。代表性的缓冲剂非限定地包括基于磷酸盐、磷酸盐-柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乌头酸盐、苹果酸盐和碳酸盐的缓冲体系。优选地，该制剂还包括赋形剂蛋白质，例如人血清白蛋白或白明胶。应当意识到，本领域技术人员会认识到并用到前述缓冲剂和赋形剂蛋白质实例的等价物。本发明的毒素制剂能以本领域公知的任何种类容器或小瓶包装，同时保持它的效力。

在相关的一个方面中，本发明包括患者的治疗方法，该患者需要抑制胆碱能传递，这种胆碱能传递到选定的肌肉或肌群或特定的腺区，例如汗腺，或到有胆碱能神经支配的特定器官。本发明还包括，本发明制剂在制备治疗这些适应症药物方面的用途。

能用肉毒毒素制剂治疗的治疗性和美容性适应症的实例非限定地包括：睑痉挛、斜视、半面肌痉挛、中耳炎、痉挛性结肠炎、肛门痉挛、泌尿的逼肌-括约肌协同失调、颌咬紧、脊柱弯曲，痉挛状态，例如由于中风、脊髓损伤、闭合性颅脑创伤、脑瘫、多发性硬化和帕金森氏症中的一种或多种引起的痉挛状态，以及肌张力障碍(例如，痉挛性斜颈(颈部肌张力障碍)、痉挛性发音困难、肢体肌张力障碍、喉性呼吸困难、颌颚痉挛(Meige’s))。还能在产妇生产过程中将该制剂给药到会阴(会阴肌)，使这些肌肉松弛。该制剂美容适应症的实例包括给药到产生皱纹或皱眉头的肌肉。该制剂的其它适应症包括肌筋膜痛、伴有偏头痛的头痛、脉管障碍、神经痛、神经病、关节炎痛、背痛、多汗、鼻漏、哮喘、过度唾液分泌和过度胃酸分泌。

具体地，本发明制剂给药的特定途径包括：肌内、皮下或离子电渗给药。例如，旨在支持本发明而进行的研究中发现，当以5000-10000个单位的剂量每天单次或分次肌内给药时，肉毒毒素B型能有效控制颈部肌张力障碍。

根据另一相关方面，本发明包括用含另一血清型的稳定液体制剂治疗患者的方法，该患者已经对特定肉毒血清型形成免疫性或抵抗力。例如，对肉毒毒素血清型A不应的患者，可用含肉毒血清型B、C₁、C₂、D、E、F或G的任意稳定液体制剂治疗，或者对肉毒毒素血清型B不应的患者，可用含肉毒血清型A、C₁、C₂、D、E、F和G的任意稳定液体制剂治疗，以便重获功效。

当结合附图阅读以下发明详述时，本发明的这些和其它目的与特征将变得更明显。发明详述

本发明涉及稳定的药用肉毒毒素液体制剂及其应用。目前，由于溶液中活性毒素成分的易变性，尽管肉毒毒素制剂上市销售供各种治疗和美容应用，但制剂必须由冻干成分恢复原态，该冻干成分有严格的贮藏要求。例如，以冻干粉末提供的“BOTOX”，其必须在等于或低于-5C的冰箱中运输和贮藏，并在临用前通过添加标准量的盐溶液恢复原态。紧随恢复原态之后，推荐在4个小时内将该制剂给药于患者，并且任何恢复原态的产品(PDR,1997)在这段时间里应冷藏；冷冻和解冻恢复原态的产品是不可取的(Hoffman,1993)。

本发明提供含肉毒毒素的稳定液体制剂，并且在标准冰箱温度下该制剂作为液体能稳定至少一年，而在室温下稳定至少6个月。因为该制剂不要求特殊的贮藏或运输条件，并且因为它减少了在可能造成用药过量的毒素稀释中出错的可能性，所以该制剂具有优势。

1．定义

在此用到的术语“稳定的”是指经过确定或非确定的时间，生物活性物质特别是肉毒毒素的生物活性或效力的保持。

术语“肉毒毒素”是指生物活性蛋白质或蛋白质复合物，通常衍生自细菌肉毒梭菌。该术语是指至少8种已知的血清学上可区分的毒素(A、B、C₁、C₂、D、E、F和G)中的任何种，以及其它有同等抑制胆碱能神经传递能力的肉毒毒素，其形成活性分子。选择性地，如本文ⅡA部分中所述，该术语还包括同样衍生自肉毒梭菌的载体蛋白质并且其与活性分子偶联。如下文所述，肉毒毒素血清型药理学性质相关，但免疫学性质有所不同。通常，活性毒素分子的分子大小介于约145和170千道尔顿(kD)。在本发明的上下文中，所理解到的是，毒素蛋白质包括从天然来源分离出的毒素和载体蛋白质，以及按照本领域公知方法重组的相应的毒素和载体蛋白质。而且如下述，术语“肉毒毒素”包括某些蛋白质，按照公知肉毒毒素序列，这些由氨基酸序列构成的蛋白质既含有保守的氨基酸取代基又含有可被删去的氨基酸取代基。

肉毒毒素的“生物活性”是指，通过阻断从神经末梢释放的乙酰胆碱，其在具有乙酰胆碱受体的突触处阻断神经传递的能力。该术语可与术语“抑制胆碱能传递”、“抑制胆碱能输入”、“降低胆碱能输入”及其倾向互换。如本文所述毒素生物活性的体外测定，包括鼠LD₅₀试验。该试验中活性的“单位”定义为：杀死50％受试鼠所要求的毒素蛋白的量。本文中，实施例2提供该术语的功能性定义。

在此用它们的一个或三个字母缩写表示，常见氨基酸是指：丙氨酸(A,Ala)、半胱氨酸(C,Cys)、天冬氨酸(D,Asp)、谷氨酸(E,Glu)、苯丙氨酸(F,Phe).甘氨酸(G.Gly)、组氨酸(H,His)、异亮氨酸(I,ne)、赖氨酸(K,Lys)、亮氨酸(L,Leu)、蛋氨酸(M,Met)、天冬酰胺(N,Ash)、脯氨酸(P,Pro)、谷氨酰胺(Q,Gln)、精氨酸(R,Arg)、丝氨酸(S,Ser)、苏氨酸(T,Thr)、缬氨酸(V,Val)、色氨酸(W,Trp)、酪氨酸(Y,Tyr)。

术语“液体药物制剂”是指具有药理活性的药品或生物制剂，该制剂能够在例如缓冲盐或生理缓冲液的液体药物赋形剂中贮藏较长的时间。该制剂可为浓缩制剂，其在临使用前以相似或不同的液体稀释。

术语“缓冲剂”是指一种化合物，通常是盐，当其溶于水性介质，当添加或从该溶液除去氢离子时，将溶液中游离氢离子浓度维持在某一pH值范围内。当提供此功能时，称盐或溶液具有“缓冲能力”或在该范围“缓冲”该溶液。通常，在其pK±1的pH单位的范围上，该缓冲剂具有足够的缓冲能力。“生理缓冲剂”是当作为药用制剂的一部分给药时，对哺乳动物尤其是对人类无毒性的缓冲剂。在此，提供本发明说明书中相关生理缓冲剂的实例。

“药学可接受的液体”是一种液体，据认为哺乳动物尤其是人类耗用或注射它将是安全的。

这里使用的术语“赋形剂蛋白质”，是指一种蛋白质，其被加到药用活性制剂中，但其未给予该制剂另外的显著的生物活性。赋形剂蛋白质的实例非限定地包括：血清白蛋白，特别是人类的血清白蛋白，以及白明胶。将优选对要接受该药用制剂的哺乳类动物相对非免疫原性的蛋白质。

本发明文中且尤其是在权利要求书中，用到的术语“含有”有意要具有术语“包括”、“包含”或“特征在于”的含义。组合物或方法，其“含有”要素A、B和C，则除了A、B和C之外，还有其它未叙述的要素，如X或Y。

本发明文中且尤其是在权利要求书中，用到的术语“约”意味着“左右”或“接近”。在数字值的上下文中，若没有给予严格的数字定义，该术语可解释为估计值，其为所引用值或范围±10％。

这里用到的所有其它术语，应当解释为具有本领域技术人员公知的通常含义，或者在权威的医学或科学词典中引用的含义。

Ⅱ．肉毒毒素

如上述，肉毒毒素是肉毒梭菌各种菌株产生的多肽产物。这些菌株产生至少8种已知的血清学上区别的毒素(A、B、C₁、C₂、D、E、F和G)。分别地，C.barati和C.butyricum均产生与血清型E和F相似的单独血清型(Simpson,1993)。一般地，该毒素分子具有介于约145和170千道尔顿(kD)之间的分子大小。在某些情况下，该活性毒素分子由两条被二硫键连接的链构成，该链由源多肽形成。例如，肉毒毒素B型由150kD的单一前体多肽产生，该多肽形成断口以便产生两个由二硫键连接的片段-100kD的重链(H-链)和50kD的轻链(L-链)，使活性最大化。自然出现的毒素与仍由肉毒梭菌产生的非毒性载体蛋白质以非共价连接。这些载体蛋白质连接到毒素链上，形成大到900kD(A型)复合物，并对B型优选约700kD。该载体蛋白质与该毒素共纯化，并最适地形成本文描述制剂的部分。

细胞中，不同的肉毒毒素血清型呈现不同结合特性。例如，A型和E型毒素看来结合到相同的突触小体结合位点，而B型毒素结合到不同的位置上，并不能竞争性结合于在该A/E型的结合位点处(Melling,1988)。虽然不希望受特定理论和作用机理的局限，但据信，毒素的H-链提供神经元细胞结合及细胞渗透活性，而L-链的作用是在突触处抑制乙酰胆碱释放。另外，据信，肉毒毒素A型和B型采用略有不同的机理，来产生对乙酰胆碱释放的抑制作用：A型粘着突触相关蛋白质(SNAP-25)而B型粘着囊泡相关膜蛋白(VAMP，或者突触短杆素(synaptobrevin))，这两种蛋白质均是释放自突触的突触囊组分。

所有肉毒梭菌毒素血清型对哺乳动物产生共同生理效应。它们均抑制或阻断胆碱能突触的活性，这导致部分或全部肌肉麻痹或封闭，或者抑制器官或腺体发挥作用，这取决于给药的位置。因此，本发明的制剂能与得自肉毒梭菌的任何肉毒毒素血清型一起使用，它们的特征在于具有上述生物活性。目前大多数已知血清型的氨基酸序列也已知或能通过本领域公知的方法测定。应当理解，在本发明的叙述中，肉毒毒素液体制剂应当进一步解释为包括重组肉毒毒素，它具有与已知的序列相对应的保守氨基酸置换体。通常，这样的置换体，由天然氨基酸的标准置换体类产生。例如，当例如用本领域公知的标准频率交换基质，如Dayhoff频率交换基质测定时，根据侧链性质和自然界的同源蛋白质中最高的取代频率，标准置换体类可为六类。例如，在Dayhoff频率交换基质下，这些类别是，类Ⅰ:Cys；类Ⅱ:Ser、Thr、Pro、Hyp、Ala和Gly，代表小脂肪族侧链和OH-基侧链；类Ⅲ:Asn、Asp、Glu、和Gln，代表能形成氢键的中性和负电性侧链；类Ⅳ:His、Arg、和Lys，代表碱性极性侧链；类Ⅴ:Ile、Val和Leu，代表支链化的脂肪族侧链，以及Met；类Ⅵ:Phe、Tyr和Trp，代表芳香侧链。另外，每一组可包括相关的氨基酸类似物，例如类Ⅳ中的鸟氨酸、高精氨酸、N-甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸或三甲基赖氨酸，以及组Ⅵ中的卤代酪氨酸。另外，这些类别可包括L和D立体异构体，尽管优选L-氨基酸作为置换体。作为举例，对于另一个类Ⅲ残基例如Asn、Gln或Glu的Asp的置换体是一种保守的置换体。

虽然能用例如本领域公知的电生理学分析测量肉毒毒素的活性，但是通常通过将该毒素注射到小动物例如鼠类体内，并测定50％的受试动物致死所需的平均毒素剂量来测定活性。该剂量记作“致死剂量-50”或LD₅₀并且定义为生物活性的单位。按照惯例，治疗用途的剂量，相对该单位进行标准化。如以下ⅢB部分进一步详细讨论的，当用LD₅₀单位度量时，各种血清型可具有不同的人体治疗效力。根据本领域公知的方法，可从该信息得出治疗剂量。

Ⅲ．肉毒毒素的制各

本节叙述肉毒毒素的制造方法，该毒素将用于根据本发明的制剂。

A．提纯得自肉毒梭菌的肉毒毒素

本部分以肉毒毒素B型为例，提供由培养的肉毒梭菌制备提纯肉毒毒素的一般方法。除了这里专门引用的方法外，制备肉毒毒素A和B型，以及其它已知血清型的另外方法是本领域公知的。

如上述，本发明制剂中的活性成分是一种肉毒梭菌提取物的蛋白质组分，称作肉毒毒素，该活性组分的分子量介于约145-170kD，并且其通常存在于天然蛋白质的复合物，该复合物具有相当大的分子量。本部分提供提纯各种肉毒毒素的示例方法，集中叙述肉毒毒素血清型A和B。应当理解的是，一般的科学文献提供了其它提纯毒素方法的指导，并且本领域技术人员将会辨别这样的方法，并将它们应用于本发明的制剂中的特定毒素。

通常，肉毒毒素B型是按照本领域熟知方法，作为复合物从肉毒梭菌培养物的高效价发酵中分离的。在美国，根据联邦对有机体分配的规定，从持有疾病控制中心(CDC)许可证的机构及其它地方能获得原液培养物。为了提纯肉毒毒素B，肉毒梭菌Okra或Bean B是合适的起始材料。将冷冻的原液培养物接种到含培养基的试管中，并按照下述在美国专利US5,696,077中详述的方法，使培养物生长并加工，该培养基例如为巯基乙酸酯培养基或类胰蛋白酶消化蛋白培养基(trypticase peptone medium)，该专利在此引用供参考，并描述如下。

简言之，按照本领域公知方法繁殖培养物，以便产生足够量的细菌起始材料而获得需要的毒素产量。通常，制造0.5克毒素将需要约20升的细菌培养物。将该培养物置于室温，并用硫酸或另一种合适的酸调节该培养物的pH值为pH3.5。使所得的沉淀物沉淀，弃除上清液，然后在搅拌下将氯化钙加入该沉淀物中，并用去离子水增加体积，以致CaCl₂的最终浓度为约150mM。pH值升高到接近中性(pH6.5)，通过离心法使毒素溶液物沉淀。将pH值调节到3.7使毒素再沉淀。使获得的沉淀物沉淀，并通过离心法收集毒素沉淀物，然后重新溶解在缓冲液(pH5.5)中，并对同一缓冲液彻底透析过夜。离心分离经透析的毒素，并经阴离子交换柱(DEAE)对获得的上层清液进行层析。收集未结合的部分并测试蛋白质的含量。通过添加硫酸铵达到约60％的饱和度，从该部分中沉淀毒素复合物。将片状沉淀物溶解在磷酸盐缓冲剂中，并对同一缓冲液(pH7.9)透析。可用此提纯的毒素制剂制备该制剂。

肉毒毒素A型的制备方法也是本领域熟知的。例如，均在此引用并参考的Hambleton等(1981)和Melling等(1988)的文献，描述了从肉毒梭菌A型NCTC2916制造和提纯肉毒毒素A型。按照本领域公知的标准条件，从验明的种材料成长出细菌的培养物，并接种到厌氧条件下作业的30升发酵罐中。(例如通过LD₅₀测定)连续监测毒素产量，且当获得最大产率时(约2×10⁶鼠LD₅₀/毫升)，将该培养物酸化(用3N H₂SO₄调节到pH3.5)，并通过离心法收取该毒素。将该沉淀的粗制毒素再溶解，并用0.2M磷酸盐缓冲液(pH6.0)提取，随后用核糖核酸酶处理(100微克/毫升于34°)，并用NH₄SO₄(于25°60％饱和度)沉淀。然后使该沉淀物重新悬浮，并于pH5.5经DEAE-Sephacel离子交换色谱分析(接在分批的预吸收之后)。监测各部分的活性，将活性部分用NH₄SO₄(60％饱和度于25°)再次沉淀。该沉淀可如下述，被贮藏并再溶解，以便制造本发明的制剂。

本发明的制剂优选包括结合复合物的毒素，例如按照上述有关肉毒毒素A型和B型的方法制备的，或者采用按照本领域公知方法制备肉毒毒素类型C₁、C₂、D、E、F和G的等价形式。通过将重组的结合复合物毒素系列稀释到赋形剂蛋白质中，测定毒素的效价，该赋形剂例如为人血清白蛋白，要避免气泡和激烈搅拌例如可通过旋涡混合。按照常规，以鼠的致死性分析测定效价，例如实施例2中鼠的LD₅₀分析。将加工原料稀释、等分并冻干，供贮藏。按照本领域熟知且在本发明实施例2中举例的方法，将该原料溶液化验测试，以便确定蛋白质的浓度、LD₅₀、纯度和制药适用性。

Ⅳ．稳定的肉毒毒素制剂

本发明发现，能以稳定的液体制剂制造并贮藏肉毒毒素，在持续一段时间里，例如在“冰箱”温度(即约5±3℃，或更具体地，约4±2℃，或更一般地，0-10℃)至少1-2年，在“室温”(即约25℃，或更一般地10-30℃)至少约6个月，该制剂能保持其效力。这种制剂能方便地以成药分发给人或其它哺乳类动物，而不需要医生另外恢复原态。该制剂的特征在于，其pH值介于约pH5和pH6之间，优选约pH5.5-5.6，这通过适当的缓冲条件得以维持。该制剂还可包括一种或多种赋形剂蛋白质。

实施例l提供浓度为5000U/ml的肉毒毒素(B型)制剂的制备细节。应当理解，为了提供常规剂量包装的稳定制剂，在这些肉毒毒素血清型要求的浓度下，可将这样的制剂条件应用于其他肉毒毒素血清型，例如肉毒毒素A型。

简言之，将肉毒毒素的浓缩制剂，例如上述引用A型和B型所描述的提纯毒素制剂，与稀释剂混合，例如与pH值介于pH5和pH6之间，优选约pH5.6的琥珀酸盐缓冲剂混合。在肉毒毒素B型的情况下，以鼠LD₅₀分析估计的，浓度约5000U/ml是可取的；但是，100-20000U/ml范围或更高的任何浓度也是需要或可取的，这取决于被递送的剂量。在肉毒毒素A型的情况下，浓度范围20-2000，优选约100-1000U/ml可能是适当的。为了制药目的，将该制剂采样并测试可能存在的染菌量，并无菌过滤到玻璃或聚丙烯小瓶中，以分发给患者。最终产品能以液体在0-10℃贮藏至少一年，优选多于两年，而不会明显损失生物活性，这可通过鼠LD₅₀试验(实施例2)中效力损失＜20％得以证实。

上述所指稀释剂可为任何药学可接受液体，该液体不会对复合物的稳定性产生不利影响，并且它支持介于约pH5和pH6之间稳定的pH范围。特别适用缓冲剂的实例包括：琥珀酸盐和磷酸盐缓冲剂；然而，本领域的技术人员会认识到，只要该缓冲剂在所需要的范围提供可接受程度的pH稳定性，本发明制剂将不局限于特定的缓冲剂或者“缓冲容量”范围。通常，缓冲剂在其pK的约1个pH单位内具有足够的缓冲容量(Lachman等，1986)。在本发明的叙述中，这包括pK在约4.5-6.5范围的缓冲剂。缓冲剂的适用性可根据出版的pK表估计，或者可按本领域公知的方法经验性地测定。除了上述的琥珀酸盐和磷酸盐缓冲剂之外，其它药用性缓冲剂包括：醋酸盐、柠檬酸盐、顺乌头酸盐、苹果酸盐和碳酸盐(Lachman)。能用任何药物可接受的酸例如盐酸或硫酸，或者碱例如氢氧化钠，将溶液的pH值调节到需要的边界点。

加入制剂中的赋形剂蛋白质可以是许多药物可接受蛋白质或肽中的任何种。优选地，根据其给药于哺乳动物主体而不引起免疫反应的能力，选择赋形剂蛋白质。例如，人血清白蛋白适合在给药于人类的药物制剂中使用；相反，可选择牛血清白蛋白供牛群使用。其它公知的药用蛋白质赋形剂，例如，象白明胶，可用于此目的。将该赋形剂以足够的浓度包括在该制剂中，以便防止毒素蛋白质复合物吸附在盛器或小瓶上。赋形剂的浓度将根据该制剂中赋形剂的特性和毒素复合物的浓度改变。举例而言，在进行支持本发明的研究中，已经测定出，对大多数人来说，用0.5毫克/毫升人血清白蛋白，就足以使含5000U/mL肉毒毒素B型的制剂达到目的，而不引起严重的免疫学反应或过敏反应；通常，介于每1000U肉毒杆菌B约0.05mg和1mg的浓度应当提供足够的保护。

也已经有用于稳定肉毒毒素A型的适当赋形剂浓度的描述。例如经每100单位毒素活性添加0.5毫克白蛋白，使″BOTOX″稳定化(PDR)。

Ⅴ．实用性

A．治疗和美容用肉毒毒素制剂

本发明的药用组合物可用于许多其中希望抑制或阻断胆碱能神经传导的适应症，尤其是，与平滑肌或骨骼肌控制有关的胆碱能传递，但又不限于此。本部分提供其中能使用本发明制剂治疗的紊乱实例；但是，在此提供的这些实例，不应理解为限定本发明。对这些适应症中的某些适应症，其代表性的给药剂量和途径描述于下面的B部分。

肉毒毒素，特别是肉毒毒素A型已经显示出对肌肉痉挛症的疗效。单一的治疗法(其可包括多点肌肉注射)在长达数月期间，能使无法控制的肌肉痉挛得到缓解。例如，美国食品和药品管理局核准″BOTOX″(肉毒毒素A型)用于局部注射到眼眶中，以便治疗眼睑痉挛。其它适应症包括别的局部肌张力障碍，例如，喉性呼吸困难、Meige′s综合症(颌颚肌张力障碍；颌面运动障碍)、痉挛性斜颈(Hardman等，1996)、肢体肌张力障碍、肛门痉挛和泌尿逼肌-括约肌协同困难，眼睑痉挛、斜视、半面肌痉挛以及鼻漏、中耳炎、过度唾液分泌、哮喘、痉挛性结肠炎、过度胃酸分泌(参见，例如，US5,766,005)，伴随偏头痛的头痛、脉管障碍、神经痛或神经病(US5,714,468；WO953041)，关节炎痛(WO9517904)，涉及横纹肌和平滑肌的胃肠道紊乱(US5,674,205)，生产时松驰会阴(US5,562,899)，或缓减颌咬紧(US5,298,019)。肉毒毒素A型也被局部注射，以便获得肌紧张性的美容性缓减，以及获得″举眉(browlift)″(Frankel,1998)，该肌紧张性引起面部“皱眉纹”，而且已经发现，当为了治疗病灶多汗症(过度排汗；WO9528171；US5,766,605)，以及为了治疗青少年脊柱弯曲(US5,053,005)、成人和青少年脑瘫(US5,298,019；WO9305800)、以及脑瘫引起的痉挛和不随意收缩，多发性硬化或帕金森氏症(US5,183,462)而皮内注射时，肉毒毒素A型是有用的。所有上述引用文献将引入本文作参考。

在为支持本发明而进行的实验中，测试了含肉毒毒素B型的稳定液体制剂，并发现对颈部肌张力障碍有效，颈部肌张力障碍也称斜颈，是一种其中患者经受头、颈和脊柱不随意痉挛和肌肉收缩的病症，其导致头颅的转向或倾斜运动。该病症还常常伴有震颤和肌(与)骨骼的疼痛。通常，紊乱的病原学是未知的；但是，据认为，其是中枢神经系统功能失调的结果，它导致相关肌群织的机能亢进。目前，包括抗胆碱能、多巴胺能、肌肉弛缓剂，抗痉挛和抗惊厥药在内的治疗法，未提供持续缓解。通过引起局部瘫痪麻痹，肉毒毒素B型有效治疗该病症，其一般奏效时间是在注射后约1星期，并且持续约1-4月。

其它肉毒毒素血清型的制剂，有效用于前述与A型相关的任何病症的初步治疗。另外，如上述，血清型B-G还对那些用肉毒毒素A型治疗时因对该毒素存在免疫反应而不应的患者有治疗用途。相反，血清型A可用于对血清型B或任何其它毒素血清型不应的患者。根据本发明可制备并应用一种或更多肉毒毒性血清型制剂。

可取的是，通常，从它们生物学作用相似的观点出发，各种毒素类型在各种紊乱，特别是那些与肌肉痉挛有关的治疗中，可互换。但是，在如下与血清型A和B有关的叙述中，有效剂量(以术语LD₅₀或生物学单位表达)可在不同血清型之间显著不同。可基于任何测试毒素相关描述中的已知剂量估计等效剂量。

B．给药的剂量和方式

已知肉毒毒素是一种对动物有力的并且有时致命的毒素。尽管如此，如下述，当足够谨慎地调节给药方式和剂量时，该药能安全地用于人体。

各种形式的肉毒毒素的剂量会根据所用毒素的血清型改变。例如，在为支持本发明而进行的实验中，通过对鼠LD₅₀单位进行比较，已经发现，当以电生理学测量对选定的骨骼肌进行评估时，肉毒毒素A型(″BOTOX″)比肉毒毒素B型在诱导猴子麻痹上，效力高约4-6倍。该观测与大鼠的实验结果一致，该实验显示，在产生大鼠四肢麻痹所要求的毒素量方面，两种毒素有很大不同(Sellin；Jackson)。鉴于这些观测，熟练的专业人员可经验地估计或确定出适当的等效剂量。

推荐剂量的变更，也可根据患者病史有所不同。例如，已报导，接受重复剂量肉毒毒素A型的患者对进一步治疗有了“抗药性”，随着时间过去，产生等同效果需更大剂量。该现象据信与患者血清型特异性免疫反应的发展有关，这缺乏特定的作用机理。有关进行重复肉毒毒素A型治疗的患者中抗体发生率的报导占约3％-57％。因此推荐，倘若临床医生在治疗当中选择改变血清型，新血清型的最初剂量的计算应当基于患者自身，而不是基于患者的剂量历史。

给药的适当方法包括，会导致活性毒素成分向利害组织输送，又不对患者产生严重副作用的任何方法。这些方法非限定地包括：肌内注射(i.m.)、局部给药、皮下、神经周施用、离子电渗给药等等。本领域熟知肉毒毒素的具体给药程序，这包括了限制活性组分全身性分布的手法。可用肌电图仪识别并更精确定位具体的肌群，特别是对涉及难以分辨肌肉的治疗，例如，眼眶、喉和翼状区中的那些肌肉以及肥胖主体的肌肉。

完成肉毒毒素治疗通常是将毒素给药到患病肌肉的神经分布区域附近，常常是用皮下注射器针头进行肌内注射。一般情况，造成的局部麻痹能缓减患者长达3或4个月的病痛。可让患者试验更低剂量并使各自达到最佳剂量，以便获得足够的神经肌肉阻滞，从而纠正任何机能障碍，而不产生单纯的麻痹。如果患者对毒素产生抗药性，可能意味着要改变剂量。本发明的优点是，其克服了与溶液中毒素物质不稳定相关常见剂量问题，该问题可导致合适剂量更不明确。

已经确定了许多适应症的肉毒毒素A型推荐剂量，并且本领域公知这些剂量。例如，治疗斜视时，对小于20屈光度的水平斜视，建议给予垂直肌1.25-2.5U肉毒毒素A型，而对屈光度大于20棱镜曲光度的水平斜视，建议给予垂直肌2.5-5U肉毒毒素A型，(医生案头手册，第51版(Physician′s Desk Reference,51″Edition))。

肉毒毒素A型还用于治疗眼睑痉挛，注射剂量为1.25-2.5U，使用27-30号针头，注射到上眼睑中间和侧面眼睑软骨前的眼轮匝肌中，并注射到下眼睑侧面眼睑软骨前的眼轮匝肌中。预计治疗持续约3个月；当重复治疗时，可将该剂量加至2倍，这取决于患者的反应。推荐30天当中应当给予累积剂量不超过200U的肉毒毒素A型(医生案头手册，第51版(Physician′s Desk Reference,51″Edition))。

实施例3提供使用本发明制剂治疗颈部肌张力障碍(斜颈)时，肉毒毒素B型使用剂量范围研究的实例。在这些概括如下的研究中，将依照本发明的肉毒毒素B型液体制剂提供给给药的临床医生，并作出将该制剂在临床冰箱中贮藏的说明，该冰箱温度控制在2-8℃之间。通常，制剂来自批量制备，并在推荐温度下贮藏6-12个月。临床医生收到约6个月供应量的该制剂。

简言之，可变剂量的毒素通过肌内(i.m.)注射到2-4颈和/或肩浅层肌群中而给予患者，其根据临床医生对涉及紊乱的肌肉的估计确定。在一项研究中，在整个长达398天的时间里，给出个体单次剂量的范围为100-1200U，累积剂量介于270-2280U。研究期间，所有患者病情改善，并且在研究过程中未观察到制剂效力降低。

为了支持本发明而进行的进一步研究揭示，对肉毒毒素A型已产生抗药性的患者能用肉毒毒素B型治疗。这里，按照“多伦多西方痉挛性斜颈等级评定量表”(Toronto Western Spasmodic Torticollis RatingScale)(TWSTRS；Consky,1994)，参与研究的患者对肉毒毒素A反应下降，并且如果治疗后，和基准分相比，他们呈现出至少25％的总分下降(下降=改善)，则认为治疗成功。细节如实施例3，在整个长达117天里，将肉毒毒素B型制剂给药，单次剂量介于150-1430U，累积剂量范围为300-12000单位。总的说来，在该项研究中，患者病情改善，特别是以较高剂量给药。并且既没有发现对肉毒毒素B型的抗体的阻断，也没有发现制剂效力降低。如上述，进一步的研究中，在长达203天期间，以0、400、1200和2400U肉毒毒素B型的单次剂量定期给药，治疗斜颈获得成功。

用以下实施例举例说明本发明，但绝非要对其进行限定。

实施例材料

除非做不同说明，在此描述的所有试剂可从任何出售化学、生物化学、生物技术或制药用试剂的著名供应商处获得。实施例1：稳定肉毒毒素制剂的制备

A．琥珀酸盐缓冲液的制备

3升一批的琥珀酸盐缓冲液是用2.7mg/mL琥珀酸二钠与5.8mg/mL氯化钠制备的、并补充0.5mg/mL人血清白蛋白(密歇根生物制品研究所)。用浓盐酸将缓冲液的pH值调节到pH5.6。将该缓冲液经0.2微米的过滤器过滤到高压、密封的容器中。使用之前，将该缓冲液制样并测定pH值、细菌内毒素和染菌量。

B．肉毒毒素制剂的制备

用琥珀酸盐缓冲液(pH5.6)将浓缩肉毒毒素B型的一个等分试样稀释约1000倍，以便获得5000±1000U/ml的效力。将该稀释毒素贮藏在密封的2升玻璃容器中，并称作“本体溶液”。然后，在5±3℃贮藏，直到该材料被载运用于分装。

在分装之前，按照本领域公知的标准方法，将“本体溶液”采样并测试染菌量的存在。然后，用蠕动泵经医用级管将其输送、并无菌过滤(0.2微米)到位于分装间的无菌散装收集器中。将得到的无菌过滤“本体溶液”以0.5mL(2500U),1mL(5000U)或2mL(10000U)的试样等分装入3.5cc的玻璃小瓶中。

表1中列出了最终装箱产品的组成。

表1

肉毒毒素B型制剂的组成

活性成分	非活性成分	浓度
活性成分	非活性成分	浓度	肉毒毒素B型	-	5000±1000LD₅₀U/mL
-	琥珀酸盐，USP	10mM	肉毒毒素B型	-	5000±1000LD₅₀U/mL
-	琥珀酸盐，USP	10mM	-	氯化钠，USP	100mM
-	人血清白蛋白，FDA分发	0.5mg/mL	-	氯化钠，USP	100mM
-	人血清白蛋白，FDA分发	0.5mg/mL	-	盐酸,NF	用于调节pH

实施例2：肉毒毒素制剂的稳定性测试

A．稳定性结果

如上述制备肉毒毒素B型并稀释到2500单位/毫升浓度，并按1毫升等分量装入5毫升玻璃小瓶中，于5℃贮藏长达并包括30个月。从开始贮藏起的0、1、3、6、9、12、18、24和30个月，随机选取等分试样，并做鼠LD₅₀分析以测试效力。另外观察该溶液外观并按照标准方法测试pH值。

表2列出不同时间点取出的等分试样的测试结果。这些结果显示，根据本发明制备的制剂是稳定的，其证据是，当在5℃贮藏至少30个月时，效力在贮藏时间为零时所记录的效力的范围内。

表2

5℃时制剂的稳定性

贮藏时间(月)	效力(平均；U/ml)	pH	外观^a
贮藏时间(月)	效力(平均；U/ml)	pH	外观^a	0	1750-3250	5.5	合格
1	1941	ND^b	ND	0	1750-3250	5.5	合格
1	1941	ND^b	ND	3	2541	5.6	ND
6	2020	5.6	合格	3	2541	5.6	ND
6	2020	5.6	合格	9	2357	5.6	合格
12	2064	5.6	合格	9	2357	5.6	合格
12	2064	5.6	合格	18	2318	5.4	合格
24	1799	5.6	合格	18	2318	5.4	合格
24	1799	5.6	合格	30	2101	5.6	合格

^a合格=清澈，无色至淡黄色溶液；基本上无可见颗粒

^b未进行测试

表3显示肉毒B型毒素制剂等分试样的测试结果，该制剂如上述制备并等分，但在25℃贮藏。这些结果显示，在该制剂25℃下稳定至少6个月，其证据是，在25℃，贮藏6个月后，平均效力保留了其最初效力的至少约90％，优选至少95％，并且贮藏9个月后，保留了至少75％。

表3

25℃时制剂的稳定性

贮藏时间(月)	效力(平均；U/ml)	pH	外观^a
贮藏时间(月)	效力(平均；U/ml)	pH	外观^a	0	1941	5.5	合格
1	2297	5.6	ND^b	0	1941	5.5	合格
1	2297	5.6	ND^b	2	1935	5.6	ND
3	2017	5.6	ND	2	1935	5.6	ND
3	2017	5.6	ND	6	1909	ND	合格
9	1579	5.6	合格	6	1909	ND	合格

^a合格=清澈，无色至淡黄色溶液；基本上无可见颗粒

^b未进行测试

B．稳定性测试

1．肉毒毒素制剂的pH测定

使用带自动温度补偿探测器的50型Fisher Scientific Accumet pH计测量肉毒毒素B型制剂的pH值。电极为Orion Ross组合电极和KCl参考电极。根据制造商的指示，pH值测定是在标准的两点规范化(pH4.0,pH 7.0)后进行的。每个样品进行3次测量。保留两位有效数字记录pH值，并取平均值。

2．鼠LD₅₀效力试验

用健康、未使用CFW或CD-1、重18-22克任意性别的鼠测定LD₅₀。用每一分装产品，以5剂肉毒毒素B型制剂测试。各分析按5倍进行。

由测试样品制备两份原液。用pH6.2的白明胶磷酸盐缓冲液，将该测试样品稀释到估计效力750U/mL，获得原液A。将原液A稀释10倍至75U/mL获得原液B。由原液B制得以下测试稀释液：1∶7.5、1∶10、1∶13.5、1∶18和1∶24.3。

给鼠进行0.2毫升化合物适当稀释液的腹腔内注射。这些鼠保持4天后续注射，并每日观察。记录所有的死亡例。4天后结束观察。

通过从最大稀释液向上加和死亡数，计算不同稀释水平下的累积死亡(CD)。通过从最小稀释液向下加和存活数，计算累积存活(CS)。对每一稀释液，计算CD/(CD+CS)×100％作为％CD。将用于产生％CD值的稀稀液通过Reed和Muench的比例距离法(Proportional Distancemethod)(PD)，以50％累积死亡归类，确定代表LD₅₀的稀释液。

用稀释水平间的对数差乘获得的PD值，该稀释水平按50％CD归类。将该值加到死亡数目(CD)多于50的稀释度的对数上，从而获得代表LD₅₀的稀释度。

计算该稀释度的反对数，以便获得每注射体积(0.2毫升)毒素的LD₅₀单位数。将该数值乘以5，得到每毫升毒素原液B的LD₅₀单位数。

每毫升原液B的LD₅₀单位数乘以它的稀释因子(即产生估计效力为75U/mL所需的稀释液)，得到样品的效力。以5次有效试验计算每毫升LD₅₀单位数的算术均值和标准偏差。

3．制剂外观

在温和旋动后，通过亮光下相对黑或白色背景目测，评定外观。全部评估颜色、透明度和存在可见微粒的情况。实施例3：颈部肌张力障碍(CD)的治疗

A．药物稀释液、计算法、给药和剂量给药疗法

1．药物处理

分装药物小瓶以便递送2.0mL(10000U)、1.0mL(5000U)、0.5mL(2500U)未稀释的研究药物。在所有操作步骤中，避免激烈搅动或起泡，因为这些条件均会使肉毒毒素改变本性。用1毫升的结核菌素注射器从小瓶中取出该制剂，保证精确量取。

2．用药计算

通过将适当的小瓶容量给药，使肉毒毒素B型给药于颈部肌张力障碍(CD)患者，以便提供下表中示出的剂量。如下计算增加剂量的大鼠单位(U)，其中1U是在代表LD₅₀的一剂药中存在的毒素量，鼠的测定如实施例2所述。

在每次给药期间，按照如下述的标准步骤将肉毒毒素B型给药。由曾用肉毒毒素治疗过CD病患者神经科大夫注射化合物，要求患者尽可能松弛，以便于不动时，观察头和颈的状态。通过触诊相关肌肉，确定并证实产生CD所涉及的颈部肌肉。当该研究者判断时，进行EMG评估，以便进一步定位主要受侵袭的肌肉。这些在记录中需治疗的肌肉是肩胛提肌、中斜角肌和前、颈半棘肌、头夹肌、胸锁乳突肌和斜方肌。向这些肌肉每一块的1-5个部位进行注射。每个部位的总注射体积小于或等于1.0mL，以避免局部组织变形，但至少要0.1mL，以便有助于用标准1.0mL的注射器量取正确的体积。最初，患者接受的总计量为5000U，在接下来就诊该诊所时，随后计量达到约15000单位。

B．颈部肌张力障碍(CD)的临床研究

研究1

平均年龄43.9岁且个体临床诊断为特发性CD的8名患者(3名男性，5名女性)参与研究，其中将肉毒毒素B型制剂注射到2-4块颈和/或肩浅层肌群中。只要患者陈述，没有严重的不利效应或者持续临床改善，则使患者每4周接受一次治疗。患者参加1-5个给药疗程。如所述，个体的给药期范围是100U到1200U同时总累积剂量范围为270U至2280U肉毒毒素B型毒素制剂。使用Tsui斜颈量表(Tsui,J.K.C.(1986)，柳叶刀2:245-247)评定有效性。患者参加该项研究127-398天，处于研究中的平均时间为244.8天。当比较总剂量时，基线处的斜颈评分类似，所有患者经历了适度的评分下降(下降=改善)和一些具有与剂量相关倾向的适应症。总之，患者经历了斜颈症状的改善。在该项研究中，没有迹象显示产生了阻断性抗体。

2．研究2

参加在此项研究中的患者临床诊断为特发性CD(斜颈)，并且对肉毒毒素A型产生了抗药性。患者接受本发明肉毒毒素B型制剂的肌内注射，注射到2-4块浅层的颈和肩肌肉中。

12位患者(平均年龄52.3岁)参加并完成了该研究。患者参加在研究中37到127天，平均时间为65天。患者用1-3剂的研究药物治疗。累积剂量范围为940-2100U，并且肉毒毒素B型的个体剂量范围为150-1430U。对于接受较低剂量(共100-899U)的患者，给药期之间的平均时间长度为22.3天；而对于接受较高剂量范围(900-1500U)的患者，为48.4天。

临床效果定义为，在“多伦多西方痉挛性斜颈等级评定量表”(Toronto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale)(TWSTRS)-严重量表(Consky,E.S.,Lang,A.E.(1994)使用肉毒毒素的治疗(Therapywith Botulinum Toxin).Jankovic,J和Hanet M,eds.Marcel Dekker,Inc.,New York)中，当和基线相比，得分下降至少25％(下降=改善)。基线处，所有患者的平均得分类似。较高剂量组中56％患者的TWSTRS-严重性得分呈现下降，与此对照，较低剂量组中为7％的患者。在两组中，尤其是在较早阶段的研究中，还观察到TWSTRS-疼痛得分适度改善。没有证据显示肉毒毒素B型的阻断性抗体的产生。

3．研究3

确诊为颈部肌张力障碍的28名患者(平均年龄50.9岁)，整个时间里，接受将肉毒毒素B型制剂以加大剂量(每后续疗程高达1.5倍)注射到2-4块浅层颈和肩肌肉中的治疗。如上述，用TWSTRS-严重性试验评定临床效果，有25％得分降低的视为改善。

患者参加该研究28-177天，处于研究中的平均时间为71.9天。患者用1-3剂制剂治疗。累积剂量范围为1430U-12000U，并且个体剂量范围为300U-12000U。为了进行临床评定，定义了4个剂量组：100-800U(A组)，900-2399U(B组)，2400-5999U(C组)和6000-12000U(D组)。给药期之间的时间长度范围如下：A组，13-101天，平均35.7天；B组，14-113天，平均48.8天；C组，29-177天，平均62.2天；D组，28-177天，平均55.1天。

研究中，一个治疗组中所有患者的平均基线得分类似，并且所有4组的得分经历了平均下降(改善)。总之，研究中，C组和D组从基线改进的平均百分数以及对严重性得分的平均最大响应率是最高的。测定的平均最大改进、平均最大改进百分数和平均最大响应率，两个较高剂量组的要高于两个较低剂量组的(最大改进为8.1和6.8相对2.1和3.6；平均最大改进为43.9％和35.5％对10％和16.1％；平均最大响应率为0.32和0.23对0.05和0.09)。对治疗有响应的患者百分数，两个较高剂量组(C,80％和D,78％)的要高于两个较低剂量组(A,0％和B,27％)的。响应的平均持续时间，两个较高剂量组的(C,47.6天；D,38.1天)比两个较低剂量组的(A,0天；B,31天)更长。这些数据显示了响应对本发明的肉毒b毒素制剂的剂量依赖性。

4．研究4

研究中，针对安慰剂治疗，试验了3种剂量的肉毒毒素B型制剂，该研究包括：85位CD患者参加的随机、双盲、单剂量、4-臂、平行组、多中心的研究。患者的年龄范围为18-80岁。向2-4块颈和/或肩浅层肌群注射剂量为400、1200或2400U的肉毒毒素B型。用TWSTRS评分表于基线以及于治疗后2和4周评定患者。4周后，TWSTRS严重性记分未能显示3或更多点改善(≥20％)的患者，作为无响应者退出研究。响应者每4周返回评定一次，直到他们的响应水平下降程度大于50％。

所有的TWSTRS得分显示，随肉毒毒素B型制剂剂量增加，病情改善。在第4周，在2400U剂量组与安慰剂治疗患者的对照中，就TWSTRS-疼痛和TWSTRS-总评定两者，患者中出现统计性显著改善，并且2400U剂量组中显示改善的患者的百分数最高。在2、4和8周，和任何其它治疗组相比，2400U剂量组的各平均患者整体评价要高出许多；在第4周数据的方差分析中，在各治疗组之间，存在显著统计性差异(p=0.0286)。在安慰剂组与2400U剂量组之间也存在显著差异(p=0.0050)，且存在在剂量响应分析中(p=0.0028)。在第4周数据的方差分析中，在治疗组之间存在统计性显著差异(p=0.0073)，并且安慰剂组与2400U剂量组之间也存在显著差异(p=0.0015)，而且在剂量响应分析中(p=0.0008)。

患者参加该研究25-203天，其中2400U剂量组的平均天数更多(61天)。

5．研究5

本研究也是随机、双盲、安慰剂对照、单剂量、4-臂、平行组、多中心对门诊病人的研究，其检测安慰剂(A组)或3种剂量之一(B组，2500U；C组，5000U；D组，10000U)单次治疗的效果。通过在确诊患有CD患者的2-4块颈和/或肩浅层肌群中注射肉毒毒素B型制剂进行此治疗。在治疗后2和4周就诊时评价患者。将在第4周时和基线(TWSTRS-总分)相比改善大于20％的那些患者看作“响应者”，并要求其复诊，以便在以4周为间隔的最长4个月中重新评价，或者直到他们的响应得分水平下降大于50％为止。

年龄范围19-81岁的122位患者参加此研究。患者持续在研究中的时间，反映他们响应研究药物的时间。对患者留在研究中的最少和最多天数，治疗组间是相似的。随着剂量增加，处于研究中的平均时间也增加，从安慰剂A组的45天到，61天(B)，67天(C)以及75天(D)。

对所有TWSTRS得分，从基线到第4周，所有治疗组显示改善。随着制剂剂量增加，所有TWSTRS得分趋于改善，在第4周TWSTRS-总分的协方差分析中，治疗组之间总的差异是统计学上显著的(p=0.0001)，另外，剂量响应性分析也是显著的(p=0.0001)，并且安慰剂与有效组(active groups)之间的所有3种对照也是显著的(安慰剂对2500U组的p=0.0016；安慰剂对5000U组的p=0.0005；安慰剂对10000U组的p=0.0001)。在第4周，在TWSTRS-总分、-无能力分数和-疼痛分数方面，D组(10000U)的响应治疗的患者百分数高于任何其它组的。对4种TWSTRS得分(总分，p＜0.001；严重性，p=0.035；无能力，p=0.002；疼痛，p=0.001)中的每一种，均存在显著的剂量响应性。在第4周，所有治疗组的疼痛评价改善，对于B、C和D组，分别达到67.5、70.2和75.1。治疗组之间全部的差异都是统计学显著的(p=0.0049)，剂量反应分析也是统计学显著的(p=0.0017)，并且安慰剂与全部3个有效治疗组之间的对照也是显著的(将B、C及D组分别和安慰剂相对照得到，p=0.0149、0.0084和0.0007)。实施例4：人类受检者对肉毒毒素B型制剂的生理学反应

用本领域公知的电生理学方法测试18名健康受检者对肉毒毒素B型的EDB(extensor digitalis brevis)M波振幅反应。受检者年龄范围为18-22岁。在第2、4、6、9、11、13和14天，后注射(i.m.)1.25U-480U范围剂量的肉毒毒素B型制剂时，进行电生理学研究。数据的分析结果显示，随着剂量增加，EDB M-波的振幅和面积对剂量的依赖性降低。480U时的最大效果导致离开基线的M-波振幅减少75％。

在分开的研究中，让10名受检者随机地在一个EDB中注射一剂肉毒毒素B型制剂“B”，在另一个EDB中注射一剂″BOTOX″(肉毒毒素A型，″A″)，使用5种不同给药方案之一：1.25UA/20UB；2.5UA/80UB；5UA/160UB；7.5UA/320UB；10UA/480UB(2名受检者/给药方案)。在每一EDB肌肉中给一名对照受检者注射盐水。对两种肌肉，M-波振幅和面积的下降速率是相似的，并且最大效果出现在后注射的第6天左右。两种血清型都呈现剂量依赖的M-波振幅递减。对两种毒素来说，第9天时，后训练的容易性最高。

尽管本发明引用特定的方法和实施方案进行描述，但应认识到，无需背离本发明，即可对其进行各种修饰和变更。

Claims

1．一种稳定的药用肉毒毒素液体制剂，其包括药学可接受的缓冲剂和分离的肉毒毒素，该缓冲剂能提供介于约pH5和pH6之间的pH缓冲范围；

其中所述制剂能以液体形式，在介于约0-10℃的温度保持稳定至少1年。

2．权利要求1的制剂，其中所述温度是约5±3℃。

3．权利要求1的制剂，其中所述温度是约4±2℃。

4．权利要求1-3任何一项的制剂，其中所述缓冲剂具有pH4.5-6.5范围内的pK。

5．权利要求1-4任何一项的制剂，其中所述毒素制剂能以液体形式保持稳定至少2年。

6．权利要求1-5任何一项的制剂，其中所述缓冲pH范围是约pH5.6±0.2。

7．权利要求1-6任何一项的制剂，其中所述缓冲剂选自磷酸盐缓冲剂、磷酸盐-柠檬酸盐缓冲剂和琥珀酸盐缓冲剂。

8．权利要求1-7任何一项的制剂，其中所述肉毒毒素是选自血清型A、B、C₁、C₂、D、E、F和G的肉毒毒素血清型。

9．权利要求8的制剂，其中所述肉毒毒素是以约100-20000U/ml范围浓度存在的肉毒毒素B型。

10．权利要求9的制剂，其中所述肉毒毒素B型以约1000-5000U/ml范围的浓度存在。

11．权利要求9或权利要求10的制剂，其中所述肉毒毒素B型以约700千道尔顿(KD)的高分子量复合物存在。

12．权利要求8的制剂，其中所述肉毒毒素是肉毒毒素A型，以约20-2000U/ml范围的浓度存在。

13．权利要求12的制剂，其中所述肉毒毒素A型以约100-1000U/ml范围的浓度存在。

14．权利要求1-13任何一项的制剂，其进一步包括赋形剂蛋白质。

15．权利要求14的制剂，其中所述赋形剂蛋白质选自血清白蛋白、人血清白蛋白重组体和白明胶。

16．一种稳定的药用肉毒毒素液体制剂，其含有药学可接受的液体缓冲剂和分离的肉毒毒素，该缓冲剂能提供介于约pH5和pH6之间的pH缓冲范围；

其中所述毒素制剂能以液体形式，在介于约10-30℃的温度保持稳定至少约6个月。

17．权利要求16的制剂，其中所述温度为大约25℃。

18．权利要求16-17任何一项的制剂，其中所述缓冲剂具有处于pH4.5-6.5范围的pK。

19．权利要求16-18任何一项的制剂，其中所述缓冲剂选自磷酸盐缓冲剂、磷酸盐-柠檬酸盐缓冲剂和琥珀酸盐缓冲剂。

20．权利要求16-19任何一项的制剂，其中所述pH缓冲范围是约pH 5.6±0.2。

21．权利要求16-20任何一项的制剂，其中所述肉毒毒素是选自血清型A、B、C₁、C₂、D、E、F和G的肉毒毒素血清型。

22．权利要求21的制剂，其中所述肉毒毒素是以约100-20000U/ml浓度存在的肉毒毒素B型。

23．权利要求22的制剂，其中所述肉毒毒素B型以约1000-5000U/ml范围的浓度存在。

24．权利要求22或权利要求23的制剂，其中所述肉毒毒素B型以约700KD的高分子量复合物存在。

25．权利要求21的制剂，其中所述肉毒毒素是肉毒毒素A型，以约20-2000U/ml范围的浓度存在。

26．权利要求25的制剂，其中所述肉毒毒素是肉毒毒素A型，以约100-1000U/ml范围的浓度存在。

27．权利要求16-26任何一项的制剂，其进一步包括赋形剂蛋白质。

28．权利要求27的制剂，其中所述赋形剂蛋白质选自血清白蛋白、人血清白蛋白和白明胶。

29．一种治疗患者的方法，该患者需要抑制胆碱能输入选定肌肉、肌群、腺或器官，该方法包括

对患者的选定肌肉、肌群、腺或器官给予药用有效剂量的权利要求1-28任一项的肉毒毒素液体制剂。

30．权利要求29的方法，其中所述患者所患病症选自痉挛状态、眼睑痉挛、斜视、半面痉挛、肌张力障碍、中耳炎、痉挛性结肠炎、肛门痉挛、泌尿的逼肌-括约肌协同障碍、颌咬紧和脊柱弯曲。

31．权利要求30的方法，其中所述患者经受痉挛状态的原因是中风、脊髓损伤、闭合性颅脑创伤、脑瘫、多发性硬化症和帕金森氏症中的一种或多种。

32．权利要求30的方法，其中所述患者患有的肌张力障碍选自痉挛性斜颈(颈部肌张力障碍)、痉挛性发音困难、肢体肌张力障碍、喉性呼吸困难和颌颚痉挛(Meige’s)肌张力障碍。

33．权利要求29的方法，其中所述选定肌肉或肌群造成皱纹或皱眉头。

34．权利要求29的方法，其中所述肌肉是会阴肌并且其中所述患者处于分娩过程中。

35．权利要求29的方法，其中所述患者的病情选自肌筋膜痛、伴随偏头痛的头痛、脉管障碍、神经痛、神经障碍、关节炎痛、背痛、巨汗、鼻漏、哮喘、过度唾液分泌和过度胃酸分泌。

36．权利要求29-35任何一项的方法，其中所述患者对肉毒毒素血清型A不应，并且所述制剂中的所述肉毒毒素选自肉毒毒素血清型B、C₁、C₂、D、E、F和G。

37．权利要求36的方法，其中所述制剂中的所述肉毒毒素为肉毒毒素B型。

38．权利要求29-35任何一项的方法，其中所述患者对肉毒毒素血清型B不应，并且所述制剂中的所述肉毒毒素选自肉毒毒素血清型A、C₁、C₂、D、E、F和G。

39．权利要求38的方法，其中所述制剂中的所述肉毒毒素为肉毒毒素A型。

40．根据权利要求1-28任何一项稳定肉毒毒素液体制剂在制药中的用途，所得药剂用于治疗需要抑制胆碱能传递到选定肌肉、肌群、腺和器官的患者。

41．根据权利要求40的用途，其中所述患者所患病症选自：痉挛状态、眼睑痉挛、斜视、半面痉挛、肌张力障碍、中耳炎、痉挛性结肠炎、肛门痉挛、泌尿的逼肌-括约肌协同困难、颌咬紧和脊柱弯曲。

42．根据权利要求41的用途，其中所述患者经受痉挛状态的原因是中风、脊髓损伤、闭合性颅脑创伤、脑瘫、多发性硬化症和帕金森氏症中的一种或多种。

43．根据权利要求41的用途，其中所述患者患有的肌张力障碍选自痉挛性斜颈(颈部肌张力障碍)、痉挛性发音困难、肢体肌张力障碍、喉性呼吸困难和颌颚痉挛(Meige’s)肌张力障碍。

44．根据权利要求40的用途，其中所述选定肌肉或肌群造成皱纹或皱眉头。

45．根据权利要求40的用途，其中所述选定肌肉是会阴肌并且其中所述患者处于分娩过程中。

46．根据权利要求40的用途，其中所述患者的病情选自肌筋膜痛、伴随偏头痛的头痛、脉管障碍、神经痛、神经障碍、关节炎痛、背痛、巨汗、鼻漏、哮喘、过度唾液分泌和过度胃酸分泌。

47．根据权利要求40-46任何一项的用途，其中所述患者对肉毒毒素A型不应，并且所述制剂中的所述肉毒毒素选自肉毒毒素血清型B、C₁、C₂、D、E、F和G。

48．权利要求47的方法，其中所述制剂中的所述肉毒毒素为肉毒毒素B型。

49．根据权利要求40-46任何一项的用途，其中所述患者对肉毒毒素B型不应，并且所述制剂中的所述肉毒毒素选自肉毒毒素血清型A、C₁、C₂、D、E、F和G。

50．根据权利要求49的用途，其中所述制剂中的所述肉毒毒素为肉毒毒素A型。