CN109069608A

CN109069608A - 具有长的治疗或美容效应持续时间的可注射肉毒杆菌毒素制剂以及其使用方法

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Publication number: CN109069608A
Application number: CN201680072956.XA
Authority: CN
Inventors: C·L·鲁格; J·M·沃
Original assignee: Essentia Biosystems Inc
Current assignee: Revance Therapeuticals Inc
Priority date: 2015-10-29
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2018-12-21
Also published as: MX2018005256A; EP3368071B1; BR112018008684A2; RU2018119765A3; RU2018119765A; AU2016343748A1; IL286472A; EP3368071A1; US20220062400A1; CA3003447A1; KR20180077202A; SG11201803566TA; SG10202004337WA; JP2018531984A; US20180311333A1; CO2018005361A2; IL259016A; DK3368071T3; JP2022008814A; WO2017075468A1

Abstract

本发明提供了包含肉毒杆菌毒素的新型可注射组合物，其可以被施用给受试者以为了各种治疗、美学和/或美容目的。由本发明所包括的可注射组合物展示出一个或多个超过传统肉毒杆菌毒素制剂的优点，包括降低的抗原性、降低的在注射后经历不想要的局部扩散的倾向、相对而言的增加的临床功效持续时间或增强的效能、更快的临床功效起始和/或经改善的稳定性。根据本发明，通过注射的所述组合物的单次处理在经受处理的受试者中提供显著的临床应答和至少6个月的效应持续时间，如由所描述的处理方法所提供的。

Description

具有长的治疗或美容效应持续时间的可注射肉毒杆菌毒素制剂以及其使用方法

发明领域

本发明涉及包含肉毒杆菌毒素的新型可注射组合物，其可以被施用给受试者以为了各种治疗、美学和/或美容目的。所述可注射组合物和其中使用这些组合物的方法提供了有利的处理，其导致高的应答率和长的效应持续时间，例如20至24周和更长的效应持续时间。

发明背景

皮肤保护身体的器官免于外部环境威胁并且充当恒温器以维持体温。它由数个不同的层组成，每层具有专门的功能。主要的层包括表皮、真皮和皮下组织。表皮为分层性上皮细胞层，其覆盖在由结缔组织组成的真皮上面。表皮和真皮都由皮下组织(内部的脂肪组织层)来进一步支持。

表皮(皮肤的最上层)仅为0.1至1.5毫米厚(Inlander,Skin,New York,N.Y.:People's Medical Society,1-7(1998))。它由角质形成细胞组成，并且被分为数个层(基于其分化状态)。表皮可以进一步被分类为角质层和活表皮，其由颗粒马尔皮基氏细胞和基细胞组成。角质层是吸湿性的，并且需要至少10重量％的湿气以保持其柔韧性和柔软性。该吸湿性部分地可归因于角蛋白的保水能力。当角质层失去其柔软性和柔韧性时，它就变得粗糙和易碎，从而导致干燥的皮肤。

真皮(其位于表皮正下方)为1.5至4毫米厚。它是皮肤的三个层中最厚的。大多数皮肤结构，包括汗腺和脂腺(其通过被称为毛孔或粉刺的在皮肤中的开口来分泌物质)、毛囊、神经末梢以及血管和淋巴管，均存在于真皮中(Inlander,Skin,New York,N.Y.:People's Medical Society,1-7(1998))。但是，真皮的主要组分为胶原和弹性蛋白。

皮下组织是皮肤的最深层。它充当用于身体热量保存的绝热体和用于器官保护的减震器(Inlander,Skin,New York,N.Y.:People's Medical Society,1-7(1998))。另外，皮下组织也储存脂肪用于能量储备。皮肤的pH通常在5和6之间。该酸度是由于来自皮脂腺分泌物的两性氨基酸、乳酸和脂肪酸的存在。术语“酸性套膜(acid mantle)”是指在皮肤的大部分区域上的水溶性物质的存在。皮肤的缓冲能力部分地是由于在皮肤角质层中储存的这些分泌物。

皱纹(其是衰老的泄露秘密的迹象之一)可以由从对皮肤的环境损害而积累的生物化学、组织学和生理学变化所引起(Benedetto,International Journal ofDermatology,38:641-655(1999))。另外，存在可以引起面部皱纹的特征性褶皱、沟纹和褶痕的其他次要因素(Stegman等人,The Skin of the Aging Face CosmeticDermatological Surgery,2^nd ed.,St.Louis,Mo.:Mosby Year Book:5-15(1990))。这些次要因素包括持续不变的重力牵拉、在皮肤上的频繁且持续不变的位置压力(例如，在睡眠期间)和由面部肌肉的收缩所引起的反复的面部运动(Stegman等人,The Skin of the AgingFace Cosmetic Dermatological Surgery,2^nd ed.,St.Louis,Mo.:Mosby Year Book:5-15(1990))。

已经使用了不同的技术以便可能地缓和衰老的一些迹象。这些技术从包含α-羟基酸和视黄醇的面部湿润剂到外科手术程序和注射神经毒素变动。例如，在1986年，JeanCarruther和Alastair Carruther(由一名眼整形外科医生和一名皮肤病学家组成的夫妻团队)开发出了使用肉毒杆菌毒素的A型形式来处理在眉间区域中的运动相关性皱纹的方法(Schantz和Scott,见Lewis G.E.(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum,New York:Academic Press,143-150(1981))。肉毒杆菌毒素的A型形式用于处理皱纹的卡拉瑟斯氏(Carruthers)用途导致在1992年该方法的开创性发表(Schantz和Scott,见Lewis G.E.(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum,New York:Academic Press,143-150(1981))。到1994年，同一团队报道了用在面部上的其他运动相关性皱纹来进行的体验(Scott,Ophthalmol,87:1044-1049(1980))。这反过来导致了使用肉毒杆菌毒素的A型形式的美容处理时代的诞生。

肉毒杆菌毒素的A型形式据报导是人类已知的最致死的天然生物学试剂。肉毒梭菌(C.botulinum)的孢子被发现存在于土壤中，并且可以在经不恰当地灭菌和密封的食品容器中生长。肉毒中毒(其可以是致命的)可以由摄入该细菌而引起。肉毒杆菌毒素通过经由抑制跨神经肌肉接头的乙酰胆碱释放而阻止突触传递来起作用以产生肌肉麻痹，并且被认为也以其他方式起作用。它的作用基本上阻断了通常将会引起肌肉痉挛或收缩的信号，从而导致麻痹。在最近的十年期间，已经利用肉毒杆菌毒素的肌肉麻痹活性来取得各种各样的治疗效应。肉毒杆菌毒素的受控施用已经用于提供肌肉麻痹，以处理各种各样的医学状况，例如以骨骼肌活动过强为特征的神经肌肉病症。已经用肉毒杆菌毒素进行处理的状况包括半面痉挛、成人发作的痉挛性斜颈、肛裂、睑痉挛、脑性瘫痪、颈肌张力障碍、偏头痛、斜视、颞下颌关节病症以及各种类型的肌肉痛性痉挛和痉挛。更近期，肉毒杆菌毒素的肌肉麻痹效应已经应用于治疗性和美容性面部应用，例如处理皱纹、皱眉细纹以及面部肌肉的痉挛或收缩的其他结果。

除了肉毒杆菌毒素的A型形式外，还存在七种其他在血清学上不同的肉毒杆菌毒素形式，其也由革兰氏阳性细菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生。在肉毒杆菌毒素的这八种在血清学上不同的类型之中，可以引起麻痹的七种被命名为肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。这些中的每一种通过用类型特异性抗体进行的中和来区分。每种肉毒杆菌毒素蛋白质的分子量为大约150kD。由于肉毒杆菌毒素的分子大小和分子结构，它不能跨越角质层和下面的皮肤构造的多个层。肉毒杆菌毒素的不同血清型在效应方面以及在它们在不同动物物种中引起的麻痹的严重度和持续时间方面变化。例如，在大鼠中，已确定A型肉毒杆菌毒素的效能是B型肉毒杆菌毒素的500倍，如通过麻痹率所测量的。另外，已确定B型肉毒杆菌毒素以480U/kg的剂量(对于A型来说的灵长类动物LD₅₀的大约12倍)在灵长类动物中是非毒性的。

如由肉毒梭菌细菌所释放的，肉毒杆菌毒素是包含大约150kD肉毒杆菌毒素蛋白质分子连同所结合的非毒素蛋白质一起的毒素复合物的一种组分。这些内源性非毒素蛋白质被认为包括血凝素蛋白质家族，以及非血凝素蛋白质。非毒素蛋白质已被报道使在毒素复合物中的肉毒杆菌毒素分子稳定，并且在当毒素复合物被摄入时，保护它免于经由消化酸的变性。因此，毒素复合物的非毒素蛋白质保护肉毒杆菌毒素的活性，并由此在当经由胃肠道施用毒素复合物时，增强全身渗透。另外，认为一些非毒素蛋白质特异地使在血液中的肉毒杆菌毒素分子稳定。

在毒素复合物中非毒素蛋白质的存在典型地造成毒素复合物具有比单纯的肉毒杆菌毒素分子(其为大约150kD，如前面所叙述的)更大的分子量。例如，肉毒梭菌细菌可以产生具有大约900kD、500kD或300kD的分子量的A型肉毒杆菌毒素复合物。作为具有大约700kD或大约500kD的分子量的复合物产生B和C型肉毒杆菌毒素。作为具有大约300kD或500kD的分子量的复合物产生D型肉毒杆菌毒素。仅作为具有大约300kD的分子量的复合物产生E和F型肉毒杆菌毒素。

为了对肉毒杆菌毒素提供额外的稳定性，常规地通过在制备期间将复合物与白蛋白相组合来使毒素复合物稳定。例如(Allergan,Inc.,Irvine,CA)是一种含肉毒杆菌毒素的制剂，其包含100U的A型肉毒杆菌毒素以及附属蛋白质(0.5毫克的人白蛋白)和0.9毫克的氯化钠。白蛋白用于在完全不同的环境(包括与制备、运输、储存和施用相关联的那些)中结合毒素复合物和使之稳定。

典型地，通过包含肉毒杆菌毒素复合物和白蛋白的组合物的小心控制的注射来将肉毒杆菌毒素施用给患者。但是，存在数个与该方法相关联的问题。不仅注射是疼痛的，而且典型地在注射位点周围局部地产生大的皮下毒素井，以便取得所希望的治疗或美容效应。肉毒杆菌毒素可以从这些皮下井进行迁移从而在身体的周围区域中引起不想要的麻痹。当待处理的区域是大的并且需要许多次毒素注射以处理该区域时，该问题更加严重。而且，因为所注射的毒素复合物包含使肉毒杆菌毒素稳定和增加毒素复合物的分子量的非毒素蛋白质和白蛋白，因此毒素复合物在身体内具有长的半寿期并且可以在患者中引起不希望的抗原应答。例如，有些患者将会随着时间而发展出对于在目前的商业制剂中作为稳定剂而使用的白蛋白的变态反应。此外，毒素复合物可以诱导患者的免疫系统形成中和抗体，从而在随后的施用中需要更大量的毒素来取得相同的效应。当这发生时，必须小心地安排随后的注射，以便它们不释放大量的毒素进入到患者的血流中，其能够导致致命的全身中毒，尤其是因为非毒素蛋白质和白蛋白使在血液中的肉毒杆菌毒素稳定。

鉴于与目前的肉毒杆菌毒素制剂相关联的缺点，非常希望具有这样的可注射肉毒杆菌毒素制剂，其是有效的且稳定的，但展示出降低的抗原性和更低的在注射后局部扩散的倾向。还希望的是，将这样的肉毒杆菌毒素制剂用于各种治疗、美学和/或美容目。

发明简述

在其一个方面，本发明提供了可注射组合物，其包含与带正电荷的载体分子非共价地相结合的肉毒杆菌毒素。在优选的实施方案中，本发明的组合物具有一个或多个超过传统商业肉毒杆菌毒素制剂例如或的优点。例如，在某些实施方案中，所述组合物可以展示出一个或多个超过传统可注射肉毒杆菌毒素制剂的优点，包括降低的抗原性、降低的在注射后经历进入周围组织中的扩散的倾向、相对于传统肉毒杆菌毒素制剂而言的增加的临床功效持续时间或增强的效能、更快的临床功效起始和/或经改善的稳定性。

本发明的另一个方面是认识到可以向肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物和特别地缩减型肉毒杆菌毒素复合物(如在本文中所定义的)添加某些非天然分子(即在从肉毒梭菌细菌获得的肉毒杆菌毒素复合物中找不到的分子)，以改善穿过组织的毒素扩散。所述非天然分子与毒素非共价地相结合，并且充当改善毒素在注射后到达靶结构的能力的渗透增强剂。此外，所述非天然分子可以在注射之前和之后增加毒素的稳定性。作为例子，所述渗透增强剂可以是带正电荷的载体，例如阳离子肽，其没有内在的肉毒杆菌毒素样活性并且也包含一个或多个在本文中所描述的蛋白质转导结构域。

本发明的另一个方面是提供组合物，其包含肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物(或缩减型肉毒杆菌毒素蛋白质复合物，其包括仅该150kD神经毒素本身，或者该神经毒素与一些但不是所有的天然复合物蛋白质)和带正电荷的载体。

在其另一个方面，本发明进一步涉及用于通过向需要此类处理的受试者或患者注射有效量(优选地，在治疗上有效的量)的本发明的组合物来产生生物学效应的方法。所述生物学效应可以包括例如肌麻痹，分泌过多或出汗的减轻，神经性痛或偏头痛的治疗，鼻炎或鼻窦炎的管理，膀胱过度活动症的治疗，肌痉挛的减轻，痤疮的预防或减少，免疫应答的减轻或增强，皱纹、细纹或眉间细纹(也称为皱眉细纹)(特别是在脸部中的)的减少，或者各种其他病症的预防或治疗。

在另一个方面，本发明提供了本发明的组合物的有效剂量和量，其在通过注射向需要处理的受试者或患者进行施用之后提供长期的、持久的功效，例如长持续时间的应答率。这样的剂量和量优选地为在治疗上或在美容上有效的剂量和量，其在向之施用了所述剂量和量的受试者中产生或导致所希望的治疗或美容效应。在一个实施方案中，由作为单次处理通过注射而施用给有需要的受试者或患者的本发明组合物的剂量所提供的减少面部的皱纹和细纹(特别地，眉间细纹)的效应持续数周至数个月，相比于传统处理例如美容注射而言。在特别的实施方案中和如在本文的实施例中所描述的，以20U至60U的在治疗上有效的量用包含肉毒杆菌毒素(例如肉毒杆菌毒素A)和带正电荷的载体(如在本文中所描述的)的本发明的组合物对受试者或患者进行的单次处理在至少20周、至少24周或大约6至10个月或者甚至更长的时间内提供皱纹和面部细纹减少的应答率，相比于传统注射而言。而且，本发明的组合物提供了降低的在注射后从注射位点扩散或散布这样一种属性，由此使该毒素和其效应局限在所希望的地方，并且降低在远离用于处理的注射位点的位点或位置处的该毒素的非特异性或不想要的效应。

由本发明的组合物(例如实施例5的RT002)以及由所描述的处理方法和用途所提供的效应持续时间提供了相比于现有技术而言的显著优点。作为例子，经受处理(例如用包含肉毒杆菌毒素的组合物进行的美学处理)的受试者认为，在处理后的效应持续时间对于他们来说是非常重要的。这样长的、持久的效应持续时间(其是通过甚至用有效剂量的本发明的产品例如RT002进行单次处理所取得的)允许对于受试者的更少的注射/处理过程，这对受试者来说是极其重要的。来自用由在本文中所描述的本发明组合物和方法所提供的产品(其具有清楚的功效和安全性)进行的单次处理的持续时间延长的效应为经受处理过程的受试者提供了更少的不适、更少的花费和更多的方便。此外，提供在向受试者进行产品的单次可注射处理后保持至少20或24周时间段或者至少6个月时间段或者大于6个月时间段的显著且持久的效应的产品为开业医生和患者两者同样地提供了对于本领域中未满足的需要的解决方案。因此，本发明的组合物和方法提供了对于过于频繁的处理这一问题的解决方案，并且改善了患者的总体福利。这样的延长的作用持续时间在整个处理过程中提供了更少的处理。

在另一个方面，本发明提供了施用肉毒杆菌毒素以在个体中取得持续时间延长的治疗或美容效应的方法，其中所述方法包括：通过注射来将无菌可注射组合物的剂量施用到需要处理的个体的区域中，以在用所述组合物进行的第一处理后取得治疗或美容效应；其中所述组合物包含：肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物组分；和带正电荷的载体组分，其包含具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q、(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q或(gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q的氨基酸序列，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；和适合于注射的在药学上可接受的稀释剂；其中以20U至60U的处理剂量将所述肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物组分施用给所述个体；其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物组分非共价地相结合；并且其中通过注射向所述个体施用的所述组合物的所述第一处理剂量取得具有至少大约6个月至大约10个月效应持续时间的持续时间延长的治疗或美容效应，任选地在施用第二或随后处理剂量之前。

在另一个方面，本发明提供了在有此需要的个体中减少皱纹、细纹或沟纹的方法，所述方法包括：作为单剂量注射向所述个体施用组合物，所述组合物包含：肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物；和带正电荷的载体，其包含具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q、(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q或(gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q的氨基酸序列，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；和用于注射的在药学上可接受的稀释剂；其中以20U至60U的量将所述肉毒杆菌毒素施用给所述个体；其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物组分非共价地相结合；并且其中所述组合物的所述单剂量注射在所述个体中减少皱纹、细纹或沟纹方面提供具有至少大约6个月至大约10个月效应持续时间的单次处理，从而对于所述个体延长了处理间隔持续时间。在一个实施方案中，所述组合物减少在所述个体的面部中的眉间细纹，或者减轻在所述个体的面部中的眉间细纹的严重度。

在另一个方面，本发明提供了无菌可注射组合物，其包含：以选自20U、40U或60U的剂量数量的肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物；和带正电荷的载体，其包含具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q、(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q或(gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q的氨基酸序列，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；和用于注射的在药学上可接受的稀释剂；其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物组分非共价地相结合；并且其中所述组合物提供在用有效剂量的所述可注射组合物对个体进行处理后持续至少20至24周或者至少6个月或者大于6个月(例如，大约6个月至大约10个月)的美容或治疗效应。

在这些上面的方法和组合物的一些实施方案中，所述组合物包含血清型A的肉毒杆菌毒素，优选地具有150kDa的分子量的血清型A肉毒杆菌毒素。在一个实施方案中，所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR。在一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素以20U的剂量数量存在于所述组合物中。在一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素以40U的剂量数量存在于所述组合物中。在一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素以60U的剂量数量存在于所述组合物中。在一个实施方案中，所述组合物在经受了通过注射所述组合物来进行的单次处理的个体中减轻眉间细纹的严重度。在某些实施方案中，处理效应的持续时间包括大于6个月；大于7个月；大于8个月；大于9个月；或至少6个月至10个月。

在其另一个方面，本发明提供了用可注射肉毒杆菌毒素处理需要处理的个体的方法，其中所述处理方法包括具有多个处理间隔的处理过程，其具有延长的效应持续时间和在每个处理间隔之间的持续时间，所述处理过程包括：通过注射来将无菌可注射组合物的初始处理剂量施用到需要处理的个体的区域中，以在用所述组合物进行的初始处理后取得治疗或美容效应；其中所述组合物包含：肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物组分；和带正电荷的载体组分，其包含具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q、(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q或(gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q的氨基酸序列，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；和适合于注射的在药学上可接受的稀释剂；其中以20U至60U的处理剂量将所述肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物组分施用给所述个体；其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物组分非共价地相结合；其中通过注射向所述个体施用的所述组合物的所述初始处理剂量提供持续直至至少大约10个月的治疗或美容效应持续时间；以及在所述初始处理剂量后和在每个随后处理剂量之间，以包括大于或等于3个月至至少大约10个月的持续时间的处理间隔，通过注射来将所述组合物的随后处理剂量施用给所述个体。

在上面所描述的处理方法的实施方案中，所述治疗或美容效应为皱纹、细纹或沟纹的处理或减少。在一个实施方案中，所述治疗或美容效应为在所述个体的面部中的眉间细纹的减少。在一个实施方案中，所述组合物包含血清型A的肉毒杆菌毒素，优选地具有150kDa的分子量的血清型A肉毒杆菌毒素。在一个实施方案中，所述带正电荷的载体为具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR的带正电荷的肽。在一个实施方案中，所述组合物在注射后不从注射位点局部地扩散。在特别的实施方案中，以20U的量或以40U的量或以60U的量将所述肉毒杆菌毒素施用给所述个体。在一个实施方案中，所述治疗效应为与从由下列各项组成的组中选择的病症相关联的症状的减轻：半面痉挛、成人发作的痉挛性斜颈、肛裂、睑痉挛、脑性瘫痪、头痛、斜视、颞下颌关节病症、神经性痛、膀胱过度活动症、鼻炎、鼻窦炎、痤疮、张力障碍、张力障碍性收缩、多汗症和由胆碱能神经系统控制的腺体的分泌过多。在某些实施方案中，所述处理间隔的持续时间包括大于3个月；大于4个月；大于5个月；大于6个月；大于7个月；大于8个月；大于9个月；或至少6个月至10个月。

本发明还提供了试剂盒，其用于制备包含肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素蛋白质复合物和带正电荷的载体的制剂或组合物，或者转而可以用于产生这样的制剂或组合物的预混合物。还提供了试剂盒，其包含用于顺次地施用肉毒杆菌毒素复合物(或缩减型肉毒杆菌毒素复合物，其包括仅该150kD神经毒素本身，或者该神经毒素与一些天然复合物蛋白质)和带正电荷的载体的工具。

附图描述

图1呈现了条形图，其显示了在重复施用RT003或后返回基线趾外展得分(digit abduction score；DAS)值(0.4)所需要的时间。

图2A和2B：图2A显示了注射了黑色染料的小鼠的后腿，以指明受到外侧至中线(lateral-to-midline)注射影响的小鼠腓肠肌的部分。图2B显示了注射了黑色染料的小鼠的后腿，以指明受到中线(midline)注射影响的小鼠腓肠肌的部分。

图3呈现了在将RT003、RTT150或注射到小鼠腓肠肌的外侧至中线部分或中线部分中之后随时间变化而测量的趾外展得分(DAS)。

图4A和4B呈现了卡-迈曲线(Kaplan-Meier Curves)，其显示了在来自在本文的实施例5中所描述的临床研究的各种处理组之中的应答持续时间。卡-迈曲线描绘了来自该临床研究的主要功效分析的结果，并且证明了在所示的处理组中关于“调查者总体评估-面部皱纹严重度(Investigator Global Assessment-Facial Wrinkle Severity；IGA-FWS)评估”而言具有离基线至少1-点的改善的应答持续时间。图4A呈现了关于安慰剂处理组、/20 U处理组和RT002 40 U处理组的卡-迈曲线。图4B呈现了关于安慰剂处理组、/20 U处理组、RT002 20 U处理组、RT00240 U处理组和RT002 60 U处理组的卡-迈曲线。

发明详述

本发明涉及包含肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物的新型可注射组合物。在优选的实施方案中，所述组合物使所述毒素稳定，或者使得能够在注射后将毒素转运或递送穿过组织，从而使得所述毒素具有相比于与外源白蛋白相结合的传统商业肉毒杆菌毒素复合物(例如或)而言降低的抗原性、更好的安全性特性谱、增强的效能、更快的临床功效起始和/或更长的临床功效持续时间。本发明的组合物可以用作可注射应用，以用于向受试者提供肉毒杆菌毒素，为了各种治疗、美学和/或美容目的，如在本文中所描述的那样。本发明的组合物还具有超过其他用于递送肉毒杆菌毒素的组合物和方法的经改善的安全性特性谱。另外，这些组合物可以提供在对于肉毒杆菌毒素的免疫应答方面的有益的减少。在实施方案中，在通过注射向其施用了这样的组合物(特别是包含以20U或更多的量的肉毒杆菌毒素的那些组合物)以便处理皱纹和面部细纹(例如眉间细纹)的受试者中，本发明的可注射组合物提供长期的功效，例如持续至少20周，至少24周、至少6个月或大于6个月(例如直至大约10个月)的效应。

在本文中所使用的术语“肉毒杆菌毒素”是指任何已知类型的肉毒杆菌毒素(例如，与肉毒梭菌的不同血清型相关联的150kD肉毒杆菌毒素蛋白质分子)，不论其是由该细菌产生的还是通过重组技术产生的，以及任何可以后来被发现的此类类型，包括新发现的血清型和经改造的变体或融合蛋白。如上面所提及的，目前已经表征了七种在免疫学上不同的肉毒杆菌神经毒素，即肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C、D、E、F和G，它们中的每一种通过用类型特异性抗体进行的中和来区分。所述肉毒杆菌毒素血清型是商购可得的，例如从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)和从Metabiologics,Inc.(Madison,WI)，以及从其他来源。肉毒杆菌毒素的不同血清型在它们所影响的动物物种方面以及在它们引起的麻痹的严重度和持续时间方面变化。至少两种类型的肉毒杆菌毒素，A和B型，是以用于处理某些状况的制剂而商购可得的。A型例如被包含在具有商标的Allergan的制备物中和在具有商标的Ipsen的制备物中，和B型被包含在具有商标的Elan的制备物中。

备选地，在本发明的组合物中所使用的术语“肉毒杆菌毒素”可以指肉毒杆菌毒素衍生物，即具有肉毒杆菌毒素活性但相对于天然存在的或重组的天然肉毒杆菌毒素而言在任何部分上或在任何氨基酸链上包含一个或多个化学或功能改变的化合物。例如，所述肉毒杆菌毒素可以是经修饰的神经毒素，其是相比于天然形式而言删除、修饰或替换了至少一个其氨基酸的神经毒素，或者所述经修饰的神经毒素可以是重组地产生的神经毒素或者其衍生物或片段。例如，所述肉毒杆菌毒素可以是以这样的方式进行了修饰的肉毒杆菌毒素，所述方式例如增强其特性或降低不希望的副作用，但是仍然保持所希望的肉毒杆菌毒素活性。备选地，在本发明中所使用的肉毒杆菌毒素可以是使用重组或合成化学技术来制备的毒素，例如重组肽、融合蛋白或杂合神经毒素，其例如是从不同肉毒杆菌毒素血清型的亚基或结构域来制备的(参见，例如美国专利号6,444,209)。所述肉毒杆菌毒素还可以是已显示出具有必需的肉毒杆菌毒素活性的整个分子的一部分，并且在这样的情况下可以以本身或作为组合或缀合分子(例如融合蛋白)的一部分来进行使用。备选地，所述肉毒杆菌毒素可以以肉毒杆菌毒素前体的形式，其可以本身是非毒性的，例如在蛋白水解切割后变成毒性的非毒性锌蛋白酶。

在本文中所使用的术语“肉毒杆菌毒素复合物”或“毒素复合物”是指连同所结合的内源性非毒素蛋白质(即，由肉毒梭菌细菌所产生的血凝素蛋白质和非毒素非血凝素蛋白质)一起的大约150kD肉毒杆菌毒素蛋白质分子(属于肉毒杆菌毒素血清型A-G中的任一种)。但是，应当注意，所述肉毒杆菌毒素复合物不必作为一种单一的毒素复合物源自肉毒梭菌。例如，可以首先重组地制备肉毒杆菌毒素或经修饰的肉毒杆菌毒素，然后随后将其与非毒素蛋白质相组合。还可以购买重组肉毒杆菌毒素(例如，从List BiologicalLaboratories,Campbell,CA)，然后将其与非毒素蛋白质相组合。

本发明还考虑了通过添加一种或多种外源性稳定剂、移除内源性稳定剂或者两者的组合来调节肉毒杆菌毒素分子的稳定性。例如，本发明考虑了使用“缩减型肉毒杆菌毒素复合物(reduced botulinum toxin complex)”，其中所述肉毒杆菌毒素复合物具有相比于在由肉毒梭菌细菌所产生的肉毒杆菌毒素复合物中天然存在的量而言减少的量的非毒素蛋白质。在一个实施方案中，缩减型肉毒杆菌毒素复合物通过下述方式来制备：使用任何传统的蛋白质分离方法以从源自肉毒梭菌细菌的肉毒杆菌毒素复合物中提取血凝素蛋白质或非毒素非血凝素蛋白质的级分。例如，缩减型肉毒杆菌毒素复合物可以通过经由在7.3的pH下暴露于红细胞而使肉毒杆菌毒素复合物解离来产生(例如，参见EP 1514556 A1，其特此通过提及而合并入本文)。可以使用HPLC、透析、柱子、离心和其他用于从蛋白质中提取蛋白质的方法。备选地，当缩减型肉毒杆菌毒素复合物待通过将合成产生的肉毒杆菌毒素与非毒素蛋白质相组合来产生时，可以简单地向混合物中添加比对于天然存在的肉毒杆菌毒素复合物来说将会存在的更少的血凝素或非毒素非血凝素蛋白质。在根据本发明的缩减型肉毒杆菌毒素复合物中的非毒素蛋白质(例如，血凝素蛋白质或非毒素非血凝素蛋白质或两者)中的任何一种可以独立地以任何量被减少。在某些示例性的实施方案中，一种或多种非毒素蛋白质被减少至少大约0.5％、1％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，相比于在肉毒杆菌毒素复合物中通常存在的量而言。如上面所说明的，肉毒梭菌细菌产生七种不同血清型的毒素，并且商业制备物以不同的相对量的非毒素蛋白质(即，不同量的毒素复合物)来制备。例如，MYOBLOC^TM具有5000U的B型肉毒杆菌毒素/ml，以及0.05％人血清白蛋白、0.01M琥珀酸钠和0.1M氯化钠。DYSPORT^TM具有500U的A型肉毒杆菌毒素-血凝素复合物，以及125mg白蛋白和2.4mg乳糖。在某些实施方案中，基本上所有的在源自肉毒梭菌细菌的肉毒杆菌毒素复合物中通常将会存在的非毒素蛋白质(例如，大于95％、96％、97％、98％或99％的血凝素蛋白质和非毒素非血凝素蛋白质)被从肉毒杆菌毒素复合物中移除。此外，虽然在一些情况下可以以相同的量减少内源性非毒素蛋白质的量，但是本发明还考虑了以不同的量减少每种内源性非毒素蛋白质，以及减少内源性非毒素蛋白质中的至少一种，而不减少其他。

如上面所说明的，典型地，添加外源性稳定剂(例如，白蛋白)以使肉毒杆菌毒素制剂稳定。例如，在的情况下，添加0.5mg的人白蛋白/100U的A型肉毒杆菌毒素复合物以使该复合物稳定。通常，可以添加以使根据本发明的组合物稳定的外源性稳定剂的量不特别地受到限制。在一些实施方案中，所添加的稳定剂的量可以少于常规所添加的量，这是由于本发明的带正电荷的载体本身充当稳定剂的能力。例如，所添加的外源性白蛋白的量可以是任何比传统千倍过量的外源性白蛋白少的量，和在本发明的某些示例性的实施方案中，其仅为大约0.25、0.20、0.15、0.10、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.00001、0.000005、0.000001或0.0000001mg/100U肉毒杆菌毒素。在一个实施方案中，不向本发明的组合物添加外源性白蛋白作为稳定剂，从而产生没有白蛋白的肉毒杆菌毒素组合物。

本发明的优选的组合物为液体的、含肉毒杆菌毒素的组合物，其未用蛋白质性质的赋形剂，尤其是未用任何源自动物蛋白质的赋形剂来稳定化。这样的液体组合物包含肉毒杆菌毒素，优选地血清型A的肉毒杆菌毒素，带正电荷的载体(例如，肽)，非还原二糖或非还原三糖，非离子型表面活性剂，和用于维持4.5至7.5的pH的在生理学上相容的缓冲液。在该液体组合物中非还原糖的浓度在10％至40％(w/v)的范围内，和非离子型表面活性剂的浓度在0.005％至0.5％(w/v)的范围内。该优选的组合物在通过单次注射进行处理后提供长的效应持续时间。在一个优选的实施方案中，肉毒杆菌毒素A具有150kDa的分子量(MW)。该优选的组合物包含肉毒杆菌毒素，优选地肉毒杆菌毒素A，更优选地具有150kDa MW的肉毒杆菌毒素A，在本文中所描述的带正电荷的载体(例如，肽)，非还原二糖，例如蔗糖，非离子型表面活性剂，例如聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80或脱水山梨糖醇酯，和在生理学上相容的缓冲液，例如柠檬酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、马来酸和组氨酸；并且具有在pH4.5至pH 7.5的范围内的pH。

根据本发明，已发现在本文中所描述的具有蛋白质转导结构域或效力基团的带正电荷的载体分子适合作为用于肉毒杆菌毒素的转运系统，其使得毒素能够以经改善的渗透被注射以靶向结构例如肌肉和/或其他皮肤相关结构。所述转运在没有肉毒杆菌毒素的共价修饰的情况下发生。除了增强肉毒杆菌毒素的渗透外，本发明的带正电荷的载体在某些优选的实施方案中可以使肉毒杆菌毒素稳定以对抗降解。在这样的实施方案中，可以减少或完全省略通常存在以使肉毒杆菌毒素稳定的血凝素蛋白质和非毒素非血凝素蛋白质。类似地，可以省略在制备期间通常添加的外源性白蛋白。

通过与术语“载体”相联系地使用术语“带正电荷的”或“阳离子的”，意味着所述载体在至少一些溶液相条件下，更优选地在至少一些在生理学上相容的条件下，具有正电荷。更特别地，在本文中所使用的“带正电荷的”和“阳离子的”意味着，所讨论的基团包含在所有pH条件下带电荷的官能团，例如季铵，或者包含在某些溶液相条件(例如，在伯胺的情况下，pH变化)下可以获得正电荷的官能团。更优选地，在本文中所使用的“带正电荷的”或“阳离子的”是指于在生理学上相容的条件之下具有与阴离子相结合的行为的那些基团。具有许多带正电荷的部分的聚合物不必是均聚物，如对于本领域技术人员来说将会是显然的。带正电荷的部分的其他例子是现有技术中众所周知的并且可以容易地使用，如对于本领域技术人员来说将会是显然的。

通常，所述带正电荷的载体(也称为“带正电荷的主链”)典型地为原子链，其要么具有在该链中的在生理学pH下携带正电荷的基团，要么具有与从主链延伸的侧链相附着的携带正电荷的基团。在某些优选的实施方案中，所述带正电荷的主链为阳离子肽。在本文中所使用的术语“肽”是指氨基酸序列，但关于在该氨基酸序列内的氨基酸残基的数目没有暗含的涵义。因此，术语“肽”也可以包括多肽和蛋白质。在某些优选的实施方案中，所述带正电荷的主链本身将不会具有确定的酶促或治疗的生物学活性。在某些实施方案中，所述主链为线性的烃主链，其在一些实施方案中被选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子所间断。主链原子的大部分通常为碳。另外，所述主链经常将会是重复单元(例如，氨基酸、聚(乙烯氧)、聚(丙烯胺)、聚烯化亚胺等等)的聚合物，但可以是杂聚物。在一组实施方案中，所述带正电荷的主链为聚丙烯胺，其中许多胺氮原子作为携带正电荷的铵基团(四取代的)而存在。在另一个实施方案中，所述带正电荷的主链为非肽基聚合物，其可以是杂聚物或均聚物，例如聚烯化亚胺，例如聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺，其具有大约10,000至大约2,500,000，优选地大约100,000至大约1,800,000，和最优选地大约500,000至大约1,400,000的分子量。在另一组实施方案中，所述主链附着有多个包含带正电荷的基团(例如，铵基团、吡啶鎓基团、鏻基团、鋶基团、胍鎓基团或脒鎓基团)的侧链部分。在该组实施方案中的侧链部分可以沿着主链以间隔一致或可变的间距进行布置。另外，所述侧链的长度可以是相似的或相异的。例如，在一组实施方案中，所述侧链可以是线性或支化的烃链，其具有一个至二十个碳原子并且在上面所说明的带正电荷的基团之一中在远端(远离主链)结束。在所述带正电荷的载体和所述肉毒杆菌毒素之间的结合是通过非共价相互作用(其非限制性例子包括离子相互作用、氢键键合、范德华力或其组合)来进行的。

在一组实施方案中，所述带正电荷的主链为具有多个带正电荷的侧链基团(例如，赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、高精氨酸等等)的多肽。优选地，所述多肽具有大约100至大约1,500,000，更优选地大约500至大约1,200,000，最优选地大约1000至大约1,000,000的分子量。本领域技术人员将会意识到，当在本发明的该部分中使用氨基酸时，所述侧链在附着中心处可以具有D-型或L-型(R或S构象)。在某些优选的实施方案中，所述多肽具有大约500至大约5000，更优选地1000至大约4000，更优选地2000至大约3000的分子量。在其他优选的实施方案中，所述多肽包含10至20个氨基酸，或者10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸，优选地聚赖氨酸。

备选地，所述主链可以包含氨基酸类似物和/或合成的氨基酸。所述主链也可以是多肽的类似物，例如拟肽。参见例如，Kessler,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32:543(1993)；Zuckermann等人,Chemtracts-Macromol.Chem.4:80(1992)；和Simon等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 89:9367(1992))。简而言之，拟肽是其中侧链附着至主链氮原子而非α-碳原子的聚甘氨酸。如上所述，侧链的一部分将会典型地以带正电荷的基团结束以提供带正电荷的主链组分。拟肽的合成描述在例如美国专利号5,877,278(其特此通过提及而以其整体合并入本文)中。如在本文中使用该术语那样，具有拟肽主链构造的带正电荷的主链被认为是“非肽”，因为它们不由具有在α-碳位置处的天然存在的侧链的氨基酸组成。

可以使用各种各样的其他主链，其采用例如多肽的空间或电子模拟物，其中肽的酰胺键被下列替代物替代：例如酯键、硫代酰胺(--CSNH--)、反向硫代酰胺(--NHCS--)、氨基亚甲基(--NHCH₂--)或反向亚甲基氨基(--CH₂NH--)基团、酮基亚甲基(--COCH₂--)基团、次膦酸盐(--PO₂RCH₂--)、膦酸酰胺盐和膦酸酰胺酯(--PO₂RNH--)、反向肽(--NHCO--)、反式烯烃(--CR＝CH--)、氟烯烃(--CF＝CH--)、二亚甲基(--CH₂CH₂--)、硫醚(--CH₂S--)、羟基亚乙基(--CH(OH)CH₂--)、亚甲基氧基(--CH₂O--)、四唑(CN₄)、磺酰胺基(--SO₂NH--)、亚甲基磺酰胺基(--CHRSO₂NH--)、反向磺酰胺(--NHSO₂--)和具有丙二酸盐和/或偕二氨基烷基亚单位的主链，例如由Fletcher等人((1998)Chem.Rev.98:763)所综述并且由在其中所引用的参考文献所详细说明的。上述置换中的许多导致相对于从α-氨基酸形成的主链而言大致电子等排的聚合物主链。

在每个上面所提供的主链中，可以附加携带带正电荷的基团的侧链基团。例如，经磺酰胺连接的主链(--SO₂NH--和--NHSO₂--)可以具有附着至氮原子的侧链基团。类似地，羟基亚乙基(--CH(OH)CH₂--)连接可以携带附着至羟基取代基的侧链基团。本领域技术人员可以容易地调整其他连接化学以通过使用标准的合成方法来提供带正电荷的侧链基团。

在一个实施方案中，所述带正电荷的主链为具有蛋白质转导结构域(也称为效力基团(efficiency group))的多肽。在本文中所使用的“效力基团”或“蛋白质转导结构域”是任何具有促进所述带正电荷的主链移位穿过组织或细胞膜的效应的试剂。蛋白质转导结构域或效力基团的非限制性例子包括：-(gly)_n1-(arg)_n2，HIV-TAT或其片段，或者触角足蛋白(Antennapedia)的蛋白质转导结构域(PTD)或其片段，其中下标n1为0至20，更优选地0至8，更加优选地2至5的整数，和下标n2独立地为大约5至大约25，更优选地大约7至大约17，最优选地大约7至大约13的奇整数。在一些实施方案中，HIV-TAT片段不包含HIV-TAT分子的富含半胱氨酸的区域，以便使与二硫化物聚集相关联的问题最小化。优选地，HIV-TAT和触角足蛋白蛋白质转导结构域的片段保留了全蛋白质的蛋白质转导活性。更加进一步优选的是那些实施方案，其中HIV-TAT片段具有氨基酸序列(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q、(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q或(gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数，或其中p和q各自独立地为整数1。在另一个实施方案中，所述片段或效力基团经由该片段或该效力基团的氨基酸序列的C-末端或N-末端而附着至主链。在某些优选的实施方案中，p为一且q为零或者p为零且q为一。优选的HIV-TAT片段为那些，其中下标p和q各自独立地为0至8，更优选地0至5的整数。在另一个优选的实施方案中，所述带正电荷的侧链或分支基团为触角足蛋白(Antp)蛋白质转导结构域(PTD)，或者保留了活性的其片段。这些是本领域中已知的，例如从Console等人,J.Biol.Chem.278:35109(2003)中，并且本发明所考虑的触角足蛋白PTD的一个非限制性例子为具有氨基酸序列SGRQIKIWFQNRRMKWKKC的PTD。在其他实施方案中，所述带正电荷的载体为具有氨基酸序列RKKRRQRRR-G-(K)₁₅-G-RKKRRQRRR的带正电荷的肽；或者具有氨基酸序列YGRKKRRQRRR-G-(K)₁₅-G-YGRKKRRQRRR的带正电荷的肽；或者具有氨基酸序列RGRDDRRQRRR-G-(K)₁₅-G-RGRDDRRQRRR的带正电荷的肽，其用于在本发明的组合物和方法中使用。

优选地，所述带正电荷的载体包括侧链带正电荷的蛋白质转导结构域或带正电荷的效力基团，以至少大约0.01％(作为总载体重量的百分比)，优选地大约0.01至大约50重量百分比，更优选地从大约0.05至大约45重量百分比，和最优选地大约0.1至大约30重量％的量。对于具有式-(gly)_n1-(arg)_n2的带正电荷的蛋白质转导结构域，优选的范围为大约0.1至大约25％。

在另一个实施方案中，所述主链部分为聚赖氨酸，并且带正电荷的蛋白质转导结构域附着至赖氨酸侧链氨基基团或者附着至C-或N-末端。在一些优选的实施方案中，所述聚赖氨酸可以具有至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500或6000D，并且低于大约2,000,000、1,000,000、500,000、250,000、100,000、75,000、50,000和25,000D的分子量。在100至2,000,000D的范围内，考虑了下限和/或上限范围可以分别增加或降低100，从而每个所得的子范围为本发明的经特别考虑的实施方案。在一些示例性的实施方案中，所述聚赖氨酸具有大约1,000至大约1,500,000D，大约2,000至大约800,000D，或大约3,000至大约200,000D的分子量。在其他示例性的实施方案中，所述聚赖氨酸具有大约100至大约10,000D，大约500至大约5,000D，大约1,000至大约4,000D，大约1,500至大约3,500D，或大约2,000至大约3,000D的分子量。优选的是具有10至20个赖氨酸，更优选地15个赖氨酸的聚赖氨酸多肽。在一些实施方案中，本发明所考虑的聚赖氨酸可以是商购可得的(Sigma Chemical Company,St.Louis，Mo.,USA)聚赖氨酸例如具有MW>70,000的聚赖氨酸、具有70,000至150,000的MW的聚赖氨酸、具有MW 150,000至300,000的聚赖氨酸和具有MW>300,000的聚赖氨酸中的任一种。合适的聚赖氨酸的选择将会取决于组合物的其余组分，并且将会足以为组合物提供总的净正电荷并提供优选地为带负电荷的组分的合并长度的一至四倍的长度。优选的带正电荷的蛋白质转导结构域或效力基团包括例如-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly₃Arg₇)或HIV-TAT。

在另一个优选的实施方案中，所述带正电荷的主链为聚烯化亚胺，其非限制性例子包括聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺和聚丁烯亚胺。在某些实施方案中，所述聚烯化亚胺具有至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500或6000D，并且低于大约2,000,000、1,000,000、500,000、250,000、100,000、75,000、50,000和25,000D的分子量。在100至2,000,000D的范围内，考虑了下限和/或上限范围可以分别增加或降低100，从而每个所得的子范围为本发明的经特别考虑的实施方案。

在本发明的其他实施方案中，所述载体为相对短的聚赖氨酸或聚乙烯亚胺(PEI)主链(其可以是线性的或支化的)并且其具有带正电荷的分支基团。在不希望受限于理论的情况下，认为此类载体对于使在治疗性组合物中主链和肉毒杆菌毒素的不受控聚集最小化是有用的，所述不受控聚集引起转运效率急剧下降。当所述载体为相对短的线性聚赖氨酸或PEI主链时，所述主链将会具有低于75,000D，更优选地低于30,000D，和最优选地低于25,000D的分子量。但是，当所述载体为相对短的支化聚赖氨酸或PEI主链时，所述主链将会具有低于60,000D，更优选地低于55,000D，和最优选地低于50,000D的分子量。

在一个特别令人感兴趣的实施方案中，所述非天然分子为不具有内在的肉毒杆菌毒素样活性并且也包含一个或多个在本文中所描述的蛋白质转导结构域的阳离子肽。在不希望束缚于任何特别的科学理论的情况下，认为所述肽增强在注射后结合在复合物中的分子的组织渗透，同时增强在皮肤中和在体外肉毒杆菌毒素的稳定化。认为由这些肽所提供的经增强的组织渗透特别地提供相比于与外源白蛋白相结合的传统商业肉毒杆菌毒素复合物(例如或)而言降低的抗原性、更好的安全性特性谱、增强的效能、更快的临床功效起始或更长的临床功效持续时间。

在优选的实施方案中，在根据本发明的组合物中带正电荷的载体的浓度足以增强肉毒杆菌毒素向分子靶标例如运动神经板的递送。进一步地，在不希望束缚于理论的情况下，认为渗透率遵循由受体介导的动力学，从而组织渗透随着渐增量的增强渗透的分子而增加，直至饱和点，在这之后转运率变为恒定。因此，在一个优选的实施方案中，所添加的增强渗透的分子的量等于恰好在饱和之前使渗透率最大化的量。关于在本发明的可注射组合物中的带正电荷的载体(或载体肽)的有用的浓度范围为大约0.1pg的载体/单位(U)的肉毒杆菌毒素(0.1pg/U)至大约1.0mg/单位的肉毒杆菌毒素(mg/U)，如在本文中所描述的。关于在本发明的局部组合物中的带正电荷的载体(或载体肽)的有用的浓度范围为大约1.0pg/U的肉毒杆菌毒素至0.5mg/U的肉毒杆菌毒素(载体的量/U的肉毒杆菌毒素)。在其他实施方案中，所述带正电荷的载体(或载体肽)以例如10ng/U至200ng/U的肉毒杆菌毒素的范围，或以1ng/U至1000ng/U的肉毒杆菌毒素的范围，或以0.1ng/U至10,000ng/U的肉毒杆菌毒素的范围存在于本发明的可注射组合物中。在一些实施方案中，在本发明的组合物中存在的带正电荷的载体(或载体肽)的量与肉毒杆菌毒素的单位数之比为(作为非限制性例子)50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100等ng的载体/单位的肉毒杆菌毒素(ng/U)。优选地，所述肉毒杆菌毒素是血清型A的，和特别地血清型A肉毒杆菌毒素的150kD形式。

通常，用于测量肉毒杆菌毒素的活性(即肉毒杆菌毒素活性的单位数(U))的方法和程序是本领域技术人员已知的并由他们来实施。简而言之，在小鼠中的半数致死测定法(LD₅₀测定法)常规地用于以高的精确度来估计肉毒杆菌毒素的单位数目。所有商购可得的肉毒杆菌毒素的剂量都以生物学活性的单位数来表示。作为例子，一个单位的肉毒杆菌毒素相应于所计算出的在雌性Swiss-Webster小鼠中的半数腹膜内致死剂量(LD50)。参见Hoffman,R.O.等人,1986,Int.Ophthalmol.Clin.,26:241-50；以及DePass,L.R.,1989,Toxicol.Letters,49:159-170；和Pearce,L.B.等人,1994,Toxicol.Appl.Pharmacol.,128:69-77，其也描述了在本领域中的致死测定法。更特别地，用于测定关于本发明组合物的肉毒杆菌毒素组分的肉毒杆菌毒素单位数的合适方法如下：将四十八(48)只重17-23克的雌性CD-1小鼠随机分配至六个剂量的测试品(1.54、1.31、1.11、0.95、0.80和0.68U/0.5mL)，每个剂量组八(8)只动物。所述测试品是指正被检定或测试的肉毒杆菌毒素制备物或样品。每个笼子安置八只动物，并且在用测试品进行按剂量给药的24小时内称重。在按剂量给药的那天，将测试品在等渗盐水(0.9％NaCl)中稀释至合适的浓度。通过腹膜内注射给每只动物施用0.5mL的经稀释的测试品。在注射后，将小鼠送回笼子，并且每日记录死亡共三天。在注射后72小时对致死进行评分，并且将结果通过概率单位(probit)或逻辑分析进行分析以得出相对于使用相同按剂量给药方案来进行评估的参考标准而言的LD₅₀值。作为例子，所述参考标准为本发明的相同组合物的经特别地认证和校准的批次，其用于进行比较以得出测试品的相对效能。然后，将所测定的LD₅₀值关于所施行的累积稀释进行校正，以为纯净的(未经稀释的)测试品分配相对效能值。

本发明的组合物优选地以允许注射到受试者或患者(即，需要所述特别处理的人或其他哺乳动物)的皮肤或上皮中的形式。术语“有...需要”意味着包括药学的或健康相关的需要(例如，处理涉及不希望的面部肌肉痉挛的状况)，以及美容的和主观的需要(例如，改变或改善面部组织的外观)。在优选的实施方案中，所述组合物通过下述方式来制备：混合肉毒杆菌毒素(其包含所结合的非毒素蛋白质或者减小的所结合的非毒素蛋白质)与带正电荷的载体，和通常与一种或多种额外的在药学上可接受的载体或赋形剂。在其最简单的形式中，它们可以包含水性的在药学上可接受的稀释剂，例如缓冲盐水(例如，磷酸盐缓冲盐水)。但是，所述组合物可以包含其他在可注射的药物组合物或药妆(cosmeceutical)组合物中典型地存在的成分，包括与它将被施用至的组织相容的在皮肤病学上或在药学上可接受的载体、载料或介质。在本文中所使用的术语“在皮肤病学上或在药学上可接受的”意味着，如此描述的组合物或其组分适合于与这些组织相接触地进行使用或者适合于在患者中进行使用，而一般没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、变应性反应等。在合适时，本发明的组合物可以包含任何在所考虑的领域中(特别是在美容学和皮肤病学中)常规使用的成分。

就其形式而言，本发明的组合物可以包括溶液、乳状液(包括微乳状液)、悬浮液、凝胶、粉末或者其他典型的用于注射至肌肉或其他在那里可以使用所述组合物的组织的固体或液体组合物。在优选的实施方案中，本发明的组合物以适合于用注射器进行注射的低粘度的无菌制剂存在。在本文中所使用的术语“组合物”和“制剂”是基本上可互换的，当提到根据本发明的组合物和制剂时。本发明的组合物可以以冻干粉末的形式，其在注射之前使用在药学上可接受的液体稀释剂来进行重构。在某些实施方案中，所述冻干粉末用液体稀释剂进行重构以形成可注射制剂，其具有大约0.1至大约2000cP，更优选地大约0.2至大约500cP，更加优选地大约0.3至大约50cP，和更加优选地大约0.4至大约2.0cP的粘度。除了肉毒杆菌毒素和带正电荷的载体外，本发明的组合物还可以包含其他在此类产品中典型地使用的成分，例如抗微生物剂、水化试剂、组织填充剂或组织填料、防腐剂、乳化剂、天然或合成油、溶剂、表面活性剂、去污剂、胶凝剂、抗氧化剂、填料、增稠剂、粉末、粘度控制剂和水，和任选地包括麻醉剂、抗痒活性物、植物提取物、调节剂、矿物、多酚、聚硅氧烷或其衍生物、维生素和植物药(phytomedicinals)。

根据本发明的可注射组合物可以以受控释放或持续释放组合物的形式，其包含被包囊或者包含在材料中的肉毒杆菌毒素和带正电荷的载体，从而它们随着时间以受控方式在组织内进行释放。包含肉毒杆菌毒素和带正电荷的载体的组合物可以被包含在基质、脂质体、囊泡、微囊、微球等中，或者被包含在固体颗粒材料中，所有这些均进行选择和/或构建以提供肉毒杆菌毒素的随着时间的释放。所述肉毒杆菌毒素和所述带正电荷的载体可以一起地(即，在同一胶囊中)或分开地(即，在分开的胶囊中)进行包囊。

在实施方案中，本发明的组合物包括液体的(水性的)组合物(或制剂)，其包含在本文中所描述的肉毒杆菌毒素、在本文中所描述的带正电荷的载体(或肽)、非还原二糖或非还原三糖、非离子型表面活性剂和在生理学上相容的缓冲液，所述缓冲液能够维持合适的pH，例如在pH 4.5至pH 7.5，或pH 4.5至pH 6.8，或pH 4.5至pH 6.5的范围内的pH。应当理解，合适的pH也包括在所述范围内的下限和上限pH值，例如6.5的pH或7.5的pH。在所述液体组合物中非还原糖的浓度在10％至40％(w/v)的范围内，和非离子型表面活性剂的浓度在0.005％至0.5％(w/v)的范围内。所述液体组合物可以进行干燥(优选地通过冻干)以产生经稳定化的固体组合物，其可以在此后进行重构以用于使用，例如通过使用无菌盐水或者其他已知的在生理学上和在药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载料，尤其是已知用于在可注射制剂中使用的那些。优选地，经干燥的(例如，经冻干的)固体组合物为非晶性的和无定形的固体组合物，并且可以以例如粉末的形式。此外，优选地，本发明的组合物不包括源自动物蛋白质的产物，例如白蛋白。适合于本发明的组合物也描述在美国申请公开号US2010/0330123(其全部内容通过提及而合并入本文中)中。在特别的实施方案中，所述组合物包含血清型A的肉毒杆菌毒素。在其他特别的实施方案中，所述组合物包含具有150kDa的分子量的血清型A的肉毒杆菌毒素。

在某些实施方案中，本发明的组合物包含非还原糖，其优选地为二糖，其非限制性例子包括海藻糖(包括其无水和水合形式)，或者蔗糖，以及其组合。在一些实施方案中，海藻糖的水合形式即海藻糖二水合物是优选的。在其他实施方案中，所述组合物包含三糖，其非限制性例子为棉子糖。通常，在本发明的组合物中非还原糖(优选地二糖，例如蔗糖)的浓度在10％至40％(w/v)，优选地10％至25％(w/v)，更优选地15％至20％(w/v)的范围内。在一些优选的实施方案中，所述非还原糖(优选地二糖，例如蔗糖)的浓度为10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％(w/v)。

通常，本发明的组合物可以包含任何具有使肉毒杆菌毒素稳定的能力并且适合于药学用途的非离子型表面活性剂。在一些实施方案中，所述非离子型表面活性剂为聚山梨酯，例如，作为非限制性例子，聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60和聚山梨酯80。在其他实施方案中，所述非离子型表面活性剂为脱水山梨糖醇酯，其非限制性例子包括20、60、65和80。也可以使用非离子型表面活性剂X-100或NP-40。另外，可以使用不同非离子型表面活性剂的组合。在某些优选的实施方案中，所述非离子型表面活性剂为聚山梨酯、泊洛沙姆和/或脱水山梨糖醇；聚山梨酯和脱水山梨糖醇是特别优选的。在实施方案中，所述非离子型表面活性剂以0.005％至0.5％的范围，或以0.01％至0.2％的范围，或以0.02％至0.1％的范围，或以0.05％至0.08％的范围(包括上限和下限值)存在于本发明的组合物中。另外，本发明的组合物可以包含以0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.10％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％或0.15％的量的所述非离子型表面活性剂。

通常，对于本发明的组合物，任何能够维持pH在上述范围内的在生理学上相容的缓冲液都适合于使用。此类缓冲液的非限制性例子包括柠檬酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、马来酸和组氨酸的盐。合适的缓冲液浓度的非限制性例子包括在0.400％至0.600％，0.450％至0.575％，或0.500％至0.565％的范围内的缓冲液浓度。本发明的组合物还可以包含缓冲盐的混合物，其非限制性例子包括柠檬酸盐/乙酸盐、柠檬酸盐/组氨酸、柠檬酸盐/酒石酸盐、马来酸盐/组氨酸或琥珀酸盐/组氨酸。因此，在通过单次注射进行处理后提供长持续时间的效应的本发明的组合物包含在本文中所描述的肉毒杆菌毒素，例如肉毒杆菌毒素A或150kDa MW的肉毒杆菌毒素A，在本文中所描述的带正电荷的载体(或肽)，非还原二糖，例如蔗糖，非离子型表面活性剂，例如聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60和聚山梨酯80或脱水山梨糖醇酯，和在生理学上相容的缓冲液，例如柠檬酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、马来酸和组氨酸，其能够维持合适的pH，例如在pH4.5至pH 6.5的范围内或在pH 4.5至pH 7.5的范围内的pH，以w/v量，如在本文中所描述的。

本发明的一个特别的组合物为没有白蛋白的液体(水性)组合物，其包含肉毒杆菌毒素，优选地血清型A的肉毒杆菌毒素或具有150kDa的分子量的肉毒杆菌毒素A；带正电荷的载体(例如，肽)；非还原二糖或非还原三糖，优选地二糖，以10％至40％(w/v)的范围存在；非离子型表面活性剂，优选地聚山梨酯或脱水山梨糖醇酯，以0.005％至0.5％(w/v)的范围存在；和在生理学上相容的缓冲液，例如柠檬酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、马来酸或组氨酸，以0.400％至0.600％、0.450％至0.575％或0.500％至0.565％的范围存在，其用于维持在4.5和7.5之间的pH。

根据本发明的肉毒杆菌毒素制剂可以通过注射(典型地，使用注射器)而以有效的量递送至在皮肤下面的肌肉或至在皮肤内的腺体结构，以便产生麻痹、产生松弛、缓和收缩、预防或缓和痉挛、减少腺体输出或产生其他所希望的效应。以该方式的肉毒杆菌毒素的局部递送可以提供剂量减少，降低毒性，并且允许相对于可注射或可植入材料而言更精确的对于所希望的效应的剂量优化。

施用本发明的组合物以递送有效量(优选地，在治疗上或在美容上有效的量)的肉毒杆菌毒素。在本文中所使用的术语“有效量”或“在治疗上或在美容上有效的量”意味着这样的上面所定义的肉毒杆菌毒素的量，其足以产生所希望的肌肉麻痹或其他生物学或美学效应，但其隐含地是安全的量，即足够低以避免严重的副作用的量。所希望的效应包括某些肌肉的松弛，其目的是例如减少细纹和/或皱纹的出现(尤其是在面部中)，或者以其他方式调整面部外观，例如加宽眼睛、提升嘴角或使从上嘴唇散开的细纹变光滑，或者肌肉张力的总体缓减。最后提及的效应，肌肉张力的总体缓减，可以在面部或别处中进行。

本发明的肉毒杆菌毒素可以包含适当的有效量的肉毒杆菌毒素，用于作为单剂量处理进行应用，或者可以是更浓缩的，用于在施用的地方进行稀释或用于以多次应用进行使用。通过使用本发明的带正电荷的载体，可以通过向受试者注射来施用肉毒杆菌毒素，以处理状况例如皱纹、不希望的面部肌肉或其他肌肉痉挛、多汗症、痤疮或者其中希望缓减肌肉疼痛或痉挛的在身体别处的状况。本发明的组合物特别地适合于处理细纹，例如面部细纹，和眉间细纹，其也称为“皱眉细纹”(在受试者面部中)。通过注射至肌肉或者注射至其他皮肤相关结构或其他靶组织结构来施用肉毒杆菌毒素。所述施用可以例如向腿、肩、背(包括腰)、腋窝、手掌、足、颈、脸、腹股沟、手背或足背、肘、上臂、膝、大腿、臀、躯干、骨盆或其中希望施用肉毒杆菌毒素的身体的任何其他部分来进行。

还可以进行本发明的可注射的含肉毒杆菌毒素的组合物的施用以处理其他状况，包括任何这样的状况，对于其来说阻止突触传递或乙酰胆碱的释放将会赋予治疗益处。例如，可以通过根据本发明的组合物来进行处理的状况包括(没有限制地)：神经性痛、偏头痛或其他头痛，膀胱过度活动症，鼻炎，鼻窦炎，痤疮，张力障碍，张力障碍性收缩(无论是主观的还是临床的)，多汗症(无论是主观的还是临床的)，和由胆碱能神经系统控制的一个或多个腺体的分泌过多。本发明的组合物还可以用于减弱或增强免疫应答，或者处理对于其来说已建议或实施了通过注射来进行的肉毒杆菌毒素的施用的其他状况。

最优选地，由医师或其他健康护理专业人员或者在其指导下施用所述组合物。可以以单次处理或者以随着时间的一系列处理来施用它们。在优选的实施方案中，在希望与肉毒杆菌毒素相关联的效应的位置处注射根据本发明的组合物。由于其性质，肉毒杆菌毒素优选地以将会产生所希望的结果而不产生任何不利的或不希望的结果的量、应用率和频次来进行施用。例如，在某些实施方案中，以大约1U至大约20,000U，和更优选地大约1U至大约10,000U肉毒杆菌毒素/cm²皮肤表面积的比率来应用本发明的组合物。可以采用在这些范围内的较高用量，例如在其中与受控释放材料相联合地施用肉毒杆菌毒素的情况下，如在本文中所描述的。在某些实施方案中，施用本发明的肉毒杆菌毒素制剂以提供1U至400U，优选地10U至300U，优选地10U至350U，优选地30U至250U，和优选地50U至200U的肉毒杆菌毒素/注射。在其他优选的实施方案中，通过注射来施用本发明的含肉毒杆菌毒素的组合物以向经受处理的受试者提供10U至100U，或20U至100U，或20U至80U，或20U至60U，或至少20U，至少40U，或至少60U，或10U、20U、30U、40U、50U、60U、70U、80U、90U或100U的肉毒杆菌毒素，优选地血清型A的肉毒杆菌毒素，或具有150kDa的分子量的血清型A的肉毒杆菌毒素。在实施方案中，用有效剂量的本发明的组合物来进行的单次处理提供了长持续时间的效应，从而使得在对于通过肉毒杆菌毒素可处理的适应症的处理过程(例如，皱纹、细纹和沟纹的处理)期间，受试者将会需要更少的注射，和也许仅单次注射，或者在单次处理期期间的系列注射，其具有在延长的时间段，例如至少6个月或大于6个月，即6个月、7个月、8个月、9个月或更长(包括10个月)内持续的相伴的效应。当使用多次处理来维持处理目标或效应时，更长的作用持续时间提供了更长的在处理之间的间隔或时间段。在一个实施方案中，在用提供20U至100U，或20U至60U，或20U、40U或60U的肉毒杆菌毒素的本发明的组合物向个体进行施用或按剂量给药之后所述组合物的更长的效应持续时间，例如至少6个月或大于6个月，例如7、8、9或10个月(包括在中间的)，是相对于不包含根据本发明的带正电荷的载体(或肽)的含肉毒杆菌毒素的组合物或产品的效应持续时间而言的。在一些情况下，没有本发明的带正电荷的载体(或肽)的包含肉毒杆菌毒素的组合物或产品在少于6个月(例如3或4个月)内是有效的。

在某些实施方案中，以提供20U至60U，或至少20U至至少60U的肉毒杆菌毒素/注射的量，作为单次注射向有此需要的受试者或患者施用本发明的组合物以用于处理皱纹、细纹或沟纹(特别是在脸部中的)，所述本发明的组合物包含在本文中所描述的肉毒杆菌毒素和带正电荷的载体(其包含具有一个或多个共价地附着的带正电荷的效力基团的带正电荷的聚合物主链)。根据本发明，在处理受试者或患者中进行单次注射后，处理效应，即皱纹、细纹或沟纹(例如眉间细纹)的减少，持续数周或数个月，例如至少20周，至少24周，或者至少6个月，或大于6个月，例如6、7、8、9或10个月或更长。在实施方案中，所述肉毒杆菌毒素是血清型A、B、C、D、E、F或G的。在一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素是血清型A的。在一个实施方案中，所述血清型A肉毒杆菌毒素具有150kDa的分子量。在一个实施方案中，所述血清型A肉毒杆菌毒素以如在上面所描述的更高分子量复合物的形式。在优选的实施方案中，所述150kDa肉毒杆菌毒素或该毒素的更高分子量形式处于没有白蛋白的制剂中。在一个实施方案中，所述带正电荷的聚合物主链为聚赖氨酸或聚乙烯亚胺。在一个实施方案中，所述一个或多个带正电荷的效力基团包括-(gly)_n1-(arg)_n2，其中下标n1为0至20，更优选地0至8，更加优选地2至5的整数，和下标n2独立地为大约5至大约25，更优选地大约7至大约17，最优选地大约7至大约13的奇整数。在一些实施方案中，所述一个或多个带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q、(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q或(gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。在某些优选的实施方案中，p为一且q为零，或者p为零且q为一。在其他优选的实施方案中，下标p和q各自独立地为0至8，更优选地0至5的整数。在特别的实施方案中，所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR。在其他实施方案中，所述一个或多个带正电荷的效力基团经由效力基团例如氨基酸序列的C-末端或N-末端而附着至所述带正电荷的主链。在一些实施方案中，所述一个或多个带正电荷的效力基团附着至所述带正电荷的载体的所述带正电荷的聚赖氨酸主链的任一末端或两个末端。在特别的实施方案中，所述带正电荷的主链为聚赖氨酸，并且所述肉毒杆菌毒素是血清型A的。在另一个特别的实施方案中，所述血清型A肉毒杆菌毒素具有150kDa的分子量，所述带正电荷的主链为聚赖氨酸，并且所述一个或多个共价地附着的带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q、(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q或(gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数，或各自独立地为上面所陈述的值；或者所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR。在实施方案中，以提供20U或至少20U；30U或至少30U；40U或至少40U；50U或至少50U；60U或至少60U；70U或至少70U；80U或至少80U；90U或至少90U；或者100U或至少100U的肉毒杆菌毒素/注射的量或剂量，通过注射来施用所述组合物。还考虑了在前述量或剂量之间的量或剂量，例如25U或至少25U；35U或至少35U；45U或至少45U等。在特别的实施方案中，以提供20U、40U或60U的肉毒杆菌毒素的量作为单次处理剂量通过注射来施用所述组合物，并且取得应答或效应，例如皱纹和面部细纹(例如眉间细纹)的减少，并保持长的持续时间，例如至少20周，至少24周，至少6个月，或大于6个月，例如6、7、8、9或10个月或更长。在一个特别的实施方案中，包含所描述的带正电荷的载体和以40U的剂量数量的150kDa肉毒杆菌毒素A的本发明的组合物的单剂量在处理眉间细纹中提供长持续时间的效应，例如至少6个月和可能更长。参见例如图4B。

不希望是限制性的，在治疗过程中，本发明的组合物可以在初始处理剂量后以频次更少的间隔来进行施用，基于由在本文中所描述的本发明的组合物和方法的在治疗上和在美容上有效的剂量所提供的延长的效应持续时间。例如，通过实施本发明的方法，可以以大约每年两次(大约每6个月)，或者每7个月、8个月、9个月或10个月或更长来向有需要的个体施用(或按剂量给药)本发明的组合物。在一个特别的实施方案中，以每年两次向个体施用本发明的组合物的剂量。在剂量之间的平均持续时间可以为6个月，至少6个月，或大于6个月，取决于所述治疗性或美容性处理和/或由正进行处理的个体所决定的对于处理的期望。因此，用本发明的组合物对个体进行的按剂量给药可以在初始剂量后一年两次地，或者比一年两次更长地，例如每6、7、8、9或10个月地发生。可以以在组合物中的20U至100U，更优选地20U至60U，和更优选地20U、40U或60U的肉毒杆菌毒素，以合适的间隔来对本发明的组合物进行按剂量给药。

本发明还考虑了各种各样的递送装置用于跨皮肤注射在本文中所描述的含肉毒杆菌毒素的组合物的用途。这样的装置可以包括(没有限制地)针头和注射器，或者可以涉及能够分配组合物和监测组合物的分配，和任选地在一个或多个方面监测受试者的状况(例如，监测受试者对于正进行分配的物质的反应)的更精密的装置。

在一些实施方案中，所述组合物可以如此地预先配制和/或预先安装在递送装置中。本发明还考虑了其中在与其余组分分开地储存一种或多种组分的试剂盒中提供所述组合物的实施方案。例如，在某些实施方案中，本发明提供这样的试剂盒，其分开地储存肉毒杆菌毒素和带正电荷的载体以在应用之时或之前进行合并。带正电荷的载体的量或者这些分子与肉毒杆菌毒素的浓度比例将会取决于选择哪种载体用于在所讨论的组合物中使用。可以容易地确定在给定情况下载体分子的合适的量或比例，例如通过进行一个或多个实验，例如下面所描述的那些。

通常，本发明还考虑了用于向有此需要的受试者或患者施用肉毒杆菌毒素(备选地，作为肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物)的方法，其中将有效量的肉毒杆菌毒素与带正电荷的载体相联合地进行施用，如在本文中所描述的。“与……相联合地”意味着，在组合程序中施用所述两种组分(肉毒杆菌毒素和带正电荷的载体)，其可以涉及在向受试者施用之前将它们合并，或者分开地施用它们，但是以这样的方式，即它们一起发挥作用以提供有效量的所述治疗性蛋白质的必需递送。例如，可以首先将包含所述带正电荷的载体的组合物施用至受试者的皮肤，随后为应用包含所述肉毒杆菌毒素的皮肤贴剂、注射器或其他装置。所述肉毒杆菌毒素可以以干燥形式储存在注射器或其他分配装置中，和所述带正电荷的载体可以在应用所述毒素之前进行注射，从而使得两者一起发挥作用，进而导致所希望的组织渗透增强。因此，在这个意义上，所述两种物质(带正电荷的载体和肉毒杆菌毒素)相组合地发挥作用或者也许相互作用在原位形成组合物或组合。因此，本发明还包括具有用于分配肉毒杆菌毒素和包含带正电荷的载体的液体、凝胶等的装置的试剂盒，所述装置适合于注射至受试者的皮肤或靶组织。用于在健康护理专业人员的指导下或由患者或受试者施用本发明的组合物的试剂盒还可以包括适合于该目的的定制的涂药器。

本发明的组合物适合于在具有从大约4.5至大约6.3变动的pH的生理学环境中使用，并且因此可以具有这样的pH。但是，具有从大约4.5至大约7.5变动的pH的组合物也被在本文中所描述的本发明所囊括。根据本发明的组合物可以在室温下或在冷冻条件下进行储存。

在一些实施方案中，待处理的患者为65岁，至少65岁，或超过65岁。例如，所述患者可以为65、66、68、70、75、80岁或更年长。

应当理解的是，在本文中所描述的下面的实施例和实施方案用于举例说明的目的，并且按照其的各种修改或变化对于本领域技术人员来说将会是被暗示了的并被包括在本申请的精神和视野以及所附权利要求书的范围之内。

在本文中所提及的所有出版物、专利和公开的专利申请均特此通过提及而以其整体合并入本文以用于所有目的。

实施例

实施例1

在小鼠模型中局部肌肉麻痹的持续时间

该实施例比较了在用RT003或进行注射的小鼠中局部肌肉麻痹的持续时间。RT003是根据本发明的示例性可注射制剂，其包含A型肉毒杆菌毒素(其经纯化以去除所有内源性非毒素蛋白质)和具有序列RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR的带正电荷的载体。也包含A型肉毒杆菌毒素，但是添加了外源性白蛋白以使所述A型肉毒杆菌毒素分子稳定。

使用由Aoki,K.R.在“A comparison of the safety margins of botulinumneurotoxin serotypes A,B,and F in mice”,Toxicon 2001，39(12):1815-1820中所报道的趾外展得分(DAS)测定法来测量肌肉麻痹。在所述DAS测定法中，将小鼠通过其尾巴短暂地悬吊以引起特征性的惊吓应答，其中小鼠伸展其后肢并外展其后趾。在五点量表(0-4)上对小鼠能够展示出该惊吓应当的程度进行评分，其中零表示正常的惊吓应答和四表示趾外展和腿伸展的最大减少。所述评分由不知道受试者小鼠被用神经毒素进行处理的程度的观察者来进行。对于未处理的动物群体，使用该DAS测定法的基线得分被测得为0.4。

在本实施例中所报道的研究涉及10只动物(在RT003组中5只小鼠，和在组中5只小鼠)。这些动物中的每一只用各自的肉毒杆菌毒素制剂(即，RT003或)注射三次，其中在每次按剂量给药之间具有40天的时间段。在注射后，对在每个测试组中的所有动物均超过DAS测定法的0.4基线的天数进行计数。在图1中所显示的结果表明，关于经RT003处理的组的DAS测定法得分在第一、第二和第三次处理后停留在0.4基线值之上分别25、22和21天。相反地，关于经处理的组的DAS测定法得分在第一、第二和第三次处理后停留在0.4基线值之上分别11、8和11天。

这些DAS测定法数据表明，由RT003所引起的局部肌肉麻痹持续的时间长度是由所引起的局部肌肉麻痹的两倍。该结果对于RT003和其他根据本发明的可注射的含肉毒杆菌毒素的化合物的治疗性用途具有重要的暗示。特别地，通过使用根据本发明的可注射组合物，可以显著地减少为了维持由肉毒杆菌毒素所引起的特别的美容或治疗效应所需要的后续注射的频次。反过来，减少的应用频次可以导致更好的长期功效，因为受试者更少倾向于发展出对于肉毒杆菌毒素的抗体。

实施例2

具有经改善的安全性特性谱的可注射肉毒杆菌毒素制剂

在过去的几十年内，肉毒杆菌毒素已被用作用于处理各种各样的状况(包括皱纹、多汗症和肌肉痉挛)的治疗性试剂。但是，由于肉毒杆菌毒素是已知对于人的最强有力的天然出现的毒素，因而该毒素的不适当施用可以是极其危险的。例如，肉毒杆菌毒素的意外的全身递送可以导致麻痹、呼吸困难和甚至死亡。此外，即使肉毒杆菌毒素作为治疗性处理的一部分而被正确地递送至身体的局部区域，该毒素也具有随着时间进行扩散的天然倾向，因而增加了在身体的其他部分中的不想要的麻痹的风险。例如，当在眼睛周围注射肉毒杆菌毒素以处理皱纹时，它可以扩散至控制眼睑运动的肌肉。如果这发生了，那么眼睑肌肉可能变得部分地被麻痹，这导致称为“眼睑下垂”的众所周知的状况，其中眼睑部分地闭合并且干扰正常的视觉。

本发明的一个方面是提供具有相比于目前可得的商业肉毒杆菌毒素制剂而言经改善的安全性特性谱的可注射肉毒杆菌毒素制剂。在优选的实施方案中，所述可注射肉毒杆菌毒素制剂具有降低的在注射后扩散的倾向。以这种方式，本发明的某些优选的制剂允许肉毒杆菌毒素的更准确的递送，从而大大地减少与肉毒杆菌毒素的不受控的局部扩散相关联的不想要的副作用。

该实施例报道了在各种制剂中肉毒杆菌毒素在注射后扩散的倾向的比较研究。所述研究涉及三种肉毒杆菌毒素制剂：(1)；(2)RT003，一种经缓冲和经稳定化的溶液，其包含与具有式RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR的带正电荷的载体非共价地相结合的150kD A型肉毒杆菌毒素；和(3)RTT150，其与RT003制剂相同，除了不包含在RT003中存在的带正电荷的载体外。

用上面提及的肉毒杆菌毒素制剂之一对在该研究中所使用的小鼠中的每一只小鼠的腓肠肌进行注射，要么在肌肉的外侧至中线部分(图2A)要么在肌肉的中线部分(图2B)。在用肉毒杆菌毒素进行注射后，在所述小鼠中的每一只上实施DAS测定法四天，以确定各自制剂的肉毒杆菌毒素是否展示出任何从腓肠肌向小鼠后爪扩散的倾向。从所述DAS测定法中，将受试动物的任何降低的外展其后趾的能力解释为肉毒杆菌毒素扩散的指示。

图3显示了在用上面所描述的不同肉毒杆菌毒素制剂对受试动物进行注射后实施的DAS测定法的结果。注意，趾外展得分被归类成两个群集，其相应于注射是在腓肠肌的中线部分还是在腓肠肌的外侧至中线部分。相比于关于外侧至中线注射的DAS得分而言通常更低的关于中线注射的DAS得分表明，在受试动物的后爪中的麻痹程度通常在中线注射后是更低的。在不希望受限于理论的情况下，认为该行为产生自相比于外侧至中线注射而言在中线注射后肉毒杆菌毒素不得不行进更大的距离以到达受试动物的后趾。认为该更大的所需的肉毒杆菌毒素行进距离降低了后趾麻痹的可能性。

图3显示了，对于在RT003制剂的中线注射后的所有四天，趾外展得分为零。该结果表明，在RT003制剂中的肉毒杆菌毒素在注射后保持定位在腓肠肌的中线部分中，并且在该实验的时间尺度上没有出现引起麻痹的扩散。相反地，在注射RTT150和制剂后观察到超过0.4DAS基线的趾外展得分，其中关于制剂的平均DAS得分是更高的。关于RTT150和制剂的DAS结果表明，在这些制剂的中线注射后观察到受试动物的后趾麻痹，其中在注射制剂后观察到更大的麻痹程度。这些数据暗示，在RTT150和制剂中的肉毒杆菌毒素分子能够在注射后局部地扩散，其中关于在制剂中的肉毒杆菌毒素分子具有更大的局部扩散程度。

图3还显示了，在外侧至中线注射后对于所有受试动物均观察到后趾麻痹，无论具体的肉毒杆菌毒素制剂。如上面所讨论的，该相比于中线注射而言在外侧至中线注射后更大的麻痹程度被认为与对于肉毒杆菌毒素来说至受试动物后爪的更短的行进距离有关。但是，虽然所有三种肉毒杆菌毒素制剂在外侧至中线注射后均展示出引起麻痹的扩散，但是在该实验的时间尺度期间在用RT003进行注射的受试动物中的麻痹程度平均而言比关于RTT150和制剂所观察到的麻痹程度更低。因此，相应于外侧至中线注射的DAS测定法数据在性质上与关于中线注射的DAS测定法数据是相似的，因为它显示了相比于RTT150和而言降低的关于RT003制剂的肉毒杆菌毒素局部扩散的倾向。

在中线注射和外侧至中线注射后局部扩散率的比较可以通过考虑被称为“扩散指数”的参数来进行，所述参数按照等式(1)来定义：

由于趾外展得分可以从0至4变动，并且预期外侧至中线趾外展得分高于中线趾外展得分(如上面所讨论的)，因此扩散指数值将会典型地从0至100变动。接近100的扩散指数值表明，中线趾外展得分与外侧至中线趾外展得分的比例接近一。如果在注射后的扩散率是足够高的，从而对于肉毒杆菌毒素来说在中线注射和外侧至中线注射后到达受试动物的后趾并使之麻痹的扩散时间是相当的或几乎相同的，那么这可能出现。在另一个极端，接近零的扩散指数值表明，中线趾外展得分与外侧至中线趾外展得分的比例接近零。如果在中线注射后肉毒杆菌毒素的扩散是如此低，以至于它不足以在受试动物的后趾中引起麻痹(尽管在外侧至中线注射后观察到了麻痹)，那么这可能出现。

下面的表1显示了在RT003和RTT150的中线注射或外侧至中线注射后使用趾外展得分所计算出的扩散指数值，如在相应于图3的实验中所报道的。在该实验的时间尺度上，相应于注射制剂的扩散指数值比关于RTT150和RT003制剂所观察到的值高。这表明，关于注射制剂，中线趾外展得分与外侧至中线趾外展得分的比例更接近于一，相比于关于RTT150和RT003制剂所观察到的比例而言。由于肉毒杆菌毒素在中线注射后必须进一步扩散以引起受试动物的后趾麻痹，因此在注射后中线趾外展得分与外侧至中线趾外展得分的比例更接近于一这一观察结果暗示，在的中线注射后肉毒杆菌毒素扩散率相对于在外侧至中线注射后的扩散率而言是相当大的。换言之，与中线注射相关联的增加的扩散路径长度对于引起后趾麻痹来说不会是太大的障碍。

相反地，关于RT003的扩散指数值在该实验的四天时间尺度上均是零。该结果表明，在RT003的中线注射后没有观察到诱导麻痹的扩散。换言之，RT003制剂(其包含与带正电荷的载体非共价地相结合的A型肉毒杆菌毒素分子)允许所注射的A型肉毒杆菌毒素的增强的局部化。以这种方式，RT003制剂提供了相比于制剂而言的经改善的安全性特性谱并且使不想要的麻痹最小化。

所观察到的关于RTT150的扩散指数值虽然不是零(如在RT003的情况下)，但仍然比关于制剂所观察到的那些小。参见表1。该结果表明，在该实验的四天时间尺度上出现了足够的肉毒杆菌毒素扩散从而产生可观察到的后趾麻痹，但是在中线注射后对于肉毒杆菌毒素的引起麻痹的扩散所需要的时间是相对更长的。

表1

关于RTT150、和RT003的肉毒杆菌毒素扩散指数测量结果

实施例3

具有降低的产生抗体的倾向的可注射肉毒杆菌毒素制剂

当定期地将肉毒杆菌毒素注射到患者中以处理不想要的状况例如皱纹时，经常观察到肉毒杆菌毒素的功效随连续的注射而下降，虽然肉毒杆菌毒素的效应持续时间可以保持相同。该现象被认为是患者的免疫系统形成对于肉毒杆菌毒素的抗体的结果。从处理的角度来看，患者形成对于肉毒杆菌毒素的抗体是不希望的，因为那么就需要越来越大剂量的肉毒杆菌毒素以取得相同的效应，这具有与安全性和花费两者相关的严重问题。

在某些实施方案中，本发明提供了可注射肉毒杆菌毒素制剂，其具有相比于目前可得的商业可注射肉毒杆菌毒素制剂而言降低的诱导抗体形成的倾向。因此，在这些实施方案中，肉毒杆菌毒素制剂通过允许随着时间使用更少的毒素来取得相同的效应而有助于使与肉毒杆菌毒素注射相关联的风险最小化。

在该实施例中，随时间变化分析在重复的RT003和注射(如在实施例2中所描述的)后获得的DAS测定法数据，以确定在对相同的受试动物重复施用后这两种制剂的功效如何变化。通常，在重复施用任一种所述制剂后，与肉毒杆菌毒素相关联的效应持续时间是相同的。但是，在重复施用后肌肉麻痹的程度依赖于制剂而变化。为了定量肌肉麻痹程度的变化，按照等式(2)来确定在注射RT003或后趾外展得分的变化百分比：

由于等式(2)的分子为在关于第n次和第一次处理所测量的趾外展得分之间的差，因此如果关于第n次处理所测量的趾外展得分比关于第一次处理所测量的趾外展得分小，那么DAS的变化百分比将会是负的。换言之，当相比于第一次处理而言在第n次处理后观察到更少的麻痹时，DAS的变化百分比是负的。表2显示了在按照在实施例2中所描述的程序重复施用RT003和制剂后所测量的DAS值的变化百分比。

表2

在重复施用RT003和后DAS值的变化百分比

如在表2中所指出的，在第一次复处理后，趾外展得分的变化百分比对于制剂来说为-44％，这暗示了功效的重大下降。相反地，关于RT003制剂的趾外展得分的变化百分比为零，这表明在第二次复处理后的DAS得分与在初始处理和第一次复处理后的DAS得分是相同的。该结果表明，在RT003的第一次复处理后所观察到的麻痹程度与在第一次处理后的麻痹程度是相同的，并且即使在第一次复处理后在受试动物中出现了可忽略的中和抗体形成。在RT003和的第2次复处理后，所计算出的DAS值的变化百分比对于这两种制剂来说都是负的，虽然关于RT003制剂的DAS值的变化百分比的大小程度是关于所测定的值的一半。关于所观察到的更大的和负的DAS值的变化百分比暗示，受试动物具有相比于RT003而言更高的对于的抗体产生率。因此，这些数据表明，由本发明所考虑的制剂，例如RT003，可以具有更低的诱导抗体形成的倾向，所述抗体中和肉毒杆菌毒素的效应。因此，该结果暗示，通过使用由本发明所考虑的制剂，可以随着时间使用更少的肉毒杆菌毒素来取得相同的治疗效应。

实施例4

具有经改善的稳定性的可注射肉毒杆菌毒素制剂

该实施例证明，在本发明的可注射肉毒杆菌毒素制剂中所使用的带正电荷的载体分子不仅增强制剂的安全性特性谱(实施例2)，而且还改善其稳定性。表3显示了老化实验的结果，其中将RT003和RTT150制剂在4℃下(仅RT003)和在40℃下(RT003和RTT150两者)老化各种不同的时间间隔。在指定的温度下老化指定的时间后，通过一系列的小鼠IP LD₅₀测定法来测量RT003和RTT150制剂的效能。在表3中所概括的结果表明，RT003的效能在于4℃进行老化后基本上没有变化，即使在六个月后。进一步地，即使将RT003制剂在升高的温度(40℃)下老化六个月，通过在小鼠IP LD₅₀测定法中所述制剂杀死靶动物的能力所测量的RT003制剂的效能仅稍微下降。相反地，RTT150制剂在于40℃进行老化仅一个月后就展示出效能的显著降低。由于RT003和RTT150制剂是相同的(除了RT003制剂还包含具有式RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR的带正电荷的载体分子外)，因而这些数据表明所述带正电荷的载体分子改善在RT003制剂中肉毒杆菌毒素的稳定性。

表3

在各种条件下进行RT003和RTT150的老化后小鼠IP LD₅₀测定法的结果

实施例5

在眉间细纹处理中显示出长期持续时间的效应的可注射肉毒杆菌毒素制剂

该实施例描述了在第24周的临床研究和结果的中期分析，以评价称为RT002的本发明的可注射组合物的安全性、功效和效应持续时间，所述本发明的可注射组合物包含肉毒杆菌毒素A和带正电荷的载体，所述带正电荷的载体包含具有共价地附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸多肽。所述RT002产品是可注射制剂，其包含不与具有式RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR的带正电荷的载体肽共价地相结合的150kD亚型A肉毒杆菌毒素分子，并且其不包含在用于处理中度至严重眉间细纹的研究中所使用的附属蛋白质或源自动物的组分。

该临床研究是2期的、随机化的、双盲的、剂量变动的、活性产品和安慰剂-控制的、多中心的研究，其被设计并实施去评价用于在成人中临时改善眉间细纹外观的通过注射RT002来进行的单次(一次)处理的安全性和功效和效应持续时间。相比于活性产品即/(20U剂量，通过肌内注射)和安慰剂对照(肌内注射)而言来评价RT002的三个剂量，20U、40U和60U。所述注射处理是单次肌内注射。还评估了在所述三个剂量水平下RT002的单次处理的效应持续时间，相对于/Cosmetic。

所述RT002产品由配制成冻干粉末的经纯化的150kDa肉毒杆菌神经毒素(称为RTT150)组成。在非临床研究中，RT002已显示展示出比其他形式的肉毒杆菌神经毒素A(BoNTA)更少的扩散，并且可以在靶位点处提供更多的效应控制，且具有更少的副作用(其是由于毒素远距离散布入邻近的肌肉中)。另外，RT002这种没有添加剂的A型肉毒杆菌毒素制剂具有提供更小的免疫原性潜力的能力，这是由于在所述制剂中不存在非活性蛋白质。另外，在大鼠中在直至50U/kg的重复剂量肌内施用后，RT002被很好地耐受。

按剂量给药方案和注射技术：对于该研究，RT002的按剂量给药方案为RT002(20U、40U或60U)、安慰剂或/(其以20U/受试者进行按剂量给药)的单次处理，作为进入到经受处理的患者的在眉毛之间的前额上的5个注射位点中的每一个之中的0.1mL肌内注射(总共0.5mL)。所有处理都是由经训练的医师来实施的肌内注射。更特别地，研究受试者接受向五个注射位点的0.1mL/注射的单次处理：两次注射入每个皱眉肌中，和一次注射在降眉间肌中。调查者、现场工作人员、受试者和主办者对于处理组分配是不知情的。大约250名成年的女性和男性受试者(30至65岁且处于良好的总体健康，在进入时具有中度至严重的眉间细纹)被招收参加了本研究。

眉间脸部细纹源于在脸部中的侧面的皱眉肌和垂直的降眉间肌。这些可以通过在让患者最大程度地皱眉时进行肌肉块的触诊而容易地鉴定。皱眉肌压低皮肤，从而产生垂直的细纹，即由绷紧的肌肉的嵴所围绕的沟纹(即皱眉细纹)。由于肌肉的位置、大小和使用在个体之中明显地变化，因而施用可注射肉毒杆菌毒素的医师必须理解所涉及的区域的相关解剖学和由于先前的外科手术程序而引起的对于解剖学的任何改变。为了降低上睑下垂的风险，最佳地实施下列步骤：(i)应当避免上睑提肌的或在上睑提肌附近的注射，特别是在具有较大的降眉肌的患者中；(ii)正中的皱眉肌注射应当在骨质的眶上嵴之上至少1厘米处；(iii)应当确保所注射的体积/剂量是准确的；和(iv)毒素不应当于比在中央眉毛之上1厘米近之处进行注射。通过在上正中眼眶边缘上施加指压并同时将针头穿过皮肤推进到下面的肌肉中来注射肉毒杆菌毒素。

对于该研究，由调查者和受试者来评估受试者的眉间细纹的严重度。关于调查者评估，如下来使用“调查者总体评估-面部皱纹严重度(IGA-FWS)”评级得分系统：(0)的IGA-FWS评级得分表明没有面部皱纹严重度；(1)的IGA-FWS评级得分表明轻微的面部皱纹严重度；(2)的IGA-FWS评级得分表明中度的面部皱纹严重度；和(3)的IGA-FWS评级得分表明严重的面部皱纹严重度。如由熟练的开业医生所意识到的，照片指南展示出了用于调查者和参考的皱纹严重度的等级。

患者面部皱纹严重度(Patient Facial Wrinkle Severity，PFWS)评估：将患者面部皱纹严重度(PFWS)用于他的/她的面部皱纹严重度的受试者评估。受试者在最大皱眉下完成患者面部皱纹严重度(PFWS)，以在筛选就诊、处理就诊(第0天)(处理前)、随访就诊(第2、4、8、12、16、20、24、28、32周)和研究结束就诊(第24、28、32或36周，视情况而定)或早期中止就诊(若有可能)时评估眉间细纹的严重度。在使用所提供的手持式镜子来检查眉间细纹的时候，将评估表直接提供给受试者以进行填写。PFWS评级得分系统如下：(0)的PFWS评级得分表明没有皱纹严重度，具有“没有皱纹”的相关描述；(1)的PFWS评级得分表明轻微的皱纹严重度，具有“非常浅的皱纹”的相关描述；(2)的PFWS评级得分表明中度的皱纹严重度，具有“中度的皱纹”的相关描述；和(3)的PFWS评级得分表明严重的皱纹严重度，具有“深的皱纹”的相关描述。按照本研究，对于待被招收参加本研究的受试者来说，要求关于受试者的眉间细纹的(2)(中度的)的或(3)(严重的)的IGA-FWS和PFWS评级。

将受试者以1:1:1:1:1随机分至在下面的表4中所给出的处理之一中。

表4

处理组的描述

被招收参加本研究的受试者在整个直至36周的研究中具有筛选和处理就诊以及随访安全性和功效评价。在初始的2周时间段内提供受试者日记以记录处理应答的起始。在本研究的第1周用电话访问和在本研究的第2、4、8、12、16、20、24、28、32和36周在就诊期间对受试者进行评价。所有受试者在处理后被追踪至少24周。如果受试者在最大皱眉下的“调查者总体评估-面部皱纹严重度”(IGA-FWS)得分在24周就诊和36周就诊之间返回基线，那么记录那个得分时所处的就诊被认为对于该受试者来说是研究结束就诊。

研究持续时间为直至38周(进行研究中)，包括直至两周的筛选期，随后为单次处理，和处理后直至36周的随访期。所有受试者在处理后被追踪至少24周。在筛选就诊、处理就诊(第0天)(处理前和后(以确定是否存在对于调查产品的立即反应))、随访就诊(第2、4、8、12、16、20、24、28、32周)和研究结束就诊(第24、28、32或36周，视情况而定)或早期中止就诊(若有可能)时对注射位点进行评价。所述评估以5个注射位点的总体评价来进行，并且评价了红斑、水肿、烧灼或刺痛感和瘙痒，由受试者所描述。

另外，在处理就诊(第0天)(处理前)时、在随访就诊(第2、4、8、12、16、20、24、28、32周)时和在研究结束就诊(第24、28、32或36周，视情况而定)或早期中止就诊(若有可能)时由调查者来对脑神经II–VII进行评价。如下获取关于脑神经评估的得分：(1)的评级相应于“正常”；(2)的评级相应于“不正常，不是在临床上显著的”；(3)的评级相应于“不正常，在临床上显著的”；(4)的评级相应于“未评估”。对于这些评估，脑神经II是视神经；脑神经III是动眼神经；脑神经IV是滑车神经；脑神经V是三叉神经；脑神经VI是展神经；和脑神经VII是面神经。区域House-Brackmann面神经分级系统(Regional House-Brackmann FacialNerve Grading System)(Yen,T.L.等人,2003,Otol.Neurotol.,24(1):118-122)被设计用于评价联带运动和使靶标和邻近的肌肉系统受神经支配的面神经(VII)的四个主要分支。调查者在处理就诊(第0天)(处理前)、随访就诊(第2、4、8、12、16、20、24、28、32周)和研究结束就诊(第24、28、32或36周，视情况而定)或早期中止就诊(若有可能)时对面神经(VII)的功能性进行评价。

使用“关于肌肉力量评估的医学研究委员会(MRC)量表”(Medical ResearchCouncil Scale for Assessment of Muscle Power)来评价面部肌力。MRC是用于评估肌无力的可靠且经验证的量表，并且有助于周围神经损伤的调查(Paternostro-Sluga,2008)。评价了在脸的每一侧上的眼轮匝肌(眼睑)、侧提眉肌和侧颧轮匝肌。在用于肌肉力量评估的MRC量表中，(0)的评级相应于“无运动”；(1)的评级相应于“肌肉中可感知的颤动”；(2)的评级相应于“只有当去除重力时才有运动”；(3)的评级相应于“可以对抗重力移动四肢”；(4)的评级相应于“可以对抗重力和一些由检查者所施加的阻力进行移动”；和(5)的评级相应于“正常力量”。

在处理就诊(第0天)(处理后)、随访电话访问(第1周)、随访就诊(第2、4、8、12、16、20、24、28、32周)和研究结束就诊(第24、28、32或36周，视情况而定)或早期中止就诊(若有可能)时对受试者进行毒素远距离散布询问。另外，在这些相同的时间点还评价了不利事件(AE)。不希望是限制性的，AE的例子包括复视、眼睑麻痹、肌无力、极度疲劳以及吞咽、呼吸和说话困难。

功效评估包括眉间细纹严重度和眉间细纹改善量表的调查者评估，眉间细纹严重度和改善的受试者评估，包括受试者问卷，和通过受试者日记所评价的效应的起始。对处于坐姿的受试者进行功效评估。为了在评估期间具有一致的眼睛位置布置，调查者要求受试者聚焦在检查室中的固定点上。所述评估应当在具有良好的头顶照明(不应当使用检查灯)或来自窗户的自然光(但不是直接的阳光)的房间中进行。在每次门诊就诊时，由调查者来评估眉间细纹的目视外观(在最大皱眉下和在最大皱眉后休息的情况下)，其中使用如下的用于脸部皱纹严重度得分的适合于目的的4点IGA-FWS量表/评级得分：(0)的评级得分相应于没有脸部皱纹；(1)的评级得分相应于轻微的脸部皱纹；(2)的评级得分相应于中度的脸部皱纹；和(3)的评级得分相应于严重的脸部皱纹。所述评估描绘了在每个给定时间点处的皱纹严重度，并且不是基于与处理前水平的比较。最佳地，由相同的调查者并且在每次就诊时在尽可能接近于一天中的相同时刻来完成评估。在使调查者之间的皱纹严重度评级标准化的努力中，将一套展示出皱纹严重度等级的训练照片用于调查者训练。还给每个研究中心提供照片指南以协助调查者的评估。

“患者总体美学改善量表(Patient Global Aesthetic Improvement Scale)”(GAIS)：调查者和受试者通过使用在下面的表5中所显示的7点严重度“患者总体美学改善量表”(GAIS)来评估从基线状况起的眉间细纹改善的目视外观(在最大皱眉下和在最大皱眉后休息的情况下)。研究受试者在最大皱眉下和在最大皱眉后休息的情况下填写“患者总体美学改善量表”(GAIS)，以在随访就诊(第2、4、8、12、16、20、24、28、32周)和研究结束就诊(第24、28、32或36周，视情况而定)或早期中止就诊(若有可能)时评估从基线状况起的眉间细纹改善的目视外观。在使用所提供的手持式镜子来检查所处理的区域的时候，将GAIS评估表直接提供给受试者以进行填写。具有隐形眼镜的受试者最佳地在佩戴其隐形眼镜的时候查看其眉间细纹。建议佩戴眼镜的受试者在没有眼镜的情况下查看其眉间细纹，如果可能。如果对于受试者来说需要眼镜以看清其眉间细纹，那么就佩戴眼镜来进行评估。受试者评估在调查者完成IGA-FWS评估之前完成。

表5

总体美学改善量表

评级得分	皱纹改善
		-3	非常大程度地变差
-2	大程度地变差
		-1	变差
0	没有变化
		1	经改善
2	大程度地经改善
		3	非常大程度地经改善

在每次门诊就诊时，受试者通过使用下面的用于患者面部皱纹严重度的受试者评估的适合于目的的4点量表(下面的表6)来评估眉间细纹的目视外观(在最大皱眉下)。在使用所提供的手持式镜子来检查眉间处理区域的时候，将评估表直接提供给受试者以进行填写。关于上面的GAIS评估，具有隐形眼镜的受试者最佳地在佩戴其隐形眼镜的时候查看其眉间细纹。建议佩戴眼镜的受试者在没有眼镜的情况下查看其眉间细纹，如果可能。如果对于受试者来说需要眼镜以看清其眉间细纹，那么就佩戴眼镜来进行评估。受试者评估在调查者完成IGA-FWS评估之前完成。所述评估描绘了在每个给定时间点处的皱纹严重度，并且不是基于与处理前缺陷水平的比较。最佳地，由受试者在每次就诊时在尽可能接近于相同时刻来完成评估。

表6

患者面部皱纹严重度(PFWS)

评级得分	皱纹严重度	描述
			0	无	没有皱纹
1	轻微	非常浅的皱纹
			2	中度	中度的皱纹
3	严重	深的皱纹

在该研究期间额外的受试者评估包括：在选择美学处理时效应持续时间的重要性的评级(在处理就诊(第0天)时提供的)；受试者对处理结果的满意度的评级(在第4周就诊时)，以问卷的形式以便对他们对处理结果的满意度进行评级–受试者被问及他们对脸部的经处理的区域的外观如何满意或不满意；和他们对处理效应持续时间的满意度的评级(在研究结束就诊(第24、28、32或36周，视情况而定)或早期中止就诊(若有可能)时)。

在处理就诊(第0天)(处理前)、随访就诊(第2、4、8、12、16、20、24、28、32周)和研究结束就诊(第24、28、32或36周，视情况而定)或早期中止就诊时获取处理区域的数码照片。以受控和标准化的方式获取数码照片。向现场工作人员和调查者提供参考照片和合适的训练。最佳地，受试者不佩戴任何类型的眼睛或面部装饰品。为了使来自皮肤的光反射最小化，在获取任何照片之前用酒精片对经处理的区域进行擦吸清洁并让其干燥以去除皮肤油脂。照片包括在最大皱眉下和在最大皱眉后休息的情况下受试者的前额视图。

统计学分析：所有统计学程序设计和分析均通过使用9.3版本或更高版本的SAS来进行。由于该研究没有被赋予检测处于0.05水平的在处理组之间的任何在统计学上显著的差异的能力，因此期望从下面所描述的各种测试中所获得的p-值去建立统计学趋势。没有对测试的多重性进行调整。对于意向处理(intent-to-treat，ITT)群体、符合方案(per-protocol，PP)群体和安全性群体总结了人口统计和基线特征。由处理组以及由处理组和地理学/国家，在所有时间点对于所有功效变量提供了描述性的统计学。对于ITT和PP群体进行了功效分析。安全性分析在安全性群体上进行。

群体：所有被随机分组并接受处理的受试者被包括在意向处理(ITT)群体中。所有被随机分组、接受处理并已提供至少一个处理后安全性评估的受试者被包括在安全性群体中。符合方案(PP)群体包括完成了24-周评价而没有重大的方案违反的来自ITT群体的受试者。因下列原因中的任一个而从PP群体中排除受试者：(i)受试者违反纳入/排除标准；(ii)受试者错过了第24周就诊；(iii)受试者使用了被禁止的药物；(iv)受试者的第24周就诊在计划表外±5天(在经计划安排的就诊日方面被允许的变化之外)。

关于安全性组和功效比较，将受试者随机分入5个处理组(RT002 20 U；RT002 40U；RT002 60 U；安慰剂；活性比较物)。在每个RT002剂量与活性比较物之间，在每个RT002剂量与安慰剂之间，以及在活性比较物与安慰剂之间进行主要功效比较。评价风险收益比以检查在关键研究评价(在第6个月时的应答者比例和直至36周所测量的应答持续时间；AE的频次)方面相对于活性比较物而言有利于所述RT002剂量中的至少一个的趋势。

在每个处理组内，对于ITT群体的关于IGA-FWS、PFWS和GAIS的缺失的得分通过马尔科夫链蒙特卡洛(Markov Chain Monte Carlo，MCMC)多重填补法(multipleimputation)来进行填补以用于基于应答者比例的分析。关于主要终点的灵敏度分析通过使用基于末次观察结果结转法(last observation carried forward method)的填补来进行。

使用描述性的统计学来总结人口统计特征(例如，年龄、性别、种族等)和背景特征(例如，IGA-FWS、PFWS等)。对于所有受试者总结过去或正在进行的医疗史、研究就诊顺从性以及先前和伴随的药物使用，并且由受试者呈现在列表中。

功效：关于功效，由通过使用IGA-FWS来对在最大皱眉下受试者的眉间细纹的严重度进行分级的不知情的评价者来评估主要临床功效。应答者被定义为这样的受试者，其在IGA-FWS方面相对于基线而言具有一个点或更大的改善，并且其在评价的时间点没有返回基线IGA-FWS。为了主要分析的目的，在第24周在每个RT002剂量与活性比较物之间比较应答者比例。将每个RT002处理组分开地与安慰剂和活性比较物进行比较。还在每次就诊时将活性比较物与安慰剂进行比较。用通过基线IGA-FWS进行分层的Cochran-Mantel-Haenszel(CMH)检验来进行比较。

为了主要分析的目的，通过使用卡-迈(Kaplan-Meier)方法在每个所述RT002剂量与活性比较物之间比较应答持续时间。从注射的时刻至受试者恢复至其基线严重度(如由不知情的调查者基于IGA-FWS所测量的)时所处的时间点，测量应答持续时间。如果受试者在第4周之时或之前未取得离基线一个点的改善(通过IGA-FWS)，那么就认为应答持续时间为零。如果受试者在第4周之时或之前取得了至少1个点的改善(基于IGA-FWS)，但是到第36周(最后的时间点)前未恢复至其基线，那么在第36周(最后评价的日期)时审查这样的受试者以用于分析。使用时序检验来在RT002与活性比较物之间比较应答持续时间。关于每个处理组所计算出的风险收益比等于处理相关的不利事件的数目之和除以关于在处理组中的受试者的应答持续时间的天数之和。如果受试者在第4周之时或之前取得了至少1个点的改善(基于IGA-FWS)但是到第36周(最后的时间点)前未恢复至其基线，那么他/她对于收益总和的贡献为在基线和最后就诊日之间的天数。

关于次要分析，所使用的次要终点如下进行定义：

(1)在第2周时和在第4-36周时的应答者比例，其中重点在于第12周和第24周的评价。在处理组之间的比较基于通过所分析的变量的基线严重度进行分层的CMH检验，在可能的情况下。对于具有基线严重度(其可能允许对于成功所需要的改善)的那些受试者，将每个处理组与安慰剂进行比较和分开地与活性比较物进行比较。还在每次就诊时将活性比较物与安慰剂进行比较。

基于几个定义来对应答者进行评价：(i)相对于基线而言改善了至少2个点(基于IGA-FWS)的那些；(ii)相对于基线而言改善了至少1个点(基于IGA-FWS)的那些；(iii)具有0或1的IGA-FWS得分的那些；(iv)改善了至少1个点(基于PFWS)的那些；(v)改善了至少2个点(基于PFWS)的那些；(vi)在GAIS量表上具有至少1的得分的那些。

(2)基于应答持续时间的各种定义的次要终点。给在第4周前未取得在下面的每个定义中所指定的改善的受试者分配0的持续时间；在第36周(最后评价的日期)时审查取得了下面所定义的改善但是到第36周前未恢复回基线的受试者。使用时序检验来对处理组进行比较。对于每个定义和处理组，如上面所描述的那样来计算风险收益比。关于应答持续时间的定义包括：(i)从注射至小于1的GAIS得分的时间，关于在GAIS中具有至少1个点的改善的应答者定义；(ii)从注射至恢复至基线的时间，关于在IGA-FWS中具有至少2个点的改善的应答者定义；(iii)从注射至恢复至基线的时间，关于在PFWS中具有至少1个点的改善的应答者定义；(iv)从注射至恢复至基线的时间，关于在PFWS中具有至少2个点的改善的应答者定义；(v)从注射至恢复至基线的时间，关于在IGA-FWS中具有至少1个点的改善的应答者定义，其中使用具有关于处理、基线严重度和处理/基线严重度相互作用的项目的比例危险模型；和(vi)从注射至恢复至基线的时间，关于在PFWS中具有至少1个点的改善的应答者定义，其中使用具有关于处理、基线严重度和处理/基线严重度相互作用的项目的比例危险模型。进行探索性分析以将受试者的GAIS评估得分与应答者比率(其基于PFWS，关于1-点和2-点变化这两者)相关联。使用相关分析和逻辑斯谛回归，视情况而定。

关于眉间细纹处理的中期分析和研究结果

当100％的受试者已完成(或者先前已中止)第12周就诊时，进行主要变量的中期分析。所述分析对于在主要终点中所定义的应答者比例提供了具有95％置信区间的点估计。还对于在活性比较物(处理组5)与每个活性产品处理组RT002 20U、RT002 40U和RT00260U(处理组1、2和3)之间的应答者比例的差异提供了具有95％置信区间的点估计。当75％的受试者已分别完成这些就诊时，对于第12周和第24周就诊进行次要功效终点的中期分析。关于安全性和功效在第24周进行的中期分析包括至少75％(实际100％)的已完成或先前已中止第24周就诊的受试者。所述分析还包括主要和次要功效终点(在最大皱眉下)和安全性数据。到中期分析的时刻为止，工作人员和受试者仍然是不知情的。结果概括在本文下面。

功效：以在IGA-FWS上具有1-点改善的28-天主要功效终点，RT002在所有剂量组中取得100％的应答率。(关于患者成功的占位符)。RT002剂量比 Cosmetic更长地保持了1-点收益。RT002以优于 Cosmetic的方式运作，如通过没有皱纹或具有轻微的皱纹的患者的百分比所测量的。在第16周，相比于用 Cosmetic进行的处理而言，多于两倍的用RT002 40U和60U进行处理的受试者保持没有皱纹或具有轻微的皱纹(按照IGA-FWS评分系统)(P<0.05)。在第16周，相比于 Cosmetic而言，没有皱纹或具有轻微的皱纹(按照IGA-FWS评分系统)的受试者的百分比在所有三个RT002剂量组中均是在统计学上更高的。在第16周后的所有时间点，相比于 Cosmetic处理组而言，没有皱纹或具有轻微的皱纹(按照IGA-FWS评分系统)的受试者的百分比在RT002 40U剂量组中是在统计学上更高的。

患者数据：患者报告的后果支持了关于RT002处理的持续时间和功效的调查者发现。在24周(6个月)时，40U RT002剂量继续给出在“受试者总体美学改善量表(SubjectGlobal Aesthetic Improvement Scale)”(GAIS)中的在临床上有意义的更高的应答率，其中46.3％的经RT002 40U处理的受试者具有至少1的评价得分，而31％的经Cosmetic处理的受试者具有至少1的评价得分。在第16周，相比于 Cosmetic的“直至120天”的持续时间(基于其标签信息)而言，RT002 40U剂量取得了在统计学上显著的更高的应答率，如通过在“患者皱纹严重度(PWS)量表”上具有至少1-点改善和在“受试者总体美学改善量表”上具有至少1-点评级所测量的。76.9％的用RT002 40U进行处理的受试者保持了在PWS中的至少1-点改善，相比于58.5％的用 Cosmetic进行处理的受试者而言。另外，89.7％的用RT002 40U进行处理的受试者保持了在GAIS中的至少1-点得分，相比于70.7％的用 Cosmetic进行处理的受试者而言。

安全性：RT002产品展示出与 Cosmetic高度相当的安全性和功效特性谱。不利事件通常是轻微的，并且主要与来自注射本身的效应相关联。所有RT002剂量组均展示出优异的总安全性特性谱，其中具有大部分地局部化的、暂时的和在严重性方面轻微的AE。在任何活性产品剂量组中没有严重的AE发生。20U和40U RT002剂量组被很好地耐受，并且就引起上睑下垂而言在临床上优于另外，RT002在20U和40U剂量下展示出更少的向下散布。20U和40U剂量这两者在任何时间点处在任何用那些剂量的RT002进行处理的患者中均不引起上睑下垂，相比于在经 Cosmetic处理的组中的1.9％而言。在RT002 60U处理组的受试者中观察到5.7％的上睑下垂率。这些本质上是暂时的，如用处理时典型地看到的那样。RT002的减少的扩散与非临床的和先前的研究相一致，并且支持了毒素的减少的散布，如在用本发明的组合物进行处理的受试者中所观察到的，所述本发明的组合物，例如RT002，包含在本文中所描述的肉毒杆菌毒素例如肉毒杆菌毒素A，和带正电荷的载体(其包含具有一个或多个共价地附着的带正电荷的效力基团的主链，例如聚赖氨酸)。

剂量和效应持续时间：不希望是限制性的，中期分析结果支选择持40U的剂量作为用于用本发明的含肉毒杆菌毒素的组合物进行单次处理的最佳剂量，基于高的应答者比率、效应持续时间和正面的安全性特性谱。另外，本发明的组合物，例如RT002，在通过注射向受试者进行施用后，具有持久的和长期的效应持续时间，例如至少6个月。如从研究结果的中期分析中所确定的，用RT002产品对受试者的眉间细纹进行的处理取得了更优的效应持续时间，当与用 Cosmetic对受试者中的眉间细纹进行的处理相比较时。的确，基于卡-迈分析方法，证明了在RT002 40U剂量组中在IGA上具有1-点改善的5.9个月的平均持续时间(23.6周)，相对于在用 Cosmetic进行处理的受试者中的18.8周的持续时间而言(p＝0.020)(参见例如图4A和4B)。需注意的是，在第6个月，从持续时间的中期分析中审查了重大数目的经RT002处理的受试者，因为他们仍然是应答者。在第6个月，接近三分之一(～33％)的在RT002 40 U处理组中的受试者在单次处理后仍然不具有或几乎不具有皱纹，相对于在 Cosmetic处理组中12％的受试者而言(p＝0.041)。进一步地，该高剂量组在处理后32周内进行追踪以评估应答持续时间，并且取得了29.4周或7.3个月的平均持续时间，基于调查者评估和受试者评估两者。

由本发明的组合物(例如RT002)以及其处理方法和用途所提供的效应持续时间提供了优点，因为经受处理的受试者认为对于美学处理而言，在处理后的效应持续时间对他们来说具有高度的重要性。这样的长的、持久的效应持续时间(特别地通过产品即RT002的单次或一次注射剂量所取得的)允许对于受试者的更少的注射/处理过程，这对于受试者的舒适、方便和总体福利来说是重要的。提供在通过向受试者注射产品的单次处理剂量后保持至少6个月时间段的显著且持久的效应的产品为开业医生和患者两者提供了对于本领域中未满足的需要的解决方案。

中期结果的概括：结果证明，由RT002产品所代表的本发明的组合物经证实优于 Cosmetic，如通过在IGA-FWS上具有1-点和2-点改善的平均效应持续时间和应答者比率，和取得并保持没有皱纹或轻微的皱纹(依照上面所描述的IGA-FWS评分系统)的患者的百分比所测量的。关于在28天时在IGA-FWS上具有1-点改善的主要功效终点，所述研究取得了在统计学上显著的结果。第24周中期分析证明了相对于用Cosmetic进行的注射而言，在通过用所注射的RT002的剂量对受试者进行的单次处理所提供的结果中的在临床上有意义的差别。

如也通过中期分析所确定的，RT002取得了大约6个月的效应持续时间，其中具有高的应答者比率。RT002取得了相比于 Cosmetic而言更优的效应持续时间，其中基于卡-迈分析方法，证明了在40U剂量组中基于“调查者总体评估-面部皱纹严重度”(IGA-FWS)量表在眉间细纹方面具有1-点改善的5.9个月的平均持续时间(23.6周)，相对于关于 Cosmetic的18.8周而言(p＝0.020)。在24周(6个月)时，剂量为40U和60U的RT002继续给出在临床上有意义的更高的应答率，其中分别35.9％和29.3％的受试者保持1-点改善，相对于19％的经 Cosmetic处理的受试者而言。RT002取得了在28天时在调查者量表(IGA-FWS)上具有至少1-点改善的其主要功效终点，以及患者报告了后果。以在“调查者总体评估-面部皱纹严重度量表”(IGA-FWS)上具有1-点改善的28-天主要功效终点，RT002在所有剂量组中取得了100％的应答率。以在“患者面部皱纹量表”上具有1-点改善的28-天主要功效终点，RT002在所有剂量处理组中取得了大于97％的应答率。功效数据显示，96％的受试者在处理后4周通过临床调查者评估被评级为在最大皱眉下“没有皱纹”或“轻微的皱纹”的严重度，和83％的受试者评估自己为在相同的时间点取得在最大皱眉下“没有皱纹”或“轻微的皱纹”。RT002被很好地耐受，并且没有发现严重的不利事件。在RT002 20U或40U剂量处理组中的受试者之中没有出现眼睑的上睑下垂。在该研究中观察到了剂量应答；施用了40U剂量的RT002的受试者显示出特别高的应答率。

总的来说，用于注射的DaxibotulinumtoxinA在所有剂量水平上都被很好地耐受，没有任何全身或局部安全性担忧或散布的证据。用于注射的RTT150在临床试验中被很好地耐受，在任何剂量下都没有散布越过处理位点的证据。在1/2期剂量逐步升高的开放标签临床试验RT002-CL001中的不利事件通常是轻微的、局部化的和暂时的。所观察到的最普遍的不利事件是头痛和注射位点反应。在任何群组中没有受试者经历上睑下垂。不存在严重的不利事件，并且不利事件率并不随着增加的剂量而在频次、严重度或类型方面发生变化。三十四(34)名受试者报告了131次AE。所报告的最普遍的不利事件为头痛(31次报告；17名受试者)；注射位点瘙痒(34次事件；8名受试者)；注射位点疼痛(烧灼)(14次事件；6名受试者)；和眼睛病症(14次事件；5名受试者)。除了不利事件外，在RT002-CL001研究中的安全性评价包括临床实验室测试(血液学、化学、尿分析和凝血酶原时间)、关于RTT150毒素和RTP004肽的血清抗体、脑神经II-VII和面部肌力的评估、伴随疗法药物治疗和对于具有分娩可能性的女性的尿液妊娠测试。在任何剂量下都不存在散布越过处理位点的证据，和不存在任何全身暴露的证据，基于临床实验室结果和身体评估。关于对于毒素和肽两者的抗体，所有受试者都是阴性的。

实施例6

关于在眉间细纹处理中显示出长期持续时间的效应的可注射肉毒杆菌毒素制剂的随访研究

还于在加拿大的2期的、剂量变动的、活性产品和安慰剂-控制的临床试验RT002-CL002中评价了RT002，以评价用于在成人中处理中度至严重的眉间细纹的单次施用的安全性、功效和持续时间。该试验招收了268名受试者(超过50名/处理组)，他们用20、40或60U的RT002，20U的BOTOX Cosmetic，或安慰剂来进行处理。关于眉间细纹的处理，在该临床试验中所建议的按剂量给药方案为20、40或60个单位/受试者的单次处理，进入到在前额上的5个注射位点中的每一个之中的0.1mL肌内注射。基于目前的盐水效能法的16、32、48或64U(相应于在以前的明胶磷酸盐缓冲液效能法中的25、50、75和100U)的剂量在1/2期临床试验(RT002-CL001研究；12名受试者/剂量组；总共48名受试者)中被很好地耐受。

中期数据显示，在4周时，对于所有三个剂量，RT002取得了其主要功效测量结果。该研究证明了6个月的RT002平均效应持续时间，基于在“调查者总体评估-面部皱纹严重度”量表上的在最大皱眉下在眉间细纹方面的至少1-点改善。受试者报告的后果与关于RT002的持续时间和功效的调查者发现相一致。在所有群组中，RT002看起来通常是安全的和被很好地耐受。不利事件通常是轻微的、局部化的和暂时的。在所评价的三个剂量中的任一个下都不存在严重的不利事件或者任何全身暴露的证据。

Claims

1.施用肉毒杆菌毒素以在个体中取得持续时间延长的治疗或美容效应的方法，所述方法包括：

通过注射来将无菌可注射组合物的第一处理剂量施用到需要处理的个体的区域中，以在用所述组合物进行的第一处理后取得治疗或美容效应；

其中所述组合物包含：

适合于注射的在药学上可接受的稀释剂；和

肉毒杆菌毒素组分，其选自由肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物组成的组；和

带正电荷的载体组分，其包含具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q、(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q或(gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q的氨基酸序列，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；

其中以20U至60U的处理剂量将所述肉毒杆菌毒素组分施用给所述个体；

其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素组分非共价地相结合；并且

其中通过注射向所述个体施用的所述组合物的所述第一处理剂量取得具有至少大约6个月至大约10个月效应持续时间的持续时间延长的治疗或美容效应，任选地在施用第二或随后处理剂量之前。

2.在有此需要的个体中减少皱纹、细纹或沟纹的方法，所述方法包括：

作为单剂量注射向所述个体施用组合物，所述组合物包含：

用于注射的在药学上可接受的稀释剂；

其中以20U至60U的量将所述肉毒杆菌毒素施用给所述个体；

其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌组分非共价地相结合；并且

其中所述组合物的所述单剂量注射在所述个体中减少皱纹、细纹或沟纹方面提供具有至少大约6个月至大约10个月效应持续时间的单次处理，从而对于所述个体延长了处理间隔持续时间。

3.在无菌可注射制剂中的药物组合物，其用途为用于在施用肉毒杆菌毒素以在个体中取得持续时间延长的治疗或美容效应之中使用，

所述组合物包含：

适合于注射的在药学上可接受的稀释剂；

以20U至60U的处理剂量的肉毒杆菌毒素组分，其中所述肉毒杆菌毒素组分选自由肉毒杆菌毒素复合物、缩减型肉毒杆菌毒素复合物或肉毒杆菌毒素组成的组；和

其中所述组合物的所述处理剂量在通过注射而施用了所述制剂的个体中取得具有至少大约6个月至大约10个月效应持续时间的持续时间延长的治疗或美容效应。

4.在无菌可注射制剂中的药物组合物，其用途为用于在有此需要的个体中减少皱纹、细纹或沟纹之中使用，

所述组合物包含：

以20U至60U的剂量的肉毒杆菌毒素组分，所述肉毒杆菌毒素组分选自由肉毒杆菌毒素复合物、缩减型肉毒杆菌毒素复合物或肉毒杆菌毒素组成的组；

带正电荷的载体组分，其包含具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q、(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q或(gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q的氨基酸序列，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；和

用于注射的在药学上可接受的稀释剂；

其中所述组合物的所述剂量在所述个体中减少皱纹、细纹或沟纹方面提供具有至少大约6个月至大约10个月效应持续时间的单次处理，从而对于所述个体延长了处理间隔持续时间。

5.根据权利要求1或权利要求2的方法，或者根据权利要求3或权利要求4的用于所述用途的药物组合物，其中所述组合物减少在所述个体的面部中的眉间细纹。

6.根据权利要求5的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述组合物包含血清型A的肉毒杆菌毒素。

7.根据权利要求6的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述组合物包含具有150kDa的分子量的血清型A的肉毒杆菌毒素。

8.根据权利要求1至7中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的聚赖氨酸主链具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。

9.根据权利要求1至7中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的聚赖氨酸主链具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。

10.根据权利要求1至7中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的聚赖氨酸主链具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。

11.根据权利要求1至10中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中下标p和q(i)各自独立地为0至8的整数，或(ii)各自独立地为2至5的整数。

12.根据权利要求1至11中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述一个或多个带正电荷的效力基团附着至所述带正电荷的载体的所述带正电荷的聚赖氨酸主链的任一末端或两个末端。

13.根据权利要求12的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR。

14.根据权利要求1至13中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述组合物在注射后不从注射位点局部地扩散。

15.用根据权利要求1至14中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中以20U的量将所述肉毒杆菌毒素施用给所述个体。

16.用根据权利要求1至14中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中以40U的量将所述肉毒杆菌毒素施用给所述个体。

17.用根据权利要求1至14中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中以60U的量将所述肉毒杆菌毒素施用给所述个体。

18.根据权利要求1的方法或者根据权利要求3的用于所述用途的药物组合物，其中所述治疗效应为与从由下列各项组成的组中选择的病症相关联的症状的减轻：半面痉挛、成人发作的痉挛性斜颈、肛裂、睑痉挛、脑性瘫痪、头痛、斜视、颞下颌关节病症、神经性痛、膀胱过度活动症、鼻炎、鼻窦炎、痤疮、张力障碍、张力障碍性收缩、多汗症和由胆碱能神经系统控制的腺体的分泌过多。

19.根据权利要求1的方法或者根据权利要求3的用于所述用途的药物组合物，其中所述治疗或美容效应为在所述个体中皱纹、细纹或沟纹的处理或减少。

20.根据权利要求1至19中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述处理效应持续时间包括大于3个月。

21.根据权利要求1至19中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述处理效应持续时间包括大于4个月。

22.根据权利要求1至19中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述处理效应持续时间包括大于5个月。

23.根据权利要求1至19中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述处理效应持续时间包括大于6个月。

24.根据权利要求1至19中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述处理效应持续时间包括大于7个月。

25.根据权利要求1至19中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述处理效应持续时间包括大于8个月。

26.根据权利要求1至19中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述处理效应持续时间包括大于9个月。

27.根据权利要求1至19中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述处理效应持续时间包括至少6个月至10个月。

28.无菌可注射组合物，其包含：

以选自20U、40U或60U的剂量数量的肉毒杆菌毒素组分，其选自由肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物组成的组；和

用于注射的在药学上可接受的稀释剂；

其中所述组合物提供在用所述可注射组合物对个体进行单次处理后持续至少20至24周的美容或治疗效应。

29.根据权利要求28的组合物，其中所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR。

30.根据权利要求28或权利要求29的组合物，其中所述组合物包含血清型A的肉毒杆菌毒素。

31.根据权利要求30的组合物，其中所述组合物包含具有150kDa的分子量的血清型A的肉毒杆菌毒素。

32.根据权利要求28至31中任一项的组合物，其中以20U的剂量数量将所述肉毒杆菌毒素施用给所述个体。

33.根据权利要求28至31中任一项的组合物，其中以40U的剂量数量将所述肉毒杆菌毒素施用给所述个体。

34.根据权利要求28至31中任一项的组合物，其中以60U的剂量数量将所述肉毒杆菌毒素施用给所述个体。

35.用可注射肉毒杆菌毒素处理需要处理的个体的方法，其中所述处理方法包括具有多个处理间隔的处理过程，其具有延长的效应持续时间和在每个处理间隔之间的持续时间，所述处理过程包括：

通过注射来将无菌可注射组合物的初始处理剂量施用到需要处理的个体的区域中，以在用所述组合物进行的初始处理后取得治疗或美容效应；

其中所述组合物包含：

适合于注射的在药学上可接受的稀释剂；

带正电荷的载体组分，其包含具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q、(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q或(gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q的氨基酸序列，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；并且

其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素组分非共价地相结合；

其中通过注射向所述个体施用的所述组合物的所述初始处理剂量提供持续直至至少大约10个月的治疗或美容效应持续时间；以及

在所述初始处理剂量后和在每个随后处理剂量之间，以包括大于或等于3个月至至少大约10个月的持续时间的处理间隔，通过注射来将所述组合物的随后处理剂量施用给所述个体。

36.根据权利要求35的方法，其中所述治疗或美容效应为皱纹、细纹或沟纹的处理或减少。

37.根据权利要求36的方法，其中所述治疗或美容效应为在所述个体的面部中的眉间细纹的减少。

38.根据权利要求35至权利要求37中任一项的方法，其中所述组合物包含血清型A的肉毒杆菌毒素。

39.根据权利要求38的方法，其中所述组合物包含具有150kDa的分子量的血清型A的肉毒杆菌毒素。

40.根据权利要求35至39中任一项的方法，其中所述带正电荷的聚赖氨酸主链具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。

41.根据权利要求35至39中任一项的方法，其中所述带正电荷的聚赖氨酸主链具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。

42.根据权利要求35至39中任一项的方法，其中所述带正电荷的聚赖氨酸主链具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。

43.根据权利要求35至42中任一项的方法，其中下标p和q(i)各自独立地为0至8的整数，或(ii)各自独立地为2至5的整数。

44.根据权利要求35至43中任一项的方法，其中所述一个或多个带正电荷的效力基团附着至所述带正电荷的载体的所述带正电荷的聚赖氨酸主链的任一末端或两个末端。

45.根据权利要求35至39中任一项的方法，其中所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)₁₅-GRKKRRQRRR。

46.根据权利要求35至45中任一项的方法，其中所述组合物在注射后不从注射位点局部地扩散。

47.根据权利要求35至46中任一项的方法，其中以20U的量将所述肉毒杆菌毒素施用给所述个体。

48.根据权利要求35至46中任一项的方法，其中以40U的量将所述肉毒杆菌毒素施用给所述个体。

49.根据权利要求35至46中任一项的方法，其中以60U的量将所述肉毒杆菌毒素施用给所述个体。

50.根据权利要求35的方法，其中所述治疗效应为与从由下列各项组成的组中选择的病症相关联的症状的减轻：半面痉挛、成人发作的痉挛性斜颈、肛裂、睑痉挛、脑性瘫痪、头痛、斜视、颞下颌关节病症、神经性痛、膀胱过度活动症、鼻炎、鼻窦炎、痤疮、张力障碍、张力障碍性收缩、多汗症和由胆碱能神经系统控制的腺体的分泌过多。

51.根据权利要求35至50中任一项的方法，其中所述处理间隔的持续时间包括大于3个月。

52.根据权利要求35至50中任一项的方法，其中所述处理间隔的持续时间包括大于4个月。

53.根据权利要求35至50中任一项的方法，其中所述处理间隔的持续时间包括大于5个月。

54.根据权利要求35至50中任一项的方法，其中所述处理间隔的持续时间包括大于6个月。

55.根据权利要求35至50中任一项的方法，其中所述处理间隔的持续时间包括大于7个月。

56.根据权利要求35至50中任一项的方法，其中所述处理间隔的持续时间包括大于8个月。

57.根据权利要求35至50中任一项的方法，其中所述处理间隔的持续时间包括大于9个月。

58.根据权利要求35至50中任一项的方法，其中所述处理间隔的持续时间包括至少6个至10个月。