CN110996979A - 颈肌张力障碍的治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使用新的注射用组合物治疗或预防颈肌张力障碍、与其相关的病症、或其症状的方法，所述组合物包含可以施用于患有该病的受试者的肉毒毒素。所述注射用组合物和其中使用这些组合物的方法提供了新的且有利的治疗，导致高响应率和长作用持续时间，例如，24周和更长的作用持续时间。

Description

颈肌张力障碍的治疗方法
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交并且通过引用完整地结合于此。所述ASCII拷贝在2016年12月13日创建，并且命名为CD.txt，大小为6,809字节。
技术领域
本发明涉及用新的注射用组合物治疗或预防颈肌张力障碍、与其相关的病症、或其症状的方法，所述注射用组合物包含肉毒毒素，其可以施用于患有该疾病(maledy)的受试者。该注射用组合物和其中使用这些组合物的方法提供新的且有利的治疗，其导致高的响应率和长的作用持续时间，例如，超过24周的作用持续时间。
背景技术
颈肌张力障碍是一种极其痛苦的慢性神经学运动障碍，其中颈部和肩部肌肉不自主的收缩和扭曲，导致头颈异常运动和尴尬姿势，如头扭曲或转向左边或右边(斜颈)、向上(颈后倾)、向下(颈前倾)或侧面(颈侧倾)。该运动可以是持续的(强直的)、反射性的(阵挛性的)或组合。颈肌张力障碍(也称为颈肌张力异常或痉挛性斜颈)影响人控制肌肉活动的能力。颈肌张力障碍可以是原发性的(意思是它是唯一的表观神经学病症，具有或不具有家族史)或者可以是由次要因素(如物理创伤)导致并且经常归因于神经系统损伤，所述神经系统损伤由卒中、疾病或创伤导致。作为可以在任何年龄、甚至在婴儿期发生的稀有病症，颈肌张力障碍最经常发生在中年个体中，并且在女性中比在男性中更普遍。具有颈肌张力障碍或某种其他类型的肌张力障碍的家族史的那些人发展该病症的风险较高。
颈肌张力障碍是次于特发性震颤(essential tremor)和帕金森病的第三最常见的运动障碍。已知每10,000个人中估计有3人患有颈肌张力障碍。仅北美报告的病例数目为大约300,000。
症状通常逐渐开始，然后到达一个稳定水平，此时症状不会变得显著更坏。不幸地，对于颈肌张力障碍不存在治愈，该病症大大影响个人的生活质量。在一些病例中，该病症在不治疗的情况下消解，但是持续缓解是非常难得的。
据报道A型形式的肉毒毒素是对于人类已知的最致命的天然生物试剂。肉毒梭菌(C.botulinum)孢子在土壤中发现，并且可以在不适当地灭菌和密封的食物容器中生长。肉毒中毒(其可以是致命的)可以由摄入该细菌而导致。通过抑制乙酰胆碱释放穿过神经肌肉接头而防止突触传递，肉毒毒素作用来产生肌肉麻痹，并且还被认为也以其他方式起作用。其作用基本上阻断通常将导致肌肉痉挛或收缩的信号，导致麻痹。在最近十年，已经利用肉毒毒素的肌肉麻痹活性来实现各种各样的治疗效果。已经使用肉毒毒素的受控施用来提供肌肉麻痹，以治疗各种各样的医学病况，例如特征在于过度兴奋的骨骼肌的神经肌肉病症。已经用肉毒毒素治疗的病况包括偏侧面肌痉挛(hemifacial spasm)、成人痉挛性斜颈(adult onset spasmodic torticollis)、肛裂(anal fissure)、睑痉挛(blepharospasm)、大脑性麻痹(cerebral palsy)、颈肌张力障碍、偏头痛(migraine headaches)、斜视(strabismus)、颞颌关节病症(temporomandibular joint disorder)和各种类型的肌痉挛和抽搐。更近地，已经将肉毒毒素的肌肉麻痹作用应用于治疗学和美容的面部应用，如处理皱纹、皱眉纹和面部肌肉痉挛或收缩的其他结果。
除了A型形式的肉毒毒素以外，存在七种其他血清学不同形式的肉毒毒素，其也由革兰氏阳性细菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生。在这八种血清学不同类型的肉毒毒素中，可以导致麻痹的七种已经命名为A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。这些中的每一种通过用类型特异性抗体中和来进行区分。每一种肉毒毒素蛋白的分子量为大约150kD。由于肉毒毒素的分子大小和分子结构，它不能穿过角质层和多层皮肤下结构。不同血清型的肉毒毒素在作用方面和在(它们在不同动物物种中引起的)麻痹的严重性和持续时间方面不同。例如，在大鼠中，已经确定A型肉毒毒素的效力是B型肉毒毒素的500倍，如通过麻痹率测量。另外，已经确定B型肉毒毒素在灵长类中在480U/kg的剂量下是无毒性的，这是A型在灵长类中的LD50的大约12倍。
当由肉毒梭菌细菌释放时，肉毒毒素是一种含有约150kD肉毒毒素蛋白分子以及缔合的非毒素蛋白的毒素复合物的组分。据信这些内源性非毒素蛋白包括血凝素蛋白家族以及非血凝素蛋白。已经报道所述非毒素蛋白将毒素复合物中的肉毒毒素分子稳定化，并且当毒素复合物被摄入时保护它不被消化酸类变性。因此，毒素复合物的非毒素蛋白保护肉毒毒素的活性，由此当将毒素复合物经由胃肠道施用时增强系统渗透。另外，据信一些非毒素蛋白在血液中特异性地稳定肉毒毒素分子。
毒素复合物中非毒素蛋白的存在通常导致毒素复合物具有的分子量大于裸肉毒毒素分子的分子量(其为约150kD，如之前陈述的)。例如，肉毒梭菌细菌可以生产A型肉毒毒素复合物，复合物的分子量为大约900kD、500kD或300kD。B型和C型肉毒毒素作为大约700kD或大约500kD分子量的复合物产生。D型肉毒毒素作为大约300kD或500kD分子量的复合物产生。E型和F型肉毒毒素仅仅作为分子量为大约300kD的复合物产生。
为了为肉毒毒素提供附加的稳定性，通常通过在制造过程中将毒素复合物与白蛋白组合来稳定该复合物。例如，
Figure BDA0002332581850000031
(Allergan，Inc.，Irvine，CA)是一种含有肉毒毒素的制剂，其含有100U的A型肉毒毒素以及辅助蛋白、0.5毫克的人白蛋白和0.9毫克的氯化钠。所述白蛋白用于结合毒素复合物并且在完全不同的环境下将毒素复合物稳定化，所述环境包括与制造、运输、贮存和施用相关的那些。
典型地，通过小心控制注射含有肉毒毒素复合物和白蛋白的组合物，将肉毒毒素施用于患者。然而，存在与该方法有关的一些问题。不仅存在注射疼痛，而且典型地在注射部位周围局部产生毒素的大的真皮下井(subdermal well)，以实现所需的治疗或美容效果。肉毒毒素可以从这些真皮下井迁移而在身体周围区域导致不需要的麻痹。该问题在被处理的区域较大并且需要许多次毒素注射来处理该区域时变得严重。此外，因为注射的毒素复合物含有非毒素蛋白和白蛋白(其稳定肉毒毒素并且增加毒素复合物的分子量)，所以毒素复合物在体内具有长的半衰期并且可以在患者中导致不希望有的抗原反应。例如，一些患者随时间会发展对白蛋白的变态反应，所述白蛋白在当前的商业制剂中用作稳定剂。此外，毒素复合物可以诱导患者免疫系统形成中和抗体，以致于在后续的施用中需要更大量的毒素来实现相同效果。当这发生时，必须小心安置后续的注射以便它们不会释放大量的毒素到患者血流中，大量的毒素到患者血流中可导致致命的系统中毒，特别是因为非毒素蛋白和白蛋白在血液中将肉毒毒素稳定化。
鉴于与当前肉毒毒素制剂相关的缺点，高度期望的是具有这样的注射用肉毒毒素制剂，其为有效并且稳定的但是显示降低的抗原性和更低的注射后局部扩散的趋势。还期望的是使用这样的肉毒毒素制剂用于治疗目的以治疗颈肌张力障碍。
对于颈肌张力障碍的治疗包括口服药物、肉毒毒素注射、外科手术和补充疗法。颈肌张力障碍的最常见的医嘱治疗是使用肉毒毒素，典型地A型(但是也可以使用B型)，其可以减少其症候和症状。肉毒毒素可以帮助阻断神经和肌肉之间的通讯，并且可以缓解异常运动和姿势。注射次数典型地基于肌张力障碍的严重性。通过观察异常姿势或运动和感觉肌肉痉挛或通过使用肌电描记器来测量肌肉活动，注射毒素的医生可以选择将要注射的肌肉。每块受肌张力障碍影响的肌肉典型地都不得不分开注射。因此，基于当前可用毒素制剂的扩散特性，限制了一次可以注射到身体中的毒素总量。尽管对于颈肌张力障碍的治疗包括规律的神经干预，其在注射后4–7天或更长期间内起效，但是对于肉毒毒素治疗的响应典型地在12周时间后逐渐减弱，经常早至10周，需要对患有颈肌张力障碍的人再次注射。因此，一种持续的更长作用的要求更少神经干预的治疗将是合乎期望的。
发明内容
在本发明的一个方面，本发明涉及一种在治疗颈肌张力障碍中产生生物学效果的方法，所述方法向需要该治疗的受试者或患者注射有效量的、优选治疗有效量的本发明的组合物进行。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种在有需要的个体中治疗颈肌张力障碍的方法，所述方法包括向所述个体施用组合物注射剂，所述组合物注射剂包含：肉毒毒素，肉毒毒素复合物，或缩减的(reduced)肉毒毒素复合物和带正电荷的载体，所述载体包含带正电荷的多聚赖氨酸骨架，所述多聚赖氨酸骨架具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有以下氨基酸序列：(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0-20的整数；和用于注射的药用稀释剂；其中将肉毒毒素以大约100U至大约450U的量施用于所述个体；其中带正电荷的载体与肉毒毒素、肉毒毒素复合物或缩减的肉毒毒素复合物组分非共价缔合；并且其中所述组合物注射剂提供的治疗在减少颈肌张力障碍症状方面具有至少大约6个月至大约10个月的作用持续时间，由此延长对于所述个体的治疗间隔持续时间。
在本发明的另一方面，本发明提供了注射用组合物，其包含与带正电荷的载体分子非共价缔合的肉毒毒素，用于治疗颈肌张力障碍。在优选实施方案中，本发明的组合物具有一个或多个相对于常规商购的肉毒毒素制剂如
Figure BDA0002332581850000051
或
Figure BDA0002332581850000052
的优势。例如，在某些实施方案中，所述组合物可以显示一个或多个相对于常规注射用肉毒毒素制剂的优势，包括降低的抗原性，降低的在注射后进行扩散到周围组织中的倾向，相对于常规肉毒毒素制剂的增加的临床功效持续时间或增强的效力，更快的临床功效开始，和/或改善的稳定性。
本发明的另一方面是认识到某些非天然分子(即，在获自肉毒梭菌细菌的肉毒毒素复合物中未发现的分子)可以加入肉毒毒素、肉毒毒素复合物和特别是缩减的肉毒毒素复合物(如本文定义)，以改善颈肌张力障碍的治疗中毒素通过组织的扩散。所述非天然分子与所述毒素非共价缔合并且用作渗透增强剂以改善注射后毒素到达目标结构的能力。此外，所述非天然分子可以增加毒素在注射之前和之后的稳定性。作为实例，所述渗透增强剂可以是带正电荷的载体，如阳离子肽，其不具有内在的肉毒毒素样活性并且其还含有一个或多个蛋白转导结构域(如本文定义)。
本发明的另一方面是提供用于治疗颈肌张力障碍的方法中的组合物，其包含：肉毒毒素，肉毒毒素复合物(或缩减的蛋白肉毒毒素复合物，其仅包括150kD神经毒素本身，或神经毒素和一些但是不是所有天然复合物蛋白)和带正电荷的载体。
在另一方面，本发明提供了在治疗颈肌张力障碍中的有效剂量和量的本发明的组合物，其在通过注射于需要治疗的受试者或患者进行施用后，提供持久的持续功效，例如长持续时间的响应率。该剂量和量优选为在施用了所述剂量和量的受试者中产生或导致所需治疗效果的治疗有效剂量和量。在具体实施方案中，用大约100U至大约450U/受试者的治疗有效剂量的本发明的组合物的单次治疗受试者或患者在减少颈肌张力障碍症状方面提供了响应率持续至少16周，至少20周，至少24周，或大约6-10个月，或甚至更长，所述组合物包含：肉毒毒素，如肉毒毒素A，和带正电荷的载体，如本文所述。此外，本发明的组合物提供在注射后从注射部位的减少的扩散或扩展的属性，由此将毒素及其效果局部化在所需位置，并且降低在远离治疗注射部位的部位或位置的非特异性或不想要的作用。
本发明的组合物(例如，RT002)以及通过所述治疗方法和应用提供的作用持续时间，提供了相对于现有技术的显著优势。作为实例，用含有肉毒毒素的组合物进行治疗的受试者认为治疗后的作用持续时间对于他们是非常重要的。这样长的持续作用时间(其通过甚至用有效剂量和治疗方案的本发明的产品(例如，RT002)单次治疗实现)允许对于受试者的每个疗程更少的注射，这对于受试者是极其重要的。使用具有清楚功效和安全性的产品的单次治疗的长持续时间作用(如通过本发明组合物和本文所述方法提供的)提供了较少不适、更低成本和对于经历疗程的受试者更多便利。此外，在对于受试者的产品的单次注射剂治疗后，提供显著和持续作用(其维持至少16或24周的时间，或至少6个月的时间，或大于6个月的时间)的产品，对于执业医师和患者两者同样提供了对于本领域未满足需要的解决方案。因此，本发明的组合物和方法提供了对于治疗太频繁的问题的解决方案和改善患者的总体健康。这样的长持续作用时间在整个疗程中提供了较少治疗。
在另一方面，本发明提供了一种在患有颈肌张力障碍的个体中施用肉毒毒素以实现延长持续时间的治疗效果的方法，其中所述方法包括通过注射施用一个剂量的无菌注射用组合物至需要治疗的个体区域，以在使用所述组合物的第一次治疗后实现所述治疗效果；其中所述组合物包含：肉毒毒素，肉毒毒素复合物，或缩减的(reduced)肉毒毒素复合物和带正电荷的载体，所述载体包含带正电荷的多聚赖氨酸骨架，所述多聚赖氨酸骨架具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有以下氨基酸序列：(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0-20的整数；其中将肉毒毒素、肉毒毒素复合物、或缩减的肉毒毒素复合物组分以大约100U至450U、或更具体地大约100U至200U或大约200U至300U或大约300U至450U的治疗剂量施用于所述个体，其中所述带正电荷的载体与所述肉毒毒素、肉毒毒素复合物、或缩减的肉毒毒素复合物组分非共价缔合；和适合于注射的药用稀释剂；并且其中通过注射施用至所述个体的组合物的第一治疗剂量实现了延长持续时间的治疗效果，具有至少大约6个月至大约10个月的作用持续时间，任选地之后施用第二或后续的治疗剂量。
在另一方面，本发明提供了用于治疗颈肌张力障碍的无菌注射用组合物，其包含：剂量选自超过100U、100U至200U、200-300U、或300-450U的肉毒毒素、肉毒毒素复合物或缩减的肉毒毒素复合物；和带正电荷的载体，所述载体包含带正电荷的多聚赖氨酸骨架，所述多聚赖氨酸骨架具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有以下氨基酸序列：(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0-20的整数；和用于注射的药用稀释剂；其中所述带正电荷的载体与所述肉毒毒素、肉毒毒素复合物、或缩减的肉毒毒素复合物组分非共价缔合；并且其中在用有效剂量的所述注射用组合物治疗个体后，所述组合物提供持续至少20至24周或至少6个月或大于6个月(例如大约6个月至大约10个月)的治疗效果。
在以上这些方法和组合物的一些实施方案中，所述组合物包含A血清型肉毒毒素，优选分子量为150kDa的A血清型肉毒毒素。在一个实施方案中，所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)。在一个实施方案中，所述肉毒毒素以超过100U、100U-200U、200-300U或300-450U的剂量存在于所述组合物中。在一个实施方案中，所述肉毒毒素以选自100U、200U、300U和450U的剂量存在于所述组合物中。在一个实施方案中，所述组合物在已经通过注射所述组合物经历单次治疗的个体中减少颈肌张力障碍的症状。在某些实施方案中，治疗效果的持续时间包括大于6个月；大于7个月；大于8个月；大于9个月；或至少6个月至10个月。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种治疗患有颈肌张力障碍的个体的方法，所述个体需要用注射用肉毒毒素治疗，其中治疗方法包括具有多个治疗间隔的疗程，所述疗程具有延长持续时间的作用和每次治疗间隔之间延长的持续时间，所述疗程包括：通过注射施用初始治疗剂量的无菌注射用组合物至需要治疗的个体区域，以在用所述组合物初始治疗后实现治疗效果；其中所述组合物包含：肉毒毒素，肉毒毒素复合物，或缩减的肉毒毒素复合物和带正电荷的载体组分，所述载体组分包括带正电荷的多聚赖氨酸骨架，所述多聚赖氨酸骨架具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有以下氨基酸序列：(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0-20的整数；和用于注射的药用稀释剂；其中将肉毒毒素、肉毒毒素复合物、或缩减的肉毒毒素复合物组分以大于100U、100-200U、200-300U或300-450U的治疗剂量施用于所述个体；其中所述带正电荷的载体与所述肉毒毒素、肉毒毒素复合物、或缩减的肉毒毒素复合物组分非共价缔合；其中通过注射施用至所述个体的组合物的初始治疗剂量提供了持续至少大约10个月的治疗作用持续时间；并且通过注射将后续治疗剂量的组合物以治疗间隔(包括在初始治疗剂量之后和在每个后续的治疗剂量之间，大于或等于3个月至至少大约10个月的持续时间)施用于所述个体。
在上述治疗方法的实施方案中，治疗作用是治疗颈肌张力障碍的症状。在一个实施方案中，所述组合物包含A血清型肉毒毒素，优选分子量为150kDa的A血清型肉毒毒素。在一个实施方案中，所述带正电荷的载体是具有以下氨基酸序列的带正电荷的肽：RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)。在一个实施方案中，所述组合物在注射后不从注射部位局部扩散。在特定实施方案中，将所述肉毒毒素以超过100U、100-200U、200-300U、或300-450U的量施用于所述个体。在某些实施方案中，治疗间隔的持续时间包括大于3个月；大于4个月；大于5个月；大于6个月；大于7个月；大于8个月；大于9个月；或至少6个月至10个月。
附图描述
图1显示如本文实施例中描述的颈肌张力障碍2期研究设计。
图2显示如本文实施例中描述的研究中各组的人口统计状况。
图3显示如本文实施例中描述的研究中每组根据优选项具有治疗相关不利事件的受试者的数量(％)。
图4显示如本文实施例中描述的研究中每组的主要终点-在第4周TWSTRS-总分的降低。
图5显示如本文实施例中描述的研究中每组的次要终点-TWSTRS-总分随时间从基线的改变。
图6显示如本文实施例中描述的研究中每组的次要终点–通过受试者达到目标TWSTRS分数定义的反应持续时间(受试者在第4周具有改善。由于需要重新治疗而退出被认为是事件)。
图7显示如本文实施例中描述的研究中按照剂量的受试者分布–施用的研究剂量聚类为两个分开的剂量组。
图8显示如本文实施例中描述的研究中每剂量组的次要终点–TWSTRS-总分随时间从基线的改变。
具体实施方式
本发明涉及用于治疗颈肌张力障碍的方法的新的注射用组合物，其包含肉毒毒素、肉毒毒素复合物或缩减的肉毒毒素复合物。在优选实施方案中，组合物将毒素稳定化或者使得能够在注射后转运或递送毒素通过组织，以致于与常规商购肉毒毒素复合物(其与外源性白蛋白结合(例如，
Figure BDA0002332581850000101
或
Figure BDA0002332581850000102
))相比，所述毒素具有降低的抗原性，更好的安全性质，增强的功效，更快的临床功效开始和/或临床功效的更长持续时间。本发明的组合物可以用作注射应用，将肉毒毒素提供给受试者，用于各种治疗目的，如本文所述。与其他肉毒毒素的组合物和递送方法相比，本发明的组合物还具有改善的安全性质。此外，这些组合物可以提供有益的针对肉毒毒素的免疫反应减少。在多个实施方案中，本发明的注射用组合物在受试者中提供了长持续功效，例如持续至少20周、至少24周、至少6个月、或大于6个月、例如多至大约10个月的作用，通过注射向所述受试者施用了该组合物，特别是以100U或更多的量包含肉毒毒素的那些，以治疗颈肌张力障碍。
如本文所用，术语“肉毒毒素”可以是指任何已知类型的肉毒毒素(例如与不同血清型的肉毒梭菌相关的150kD肉毒毒素蛋白分子)，无论是通过细菌或通过重组技术生产，以及可以随后发现的任何这样的类型(包括新发现的血清型)，和改造的变体或融合蛋白。如上所述，当前已经表征了七种免疫学上不同的肉毒神经毒素，即A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒神经毒素，其中每一个通过用类型特异性抗体中和来区别。各血清型肉毒毒素是可商购的，例如，购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)和购自Metabiologics，Inc.(Madison，WI)以及其他来源。不同血清型的肉毒毒素在以下方面不同：它们感染的动物物种，它们引发的麻痹的严重性和持续时间。至少两种类型的肉毒毒素，A型和B型，可以商购制剂获得用于治疗某些病况。例如，A型包含在商标为
Figure BDA0002332581850000111
的Allergan的制剂中以及在商标为
Figure BDA0002332581850000112
的Ipsen的制剂中，B型包含在商标为
Figure BDA0002332581850000113
的Elan的制剂中。
用于本发明组合物中的术语“肉毒毒素”可以备选地是指肉毒毒素衍生物，其为这样的化合物，该化合物具有肉毒毒素活性但是相对于天然存在的或重组的天然肉毒毒素含有一个或多个在任何部分或任何氨基酸链上的化学或功能改变。例如，肉毒毒素可以是一种修饰的神经毒素，其为与天然形式相比至少一个其氨基酸被缺失、修饰或替换的神经毒素，或者修饰的神经毒素可以是重组生产的神经毒素或其衍生物或片段。例如，肉毒毒素可以是以如下方式修饰的肉毒毒素，所述方式例如增强其性质或者降低不希望有的副作用，但是仍然保留所需的肉毒毒素活性。备选地，用于本发明的肉毒毒素可以是使用重组或合成化学技术制备的毒素，例如重组肽，融合蛋白，或者杂合神经毒素，例如制备自不同血清型肉毒毒素的亚基或结构域(例如，参见美国专利号6,444,209)。肉毒毒素也可以是整个分子已经显示具有所需肉毒毒素活性的一部分，并且在这种情形中本身可以使用或者可以用作重组或缀合分子(例如融合蛋白)的一部分。备选地，肉毒毒素可以是肉毒毒素前体的形式，其自身可以是非毒性的，例如非毒性的锌蛋白酶，其在蛋白水解裂解后变得有毒性。
如本文所用，术语“肉毒毒素复合物”或“毒素复合物”是指缔合了内源性非毒素蛋白(即，肉毒梭菌细菌生成的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)的大约150kD的肉毒毒素蛋白分子(属于A-G血清型肉毒毒素中的任一种)。然而，注意肉毒毒素复合物不一定作为一个单一的毒素复合物衍生自肉毒梭菌细菌。例如，可以首先重组制备肉毒毒素或修饰的肉毒毒素，然后将其与非毒素蛋白组合。重组肉毒毒素也可以购买得到(例如，购自ListBiological Laboratories，Campbell，CA)然后与非毒素蛋白组合。
本发明还考虑通过加入一种或多种外源性稳定剂、去除内源性稳定剂或其组合来调节肉毒毒素分子的稳定性。例如，本发明考虑使用“缩减的肉毒毒素复合物”，其中与在肉毒梭菌细菌生成的肉毒毒素复合物中天然存在的量相比，肉毒毒素复合物具有减少量的非毒素蛋白。在一个实施方案中，缩减的肉毒毒素复合物的制备使用任何常规蛋白分离方法，以从来源于肉毒梭菌细菌的肉毒毒素复合物中提取血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白的级分。例如，通过在7.3的pH暴露于红细胞使肉毒毒素复合物解离(参见，例如EP1514556A1，通过引用结合于此)，可以制备缩减的肉毒毒素复合物。可以使用HPLC、透析、柱、离心和从蛋白质提取蛋白质的其他方法。备选地，当通过将合成制备的肉毒毒素与非毒素蛋白组合来制备缩减的肉毒毒素复合物时，可以简单地加入比天然存在的肉毒毒素复合物存在的少的血凝素或非毒素非血凝素蛋白至混合物中。根据本发明的缩减的肉毒毒素复合物中的非毒素蛋白中的任一种(例如，血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白或两者)可以独立地减少任何量。在某些例举性实施方案中，与肉毒毒素复合物中通常存在的量相比，一种或多种非毒素蛋白减少至少大约0.5％，1％，3％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。如上所述，肉毒梭菌细菌产生七种不同血清型的毒素，并且使用不同相对量的非毒素蛋白(即，不同量的毒素复合物)生产商购制剂。例如，MYOBLOCTM具有5000U/ml的B型肉毒毒素，0.05％人血清白蛋白，0.01M琥珀酸钠，和0.1M氯化钠。DYSPORTTM具有500U的A型肉毒毒素-血凝素复合物，125mcg白蛋白和2.4mg乳糖。在某些实施方案中，从肉毒毒素复合物中去除基本上所有在来源于肉毒梭菌细菌的肉毒毒素复合物中通常存在的非毒素蛋白(例如，大于95％，96％，97％，98％或99％的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)。此外，尽管在一些情形中可以将内源性非毒素蛋白的量降低相同的量，但是本发明还考虑将内源性非毒素蛋白各自降低不同的量，以及减少至少一种内源性非毒素蛋白，而不减少其他。
如上所述，通常将外源性稳定剂(例如白蛋白)加入以稳定肉毒毒素制剂。例如，在
Figure BDA0002332581850000131
的情形中，每100U的A型肉毒毒素复合物加入0.5mg人白蛋白以稳定所述复合物。通常，不具体限制可以加入以稳定根据本发明的组合物的外源性稳定剂的量。在一些实施方案中，因为本发明带正电荷的载体其自身用作稳定剂的能力，加入的稳定剂的量可以小于常规加入的量。例如，加入的外源性白蛋白的量可以是小于常规千倍过量的外源性白蛋白的任何量，并且在本发明的某些例举性实施方案中，仅为大约0.25，0.20，0.15，0.10，0.01，0.005，0.001，0.0005，0.00001，0.000005，0.000001，或0.0000001mg/100U的肉毒毒素。在一个实施方案中，没有向本发明的组合物中加入外源性白蛋白作为稳定剂，因此产生不含白蛋白的肉毒毒素组合物。
本发明的一个优选实施方案是液体的含有肉毒毒素的组合物，其是稳定化的而没有蛋白质赋形剂，特别是没有任何源自动物蛋白的赋形剂。这样的液体组合物包含肉毒毒素，优选A血清型肉毒毒素，带正电荷的载体(例如，肽)，非还原性二糖或非还原性三糖，非离子表面活性剂，和用于将pH维持在4.5至7.5的生理上相容的缓冲剂。液体组合物中非还原性糖的浓度在10％至40％(w/v)的范围内，并且非离子表面活性剂的浓度在0.005％至0.5％(w/v)的范围内。优选的组合物在单次注射治疗后提供长持续时间的作用。在优选实施方案中，肉毒毒素A具有150kDa的分子量(MW)。优选的组合物包含：肉毒毒素，优选肉毒毒素A，更优选150kDa MW的肉毒毒素A，本文所述的带正电荷的载体(例如，肽)，非还原性二糖，如蔗糖，非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯40，聚山梨醇酯60，聚山梨醇酯80或脱水山梨糖醇酯，和生理上相容的缓冲剂，如柠檬酸，乙酸，琥珀酸，酒石酸，马来酸，和组氨酸；并且具有的pH在pH 4.5至pH 7.5的范围内。
根据本发明，已经发现如本文所述的具有蛋白转导结构域或功效基团的带正电荷的载体分子适合作为肉毒毒素的转运系统，使得能够注射毒素而具有对目标结构如肌肉的改善的渗透。在不对肉毒毒素的共价修饰的情况下进行转运。除了增强肉毒毒素的渗透以外，在某些优选实施方案中，本发明的带正电荷的载体可以将肉毒毒素稳定化而防止降解。在这些实施方案中，可以减少或完全省略通常存在以稳定肉毒毒素的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白。类似地，可以省略通常在制造期间加入的外源性白蛋白。
连同术语“载体”使用术语“带正电荷的”或“阳离子的”是指载体在至少一些溶液相条件下，更优选地在至少一些生理上相容的条件下，具有正电荷。更具体地，如本文所用，“带正电荷的”和“阳离子的”是指所讨论的基团含有在所有pH条件下带电荷的官能团，例如季胺，或含有在某些溶液相条件下可以获得正电荷的官能团，诸如在伯胺的情形中pH变化。更优选地，如本文所用的“带正电荷的”或“阳离子的”是指在生理上相容的条件下具有与阴离子缔合的行为的那些基团。具有多个带正电荷的部分的聚合物不一定是均聚物，这对于本领域技术人员而言是明显的。带正电荷部分的其他实例是现有技术公知的，并且可以容易地利用，这对于本领域技术人员而言是明显的。
通常，带正电荷的载体(也称为“带正电荷的主链”)典型地是一个原子链，在所述链中具有在生理pH下携带正电荷的基团，或具有与从所述主链延伸出的侧链连接的携带正电荷的基团。在某些优选实施方案中，带正电荷的主链是阳离子肽。如本文所用，术语“肽”是指氨基酸序列，但是不包含关于氨基酸序列中的氨基酸残基的数目的含义。因此，术语“肽”也可以包含多肽和蛋白。在某些优选实施方案中，带正电荷的主链本身将不具有限定的酶促活性或治疗生物活性。在某些实施方案中，主链是直链的烃主链，其在一些实施方案中被选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子中断。大多数主链原子通常是碳。另外，主链经常是重复单元(例如，氨基酸，聚(乙烯氧)，聚(丙烯胺)，聚亚烷基亚胺等)的聚合物，但是可以是杂聚物。在一组实施方案中，带正电荷的主链是聚丙烯胺，其中许多胺氮原子作为携带正电荷的铵基团(四取代的)存在。在另一个实施方案中，带正电荷的主链是非肽聚合物，其可以是杂聚物或均聚物，如聚亚烷基亚胺，例如聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺，分子量为大约10,000至大约2,500,000，优选大约100,000至大约1,800,000，并且最优选大约500,000至大约1,400,000。在另一组实施方案中，主链已经连接了多个侧链部分，其包括带正电荷的基团(例如，铵基团，吡啶鎓基团，鏻基团，锍基团，胍盐(guanidinium)基团，或脒盐(amidinium)基团)。该组实施方案中的侧链部分可以沿着主链间隔放置，所述间隔距离恒定或者可变。另外，侧链长度可以是相似的或不相似的。例如，在一组实施方案中，侧链可以是直链或支链的烃链，具有1-20个碳原子，并且在远端(远离主链)以上述带正电荷的基团之一终止。带正电荷的载体和肉毒毒素之间的缔合是通过非共价相互作用，其非限制性实例包括离子相互作用、氢键、范德华力或其组合。
在一组实施方案中，带正电荷的主链是具有多个带正电荷的侧链基团(例如，赖氨酸，精氨酸，鸟氨酸，高精氨酸等)的多肽。优选地，多肽的分子量为大约100至大约1,500,000，更优选大约500至大约1,200,000，最优选大约1000至大约1,000,000。本领域技术人员将理解，当将氨基酸用于本发明的该部分时，侧链在连接中心可以具有D-或L-形式(R或S构型)。在某些优选实施方案中，多肽的分子量为大约500至大约5000，更优选1000至大约4000，更优选2000至大约3000。在其他优选实施方案中，多肽包含10至20个氨基酸，或10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个氨基酸，优选多聚赖氨酸。
备选地，主链可以包含氨基酸类似物和/或合成氨基酸。主链也可以是多肽的类似物，如类肽(peptoid)。参见例如Kessler，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32:543(1993)；Zuckermann等Chemtracts-Macromol.Chem.4:80(1992)；和Simon等Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 89:9367(1992)。简而言之，类肽是聚甘氨酸，其中侧链与主链氮原子而非α-碳原子连接。如上，一部分侧链将典型地终止于带正电荷的基团，以提供带正电荷的主链组分。类肽的合成在例如美国专利号5,877,278中描述，该美国专利通过引用完整地结合于此。当该术语在本文中使用时，具有类肽主链构造的带正电荷的主链被认为是“非肽”，因为它们不是由在α碳位置具有天然存在的侧链的氨基酸组成。
可以使用各种各样的其他主链，例如多肽的空间或电子模拟物，其中肽的酰胺键被如下的替代物取代：酯键、硫代酰胺(--CSNH--)、反向硫代酰胺(--NHCS--)、氨基亚甲基(--NHCH2--)或反向亚甲基氨基(--CH2NH--)基团、酮-亚甲基(--COCH2--)基团、亚膦酸酯(--PO2RCH2--)、氨基膦酸盐和氨基膦酸酯(--PO2RNH--)、反向肽(--NHCO--)、反式烯烃(--CR＝CH--)、氟烯烃(--CF＝CH--)、二亚甲基(--CH2CH2--)、硫醚(--CH2S--)、羟基亚乙基(--CH(OH)CH2--)、亚甲基氧(--CH2O--)、四唑(CN4)、亚磺酰氨基(--SO2NH--)、亚甲基亚磺酰氨基(--CHRSO2NH--)、反向磺酰胺(--NHSO2--)，以及具有丙二酸和/或偕-二氨基-烷基亚基的主链，例如，如Fletcher等((1998)Chem.Rev.98:763)综述，并且由其中引用的参考文献详述。许多上述取代导致相对于由α-氨基酸形成的主链的近似电子等排的聚合物主链。
在每个以上提供的主链中，侧链基团可以是悬垂的，携带带正电荷基团。例如，磺酰胺连接的主链(--SO2NH—和--NHSO2--)可以具有与氮原子连接的侧链基团。类似地，羟基亚乙基(--CH(OH)CH2--)键可以具有与羟基取代基连接的侧链。本领域技术人员使用标准的合成方法可以容易地适应其他键化学以提供带正电荷的侧链基团。
在一个实施方案中，带正电荷的主链是具有蛋白转导结构域(也称为功效基团)的多肽。如本文所用，功效基团或蛋白转导结构域是具有促进带正电荷的主链迁移通过组织或细胞膜的任何试剂。蛋白转导结构域或功效基团的非限制性实例包括-(gly)n1-(arg)n2(SEQ ID NO:5)，HIV-TAT或其片段，或触角足(Antennapedia)的蛋白转导结构域(PTD)，或其片段，其中下标n1是0至20、更优选0至8、还更优选2至5的整数，下标n2独立地是大约5至大约25、更优选大约7至大约17、最优选大约7至大约13的奇整数。在一些实施方案中，HIV-TAT片段不含有HIV-TAT分子的富含半胱氨酸的区域，以便将与二硫化物聚集相关的问题最小化。优选地，HIV-TAT片段和触角足蛋白转导结构域保留全蛋白的蛋白转导活性。还更优选那些实施方案，其中HIV-TAT片段具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ IDNO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ IDNO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数，或者其中p和q各自独立地为整数1。在另一个实施方案中，所述片段或功效基团与主链通过所述片段的C-末端或N-末端或所述功效基团的氨基酸序列的C-末端或N-末端连接。在某些优选实施方案中，p是1并且q是0，或者p是0并且q是1。优选的HIV-TAT片段是其中下标p和q各自独立地为0至8、更优选0至5的整数的那些。在另一个优选实施方案中，带正电荷的侧链或支链基团是触角足(Antp)蛋白转导结构域(PTD)或其保留活性的片段。这些在本领域是已知的，例如从Console等，J.Biol.Chem.278:35109(2003)中已知，本发明考虑的触角足PTD的非限制性实例是具有氨基酸序列SGRQIKIWFQNRRMKWKKC(SEQ ID NO:6)的PTD。在其他实施方案中，带正电荷的载体是具有氨基酸序列RKKRRQRRR-G-(K)15-G-RKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)的带正电荷的肽；或者具有氨基酸序列YGRKKRRQRRR-G-(K)15-G-YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:7)的带正电荷的肽；或者具有氨基酸序列RGRDDRRQRRR-G-(K)15-G-RGRDDRRQRRR(SEQ ID NO:8)的带正电荷的肽，其用于本发明的组合物和方法。
优选地，带正电荷的载体包括侧链带正电荷的蛋白转导结构域或带正电荷的功效基团，作为总载体重量的百分比其量为至少大约0.01％，优选大约0.01至大约50重量％，更优选大约0.05至大约45重量％，并且最优选大约0.1至大约30重量％。对于具有式-(gly)n1-(arg)n2(SEQ ID NO:5)的带正电荷的蛋白转导结构域，优选范围为大约0.1至大约25％。
在另一个实施方案中，主链部分是多聚赖氨酸并且带正电荷的蛋白转导结构域与赖氨酸侧链氨基基团或C-或N末端连接。在一些优选实施方案中，多聚赖氨酸可以具有的分子量是至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500或6000D和小于大约2,000,000、1,000,000、500,000、250,000、100,000、75,000、50,000和25,000D。在100至2,000,000D范围内，考虑下限和/或上限范围可以分别增加或降低100，每个获得的子范围也是本发明具体考虑的实施方案。在一些例举性的实施方案中，多聚赖氨酸的分子量为大约1,000至大约1,500,000D，大约2,000至大约800,000D，或大约3,000至大约200,000D。在其他例举性的实施方案中，多聚赖氨酸的分子量为大约100至大约10,000D，大约500至大约5,000D，大约1,000至大约4,000D，大约1,500至大约3,500D或大约2,000至大约3,000D。优选多聚赖氨酸多肽具有10至20个赖氨酸(SEQ IDNO:9)，更优选15个赖氨酸。在一些实施方案中，本发明考虑的多聚赖氨酸可以是任何可商购的(Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.，USA)多聚赖氨酸，诸如例如MW>70,000的多聚赖氨酸，MW为70,000至150,000的多聚赖氨酸，MW为150,000至300,000的多聚赖氨酸和MW>300,000的多聚赖氨酸。适当多聚赖氨酸的选择将取决于组合物中的其余组分，并且足以为组合物提供整体净正电荷并且提供优选为带负电荷组分的合并长度的1至4倍的长度。优选的带正电荷的蛋白转导结构域或功效基团包括例如-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7(SEQ ID NO:10))或HIV-TAT。
在另一个优选实施方案中，带正电荷的主链是聚亚烷基亚胺，其非限制性实例包括聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺和聚丁烯亚胺。在某些实施方案中，聚亚烷基亚胺具有的分子量为至少100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500或6000D和小于大约2,000,000，1,000,000，500,000，250,000，100,000，75,000，50,000和25,000D。在100至2,000,000D的范围内，考虑下限和/或上限范围可以分别增加或降低100，每个获得的子范围也是本发明具体考虑的实施方案。
在本发明的其他实施方案中，载体是相对较短的多聚赖氨酸或聚乙烯亚胺(PEI)主链(其可以是直链或支链)，并且其具有带正电荷的支链基团。不希望受理论限制，据信该载体用于将治疗剂组合物中主链和肉毒毒素的不受控制的聚集最小化，所述聚集导致转运效率急剧下降。当载体是相对较短的直链多聚赖氨酸或PEI主链时，所述主链将具有小于75,000D，更优选小于30,000D和最优选小于25,000D的分子量。然而，当载体是相对较短的支链多聚赖氨酸或PEI主链时，所述主链将具有小于60,000D，更优选小于55,000D和最优选小于50,000D的分子量。
在一个特别令人感兴趣的实施方案中，所述非天然分子是阳离子肽，其不具有内在的肉毒毒素样活性并且还含有一个或多个本文所述的蛋白转导结构域。不希望受限于任何具体科学理论，据信在注射后所述肽增强复合物中缔合的分子的组织渗透，同时增强肉毒毒素在皮肤中和体外的稳定化。据信与常规的商购肉毒毒素复合物(其与外源性白蛋白结合，例如
Figure BDA0002332581850000191
或
Figure BDA0002332581850000192
)相比，由这些肽提供的增强的组织渗透尤其提供减小的抗原性，更好的安全性质，增强的功效，更快的临床功效开始，或更长持续时间的临床功效。
在优选实施方案中，带正电荷的载体在根据本发明的组合物中的浓度足以增强肉毒毒素向分子靶标如例如运动神经板(motor nerve plates)的递送。此外，不希望受理论约束，据信渗透速率遵循受体介导的动力学，以致于随着渗透增强分子的量增加，组织渗透增加至饱和点，之后转运速率变得恒定。因此，在一个优选实施方案中，加入的渗透增强分子的量等于使渗透速率刚好在饱和前最大化的量。在本发明注射用组合物中带正电荷的载体(或载体肽)的有用浓度范围为大约0.1pg载体/单位(U)肉毒毒素(0.1pg/U)至大约1.0mg/单位(mg/U)肉毒毒素(如本文所述)。本发明的局部组合物中带正电荷的载体(或载体肽)的有用浓度范围为大约1.0pg/U至0.5mg/U肉毒毒素(载体量/肉毒毒素单位)。在其他实施方案中，本发明注射用组合物中存在的带正电荷的载体(或载体肽)在例如10ng/U至200ng/U肉毒毒素范围内，或在1ng/U至1000ng/U肉毒毒素范围内；或在0.1ng/U至10,000ng/U肉毒毒素范围内。在一些实施方案中，作为非限制性实例，本发明组合物中存在的肉毒毒素单位中带正电荷的载体(或载体肽)的量为50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100(等等)ng的载体/U肉毒毒素(ng/U)。优选地，肉毒毒素是A血清型肉毒毒素，并且特别是150kD形式的A血清型肉毒毒素。
通常，用于测量肉毒毒素活性(即肉毒毒素活性单位(U))的方法和步骤是本领域技术人员已知的和实施的。简而言之，常规使用小鼠中的半数致死测定(LD50测定)来以高精度估计肉毒毒素的单位数。所有可商购的肉毒毒素的剂量以生物活性单位表示。作为实例，一单位的肉毒毒素对应于雌性Swiss-Webster小鼠中计算的半数腹膜内致死剂量(LD50)。参见Hoffman，R.O.等，1986，Int.Ophthalmol.Clin.，26:241-50，以及DePass，L.R.，1989，Toxicol.Letters，49:159-170；和Pearce，L.B.等，1994，Toxicol.Appl.Pharmacol.，128:69-77，它们也描述了本领域的致死测定。更具体地，如下是一种用于测定本发明组合物的肉毒毒素组分的肉毒毒素单位的适当方法：将四十八(48)只重17-23克的雌性CD-1小鼠随机分配至六个剂量的测试物品(1.54，1.31，1.11，0.95，0.80和0.68U/0.5mL)，每个剂量组八只(8)动物。测试物品是指被测定或检测的肉毒毒素制备物或样品。将动物收在笼子里(八只/笼)并且在用测试物品给药24小时内称重。在给药当日，将测试物品在等渗盐水(0.9％NaCl)中稀释至适当浓度。将每只动物经由腹膜内注射施用0.5mL的稀释的测试物品。在注射后，将小鼠放回笼中并且每天记录死亡共三天。在注射后72小时对致死性进行评分，并且通过概率分析或逻辑分析来分析结果，以导出相对于参考标样的LD50值，所述参考标样使用相同的剂量方案评估。作为实例，参考标样是一种特别质检过和校正过批次的相同的本发明组合物，其用于比较以导出所述测试物品的相对效力。然后将测定的LD50值对于进行的累积稀释进行校正，以对净(未稀释的)测试物品赋予相对效力值。
本发明的组合物优选为允许注射到受试者或患者的皮肤或上皮中的形式。术语“需要”意指包括药学或健康相关的需要(例如，治疗涉及不希望有的张力障碍性收缩或肌肉痉挛的病症)。在优选实施方案中，如下制备组合物：将肉毒毒素(含有缔合的非毒素蛋白或缩减的缔合非毒素蛋白)与带正电荷的载体并且通常与一种或多种另外的药用载体或赋形剂混合。在它们的最简单的形式中，它们可以含有水性药用稀释剂，如缓冲盐水(例如，磷酸盐缓冲盐水)。然而，组合物可以含有典型地在注射用药物组合物或化妆品组合物中存在的其他成分，包括皮肤学或药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物，其与将要施用它的组织相容。如本文所用的术语“药用”是指如此描述的组合物或其组分适合用于与这些组织接触或者一般用于患者中，而无过度毒性、不相容性、不稳定性、变态反应等。合适时，本发明的组合物可以包含在考虑的领域中常规使用的任何成分。
在它们的形式方面，本发明的组合物可以包括溶液剂、乳剂(包括微乳剂)、混悬剂、凝胶剂、粉末剂或用于注射到肌肉和其他组织(组合物可以使用的地方)的其他典型固体或液体组合物。在优选实施方案中，本发明的组合物以适合于用注射器注射的低粘度、无菌制剂存在。如本文所用，当涉及根据本发明的组合物和制剂时，术语组合物和制剂基本上可互换。本发明的组合物可以为冻干粉末形式，其在注射前使用药用液体稀释剂重构。在某些实施方案中，使用液体稀释剂重构冻干粉末以形成注射用制剂，其粘度为大约0.1至大约2000cP，更优选大约0.2至大约500cP，甚至更优选大约0.3至大约50cP并且甚至更优选大约0.4至大约2.0cP。除了肉毒毒素和带正电荷的载体以外，本发明的组合物还可以含有典型地用于这些产品中的其他成分，诸如抗微生物剂，水化剂，组织填充剂或组织填料，防腐剂，乳化剂，天然或合成油，溶剂，表面活性剂，去污剂，胶凝剂，抗氧化剂，填充剂，增稠剂，粉末，粘度控制剂和水，并且任选地包括麻醉剂，抗痒活性成分，植物提取物，调制剂，矿物质，多酚，硅酮或其衍生物，维生素和植物药(phytomedicinals)。
根据本发明的注射用组合物可以是控释或缓释组合物形式，其包含肉毒毒素和带正电荷的载体，被包封或包含在材料中使得它们随时间以受控的方式释放到组织中。包含肉毒毒素和带正电荷的载体的组合物可以包含在基质、脂质体、囊泡、微胶囊、微球等中，或者包含在固体颗粒材料中，所有这些是被选择和/或构建来提供肉毒毒素随时间的释放。肉毒毒素和带正电荷的载体可以包封在一起(即，在相同的胶囊中)或分开包封(即，在分开的胶囊中)。
在多个实施方案中，本发明的组合物包含液体(水性)组合物(或制剂)，其包含本文所述的肉毒毒素、如本文所述的带正电荷的载体(或肽)、非还原性二糖或非还原性三糖、非离子表面活性剂和生理上相容的缓冲剂，该缓冲剂能够维持适当的pH，如pH 4.5至pH7.5或pH 4.5至pH 6.8或pH 4.5至pH 6.5范围内的pH。应当理解，适当的pH还包括范围内的上限和下限pH值，例如6.5的pH或7.5的pH。液体组合物中非还原性糖的浓度在10％至40％(w/v)的范围内，并且非离子表面活性剂的浓度在0.005％至0.5％(w/v)的范围内。液体组合物可以经干燥，优选通过冷冻干燥以生产稳定化的固体组合物，其可以随后被重构使用，例如使用无菌盐水或其他已知的生理上和药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体重构，特别是用已知用于注射用制剂的那些重构。优选地，所述干燥的例如冻干的固体组合物是非晶型的和无定形的固体组合物，并且可以是例如粉末的形式。此外，优选地，本发明的组合物不包括动物蛋白来源的产品，例如白蛋白。适合于本发明的组合物也在美国申请公开号US 2010/0330123中描述，其整个内容通过引用结合于此。在具体实施方案中，组合物包含A血清型肉毒毒素。在其他具体实施方案中，组合物包含分子量为150kDa的A血清型肉毒毒素。
在某些实施方案中，本发明的组合物含有非还原性糖，其优选为二糖，其非限制性实例包括海藻糖，包括其无水形式和水合形式，或蔗糖，以及它们的组合。在一些实施方案中，海藻糖的水合形式，海藻糖-二水合物，是优选的。在其他实施方案中，组合物含有三糖，其非限制性实例是棉子糖。通常，本发明组合物中非还原性糖(优选二糖，例如蔗糖)的浓度范围为10％至40％(w/v)，优选10％至25％(w/v)，更优选15％至20％(w/v)。在一些优选实施方案中，非还原性糖(优选二糖，例如蔗糖)的浓度为10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％或20％(w/v)。
通常，本发明的组合物可以包括具有稳定肉毒毒素的能力和适合于药用的任何非离子表面活性剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯，作为非限制性实例诸如聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯40，聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80。在其他实施方案中，非离子表面活性剂是脱水山梨糖醇酯，其非限制性实例包括
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20，
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60，
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65和
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80。也可以使用非离子表面活性剂
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X-100或NP-40。另外，可以使用不同非离子表面活性剂的组合。在某些优选实施方案中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯、泊洛沙姆和/或脱水山梨糖醇；聚山梨醇酯和脱水山梨糖醇是特别优选的。在多个实施方案中，非离子表面活性剂存在于本发明的组合物中的范围为0.005％至0.5％，或者范围为0.01％至0.2％、或范围为0.02％至0.1％或范围为0.05至0.08％，包括上限值和下限值。另外，本发明的组合物可以包含的非离子表面活性剂的量为0.01％，0.02％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.07％，0.08％，0.09％，0.10％，0.11％，0.12％，0.13％，0.14％，或0.15％。
通常，对于本发明的组合物，适合于使用能够将pH维持在上述范围内的任何生理上相容的缓冲剂。该缓冲剂的非限制性实例包括下述酸的盐：柠檬酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、马来酸和组氨酸。适当缓冲剂浓度的非限制实例包括0.400％至0.600％、0.450％至0.575％或0.500％至0.565％范围内的缓冲剂浓度。本发明的组合物还可以包括缓冲剂盐的混合物，其非限制性的实例包括柠檬酸盐/乙酸盐，柠檬酸盐/组氨酸，柠檬酸盐/酒石酸盐，马来酸盐/组氨酸，或琥珀酸盐/组氨酸。因此，通过单次注射在治疗后提供长持续时间作用的本发明的组合物以本文所述的w/v量包括：如本文所述的肉毒毒素(诸如肉毒毒素A或150kDa MW的肉毒毒素A)，如本文所述的带正电荷的载体(或肽)，非还原性二糖(诸如蔗糖)，非离子表面活性剂(诸如聚山梨醇酯20,聚山梨醇酯40,聚山梨醇酯60,聚山梨醇酯80、或脱水山梨糖醇酯)，和生理上相容的缓冲剂(诸如柠檬酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、马来酸和组氨酸)，其能够维持适当的pH，诸如pH 4.5至pH 6.5范围内或pH 4.5.至pH 7.5范围内的pH。
本发明的具体组合物是一种不含白蛋白的液体(水性)组合物，其包含：肉毒毒素，优选A血清型肉毒毒素，或分子量为150kDa的肉毒毒素A；带正电荷的载体(例如，肽)；非还原性二糖或非还原性三糖，优选二糖，以10％至40％(w/v)的范围存在；非离子表面活性剂，优选聚山梨醇酯或脱水山梨糖醇酯，以0.005％至0.5％(w/v)的范围存在；和生理上相容的缓冲剂，诸如柠檬酸，乙酸，琥珀酸，酒石酸，马来酸，或组氨酸，以0.400％至0.600％、0.450％至0.575％、或0.500％至0.565％的范围存在，用于维持pH在4.5和7.5之间。
根据本发明的肉毒毒素制剂可以以有效量通过注射(典型地使用注射器)递送至皮肤下的肌肉或者递送至皮肤内的腺组织，以产生麻痹、产生松弛、缓解收缩、预防或缓解痉挛、减少腺体输出或其他所需作用。肉毒毒素以这种方式的局部递送可以有提供剂量减少、降低毒性和允许针对所需效果关于注射用或植入用材料的更精确的剂量优化。
施用本发明的组合物以递送有效量的、优选治疗有效量的肉毒毒素。如本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指以上定义的肉毒毒素的量，其足以产生所需的肌肉麻痹或其他生物学作用，但是暗含为安全量，即足够低以避免严重副作用。
本发明的组合物可以含有适当有效量的肉毒毒素以作为单剂量治疗应用，或者可以是更浓缩的，以在施用地点稀释或者用于一段时期内的多次应用和/或顺序应用。通过使用本发明带正电荷的载体，可以将肉毒毒素通过注射施用于受试者以治疗病况如颈肌张力障碍。将肉毒毒素通过注射施用于肌肉或其他皮肤相关的或其他目标组织结构。
更优选地，由医师或其他健康护理专业人员或在其指导下施用所述组合物。它们可以以单次治疗或以随时间的一系列治疗进行施用。在优选实施方案中，在期望与肉毒毒素相关的效果的一个部位或多个部位注射根据本发明的组合物。在治疗颈肌张力障碍中，下表1提供了关于RTT150(RT002产品是由纯化的150kDa肉毒神经毒素组成，称为RTT150)的适当剂量的指导，对于指定肌肉组提供剂量范围1、2和3：[表1是使用通过涉及的肌肉对于
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的推荐剂量给药范围的观察产生的(Allergan,Inc.
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USPrescribing Information,2015&
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医学网站，Flexible dosing in cervicaldystonia.https://www.botoxmedical.com/CervicalDystonia/DosingAndAdministration)]
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由于其本质，肉毒毒素优选施用的量、施加速率和频率将产生期望结果，而不产生任何不利的或不希望有的结果。在多个实施方案中，使用有效量的本发明的组合物的单次治疗提供长持续时间作用，以致于在肉毒毒素可治疗的适应症的疗程期间，或者在单个多次治疗期间的一系列注射，伴随的效果持续延长的时间，例如至少6个月或大于6个月，即6个月、7个月、8个月、9个月，或更长，包括10个月。当使用多次治疗来维持治疗目标或效果时，更长的作用持续时间提供了治疗之间的更长的间隔或时期。在一个实施方案中，相对于不包含根据本发明的带正电荷的载体(或肽)的含有肉毒毒素的组合物或产品的作用持续时间，在用提供了大约100U至450U、或更具体地提供了大约100U至200U或大约200U至300U或大约300U至450U的肉毒毒素的本发明的组合物施用于或剂量给药于个体后，组合物的更长持续时间的作用例如至少6个月或大于6个月，如7、8、9、或10个月，包括在之间的时间。在一些情形中，不含本发明的带正电荷的载体(或肽)的含有肉毒毒素的组合物或产品在小于6个月内如3或4个月有效。
在某些实施方案中，将本发明的组合物(其包含肉毒毒素和带正电荷的载体，所述带正电荷的载体包含带正电荷的聚合物主链，所述主链具有一个或多个共价连接的如本文所述的带正电荷的功效基团)作为单次注射以提供大约100U至450U或更具体地大约100U至200U或大约200U至300U或大约300U至450U的肉毒毒素/治疗剂量/受试者的量或剂量施用于有需要的受试者或患者，用于治疗颈肌张力障碍。根据本发明，治疗作用持续数周或数月，例如至少10周，至少12周，至少16周，至少20周，至少24周，或至少6个月，或大于6个月，如6、7、8、9或10个月，或更长。在多个实施方案中，肉毒毒素是A、B、C、D、E、F或G血清型。在一个实施方案中，肉毒毒素是A血清型。在一个实施方案中，A血清型肉毒毒素具有150kDa的分子量。在一个实施方案中，A血清型肉毒毒素是更高分子量复合物的形式，如上文所述。在优选实施方案中，所述150kDa肉毒毒素或更高分子量形式的毒素在不含白蛋白的制剂中。在一个实施方案中，带正电荷的聚合物主链是多聚赖氨酸或聚乙烯亚胺。在一个实施方案中，所述一个或多个带正电荷的功效基团包括-(gly)n1-(arg)n2(SEQ ID NO:5)，其中下标n1是0至20、更优选0至8、还更优选2至5的整数，并且下标n2独立地为大约5至大约25、更优选大约7至大约17、最优选大约7至大约13的奇整数。在一些实施方案中，所述一个或多个带正电荷的功效基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。在某些优选的实施方案中，p为1并且q为0，或者p为0并且q为1。在其他优选实施方案中，下标p和q各自独立地为0至8,更优选0至5的整数。在一个具体实施方案中，带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)。在其他实施方案中，一个或多个带正电荷的功效基团经由功效基团(例如氨基酸序列)的C-末端或N-末端连接至所述带正电荷的主链。在一些实施方案中，所述一个或多个带正电荷的功效基团连接至带正电荷的载体的带正电荷的多聚赖氨酸主链的任一端或两端。在具体实施方案中，所述带正电荷的主链是多聚赖氨酸并且肉毒毒素是A血清型。在另一个具体实施方案中，A血清型肉毒毒素具有150kDa的分子量，并且带正电荷的主链是多聚赖氨酸并且一个或多个共价连接的带正电荷的功效基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数，或者各自独立地为如上所述的值；或者带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ IDNO:4)。在多个实施方案中，将组合物通过注射以每次注射提供20U或至少20U；30U或至少30U；40U或至少40U；50U或至少50U；60U或至少60U；70U或至少70U；80U或至少80U；90U或至少90U；或100U或至少100U的肉毒毒素的量或剂量施用。还考虑上述量或剂量之间的量或剂量，例如25U或至少25U；35U或至少35U；45U或至少45U等。在具体实施方案中，将组合物通过注射作为单次治疗剂量以提供大约100U至450U；或更具体地大约100U至200U或大约200U至300U或大约300U至450U的肉毒毒素的量施用，并且实现响应或效果并维持长持续时间，例如至少10周，至少12周，至少16周，至少20周，至少24周，至少6个月，或大于6个月，诸如例如6、7、8、9或10个月，或更长。
不希望受限，基于本文所述的本发明的治疗有效剂量的组合物和方法提供的延长的作用持续时间，在治疗过程中，在初始治疗剂量后本发明的组合物可以以较不频繁的间隔施用。例如，通过实施本发明的方法，本发明的组合物可以以大约每年两次(大约每6个月)或每7个月、8个月、9个月、或10个月或更长时间施用于(或剂量给药于)个体。在具体实施方案中，每年两次向个体施用一个剂量的本发明的组合物。两个剂量之间的中值持续时间可以是6个月，至少6个月，或大于6个月，这取决于治疗性治疗和/或治疗的期望，如由被治疗的个体确定。因此，使用本发明的组合物向个体剂量给药可以在初始剂量后进行一年两次或长于一年两次，例如每6、7、8、9或10个月一次。本发明的组合物可以以适当间隔以组合物中大约100U至450U，或更具体地大约100U至200U或大约200U至300U或大约300U至450U的肉毒毒素进行剂量给药。
本发明还考虑使用各种各样的递送装置用于注射本文所述的含有肉毒毒素的组合物通过皮肤。这样的装置可以非限制性地包括针和注射器，或可以涉及以下更复杂的装置，该装置能够分配组合物和监视组合物的分配并且任选地监视受试者的一方面或多方面的状况(例如，监视受试者对于被分配的物质的反应)。
在一些实施方案中，组合物可以原样预配制和/或预填充在递送装置中。本发明还考虑其中组合物提供在试剂盒中的实施方案，所述试剂盒与其余组分分开储存一种或多种组分。例如，在某些实施方案中，本发明提供分开储存肉毒毒素和带正电荷的载体(在应用时或应用时之前合并)的试剂盒。带正电荷的载体的量或这些分子与肉毒毒素的浓度比率将取决于选择哪种载体用于所讨论的组合物。可以容易地确定在给定情形中载体分子的适当量或比率，例如通过进行一种或多种实验诸如下述的那些。
通常，本发明还考虑一种施用肉毒毒素(或者作为肉毒毒素复合物或缩减的肉毒毒素复合物)至有需要的受试者或患者的方法，其中将有效量的肉毒毒素连同本文所述的带正电荷的载体一起施用。“连同…一起”意思是将两种组分(肉毒毒素和带正电荷的载体)以联合方式施用，其可以包括在施用于受试者之前将它们组合，或者分开施用它们，但是以这样的方式施用使得它们一起作用以提供有效量的治疗蛋白的所需递送。例如，含有带正电荷的载体的组合物可以首先施用于受试者的皮肤，接着施加含有肉毒毒素的皮肤贴片、注射器或其他装置。肉毒毒素可以以干燥形式储存在注射器或其他分配装置中，并且可以在施加毒素之前注射带正电荷的载体以致于两者一起作用，导致所需的组织渗透增强。因此，在那个意义上，这两种物质(带正电荷的载体和肉毒毒素)联合作用或者可能相互作用以原位形成组合物或组合。因此，本发明还包括试剂盒，其具有分配肉毒毒素的装置和含有带正电荷的载体并且适合于注射到受试者皮肤或目标组织的液体、凝胶等。在健康护理专业人员的指导下或由患者或受试者施用本发明组合物的试剂盒也可以包括适合于该目的的定制施加器。
本发明的组合物适用于pH范围为大约4.5至大约6.3的生理环境，并且因此可以具有这样的pH。然而，本文所述的组合物也包括具有大约4.5至大约7.5范围内的pH的组合物。根据本发明的组合物可以储存在室温下或者在冷冻条件下。
在一些实施方案中，被治疗的患者为65岁，至少65岁，或超过65岁。例如，患者可以是65、66、68、70、75、80岁或更大。
实施例
实施例1
本实施例是在成人中肉毒毒素A注射剂(DaxibotulinumtoxinA Injectable)(RT002)治疗中度至严重的孤立颈肌张力障碍(一种颈部运动障碍)的开放标签的顺序的剂量逐步升高的临床研究。在美国多个地方招募具有中度至严重的颈肌张力障碍的三十七名受试者。该试验第一组12名受试者接受单个剂量的多至200单位的RT002注射剂，第二组12名受试者接受200至300单位，而第三组13名受试者接受300至450单位。该研究显示阳性功效结果和RT002通常是安全的和良好耐受的。
跟踪所有受试者直至他们恢复至基线或者直至在治疗后合计24周。由于在第一组观察到的长持续时间的作用，所以为第二组和第三组中的受试者提供继续的选择。数名受试者选择留在研究中并且将跟踪多至36周。
2期研究的主要功效终点是肌张力障碍的改善，如通过在四周时多伦多西部痉挛性斜颈评定量表(Toronto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale，TWSTRS)-总分从基线的改变(降低)来测量。TWSTRS是校验过的覆盖颈肌张力障碍病症的不同特征的复合量表。该量表的第一部分是基于肌张力障碍的身体发现和严重性，第二部分对患者感受的失能的水平进行评定，并且第三部分对于该病症相关的疼痛进行评定。该研究方案还展示了许多次要功效终点。
总之，研究目的是：
-评估注射用RT002在具有孤立颈肌张力障碍的受试者中的安全性和初步功效，和
-评估注射用RT002在治疗孤立颈肌张力障碍中的作用持续时间。
主要终点是：
-肌张力障碍的改善，如通过在第四周时TWSTRS-总分从基线的改变来测量(TWSTRS＝多伦多西部痉挛性斜颈评定量表)。
次要终点是：
-在TWSTRS-总分中从基线的改变；
-在TWSTRS分量表评分中从基线的改变：(即，TWSTRS-严重性量表，TWSTRS-失能量表&TWSTRS-疼痛量表)；
-作用持续时间，如从治疗直至需要治疗的症状重现(当受试者达到或超过它们的目标TWSTRS-总分，或者受试者表达对治疗的需要并且研究者同意这是需要的)的星期数所评估；
-显示CGIC(临床医师总体印象改变量表(Clinician Global Impression ofChange))的改善的响应者的百分比；和
-患者评定的生活质量，通过CDIP-58(颈部肌张力障碍影响图表-58)总分(全部为治疗后时间点)从基线的改变来测量。
最高级别24周结果:
作用持续时间至少24周：对于研究的三个剂量组中的每一个，中值作用持续时间是至少24周。作用持续时间被定义为从治疗到需要重新治疗的征候和症状重现(基于受试者达到他们的目标多伦多西部痉挛性斜颈评定量表(TWSTRS)得分)的星期数。对于参照，当前颈肌张力障碍的治疗要求大约每3个月(12周)或每年4次注射肉毒毒素。
阳性功效结果：试验的4周主要功效测量是颈肌张力障碍的征候和症状的改善，如通过TWSTRS-总分从基线的降低来测定。在第4周，RT002注射剂在所有三个组中显示了临床上显著的从基线的平均38％的降低。对于所有受试者，该降低在第6周继续增加至50％，在第12周是42％并且保持在30％或以上直至第24周。对于参照，批准治疗颈肌张力障碍的A型肉毒毒素产品的安慰剂对照试验的TWSTRS-总分在第4周从基线降低21％至26％并且在第12周从基线降低13％至16％。
在关键次要终点，显示临床医师总体印象改变量表(CGIC)的改善的响应者的百分比，所有受试者中有97％在第4周经历颈肌张力障碍症状的改善。
总体安全和良好耐受的：在所有三组中，直至第24周，RT002注射剂似乎是总体安全的并且是良好耐受的。没有严重不利事件并且没有不利事件的剂量依赖性增加。治疗相关不利事件通常是瞬时的并且在严重性方面是轻度至中度，一例颈部疼痛被报道为严重的。最常见的不利事件是吞咽困难，或者难以吞咽(14％)，其中全部病例的严重性是轻度的，注射部位发红(8％)，注射部位青肿(5％)，注射部位疼痛(5％)，肌肉紧绷(5％)和肌肉无力(5％)。对于参照，批准治疗颈肌张力障碍的A型肉毒毒素产品的试验具有13％至39％的吞咽困难不利事件。
具有颈肌张力障碍的患者遭受相当大的疼痛和乏力，这显著影响他们的生活质量。该研究中的几乎所有受试者对治疗响应并且大多数在24周仍然对RT002响应。图1-8提供了关于研究设计和结果的另外数据。
研究的安全性总结:在评估的所有剂量组中，直至第24周，RT002似乎总体上安全并且良好耐受，在剂量升高时治疗出现的不利事件(TEAE’s)没有增加。
在37名受试者中有13名(35％)报道了总共22件治疗相关的TEAE’s：
-最频繁报道的：吞咽困难(14％)，注射部位红斑(8％)，注射部位青肿(5％)，注射部位疼痛(5％)，肌肉紧绷(5％)和肌肉无力(5％)
-全部TEAE’s的严重性是轻度的或中度的，除了一例颈部疼痛被报道为严重的以外(第10天发作，持续2天)
没有报道严重不利事件。
所有特别感兴趣的治疗相关的TEAE’s减轻，与现有的BoNTA研究相比具有类似的或更低的发生率(批准治疗CD的其他BoNTA产品的试验具有的吞咽困难率的范围为13-39％；包括BOTOX,Dysport和Xeomin，数据报道在产品处方信息中)。
-吞咽困难:14％(5/37；全部为轻度的)；平均持续时间35天。
-肌肉无力:5％(2/37；1名轻度,1名中度)，两者均为局部
-颈部疼痛:3％(1/37；严重)
研究的功效总结:
作用持续时间:对于研究的3组的每一组，中值作用持续时间大于24周，所述作用定义为受试者保持至少20％的在第4周实现的治疗益处(目标TWSTRS得分)。
-当通过剂量组A和B分析时，中值作用持续时间对于两组都大于24周。
CD征候和症状的改善:在第4周对于所有受试者观察到了TWSTRS总分从基线的38％的临床显著的降低。
-从基线的改善在第6周达到50％峰值，该治疗益处的大部分保持大于30％直至第24周。
总体印象改变响应率:所有受试者中有97％在第4周在他们的颈肌张力障碍方面经历改善(评分>1)，如通过临床医师总体印象改变(CGIC)所评估的。
在本发明优选实施方案中，本发明的注射用组合物称作RT002，含有肉毒毒素A和带正电荷的载体，所述载体包含带正电荷的多聚赖氨酸多肽，所述多聚赖氨酸多肽共价连接有一个或多个带正电荷的功效基团。该RT002产品是注射用制剂，其含有150kD的A亚型肉毒毒素分子，其不是共价连接于具有式RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)的带正电荷的载体肽，并且不含有附属蛋白或动物来源的组分。在本发明的优选方法中，任选地在受试者颈部的不同肌肉部位，通过注射RT002施用单次(一次)治疗以治疗颈肌张力障碍。优选的治疗剂量为超过100U、100-200U、200-300U和300-450U的RT002。RT002产品包括纯化的150kDa的肉毒神经毒素，称为RTT150，其配制为冻干粉末剂。在非临床研究中，已经显示RT002展示了比其他形式的肉毒神经毒素A(BoNTA)更少的扩散并且可以提供在目标部位的更控制的作用，由于毒素对周围肌肉的遥远扩散而具有较小副作用。此外，RT002无添加剂的A型肉毒毒素制剂具有提供较小免疫原性潜力的能力(由于缺少制剂中存在的非活性蛋白)。另外，在大鼠中多至50U/kg的重复剂量的肌内施用后，RT002是良好耐受的。
剂量给药方案和注射技术：本发明RT002的优选剂量给药方案是RT002单次治疗(剂量多至100U、100-200U、200-300U或300-450U/受试者)，作为0.1mL肌内注射到经历治疗的受试者的颈部上的注射部位。
RT002的减少的扩散与非临床和之前的研究一致，并且支持毒素的减少的扩散，如在用本发明的组合物治疗的受试者中观察到的，本发明的组合物含有：肉毒毒素，如肉毒毒素A，和带正电荷的载体，所述载体包含主链如多聚赖氨酸，所述主链具有一个或多个共价连接的带正电荷的如本文所述的功效基团，所述组合物诸如RT002。
剂量和作用持续时间：不希望受限，基于高响答率、作用持续时间和阳性安全性质，中期分析结果支持选择超过100U的剂量作为使用含有肉毒毒素的本发明组合物单次治疗的最优剂量。另外，在通过注射施用于受试者后，本发明的组合物，如RT002，具有持续的和长的作用持续时间，例如至少6个月。本发明的组合物如RT002提供的作用持续时间以及治疗方法及其应用提供了优势，原因在于，经历治疗的受试者认为治疗后的作用持续时间对于他们是非常重要的。特别是通过单次或一次注射剂量的产品即RT002实现的这样长的持续作用时间，允许对于受试者每个疗程更少的注射，这对于受试者的舒适性、便利性和总体健康是重要的。获得了显著和持续作用的产品(其在通过向受试者注射产品的单次治疗剂量后维持至少6个月的时间)对于本领域未满足的需要为专业人员和患者两者都提供了解决方案。
应当理解，本文描述的以下实施例和实施方案是为了举例说明目的，并且依据它们的各种改变或变化对本领域技术人员有启示，并且包括在本申请的精神和界限内以及后附权利要求的范围内。
对于所有目的，本文引用的所有出版物、专利和公开的专利申请通过引用完整地结合于此。

Claims (53)

1.一种在具有颈肌张力障碍的个体中施用肉毒毒素以实现延长持续时间的治疗作用的方法，所述方法包括：
通过注射将第一治疗剂量的无菌注射用组合物施用至需要治疗的个体中的导致颈肌张力障碍的一块或多块肌肉中，以在用所述组合物第一次治疗后实现所述治疗作用；
其中所述组合物包含：
适合于注射的药用稀释剂；和
肉毒毒素组分，所述肉毒毒素组分选自肉毒毒素、肉毒毒素复合物或缩减的肉毒毒素复合物；和
带正电荷的载体组分，其包含带正电荷的多聚赖氨酸主链，所述主链具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有以下氨基酸序列：(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；
其中施用于所述个体的肉毒毒素组分的总治疗剂量为100U至450U；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒毒素组分非共价缔合；并且
其中通过注射施用至所述个体的第一治疗剂量的所述组合物实现了至少大约24周作用持续时间的延长持续时间的治疗或美容作用，任选地之后施用第二或后续治疗剂量。
2.一种在有需要的个体中治疗颈肌张力障碍的方法，所述方法包括：
通过注射将组合物施用至所述个体的导致颈肌张力障碍的一块或多块肌肉中，所述组合物包含：
注射用的药用稀释剂；
肉毒毒素组分，所述肉毒毒素组分选自肉毒毒素、肉毒毒素复合物、或缩减的肉毒毒素复合物；和
带正电荷的载体组分，其包含带正电荷的多聚赖氨酸主链，所述主链具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有以下氨基酸序列：(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；
其中肉毒毒素以100U至450U的总治疗剂量施用于所述个体；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒毒素组分非共价缔合；并且
其中注射所述组合物提供了在所述个体中减少颈肌张力障碍的症状方面具有至少大约24周作用持续时间的单次治疗剂量，由此延长了对于所述个体的治疗间隔持续时间。
3.一种无菌注射用制剂中的药物组合物，其用于施用肉毒毒素以在具有颈肌张力障碍的个体中实现延长持续时间的治疗作用，
所述组合物包含：
适合于注射的药用稀释剂；
治疗剂量为100U至450U的肉毒毒素组分，其中所述肉毒毒素组分选自肉毒毒素复合物、缩减的肉毒毒素复合物或肉毒毒素；和
带正电荷的载体组分，其包含带正电荷的多聚赖氨酸主链，所述主链具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有以下氨基酸序列：(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒毒素组分非共价缔合；并且
其中所述治疗剂量的组合物在通过注射施用了所述制剂的个体中实现了具有至少大约24周作用持续时间的延长持续时间的治疗作用。
4.一种无菌注射用制剂中的药物组合物，其用于在需要其的个体中减少颈肌张力障碍的症状，所述组合物包含：
剂量为100U至450U的肉毒毒素组分，所述肉毒毒素组分选自肉毒毒素复合物、缩减的肉毒毒素复合物或肉毒毒素，
带正电荷的载体组分，其包含带正电荷的多聚赖氨酸主链，所述主链具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有以下氨基酸序列：(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；和
注射用的药用稀释剂；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒毒素组分非共价缔合；并且
其中所述剂量的组合物提供单次治疗，其在所述个体中减少颈肌张力障碍的症状方面具有至少大约24周作用持续时间，由此延长了对于所述个体的治疗间隔持续时间。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的方法、或根据权利要求3或权利要求4所述的药物组合物，其中所述组合物实现了至少大约8个月的延长持续时间的治疗作用。
6.根据权利要求5所述的方法或药物组合物，其中所述组合物包含A血清型肉毒毒素。
7.根据权利要求6所述的方法或药物组合物，其中所述组合物包含分子量为150kDa的A血清型肉毒毒素。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述带正电荷的多聚赖氨酸主链具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述带正电荷的多聚赖氨酸主链具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有氨基酸序列(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述带正电荷的多聚赖氨酸主链具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有氨基酸序列(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法或药物组合物，其中(i)下标p和q各自独立地为0至8的整数；或(ii)各自独立地为2至5的整数。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述一个或多个带正电荷的功效基团与所述带正电荷的载体的所述带正电荷的多聚赖氨酸主链的一端或两端连接。
13.根据权利要求12所述的方法或药物组合物，其中所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述组合物在注射后不从注射部位局部扩散。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法或药物组合物，其中将所述治疗剂量的肉毒毒素以大约100U至200U的量施用于所述个体。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的方法或药物组合物，其中将所述治疗剂量的肉毒毒素以大约200U至300U的量施用于所述个体。
17.根据权利要求1-14中任一项所述的方法或药物组合物，其中将所述治疗剂量的肉毒毒素以300U至450U的量施用于所述个体。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法或药物组合物，其中治疗作用持续时间包括大于3个月。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法或药物组合物，其中治疗作用持续时间包括大于4个月。
20.根据权利要求1-17中任一项所述的方法或药物组合物，其中治疗作用持续时间包括大于5个月。
21.根据权利要求1-17中任一项所述的方法或药物组合物，其中治疗作用持续时间包括大于6个月。
22.根据权利要求1-17中任一项所述的方法或药物组合物，其中治疗作用持续时间包括大于7个月。
23.根据权利要求1-17中任一项所述的方法或药物组合物，其中治疗作用持续时间包括大于8个月。
24.根据权利要求1-17中任一项所述的方法或药物组合物，其中治疗作用持续时间包括大于9个月。
25.根据权利要求1-17中任一项所述的方法或药物组合物，其中治疗作用持续时间包括至少6个月至10个月。
26.无菌注射用组合物，其包含：
剂量选自100U、200U、300U或450U的肉毒毒素组分，所述肉毒毒素组分选自肉毒毒素、肉毒毒素复合物或缩减的肉毒毒素复合物；和
带正电荷的载体组分，其包含带正电荷的多聚赖氨酸主链，所述主链具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有以下氨基酸序列：(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；和
用于注射的药用稀释剂；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒毒素组分非共价缔合；并且
其中所述组合物提供了美容或治疗作用，所述美容或治疗作用在用所述注射用组合物单次治疗个体后持续至少24周。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)。
28.根据权利要求26或权利要求27所述的组合物，其中所述组合物包含A血清型肉毒毒素。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述组合物包含分子量为150kDa的A血清型肉毒毒素。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的组合物，其中以100U的量将所述治疗剂量的肉毒毒素施用于所述个体。
31.根据权利要求26至29中任一项所述的组合物，其中以200U的量将所述治疗剂量的肉毒毒素施用于所述个体。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的组合物，其中以450U的量将所述治疗剂量的肉毒毒素施用于所述个体。
33.一种用注射用肉毒毒素治疗需要治疗的具有颈肌张力障碍的个体的方法，其中治疗方法包括具有多个治疗间隔的疗程，所述疗程具有延长持续时间的作用和每个治疗间隔之间延长的持续时间，所述疗程包括：
通过注射将初始治疗剂量的无菌注射用组合物施用至需要治疗的所述个体的导致颈肌张力障碍的一块或多块肌肉中，以在用所述组合物初始治疗后实现减少颈肌张力障碍的症状的治疗作用；
其中所述组合物包含：
适合于注射的药用稀释剂；
肉毒毒素组分，所述肉毒毒素组分选自肉毒毒素、肉毒毒素复合物或缩减的肉毒毒素复合物；和
带正电荷的载体组分，其包含带正电荷的多聚赖氨酸主链，所述主链具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有以下氨基酸序列：(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；并且
其中将所述肉毒毒素组分以大约100U至大约450U的治疗剂量施用于所述个体；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒毒素组分非共价缔合；
其中通过注射施用于所述个体的初始治疗剂量的所述组合物提供持续至少大约10个月的治疗作用持续时间；并且
以治疗间隔通过注射施用后续治疗剂量的所述组合物至所述个体，所述治疗间隔包括在初始治疗剂量之后和每个后续治疗剂量之间的大于或等于6个月至至少大约10个月的持续时间。
34.根据权利要求33至权利要求35中任一项所述的方法，其中所述组合物包含A血清型肉毒毒素。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述组合物包含分子量为150kDa的A血清型肉毒毒素。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述带正电荷的多聚赖氨酸主链具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。
37.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述带正电荷的多聚赖氨酸主链具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有氨基酸序列(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。
38.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述带正电荷的多聚赖氨酸主链具有与其共价连接的一个或多个带正电荷的功效基团，所述功效基团具有氨基酸序列(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的方法，其中(i)下标p和q各自独立地为0至8的整数；或(ii)各自独立地为2至5的整数。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的方法，其中所述一个或多个带正电荷的功效基团与所述带正电荷的载体的所述带正电荷的多聚赖氨酸主链的一端或两端连接。
41.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)。
42.根据权利要求33至41中任一项所述的方法，其中所述组合物在注射后不从注射部位局部扩散。
43.根据权利要求33至42中任一项所述的方法，其中将所述肉毒毒素以大约100U至200U的量施用于所述个体。
44.根据权利要求33至42中任一项所述的方法，其中将所述肉毒毒素以200U至300U的量施用于所述个体。
45.根据权利要求33至42中任一项所述的方法，其中将所述肉毒毒素以300U至450U的量施用于所述个体。
46.根据权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述治疗间隔的持续时间包括大于3个月。
47.根据权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述治疗间隔的持续时间包括大于4个月。
48.根据权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述治疗间隔的持续时间包括大于5个月。
49.根据权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述治疗间隔的持续时间包括大于6个月。
50.根据权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述治疗间隔的持续时间包括大于7个月。
51.根据权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述治疗间隔的持续时间包括大于8个月。
52.根据权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述治疗间隔的持续时间包括大于9个月。
53.根据权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述治疗间隔的持续时间包括至少6个月至10个月。
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