CN102300584A

CN102300584A - 可注射的肉毒杆菌毒素制剂

Info

Publication number: CN102300584A
Application number: CN2009801555495A
Authority: CN
Inventors: C·L·鲁格; H·F·斯通; J·M·沃
Original assignee: Essentia Biosystems Inc
Current assignee: Revance Therapeuticals Inc
Priority date: 2008-12-31
Filing date: 2009-12-28
Publication date: 2011-12-28
Also published as: IL213668A0; US20100168023A1; KR101753242B1; SG10202100698QA; JP2015134784A; US20110268765A1; ES2669020T3; CY1120137T1; KR102363878B1; SI2379104T1; IL281675A; KR102005930B1; AU2021200561B2; US20200215357A1; WO2010078242A1; ES2908616T3; SG172812A1; KR20200131348A; JP5866202B2; AU2018253620A1

Abstract

本发明提供新的包含肉毒杆菌毒素的可注射的组合物，其可以施用于受试者以用于多种治疗、美容和/或化妆目的。本发明涉及的可注射的组合物与常规的肉毒杆菌毒素制剂相比，表现出一种或多种优点，包括减少的抗原性，注射后减少的不想要的局部扩散的倾向，增加的临床功效持续时间或相对增强的效力，临床功效的更快开始，和/或改善的稳定性。

Description

可注射的肉毒杆菌毒素制剂

相关专利申请

本申请根据35 U.S.C.§119要求2008年12月31日提交的美国临时专利申请No.61/142,063的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明涉及新的包含肉毒杆菌毒素的可注射的组合物，其可以施用于受试者以用于多种治疗、美容和/或化妆目的。

发明背景

皮肤保护身体器官免受外部环境的威胁，并起保持体温的恒温器作用。其由几个不同的层组成，每层都具有特定的功能。主要的层包括表皮、真皮和皮下组织。表皮是覆盖真皮的上皮细胞的分化层，真皮由结缔组织组成。表皮和真皮都受皮下组织的进一步支持，皮下组织是脂肪组织的内层。

表皮，皮肤的最上层，仅仅为0.1至1.5毫米厚(Inlander，Skin，New York，N.Y.：People′s Medical Society，1-7(1998))。其由角质形成细胞组成，根据它们的分化状态，其被分成几层。可以进一步将表皮分成角质层和有活力的表皮，该有活力的表皮由granularmelphigian和基细胞组成。角质层是吸湿性的，需要至少10％重量的水分以保持其弹性和柔软性。吸湿性部分归于角蛋白的持水能力。当角质层丧失其柔软性和弹性时，其变得粗糙且脆，产生干燥皮肤。

真皮，其紧位于表皮之下，为1.5至4毫米厚。其是皮肤的三个层中最厚的。大部分皮肤结构，包括汗腺和脂腺(其通过皮肤中称为毛孔或痤疮的孔分泌物质)、毛囊、神经末梢和血管及淋巴管，在真皮中被发现(Inlander，Skin，New York，N.Y.：People′s Medical Society，1-7(1998))。然而，真皮的主要组分是胶原和弹性蛋白。

皮下组织是皮肤的最深层。其起用于身体热量保存的绝缘体和用于器官保护的减震器作用(Inlander，Skin，New York，N.Y.：People′s Medical Society，1-7(1998))。另外，皮下组织也贮藏用于能量储备的脂肪。皮肤的pH通常为5至6之间。该酸性是由于存在来自于皮脂腺分泌物的两性氨基酸、乳酸和脂肪酸。术语“酸外膜(acidmantle)”指在皮肤的大多数区域存在水溶性物质。皮肤的缓冲能力部分由于储存在皮肤角质层中的这些分泌物。

皱纹，年龄的指示特征之一，可能是由皮肤受环境损害而蓄积的生物化学、组织学和生理学变化引起(Benedetto，“InternationalJournal of Dermatology”，38：641-655(1999))。另外，存在可引起面部皱纹的皱褶、皱纹和皱痕(creases)的其他第二因子(Stegman等人，The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery，第2版，St.Louis编著，Mo.：Mosby Year Book：5-15(1990))。这些第二因子包括重力的持续牵拉、皮肤上经常和持续的位置压力(例如，在睡眠期间)和由于面部肌肉收缩引起的反复面部运动(Stegman等人.，The Skin of the Aging Face Cosmetic DermatologicalSurgery，第2版，St.Louis编著，Mo.：Mosby Year Book：5-15(1990))。

为了可能缓和某些老化体征，已经使用了不同的技术。这些技术从包含α羟酸和视黄醇的面部增湿剂到外科手术方法和注射神经毒素。例如，在1986年，Jean和Alastair Carruthers，一对由眼整形外科医生和皮肤科医生组成的夫妻团队，研究了一种使用A型肉毒杆菌毒素治疗眉间区域与运动相关的皱纹的方法(Schantz和Scott，In Lewis G.E.(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum，New York：Academic Press，143-150(1981))。在1992年，Carruthers使用A型肉毒杆菌毒素来治疗皱纹引起该方法最初公布(Schantz和Scott，In Lewis G.E.(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum，New York：Academic Press，143-150(1981))。直到1994年，同一团队报道了对于面部的其它运动相关的皱纹的经验(Scott，Ophthalmol，87：1044-1049(1980))。这依次引起使用A型肉毒杆菌毒素进行化妆处理的时代的诞生。

据报道A型肉毒杆菌毒素是人类所知最致命的天然生物剂。肉毒杆菌(C.botulinum)的孢子可在土壤中找到，并可在不正确地杀菌和密封的食物容器中生长。肉毒中毒(其可能是致命的)，可通过摄入该细菌引起。肉毒杆菌毒素通过阻止突触传递(通过抑制乙酰胆碱释放穿过神经肌肉接点)而导致产生肌肉麻痹，并且其被认为也以其它方式起作用。其作用主要是阻断通常引起肌肉痉挛或收缩的信号，导致麻痹。在最近十年间，已经将肉毒杆菌毒素的肌肉-麻痹活性用于获得多种治疗功效。已经使用肉毒杆菌毒素的受控施用来提供肌肉麻痹，以治疗多种医学病症，例如以骨骼肌活动过度为特征的神经肌肉失调。已经用肉毒杆菌毒素治疗的病症包括偏侧面肌痉挛、成年人发病的痉挛性斜颈、肛裂、眼睑痉挛、大脑性瘫痪、颈张力障碍、偏头痛、斜视、颞下颌关节障碍和各种类型的肌痛性痉挛和肌痉挛。近来，在治疗和化妆性面部应用中已经利用肉毒杆菌毒素的肌肉-麻痹效应，所述应用例如治疗皱纹、皱眉线(frown lines)及其它面部肌肉痉挛或收缩的后果。

除了A型肉毒杆菌毒素之外，存在七种其它的血清学不同形式的肉毒杆菌毒素，其也由革兰氏阳性菌肉毒杆菌产生。在这八种血清学不同类型的肉毒杆菌毒素中，可引起麻痹的七种被称为肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。这些毒素中的每种以用特定类型的抗体中和为特征。各肉毒杆菌毒素蛋白的分子量为约150 kD。由于肉毒杆菌毒素的分子尺寸和分子结构，其不能穿过角质层和多层皮下结构。不同血清型的肉毒杆菌毒素在不同动物物种中在它们引起的麻痹的严重性和持续时间方面以及效果方面不同。例如，已经确定，在大鼠中A型肉毒杆菌毒素的功效为B型肉毒杆菌毒素的500倍以上，如通过麻痹速率所测定的。另外，已经确定B型肉毒杆菌毒素在灵长类动物中在480 U/kg的剂量下是无毒的，该剂量为A型肉毒杆菌毒素的灵长类动物LD₅₀的约12倍。

当由肉毒杆菌细菌释放时，肉毒杆菌毒素为毒素复合物的组分，所述毒素复合物包含约150 kD的肉毒杆菌毒素蛋白分子和缔合的非毒素蛋白。这些内源性非毒素蛋白被认为包括血凝素蛋白家族和非血凝素蛋白。据报道，非毒素蛋白稳定毒素复合物中的肉毒杆菌毒素分子并且保护它防止被消化酸变性(当毒素复合物被摄取时)。因此，毒素复合物中的非毒素蛋白保护肉毒杆菌毒素的活性，并因此当经由胃肠道施用所述毒素复合物时，增加全身性渗透。此外，据认为，某些非毒素蛋白特异性稳定血液中的肉毒杆菌毒素分子。

非毒素蛋白在毒素复合物中的存在通常导致毒素复合物具有比单纯的肉毒杆菌毒素分子更大的分子量，所述单纯的肉毒杆菌毒素分子的分子量为约150 kD，如之前陈述的。例如，肉毒杆菌细菌可以产生A型肉毒杆菌毒素复合物，其具有约900 kD、500 kD或300 kD的分子量。B型和C型肉毒杆菌毒素作为具有约700 kD或约500 kD分子量的复合物产生。D型肉毒杆菌毒素作为具有约300 kD或约500 kD分子量的复合物产生。E型和F型肉毒杆菌毒素仅作为具有约300 kD分子量的复合物产生。

为了给肉毒杆菌毒素提供额外的稳定性，在制备过程中，通常通过将复合物与白蛋白组合来稳定毒素复合物。例如，(Allergan，Inc.，Irvine，CA)是包含肉毒杆菌毒素的制剂，其包含100 UA型肉毒杆菌毒素，和辅助蛋白，0.5毫克人白蛋白，以及0.9毫克氯化钠。白蛋白用于在不同的环境中结合和稳定毒素复合物，所述环境包括与制备、运输、存储和施用相关的环境。

一般地，通过组合物的小心受控的注射将肉毒杆菌毒素施用给患者，所述组合物包含肉毒杆菌毒素复合物和白蛋白。然而，存在与该方法相关的几个问题。不仅是注射的痛苦，而且为了实现想要的治疗或化妆效果，一般地在注射部位周围局部地产生毒素的大的皮下孔。肉毒杆菌毒素可能从这些皮下孔转移，引起身体的邻近区域的不想要的麻痹。当要治疗的区域较大并且需要多次注射毒素以治疗该区域时，该问题更加严重。此外，因为注射的毒素复合物包含非毒素蛋白和白蛋白(其稳定肉毒杆菌毒素并且增加毒素复合物的分子量)，毒素复合物在体内具有长半衰期并且可能在患者中引起不希望的抗原应答。例如，一些患者将随时间产生对在目前的商品化制剂中用作稳定剂的白蛋白的变态反应。并且，毒素复合物可能诱导患者的免疫系统形成中和抗体，以致在随后的施用中需要更大量的毒素来实现相同的效果。当其发生时，随后的注射必须小心地定位，以使它们不释放大量毒素进入患者血流，其可以导致致命的全身中毒，特别地因为非毒素蛋白和白蛋白稳定血液中的肉毒杆菌毒素。

鉴于与目前的肉毒杆菌毒素制剂相关的不利因素，非常期望具有这样的可注射的肉毒杆菌毒素制剂，其是有效的和稳定的，但表现出减少的抗原性和较低的注射后局部扩散的倾向。还希望将这样的肉毒杆菌毒素制剂用于各种治疗、美容和/或化妆目的。

发明概述

本发明提供可注射的组合物，其包含与带正电荷的载体分子非共价结合的肉毒杆菌毒素。在优选实施方案中，本发明的组合物与常规的市售可得的肉毒杆菌毒素制剂(例如

或

)相比具有一种或多种优点。例如，在某些实施方案中，与常规的可注射的肉毒杆菌制剂相比，该组合物可以表现出一种或多种优点，包括减少的抗原性，减少的注射后扩散进入周围组织的倾向，临床功效的增加的持续时间或增强的效力(相对于常规的肉毒杆菌毒素制剂)，临床功效的更快开始，和/或改善的稳定性。

本发明的一个方面是认识到，某些非天然分子(即，未在获自肉毒杆菌细菌的肉毒杆菌毒素复合物中发现的分子)可以添加到肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物，特别是缩减的(reduced)肉毒杆菌毒素复合物(如本文所定义的)中，以提高毒素通过组织的扩散作用。非天然分子与毒素非共价结合并且用作渗透增强剂，其提高毒素注射后到达目标结构的能力。此外，非天然分子可以在注射前和注射后增加毒素的稳定性。例如，渗透增强剂可以是带正电荷的载体，例如阳离子肽，其没有固有的肉毒杆菌毒素样活性并且其还包含一个或多个蛋白转导结构域，如本文描述的。

本发明的另一个实施方案是提供包含肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物(或缩减的蛋白肉毒杆菌毒素复合物，其仅包括150 kD神经毒素本身或神经毒素与一些但不是全部的天然复合物蛋白)以及带正电荷的载体的组合物。

本发明进一步涉及通过给需要此类治疗的受试者或患者注射有效量的本发明的组合物来产生生物学效果的方法。生物学效果可以包括例如，肌肉麻痹、减少分泌过多或出汗、治疗神经性疼痛或偏头痛、控制鼻炎或鼻窦炎、治疗膀胱过度活动症、减少肌肉痉挛、预防或减少痤疮、减少或增强免疫应答、减少皱纹或预防或治疗多种其他病症。

本发明还提供用于制备制剂或预混合物的试剂盒，所述制剂包含肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减的蛋白肉毒杆菌毒素复合物以及带正电荷的载体，所述预混合物可以用于产生所述制剂。还提供试剂盒，其包含用于连续地施用肉毒杆菌毒素复合物(或缩减的肉毒杆菌毒素复合物，其仅包括150 KD的神经毒素本身或所述神经毒素与一些天然复合物蛋白)和带正电荷的载体的工具。

附图概述

图1：柱状图，其表示重复施用RT003或

后恢复至基线DAS值(0.4)所需要的时间。

图2：图2A表示注射了用于指示小鼠的腓肠肌肌肉部分的深色染料的小鼠的后肢，所述腓肠肌肌肉接受中线旁侧注射。图2B表示注射了用于指示小鼠的腓肠肌肌肉部分的深色染料的小鼠的后肢，所述腓肠肌肌肉接受中线注射。

图3：趾外展评分(Digital abduction scores)，其测量为RT003、RTT150或

注射入小鼠的腓肠肌肌肉的中线旁侧或中线部分后的时间的函数。

发明详述

本发明涉及新的包含肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减的肉毒杆菌毒素复合物的可注射的组合物。在优选实施方案中，该组合物稳定毒素或使得能够在注射后运送或递送毒素通过组织，以便与常规的市售可得的与外源白蛋白结合的肉毒杆菌毒素复合物(例如

或

)相比，毒素具有减少的抗原性，更好的安全特征，增强的效力，临床功效的更快开始和/或更长的临床功效持续时间。如本文所述，本发明的组合物可以用作向受试者提供肉毒杆菌毒素的可注射施用剂，用于各种治疗、美容和/或化妆目的。与递送肉毒杆菌毒素的其它组合物和方法相比，本发明的组合物还具有改善的安全特征。此外，该组合物可以有利地减少对内毒杆菌毒素的免疫应答。

本文使用的术语“肉毒杆菌毒素”可以指任一种已知类型的肉毒杆菌毒素(例如，与不同血清型的肉毒杆菌相关的150 kD的肉毒杆菌毒素蛋白分子)，无论其是由细菌生成的还是通过重组技术生成的，和随后可能发现的任何这样的类型，包括新发现的血清型和工程改造的变体或融合蛋白。如上所述，目前已经表征了七种免疫学上不同的肉毒杆菌神经毒素，即肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C、D、E、F和G，其各自以用特定类型的抗体中和为特征。所述肉毒杆菌毒素血清型为市售可得的，例如，得自Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)和Metabiologics，Inc.(Madison，Wis)和其它来源。不同血清型的肉毒杆菌毒素随动物种类不同，影响它们引起的麻痹的严重性和持续时间。至少两种肉毒杆菌毒素，A型和B型，是以用于治疗某些病症的制剂市售可得的。例如，A型包含在具有商标

的Allergan制剂中和具有商标的Ipsen制剂中，B型包含在具有商标

的Elan制剂中。

在本发明的组合物中使用的术语“肉毒杆菌毒素”可以可选地指肉毒杆菌毒素衍生物，即，具有肉毒杆菌毒素活性但相对于天然存在的或重组的天然肉毒杆菌毒素在任何部分或任何氨基酸链上包含有一个或多个化学或功能改变的化合物。例如，所述肉毒杆菌毒素可以是修饰的神经毒素，即与天然形式相比具有至少一个氨基酸被删除、修饰或替换的神经毒素，或者所述修饰的神经毒素可以是重组生成的神经毒素或其衍生物或片段。例如，肉毒杆菌毒素可以是已经以一种方式进行修饰的毒素，所述方式例如增强其性质或减少不想要的副作用，但仍然保持希望的肉毒杆菌毒素活性。可选地，本发明所用的肉毒杆菌毒素可以是使用重组或合成化学技术制备的毒素，例如重组肽、融合蛋白、或杂种神经毒素，例如从不同肉毒杆菌毒素血清型的亚基或结构域制备(例如，参见美国专利6,444,209)。所述肉毒杆菌毒素也可以是整个分子的一部分，其已经显示具有必需的肉毒杆菌毒素活性，并且在这种情况下，可以单独使用或作为组合或缀合分子例如融合蛋白的一部分使用。或者，所述肉毒杆菌毒素可以是肉毒杆菌毒素前体的形式，其本身可以是无毒的，例如无毒的锌蛋白酶，其在蛋白酶切割后变成有毒的。

本文使用的术语“肉毒杆菌毒素复合物”或“毒素复合物”是指约150 kD的肉毒杆菌毒素蛋白分子(属于肉毒杆菌毒素血清型A-G的任一种)连同结合的内源性非毒素蛋白(即，由肉毒杆菌细菌生成的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)一起。然而，应当注意，所述肉毒杆菌毒素复合物不必作为一种单一毒素复合物来源于肉毒杆菌细菌。例如，可以首先重组制备肉毒杆菌毒素或修饰的肉毒杆菌毒素，然后将其与非毒素蛋白组合。重组的肉毒杆菌毒素还可以是购买的(例如，购自List Biological Laboratories，Campbell，Ca)，然后将其与非毒素蛋白组合。

本发明还涉及通过添加一种或多种外源稳定剂，除去内源稳定剂或其组合，调节肉毒杆菌毒素分子的稳定性。例如，本发明涉及使用″缩减的肉毒杆菌毒素复合物″，其中所述肉毒杆菌毒素复合物具有减少量的非毒素蛋白，与在由肉毒杆菌细菌生成的肉毒杆菌毒素复合物中天然发现的数量相比。在一个实施方案中，使用任何常规蛋白分离方法，从来源于肉毒杆菌细菌的肉毒杆菌毒素复合物中提取一部分血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白，从而制备缩减的肉毒杆菌毒素复合物。例如，缩减的肉毒杆菌毒素复合物可以通过将肉毒杆菌毒素复合物暴露在pH 7.3的红细胞下以分离肉毒杆菌毒素复合物来产生(例如参见EP 1514556 A1，其通过引用并入本文)。可以使用HPLC、透析、柱、离心及其它方法来从蛋白中提取蛋白。或者，当通过组合合成产生的肉毒杆菌毒素与非毒素蛋白来产生缩减的肉毒杆菌毒素复合物时，人们可仅仅向该混合物中加入比天然存在的肉毒杆菌毒素复合物中所含的更少的血凝素或非毒素非血凝素蛋白。根据本发明，可以独立地以任何量减少在缩减的肉毒杆菌毒素复合物中的任何非毒素蛋白(例如血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白或两者)。在某些示例性的实施方案中，一种或多种非毒素蛋白相对于在肉毒杆菌毒素复合物中通常发现的量减少了至少约0.5％、1％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。如上所述，肉毒杆菌细菌产生七种不同血清型的毒素并且用不同相对量的非毒素蛋白制备市售可得的制剂(即，不同量的毒素复合物)。例如，MYOBLOC^TM含有5000 U的B型肉毒杆菌毒素/ml和0.05％的人血清白蛋白、0.01 M丁二酸钠和0.1 M氯化钠。DYSPORT^TM含有500 U的A型肉毒杆菌毒素-血凝素复合物与125 mcg的白蛋白和2.4 mg的乳糖。在某些实施方案中，从所述肉毒杆菌毒素复合物中除去了基本上所有的通常在来源于肉毒杆菌细菌的肉毒杆菌毒素复合物中发现的非毒素蛋白(例如大于95％，96％，97％，98％或99％的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)。此外，尽管在某些情况下可以以相同的数量减少内源性非毒素蛋白的量，本发明还涉及以不同的量减少每种内源性非毒素蛋白，和减少至少一种内源性非毒素蛋白，但不减少其它的。

如上所述，一般添加外源稳定剂(例如白蛋白)以稳定肉毒杆菌毒素制剂。例如，就

来说，0.5 mg人白蛋白/100U A型肉毒杆菌毒素复合物用于稳定复合物。通常，可以添加以稳定根据本发明的组合物的外源稳定剂的量不受特别限定。在一些实施方案中，由于本发明的带正电荷的载体单独用作稳定剂的能力，添加的稳定剂的量可以小于常规添加的量。例如，添加的外源白蛋白的量可以是小于常规的千倍过量的外源白蛋白的任何量，并且在本发明的某些示例性的实施方案中，仅为约0.25、0.20、0.15、0.10、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.00001、0.000005、0.000001、或0.0000001 mg/100U肉毒杆菌毒素。在一个实施方案中，没有向本发明的组合物中添加外源白蛋白作为稳定剂。

根据本发明，如本文所述的，已经发现具有蛋白转导结构域或效能基团(efficiency group)的带正电荷的载体分子适合作为用于肉毒杆菌毒素的运输系统，其使得毒素能够以改善的渗透性被注射至目标结构，例如肌肉和/或其他皮肤相关结构。在没有共价修饰肉毒杆菌毒素的情况下进行运输。除增强肉毒杆菌毒素的渗透性之外，在某些优选实施方案中，本发明的带正电荷的载体还可以稳定肉毒杆菌毒素，防止降解。在此类实施方案中，可以减少或全部省略通常存在以稳定肉毒杆菌毒素的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白。类似地，通常在制备过程中添加的外源白蛋白也可以省略。

所使用的与术语“载体”相关的术语“带正电荷的”或“阳离子的”，指所述载体在至少一些溶液相条件下，更优选地在至少一些生理学相容性条件下具有正电荷。更具体地，本文使用的″带正电荷的″和“阳离子的”是指，所关注的基团包含在所有pH条件下带电荷的官能团(functionality)，例如季胺，或包含在某些溶液相条件下可以获得正电荷的官能团，例如在伯胺的情况下，pH变化。更优选地，如本文使用的，″带正电荷的″或“阳离子的”指在生理学相容性条件下，具有与阴离子结合的行为的基团。具有多个带正电荷的部分的聚合物不必是均聚物，这对本领域技术人员来说是显而易见的。带正电荷的部分的其他实例是现有技术中公知的并且可以容易地被使用，这对本领域技术人员来说是显而易见的。

通常，带正电荷的载体(也称为″带正电荷的主链″)一般是原子链，并且链中的基团在生理学pH下携带正电荷，或携带正电荷的基团连接至从所述主链延伸的侧链。在某些优选实施方案中，所述带正电荷的主链是阳离子肽。如本文使用的，术语″肽″指氨基酸序列，但不具有关于氨基酸序列内的氨基酸残基的数目的含义。因此，术语″肽″还可以包括多肽和蛋白。在某些优选实施方案中，带正电荷的主链本身不具有确定的酶促或治疗性生物学活性。在一些实施方案中，主链是直链烃主链，其在一些实施方案中被选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子中断。大部分主链原子通常是碳。另外，主链通常是重复单位的聚合物(例如氨基酸、聚(氧乙烯)、聚(丙烯胺)、聚烯化亚胺(polyalkyleneimine)等)，但也可以是杂聚物。在一组实施方案中，带正电荷的主链是聚丙烯胺(polypropyleneamine)，其中大量胺氮原子以携带正电荷的铵基基团(四取代的)存在。在另一个实施方案中，带正电荷的主链是非肽聚合物，其可以是杂聚物或均聚物，例如聚烯化亚胺，例如聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺，具有约10,000至约2,500,000，优选约100,000至约1,800,000，和最优选约500,000至约1,400,000的分子量。在另一组实施方案中，所述主链连接有多个侧链部分，所述侧链部分包括带正电荷的基团(例如铵基、吡啶基、磷鎓基、锍基、胍基或脒基)。在该组实施方案中，侧链部分可以沿主链间隔分布，其间隔是一致的或可变的。另外，侧链的长度可以是相同的或不同的。例如，在一组实施方案中，所述侧链可以是直链或支化烃链，其具有一个至二十个碳原子并且在远端(远离主链)以上述带正电荷的基团之一终止。带正电荷的载体和肉毒杆菌毒素、缩减的肉毒杆菌毒素复合物之间通过非共价相互作用结合，其非限定性实例包括离子相互作用、氢键结合、范德华力或其组合。

在一组实施方案中，带正电荷的主链是具有多个带正电荷的侧链基团(例如赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、高精氨酸等)的多肽。优选地，所述多肽具有约100至约1,500,000，更优选约500至约1,200,000，最优选约1000至约1,000,000的分子量。本领域技术人员能够理解，当氨基酸用于本发明的这部分时，所述侧链可以在连接中心具有D-型或L-型(R或S构型)。在某些优选实施方案中，所述多肽具有约500至约5000，更优选约1000至约4000，更优选2000至约3000的分子量。

可选地，主链可以包含氨基酸类似物和/或合成的氨基酸。主链还可以是多肽类似物，例如类肽。参见，例如，Kessler，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32：543(1993)；Zuckermann等人，Chemtracts-Macromol.Chem.4：80(1992)；和Simon等人，Proc.Nat′1.Acad.Sci.USA 89：9367(1992)。简言之，类肽是其中侧链连接至主链氮原子而非α-碳原子的聚甘氨酸。如上所述，一部分侧链一般以带正电荷的基团终止，以提供带正电荷的主链成分。在例如美国专利5,877,278中描述了类肽的合成，其通过引用完整并入本文。如该术语在本文中使用的，具有类肽主链结构的带正电荷的主链被认为是″非肽″，因为它们不由具有天然存在于α-碳位置的侧链的氨基酸组成。

可以使用多种其他主链，例如，多肽的空间或电子模拟物，其中肽的酰胺键被替代物所取代，例如酯键、硫代酰胺(--CSNH--)，反向硫代酰胺(--NHCS--)、氨基亚甲基(--NHCH₂--)或反向的亚甲基氨基(--CH₂NH--)基团、酮-亚甲基(--COCH₂--)基团、亚膦酸酯(--PO₂RCH₂--)、烷基磷酰胺和烷基磷酰胺酯(--PO₂RNH--)、反向肽(--NHCO--)、反式烯烃(--CR＝CH--)、氟代烯烃(--CF＝CH--)、二亚甲基(--CH₂CH₂--)、硫醚(--CH₂S--)、羟基亚乙基(--CH(OH)CH₂--)、亚甲基氧(--CH₂O--)、四唑(CN₄)、亚磺酰氨基(--SO₂NH--)、亚甲基亚磺酰氨基(--CHRSO₂NH--)、反向亚磺酰氨基(--NHSO₂--)，和具有丙二酸酯和/或偕二氨基烷基亚单位的主链，例如，如Fletcher等人((1998)Chem.Rev.98：763)所论述的和其中引用的文献所描述的。许多在先的取代导致相对于由α氨基酸形成的主链大致等电子排列的(isosteric)聚合物主链。

在上文提供的各个主链中，可以连接侧链基团，所述侧链基团携带带正电荷的基团。例如亚磺酰氨基连接的主链(--SO₂NH--和--NHSO₂--)可以具有连接至氮原子的侧链基团。类似地，羟基亚乙基(--CH(OH)CH₂--)连接可以具有连接至羟基取代基的侧链基团。本领域技术人员可以容易地使用标准合成法，采用其他化学连接以提供带正电荷的侧链基团。

在一个实施方案中，带正电荷的主链是具有蛋白转导结构域(也称为效能基团)的多肽。如本文使用的，″效能基团(efficiency group)″是具有促进带正电荷的主链转移通过组织或细胞膜的效果的任何试剂。蛋白转导结构域或效能基团的非限制性实例包括-(gly)_n1-(arg)_n2、HIV-TAT或其片段、或触角足蛋白(Antennapedia)的蛋白转导结构域、或其片段，其中下标n1是0至20，更优选0至8，更优选2至5的整数，并且下标n2单独地为约5至约25，更优选约7至约17，最优选约7至约13的奇整数。在一些实施方案中，HIV-TAT片段不包含HIV-TAT分子的富含半胱氨酸的区域，以最小化与二硫化物聚集相关的问题。进一步优选的是这样的实施方案，其中HIV-TAT片段具有下式(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q、(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q或(gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数并且所述片段经由片段的C末端或N末端连接至主链。在某些优选的实施方案中，p为1且q为0或p为0且q为1。优选的HIV-TAT片段是这样的片段，其中下标p和q各自独立地为0至8，更优选0至5的整数。在另一个优选实施方案中，带正电荷的侧链或分支基团是触角足蛋白(Antp)蛋白转导结构域(PTD)，或其保留活性的片段。这些在本领域是已知的，例如参见Console等人，J.Biol.Chem.278：35109(2003)，且本发明涉及的Antp PTD的非限制性实例为SGRQIKIWFQNRRMKWKKC。

优选，带正电荷的载体包括至少约0.01％(总载体重量的百分比)，优选约0.01至约50重量％，更优选约0.05至约45重量％，和最优选约0.1至约30重量％的量的侧链带正电荷的蛋白转导结构域。对于具有式-(gly)_n1-(arg)_n2的带正电荷的蛋白转导结构域，优选的范围为约0.1至约25％。

在另一个实施方案中，主链部分是聚赖氨酸并且带正电荷的蛋白转导结构域连接至赖氨酸侧链氨基或连接至C-或N-末端。在一些优选实施方案中，聚赖氨酸可以具有至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500或6000D，且小于约2,000,000、1,000,000、500,000、250,000、100,000、75,000、50,000和25,000D的分子量。在100至2,000,000D的范围内，预期较低和/或较高的范围可以分别地以100增加或减少，各个所得的子范围是本发明明确涉及的实施方案。在一些示例性的实施方案中，聚赖氨酸具有约1,000至约1,500,000D，约2,000至约800,000D，或约3,000至约200,000D的分子量。在其他示例性的实施方案中，聚赖氨酸具有约100至约10,000D，约500至约5,000D，约1,000至约4,000D，约1,500至约3,500D或约2,000至约3,000D的分子量。在一些实施方案中，本发明涉及的聚赖氨酸可以是任何市售可得的(Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.，USA)聚赖氨酸，诸如例如MW＞70,000的聚赖氨酸，具有70,000至150,000MW的聚赖氨酸，具有150,000至300,000MW的聚赖氨酸和MW＞300,000的聚赖氨酸。合适的聚赖氨酸的选择取决于组合物的其他组分，并且将足以提供总的净正电荷给所述组合物，并提供优选一至四倍于带负电荷的组分的组合长度的长度。优选的带正电荷的蛋白转导结构域或效能基团包括，例如，-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly₃Arg₇)或HIV-TAT。

在另一个优选实施方案中，带正电荷的主链是聚烯化亚胺，其非限制性实例包括聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺和聚丁烯亚胺。在某些优选实施方案中，聚烯化亚胺具有至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500或6000D，且小于约2,000,000、1,000,000、500,000、250,000、100,000、75,000、50,000和25,000D的分子量。在100至2,000,000D的范围内，预期较低和/或较高的范围可以分别地以100增加或减少，各个所得的子范围是本发明明确涉及的实施方案。

在本发明的其他实施方案中，载体是相对短的聚赖氨酸或聚乙烯亚胺(PEI)主链(其可以是线性的或分支的)并且其具有带正电荷的分支基团。不希望被理论约束，据信，此类载体可用于最小化主链和治疗组合物中的肉毒杆菌毒素的不受控制的聚集，所述聚集导致运输效率显著降低。当载体是相对短的线性聚赖氨酸或PEI主链时，所述主链具有小于75,000 D，更优选小于30,000 D，和最优选小于25,000 D的分子量。然而当载体是相对短的分支的聚赖氨酸或PEI主链时，所述主链具有小于60,000 D，更优选小于55,000 D，和最优选小于50,000 D的分子量。

在一个特别有趣的实施方案中，非天然分子是阳离子肽，其没有固有的肉毒杆菌毒素样活性，并且还包含一个或多个蛋白转导结构域，如本文描述的。不希望被任何特定科学理论束缚，据信所述肽在注射后增强复合物中结合的分子的组织渗透性，同时增强皮肤中和体外的肉毒杆菌毒素的稳定性。据信，由这些肽赋予的增强的组织渗透性特别地提供了减少的抗原性，更好的安全特征，增强的效力，临床功效的更快开始或更长的临床功效持续时间，与常规的市售可得的与外源白蛋白结合的肉毒杆菌毒素复合物(例如

或)相比。

在优选实施方案中，本发明的组合物中带正电荷的载体的浓度足以增强肉毒杆菌毒素至分子靶，诸如例如运动神经板的递送。此外，不希望被理论束缚，据信渗透速率遵循受体介导的动力学，从而组织渗透性随着渗透增强分子的量的增加而增加，直至饱和点，之后运输速率变成常数。因此，在优选实施方案中，添加的渗透增强分子的量等于正好饱和前最大化渗透速率的量。如本文所述的，本发明的可注射的组合物中带正电荷的载体的有用的浓度范围为约0.1pg至约1.0mg/单位肉毒杆菌毒素组合物。更优选，本发明的局部组合物中带正电荷的载体以约1.0pg至0.5mg/单位肉毒杆菌毒素存在。

本发明的组合物优选为允许注射入受试者或患者(即，需要具体治疗的人或其他哺乳动物)的皮肤或上皮的形式。术语″需要″意欲包括药学或健康相关需要(例如治疗病状，包括不希望的面部肌肉痉挛)，及美容和主观需要(例如改变或改进面部组织的外观)。在优选实施方案中，通过将肉毒杆菌毒素(包含相关非毒素蛋白或减少的相关非毒素蛋白)和带正电荷的载体混合来制备组合物，并且通常混合一种或多种另外的药学上可接受的载体或者赋形剂。在它们的最简单的形式中，它们可以包含水性的药学上可接受的稀释剂，诸如缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲的盐水)。然而，组合物可以包含通常在可注射的药物或药妆组合物中发现的其他成分，包括皮肤病学或药学上可接受的载体、媒介物或介质，其与将要施用的组织相容。如本文使用的，术语″皮肤病学或药学上可接受的″指，所述的组合物或其组分适合用于与这些组织接触或适合用于患者，而通常不具有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、变应性应答等等。需要时，本发明的组合物可以包含通常用于所涉及的领域，特别地用于化妆品和皮肤病学中的任何成分。

根据它们的形式，本发明的组合物可以包括溶液、乳剂(包括微乳剂)、悬浮液、凝胶、粉末或其他的一般的固体或液体组合物，其用于注射至所述组合物可以使用的肌肉及其他组织。在优选实施方案中，本发明的组合物存在于适用于注射器注射的低粘度、无菌的制剂中。本发明的组合物可以是冻干粉末形式，其在注射前用药学上可接受的液体稀释剂重构。在某些实施方案中，用液体稀释剂重构冻干粉末以形成可注射的制剂，该制剂具有约0.1至约2000cP，更优选约0.2至约500cP，更优选约0.3至约50cP，更优选约0.4至约2.0cP的粘度。本发明的组合物除肉毒杆菌毒素和带正电荷的载体之外，还可以包含通常用于此类产品的其他成分，诸如抗微生物剂、水化剂、组织膨胀剂(tissuebulking agent)或组织填充剂、防腐剂、乳化剂、天然或合成的油、溶剂、表面活性剂、清洁剂、胶凝剂、抗氧化剂、填充剂、增稠剂、粉末、粘度控制剂和水，并且任选地包括麻醉剂、抗痒活性剂、植物提取物、调理剂、矿物质、多酚、硅酮或其衍生物、维生素和植物药(phytomedicinals)。

本发明的可注射的组合物可以为控释或缓释组合物的形式，其包含被封装或否则包含在材料内的肉毒杆菌毒素和带正电荷的载体，以便它们以受控的方式随时间在组织内释放。包含肉毒杆菌毒素和带正电荷的载体的组合物可以包含在基质、脂质体、囊、微胶囊、微球体等内，或在固体颗粒材料内，其都被选择和/或构建以使肉毒杆菌毒素随时间释放。肉毒杆菌毒素和带正电荷的载体可以一起被封装(即在相同的胶囊中)或分别封装(即在分开的胶囊中)。

本发明的肉毒杆菌毒素制剂可以以产生麻痹、产生松弛、减轻收缩、防止或减轻痉挛、减少腺的排出量(glandular output)、或产生其他期望效果的有效量，通过注射(一般使用注射器)递送至皮肤下的肌肉，或递送至皮肤内的腺结构。用这样的方式局部递送肉毒杆菌毒素可以减少剂量、减少毒性并且允许针对期望的效果进行更精确的剂量优化(与可注射的或可植入的材料相比)。

施用本发明的组合物以递送有效量的肉毒杆菌毒素。如本文使用的，术语″有效量″指上文定义的肉毒杆菌毒素的量，其足以产生期望的肌肉麻痹或其他生物学或美容效果，并且明确地是安全量，即低至足以避免严重的副作用的量。期望的效果包括某些肌肉的松弛，其目的例如在于减少细纹和/或皱纹的出现(特别是在面部)，或以其他方式调整面部外观，例如扩大眼睛、提升嘴角、或使从上唇散开的细纹变平滑，或肌肉紧张的一般缓解。上述的最后一种效果，肌肉紧张的一般缓解可以在面部或其他部位实现。本发明的组合物可以包含合适的有效量的肉毒杆菌毒素，用于以单剂量治疗形式施用，或可以是更浓缩的，用于在施用时稀释或用于多次施用。通过使用本发明的带正电荷的载体，可以通过注射至受试者来施用肉毒杆菌毒素，从而治疗病状，例如皱纹、不希望的面部肌肉或其他肌肉痉挛、多汗症、痤疮或其中期望缓解肌肉酸痛或痉挛的体内其他部位的病状。通过注射至肌肉或注射至其他皮肤相关结构或其他靶组织结构，施用肉毒杆菌毒素。可以施用至例如，腿部、肩部、背部(包括腰部)、腋窝、手掌、足部、颈部、面部、腹股沟、手或足的背部、肘部、上臂、膝盖、大腿、臀部、躯干、骨盆或期望对其施用肉毒杆菌毒素的身体的任何其他部位。

还可施用本发明的包含肉毒杆菌毒素的可注射的组合物以治疗其他病状，包括对于其而言阻止乙酰胆碱的突触传递或释放可以带来治疗益处的任何病状。例如，可以通过本发明的组合物治疗的病状包括但不限于，神经性疼痛、偏头痛或其他头痛、膀胱过度活动症、鼻炎、鼻窦炎、痤疮、张力障碍、张力障碍收缩(不论主观的或临床的)、多汗症(不论主观的或临床的)、和通过胆碱能神经系统控制的一种或多种腺分泌过多。本发明的组合物还可用于减少或增强免疫应答，或治疗对于其而言已经提出或进行注射施用肉毒杆菌毒素的其他病状。

最优选，由医师或其他保健专业人员或在其指导下施用所述组合物。可以在单次治疗中施用或在一段时间内在系列治疗中施用它们。在优选实施方案中，在期望获得与肉毒杆菌毒素相关的效果的部位注射本发明的组合物。因为它的性质，优选以产生期望的结果而不产生任何不利的或不希望的结果的量、施用速率和频率施用肉毒杆菌毒素。例如，在某些实施方案中，以约1U至约20,000U，优选约1U至约10,000U肉毒杆菌毒素/平方厘米皮肤表面的比率施用本发明的组合物。可以使用这些范围内的较高剂量，例如在将肉毒杆菌毒素和控释材料一起施用的情况下，如本文描述的。在某些实施方案中，施用本发明的肉毒杆菌毒素制剂以提供1至400U，更优选10至350U，更优选30至250U和最优选50至200U的肉毒杆菌毒素/注射。

本发明还涉及各种递送装置用于注射本文所述的包含肉毒杆菌毒素的组合物通过皮肤的用途。所述装置可以包括但不限于，针和注射器，或可以包括能够分配所述组合物和监控所述组合物的分配，和任选地在一个或多个方面监控受试者的状况(例如监控受试者对分配的物质的反应)的更先进的装置。

在一些实施方案中，可以预配制和/或在此类递送装置中预装配组合物。本发明还涉及这样的实施方案，其中在试剂盒中提供组合物，所述试剂盒储存一种或多种与其他组分分开的组分。例如，在某些实施方案中，本发明提供试剂盒，所述试剂盒分开储存肉毒杆菌毒素和带正电荷的载体，它们在施用时或施用前组合。带正电荷的载体的量或这些分子对肉毒杆菌毒素的浓度比取决于选择用于所讨论的组合物的载体。在给定的情况下，可以容易地确定载体分子的合适的量或比率，例如通过进行一种或多种如下所述的实验。

通常，本发明还涉及用于将肉毒杆菌毒素(可选地，肉毒杆菌毒素复合物或缩减的肉毒杆菌毒素复合物)施用至有此需要的受试者或患者的方法，其中有效量的肉毒杆菌毒素与带正电荷的载体一起施用，如本文所述的。″与......一起″指，两个组分(肉毒杆菌毒素和带正电荷的载体)在组合过程中施用，其可以包括在施用至受试者前组合它们，或分开地施用它们，但以使得它们共同起作用以提供有效量的治疗蛋白的必要递送的方式进行施用。例如，可以首先施用包含带正电荷的载体的组合物至受试者的皮肤，然后应用包含肉毒杆菌毒素的皮肤贴剂、注射器或其他装置。肉毒杆菌毒素可以以干燥形式储存于注射器或其他分配装置中，并且可以在施用毒素前，注射带正电荷的载体，以便两者共同起作用，产生期望的组织渗透增强。因此，在该情况下，两种物质(带正电荷的载体和肉毒杆菌毒素)组合地起作用或可能地相互作用，形成原位的组合物或组合。因此，本发明还包括试剂盒，其具有用于分配肉毒杆菌毒素的装置和包含带正电荷的载体的液体、凝胶等，而且其适于注射至受试者的皮肤或靶组织。用于在卫生保健专业人员指导下或由患者或受试者施用本发明的组合物的试剂盒，还可以包括适用于该目的的常规的施用器。

本发明的组合物适于在具有约4.5至约6.3的pH的生理环境中使用，并且因此可以具有所述pH。本发明的组合物可以在室温下或在制冷条件下储存。

应理解，本文描述的下列实施例和实施方案仅用于举例目的，并且其各种修饰或改变对本领域技术人员来说是显然的，并且包括在本申请的精神和范围内和在附加的权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用完整并入本文，用于所有目的。

实施例1

小鼠模型中局部肌肉麻痹的持续时间

本实施例比较用RT003或注射的小鼠中局部肌肉麻痹的持续时间。RT003是本发明的示例性的可注射的制剂，其包含A型肉毒杆菌毒素(经纯化以除去所有内源性非毒素蛋白)和具有序列RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR的带正电荷的载体。

也包含A型肉毒杆菌毒素，但是添加外源白蛋白以稳定A型肉毒杆菌毒素分子。

使用趾外展评分(DAS)分析测量肌肉麻痹，如Aoki，K.R.在″Acomparison of the safety margins of botulinum neurotoxinserotypes A，B和F in mice″，Toxicon 2001；39(12)：1815-1820中报道的。在DAS分析中，通过其尾部简单地悬吊小鼠，以引起特征性震惊反应，其中小鼠伸展其后肢并且外展它的后趾。以五分制(从0-4)对小鼠能够表现震惊反应的程度进行评分，0表示正常震惊反应而4表示趾外展和腿伸长的最大减少。由观察者进行评分，所述观察者不知道受试小鼠用神经毒素处理的程度。使用DAS分析的基线评分针对未经处理的动物群体确定为0.4。

该实施例中报告的研究包括10只动物(RT003组的5只小鼠和

组的5只小鼠)。用分别的肉毒杆菌毒素制剂(即RT003或)注射每只动物三次，每次给药之间间隔40天。注射后，计数每个实验组中的所有动物都在DAS分析的0.4基线以上的天数。图1中所示的结果表明，在第一、第二和第三次处理后，RT003处理组的DAS分析评分保持在0.4基线值以上的天数分别为25、22和21天。相反，在第一、第二和第三次处理后，

处理组的DAS分析评分保持在0.4基线值以上的天数分别为11、8和11天。

DAS分析的数据表明，由RT003制剂引起的局部肌肉麻痹持续大约由

引起的局部肌肉麻痹的两倍长。该结果对于RT003及本发明的其他可注射的包含肉毒杆菌毒素的化合物的治疗用途具有重要的意义。特别地，通过使用本发明的可注射的组合物，可以显著地减少保持由肉毒杆菌毒素引起的具体美容或治疗效果所需要的随后注射的频率。进一步，减少的施用频率可以导致更好的长期功效，因为受试者较不易于产生抗肉毒杆菌毒素的抗体。

实施例2

具有改善的安全特征的可注射的肉毒杆菌毒素制剂

在近几十年来，肉毒杆菌毒素已经用作治疗多种病状(包括皱纹、多汗症和肌肉痉挛)的治疗剂。然而，因为肉毒杆菌毒素是人类已知的最有效的天然存在的毒素，因此不适当的施用该毒素可能非常危险。例如，意外地全身递送肉毒杆菌毒素可以导致麻痹、呼吸困难、甚至死亡。此外，即使作为治疗的一部分，将肉毒杆菌毒素适当地递送至身体的局部区域，该毒素具有天然的随时间扩散的趋势，从而增加身体其他部位中不想要的麻痹的风险。例如，当将肉毒杆菌毒素注射至眼睛周围以治疗皱纹时，它可能扩散至控制眼睑运动的肌肉。如果发生该情况，那么眼睑肌肉可能变得部分麻痹，导致公知的被称为″眼睑下垂″的病状，其中眼睑部分地闭合并且干扰正常视觉。

本发明的一方面是提供可注射的肉毒杆菌毒素制剂，其与目前市售可得的肉毒杆菌毒素制剂相比具有改善的安全特征。在优选实施方案中，可注射的肉毒杆菌毒素制剂具有减少的注射后扩散倾向。因此，本发明的某些优选的制剂允许更精确地递送肉毒杆菌毒素，显著地减少不想要的与肉毒杆菌毒素的不受控制的局部扩散相关的副作用。

本实施例报道了注射后各种制剂中的肉毒杆菌毒素的扩散倾向的对比研究。该研究包括三种肉毒杆菌毒素制剂：(1)(2)RT003，包含与具有式RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR的带正电荷的载体非共价结合的150kD A型肉毒杆菌毒素分子的经缓冲和稳定的溶液；和(3)RTT150，除了不包含存在于RT003中的带正电荷的载体外，其与RT003制剂相同。

在肌肉的中线旁侧部分(图2A)或在肌肉的中线部分(图2B)，用上述的肉毒杆菌毒素制剂之一注射该研究中使用的每只小鼠的腓肠肌肌肉。注射肉毒杆菌毒素后，对每只小鼠进行4天的DAS分析，以确定各个制剂的肉毒杆菌毒素是否表现出从腓肠肌肌肉向小鼠的后爪扩散的任何倾向。根据DAS分析，将测试动物外展其后趾的能力的任何降低解释为表示肉毒杆菌毒素扩散。

图3显示了用如上所述的不同的肉毒杆菌毒素制剂注射测试动物后进行的DAS分析的结果。注意，将趾外展评分分为两组，对应于注射是在腓肠肌肌肉的中线部分还是在中线旁侧部分。与中线旁侧注射的DAS评分相比，中线注射的通常较低的DAS评分表明，中线注射后测试动物的后爪的麻痹程度通常较轻。不希望被理论束缚，据信，该结果是由于与中线旁侧注射相比，中线注射后肉毒杆菌毒素必须经过较长的距离才能到达测试动物的后趾。据认为，运送肉毒杆菌毒素所需要的更长的距离降低了后趾麻痹的可能性。

图3表示，在RT003制剂的中线注射后4天，趾外展评分全部都为零。该结果表明，RT003制剂中的肉毒杆菌毒素在注射后保持停留在腓肠肌肌肉的中线部分中，并且在实验的时间段中没有发生引起麻痹的扩散。相反，在注射RTT150和

制剂后，观察到0.4DAS基线以上的趾外展评分，并且制剂的平均DAS评分更高。RTT150和

制剂的DAS结果表明，在中线注射这些制剂后，观察到了测试动物的后趾麻痹，并且在注射

制剂后观察到的麻痹程度更高。这些数据表明，RTT150和

制剂中的肉毒杆菌毒素分子在注射后能够局部扩散，并且制剂中的肉毒杆菌毒素分子的局部扩散程度更高。

图3还表明，在中线旁侧注射后在所有测试动物中都观察到了后趾麻痹，与具体的肉毒杆菌毒素制剂无关。如上所述，与中线注射相比，中线旁侧注射后更高的麻痹程度被认为与肉毒杆菌毒素至测试动物后爪的较短的运输距离有关。然而，虽然中线旁侧注射后，所有三种肉毒杆菌毒素制剂都表现出引起麻痹的扩散，但平均来看，在实验的时间段内与对于RTT150和

制剂所观察到的麻痹程度相比，注射了RT003的测试动物中的麻痹程度较轻。因此，对应于中线旁侧注射的DAS分析数据定性地与中线注射的数据类似，其显示与RTT150和相比，RT003制剂的肉毒杆菌毒素的局部扩散倾向降低。

可以通过考虑称为″扩散指数″的参数来进行中线注射和中线旁侧注射后的局部扩散速率的比较，所述扩散指数由下式(1)定义：

因为趾外展评分可以为0至4，并且预期中线旁侧的趾外展评分比中线的趾外展评分高(如上文所述的)，扩散指数值一般为0至100。接近100的扩散指数值表明，中线和中线旁侧的趾外展评分的比接近一致。如果注射后扩散速率足够高，使得中线和中线旁侧注射后，肉毒杆菌毒素到达测试动物的后趾并且使其麻痹的扩散时间相当或者几乎相同，则可发生上述情况。在另一个极端的情况中，接近零的扩散指数值表明，中线和中线旁侧的趾外展评分的比接近零。如果中线注射后肉毒杆菌毒素的扩散太低以致不足以引起测试动物的后趾麻痹(即使中线旁侧注射后观察到了麻痹)，则可发生上述情况。

表1显示了使用中线或中线旁侧注射

RT003和RTT150后的趾外展评分计算的扩散指数值，如对应于图3的实验所报道的。在实验的时间段内，对应于

制剂注射的扩散指数值比对于RTT150和RT003制剂所观察到的值更高。这表明，与对于RTT150和RT003制剂所观察到的比率相比，对于注射

制剂，中线和中线旁侧的趾外展评分的比率更接近一致。因为中线注射后肉毒杆菌毒素必须扩散更远以引起测试动物的后趾麻痹，

注射后中线和中线旁侧的趾外展评分的比值更接近一致的观察结果表明，相对于中线旁侧注射后的速率，中线注射

后的肉毒杆菌毒素扩散速率相当显著。换言之，与中线注射相关的增加的扩散途径长度对引起后趾麻痹阻碍较少。

相反，在4天的实验时间段内，RT003的扩散指数值全部为零。该结果表明，在中线注射RT003后，没有观察到引起麻痹的扩散。换言之，包含与带正电荷的载体非共价结合的A型肉毒杆菌毒素分子的RT003制剂允许增强注射的A型肉毒杆菌毒素的局部定位。由此可见，RT003制剂赋予与

制剂相比改善的安全特征并且最小化不想要的麻痹。

观察到的RTT150的扩散指数值，虽然不像RT003那样为零，但仍然比对于制剂所观察到的值小[参见表1]。该结果表明，在4天的实验时间段内，发生了足以产生可观察的后趾麻痹的肉毒杆菌毒素扩散，但是在中线注射后肉毒杆菌毒素的引起麻痹的扩散所需的时间相对更长。

表1：RTT150、和RT003的肉毒杆菌毒素扩散指数的测量。

实施例3

具有减少的产生抗体的倾向的可注射的肉毒杆菌毒素制剂

当肉毒杆菌毒素周期性地注射到患者中以治疗不希望的病状(例如皱纹)时，经常观察到肉毒杆菌毒素的功效随着连续注射而降低，即使肉毒杆菌毒素的效果的持续时间仍然保持相同。该现象被认为是患者的免疫系统形成抗肉毒杆菌毒素的抗体的结果。从治疗的角度来看，患者形成抗肉毒杆菌毒素的抗体是不希望的，因为之后需要逐渐增加的更大剂量的肉毒杆菌毒素来实现相同的效果，这导致与安全和费用相关的严重的问题。

在某些实施方案中，本发明提供可注射的肉毒杆菌毒素制剂，其与目前市售可得的可注射的肉毒杆菌毒素制剂相比，具有降低的诱导抗体形成的倾向。因此，在这些实施方案中，肉毒杆菌毒素制剂通过允许在一段时间内使用较少的毒素来实现相同的效果，而有助于最小化与肉毒杆菌毒素注射相关的风险。

在本实施例中，将在重复注射RT003和

后获得的DAS分析数据(如实施例2所述)作为时间的函数进行分析，以确定在重复施用至相同的测试动物时，这两种制剂的功效的改变。通常，在重复施用各个制剂后，与肉毒杆菌毒素相关的效果的持续时间是相同的。然而，重复施用后肌肉麻痹的程度取决于制剂而不同。为了定量肌肉麻痹的程度的变化，根据式(2)确定注射RT003或

后趾外展评分的百分比变化：

因为式(2)的分子是测量的第n次处理与第一次处理的趾外展评分的差，如果测量的第n次处理的趾外展评分小于测量的第一次处理的趾外展评分，则DAS的变化％将为负值。换言之，当与第一次处理相比，在第n次处理后观察到较轻的麻痹时，DAS的变化％是负值。表2表示根据实施例2中所述的方法，在重复施用RT003和

制剂后，测量的DAS值的变化％。

表2：重复施用RT003和

后DAS值的变化％

如表2中所示，在第一次再处理后，

制剂的趾外展评分的变化％为-44％，这表明功效显著下降。相反，RT003制剂的趾外展评分的变化％为零，这表明第二次再处理后的DAS评分与初次施用和第一次再处理后的相同。该结果表明，RT003的第一次再处理后观察到的麻痹程度与第一次处理后的麻痹程度相同，并且甚至在第一次再处理后，测试动物中出现了可忽略不计的中和抗体的形成。在RT003和

的第二次再处理后，两种制剂的DAS值的计算的变化％都是负值，虽然RT003制剂的DAS值的变化％的幅度是

的值的一半。对于

观察到的DAS值的变化％更大且为负值，表明与RT003相比，测试动物对

具有更高的抗体产生速率。因此，这些数据表明，本发明涉及的制剂，例如RT003，可具有较低的诱导抗体形成的倾向，所述抗体中和肉毒杆菌毒素的效果。因此，该结果表明，通过使用本发明涉及的制剂，可以在一段时间内使用较少的肉毒杆菌毒素来实现相同的治疗效果。

实施例4

具有改善的稳定性的可注射的肉毒杆菌毒素制剂

本实施例证明，用于本发明的可注射的肉毒杆菌毒素制剂中的带正电荷的载体分子不仅增强制剂的安全性(实施例2)，而且改善它们的稳定性。表3显示了老化实验的结果，其中RT003和RTT150制剂在4℃(仅RT003)和在40℃(RT003和RTT150)老化，进行各种时间间隔。在指定的温度下老化指定的时间后，经由一系列小鼠IP LD50分析，测量RT003和RTT150制剂的效力。结果概括在表3中，其表明RT003的效力在4℃下老化后(甚至在6个月后)基本上无变化。此外，即使RT003制剂在升高的温度(40℃)下老化了6个月，RT003制剂的效力(如在小鼠IP LD50分析中通过所述制剂杀死目标动物的能力所测量的)仅轻微地降低。相比之下，在40℃下老化仅一个月后，RTT150制剂表现出显著的效力下降。因为除了RT003制剂还包含具有式RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR的带正电荷的载体分子外，RT003和RTT150制剂相同，所以这些数据表明，带正电荷的载体分子改善了RT003制剂中的肉毒杆菌毒素的稳定性。

表3：RT003和RTT150在各种条件下老化后小鼠IP LD50分析的结果

Claims

1.给有此需要的个体施用肉毒杆菌毒素以实现治疗或美容效果的方法，所述方法包括

给个体注射有效量的组合物以实现治疗或美容效果，

其中所述组合物包含

带正电荷的载体，其包含带正电荷的主链，所述主链具有与其连接的多个效能基团，

肉毒杆菌毒素复合物，缩减的肉毒杆菌毒素复合物，或肉毒杆菌毒素，并且

其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素复合物、缩减的肉毒杆菌毒素复合物或肉毒杆菌毒素非共价结合。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肉毒杆菌毒素复合物、缩减的肉毒杆菌毒素复合物或肉毒杆菌毒素获自肉毒杆菌血清型A、B、C、D、E、F或G。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述带正电荷的主链包含聚氨基酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述聚氨基酸选自聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸和聚鸟氨酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述效能基团包含选自下列的氨基酸序列：(gly)_n1-(arg)_n2，HIV-TAT或其片段，触角足蛋白的蛋白转导结构域或其片段，(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q，(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q，或(gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q和SGRQIKIWFQNRRMKWKKC；

其中下标n1是0至20的整数，下标n2独立地是约5至约25，更优选约7至约17，最优选约7至约13的奇整数；和

其中下标p和q各自独立地是0至8的整数。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述带正电荷的载体稳定肉毒杆菌毒素，防止降解。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述带正电荷的载体减少注射后肉毒杆菌毒素的局部扩散。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物在注射入受试者的身体后，与

相比，具有减少的诱导抗体产生的倾向。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述美容效果是治疗皱纹。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗效果是减少与选自下列的病症相关的症状：偏侧面肌痉挛、成年人发病的痉挛性斜颈、肛裂、眼睑痉挛、大脑性瘫痪、头痛、斜视、颞下颌关节障碍、神经性疼痛、膀胱过度活动症、鼻炎、鼻窦炎、痤疮、张力障碍、张力障碍收缩、多汗症和通过胆碱能神经系统控制的腺分泌过多。

12.制备可注射的肉毒杆菌毒素制剂的方法，所述方法包括

提供有效量的肉毒杆菌毒素复合物、缩减的肉毒杆菌毒素复合物或肉毒杆菌毒素；

提供带正电荷的载体，其包含带正电荷的主链，所述主链具有与其连接的多个效能基团；

将所述肉毒杆菌毒素复合物、缩减的肉毒杆菌毒素复合物或肉毒杆菌毒素与所述带正电荷的载体和药学上可接受的稀释剂组合。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述肉毒杆菌毒素复合物、缩减的肉毒杆菌毒素复合物或肉毒杆菌毒素获自肉毒杆菌血清型A、B、C、D、E、F或G。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述带正电荷的主链包含聚氨基酸。

15.根据权利要求11所述的方法，其中所述聚氨基酸选自聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸和聚鸟氨酸。

16.根据权利要求9所述的方法，其中所述效能基团是选自下列的氨基酸序列：(gly)_n1-(arg)_n2，HIV-TAT或其片段，触角足蛋白的蛋白转导结构域或其片段，(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q，(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q，或(gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q和SGRQIKIWFQNRRMKWKKC；

其中下标p和q各自独立地是0至8的整数。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述带正电荷的载体稳定肉毒杆菌毒素，防止降解。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述带正电荷的载体减少注射后肉毒杆菌毒素的局部扩散。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述制剂在注射入受试者的身体后，与

相比，具有减少的诱导抗体产生的倾向。

21.无菌的可注射的组合物，其包含

有效量的肉毒杆菌毒素复合物、缩减的肉毒杆菌毒素复合物或肉毒杆菌毒素；和

带正电荷的载体，其包含带正电荷的主链，所述主链具有与其连接的多个效能基团；

其中所述肉毒杆菌毒素复合物、缩减的肉毒杆菌毒素复合物或肉毒杆菌毒素与所述带正电荷的载体非共价结合。

22.注射器，其包含

23.重构的肉毒杆菌毒素组合物，其包含

带正电荷的载体，其包含带正电荷的主链，所述主链具有与其连接的多个效能基团；和

药学上可接受的水性液体稀释剂，

其中所述肉毒杆菌毒素复合物、缩减的肉毒杆菌毒素复合物或肉毒杆菌毒素与所述带正电荷的载体非共价结合，

并且其中所述重构的肉毒杆菌毒素组合物具有约0.4至约2.0cP的粘度。