ES2181473T5 - Formulaciones liquidas estables de la toxina botulinica. - Google Patents

Abstract

Una formulación farmacéutica líquida estable de toxina botulínica que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable capaz de proporcionar un intervalo tamponado de pH entre aproximadamente pH 5 y pH 6, y toxina botulínica aislada; en la que dicha formulación es estable como un líquido durante al menos un año a una temperatura de entre aproximadamente 0 y 10ºC, o al menos 6 meses a una temperatura de entre aproximadamente 10 y 30ºC.

Description

Formulaciones líquidas estables de la toxina botulínica.

Campo de la invención

La invención se refiere a formulaciones terapéuticas de la toxina botulínica estables, listas para su uso, tal como se caracterizan en las reivindicaciones.

Bibliografía

Consky, E.S., Lang, A.E. (1994) en: Therapy with Botulinum Toxin. Jankovic, J y Hallet M, eds. Marcel Dekker, Inc., Nueva York.

Frankel, A.S., y Kamer, F.M. (1998) Chemical browlift. Arch. Otolaryngol. Surg. 124(3):321-323.

Gartlan, M.G., y Hoffman, H.T. (1992) Crystalline preparation of botulinum toxin type A (Botox): Degradation in potency with storage. Otolaryngology - Head and Neck Surgery 102(2): 135-140.

Hambleton, P., Capel, B., Bailey, N., Heron, N.I., Crooks, A., Melling, J. (1981). Production, purification y toxoiing of Clostridium botulinum type A toxin. Biomedical Aspects of Botulism, Academic Press, NY.

Hardman, J.G. y Limbird, L.E., Exec. Eds. (1996) Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9ª Ed. McGraw-Hill, Nueva York.

Hoffman, H.T., y Gartlan, M.G. (1993) Stability of botulinum toxin in clinical use. Botulinum and Tetanus Neurotoxins (B.R. DasGupta, Ed.), Plenum Press, NY.

Johnson, E.A., Goodnough, M.C., Borodic, G.E., (1997) Patente de los EE. UU. 5.696.077.

Lachman, L., Lieberman, H.A., Kanig, J.L. (1986) The Theory and Practice of Industrial Pharmacy (3ª Ed.), Lea & Febiger, Philadelphia.

Melling, J., Hambleton, P., y Shone, C.C. (1988) Clostridium botulinum toxins: nature and preparation for clinical use. Eye 2:16-23.

Physician's Desk Reference, 51ª Edición, 1997. ("PDR") Medical Economics Company, Inc, Montvale, NJ.

Schantz, D.J. y Kautter, D.A. (1978) Standardized assay for clostridium botulinum toxins, J Assoc. Off. Anal. Chem 61:1.

Simpson, L.L. (1993) The actions of clostridial toxins on storage and release of neutotransmitters. Natural and Synthetic Neurotoxins, A.L. Harvey, Ed., Academic Press Ltd., San Diego, pp. 277-317.

Tsui, J.K.C. (1986), Lancet 2:245-247.

Antecedentes de la invención

La toxina botulínica es un producto polipeptídico de la bacteria anaeróbica Clostridium botulinum. La toxina produce parálisis muscular en mamíferos al bloquear la liberación presináptica del neurotransmisor acetilcolina en la unión neuromuscular. Aunque la toxina se ha asociado durante mucho tiempo con el botulismo letal, en los últimos años se ha usado terapéuticamente para tratar ciertos trastornos de movimientos musculares involuntarios, incluyendo las distonías focales (tales como el estrabismo, el blefaroespasmo esencial y el espasmo hemifacial), así como las distonías segmentales (tales como el tortícolis, la distonía oromandibular y la disfonía espasmódica) y la espasticidad. También se ha encontrado que la toxina tiene utilidad en diversas indicaciones cosméticas, tales como en la reducción no quirúrgica de las "arrugas de la frente" en la cara, así como en el tratamiento de la hiperhidrosis (respiración excesiva).

En la actualidad, hay dos preparaciones de toxina botulínica (Tipo A) que están aprobadas para su uso terapéutico en humanos: "BOTOX®" (Oculinum®; Allergan Inc., Irvine, CA) y "DYSPORT®" (Spexwood Pharmaceuticals, Ltd.; R.U.). Ambas formulaciones se facilitan a los médicos en forma liofilizada para su reconstitución justo antes de su uso.

Debido a las variaciones en los requerimientos de dosificación entre pacientes, la dosis necesaria para cualquier paciente individual puede variar considerablemente. Además, para determinadas indicaciones, el médico debe administrar sólo una pequeña fracción del contenido de un vial preparado a lo largo de un periodo de tiempo prolongado, que puede ser de varias horas. Aunque un estudio publicado ha indicado que las formulaciones líquidas de toxina botulínica pueden volverse a congelar y descongelar con una conservación sustancial de la actividad (Schantz y Kautter, 1978), estudios más recientes que evaluaron la actividad de la toxina reconstituida han demostrado que "BOTOX®" pierde al menos el 44% de su potencia cuando se reconstituye y se almacena en un refrigerador estándar (aproximadamente a 4ºC) durante 12 horas. Además, cuando la formulación reconstituida se almacenaba en un congelador a -70ºC, perdía aproximadamente el 70% de su potencia tras dos semanas (Gartlan y Hoffman, 1993). Por estas razones, se recomienda que tales composiciones no se usen después de 4 horas tras la reconstitución. Esto puede dar como resultado una pérdida significativa del fármaco y suponer un coste al paciente.

Por tanto, se necesita una formulación líquida lista para usar de la toxina botulínica que pueda transportarse, almacenarse y usarse convenientemente, según los médicos lo necesiten. La presente invención proporciona tal formulación.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a formulaciones líquidas estables, listas para su uso, de la toxina botulínica como se caracteriza en las reivindicaciones. Tales formulaciones son particularmente útiles en los estados en los que la reducción o la inhibición de la transmisión nerviosa colinérgica en una región, particularmente en un músculo o grupo de músculos, glándula u órgano, es paliativa. Ejemplos de tales estados se describen en el presente documento.

Generalmente, de acuerdo con la invención, pueden incorporarse cualquiera de los estereotipos de toxina botulínica conocidos (por ejemplo, serotipos A, B, C_{1}, C_{2}, D, E, F o G) u otros serotipos que tengan actividad biológica equivalente, en las formulaciones de la invención. En las realizaciones preferidas, la toxina botulínica usada en la formulación es el serotipo A o B de la toxina botulínica, aislada de Clostridium botulinum.

En las realizaciones preferidas, la toxina botulínica de Tipo B está presente como un complejo de peso molecular de 700 kilodalton en la formulación, a una concentración de aproximadamente 100-20.000 U/ml y, particularmente, entre aproximadamente 1000-5000 U/ml. Cuando se usa el Tipo A, generalmente estará presente en una concentración de aproximadamente 20-2.000 U/ml y particularmente, entre aproximadamente 100-1.000 U/ml. Si se usan combinaciones de diferentes serotipos en la formulación, sus intervalos útiles de dosis o concentración pueden determinarse en proporción a las dosis y a las concentraciones ejemplificadas en el presente documento, de acuerdo con sus actividades biológicas respectivas.

Los tampones que pueden usarse en la formulación son los tampones fisiológicos que se consideran seguros para inyectarse en el tejido de mamíferos, particularmente en los humanos. Los tampones representativos incluyen, pero no se limitan a, sistemas de tampones basados en fosfato, fosfato-citrato, succinato, acetato, citrato, aconitato, malato y carbonato. La formulación de la toxina de la invención puede envasarse en cualquiera de una variedad de envases o viales conocidos en la técnica, mientras se conserve su potencia.

En un aspecto relacionado, la invención incluye el uso de las formulaciones de la invención en la preparación de un medicamento para inhibir la transmisión colinérgica al músculo o grupo de músculos seleccionado, o a una región glandular específica, tal como las glándulas sudoríparas, o a un órgano particular que tenga inervación colinérgica.

Ejemplos de indicaciones terapéuticas y cosméticas que han de tratarse usando la formulación de la toxina botulínica incluyen, pero no se limitan a, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, otitis media, colitis espástica, anismus, disinergia detrusor urinario-esfínter, oclusión mandibular, curvatura espinal, espasticidad, tal como espasticidad debida a uno o más del grupo que consiste en accidente vascular encefálico, lesión de la médula espinal, traumatismo craneoencefálico cerrado, parálisis cerebral, esclerosis múltiple y enfermedad de Parkinson, y distonía (por ejemplo, tortícolis espasmódico (distonía cervical), disfonía espasmódica, distonía de las extremidades, distonía de la laringe, distonía oromandibular (de Meige). La formulación también es administrable al perineo (músculos perineales) de una paciente que está en el proceso de dar a luz a un niño para producir la relajación de tales músculos. Ejemplos de indicaciones cosméticas de la formulación incluyen la administración a los músculos que producen arrugas o a la frente arrugada. Otras indicaciones de la formulación incluyen dolor miofascial, cefalea asociada con migraña, alteraciones vasculares, neuralgia, neuropatía, dolor de artritis, dolor de la espalda, hiperhidrosis, rinorrea, asma, salivación excesiva y secreción excesiva de ácido por el estómago.

Las vías de administración particularmente especificadas de las formulaciones de la invención incluyen la administración intramuscular, subcutánea o iontoforética. Por ejemplo, en estudios llevados a cabo en apoyo de la presente invención, se encontró que la toxina botulínica de Tipo B era eficaz en el control de la distonía cervical cuando se administraba intramuscularmente en una dosis diaria dividida o única de entre 5000-10000 Unidades.

De acuerdo con otro aspecto relacionado, la invención incluye medicamentos para tratar a pacientes que han desarrollado inmunidad o resistencia a un serotipo botulínico específico, con una formulación líquida estable que incluye otro serotipo. Por ejemplo, un paciente que no responda al serotipo A de la toxina botulínica puede tratarse con una formulación líquida estable que contenga cualquiera de los serotipos B, C_{1}, C_{2}, D, E, F o G, o un paciente que no responda al serotipo B de la toxina botulínica puede tratarse con una formulación líquida estable que contenga cualquiera de los serotipos A, C_{1}, C_{2}, D, E, F y G, para proporcionar eficacia renovada.

Estos y otros objetos y características de la invención se harán completamente evidentes cuando se lea la siguiente descripción detallada de la invención, junto con los dibujos adjuntos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas líquidas y estables de la toxina botulínica, y a los usos de las mismas. En la actualidad, aunque se comercializan preparaciones de la toxina botulínica para una variedad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas, debido a la labilidad del principio activo de la toxina en disolución, las formulaciones deben reconstituirse a partir de los componentes liofilizados que tienen requisitos estrictos de almacenamiento. Por ejemplo, "BOTOX®" se proporciona como un polvo liofolizado, que debe transportarse y almacenarse en un congelador a -5ºC o menos y reconstituirse mediante la adición de una cantidad medida de disolución salina justo antes de su uso. Tras la reconstitución, se recomienda que la formulación se administre al paciente en las 4 horas siguientes, y que cualquier producto reconstituido se refrigere durante este tiempo (PDR, 1997); no se recomienda la congelación y descongelación del producto reconstituido (Hoffman, 1993).

La presente invención proporciona una formulación líquida estable tal como se caracteriza en las reivindicaciones. Esta formulación es ventajosa, porque no requiere condiciones inusuales de almacenamiento o transporte y porque reduce la posibilidad de errores en la dilución de la toxina, lo que podría dar como resultado sobredosis.

I. Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, el término "estable" se refiere a la conservación de la actividad biológica o de la potencia por parte de un principio biológicamente activo, específicamente la toxina botulínica, a lo largo de un periodo de tiempo definido o indefinido.

El término "toxina botulínica" se refiere a una proteína o complejo proteínico biológicamente activo, derivado normalmente de la bacteria Clostridium botulinum. El término se refiere a cualquiera de al menos ocho toxinas conocidas serológicamente distintas (A, B, C_{1}, C_{2}, D, E, F y G), así como a cualquier toxina botulínica adicional que tenga la misma capacidad general de inhibir la neurotransmisión colinérgica, que forman la molécula activa. Opcionalmente, el término también incluye una proteína transportadora que también se deriva de C. botulinum y que forma complejos con la molécula activa, tal como se describe en la Sección IIA en el presente documento. Los serotipos de la toxina botulínica están relacionados farmacológicamente, tal como se trata más adelante, pero son inmunológicamente distinguibles. En general, la molécula activa de la toxina tiene un tamaño molecular de entre aproximadamente 145 y 170 kilodaltons (kD). En el contexto de la presente invención, se entiende que la proteína toxina incluye toxinas y proteínas transportadoras que se aíslan de fuentes naturales, así como las toxinas y las proteínas transportadoras correspondientes que se producen recombinantemente de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Además, el término "toxina botulínica" incluye proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que incluyen sustituciones conservadas de aminoácidos, incluyendo deleciones, con respecto a las secuencias conocidas de la toxina botulínica, tal como se describe más adelante.

La "actividad biológica" de la toxina botulínica se refiere a su capacidad para bloquear la neurotransmisión en las sinapsis que tienen receptores de acetilcolina, bloqueando la liberación de acetilcolina por parte de las terminaciones nerviosas. Este término se usa de manera indistinta en el presente documento con los términos "inhibición de la transmisión colinérgica", "inhibición de la entrada colinérgica", "reducción de la entrada colinérgica" y declinaciones de los mismos. Los ensayos in vitro para evaluar la actividad biológica de la toxina incluyen el ensayo de DL_{50} del ratón, tal como se describe en el presente documento. Una "unidad" de actividad en este ensayo se define como la cantidad de proteína toxina requerida para matar al 50% de los ratones a los que administró esa dosis. Una definición funcional de este término se proporciona en el ejemplo 2, en el presente documento.

Los aminoácidos comunes se denominan en el presente documento mediante sus abreviaturas de una o tres letras: alanina (A, Ala), cisteína (C, Cys), ácido aspártico (D, Asp), ácido glutámico (E, Glu), fenilalanina (F, Phe), glicina (G, Gly), histidina (H, His), isoleucina (I, Ile), lisina (K, Lys), leucina (L, Leu), metionina (M, Met), asparagina (N, Asn), prolina (P, Pro), glutamina (Q, Gln), arginina (R, Arg), serina (S, Ser), trenonina (T, Thr), valina (V, Val), triptófano (W, Trp), tirosina (Y, Tyr).

El término "formulación farmacéutica líquida" se refiere a una preparación farmacéuticamente activa del fármaco o del compuesto biológico que puede almacenarse en un excipiente líquido farmacéutico, tal como una disolución salina tamponada o un tampón fisiológico, durante un periodo prolongado de tiempo. La formulación puede ser una formulación concentrada que se diluye en un líquido similar o diferente antes de su uso.

El término "tampón" se refiere a un compuesto, normalmente una sal, que, cuando se disuelve en un medio acuoso, sirve para mantener la concentración del ion de hidrógeno libre de la disolución dentro de un intervalo de pH determinado, cuando se añaden o se eliminan iones de hidrógeno de la disolución. Se dice que una sal o una disolución tiene una "capacidad tamponante" o que "tampona" la disolución en tal intervalo, cuando proporciona esta función. En general, un tampón tendrá una capacidad tamponante adecuada en un intervalo que está dentro de \pm1 unidad de pH de su pK. Un "tampón fisiológico" es un tampón que no es tóxico para los mamíferos, particularmente para los humanos, cuando se administra como parte de una preparación farmacéutica. Ejemplos de tampones fisiológicamente importantes en el contexto de la presente invención se proporcionan en el presente documento.

Un "líquido farmacéuticamente aceptable" es un líquido que se considera seguro para el consumo o la inyección en los mamíferos, particularmente en los humanos.

El término "proteína excipiente", tal como se usa en el presente documento, se refiere a las albúminas séricas, particularmente la albúmina sérica humana y la albúmina sérica humana recombinante. Tales proteínas serán relativamente no inmunogénicas para las especies de mamíferos en las que ha de administrarse la formulación farmacéutica.

El término "que comprende", tal como se usa en el contexto de la presente invención, y particularmente en el contexto de las reivindicaciones, pretende tener el significado del término "que incluye", "que contiene" o "caracterizado por". Una composición o método que "comprende" los elementos A, B y C puede incluir, además de A, B y C, otros elementos no enumerados, tales como X o Y.

El término "aproximadamente", tal como se usa en el contexto de la presente invención, y particularmente en el contexto de las reivindicaciones, significa "alrededor de" o "cerca de". En el contexto de los valores numéricos, sin comprometerse a una definición numérica estricta, el término puede construirse para calcular un valor que es \pm10% del valor o del intervalo enumerado.

El resto de los términos usados en el presente documento deben construirse para adoptar las definiciones usuales conocidas por las personas expertas en la técnica o que se citan en un diccionario estándar médico o científico.

II. Toxina botulínica

Tal como se mencionó anteriormente, la toxina botulínica es un producto polipeptídico producido por varias cepas de Clostridium botulinum. Estas cepas producen al menos ocho toxinas conocidas serológicamente distintas (A, B, C_{1}, C_{2}, D, E, F y G). C. barati y C. botyricum producen cada uno un único serotipo que es similar a los serotipos E y F, respectivamente (Simpson, 1993). En general, la molécula de la toxina tiene un tamaño molecular de entre aproximadamente 145 y 170 kilodaltons (kD). En algunos casos, la molécula activa de la toxina consta de dos cadenas disulfuro unidas formadas a partir de un polipéptido progenitor. Por ejemplo, la toxina botulínica de Tipo B se produce a partir de un único polipéptido precursor de 150 kD, al que se le forma una hendidura para generar dos fragmentos de disulfuro unidos - una cadena pesada (cadena H) de 100 kD y una cadena ligera (cadena L) de 50 kD de actividad máxima. La toxina que se produce en la naturaleza se une no covalentemente a las proteínas transportadoras no tóxicas también producidas por C. botulinum. Estas proteínas transportadoras se unen a las cadenas de la toxina para formar complejos que tienen hasta 900 kD (Tipo A) y, preferiblemente aproximadamente 700 kD para el Tipo B. Las proteínas transportadoras se copurifican con la toxina y óptimamente forman parte de las formulaciones descritas en el presente documento.

Los diversos serotipos de la toxina botulínica muestran diferentes especificidades de unión en las células. Por ejemplo, las toxinas de Tipo A y de Tipo E parecen unirse al mismo sitio de unión sinaptosomal, mientras que la toxina de Tipo B se une a un sitio distinto y no compite por unirse en el sitio de unión de los tipos A/E (Melling, 1988). Aunque no se desea que se una mediante una teoría o mecanismo particulares de acción, se piensa que la cadena H de la toxina proporciona la unión a la célula neuronal y las actividades de penetración celular, mientras que la cadena L actúa para inhibir la liberación de la acetilcolina en la sinapsis. Además, se cree que los tipos A y B de la toxina botulínica usan mecanismos ligeramente diferentes para llevar a cabo la inhibición de la liberación de la acetilcolina: el Tipo A escinde la proteína-25 asociada a la sinapsis (SNAP-25) y el Tipo B escinde la proteína de membrana asociada a la vesícula (VAMP o sinaptobrevina), siendo ambas proteínas componentes de la liberación de la vesícula sináptica de la sinapsis.

Todos los serotipos de la toxina de C. botulinum producen un resultado fisiológico común en los mamíferos. Todos inhiben o bloquean la actividad de la sinapsis colinérgica, lo que da como resultado la parálisis muscular o el bloqueo o la inhibición del órgano o de la función glandular, totales o parciales, dependiendo del sitio de administración. De acuerdo con esto, la formulación de la presente invención puede usarse con cualquiera de los serotipos de la toxina botulínica derivados de C. botulinum que se caracteriza por las actividades biológicas descritas anteriormente. Las secuencias de aminoácidos de la mayoría de los serotipos conocidos en la actualidad también se conocen o pueden determinarse mediante métodos conocidos en la técnica. Se entiende que en el contexto de la presente invención, una formulación de toxina botulínica debe interpretarse además para que incluya una toxina botulínica obtenida recombinantemente por ingeniería que tiene sustituciones conservativas de aminoácidos con respecto a tales secuencias conocidas. Generalmente, tales sustituciones se realizarán a partir de clases estándar de sustitución de los aminoácidos que se producen naturalmente. Por ejemplo, las clases estándar de sustitución pueden ser las seis clases basadas en las propiedades comunes de la cadena lateral y en la mayor frecuencia de sustitución en las proteínas homólogas en la naturaleza, tal como se determina, por ejemplo, mediante una matriz de intercambio de frecuencia estándar conocida en la técnica, tal como la matriz de intercambio de frecuencia de Dayhoff. Por ejemplo, en la matriz de Dayhoff, las clases son Clase I: Cys; Clase II: Ser, Thr, Pro, Hyp, Ala y Gly, que representan pequeñas cadenas laterales alifáticas o cadenas laterales con grupo OH; Clase III: Asn, Asp, Glu y Gln, que representan cadenas laterales neutrales y cargadas negativamente capaces de formar puentes de hidrógeno; Clase IV: His, Arg y Lys, que representan cadenas laterales polares básicas; Clase V: Ile, Val y Leu, que representan cadenas laterales alifáticas ramificadas, y Met; y Clase VI: Phe, Tyr y Trp, que representan cadenas laterales aromáticas. Además, cada grupo puede incluir aminoácidos relacionados análogos, tales como ornitina, homoarginina, N-metil lisina, dimetil lisina o trimetil lisina en la clase IV y una tirosina halogenada en el Grupo VI. Además, las clases pueden incluir los estereoisómeros L y D, aunque se prefieren los aminoácidos L para las sustituciones. A modo de ejemplo, las sustituciones de un Asp por otro residuo de clase II, tales como Asn, Gln o Glu, es una sustitución conservativa.

Aunque la actividad de la toxina botulínica puede medirse usando ensayos electrofisiológicos, tal como se conocen en la técnica, la actividad se mide generalmente inyectando la toxina en animales pequeños, tales como los ratones, y determinando la dosis de toxina requerida para matar, como media, al 50% de los animales sometidos a prueba. Esta dosis se denomina "dosis letal 50" o DL_{50} y se define como una unidad de la actividad biológica. Las dosis para las aplicaciones terapéuticas, por convención, se estandarizan a tales unidades. Tal como se tratará con más detalle en la sección IIIB más adelante, los diversos serotipos pueden tener diferentes potencias terapéuticas humanas medidas por las unidades DL_{50}. Las dosis terapéuticas pueden titularse a partir de esta información, de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica.

III. Preparación de la toxina botulínica

Esta sección describe los métodos para preparar la toxina botulínica que ha de usarse en la formulación de acuerdo con la presente invención.

A. Purificación de la toxina botulínica a partir de C. botulinum

Esta sección proporciona los métodos generales para preparar la toxina botulínica purificada a partir de un cultivo de C. botulinum, ejemplificado por la toxina botulínica de Tipo B. Además de los métodos citados específicamente en el presente documento, se conocen en la técnica métodos alternativos para preparar la toxina botulínica de los tipos A y B, así como otros serotipos conocidos.

Tal como se mencionó anteriormente, el principio activo en las formulaciones de la presente invención es un componente proteínico de extractos de C. botulinum conocido como toxina botulínica, cuyo principio activo tiene un peso molecular de entre aproximadamente 145-170 kD y que normalmente está presente en un complejo de proteína nativo que tiene un peso molecular mucho mayor. Esta sección facilita ejemplos de métodos para la purificación de varias toxinas botulínicas, centrándose en los serotipos A y B de la toxina botulínica. Se entiende que la bibliografía científica general proporciona una orientación de los métodos alternativos de purificación de las toxinas, y las personas expertas en la técnica podrán identificar tales métodos y aplicarlos a la toxina particular deseada para su uso en las formulaciones preparadas de acuerdo con la presente invención.

En general, la toxina botulínica de tipo B se aísla como un complejo a partir de fermentaciones de alto título de cultivos de C. botulinum, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Los cultivos madre pueden obtenerse en los Estados Unidos por instituciones que tienen una licencia del Center for Desease Control (Centro de Control de Enfermedades, CDC) y en otros centros, de acuerdo con la normativa nacional sobre distribución de organismos. Para la purificación de la toxina botulínica de tipo B, C. botulinum Okra o Bean B son materiales de partida apropiados. Los cultivos madre congelados se inoculan en tubos de ensayo que contienen medios de cultivo tales como medio tioglicolato o medio peptona tripticasa, y los cultivos se crecen y se procesan de acuerdo con los métodos que se describen más adelante y que se detallan en la patente de los EE. UU. 5.696.077.

En resumen, los cultivos se extienden de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica para producir cantidad de material de partida bacteriano suficiente como para dar lugar a una producción deseada de la toxina. Generalmente, se requerirán aproximadamente 20 litros de cultivo bacteriano para producir 0,5 gramos de toxina. El cultivo se lleva a temperatura ambiente y el pH del cultivo se ajusta a pH 3,5 con ácido sulfúrico u otro ácido adecuado. Se deja que el precipitado resultante sedimente y se decanta el sobrenadante claro. A continuación se añade cloruro de calcio al precipitado con agitación y se aumenta el volumen con agua desionizada, de manera que la concentración final de CaCl_{2} sea de aproximadamente 150 mM. El pH se eleva hasta cerca de la neutralidad (pH 6,5) y la disolución de la toxina se clarifica por centrifugación. La toxina se vuelve a precipitar por ajuste de pH a 3,7. Se permite que el precipitado resultante sedimente y el precipitado tóxico se recoge por centrifugación, luego se vuelve a disolver en tampón (pH 5,5) y se dializa exhaustivamente durante la noche contra el mismo tampón. La toxina dializada se centrifuga y el sobrenadante resultante se cromatografía mediante una columna de intercambio de aniones (DEAE). La fracción no unida se recoge y se prueba para determinar el contenido de proteínas. Los complejos de la toxina se precipitan de esta fracción añadiendo sulfato de amonio a aproximadamente el 60% de saturación. El sedimento se disuelve en tampón fosfato y se dializa contra el mismo tampón (pH 7,9). Esta preparación de toxina purificada puede usarse para preparar la formulación.

Los métodos para preparar la toxina botulínica de tipo A también son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, Hambleton, et al (1981) y Mellin, et al (1988), describen la producción y la purificación de la toxina botulínica de tipo A de Clostridium botulinum de tipo A NCTC 2916. Los cultivos de la bacteria se hacen crecer a partir de una siembra madre verificada y se inoculan en un fermentador de 30 litros que funciona en condiciones anaeróbicas, de acuerdo con las condiciones estándar conocidas en la técnica. La producción de la toxina se monitoriza continuamente (por ejemplo mediante determinación de la DL_{50}) y cuando se alcanza la producción máxima (aproximadamente 2 x 10^{6} DL_{50}/ml en ratón), el cultivo se acidifica (ajustado con H_{2}SO_{4} 3N a pH 3,5 y la toxina se recoge por centrifugación. Esta toxina precipitada en bruto se vuelve a disolver y a extraer con tampón fosfato 0,2 M (pH 6,0), seguido por tratamiento con ribonucleasa (100 \mug/ml a 34º) y precipitación usando NH_{4}SO_{4} (saturación del 60% a 25º). El precipitado se resuspende entonces y se somete a cromatografía de intercambio iónico DEAE-Sephacel a pH 5,5 (tras la preadsorción del lote). Se monitoriza la actividad de las fracciones y las facciones activas se precipitan de nuevo usando NH_{4}SO_{4} (saturación del 60% a 25º). El precipitado puede almacenarse y volverse a disolver para obtener una formulación de la invención, tal como se describe a continuación.

Las formulaciones de la presente invención preferiblemente incluyen el complejo de unión a la toxina, tal como se prepara de acuerdo con los métodos descritos con respecto a los Tipos A y B de la toxina botulínica, anteriormente, o utiliza formas equivalentes de los tipos C_{1}, C_{2}, D, E, F o G de la toxina botulínica, preparados de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. El título de la toxina se determina mediante dilución seriada del complejo de unión a la toxina reconstituida en una proteína excipiente, tal como la albúmina sérica humana, evitando las burbujas y la agitación violenta, tal como mediante un mezclado en vórtex. De acuerdo con la convención, el título se determina en un ensayo de letalidad en ratón, tal como el ensayo DL_{50} en ratón descrito en el ejemplo 2. Se diluye una disolución de trabajo, se toman alícuotas y se liofiliza para su almacenamiento. Esta disolución madre se prueba en ensayos para determinar la concentración de proteína, la DL_{50}, la pureza y la idoneidad farmacéutica, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica y que se ejemplifican en el ejemplo 2 en el presente documento.

IV. Formulaciones estables de la toxina botulínica

El descubrimiento de la presente invención es que la toxina botulínica puede elaborarse y almacenarse en una formulación líquida estable que conserva su potencia durante un amplio periodo de tiempo, por ejemplo, al menos 1-2 años, a temperaturas de "refrigerador" (es decir, aproximadamente 5 \pm 3ºC, o más específicamente, aproximadamente 4 \pm 2ºC, o más generalmente 0-10ºC) o al menos aproximadamente 6 meses a "temperatura ambiente" (es decir, aproximadamente 25ºC, o más generalmente 10-30ºC). Tal formulación puede administrarse convenientemente a los humanos o a otras especies de mamíferos como un producto farmacéutico sin reconstitución adicional por parte del médico. La formulación se caracteriza por un pH de entre aproximadamente 5 y 6, preferiblemente aproximadamente pH 5,5 - 5,6, mantenido mediante condiciones apropiadas de tamponamiento. La formulación también puede incluir una o más proteínas excipientes.

El ejemplo 1 proporciona los detalles para la preparación de una formulación de toxina botulínica (tipo B) a una concentración de 5000 U/ml. Se entiende que tales condiciones de formulación pueden aplicarse a otros serotipos de la toxina botulínica, tales como la toxina botulínica de Tipo A, en las concentraciones requeridas por tales serotipos, con el fin de proporcionar formulaciones estables en envases convenientes de dosificación.

En resumen, una preparación concentrada de la toxina botulínica, tal como las preparaciones de toxina purificada descritas anteriormente con referencia a los tipos A o B, se mezcla con un diluyente, tal como el tampón succinato, que tenga un pH de entre pH 5 y pH 6, preferiblemente aproximadamente pH 5,6. En el caso de la toxina botulínica de tipo B, es deseable una concentración de aproximadamente 5000 U/ml, tal como se evalúa en el ensayo de DL_{50} del ratón; sin embargo, puede necesitarse o ser deseable cualquier concentración en el intervalo de 100 - 20.000 U/ml o incluso mayor, dependiendo de la dosis que se suministre. En el caso de la toxina botulínica de Tipo A, pueden ser convenientes concentraciones que oscilen desde 20 - 20.000 y, preferiblemente, aproximadamente 100 - 1.000 U/ml. Para la fabricación farmacéutica, se toman muestras de la formulación y se prueba para determinar la presencia de posibles contaminantes microbianos (carga biológica) y se filtra en condiciones estériles en viales de vidrio o de polipropileno para su administración a los pacientes. El producto final puede almacenarse como un líquido durante al menos un año y, preferiblemente, más de dos años a 0 - 10ºC sin pérdida significativa de potencia biológica, como se prueba por la pérdida de potencia <20% en la prueba de DL_{50} del ratón (ejemplo 2).

El diluyente referido anteriormente puede ser cualquier líquido farmacéuticamente aceptable que no afecte adversamente a la estabilidad del complejo y que mantenga un intervalo estable de pH entre aproximadamente pH 5 y pH 6. Ejemplos de tampones particularmente adecuados incluyen los tampones succinato y fosfato; sin embargo, aquellos expertos en la técnica reconocerán que la formulación de la invención no se limitará a un tampón particular, siempre que el tampón proporcione un grado aceptable de estabilidad de pH, o "capacidad tamponante" en el intervalo indicado. Generalmente, un tampón tiene una capacidad tamponante adecuada dentro de aproximadamente una unidad de pH de su pK (Lachman, et al., 1986). En el contexto de la presente invención, esto incluye tampones que tienen pK en el intervalo de aproximadamente 4,5 - 6,5. La idoneidad del tampón puede calcularse basándose en las tabulaciones publicadas de pK o pueden determinarse empíricamente mediante métodos bien conocidos en la técnica. Además de los tampones succinato y fosfato mencionados anteriormente, otros tampones farmacéuticamente útiles incluyen acetato, citrato, aconitato, malato y carbonato (Lachman). El pH de la disolución puede ajustarse al criterio de valoración deseado dentro del intervalo usando cualquier ácido farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, o base, por ejemplo, hidróxido de sodio.

La proteína excipiente añadida a la formulación puede ser cualquiera de varias proteínas o péptidos farmacéuticamente aceptables. Preferiblemente, la proteína excipiente se selecciona por su capacidad para administrarse a un mamífero objetivo sin provocar una respuesta inmune. Por ejemplo, la albúmina sérica humana es idónea para su uso en formulaciones farmacéuticas que se administran a los humanos; por el contrario, la albúmina sérica bovina podría seleccionarse para su uso con el ganado. Otra proteína excipiente farmacéutica conocida, tal como, por ejemplo, la gelatina, puede usarse para este propósito. El excipiente se incluye en la formulación a una concentración suficiente como para evitar la adsorción del complejo proteínico de la toxina al vaso o vial que lo contiene. La concentración del excipiente variará de acuerdo con la naturaleza del excipiente y con la concentración del complejo de la toxina en la formulación. A modo de ejemplo, en los estudios llevados a cabo en apoyo de la presente invención, se ha determinado que una concentración de 0,5 mg/mL de albúmina sérica humana es suficiente para las formulaciones que contienen 5000 U/mL de toxina botulínica de Tipo B, mientras no provoque una reacción inmunológica o alérgica significativa en la mayoría de los humanos; generalmente, las concentraciones de entre aproximadamente 0,05 mg y 1 mg por 1000 U de toxina botulínica B deben proporcionar protección suficiente.

También se han descrito las concentraciones apropiadas de excipiente para estabilizar la toxina botulínica de tipo A. Por ejemplo, "BOTOX®" se estabiliza mediante la adición de 0,5 mg de albúmina por 100 unidades de actividad de la toxina (PDR).

V. Utilidad A. Usos terapéuticos y cosméticos de las formulaciones de toxina botulínica

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden usarse para varias indicaciones en las que se desea la inhibición o el bloqueo de la neurotransmisión colinérgica, particularmente, pero no limitándose a, la transmisión colinérgica asociada con el control de los músculos lisos o esqueléticos. Esta sección proporciona ejemplos de trastornos en los que pueden usarse terapéuticamente las formulaciones de la invención; sin embargo, no debe interpretarse que los ejemplos proporcionados en el presente documento limitan la invención. En la parte B más adelante se describen las dosis representativas y las vías de administración para algunas de estas indicaciones.

Se ha demostrado que la toxina botulínica, particularmente la toxina botulínica de Tipo A, es un tratamiento eficaz de los trastornos del músculo espástico. Un régimen de tratamiento único (que puede incluir múltiples inyecciones intramusculares) puede proporcionar alivio del espasmo muscular incontrolable durante varios meses. Por ejemplo, "BOTOX®" (toxina botulínica de Tipo A) está aprobada por la Food and Drug Administration de los EE. UU. para la inyección localizada en la órbita ocular para el tratamiento del blefaroespasmo. Otras indicaciones incluyen otras distonías focales, tales como la distonía de la laringe, el síndrome de Meige (distonía oromandibular; disquinesia orofacial), el tortícolis espasmódico (Hardman, et al., 1996), la distonía de las extremidades, anismus y disinergia detrusor urinario-esfínter, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, así como rinorrea, otitis media, salivación excesiva, asma, colitis espástica, secreción excesiva de ácido por el estómago (véase, por ejemplo, la patente de los EE. UU. 5.766.005), cefalea asociada con migraña, alteraciones vasculares, neuralgia o neuropatía (patente de los EE. UU. 5.714.468; WO 953041), dolor de artritis (WO 9517904), trastornos del tracto gastrointestinal que implican al músculo estriado o liso (patente de los EE. UU. 5.647.205), relajación del perineo durante el alumbramiento (patente de los EE. UU. 5.562.899) o alivio de la oclusión mandibular (patente de los EE. UU. 5.298.019). La toxina botulínica de tipo A también se ha inyectado localmente para lograr el alivio cosmético del tono muscular que produce "arrugas" en el rostro y para lograr "lifting de la frente" (Frankel, 1998) y se ha encontrado que es útil cuando se inyecta intracutáneamente para tratar la hiperhidrosis focal (sudoración excesiva; WO 9528171; patente de los EE. UU. 5.766.605) así como para tratar la curvatura juvenil de la columna vertebral (patente de los EE. UU. 5.053.005) la parálisis cerebral adulta y juvenil (patente de los EE. UU. 5.298.019; WO 9305800) y los espasmos y las contracciones involuntarias producidas por la parálisis cerebral, la esclerosis múltiple o la enfermedad de Parkinson (patente de los EE. UU. 5.183.462).

En los experimentos realizados en apoyo de la presente invención se han probado formulaciones líquidas estables que contienen toxina botulínica de Tipo B y se ha encontrado que son eficaces en la distonía cervical, también conocida como tortícolis, un estado en el que un individuo experimenta espasmos y contracciones musculares involuntarios en la cabeza, el cuello y la columna vertebral, que resultan de movimientos de giro o inclinación de la cabeza. Este estado también va acompañado frecuentemente por temblor y dolor musculoesquelético. En general, la etiología del trastorno es desconocida; sin embargo, se considera que es el resultado de la disfunción del sistema nervioso central que da como resultado la hiperactividad de la musculatura implicada. Los regímenes actuales de tratamiento, incluyendo los fármacos anticolinérgicos, dopaminérgicos, relajantes musculares, antiespasmódicos y anticonvulsivantes, no proporcionan un alivio sostenido. La toxina botulínica de Tipo B es eficaz en el tratamiento de este estado produciendo parálisis o paresia locales, que tiene un tiempo de comienzo normal de aproximadamente 1 semana tras la inyección y una duración de la respuesta desde aproximadamente 1 hasta 4 meses.

Las formulaciones de los otros serotipos de toxina botulínica son útiles en el tratamiento primario de cualesquiera de los estados descritos previamente con respecto al Tipo A. Además, tal como se menciona anteriormente, la toxina botulínica de los Tipos B-G también son útiles en el tratamiento de los pacientes que no han respondido al tratamiento con la toxina botulínica de Tipo A, debido a la presencia de una respuesta inmune a la toxina. A la inversa, el serotipo A puede usarse en pacientes que no han respondido al serotipo B o a cualquiera de los otros serotipos de la toxina. Las formulaciones de uno o más serotipos de la toxina botulínica puede obtenerse y usarse de acuerdo con la presente invención.

Generalmente se aprecia que, en vista de sus efectos biológicos similares, los diversos tipos de toxina botulínica pueden ser intercambiables en el tratamiento de diversos trastornos, particularmente aquellos relacionados con la espasticidad muscular. No obstante, tal como se describe más adelante con respecto a los tipos A y B, las dosis eficaces (expresadas en términos de DL_{50} o de unidades biológicas) pueden variar significativamente entre los diversos serotipos. Pueden realizarse cálculos de dosis equivalentes basándose en las dosis conocidas descritas con respecto a cualquiera de las toxinas probadas.

B. Dosis y modos de administración

Se sabe que la toxina botulínica es una toxina potente y en ocasiones letal para los animales. Sin embargo, tal como se describe más adelante, cuando se tiene el cuidado suficiente en el ajuste del modo de administración y de la dosis, este fármaco puede usarse de forma segura en los humanos.

Las dosis de las diversas formas de toxina botulínica variarán, de acuerdo con el serotipo de toxina usado. Por ejemplo, en los experimentos realizados en apoyo de la presente invención se ha encontrado que, comparando las unidades DL_{50} del ratón, la toxina botulínica de Tipo A ("BOTOX®") es aproximadamente 4-6 veces más potente que la toxina botulínica de Tipo B en la inducción de parálisis en los monos, evaluada mediante mediciones electrofisiológicas de músculos esqueléticos seleccionados. Esta observación es coherente con los resultados experimentales en ratas que mostraron grandes diferencias en las cantidades de dos toxinas requeridas para producir parálisis de las extremidades de la rata (Sellin; Jackson). En vista de estas observaciones, el médico experto puede calcular o determinar empíricamente las dosis equivalentes apropiadas.

La variación en la dosis recomendada también puede variar de acuerdo con la historia del paciente. Se ha informado de que los pacientes que han recibido dosis repetidas de toxina botulínica de tipo A, por ejemplo, se hacen "resistentes" al tratamiento adicional, requiriendo dosis más grandes para producir un efecto equivalente a lo largo del tiempo. Sin comprometerse a ningún mecanismo particular de acción, se cree que este fenómeno está relacionado con el desarrollo en el paciente de una respuesta inmune específica de serotipo. Los informes sobre la incidencia de anticuerpos en pacientes sometidos a tratamiento repetido con la toxina botulínica de Tipo A oscilan desde aproximadamente el 3% hasta el 57%. De acuerdo con esto, se recomienda en el caso de que el médico elija cambiar los serotipos durante un régimen de tratamiento, la dosis inicial del nuevo serotipo debe calcularse partiendo de la base de un paciente que no ha recibido el tratamiento, en lugar de partir de la base de la historia de dosificación del paciente.

Los métodos apropiados de administración incluyen cualquiera que dé como resultado la administración del principio activo de la toxina al tejido de interés, sin producir efectos secundarios graves al paciente. Tales métodos incluyen, sin limitación, inyección intramuscular (i.m.), administración tópica, subdérmica, aplicación perineural, administración a la corriente iontoforética, y similares. Los procedimientos específicos para la administración de las toxinas botulínicas, incluyendo las maniobras para limitar la distribución sistémica de los componentes activos, son bien conocidos en la técnica. Puede usarse la electromiografía para identificar y localizar más precisamente los grupos musculares específicos, particularmente para los tratamientos que impliquen a los músculos que son difíciles de identificar, tales como los de la órbita del ojo, la laringe y el área pteriogoide, así como los músculos en los sujetos obesos.

El tratamiento de las distonías normalmente se realiza mediante la administración de la toxina en la proximidad de las zonas de inervación del músculo afectado, normalmente mediante inyección intramuscular usando una aguja hipodérmica. Normalmente, la parálisis localizada resultante puede proporcionar alivio a un paciente durante hasta 3 ó 4 meses. Los pacientes pueden someterse a prueba a dosis más bajas y titularse individualmente hasta una dosis óptima, con el fin de lograr bloqueo neuromuscular suficiente como para corregir cualquier disfunción sin producir parálisis manifiesta. Los cambios en la dosis pueden estar indicados si el paciente se hace resistente a la toxina. Una ventaja de la presente invención es que supera un problema de dosificación común relacionado con la inestabilidad del material de la toxina en disolución, lo que puede conducir a otras ambigüedades concernientes a la dosis apropiada.

Las dosis recomendadas de toxina botulínica de Tipo A se han determinado para varias indicaciones y son conocidas en la técnica. Por ejemplo, para el tratamiento del estrabismo, se recomienda una dosis de 1,25 - 2,5 U de toxina botulínica de tipo A para la administración a los músculos verticales y para el estrabismo horizontal de menos de 20 dioptrías; se recomiendan 2,5-2 U para el estrabismo horizontal de más de 20 dioptrías prismáticas (Physician's Desk Reference, 51^{st} Edition).

La toxina botulínica de Tipo A también se usa para el tratamiento del blefaroespasmo a una dosis de 1,25 - 2,5 U inyectada, usando una aguja de calibre 27-30, en el oculi orbicular pretarsiano lateral y medio del párpado superior y en el oculi orbicular pretarsiano lateral del párpado inferior. Se espera que los tratamientos duren aproximadamente 3 meses; en el tratamiento repetido, la dosis puede aumentarse hasta dos veces, dependiendo de la respuesta del paciente. Se recomienda que se administre una dosis acumulativa de no más de 200 U de toxina botulínica de tipo A durante un periodo de 30 días (Physician's Desk Reference, 51^{st} Edition).

El ejemplo 3 proporciona ejemplos de estudios que oscilan en la dosis para el uso de la toxina botulínica de Tipo B en el tratamiento de la distonía cervical (tortícolis) usando una formulación de acuerdo con la presente invención. En estos estudios, también explicados más adelante, se proporcionó la formulación líquida de la toxina botulínica de tipo B de acuerdo con la invención a los médicos que la administran con instrucciones para almacenar la formulación en un refrigerador clínico con control de temperaturas de 2-8ºC. Generalmente, se suministró la formulación a partir de lotes preparados y almacenados a la temperatura recomendada durante 6-12 meses. Los médicos recibieron un suministro aproximado de 6 meses de la formulación.

En resumen, se administró a los pacientes dosis variables de la toxina, mediante inyección intramuscular (i.m.) en 2-4 grupos de músculos del cuello y/o del hombro, determinadas de acuerdo con la evaluación de los médicos de la implicación del músculo en el trastorno. En un estudio se administraron dosis individuales divididas que oscilaban desde 100-1200 U, con dosis acumulativas de entre 270-2280 U durante un periodo que oscilaba hasta 398 días. Todos los pacientes experimentaron mejoría durante el estudio y no se observó disminución de la potencia de la formulación en el transcurso del estudio.

Estudios adicionales llevados a cabo en apoyo de la presente invención revelaron que los pacientes que se habían hecho resistentes a la toxina botulínica de tipo A podían tratarse con la toxina botulínica de Tipo B. Los pacientes que participaron en el estudio mostraron una disminución de su respuesta a la toxina botulínica de tipo A y se consideraron tratados con éxito si, tras el tratamiento, mostraron al menos una disminución del 25% en la puntuación total (disminución = mejoría) calculada por la Toronto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale (Escala Toronto Western de clasificación de tortícolis espasmódico, TWSTRS; Consky, 1994), en comparación con la puntuación inicial. Se administraron dosis individuales de entre 150-1430 U de la formulación de toxina botulínica de tipo B, con dosis acumulativas que oscilaban desde 300-12000 unidades durante hasta 117 días, tal como se detalla en el ejemplo 3. En general, los pacientes experimentaron una mejoría en este estudio, particularmente a dosis más elevadas, y no hubo evidencia de desarrollo de anticuerpos bloqueantes a la toxina botulínica de tipo B, ni hubo evidencia de disminución de la potencia de la formulación. En otro estudio, se administraron periódicamente dosis individuales de 0, 400, 1200 y 2400 U de la toxina botulínica de Tipo B durante periodos de hasta 203 días, con éxito en el tratamiento del tortícolis, tal como se describió anteriormente.

Los siguientes ejemplos ilustran, pero en modo alguno pretenden limitar la presente invención.

Ejemplos Materiales

A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos descritos en el presente documento pueden obtenerse de cualquier vendedor comercial reputado que venda los reactivos para su uso en las industrias química, bioquímica, biotecnológica o farmacéutica, según sea apropiado.

Ejemplo 1 Preparación de la formulación estable de la toxina botulínica A. Preparación del tampón succinato

El tampón succinato se preparó en lotes de 3 L con 2,7 mg/ml de succinato de disodio y 5,8 mg/mL de cloruro de sodio, suplementado con 0,5 mg/mL de albúmina sérica humana (Michigan Biological Products Institute). Se usó ácido clorhídrico concentrado para ajustar el pH del tampón al pH 5,6. El tampón se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum en un recipiente sellado que se había esterilizado en autoclave. Antes de usarse, se tomaron muestras del tampón y se probó para determinar el pH, la endotoxina bacteriana y la carga biológica.

B. Preparación de la formulación de toxina botulínica

Se diluyó una alícuota de toxina botulínica concentrada de Tipo B aproximadamente 1000 veces usando tampón succinato (pH 5,6) para obtener una potencia de 5000 \pm 1000 U/ml. La toxina diluida se almacenó en recipientes de vidrio sellados de 2L y se denominó "Disolución a Granel". Luego se almacenó a 5 \pm 3ºC hasta que el material se transportó para llenado.

Antes de llenarse, se tomaron muestras de la Disolución a Granel y se probó para determinar la presencia de contaminación microbiana (carga biológica) de acuerdo con los métodos estándar conocidos en la técnica. Después se transfirió mediante una bomba peristáltica a través de tubos médicos graduados y se filtraron en condiciones estériles (0,2 \mum) en un depósito a granel estéril localizado dentro de la cámara de llenado. La Disolución a Granel filtrada y estéril resultante se llenó en viales de vidrio de 3,5 cc en alícuotas de 0,5 mL (2500 U), 1 mL (5000 U) o 2 mL (10000 U).

La composición del producto del recipiente final se muestra en la tabla 1.

TABLA 1 Composición de la formulación de la toxina botulínica B

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Ejemplo 2 Pruebas de estabilidad de la formulación de toxina botulínica A. Resultados de estabilidad

La toxina botulínica de tipo B se fabricó, se diluyó tal como se describió anteriormente hasta una concentración de 2500 unidades/ml y se almacenó como alícuotas de 1 mL en viales de vidrio de 5 mL a 5ºC durante hasta 30 meses incluidos. A los 0, 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 y 30 meses tras el almacenamiento inicial, se eligieron alícuotas aleatoriamente y se probaron para determinar su potencia en el ensayo de DL_{50} en el ratón. Las disoluciones también se observaron para precisar su aspecto y se probaron para determinar el pH de acuerdo con métodos estándar.

La tabla 2 muestra los resultados de las pruebas de las alícuotas sacadas en varios puntos de tiempo. Estos resultados indican que las formulaciones preparadas de acuerdo con la presente invención son estables, tal como se evidencia por una potencia que está dentro del intervalo de potencias notificadas en el momento 0, durante al menos 30 meses cuando se almacena a 5ºC.

TABLA 2 Estabilidad de la formulación a 5ºC

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La tabla 3 muestra los resultados de las pruebas en las alícuotas de la formulación de toxina botulínica de tipo B preparada y de la que se tomaron alícuotas tal como se describió anteriormente, pero almacenadas a 25ºC. Estos resultados indican que la formulación es estable durante al menos 6 meses a 25ºC, tal como se evidencia por una potencia media que conserva al menos aproximadamente el 90%, y preferiblemente al menos el 95%, tras 6 meses de almacenamiento, y al menos aproximadamente el 75% de su potencia inicial tras 9 meses de almacenamiento a 25ºC.

TABLA 3 Estabilidad de la formulación a 25ºC

3

B. Pruebas de estabilidad 1. Determinación del pH de la formulación de toxina botulínica

El pH de la formulación de toxina botulínica de tipo B se midió usando un medidor de pH Accumet de Fisher Scientific, Modelo 50 con una sonda automática de compensación de temperatura. El electrodo fue un Electrodo de Combinación Orion Ross con un electrodo de referencia de KCl. La determinación de pH se realizó siguiendo una estandarización de dos puntos (pH 4,0, pH 7,0) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Se realizaron tres mediciones de cada muestra. Los valores de pH se anotaron en 2 cifras significativas y se hizo la media.

2. Prueba de la potencia DL_{50} en ratón

Se usaron ratones sanos, no utilizados previamente, CFW o CD-1, de cualquiera de los dos sexos, con un peso de 18 a 22 g para determinar la DL_{50}. Para cada producto lleno, los ratones se probaron en 5 dosis de la formulación de la toxina botulínica de tipo B. Cada ensayo se realizó por quintuplicado.

Se prepararon dos disoluciones madre a partir de la muestra de prueba. La Disolución Madre A se obtuvo diluyendo la muestra de la prueba hasta una potencia calculada de 750 U/mL con tampón fosfato y gelatina, pH 6,2. La Disolución Madre B se obtuvo diluyendo la disolución A 10 veces hasta 75 U/mL. Las siguientes diluciones de prueba se prepararon a partir de la Disolución Madre B: 1:7,5, 1:10, 1:13,5, 1:18 y 1:24,3.

A los ratones se les administraron inyecciones intraperitoneales de 0,2 mL de la dilución apropiada del compuesto. Los ratones se mantuvieron durante 4 días tras la inyección y se observaron diariamente. Cualquier muerte fue registrada. Las observaciones se finalizaron tras cuatro días.

Se calcularon las Muertes Acumulativas (MA) a diferentes niveles de dilución añadiendo el número de muertes desde la dilución máxima hacia arriba. Los Supervivientes Acumulativos (SA) se calcularon añadiendo el número de supervivientes desde la dilución mínima hacia abajo. El % de MA se calculó como MA/(MA+SA) x 100% en cada dilución. La dilución que representa la DL_{50} se determinó por el método de la Distancia Proporcional (PD) de Reed y Muench usando las diluciones que producen los valores de % de MA que se equiparan con el 50% de Muertes Acumulativas.

La Distancia Proporcional (PD) = \frac{(%MA > 50%) - 50%}{(%MA>50%) - (%MA<50%)}

El valor de DP obtenido se multiplicó por la diferencia del logaritmo entre los niveles de dilución que se equiparan al 50% de MA. Este valor se añadió al logaritmo de la dilución con mortalidad (MA) mayor que 50 para obtener la dilución que representa la DL_{50}. Se calculó el antilogaritmo de esta dilución para obtener el número de unidades de DL_{50} de toxina por volumen de inyección (0,2 mL). Este número se multiplicó entonces por 5 para obtener las unidades de DL_{50} por mL de Disolución Madre B de la toxina.

Las unidades de DL_{50} por mL de Disolución Madre B se multiplicaron por su factor de dilución (es decir, la dilución requerida para producir una potencia calculada de 75 U/mL) para obtener la potencia de la muestra. Se calculó la media aritmética y la desviación estándar de las unidades de DL_{50} por mL para 5 pruebas válidas.

3. Aspecto de la formulación

El aspecto se evaluó mediante inspección visual en contraste con fondos en blanco y negro bajo luz brillante tras una agitación suave. Se evaluó el color, la claridad y la presencia de partículas visibles.

Ejemplo 3 Tratamiento de la distonía cervical (DC) A. Dilución, cálculo, administración y régimen de dosificación del fármaco 1. Manipulación del fármaco

Se llenaron los viales del fármaco para suministrar 2,0 mL (10000 U), 1,0 mL (5000 U) o 0,5 mL (2500 U) del fármaco del estudio sin diluir. Se evitó la agitación violenta o la formación de burbujas en todas las etapas de la manipulación, ya que la toxina botulínica puede desnaturalizarse por cualquiera de esas condiciones. La formulación se sacó del vial usando una jeringa de tuberculina de 1 mL, asegurándose de que se sacaba el volumen exacto.

2. Cálculo del fármaco

La toxina botulínica de tipo B se administró a pacientes con distonía cervical (DC) mediante la administración del contenido del(de los) vial(es) apropiado(s) para proporcionar las dosis indicadas en la tabla mostrada más adelante. Las unidades (U) del ratón por aumento de la dosis se calculan tal como sigue, donde 1U es la cantidad de toxina presente en una dosis que representa la DL_{50}, determinada en el ratón tal como se describe en el ejemplo 2.

Para cada sesión de dosificación, se administró la toxina botulínica de Tipo B de acuerdo con los procedimientos estándar, tal como se detalla a continuación. Un médico neurólogo previamente formado en el uso terapéutico de la toxina botulínica en pacientes con DC administró las inyecciones del compuesto. Se pidió a los pacientes que se relajaran lo máximo posible para facilitar la observación de la postura de la cabeza y del cuello en reposo. Se realizó la determinación de los músculos del cuello implicados en producir la DC y se confirmó por palpación de los músculos implicados. Según el criterio del investigador, se realizó la evaluación EMG para localizar adicionalmente los músculos principalmente afectados. Los músculos considerados para tratamiento en este protocolo son elevador de la escápula, escaleno medio y anterior, semiespinal de la cabeza, esplenio de la cabeza, esternocleidomastoideo y trapecio. Se pusieron inyecciones en cada uno de estos músculos en de 1 a 5 sitios. El volumen total de inyección por sitio fue inferior o igual a 1,0 mL para evitar la distorsión local del tejido, pero al menos de 0,1 mL para facilitar la medición exacta del volumen con una jeringa estándar de 1,0 mL. Inicialmente, los pacientes recibieron una dosis total de 5000 U, con dosis posteriores de hasta aproximadamente 15000 unidades en las visitas de seguimiento a la clínica.

B. Estudios clínicos de la distonía cervical (DC) Estudio 1

Ocho pacientes (3 hombres, 5 mujeres) que tenían una edad media de 43,9 años y un diagnóstico clínico individual de DC idiopática, tomaron parte en un estudio en el que se inyectó la formulación de toxina botulínica de Tipo B en 2-4 grupos de músculos superficiales del cuello y/o del hombro. Se permitió a los pacientes que se sometieran al tratamiento con una frecuencia de hasta cada 4 semanas, siempre que no hubiera efectos adversos graves ni mejoría clínica persistente en la presentación. Los pacientes participaron en 1-5 sesiones de dosificación. Las sesiones de dosificación individuales oscilaron desde 100 U hasta 1200 U con dosis acumulativas totales que oscilaban desde 270 U hasta 2280 U de la formulación de toxina botulínica de Tipo B, tal como se describe en el presente documento. Se evaluó la eficacia usando la Escala de Tortícolis de Tsui (Tsui, J.K.C. (1986), Lancet 2: 245-247). Los pacientes participaron en el estudio durante de 127 a 398 días, con un tiempo medio en el estudio de 244,8 días. Las puntuaciones de tortícolis fueron similares en el nivel inicial y todos los pacientes experimentaron una disminución moderada en la puntuación (disminución = mejoría) con alguna indicación de una tendencia relacionada con la dosis, cuando se compararon las dosis totales. En general, los pacientes experimentaron mejoría en los estados de tortícolis. No hubo indicación de desarrollo de anticuerpos bloqueantes en este estudio.

Estudio 2

Los pacientes incluidos en este estudio tenían un diagnóstico clínico de DC idiopática (tortícolis) y habían desarrollado resistencia a la toxina botulínica de tipo A. Los pacientes recibieron inyecciones intramusculares de la formulación de toxina botulínica de Tipo B de acuerdo con la presente invención a 2-4 músculos superficiales del cuello y el hombro.

Doce pacientes (edad media 52,3 años) entraron y completaron el estudio. Los pacientes participaron en el estudio desde los días 37 al 127, con un tiempo medio de 65 días. Los pacientes se trataron con de 1 a 3 dosis del fármaco del estudio. Las dosis acumulativas oscilaron desde 940-2100 U, y las dosis individuales oscilaron de 150-1430 U de toxina botulínica de Tipo B. La longitud media de tiempo entre las sesiones de dosificación fue de 22,3 días para los pacientes que recibieron dosis inferiores (100-899 U total) y 48,4 días para los que estaban en el intervalo de dosificación más elevado (900-1500 U).

El beneficio clínico se definió como al menos un 25% de disminución en la puntuación de Toronto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale (TWSTRS) (Escala Toronto Western de la clasificación de tortícolis espasmódico) - la Escala de gravedad (Consky, E.S., Lang, A.E. (1994) En: Therapy with Botulinum Toxin. Jankovic, J y Hallet M, eds. Marcel Dekker, In., Nueva York) en comparación con el nivel inicial (disminución = mejoría). La puntuación media fue similar en todos los pacientes en el nivel inicial. El 56% de los pacientes en el grupo de dosis más elevada mostró una disminución en la puntuación de TWSTRS-gravedad, en comparación con el 7% de los pacientes en el grupo de dosis menor. También se observó una modesta mejoría en las puntuaciones de TWSTRS-dolor observadas en ambos grupos, particularmente en las fases iniciales del estudio. No hubo evidencia de desarrollo de anticuerpos bloqueantes a la toxina botulínica de Tipo B en estos pacientes.

Estudio 3

Veintiocho pacientes (edad media 50,9 años) con un diagnóstico confirmado de distonía cervical, recibieron inyecciones de la formulación de toxina botulínica de Tipo B en 2-4 músculos superficiales del cuello y del hombro en dosis crecientes (hasta 1,5 veces por sesión sucesiva) a lo largo de tiempo. Se evaluó el beneficio clínico usando la prueba de TWSTRS-gravedad, tal como se describió anteriormente, considerándose una reducción del 25% en la puntuación como una mejoría.

Los pacientes participaron en el estudio desde 28-177 días con un tiempo medio en el estudio de 71,9 días. Los pacientes se trataron con de 1 a 3 dosis de formulación. Las dosis acumulativas oscilaron desde 1430 U hasta 12000 U, con dosis individuales que oscilaban desde 300 U hasta 12000 U. Para propósitos de evaluación clínica, se definieron 4 grupos de dosis: 100-800 U (Grupo A), 900 2399 U (Grupo B), 2400-5999 U (Grupo C) y 6000-12000 U (Grupo D). El tiempo entre las sesiones de dosificación osciló tal como sigue: Grupo A, 13-101 días, media de 35,7 días; Grupo B, 14-113 días, media de 48,8 días; Grupo C, 29-177 días, media de 62,2 días; Grupo D, 28-177 días, media de 55,1 días.

Las puntuaciones iniciales medias fueron similares en todos los pacientes en todos los grupos de tratamiento, y los 4 grupos experimentaron una disminución media en la puntuación (mejoría) durante el estudio. En general, el porcentaje medio de mejoría desde el nivel inicial y la proporción de respuesta media para la puntuación de gravedad fueron mayores en los Grupos C y D durante el estudio. Las medidas de la mejoría máxima media, el porcentaje de mejoría máximo medio y la proporción de respuesta máxima media fueron mayores que para los dos grupos de dosis más elevada que para los dos grupos de dosis menos elevada (8,1 y 6,8 frente a 2,1 y 3,6 para la mejoría máxima; 43,9% y 35,5% frente a 10% y 16,1% para la mejoría máxima media; 0,32 y 0,23 frente a 0,05 y 0,09 para la proporción de respuesta máxima media). El porcentaje de pacientes que respondieron al tratamiento fue superior para los dos grupos de dosis más elevada (C, 80% y D, 78%) que para los dos grupos de dosis menos elevada (A, 0% y B, 27%). La duración media de la respuesta fue superior para los dos grupos de dosis más elevada (C, 47,6 días; D, 38,1 días) que para los dos grupos de dosis menos elevada (A, 0 días; B, 31 días). Estos datos muestran una respuesta dependiente de la dosis a las formulaciones de toxina botulínica b de acuerdo con la presente invención.

Estudio 4

Se probaron tres dosis de la formulación de toxina botulínica de Tipo B frente a tratamiento con placebo en un estudio que incluyó a 85 pacientes DC que entraron en un estudio aleatorizado, doble ciego, de dosis única, de 4 ramas, de grupos paralelos, multicéntrico. Los pacientes oscilaban en edad desde 18 hasta 80 años. Las dosis fueron de 400, 1200 ó 2400 U de toxina botulínica de Tipo B inyectadas en 2-4 grupos de músculos superficiales del cuello y/o del hombro. Los pacientes se evaluaron usando la escala de puntuación TWSTRS en el inicio y en las semanas 2 y 4 tras el tratamiento. Los pacientes que no mostraron 3 o más puntos de mejoría (\geq 20%) en la puntuación de gravedad TWSTRS tras 4 semanas tras se retiraron del estudio como no respondedores. Los respondedores volvieron para ser evaluados cada 4 semanas, hasta que sus niveles de respuesta fueron superiores al 50%.

Todas las puntuaciones TWSTRS mostraron mejoría al incrementar la dosis de la formulación de toxina botulínica de Tipo B. En la semana 4, hubo una mejoría estadísticamente significativa en los pacientes del grupo de dosis de 2400 U, en comparación con los pacientes tratados con placebo, tanto en las evaluaciones de TWSTRS-dolor como en las de TWSTRS-total, y el porcentaje de pacientes que mostraron mejoría fue superior en el grupo de 2400 U. Las evaluaciones globales medias de los pacientes fueron considerablemente superiores en el grupo de 2400 U en las semanas 2, 4 y 8, en comparación con cualquiera de los otros grupos de tratamiento; en los análisis de varianza sobre los datos de la semana 4, hubo una diferencia estadísticamente significativa (p = 0,0286) entre los grupos de tratamiento. También hubo diferencias significativas entre el grupo placebo y el de 2400 U de dosis (p = 0,0050) y en el análisis de respuesta a la dosis (p = 0,0028). En los análisis de varianza de los datos de la semana 4, hubo una diferencia estadísticamente significativa (p = 0,0073) entre los grupos de tratamiento y también hubo diferencias significativas entre los grupos de placebo y de dosis de 2400 U (p = 0,0015) y en el análisis de respuesta a la dosis (p = 0,0008).

Los pacientes participaron en este estudio desde 25 a 203 días, con una media superior del número de días para el grupo de dosis de 2400 U (61 días).

Estudio 5

Este estudio también fue un estudio aleatorizado, doble ciego, controlado por placebo, de dosis única, de 4 ramas, de grupos paralelos, multicéntrico, de pacientes externos, que examinó los efectos de un tratamiento único de placebo (Grupo A) o de uno de tres dosis (2500 U, Grupo B; 5000 U, Grupo C; 10000 U, Grupo D) de la formulación de toxina botulínica de Tipo B inyectada en de 2 a 4 grupos de músculos superficiales del cuello y/o del hombro en pacientes con diagnóstico confirmado de DC. Los pacientes se evaluaron en visitas a las 2 y 4 semanas tras el tratamiento. Los que tuvieron una mejoría superior al 20% en la semana 4 en comparación con el nivel inicial (puntuación de TWSTRS-total) se consideraron "respondedores" y se les pidió que volvieran para reevaluación a intervalos de 4 semanas durante un máximo de 4 meses, o hasta que su nivel de puntuación de respuesta fuera superior al 50%.

Ciento veintidós pacientes, que oscilaban en edad en 19-81 años, entraron en el estudio. El tiempo que los pacientes continuaron en el estudio reflejó el tiempo que respondieron al fármaco del estudio. Los grupos de tratamiento fueron similares durante el número mínimo y máximo de días que los miembros pacientes permanecieron en el estudio. El tiempo medio en el estudio aumentó a medida que se incrementaba la dosis, desde 45 días para el Grupo A de placebo, hasta 61 días (B), 67 días (C) y 75 días (D).

Para todas las puntuaciones de TWSTRS, todos los grupos de tratamiento mostraron mejoría desde el nivel inicial hasta la semana 4. Todas las puntuaciones de TWSTRS tendieron a mejorar a medida que aumentaba la formulación de la dosis. En el análisis de covarianza sobre las puntuaciones de TWSTRS-total de la semana 4, la diferencia global entre los grupos de tratamiento fue estadísticamente significativa (p = 0,0001). Además, el análisis de respuesta a la dosis fue significativo (p = 0,0001), y las 3 comparaciones del placebo con los grupos activos fueron significativos (p = 0,0016 para el placebo frente a 2500 U; p = 0,0005 para el placebo frente a 5000 U; p = 0,0001 para el placebo frente a 10.000 U). El porcentaje de pacientes que respondieron al tratamiento en la semana 4 fue superior en el Grupo D (10000 U) que en cualquier otro grupo para las puntuaciones de TWSTRS-total, -discapacidad y -dolor. Hubo una respuesta a la dosis significativa para cada una de las cuatro puntuaciones de TWSTRS (total, p < 0,001; gravedad, p = 0,035; discapacidad, p = 0,002; dolor, p = 0,001). La evaluación del dolor mejoró para todos los grupos de tratamiento en la semana 4, hasta 67,5, 70,2 y 75,1 en los grupos B, C y D, respectivamente. Las diferencias globales entre los grupos de tratamiento fueron estadísticamente significativas (p = 0,0049), el análisis de respuesta a la dosis fue estadísticamente significativo (p = 0,0017) y las comparaciones del placebo con los tres grupos de tratamiento activo fueron significativos (p = 0,0149, 0,0084 y 0,0007 para los grupos B, C y D, en comparación con el placebo, respectivamente).

Ejemplo 4 Respuesta psicológica a la formulación de toxina botulínica de Tipo B en sujetos humanos

Se sometieron a prueba 18 sujetos para determinar la respuesta de amplitud de la onda M del extensor digital breve (EDB) a la toxina botulínica de Tipo B usando métodos electrofisiológicos estándar conocidos en la técnica. Los sujetos oscilaban en edad desde 18-22 años. Los estudios electrofisiológicos se llevaron a cabo en los días 2, 4, 6, 9, 11, 13 y 14 tras la inyección de dosis que oscilaban desde 1,25 U hasta 480 U (i.m.) de la formulación de toxina botulínica de Tipo B. Los resultados de los análisis de los datos mostraron una disminución dependiente de la dosis en la amplitud de la onda M del EDB y del área con las dosis crecientes. El efecto máximo a 480 U dio como resultado una reducción del 75% en la amplitud de la onda M desde el nivel inicial.

En un estudio separado, se aleatorizaron 10 sujetos para inyectarles una dosis de la formulación "B" de toxina botulínica de Tipo B en un EDB y una dosis de "BOTOX®" (Toxina botulínica de Tipo A, "A") en el otro EDB usando uno de cinco esquemas de dosificación diferentes: 1,25 U A/20 U B; 2,5 U A/80 U B; 5 U A/160 U B; 7,5 U A/320 U B; 10 U A/480 U B (2 sujetos por programa de dosificación). A un sujeto control se le administró una inyección de disolución salina en cada músculo EDB. La tasa de disminución en la amplitud de la onda M y el área fue similar en ambos músculos, produciéndose el efecto máximo aproximadamente en el día 6 tras la inyección. Ambos serotipos mostraron una disminución dependiente de la dosis en la amplitud de la onda M. La facilitación tras el ejercicio fue mayor en el día 9 para los dos tipos de toxina.

Claims (22)

1. Una formulación farmacéutica líquida estable lista para su uso; una solución salina regulada farmacéuticamente aceptable que proporciona un rango de pH regulado entre pH 5 y pH 6; y toxina botulínica aislada que es estable en dicha formulación durante al menos un año a una temperatura de entre aproximadamente 0 y 10ºC, o al menos 6 meses a una temperatura de entre aproximadamente 10 y 30ºC.

2. La formulación de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicho intervalo de pH tamponado es pH 5,6 \pm 0,2.

3. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que dicha solución salina regulada es regulada con tampón fosfato, tampón fosfato-citrato y tampón succinato.

4. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha toxina botulínica es un serotipo de toxina botulínica A, B, C_{1}, D, E, F o G.

5. La formulación de la reivindicación 4, en la que toxina botulínica es la toxina botulínica de Tipo B y está presente en la formulación farmacéurica líquida lista para su uso en una concentración en el intervalo de aproximadamente 100 - 20.000 U/ml.

6. La formulación de la reivindicación 5, en la que dicha toxina botulínica de Tipo B está presente en una concentración de entre 1000 - 5000 U/ml.

7. La formulación de la reivindicación 5 o la reivindicación 6 en la que dicha toxina botulínica de Tipo B está presente en un complejo de alto peso molecular de aproximadamente 700 kilodaltons (kD).

8. La formulación de la reivindicación 4, en la que dicha toxina botulínica es la toxina botulínica de Tipo A, y está presente en la formulación farmacéutica líquida lista para su uso en una concentración en el intervalo de aproximadamente 20 - 2000 U/ml.

9. La formulación de la reivindicación 8, en la que dicha toxina botulínica de Tipo A está presente en la formulación farmacéutica líquida lista para su uso en una concentración en el intervalo de aproximadamente 100 - 1000 U/ml.

10. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicha albúmna de suero es albúmina de suero recombinante humana.

11. La formulación de la reivindicación 1, donde la formulación farmacéutica líquida lista para su uso comprende cloruro de sosio 100 mM; tampón de succinato 100 mM a un pH regulado de 5.6; 0.5 Mg/mL de albúmina de suero humana; y botulinum tipo B presente en una concentración de 5,000 \pm 1000 U/ml.

12. El uso de una formulación estable líquida de toxina botulínica, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para fabricar un medicamento para inhibir la transmisión colinérgica a un músculo, grupo de músculos, glándula u órgano seleccionados.

13. El uso según la reivindicación 12, en el que dicho medicamento es para tratar un trastorno seleccionado del grupo que consiste en espasticidad, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, distonía, otitis media, colitis espástica, anismus, disinergia detrusor urinario -esfínter, oclusión mandibular y curvatura espinal.

14. El uso según la reivindicación 13, en el que dicho medicamento es para tratar la espasticidad debida a uno o más de los grupos que consisten en accidente vascular encefálico, lesión de la médula espinal, traumatismo craneoencefálico cerrado, parálisis cerebral, esclerosis múltiple y enfermedad de Parkinson.

15. El uso según la reivindicación 13, en el que dicho medicamento es para tratar una distonía seleccionada del grupo que consiste en tortícolis espasmódico (distonía cervical), disfonía espasmódica, distonía de las extremidades, distonía de la laringe, distonía oromandibular (de Meige).

16. El uso según la reivindicación 12, en el que dicho músculo o grupo de músculos seleccionados produce una arruga o frente arrugada.

17. El uso según la reivindicación 12, en el que dicho músculo seleccionado es un músculo perineal y en el que dicho medicamento es para la administración a una paciente en el proceso de dar a luz a un niño.

18. El uso según la reivindicación 12, en el que dicho medicamento es para tratar un estado seleccionado del grupo que consiste en dolor miofascial, cefalea asociada con migraña, alteraciones vasculares, neuralgia, neuropatía, dolor de artritis, dolor de la espalda, hiperhidrosis, rinorrea, asma, salivación excesiva y secreción excesiva de ácido por el estómago.

19. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 12-18, en el que dicho medicamento es para tratar a un paciente que no responde a la toxina botulínica de Tipo A, y dicha toxina botulínica en dicha formulación se selecciona del grupo que consiste en los serotipos B, C_{1}, D, E, F y G de la toxina botulínica.

20. El uso de la reivindicación 19, en el que dicha toxina botulínica en dicha formulación es la toxina botulínica de Tipo B.

21. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 12-18, en el que dicho medicamento es para tratar un paciente que no responde a la toxina botulínica de Tipo B, y dicha toxina botulínica en dicha formulación se selecciona del grupo que consiste en los serotipos A, C_{1}, D, E, F y G de la toxina botulínica.

22. El uso según la reivindicación 21, en el que dicha toxina botulínica en dicha formulación es la toxina botulínica de Tipo A.