CN111655279A - 具有高应答率和长效应持续时间的可注射的肉毒杆菌毒素制剂及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供包含肉毒杆菌毒素的可注射组合物，其可以被施用给受试者以为了各种治疗、美学和/或美容目的。由本发明所包括的可注射组合物展示出一个或多个超过传统肉毒杆菌毒素制剂的优点，包括降低的抗原性、降低的在注射后经历不想要的局部扩散的倾向、增加的临床效应持续时间或增强的效能、更快的临床功效起始和/或经改善的稳定性。根据本发明，通过注射的所述组合物的单次处理在经受处理的受试者中提供显著的临床应答和至少26周的效应持续时间，如由所描述的处理方法所提供的，以及在后续处理之后仍然更高的应答率和/或更长的效应持续时间。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求Rubio于2017年12月4日提交的发明名称“具有高应答率和长作用持续时间的可注射的肉毒杆菌毒素配方及其使用方法 (Injectable Botulinum ToxinFormulations and Methods of Use Thereof Having High Response Rate and LongDuration of Effect)”的美国临时专利申请No.62/594,529的优先权的权益，和要求Rubio于2018年12 月3日提交的发明名称“具有高应答率和长作用持续时间的可注射的肉毒杆菌毒素配方及其使用方法(Injectable Botulinum Toxin Formulations and Methods ofUse Thereof Having High Response Rate and Long Duration of Effect)“的美国临时专利申请No.62/774,850的优先权的权益。
发明领域
本发明涉及包含肉毒杆菌毒素的可注射组合物，其可以施用至受试者用于各种治疗、美容和/或美容目的。所述可注射组合物和其中使用这些组合物的方法提供了有利的治疗，其产生更高应答率和更长作用持续时间，例如作用持续时间26至40周，以及在随后治疗之后仍然更高的应答率和/或更长的作用持续时间。
发明背景
皮肤保护身体的器官免于外部环境威胁和充当恒温器以维持体温。它由数个不同层组成，每层具有专门的功能。主要的层包括表皮、真皮和皮下组织。表皮为分层性上皮细胞层，其覆盖在由结缔组织组成的真皮上面。表皮和真皮都由皮下组织(内部的脂肪组织层)来进一步支持。
表皮，皮肤的最上层，仅为0.1至1.5毫米厚(Inlander,Skin,New York,N.Y.:People's Medical Society,1-7(1998))。它由角质形成细胞组成，并且被分为数个层(基于其分化状态)。表皮可以进一步被分类为角质层和活表皮，其由颗粒状马尔皮基氏细胞(melphigian)和基底细胞组成。角质层是吸湿性的，并且需要至少10重量％的水分以保持其柔韧性和柔软性。该吸湿性部分地可归因于角蛋白的保水能力。当角质层失去其柔软性和柔韧性时，它就变得粗糙和脆性，导致干性皮肤。
真皮，其位于表皮正下方，为1.5至4毫米厚。它是皮肤的三个层中最厚的。大多数皮肤结构，包括汗腺和脂腺(其通过被称为毛孔或粉刺的在皮肤中的开口来分泌物质)、毛囊、神经末梢以及血管和淋巴管，均存在于真皮中(Inlander,Skin,New York,N.Y.:People's Medical Society,1-7(1998))。但是，真皮的主要组分是胶原和弹性蛋白。
皮下组织是皮肤的最深层。它同时充当用于身体热量保存的绝缘体和用作器官保护的减震器(Inlander,Skin,New York,N.Y.:People's Medical Society,1-7(1998))。另外，皮下组织也储存脂肪用于能量储备。皮肤的pH通常在5和6之间。该酸度是由于来自皮脂腺分泌物的两性氨基酸、乳酸和脂肪酸的存在。术语“酸性套膜(acid mantle)”指在皮肤的大部分区域上存在的水溶性物质。皮肤的缓冲能力部分地是由于在皮肤角质层中储存的这些分泌物。
皱纹，其是衰老的指示标志(telltale signs)的迹象之一，可能由从对皮肤的环境损害而积累的生物化学、组织学和生理学变化所引起。 (Benedetto,InternationalJournal of Dermatology,38:641-655(1999))。另外，存在可以引起面部皱纹的特征性皱纹、沟纹和褶痕的其他次要因素 (Stegman等人,The Skin of the Aging Face CosmeticDermatological Surgery，第2版，St.Louis,Mo.:Mosby Year Book:5-15(1990))。这些次要因素包括持续不变的重力牵拉、在皮肤上的频繁且持续不变的位置压力(例如，在睡眠期间)和由面部肌肉的收缩所引起的反复的面部运动(Stegman等人,The Skin of the AgingFace Cosmetic Dermatological Surgery,第2版,St.Louis,Mo.:Mosby Year Book:5-15(1990))。
已经使用了不同的技术以便可能地缓和衰老的一些迹象。这些技术从包含α-羟基酸和视黄醇的面部湿润剂到外科手术程序和注射神经毒素变化。例如，在1986年，Jean和Alastair Carruthers(由一名眼整形外科医生和一名皮肤病学家组成的夫妻团队)开发出了使用A型形式肉毒杆菌毒素处理在眉间区域中的运动相关性皱纹的方法(Schantz和Scott,In Lewis G.E.(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum,New York: AcademicPress,143-150(1981))。A型形式的肉毒杆菌毒素用于处理皱纹的卡拉瑟斯氏(Carruthers)用途导致在1992年该方法的开创性发表 (Schantz和Scott,In Lewis G.E.(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum, New York:Academic Press,143-150(1981))。到1994年，同一团队报道了用在面部上的其他运动相关性皱纹的感受(Scott,Ophthalmol,87:1044-1049(1980))。这反过来导致使用A型形式的肉毒杆菌毒素的美容处理时代的诞生。
据报道A型形式的肉毒杆菌毒素是人类已知的最致死的天然生物制剂。肉毒梭菌(Clostridium botulinum)的孢子被发现存在于土壤中，并且可以在经不恰当地灭菌和密封的食品容器中生长。肉毒中毒，其可以是致命的，可以由摄入该细菌而引起。肉毒杆菌毒素通过抑制跨神经肌肉接头的乙酰胆碱释放而阻止突触传递来起作用以产生肌肉麻痹，并且被认为也以其他方式起作用。它的作用基本上阻断了通常将会引起肌肉痉挛或收缩的信号，导致麻痹。在最近的十年期间，已经利用肉毒杆菌毒素的肌肉麻痹活性取得多种治疗作用。受控施用肉毒杆菌毒素已经用于提供肌肉麻痹，以治疗多种医学病症，例如以骨骼肌活动过度为特征的神经肌肉病症。已经用肉毒杆菌毒素治疗的病症包括半面痉挛、成人发作的痉挛性斜颈、肛裂、眼睑痉挛、脑性瘫痪、颈肌张力障碍、偏头痛、斜视、颞下颌关节病症以及各种类型的肌肉痛性痉挛和痉挛。最近，肉毒杆菌毒素的肌肉麻痹作用已经应用于治疗性和美容性面部应用，如处理皱纹、皱眉细纹以及面部肌肉的痉挛或收缩的其他结果。
除了A型形式的肉毒杆菌毒素之外，还存在七种其他血清学不同的肉毒杆菌毒素形式，其也由革兰氏阳性细菌肉毒梭菌(C.botulinum)产生。在肉毒杆菌毒素的这八种血清学不同的类型之中，可以引起麻痹的七种被命名为肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。这些中的每一种通过用类型特异性抗体进行的中和来区分。肉毒杆菌毒素的不同血清型在作用方面以及在它们在不同动物物种中引起的麻痹的严重度和持续时间方面变化。例如，在大鼠中，已经确定A型肉毒杆菌毒素的效力是B型肉毒杆菌毒素的500倍，如通过麻痹率所测量的。另外，已经确定B型肉毒杆菌毒素以480U/kg的剂量(对于A型来说的灵长类动物LD50的约12倍)在灵长类动物中是非毒性的。
如由肉毒梭菌细菌所释放的，肉毒杆菌毒素是一种包含约150kD肉毒杆菌毒素蛋白分子连同所结合的非毒素蛋白一起的毒素复合物的组分。这些内源性非毒素蛋白被认为包括血凝素蛋白质家族，以及非血凝素蛋白质。非毒素蛋白已经被报道使在毒素复合物中的肉毒杆菌毒素分子稳定，和在当毒素复合物被摄入时，保护它免于经由消化酸的变性。因此，毒素复合物的非毒素蛋白保护肉毒杆菌毒素的活性，并由此在当经由胃肠道施用毒素复合物时，增强全身渗透。另外，据信一些非毒素蛋白特异地使在血液中的肉毒杆菌毒素分子稳定。
在毒素复合物中存在非毒素蛋白通常引起毒素复合物具有比单纯的肉毒杆菌毒素分子更大的分子量。肉毒杆菌毒素蛋白本身的分子量为约150kD，尽管不同血清型复合物的大小不同。例如，肉毒梭菌细菌可以产生具有约900kD、500kD或300kD的分子量的A型肉毒杆菌毒素复合物。作为具有约700kD或大约500kD的分子量的复合物产生B和 C型肉毒杆菌毒素。作为具有约300kD或500kD的分子量的复合物产生D型肉毒杆菌毒素。仅作为具有约300kD的分子量的复合物产生E 和F型肉毒杆菌毒素。
为了对肉毒杆菌毒素提供额外的稳定性，通常通过在制备期间结合复合物与白蛋白来稳定毒素复合物。例如
(Allergan,Inc., Irvine,CA)是一种含肉毒杆菌毒素的制剂，其包含100U的A型肉毒杆菌毒素与附属蛋白(0.5毫克的人白蛋白)和0.9毫克的氯化钠。
由于肉毒杆菌毒素的分子大小和分子结构，其自身不能穿过皮肤角质层和多个皮下结构层。因此，通常通过注射含有肉毒杆菌毒素复合物和白蛋白的组合物向患者施用肉毒杆菌毒素。然而，存在数个与该方法相关联的问题。不仅注射是疼痛的，而且通常在注射部位周围局部地产生大的皮下毒素井，以便获得期望的治疗或美容效应。肉毒杆菌毒素可以从这些皮下井迁移从而在身体的周围区域中引起不想要的麻痹。当待处理的区域是大的并且需要多次毒素注射以处理该区域时，该问题更加严重。而且，因为所注射的毒素复合物包含使肉毒杆菌毒素稳定和增加毒素复合物的分子量的非毒素蛋白和白蛋白，因此毒素复合物在身体内具有长的半寿期和可以在患者中引起不期望的抗原应答。例如，有些患者将会随时间推移发展出对于在目前的商业制剂中作为稳定剂使用的白蛋白的变态反应。此外，毒素复合物可以诱导患者的免疫系统形成中和抗体，因此在随后的施用中需要更大量的毒素来获得相同的作用。当这发生时，必须小心地安排随后的注射，以便它们不释放大量的毒素进入到患者的血流中，其可能导致致命的全身中毒。含有白蛋白的制剂引入了例如对于白蛋白的不良反应的风险，如更大的变态反应风险以及使病原菌污染一些血液源的风险。
鉴于与目前的治疗和目前的肉毒杆菌毒素制剂相关联的缺点，高度希望具有这样的可注射肉毒杆菌毒素制剂，其是有效的且稳定的，但显示出降低的抗原性和更低的在注射后局部扩散的倾向。还期望使用这样的肉毒杆菌毒素制剂用于治疗和/或美容目的，特别是需要较少介入的稳定的长期作用的治疗，其产生高的改善应答率而不会增加副作用。
发明简述
本发明涉及用于向个体施用以获得治疗和/或美容益处的可注射的肉毒杆菌毒素制剂的使用方法，所述制剂具有令人惊奇地高应答率和长作用持续时间。
在一个方面，本发明提供可注射组合物，其包含与带正电荷的载体非共价相结合的肉毒杆菌毒素。在优选的实施方案中，本发明的组合物具有一个或多个优于常规商业肉毒杆菌毒素制剂如
或
的优点。例如，在某些实施方案中，所述组合物可以显示出一个或多个优于常规可注射肉毒杆菌毒素制剂的优点，包括降低的抗原性、降低的在注射后经历扩散进入周围组织中的倾向、相对于常规制剂而言的增加的临床效应持续时间或增强的效力。
在优选的实施方案中，肉毒杆菌毒素组分包含具有150kDa的分子量的血清型A肉毒杆菌毒素。所述肉毒杆菌毒素组分可选自肉毒杆菌毒素复合物(包括所述150kD神经毒素与在由肉毒梭菌产生的天然复合物中存在的附属蛋白质)、缩减型肉毒杆菌毒素复合物(包括所述150kD 神经毒素与一些但不是全部的天然附属蛋白质)、和所述150kD肉毒杆菌毒素分子本身(不含附属(非毒素)蛋白质)。
在优选的实施方案中，将某些非天然分子(即在从肉毒梭菌细菌获得的肉毒杆菌毒素复合物中找不到的分子)加入到肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物和特别是缩减型肉毒杆菌毒素复合物(如本文定义的)中，以改善穿过组织的毒素扩散。所述非天然分子与毒素非共价地相结合，并且充当改善毒素在注射后到达靶结构的能力的渗透促进剂。此外，所述非天然分子可以在注射之前和之后增加毒素的稳定性。作为举例，所述渗透促进剂可以是带正电荷的载体，如阳离子肽，其没有内在的肉毒杆菌毒素样活性并且也包含一个或多个如本文所述的蛋白质转导结构域。
根据本发明，带正电荷的载体合适地作为肉毒杆菌毒素的转运系统，而无需共价修饰毒素分子，能够赋予注射的毒素改善的特征，包括与不含带正电荷的载体的肉毒杆菌毒素组合物相比而言更长作用持续时间和更高应答率。带正电荷的载体包含带正电荷的主链，其共价连接效力基团(也称为蛋白转导结构域(PTDs)或细胞穿透肽(CPPs))，更优选在主链的一端或两端。在某些实施方案中，效力基团为选自以下的氨基酸序列：HIV-TAT或其片段；触角足蛋白(Antennapedia)的PTD或其片段；-(gly)n1-(arg)n2(SEQ ID NO:5)其中下标n1为0至约20的整数， n2独立地为约5至约25的奇数；或(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或 (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至约20的整数。在一个特别优选的实施方案中，所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)(本文中也称为“RTP004”)。在仍然其它的实施方案中，所述带正电荷的载体具有氨基酸序列YGRKKRRQRRR-G-(K)15-G-YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:7), RGRDDRRQRRR-G-(K)15-G-RGRDDRRQRRR(SEQ ID NO:8)或 RKKRRQRRR-Q-(K)15-Q-RKKRRQRRR(SEQ ID NO:11)。
在某些实施方案中，所述载体以如下量提供在含肉毒杆菌毒素组合物中：约0.001至约1μg/U的肉毒杆菌毒素组分，优选约0.01至约 0.5μg/U，更优选约0.05至约0.35μg/U，或约0.1至约0.3μg/U，和最优选约0.234μg/肉毒杆菌毒素单位。例如，含肉毒杆菌毒素组合物可以含有约1至约20μg、约5至约15μg、约7至约12μg、或约8约10μg的载体。在一个优选的实施方案中，肉毒杆菌毒素剂量选自约20U至约60U，并且所述载体为带正电荷的载体，在组合物中的存在量选自约4.7 至约14μg，以便提供约0.234μg/U肉毒杆菌毒素的比例。
在某些实施方案中，含肉毒杆菌毒素组合物的赋形剂包含一种或多种选自L-组氨酸、L-组氨酸盐酸盐、聚山梨酯20和海藻糖二水合物的另外的稳定组分。
在某些特别优选的实施方案中，所述赋形剂包含海藻糖二水合物。例如，每50U小瓶，赋形剂可以包括约1mg至约100mg、约10至约 80mg、约20mg至约60mg、约30mg至约40mg、或约34mg、约 35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg或约40mg的海藻糖。在某些特别优选的实施方案中，所述赋形剂包含聚山梨酯20。例如，每 50U小瓶，赋形剂可以包括约0.01mg至约1mg、约0.05至约0.5mg、约0.075mg至约0.25mg、约0.08mg至约0.15mg、或约0.09mg、约0.095mg、约0.1mg、约0.105mg、约0.11mg、约0.12mg、约0.13mg、约0.14mg、或约0.15mg的聚山梨酯20。在一个特别优选的实施方案中，每50U，赋形剂含有约36mg的海藻糖和约0.1mg的聚山梨酯20。
在一个特别优选的实施方案中，称为“RT002”，所述组合物为可注射的制剂，其含有150kD的A亚型肉毒杆菌毒素分子(不含附属(非毒素)蛋白质)，与具有下式的带正电荷的载体肽非共价结合： RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)，并且其不含附属蛋白或动物来源的组分，如在Thompson等人的WO 2010/151840 (PCT/US2010/040104)“Albumin-Free Botulinum Toxin Formulations.”中描述的。也参见Stone等人,2011,“Characterization and duration of action of a new botulinum toxin type Aformulation”Toxicon, 58:159-167；Garcia-Murray,“Safety and efficacy of RT002,an injectable botulinum toxin type A,for treating glabellar lines:results ofa phase 1/2,open-label,sequential dose-escalation study”Dermatol Surg.2015Jan；41Suppl 1:S47-55；和Carruthers,等人,Injectable DaxibotulinumtoxinA forthe Treatment of Glabellar Lines:A Phase 2, Randomized,Dose-Ranging,Double-Blind,Multicenter Comparison with Onabotulinumtoxin A andPlacebo.Dermatol.Surg.2017；43: 1321-1331，描述了RT002制剂；以及Ruegg等人的WO2017/075468 (PCT/US2016/059492)，发明名称“Injectable Botulinum ToxinFormulations And Methods Of Use Thereof Having Long Duration Of TherapeuticOr Cosmetic Effect”，Ruegg于2018年08月28日提交的 International ApplicationPCT/US18/48361，发明名称“Transmucosal Botulinum Toxin Compositions,Kits,AndMethods For Treating Bladder Disorders”；Rubio于2018年11月05日提交的International Application PCT/US2018/059265，发明名称“Botulinum ToxinFormulations and Methods of Use Thereof in Plantar Fasciitis,”；和 2018年05月18日提交的International Application PCT/US18/33397,to Ruegg entitled“Methodsof Treatment for Cervical Dystonia”；将其全文通过参考并入本文中。RT002通常在150kDa肉毒杆菌毒素A的50U 小瓶中以冻干形式提供，不含附属(非毒素)蛋白质，含有0.1mg聚山梨酯20、36mg海藻糖和11.7μg RTP004(作为载体)，得到在50U小瓶中质量比51,000:1的肽：毒素。
在另一个方面，本发明涉及一种通过向需要其的受试者注射治疗或美容有效量的本发明的组合物产生生物效应的方法。所述生物效应可以包括例如肌麻痹或已知通过施用肉毒杆菌毒素产生的其它作用。这样的作用包括例如以下的任一种或多种：治疗神经疼痛、头痛或偏头痛、半面痉挛、成人发作痉挛性斜颈、肛裂、眼睑痉挛、脑性瘫痪、斜视、颞下颌关节病症、痤疮、张力障碍、张力障碍收缩、多汗、或胆碱能神经系统控制的腺分泌过多；治疗或控制鼻炎、鼻窦炎、膀胱活动过度症 (hyperactive bladder)、宫颈颈张力障碍、脚底筋膜炎；减少肌肉痉挛，和减少或增强免疫应答。在具体实例中，所述作用为减少皱纹、细纹、沟纹(特别是在脸上)的严重度，如减少眉间细纹(也成为皱眉纹)的严重度。
本文所述的方法和组合物递送有效量的肉毒杆菌毒素组分，以产生至少一种期望的生物效应。在一些实施方案中，施用肉毒杆菌毒素约1U 至约300U，优选约10U至约200U，更优选约20U至约100U，或约 20U至约60U。在优选的实施方案中，肉毒杆菌毒素的剂量选自约10U、约20U、约30U、约40U、约60U、约80U和约80U、优选约40U。
在另一个方面，本发明提供一种向受试者施用肉毒杆菌毒素的方法，其在用于受试者的期望的治疗或美容益处方面获得了延长的持续作用。在一个具体实例中，本发明提供一种施用肉毒杆菌毒素以在减少个体的眉间细纹方面获得延长的持续作用的方法，在某些实施方案中，所述方法包括将一次剂量的无菌可注射组合物注射施用到与眉间细纹有关的一处或多处肌肉中，以在治疗后获得延长的持续作用，即，在治疗之后的缓释功效或长持续时间的应答率。例如，在某些实施方案中，施用肉毒杆菌毒素组合物引起作用(如改善眉间细纹)的持续时间增加，其比用常规肉毒杆菌毒素制剂处理持续更长，从而延长了治疗间隔。优选的实施方案得到眉间细纹严重度的改善至少约3个月至约11个月，约5个月至约10个月，约6个月至约10个月，或约28周至约40周。在优选的实施方案中，如是使用40U的肉毒杆菌毒素剂量，在施用第二个或后续处理剂量之前，作用持续时间为至少约24周、至少约26周、至少约28周、至少约30周、至少约32周、至少约34周、至少约36 周、至少约40周或至少约42周。
在另一个方面，本发明提供一种获得受试者期望的治疗或美容益处的方法，其中所述方法包括具有多次处理的剂量方案，其具有延长的作用持续时间，从而与使用常规肉毒杆菌毒素制剂的方案相比连续处理之间的间隔更长。在一个特定实施方案中，本发明提供一种减少个体中眉间细纹的方法，其中所述方法包括具有多次处理的剂量方案，其具有延长的作用持续时间，从而与使用常规肉毒杆菌毒素制剂来减少眉间细纹的方案相比连续处理之间的间隔更长。在特定实施方案中，在首次处理剂量之后或在后续处理剂量之后，施用第二次或后续处理剂量的组合物之前的间隔大于或等于约26周、约28周、约30周、约32周、约34 周、约36周、约38周、约40周，或大于或等于约42周。
在优选的实施方案中，所述作用为眉间细纹的严重度降低。在这样的实施方案中，施用可以包括至少一次注射到选自右皱眉肌、左皱眉肌和降眉间肌的一处或多处肌肉中。例如，在这些实施方案的一些中，将约5至约15U，优选约8U的肉毒杆菌毒素组分注射到右皱眉肌的内侧方向，将约5至约15U，优选约8U注射到右皱眉肌的外侧方向；将约 5至约15U，优选约8U注射到左皱眉肌的内侧方向，将约5至约15U，优选约8U注射到左皱眉肌的外侧方向；和将约5至约15U，优选约8 U注射到降眉间肌中。
所述处理方法获得了令人惊奇的长持续时间和高应答率。在特定实施方案中，本发明提供减少需要其的个体中的皱纹、细纹或沟纹的方法，所述方法包括：通过将如下的组合物注射到与个体的皱纹、细纹或沟纹相关的一处或多处肌肉或面部结构施用所述个体，所述组合物包含：用于注射的可药用稀释剂；肉毒杆菌毒素组分，即具有150kDa分子量的血清型A肉毒杆菌毒素，不含附属非毒素蛋白；具有氨基酸序列 RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)的带正电荷的载体；其中将所述肉毒杆菌毒素组分以每次注射处理约20U至约60U 或约40U的处理剂量的量施用至个体，更优选地，其中所述处理剂量在注射到选自右皱眉肌、左皱眉肌和降眉间肌的一处或多处肌肉之间分开；其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌组分非共价结合；和其中所述组合物的注射在减少个体的皱纹、细纹或沟纹方面提供具有至少约26周的作用持续时间的单次处理剂量，从而延长了个体的处理间隔持续时间。所有皱纹、细纹或沟纹优选位于个体的面部，如眉间细纹。
因此，如上所述的药物组合物的方法和用途提供采用可注射的肉毒杆菌毒素处理需要其的个体的眉间细纹的方法，其中所述方法包括具有多个处理间隔的处理过程，延长了作用持续时间和处理间隔的持续时间，所述处理过程包括：将首次处理剂量的无菌可注射组合物注射施用到个体的眉间复合区(glabellar complex)，以在用所述组合物首次处理之后获得眉间细纹的严重度降低；其中所述组合物包含适用于注射的可药用稀释剂；肉毒杆菌毒素组分，即具有150kDa分子量的血清型 A肉毒杆菌毒素，不含附属非毒素蛋白；具有氨基酸序列 RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)的带正电荷的载体；其中将所述肉毒杆菌毒素组分以每次注射处理约20U至约60U 或约40U的处理剂量施用至个体，更优选地，其中所述处理剂量在注射到选自右皱眉肌、左皱眉肌和降眉间肌的一处或多处肌肉之间分开；其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌组分非共价结合；其中向个体注射施用首次处理剂量的组合物提供了持续至少约26周的作用持续时间；和以处理间隔向个体注射施用后续处理剂量的组合物，所述处理间隔包括在首次处理剂量之后和每个后续处理剂量之间的持续时间大于或等于约26周至至少约40周。
在上述两段所述的方法和用途的某些实施方案中，所述组合物获得了至少约27周、至少28周、至少约29周或至少约30周的延长的作用持续时间。在一些这样的实施方案中，带正电荷的载体在所述药物组合物中的存在量为约0.1至约0.3μg/单位肉毒杆菌毒素组分，优选存在量为约0.234μg/单位肉毒杆菌毒素组分。可替代地或另外，在一些这样的实施方案中，赋形剂包括至少一种选自L-组氨酸、L-组氨酸盐酸盐、聚山梨酯20和海藻糖二水合物的组分，优选海藻糖二水合物。
与现有技术相比，本发明的组合物、及其方法和用途提供的作用持续时间提供了显著的优点。接受含肉毒杆菌毒素组合物处理的受试者认为作用的持续时间是十分重要的。长的、持续的作用持续时间，其甚至可以根据本发明的有效剂量单次处理获得，允许在受试者的整个处理过程较少注射。例如，来自用具有明确功效和安全性的产品单次注射处理的延长的作用持续时间，如通过本文的本发明组合物和方法提供的，对正在接受处理的受试者提供了更少的不适、更低的成本和更方便性。因此，在单次注射处理之后得到显著持续作用的产品提供给执业医师和患者本领域未满足的需要的解决方案。因此，本发明的组合物和方法提供了针对太频繁、疼痛和不方便处理的任何一个或多个问题的解决方案以及改善患者全面健康。
在另一个方面，本发明提供获得受试者期望的治疗或美容益处的方法，其与常规肉毒杆菌毒素制剂相比具有更高应答率。在某些实施方案中，本发明提供一种采用可注射的肉毒杆菌毒素处理需要其的个体的皱纹、细纹、沟纹或眉间细纹的方法，所述方法包括：通过将下述组合物注射到与个体的皱纹、细纹或沟纹相关的一处或多处肌肉或面部结构(比如眉间复合区)施用所述个体，所述组合物包含：用于注射的可药用稀释剂；肉毒杆菌毒素组分，即具有150kDa分子量的血清型A肉毒杆菌毒素，不含附属非毒素蛋白；具有氨基酸序列 RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)的带正电荷的载体；其中将所述肉毒杆菌毒素组分以每次注射处理约20U至约60U 或约40U的处理剂量的量施用至个体，更优选地，其中所述处理剂量在注射到选自右皱眉肌、左皱眉肌和降眉间肌的一处或多处肌肉之间分开；其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌组分非共价结合；和其中注射所述组合物提供了降低皱纹、细纹、沟纹或眉间细纹的严重度的作用，与施用常规肉毒杆菌毒素制剂的给体相比，每次施用所述药物组合物个体的应答率提高。
在优选的这样的实施方案中，在各自施用所述药物组合物的超过 55％、优选超过60％、更优选超过70％的个体中，所述作用持续至少约4周。在更优选的实施方案中，在各自施用所述药物组合物的超过 35％、优选地超过50％、更优选超过70％的个体中，所述作用持续至少约16周。在甚至更优选的实施方案中，在各自施用所述药物组合物的超过15％、最优选地超过25％的个体中，所述作用持续至少约24周。
本发明还提供试剂盒，其用于制备含有肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物和带正电荷的载体或可能依次用于产生这样的制剂的预混物的制剂。还提供含有顺序施用肉毒杆菌毒素组分和带正电荷的载体的手段的试剂盒。
在仍然另一个方面，本发明提供通过施用多次连续肉毒杆菌毒素处理来增加用于减少需要其的个体中皱纹、细纹或沟纹的作用持续时间的方法和组合物，其中通过注射到或接近皱纹、细纹或沟纹向所述个体施用肉毒杆菌毒素组合物的首次处理；接着至少一次连续处理。在优选的实施方案中，首次处理减少所述皱纹、细纹或沟纹至少约20周，并且一次或多次连续处理减少所述皱纹、细纹或沟纹的持续时间比在所述首次处理之后获得的更长。在特定实施方案中，所述组合物包含剂量约10 U至约100U的肉毒杆菌毒素组分，所述肉毒杆菌毒素组分包含具有150 kDa的分子量的血清型A肉毒杆菌毒素(不含附属(非毒素)蛋白质)和带正电荷的载体组分，其包含具有共价连接于其的一个或多个具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、 (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或 (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)的带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；和其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌组分非共价结合。在更优选的实施方案中，剂量为40U和/或所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)。在仍然更优选的实施方案中，所述带正电荷的载体和所述肉毒杆菌毒素组分以约20,000:1至约55,000:1的质量比存在于所述药物组合物中；和/或所述带正电荷的载体以约1至约50μg/40U、约5至约25μg/40U；约10 至约15μg/40或约12μg/40U的所述肉毒杆菌毒素组分的量存在于所述组合物中。在仍然更优选的实施方案中，赋形剂包括至少一种选自L- 组氨酸、L-组氨酸盐酸盐、聚山梨酯20和海藻糖二水合物的组分，最优选海藻糖二水合物。
在仍然另一个方面，本发明提供通过施用多次连续肉毒杆菌毒素处理，用于增加实现减少需要其的个体中的皱纹、细纹或沟纹的肉毒杆菌毒素应答可能性的方法和组合物，其中通过注射到或接近皱纹、细纹或沟纹施用所述个体肉毒杆菌毒素组合物的首次处理；接着至少一次连续处理，其具有比首次处理减少皱纹、细纹或沟纹的更大可能性。在特定实施方案中，所述组合物包含剂量约10U至约100U的肉毒杆菌毒素组分，所述肉毒杆菌毒素组分包含具有150kDa分子量的血清型A肉毒杆菌毒素，和带正电荷的载体组分，其包含具有共价连接于其的一个或多个具有氨基酸序列的(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ IDNO: 1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或 (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQID NO:3)带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，其中下标p和q各自独立地为0至20；和其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌组分非共价结合。在更优选的实施方案中，剂量为40U和/或所述带正电荷的载体具有氨基酸序列 RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)。在仍然更优选优选的实施方案中，所述带正电荷的载体和所述肉毒杆菌毒素组分以约20,000:1至约55,000:1的质量比存在于所述药物组合物中；和/或所述带正电荷的载体以约1至约50μg/40U、约5至约25μg/40；约10至约15μg/40、或约120μg/40U的所述肉毒杆菌毒素组分的量存在于所述组合物中。在仍然更优选的实施方案中，赋形剂包括至少一种选自L- 组氨酸、L-组氨酸盐酸盐、聚山梨酯20和海藻糖二水合物的组分，最优选海藻糖二水合物。
在上面两段所述本发明的特定实施方案中，所述皱纹、细纹或沟纹为眉间细纹。在这样的实施方案中，施用可以包括至少一次注射到选自右皱眉肌、左皱眉肌和降眉间肌的一处或多处肌肉中。在仍然更优选的实施方案中，在施用所述组合物之后，反复处理导致副作用较少，特别是减少了眼睑下垂。
附图简述
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图1呈现显示在反复施用
或RT003之后恢复基线趾外展得分(DAS)值(0.4)所需时间的柱状图，所述RT003是一种包括150kDa 肉毒杆菌毒素A型(不含附属蛋白(RTT150))和具有氨基酸序列 RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)的带正电荷的载体的制剂。
图2A和2B：图2A显示注射黑色染料的小鼠后腿，以指示受外侧至中线(lateral-to-midline)注射影响的小鼠腓肠肌的部分。图2B注射了黑色染料的小鼠的后腿，以指示受中线(midline)注射影响的小鼠腓肠肌的部分。
图3呈现将RT003、RTT150或
注射到小鼠腓肠肌的外侧至中线部分或中线部分中之后测量为时间函数的趾外展得分(DAS)。
图4A和4B呈现了卡-迈曲线(Kaplan-Meier Curves)，其显示了在来自本文实施例5中所述的临床研究的各种处理组之中的应答持续时间。卡-迈曲线代表来自该临床研究的主要功效分析的结果，并且证明了在所示的处理组中对于调查者总体评估-面部皱纹严重度(Investigator Global Assessment-Facial Wrinkle Severity；IGA-FWS)而言距离基线至少1-点改善的应答持续时间。图4A呈现对于安慰剂处理组、
20U处理组和RT002 40U处理组的卡-迈曲线。图4B呈现对于安慰剂处理组、
20U处理组、RT002 20U处理组、RT002 40U处理组和RT002 60U处理组的卡-迈曲线。
图5A-5C呈现来自本文实施例7所述3期临床试验的两个研究组 (study arms)的主要终点结果。图5A呈现所述两个组在第4周(意图治疗群体(Intent-to-TreatPopulation))的主要终点，显示在最大皱眉获得至少2-点复合应答的受试者的比例(*p＜0.0001对安慰剂，按照研究中心分层的Cochran-Mantel-Haenszel试验)。图5B呈现对于所述两个组关于IGA-FWS和患者面部皱纹严重度(PFWS)评分恢复到基线或比基线差的时间的卡-迈曲线图(观察病例)(ITT)。图5C呈现所述两个组关于IGA-FWS或PFWS评分保持无皱纹或轻度皱纹严重度的时间的卡-迈曲线图(观察病例)(ITT)。
图6A-6B比较采用实施例5进行3期研究的两个组。图6A呈现采用实施例5的结果进行3期研究的两个组在第4周的主要终点的比较，比较了每个ITT群中在最大皱眉获得至少2点复合应答的受试者的百分比。图6B比较了在关于IGA-FWS和PFWS随时间推移的无应答或轻度应答方面，采用实施例5进行3期研究的两个组。
图7呈现对于两个组的每组随时间推移基于这些评分保持无或轻度皱纹的受试者的百分比，与实施例5以及其它肉毒杆菌毒素制剂的结果进行比较。
图8描绘了相对于实施例5，所述3期研究的ITT关于PFWS无应答或轻度应答的两个组。
图9描绘了相对于实施例5和相对于肉毒杆菌毒素A，所述3期研究关于PFWS无应答或轻度应答的两个组。
图10描绘了相对于实施例5(PP)，所述3期研究关于IGA-FWS 随时间推移的应答≥1点的比例的两个组。
图11描绘对于所述两个组的每个或实施例5而言，随时间推移关于IGA-FWS得分保持从基线改善至少1点的受试者的百分比。
图12描绘对于所述两个组的每个或实施例5而言，随时间推移关于PFWS得分保持从基线改善至少1点的受试者的百分比。
图13描绘对于所述3期研究的两个组的每个而言，随时间推移关于IGA-FWS和PFWS得分保持从基线改善至少1点的受试者的百分比。
图14描绘对于两个组(紫线和蓝线)的每个和对于实施例5(红线) 而言，随时间推移关于IGA-FWS保持无或轻度皱纹严重度状态(评分 0或1)的受试者的百分比。
图15描绘对于两个组(紫线和蓝线)的每个而言，基于在第4周的2点复合应答者，随时间推移关于IGA-FWS保持无或轻度皱纹严重度状态(评分0或1)的受试者的百分比。
图16描绘对于两个组(紫线和蓝线)的每个而言，随时间推移关于IGA-FWS或PFWS保持无或轻度皱纹严重度状态(评分0或1)的受试者的百分比。
图17描绘对于3期研究的两个组(紫线和蓝线)的每个而言，随时间推移关于IGA-FWS和PFWS两者恢复到基线的受试者的百分比。
图18描绘对于3期研究的两个组的每个而言，在处理后患者普遍满意度等级。
图19呈现在处理之后第4周(最大皱眉)显示关于IGA-FWS和 PFWS的2点改善；和直到第24周保持1点的作用持续时间的受试者的照片。
图20A-20B呈现在处理之后第4周(最大皱眉)显示关于IGA-FWS 和PFWS的2点改善；和直到第24周(图20B)和第32周(图20B) 保持1点的作用持续时间的不同受试者的照片。
图21A-B描绘本文所述开放标记的安全性研究的研究方案(图 21A)和该研究与实施例7的组和组2的比较概述(图21B)。
图22描绘采用RT002处理轻度至中度眉间细纹的示例性的注射部位。
图23描绘在临床试验中评价RT002的安全性的试验评价的示例性的日程表。
图24A-24B描绘在研究过程中在第4周保持眉间细纹改善的受试者的比例。图24A描绘在实施例8的3期研究中在第4周获得至少2点复合应答的受试者；图24B描绘在实施例7、组1和组2、和实施例8的 3期研究过程中，在第4周，研究者和受试者的GAIS评分获得至少+1 得分的受试者。
图25A-25B描绘如通过IGA-FWS(图25A)和PFWS(图25B) 评价时，在处理之后，在各个时间点具有“无”或“轻度”响应处理的皱纹得分的实施例7和实施例8的受试者百分比。
图26A-26B描绘相对于处理之后关于IGA-FWS和PFWS两者失去“无”或“轻度”得分的时间(图26A)；和关于IGA-FWS和PFWS两者失去或恢复到基线的时间(图26B)，实施例7和实施例8中受试者的百分比。
图27A-27B描绘在处理之后随时间推移，实施例8中显示如由受试者的GAIS(P-GAIS)评价最大皱眉的应答(图27A)或由研究者的 GAIS(I-GAIS)评价最大皱眉的应答(图27B)的受试者的百分比。
图28A-28B描绘示例说明在第4周IGA-FWS和PFWS改善2点，具有保持作用的持续时间直到第16周和在第24周保持1点改善的受试者的照片。
图29描绘由亚组进行的关于IGA-FWS和PFWS两者失去无或适度得分的中值时间。
图30描绘由亚组进行的关于IGA-FWS和PFWS两者恢复基线的中值时间。
发明详述
本发明涉及含肉毒杆菌毒素组合物，用于在肉毒杆菌毒素的治疗和 /或美容品应用中产生更高应答率和/或更长作用持续时间或更长起效持续时间。特别地，本发明涉及含肉毒杆菌毒素组合物，与市售可获得的肉毒杆菌毒素制剂如
相比，在具有皱眉纹的患者中产生更高应答率，保持延长的时间期间。
在一个方面，所使用的组合物在无菌可注射的制剂中，其可以通过注射施用至个体，比如注射到与待治疗的病症相关的一处或多处肌肉中，例如与中度至重度眉间细纹相关的一处或多处肌肉。如本文使用的术语组合物和制剂当指根据本发明的组合物和制剂时基本上是可互换的。
可注射组合物
在优选的实施方案中，本发明的可注射组合物在注射之后稳定毒素和/或能使其递送穿过组织，使得所述毒素具有一个或多个优点，如与常规市售肉毒杆菌毒素制剂(例如
或
)相比，降低的抗原性、更好的安全特性、增强的效力、更快地开始临床功效、更高的应答率和更长的临床效应持续时间。在特别优选的实施方案中，可注射组合物提供减少注射后从注射部位扩散或散布的特性，从而将所述毒素及其作用定位于其中想要的位点，并且减少远离该注射部位的位置毒素的非特异性或不想要的作用。可注射组合物包含与有效量的带正电荷的载体非共价结合的肉毒杆菌毒素，所述载体包含具有共价结合的带正电荷的“效力基团”(其也称为蛋白转导结构域(PTDs)或细胞穿透肽(CPPs))的带正电荷的主链。根据本发明，所述带正电荷的载体合适地作为肉毒杆菌毒素的转运系统，能够使注射的毒素具有如上讨论的改善的特性，而不会共价修饰所述毒素分子。
下述部分描述了用于本发明的组合物的各种组分。
肉毒杆菌毒素组分
如本文使用的术语“肉毒毒素”可以指任何已知类型的肉毒毒素(例如，与不同血清型的肉毒梭菌相关的150kD肉毒杆菌毒素蛋白分子)，无论是通过细菌或通过重组技术产生的，以及可以随后发现的任何这样的类型(包括新发现的血清型)，和工程化的变体或融合蛋白。如上所述，目前已经表征了七种在免疫学上不同的肉毒杆菌神经毒素，即肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C、D、E、F和G，它们中的每一种通过用类型特异性抗体进行的中和来区分。肉毒杆菌毒素的不同血清型在它们所影响的动物物种方面以及在它们引起的麻痹的严重度和持续时间方面不同。在优选的实施方案中，组合物包含血清型A肉毒杆菌毒素。
各种血清型肉毒毒素是市售可获得的，例如，来自Sigma-Aldrich(St. Louis，MO)和Metabiologics，Inc.(Madison，WI)以及其他来源。至少两种类型的肉毒毒素，A型和B型，可以以制剂市售获得用于治疗某些病症。例如，A型包含在具有商标
的Allergan,Inc.的制剂中以及具有商标
的Ipsen Limited的制剂中。原始
formulation是由Schantz在1979年制备的(Schantz等人,“Preparation andcharacterization of botulinum toxin type A for human treatment”Therapy with Botulinum Toxin.Vol.109.New York, NY:Marcel Dekker；1994.pp.10–24)。B型包含在例如具有商标
的Elan Pharmaceuticals的制剂中。重组肉毒杆菌毒素也可以购自例如List Biological Laboratories,Campbell,CA。
术语“肉毒杆菌毒素”可以可替代地指肉毒杆菌毒素衍生物，即具有肉毒杆菌毒素活性但是相对于天然存在的或重组的天然肉毒杆菌毒素含有一个或多个在任何部分或任何氨基酸链上的化学或功能改变的化合物。例如，肉毒杆菌毒素可以是一种修饰的神经毒素，其为与天然形式相比至少一个其氨基酸被缺失、修饰或替代的神经毒素，或者修饰的神经毒素可以是重组生产的神经毒素或其衍生物或片段。例如，肉毒杆菌毒素可以是以如下方式修饰的肉毒杆菌毒素，所述方式例如增强其性质或者降低不希望有的副作用，但是仍然保留期望的肉毒毒素活性。可替代地，用于本发明的肉毒杆菌毒素可以是使用重组或合成化学技术制备的毒素，例如重组肽、融合蛋白或杂合神经毒素，例如制备自不同肉毒杆菌毒素血清型的亚基或结构域(例如，参见美国专利号6,444,209)。肉毒杆菌毒素也可以是整个分子已经显示具有所需肉毒杆菌毒素活性的一部分，并且在这种情形中本身可以使用或可以用作重组或缀合分子 (例如融合蛋白)的一部分。可替代地，肉毒毒素可以是肉毒杆菌毒素前体的形式，其本身可以是非毒性的，例如非毒性的锌蛋白酶，其在蛋白水解裂解之后变得有毒性。
如本文使用的术语“肉毒毒素复合物”或“毒素复合物”指连同结合的内源性非毒素蛋白(即，肉毒梭菌细菌产生的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)的约150kD的肉毒杆菌毒素蛋白分子(属于肉毒杆菌毒素血清型A-G中的任一种)。在某些实施方案中，肉毒杆菌毒素复合物不一定作为一个单一的毒素复合物衍生自肉毒梭菌细菌，而是可以是例如首先重组制备肉毒杆菌毒素，然后将其与非毒素蛋白组合的肉毒杆菌毒素。
术语“缩减型肉毒杆菌毒素复合物”或“缩减的毒素复合物”指与在肉毒梭菌细菌生成的肉毒毒素复合物中天然存在的量相比，具有减少量的非毒素蛋白的肉毒毒素复合物。在一个实施方案中，缩减型肉毒杆菌毒素复合物是使用任何常规蛋白分离方法，以从来源于肉毒梭菌细菌的肉毒杆菌毒素复合物中提取血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白的级分制备的。例如，可以通过在7.3的pH暴露于红细胞使肉毒毒素复合物解离、HPLC、透析、柱、离心及用于从复合物提取蛋白质的其它方法，制备缩减的肉毒毒素复合物。可以使用的其它方法描述在例如Ruegg的美国专利No.9,469,849，发明名称“Methods And Systems ForPurifying Non-Complexed Botulinum Neurotoxin；”Allergan,Inc.的WO 2006/096163，发明名称“Animal Product Free System And Process For Purifying A BotulinumToxin；”和Allergan,Inc.的EP 1514556B1，发明名称“Botulinum toxin pharmaceuticalcompositions,”将其全文各自通过参考并入本文中。可替代地，当缩减型肉毒杆菌毒素复合物是通过将合成产生的肉毒杆菌毒素与非毒素蛋白质相组合来产生时，可以简单地向混合物中加入比对于天然存在的肉毒杆菌毒素复合物而言将会存在的更少的血凝素或非毒素非血凝素蛋白质。
在缩减型肉毒杆菌毒素复合物中的非毒素蛋白质(例如，血凝素蛋白质或非毒素非血凝素蛋白质或两者)中的任何一种可以独立地以任何量被减少。例如，尽管在某些情况可以将内源性非毒素蛋白的量降低相同的量，但是本发明还预期将内源性非毒素蛋白各自降低不同的量，以及减少至少一种内源性非毒素蛋白，而不减少其他。
在某些示例性的实施方案中，与肉毒毒素复合物中通常存在的量相比，一种或多种非毒素蛋白减少至少约0.5％、1％、3％、5％、10％、 20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。如上所述，肉毒梭菌细菌产生七种不同血清型的毒素。市售制剂是使用不同相对量的非毒素蛋白制备的。例如，YOBLOCTM具有5000U的B型肉毒杆菌毒素/ml、0.05％人血清白蛋白、0.01M琥珀酸钠和0.1M氯化钠。 DYSPORTTM具有500U的A型肉毒毒素-血凝素复合物、125μg白蛋白和2.4mg乳糖。在一些实施方案中，基本上所有的在源自肉毒梭菌细菌的肉毒杆菌毒素复合物中通常将会存在的非毒素蛋白(例如，大于95％、 96％、97％、98％或99％的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)被从肉毒杆菌毒素复合物中移除。
因此，在多个实施方案中，本发明组合物的肉毒杆菌毒素组分可以选自肉毒杆菌毒素复合物(包括所述150kD神经毒素与在由肉毒梭菌产生的天然复合物中存在的附属蛋白，如上所述)、缩减型肉毒杆菌毒素复合物(包括所述150kD神经毒素与一些但不是全部的天然附属蛋白质)、和所述150kD肉毒杆菌毒素分子本身(不含附属(非毒素) 蛋白质)。
在本发明组合物中，肉毒杆菌毒素非共价结合载体形成没有共价修饰肉毒杆菌毒素分子的复合物。载体和肉毒杆菌毒素之间的结合包括一种或多种类型的非共价相互作用，其非限制性实例包括离子相互作用、氢键键合、范德华力、或其组合。也参见例如Dakeet al的WO 2005/084410(PCT/US2005/007524)，“Compositions and Methods forTopical Application and Transdermal Delivery of Botulinum Toxins,”进一步描述了非共价结合如何避免共价修饰待递送毒素分子的需要。用于所述组合物的载体分子描述如下。
载体分子
根据本发明，已经发现如本文所述的具有共价连接效力基团的带正电荷的载体分子适合作为肉毒杆菌毒素的转运系统。在一些实施方案中，带正电荷的载体不具有其它酶或治疗生物活性。
所述带正电荷的载体能够使要注射的毒素具有改善递送至靶结构，引起远离注射肌肉(如与眉间细纹相关的一处或多处肌肉)的扩散减少。除了增强肉毒杆菌毒素的递送之外，在某些优选的实施方案中，所述带正电荷的载体使肉毒杆菌毒素稳定以对抗降解。在这样的实施方案中，可以减少或完全省略通常存在以使肉毒杆菌毒素稳定的血凝素蛋白质和非毒素非血凝素蛋白质，如上所述。类似地，可以省略在制备期间通常加入的外源性白蛋白。
可以在本发明的可注射组合物中使用的示例性的带正电荷的载体描述在例如Waugh et al的WO 2002/007773(PCT/US2001/023072)中，“Multi-Component BiologicalTransport Systems”；Dake等人的WO 2005/084410(PCT/US2005/007524)，“Compositionsand Methods for Topical Application and Transdermal Delivery of BotulinumToxins”； Thompson等人的WO 2010/151840(PCT/US2010/040104)，“Albumin-FreeBotulinum Toxin Formulations”；Stone等人的WO 2009/015385(PCT/US2008/071350)，“Antimicrobial Peptide, Compositions,and Methods of Use”；Waugh等人的WO 2013/112974 (PCT/US2013/023343)，“Methods and Assessment Scales for MeasuringWrinkle Severity”；Ruegg等人的美国专利No.9,956,435“Injectable Botulinum ToxinFormulations；”和Ruegg et al的WO 2014/066916 (PCT/US2013/67154)“Compositionsand Methods for Safe Treatment of Rhinitis”；另外的载体描述在例如Tan et al的美国2016/0166703A1，发明名称“Carrier Molecule Compositions and Related Methods”和Jacob,等人的US 2014/0056811 A1，发明名称“New Cell-Penetrating Peptides AndUses Thereof,”，将其中每篇的全文通过参考并入本文中。
通过使用术语“带正电荷的”或“阳离子的”其意味着所述载体在至少一些溶液相条件下，更优选地在至少一些在生理学上相容的条件下，具有正电荷。更特别地，“带正电荷的”和“阳离子的”意味着所讨论的基团包含在生理学pH条件下带电荷的官能团，例如季铵，或者包含在某些溶液相条件(例如，在伯胺的情况下，pH变化)下可以获得正电荷的官能团。更优选地，如本文使用的“带正电荷的”或“阳离子的”指在生理学上相容的条件下具有与阴离子相结合的行为的那些基团。通常，带正电荷的载体包括如下更详细描述的带正电荷的主链。
载体分子的带正电荷的主链
“带正电荷的主链”典型地是一个原子链，在所述链中具有在生理 pH下携带正电荷的基团，或具有与侧链连接的携带正电荷的基团。通常，主链是直链烃主链，其在某些实施方案中被选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子中断。大多数主链原子通常是碳。另外，主链经常是重复单元(例如，氨基酸、聚(乙烯氧)、聚(丙烯胺)、聚亚烷基亚胺等)的聚合物，并且可以是均聚物或杂聚物。
在某些优选的实施方案中，带正电荷的主链包括阳离子肽，如具有多个带正电荷的侧链基团(例如，赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、高精氨酸等)的多肽。本领域技术人员应当理解当氨基酸用于本发明的这部分中时，侧链可以在连接中心具有D-或L-形式(R或S构型)。
如本文使用的术语“肽”指氨基酸序列，但关于在该氨基酸序列之内的氨基酸残基的数目不带有任何涵义。因此，术语“肽”也可涵盖多肽和蛋白质。例如，本发明的阳离子肽主链可以包含约至约100个氨基酸残基、约10至约50个氨基酸残基或约12至约20个氨基酸残基。在优选的实施方案中，阳离子肽主链包括10至20个氨基酸，或10、11、12、 13、14 15、16、17、18、19或20个氨基酸，优选聚赖氨酸氨基酸残基。
在特别优选的实施方案中，带正电荷的主链为聚赖氨酸。在某些实施方案中，聚赖氨酸可以具有至少约100、200、300、400、500、600、 700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、 5000、5500或6000D，并且小于约2,000,000、1,000,000、500,000、250,000、 100,000、75,000、50,000和25,000D的分子量。在100至2,000,000D 的范围之内，预期下限和/或上限可以分别增加或减少100，每个子区间是本发明的实施方案特别地预期的。本发明预期的聚赖氨酸可以市售可获得的(Sigma Chemical Company,St.Louis,Mo.,USA)聚赖氨酸中任一种，例如具有MW>70,000的聚赖氨酸，具有MW为70,000至150,000 的聚赖氨酸，具有MW 150,000至300,000的聚赖氨酸和具有 MW>300,000的聚赖氨酸。
在某些优选的实施方案中，聚赖氨酸具有约1,000至约1,500,000D、约2,000至约800,000D或约3,000至约200,000D的分子量。在更优选的实施方案中，聚赖氨酸具有约100至约10,000D、约500至约5,000D、约1,000至约4,000D、约1,500至约3,500D、或约2,000至约3,000D 的分子量。特别优选的是具有10至20个赖氨酸(SEQ ID NO：9)，更优选15个赖氨酸的聚赖氨酸多肽。合适的聚赖氨酸的选择取决于组合物的其余组分，并且应当足够提供给带正电荷的载体整体净正电荷。
在另一个实施方案中，所述带正电荷的主链是非肽基聚合物，其可以是杂聚物或均聚物，如聚烯化亚胺，例如聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺。在某些实施方案中，带正电荷的主链是其中许多胺氮原子作为带有正电荷的铵基团(四取代的)存在的聚丙烯胺。在另一组实施方案中，主链已经连接了多个侧链部分，其包括带正电荷的基团(例如，铵基团、吡啶鎓基团、磷鎓基团、锍鎓基团、胍(guanidinium)基团、或脒(amidinium) 基团)。
可替代地，所述主链可包含氨基酸类似物和/或合成氨基酸。所述主链也可以是多肽类似物，如类肽。参见例如，Kessler,Angew.Chem.Int. Ed.Engl.32:543(1993)；Zuckermann等人Chemtracts-Macromol. Chem.4:80(1992)；和Simon等人Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 89:9367 (1992))。简而言之，类肽是其中侧链连接至主链氮原子而非α-碳原子的聚甘氨酸。如上所述，一部分或所有的侧链通常以带正电荷的基团终止，以提供带正电荷的主链成分。在例如美国专利5,877,278中描述了类肽的合成，将其全部内容通过参考并入本文。如该术语在本文中使用的，具有类肽主链结构的带正电荷的主链被认为是“非肽”，因为它们不由具有天然存在于α-碳位置的侧链的氨基酸组成。
可以使用多种其他主链，例如，多肽的空间或电子模拟物，其中肽的酰胺键被替代物所取代，如酯键、硫代酰胺(--CSNH--)、反向硫代酰胺(--NHCS--)、氨基亚甲基(--NHCH2--)或反向的亚甲基氨基(--CH2NH--) 基团、酮-亚甲基(--COCH2--)基团、亚膦酸酯(--PO2RCH2--)膦酰胺 (phosphonamidate)和膦酰胺酯(phosphonamidate ester)(--PO2RNH--)、反向肽(--NHCO--)、反式烯基(--CR＝CH--)、氟代烯基(--CF＝CH--)、二亚甲基(--CH2CH2--)、硫醚(--CH2S--)、羟基亚乙基(--CH(OH)CH2--)、亚甲基氧(--CH2O--)、四唑(CN4)、亚磺酰氨基(--SO2NH--)、亚甲基亚磺酰氨基(--CHRSO2NH--)、反向磺酰胺(--NHSO2--)，和具有丙二酸酯和/或偕二氨基烷基亚单位的主链，例如，如Fletcher等人((1998)Chem. Rev.98:763)综述的及其中引用的参考文献详述的。许多在先的取代导致相对于由α氨基酸形成的主链大致等电子排列的(isosteric)聚合物主链。
在一个特别优选的实施方案中，载体包括相对短的聚赖氨酸或聚乙烯亚胺(PEI)(其可以是直链或支链的)，并且其具有共价连接的带正电荷的效力基团。当载体包括相对短的直链聚赖氨酸或PEI主链时，所述主链将具有小于75,000D，更优选小于30,000D，和最优选小于 25,000D的分子量。然而，当载体为相对短的支链的聚赖氨酸或PEI主链时，所述主链将具有小于60,000D，更优选小于55,000D，和最优选小于50,000D的分子量。在更特别优选的实施方案中，带正电荷的主链为聚赖氨酸且带正电荷的效力基团在C-和/或N-末端连接至赖氨酸。所述效力基团为如下详细描述的。
效力基团
通常，带正电荷的主链具有共价连接的一个或多个效力基团(PTDs 或CPPs)。所述效力基团可以在间隔上是一致的或可变的间距沿主链放置。在优选的实施方案，一个或多个效力基团可以连接至载体主链的一个末端，或者更优选地两个末端的每一个上。另外，效力基团的长度可以类似或不同。在使用如上提供的类肽主链的实施方案中，效力基团可以共价连接主链的多个原子或基团。例如，磺酰胺-连接的主链 (--SO2NH—和--NHSO2--)可以具有连接至氮原子的效力基团。类似地，羟基亚乙基(--CH(OH)CH2--)键可以带有连接至羟基取代基的效力基团。本领域技术人员可以容易地使用标准合成方法改变其它键化学，以提供效力基团。
如本文使用的，效力基团是任何具有促进所述带正电荷的主链移位穿过组织或细胞膜和/或改善与主链结合的分子递送到靶位点的效应的试剂。效能集团的非限制性实例包括HIV-TAT或其片段，或触角足蛋白(Antennapedia)的PTD或其片段，或-(gly)n1-(arg)n2(SEQ ID NO:5)，其中下标n1为0至约20的整数，更优选0至约8，仍然更优选约2至约5，和下标n2独立地为约5至约25的奇整数，更优选约7至约17，最优选约7至约13。
在某些实施方案中，HIV-TAT片段不包含HIV-TAT分子的富含半胱氨酸的区域，以便使与二硫化物聚集相关的问题最小化。优选地， HIV-TAT和触角足蛋白PTD的片段保留了全蛋白质的蛋白质转导活性。一种优选的效力基团为例如-Gly3Arg7(SEQ ID NO:10)。在某些实施方案中，更进一步优选的效力基团为其中HIV-TAT片段具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1), (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2),或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO；3)的那些，其中下标p和q各自独立地为0至约20的整数，或和其中p和q各自独立地为整数1。在某些优选的实施方案中，p为1且q为0，或p为0且q为1。一种优选的HIV-TAT片段为其中下标p和q各自独立地为0至8，更优选 0至5的整数的那些。在某些实施方案中，所述片段或效力基团经由效力基团的片段或氨基酸序列的C-末端或N-末端连接至主链。
在某些实施方案中，效力基团为触角足蛋白(Antp)PTD，或保留活性的其片段。这些是本领域已知的，例如，来自Console等人,J.Biol. Chem.278:35109(2003)，并且本发明预期的触角足蛋白PTD的一个非限制性实例为具有氨基酸序列SGRQIKIWFQNRRMKWKKC(SEQID NO:6)的PTD。
在某些实施方案中，效力基团包含具有氨基酸KLAKLAK(SEQ ID NO:12)的肽。其它示例性的效力基团包括在Tan等人的US 2016/0166703A1，发明名称“Carrier MoleculeCompositions and Related Methods”和在Jacob,等人的US 2014/0056811 A1，发明名称“New Cell-Penetrating Peptides And Uses Thereof,”中公开的任一种 CPP，将其中每篇的全部内容通过通过参考并入本文中。
在某些特别优选的实施方案中，带正电荷的载体为具有氨基酸序列 RKKRRQRRR-G-(K)15-G-RKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)的带正电荷的肽；或具有氨基酸序列 YGRKKRRQRRR-G-(K)15-G-YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:7)的带正电荷的肽；或具有氨基酸序列 RGRDDRRQRRR-G-(K)15-G-RGRDDRRQRRR(SEQ ID NO:8)的带正电荷的肽；；或具有氨基酸序列 RKKRRQRRR-Q-(K)15-Q-RKKRRQRRR(SEQ ID NO:11)的带正电荷的肽，用于本发明的组合物和方法中。
载体的有效量
对于本发明的组合物，相对于组合物中存在的肉毒杆菌毒素的量选择载体的量，以促进毒素的稳定性和/或递送到靶位点。
不希望受到理论的束缚，据信带正电荷的主链与肉毒杆菌毒素的阴离子表面结构域形成非共价静电相互作用，以改善向靶组织的渗透。据信载体的带正电荷的主链也与施用点的带负电荷的细胞外结构和细胞表面相互作用，因此这些相互作用将肉毒杆菌毒素限制在靶位点，减少了由于扩散到非预期的结构引起的不想要的副作用。进一步据信本文所述载体有助于所述主链和肉毒杆菌毒素组合物中的聚集最小化，所述聚集会引起转运效力显著降低。在优选的实施方案中，组合物中载体的浓度足够增强肉毒杆菌毒素递送至分子靶点，如与眉间细纹例如眉间复合区相关的一处或多处肌肉的运动神经板。
进一步地，再次不希望受到理论的束缚，据认为渗透速率遵循受体介导的动力学，使得组织渗透随着渐增量的增强渗透的分子而增加，直至饱和点，此时，转运速率变成恒定值。因此，优选的实施方案，选择含肉毒杆菌毒素组合物中载体的量等于或约等于在饱和之前使渗透速率最大化的量。
在某些实施方案中，载体以如下量提供在含肉毒杆菌毒素组合物中：约0.001至约1μg/U的肉毒杆菌毒素组分，优选约0.01至约0.5μg/U，更优选约0.05至约0.35μg/U或约0.1至约0.3μg/U，和最优选约0.234μg/ 肉毒杆菌毒素单位。在某些优选的实施方案中，带正电荷的载体的使用量大于约2.5、大于约5或大于约7.5μg/40U的150kDa肉毒杆菌毒素分子本身(不含附属(非毒素)蛋白质)。例如，本发明的可注射组合物可以包含约0.16μg/U、约0.18μg/U、约0.2μg/U、约0.21μg/U、约0.22μg/U、约0.23μg/U、约0.234μg/U、约0.24μg/U、约0.25μg/U、约0.26μg/U、约0.28μg/U或约0.3μg/U的肉毒杆菌毒素。
在某些实施方案中，含肉毒杆菌毒素的组合物可以含有约1至约20 μg、约5至约15μg、约7至约12μg、或约8至约10μg,或约9μg的载体。在一个优选的实施方案中，肉毒杆菌毒素的剂量的量选自约20U 至约60U，例如约40U，并且载体为以选自约4.7至约14μg的量存在于组合物中的带正电荷的载体，以便提供约0.234μg/U肉毒杆菌毒素的比例。
通常，载体(优选RTP004)与肉毒杆菌毒素组分(优选不含附属蛋白的150kDa A型毒素)的质量比为约15,000:1至约60,000:1，优选约20,000:1至约55,000:1，如约25,000:1、约30,000:1、约35,000:1、约40,000:1、约45,000:1或约50,000:1。在更特定的实施方案中，载体(优选RTP004)与肉毒杆菌毒素组分(优选不含附属蛋白的150kDa A 型毒素)的质量比为约21,000:1、约22,000:1、约23,000:1、约24,000:1 或约25,000:1；在一些其它更特定的实施方案中，载体(优选RTP004) 与肉毒杆菌毒素组分(优选不含附属蛋白的150kDa A型毒素)的质量比为约49,000:1、约50,000:1、约51,000:1、约52,000:1或约53,000:1。例如，每50U或每100U的毒素，肽载体的质量可以为约10μg、约11 μg或约12μg如约11.7μg，在某些特别优选的实施方案中，如其中毒素的量为约40U。在一个实施方案中，载体(优选RTP004)与肉毒杆菌毒素组分(优选不含附属蛋白的150kDa A型毒素)的摩尔比为3:1摩尔比的载体：毒素。
在某些实施方案中，载体以如下量提供在含肉毒杆菌毒素组合物中：约0.001至约1μg/U肉毒杆菌毒素组分，优选约0.01至约0.5μg/U，更优选约0.05至约0.1μg/U，和最优选约0.075μg/肉毒杆菌毒素单位。在某些优选的实施方案，带正电荷的载体的使用量为大于约1.75μg/40U 的150kDa肉毒杆菌毒素分子(不含附属蛋白质)，即大于约0.04μg/U 直到约0.1μg/U、约0.2μg/U、约0.4μg/U、约0.6μg/U、约0.8μg/U 或约1/μg U。例如，本发明的可注射组合物可以包含约0.045μg/U、约 0.050μg/U、约0.055μg/U、约0.060μg/U、约0.065μg/U、约0.070μg/U、约0.075μg/U、约0.080μg/U、约0.085μg/U、约0.090μg/U、约0.095μg /U或约0.1μg/U肉毒杆菌毒素。
在一个特定实施方案中，带正电荷的载体为 RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQID NO:4)(本文中也称为“RTP004”)且以约3μg/40U的肉毒杆菌毒素(指不含附属蛋白的150kDa毒素蛋白分子)存在。在可注射组合物的一个特定实施方案中，肉毒杆菌毒素以约20U、40U或60U(指不含附属蛋白的150kDa毒素蛋白分子)的量存在，且RTP004载体分别以约1.5μg、约3.0μg或约 4.5μg的量存在。
药物制剂
用于获得高应答率和/或长持续时间的治疗或美容效应的组合物的药物制剂通常是通过混合肉毒杆菌毒素组分(含有相关的非毒素蛋白，缩减的相关非毒素蛋白或单独的150kD分子(不含附属非毒素蛋白质)) 与本文所述载体，并进一步与一种或多种适用于注射的可药用赋形剂或稀释剂混合。在它们的最简单的形式中，它们可以含有水性可药用稀释剂，如缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)。药物制剂也可以含有在可注射药物或美容品组合物中通常存在的其它成分，包括与它们将施用的组织相容的可药用载体、溶媒或介质。
术语“可药用”描述适用于与组合物或组分将施用的组织接触的或通常用于患者的，不具有异常毒性、不相容性、不稳定性、变态反应等的组合物或组分。视情况而定，本发明的组合物可包括通常在研究领域，特别是在美容品和皮肤病学中使用的任何成分。
例如，根据需要，可注射用途的制剂可以含有在这样的产品中通常使用的成分，如抗微生物剂、水合试剂、组织增量剂或组织填充剂、防腐剂、乳化剂、天然油或合成油、溶剂、表面活性剂、洗涤剂、胶凝剂、抗氧化剂、填充剂、增稠剂、粉末、粘度控制剂和水，和任选地包括麻醉剂、抗痒活性物、植物提取物、调节剂、矿物、多酚、聚硅氧烷或其衍生物、维生素和植物药(phytomedicinals)。
在优选的实施方案中，含有肉毒杆菌毒素的药物制剂不包含白蛋白或其它动物蛋白衍生的赋形剂。如上所述，通常加入外源稳定剂(例如，白蛋白)以稳定常规肉毒杆菌毒素制剂。例如，在
的情况下，使用0.5mg人白蛋白/100U的A型肉毒杆菌毒素复合物稳定所述复合物。在优选的实施方案，由于载体组分以其自身充当稳定剂的能力，在本文的肉毒杆菌毒素组合物中加入的稳定剂的量小于通常加入的量。例如，加入的外源性白蛋白的量可以为小于常规外源性白蛋白的千倍过量的任意量。在特别优选的实施方案中，没有任何外源性白蛋白作为稳定剂加入到本发明的组合物中，从而产生无白蛋白的肉毒杆菌毒素组合物。在某些更特别优选的实施方案中，所述制剂几乎不含有或不含有任何其它动物来源的蛋白，得到无动物蛋白的产物。
注射制剂
可注射制剂可以是适用于通过注射施用或用于储存直至以这样的施用使用的任何形式。例如，根据本发明的某些实施方案，用于治疗眉间细纹的组合物的可注射制剂可以包括溶液、乳剂(包括微乳剂)、混悬剂、凝胶、粉剂、或在关于注射施用到肌肉和其它靶组织(面临与肉毒杆菌毒素的美容品用途相关)方面使用的其它典型的固体或液体组合物。
在优选的实施方案中，本发明的组合物以适用于用注射器注射的低粘度无菌制剂存在。本发明的组合物可以为冻干粉末形式，其使用无菌盐水或其它已知的生理学和可药用稀释剂、赋形剂或溶媒(特别是已知用于可注射制剂的那些)重构以供使用。在某些实施方案中，用液体稀释剂重构冻干粉末，以形成具有约0.1至约2000cP、更优选约0.2至约500cP、甚至更优选约0.3至约50cP和仍然更优选约0.4至约2.0cP的粘度的可注射制剂。
在某些实施方案中，可注射制剂可以为控制释放或持续释放组合物形式，包含包封或以其它形式含有在材料内的肉毒杆菌毒素组分和带正电荷的载体，使得它们随时间推移以控制的方式在组织内释放。例如，包含肉毒杆菌毒素和带正电荷的载体的组合物可以被包含在基质、脂质体、囊泡、微囊、微球等中，或者被包含在固体颗粒材料中，所有这些均被选择和/或构建以提供肉毒杆菌毒素随时间推移的释放。所述肉毒杆菌毒素和带正电荷的载体可以一起地(即，在同一胶囊中)或分开地(即，在分开的胶囊中)进行包封。
在某些实施方案中，用于注射的含有肉毒杆菌毒素组合物的赋形剂包括一种或多种另外的稳定组分。在某些实施方案中，本发明的组合物包括液体的(水性的)制剂，其包含如本文所述的肉毒杆菌毒素和带正电荷的载体、以及一种或多种选自下述的载体：非还原糖(如非还原二糖或非还原三糖)、非离子表面活性剂和生理学相容的缓冲液，所述缓冲液能够维持合适的pH。合适的pH包括例如在pH 4.5至pH 7.5、或pH 4.5 至pH 6.8、或pH 4.5至pH 6.5的范围内的pH。应当理解，合适的pH 也包括在所述范围内的上限和下限pH值，例如6.5的pH或7.5的pH。这样的药物制剂描述在例如Thompson等人的US 9,340,587，发明名称“Albumin-Free Botulinum Toxin Formulations；”；Ruegg等人的US专利No.9,956,435，发明名称“Injectable Botulinum Toxin Formulations；”和Ruegg等人的WO 2014/066916(PCT/US2013/67154)“Compositions and Methods for Safe Treatment of Rhinitis,”，将其全文通过参考并入本文中。
在某些实施方案中，非还原糖在液体组合物中的浓度在约10％至约 40％(w/v)的范围内，并且非离子表面活性剂的浓度在约0.005％至约 0.5％(w/v)的范围内。所述液体组合物可以进行干燥(优选地通过冻干) 以产生经稳定的固体组合物，其可以在此后进行重构以用于使用，如上所述。优选地，所述干燥的例如冻干的固体组合物是非结晶的和无定形的固体组合物，并且可以是粉末形式。
在一些实施方案中，本发明的组合物含有非还原糖，其优选为二糖，其非限制性实例包括海藻糖，包括其无水形式和水合形式，或蔗糖，以及其组合。在某些实施方案中，海藻糖的水合形式，海藻糖二水合物是优选的。在其它实施方案中，所述组合物含有三糖，其非限制性实例是棉子糖。通常，非还原糖(优选二糖)的浓度在10％至40％(w/v)，优选约10％至约25％(w/v)，更优选约15％至约20％(w/v)的范围内。在一些优选的实施方案中，非还原糖(优选二糖)的浓度为约10％、11％、 12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％(w/v)。
通常，本发明的组合物可以包括具有稳定肉毒杆菌毒素和适于药物用途的能力的任何非离子表面活性剂。在某些实施方案中，非离子表面活性剂为聚山梨酯，作为非限制性实例的举例，聚山梨酯20、聚山梨酯 40、聚山梨酯60和聚山梨酯80。在其它实施方案中，非离子表面活性剂为脱水山梨醇酯，其非限制性实例包括
20、
60、
65和
80。也可以使用非离子表面活性剂
X-100或NP-40。另外，可以使用不同非离子表面活性剂的组合。在某些优选的实施方案中，非离子表面活性剂为聚山梨酯、泊洛沙姆和/或脱水山梨醇；聚山梨酯和脱水山梨醇是特别优选的。在某些实施方案中，非离子表面活性剂以约0.005％至约0.5％、约0.01％至约0.2％、约0.02％至约0.1％或约 0.05至约0.08％(包括其上限和下限值)的范围存在于本发明的组合物中。在一些优选的实施方案中，本发明的组合物含有(约)0.01％、0.02％、 0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.10％、0.11％、 0.12％、0.13％、0.14％或0.15％的量的非离子表面活性剂。
一般而言，对于本文的可注射制剂，任何能够保持合适pH的生理学相容的缓冲液都适于使用。这样的缓冲液的非限制性实例包括柠檬酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、马来酸和组氨酸的盐。合适的缓冲液浓度的非限制性实例包括在约0.400％至约0.600％、约0.450％至约0.575％、或约0.500％至约0.565％范围内的缓冲液浓度。本发明的组合物也可包含缓冲盐的混合物，其非限制性实例包括柠檬酸盐/乙酸盐、柠檬酸盐/ 组氨酸、柠檬酸盐/酒石酸盐、马来酸盐/组氨酸或琥珀酸盐/组氨酸。
本发明的特定组合物为无白蛋白、液体(水性)组合物，其包含肉毒杆菌毒素，优选血清型A肉毒杆菌毒素、或具有150kDa分子量且不具有相关的附属蛋白的肉毒杆菌毒素A；带正电荷的载体(例如，肽)；非还原二糖或非还原三糖，优选二糖，以10％至40％(w/v)的范围存在；非离子表面活性剂，优选聚山梨酯或脱水山梨醇酯，以0.005％至0.5％ (w/v)的范围存在；和生理学相容的缓冲液，如柠檬酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、马来酸或组氨酸，以0.400％至0.600％；0.450％至0.575％；或0.500％至0.565％的范围存在，用于保持pH在4.5至7.5之间。
在特别优选的实施方案中，用于注射的药物制剂包括L-组氨酸和/ 或L-组氨酸盐酸盐作为其它稳定剂。在特别优选的实施方案中，赋形剂包括海藻糖二水合物、聚山梨酯20、L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐。
可注射制剂的用途
在本发明的另一个方面，本文所述药物制剂用于产生生物效应，优选延长的持续时间生物效应和/或就期望的治疗或美容品益处而言，在较高比例的治疗患者中产生效应。药物制剂通常被施用至需要其的个体，以提供治疗或美容品有效量的肉毒杆菌毒素。术语“需要的”是指包括药物或健康相关的需要(例如，治疗涉及不期望的面部肌肉痉挛的病症)，以及美容和主观需要(例如，改变或改善面部组织的外观)。
根据本发明的肉毒杆菌毒素制剂可以通过注射(典型地，使用注射器) 以有效量递送至在皮肤下面的肌肉或至在皮肤内的腺体结构或其它靶结构，以产生麻痹、产生松弛、缓和收缩、预防或缓和痉挛、减少腺体输出或产生其他预期效应。以该方式的肉毒杆菌毒素的局部递送可以提供剂量减少，降低毒性，并且允许相对于其它可注射或可植入材料而言更精确的对于所期望效应的剂量优化。
施用本发明的组合物以递送治疗或美容有效量的肉毒杆菌毒素。如本文使用的术语“有效量”或“治疗或美容有效量”意味着如下肉毒杆菌毒素的量：足以产生期望的肌肉麻痹或其他生物学或美学效应，但其隐含地是安全的量，即足够低以避免严重的副作用的量。预期效果包括某些肌肉的松弛，其目的是例如减少细纹和/或皱纹的出现(尤其是在面部中)，或者以其它方式调整面部外观，如加宽眼睛、提升嘴角或使从上唇散开的细纹变光滑，或肌肉张力(例如，在眼部或在别处)的总体缓解。
肉毒杆菌毒素可以通过注射施用到肌肉或其它皮肤相关或靶组织结构。通常，根据本发明的制剂注射到其中期望与肉毒杆菌毒素有关的作用的一个或多个位点。所述施用可以向例如脸、腿、肩、背(包括腰)、腋下、掌心、足部、颈部、脸部、腹股沟、手背或足背、肘、上肢、膝、大腿、臀、躯干、骨盆或其中期望施用肉毒杆菌毒素的身体的任何其它部分进行。
可以进行施用本发明的可注射的含肉毒杆菌毒素组合物以治疗其中阻止乙酰胆碱的突触传导或乙酰胆碱释放将赋予治疗或美容益处的任何病症。例如，由根据本发明的组合物可以治疗的病症包括，不限于神经疼痛、偏头痛或其它头痛、膀胱过度活动症、鼻炎、鼻窦炎、痤疮、张力障碍、张力障碍性收缩(无论是主观的还是临床的)、多汗症(无论是主观的还是临床的)和由胆碱能神经系统控制的一个或多个腺体的分泌过多。本发明的组合物还可以用于减弱或增强免疫应答，或治疗对于其来说已建议或实施了通过注射来进行的肉毒杆菌毒素的施用的其他病症。在某些实施方案中，所述生物效应为降低了不期望的面部肌肉痉挛或其它肌痉挛。
在特定实施方案中，施用所述含肉毒杆菌毒素组合物减少了皱纹、细纹、沟纹的严重度，特别是在面部的，如减少了眉间细纹的严重度。本发明的组合物特别适于治疗受试者的细纹，如面部细纹和眉间细纹。
眉间为眉毛和鼻上之间的皮肤。眉间细纹或眉间面部细纹(通常也称为“皱眉细纹”)是在眉毛之间成长的那些竖线，并且可表现为单一竖线或两个或多个细纹，也可以朝着眉毛的内部角成角度出现。当人皱眉时，下部前额的肌肉沿向下方向接触，引起眉毛之间的皮肤产生褶皱。细纹是由反复皱眉行为形成的，应归于皮肤缺乏弹性。更特别地，眉间细纹是由于面部的侧皱眉肌和竖直降眉间肌引起的。皱眉肌压低皮肤产生垂直的细纹，即由绷紧的肌肉的嵴所围绕的沟纹(即皱眉细纹)。年龄、日光照射和遗传都是促成因素(contributing factors)。肉毒杆菌毒素用于阻断神经冲动，暂时性麻痹引起皱眉细纹的肌肉，使得皮肤更光滑、外观更清新。
可以由卫生专业人员和/或受试者按照各种标准评价受试者的眉间细纹的严重度。对于由除了受试者之外的一些人评价，可以使用研究者整体评价-面部皱纹严重度(IGA-FWS)评级得分系统。特别地，(0)的 IGA-FWS评级得分表明没有面部皱纹严重度；(1)的IGA-FWS评级得分表明轻微的面部皱纹严重度；(2)的IGA-FWS评级得分表明中度的面部皱纹严重度；和(3)的IGA-FWS评级得分表明严重的面部皱纹严重度。如由熟练的执业医师所认识到的，照片指南显示了皱纹严重度的等级，和可以由进行评价的人在之前的训练期间使用，和/或在评价期间作为参考。
受试者他/她自身可以使用患者面部皱纹严重度(PFWS)评价他的/ 她的面部皱纹严重度。受试者可以基于最大皱眉完成PFWS，以评价眉间细纹的严重度。受试者可以用镜子或他/她自身的照片观察。PFWS 评级得分系统如下：(0)的PFWS评级得分表明没有皱纹严重度，具有“没有皱纹”的相关描述；(1)的PFWS评级得分表明轻微的皱纹严重度，具有“非常浅的皱纹”的相关描述；(2)的PFWS评级得分表明中度的皱纹严重度，具有“中度的皱纹”的相关描述；和(3)的PFWS评级得分表明严重的皱纹严重度，具有“深的皱纹”的相关描述。
也可以使用大量其它或另外的标准，如患者总体美学改善量表 (GAIS)评价皱纹、细纹或沟纹的视觉外观。该量表可由受试者或除了受试者之外的人使用，以评价眉间细纹的视觉外观，如在最大皱眉时和/ 或在最大皱眉之后的休息时，以确定从基线条件的改善。在某些实施方案中，使用7点严重度GAIS，其中“3”的评级得分表明“非常大的改善”；“2”的评级得分表明“很大改善”；“1”的评级得分表明“改善”；“0”的评级得分表明“没有改变”；“-1”的评级得分表明“变差”；“-2”的评级得分表明“很大地变差”；和“-3”的评级得分表明“非常大的变差”。受试者可以使用镜子或他的/她的照片进行评价。
在某些实施方案中，根据上述一个或多个量表，本发明的方法产生了降低中度和/或重度皱纹的作用，优选中度至重度皱纹。按照一个或多个本文所述的量表，严重度的降低可以是1点、2点或3点改善。
也可以在注射到面部、头部或颈部之后通过评价一个或多个颅神经，如支配(innervate)靶标和相邻肌肉系统的一个或多个颅神经评价本文所述可注射制剂的安全性和功效。例如，在某些实施方案中，评价颅神经II–VII，其中脑神经II为视神经，脑神经III为动眼神经，脑神经IV为滑车神经，脑神经V为三叉神经，脑神经VI为外展神经，和脑神经VII为面神经。
也可以在注射到面部、头部或颈部之后通过评价面部的肌肉力量评价本文所述可注射制剂的安全性和功效。可以使用用于肌肉力量评价的医学研究委员会量表(MedicalResearchCouncil Scale for Assessment of Muscle Power)(MRC)来评价面部肌肉力量。MRC是一种用于评价肌无力的可靠且验证过的量表，并且有助于周围神经损伤的调查。例如，评价在面部的每一侧上的眼轮匝肌(眼睑)、侧提眉肌(lateral brow elevators)和侧颧轮匝肌(lateral orbicularis zygomaticus)的强度。在 MRC量表中，(0)的评级相当于“没有运动”；(1)的评级相当于“肌肉可察觉的颤动”；(2)的评级相当于“只有去除重力时才运动”；(3)的评级相当于“可以逆着重力运动肢体”；(4)的评级相当于“可以逆重力和检查者施加的一些阻力运动”；和(5)的评级相当于“正常力量”。
剂量和施用
本文所述的方法和组合物递送有效地获得就期望的治疗和美容益处而言至少一种生物效应，优选延长的持续时间生物效应，更优选地在接受治疗的较高百分比的患者中获得效应的剂量或量地送肉毒杆菌毒素组分。通常，治疗或美容有效量提供为包含在根据本发明注射施用的药物制剂中德肉毒杆菌毒素单位中的剂量。
在使用可注射制剂的一些实施方案中，施用肉毒杆菌毒素以提供每次注射治疗约1U至约300U、优选约10U至约200U、更优选约20U 至约100U；或者更特别地，约10U至约30U、约30U至约50U、或约50U至约70U。在优选的实施方案中，将本发明的含肉毒杆菌毒素组合物通过注射施用至需要其的受试者，以便提供大于约10U、约20U、约30U、约40U、约60U或约80U的肉毒杆菌毒素的剂量。在优选的实施方案中，所述组合物以提供如下量注射施用：每次注射20U或至少20U；30U或至少30U；40U或至少40U；50U或至少50U； 60U或至少60U；70U或至少70U；80U或至少80U；90U或至少 90U；或100U或至少100U的肉毒杆菌毒素。也预期在前述量或剂量之间的量或剂量，例如25U或至少25U；35U或至少35U；45U或至少45U等。在特别优选的实施方案中，肉毒杆菌毒素的剂量的量选自约10U、约20U、约30U、约40U、约60U和约80U，更优选血清型A肉毒杆菌毒素，最优选不含附属蛋白的150kDa的血清型A肉毒杆菌毒素分子。通常，在本发明的液体可注射制剂中，约100pg/kg的量的150kDa不含附属蛋白的肉毒杆菌毒素A分子将相当于约16 U/kg。在一个特定实施方案中，所述组合物呈单一治疗剂量通过注射施用，所述量提供20、30U、35U、40U、45U、50U或60U的肉毒杆菌毒素，以引起皱纹和/或面部细纹减少，如降低眉间细纹的严重度。
“注射治疗”指可以包括一次或多次注射给患者的单一治疗，例如在单次患者就诊之内的所有注射，如在相互数秒或数分钟之内施用一系列注射；和/或通过相对密切接近(例如，约1cm、约2cm、约3cm、约 4cm或约5cm间隔)的一个或多个注射部位在患者身体的相同一般性区域(例如，眉间复合区)施用。
通常，用于测量肉毒杆菌毒素活性(即，肉毒杆菌毒素活性单位(U)) 的方法和过程是本领域技术人员已知的和惯用的。简而言之，小鼠中的半数致死性分析(LD50分析)通常用于以高度的精确度估计肉毒杆菌毒素的单位数量。所有市售可获得的肉毒杆菌毒素的剂量都按照生物活性的单位表示。例如，一个单位的肉毒杆菌毒素相当于在雌性 Swiss-Webster小鼠中计算的半数腹膜内致死量(LD50)。参见， Hoffman,R.O.等人,1986,Int.Ophthalmol.Clin.,26:241-50,as well as DePass,L.R.,1989,Toxicol.Letters,49:159-170；和Pearce,L.B.等人, 1994,Toxicol.Appl.Pharmacol.,128:69-77，其也描述了本领域的致死性分析。
更特别地，一种用于确定本发明组合物的肉毒杆菌毒素组分的肉毒杆菌毒素单位的合适的方法如下：将四十八(48)只称重17-23克的雌性 CD-1小鼠随机分配给六个剂量的测试制品(1.54、1.31、1.11、0.95、 0.80和0.68U/0.5mL)，每个剂量组八(8)只动物。所述测试制品指要分析或测试的肉毒杆菌毒素制剂或样品。将动物按每个笼八只圈养，并在定量施用测试制品的24小时之内称重。在定量施用当天，将测试样品在等渗盐水(0.9％NaCl)中稀释至合适的浓度。经由腹膜内注射向每只动物施用0.5mL稀释的测试制品。在注射之后，将小鼠放回笼中，并每日三次记录死亡事件。在注射后72小时对致死进行评分，并且将结果通过概率单位(probit)或逻辑分析进行分析以得出相对于使用相同定量施用方案来进行评估的参考标准而言的LD50值。举例来说，所述参考标准为本发明的相同组合物的经特别地认证和校准的批次，其用于进行比较以得出测试制品的相对功效。然后，将所测定的LD50值用于所进行的累积稀释进行校正，以为纯净的(未稀释的)测试制品分配相对功效值。
LD50测试的可替代测试包括使用神经元细胞系或内肽酶分析的分析，其避免在动物中测试(参见，例如Sesardic等人,“Alternatives to the LD50 assay for botulinumtoxin potency testing:Strategies and progress towards refinement,reductionand replacement”Proc.6th World Congress on Alternatives&Animal Use in the LifeSciences,August 21-25,2007,14Special Issue,pp 581-585)。除了LD50分析或替代LD50分析，这样的方法可用于确定用于本发明组合物的肉毒杆菌毒素组分的肉毒杆菌毒素单位。
本发明的药物制剂可以含有治疗或美容有效量的肉毒杆菌毒素，用于呈单剂量治疗应用，如单次注射或单次注射治疗。可替代地，所述药物制剂可以是更浓的，例如在施用的地方稀释，或者可以含有治疗或美容有效量的肉毒杆菌毒素，用于多种应用，如在治疗过程中或在一定时期以连续应用的特定量使用。如本文所述的肉毒杆菌毒素的局部地送可以提供剂量减少，降低毒性，并且允许相对于常规肉毒杆菌毒素制剂而言更精确的对于预期效果的剂量优化。在优选的实施方案中，选择剂量 (例如，单位和体积剂量)以优化毒素向含有肌肉或筋膜/骨膜疼痛感受器的靶受体/神经递质的递送。优化可以基于例如剂量稀释分配原理(参见，例如美国专利No.8,632,768和美国专利No.8,506,970)
通常，将含肉毒杆菌毒素药物制剂通过注射到或接近需要其的患者中一个或多个与待治疗的病症有关的肌肉施用至需要其的患者。施用“接近”或“到”结构意味着施用足够接近所述结构，以允许肉毒杆菌毒素组分容易地扩散到所述结构，考虑了本文公开的肉毒杆菌毒素组合物的扩散降低。例如，施用接近眉间复合区意味着在作为靶点的结构的约0.05mm、约0.1mm、约0.5mm、约1mm、约5mm、约10mm、约 15mm或约20mm之内施用。在一些实施方案中，可以使用超声或其它可视化技术引导注射或注射级分的部位。
在特定实施方案中，所述病症是重度至中度眉间细纹，并且所述药物制剂被注射到眉间复合区的一处或多处肌肉中。所述制剂可以通过在上正中眼眶边缘上施加手指压力且同时将针头穿过皮肤推进到下面的肌肉中来注射。在更特定的实施方案中，治疗剂量在注射中被分到选自右皱眉肌、左皱眉肌和降眉间肌的一处或多处肌肉中，在给定注射治疗期间施用。例如，总治疗剂量可以被分成两份、三份、四份、五份、六份、七份、八份、九份或十份等，并且特定的剂量的量可以注射到不同靶结构中。
例如，在一个实施方案中，将总治疗剂量的一部分注射到进行治疗的受试者的眉毛之间的前额的许多注射部位的一个中。例如，将约10U 至约20U、约10U至约15U或约13U剂量的肉毒杆菌毒素注射到左皱眉肌、右皱眉肌和降眉间肌的每个中。作为另一个实例，将约10U 至约30U、约15U至约20U或约16U剂量的肉毒杆菌毒素注射到左皱眉肌和右皱眉肌的每个中，并将约5U至约15U、约7U来至约10U 或约8U剂量的肉毒杆菌毒素注射到降眉间肌中。在一个特别优选的实施方案中，将两次注射施用到每处皱眉肌中，并将一次注射施用到降眉间肌，总共5次注射，例如将约5U至约15U、约7U至约10U、或约8U剂量的肉毒杆菌毒素注射到左皱眉肌的内侧方向、左皱眉肌的侧方向、右皱眉肌的内侧方向、右皱眉肌的侧方向和降眉间肌的每个中。
在某些实施方案中，待治疗的患者为65岁、至少65岁或超过65 岁。例如，患者可以为65、66、68、70、72、73、75、77、78、80岁以上。
最优选地，所述制剂由医师或其它护理专业人员或在他们指导下施用。它们可以以单次治疗或随时间推移的一系列治疗施用。因为其性质，肉毒杆菌毒素优选地以将会产生期望的结果而不产生严重不利的或不期望的结果的量、应用率和频次来施用。
延长的持续时间
在另一个方面，本发明提供本文所述的药物制剂用于获得延长的作用持续时间的方法和用途。在优选的实施方案中，与使用常规肉毒杆菌毒素制剂治疗相比，本文所述制剂用于向需要其的受试者施用肉毒杆菌毒素以产生延长的持续时间的治疗效果。在某些实施方案中，所述方法包括通过注射施用治疗或化妆上有效剂量的如本文所述的无菌可注射制剂，优选地注射到与眉间细纹或其它细纹或皱纹有关的一处或多处肌肉或其它结构中，以在注射治疗之后获得延长的持续时间作用。在优选的实施方案中，施用肉毒杆菌毒素组合物引起作用持续时间增加，如至少改善与治疗或美容益处有关的生物效应，其比常规肉毒杆菌毒素制剂持续更久，从而允许治疗之间更长的间隔。
特别优选的实施方案得到了治疗和/或美容效应，特别地，降低了眉间细纹严重度约3个月至约11个月、约5个月至约10个月、约6个月至约10个月、或约16周至约24周、或约28周至约40周。在优选的实施方案中，在施用第二剂量或随后治疗剂量之前，作用持续时间为至少约16周、至少约20周、至少约24周、至少约6个月、至少约28周、至少约7个月、至少约30周、至少约32周、至少约8个月、至少约34 周、至少约36周、至少约9个月、至少约40周、至少约10个月或至少约42周。在特定实施方案中，在首次治疗剂量之后或在后续治疗剂量之后，施用第二次或后续治疗剂量的组合物之前的间隔大于或等于26 周、28周、30周、32周、34周、36周、38周、40周，或大于或等于 42周。
可以通过本文所述或本领域已知的任何测量方法或其组合评价关于减少细纹、皱纹或沟纹的作用持续时间。例如，可以使用在本文实施例中，特别是实施例7中，例如对于主要和/或次要终点所讨论的任何一个或多个测量方法测量作用持续时间。例如，在初步治理之前，可以考虑持续减少眉间细纹直到细纹恢复基线的时间；或者，可以基于如本文所述的用于评价皱纹严重度的一种或多种测量方法，考虑持续直到最后一个“点”失去；或者，可以再次基于如本文所述的用于评价皱纹严重度的一个或多个测量方法，考虑持续长达至0或1得分(无或轻度皱纹)。
在另一个方面，本发明提供本文所述药物制剂在用于获得与治疗或美容益处有关的生物效应的治疗方案中的方法或用途，其中在一次或多次连续治疗之间的间隔比同样使用常规肉毒杆菌毒素制剂的治疗方案 (如其中使用多次治疗保持治疗目标)中的更长。例如，在某些实施方案中，本发明提供一种降低受试者中眉间细纹的严重度的方法，其中所述方法包括具有延长作用持续时间的多次治疗的治疗过程，因此，连续治疗之间的间隔比使用常规肉毒杆菌毒素制剂(即，不含有载体分子的制剂，如本文所述的)的方案更长。例如，不具有本文所述载体的含肉毒杆菌毒素的产品通常提供小于6个月，如今仅约3-4个月的作用。
在特定实施方案中，在首次治疗剂量之后或在后续治疗剂量之后，施用第二次或后续治疗剂量的含肉毒杆菌毒素组合物之前的间隔大于或等于至少约26周、至少约28周、至少约30周、至少约32周、至少约34周、至少约36周、至少约38周、至少约40周或至少约42周、或等于约42周。在定量施用之间的中值持续时间可以为23周、至少23 周、或大于23周；24周、至少24周、或大于24周；25周、至少25 周或大于25周；26周、至少26周或大于26周；27周、至少27周或大于27周；28周、至少28周或大于28周；30周、至少30周或大于 30周，例如直到约一年。
特别地，在通过将一定剂量的无菌可注射制剂注射到至少一个与皱纹、面部细纹或沟纹(如眉间复合区)有关的肌肉或面部结构中以获得在治疗后(优选在首次治疗后)降低其严重度的实施方案中，获得了本节上述段落中的一个或多个结果。在一些这样的实施方案中，所述组合物包含注射用可药用稀释剂；肉毒杆菌毒素，如肉毒杆菌毒素A，优选不含附属蛋白的150kDa分子；和带正电荷的载体，包括具有共价连接其的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO: 1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数，优选地其中所述载体包含氨基酸序列 RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)或由其组成。更优选地，肉毒杆菌毒素以如下量的单次治疗剂量通过注射施用至个体：每次注射治疗其提供约10U至约100U、或约20、40、或60U肉毒杆菌毒素，最优选40U。在一个特定实例中，药物制剂进一步包含非还原二糖，如蔗糖或海藻糖，优选海藻糖二水合物；非离子表面活性剂，如聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80或脱水山梨醇酯；和生理学相容的缓冲液，如柠檬酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、马来酸和组氨酸，其能够保持合适的pH，如在pH4.5至pH 6.5范围内或在 pH 4.5.至pH 7.5范围内的pH，例如以如本文所述的w/v量；和/或所述载体：毒素的质量比为约20,000:1至约55,000:1，最优选约51,000:1。在仍然更优选的实施方案中，所述制剂不含白蛋白(albumen-free)和/或不含动物性蛋白，并且所述药物组合物包含0.1mg聚山梨酯20、36mg 海藻糖二水合物和8μg,9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg和15 μg，最优选11.7μg RTP004/50 U的150kDa A型毒素(不含附属蛋白质)，且治疗剂量为40U。
在一些这样的实施方案中，施用包括在单次治疗约3-7次注射，优选5次注射，注射到眉间复合区，如其中在单次治疗(例如，在单次就诊之内所有注射，在互相数秒至数分钟之内一系列注射)中将约5U至约15U、约7U至约10U、或约8U的肉毒杆菌毒素组分注射到右皱眉肌的内侧方向、右皱眉肌的外侧方向、左皱眉肌的内侧方向、左皱眉肌的外侧方向和降眉间肌的每个中，更优选地使用约0.01至约1ml/注射、约0.02至约0.8mL/注射、约0.04至约0.6mL/注射、约0.06至约 0.4mL/注射、约0.08至约0.2mL/注射、或约0.1mL/注射。也参见实施例7。
在优选的实施方案中，如上述那些中，在施用第二次或后续治疗剂量之前，治疗或美容效应可以具有至少约6个月至约10个月的持续时间，或约26周至40周的持续时间。更优选地，在通过单次注射治疗所述组合物，比如通过如上述段落中描述的药物制剂之后，获得延长的治疗或美容效应。仍然更优选地，如本文所述的治疗方案提供持续改善脸部细纹的外观，如持续降低眉间细纹的严重度。
在一个特定实施方案中，单剂量的含有如所述带正电荷的载体和剂量的量为40U的150kDa肉毒杆菌毒素A(不含附属蛋白质)的本发明组合物在治疗眉间细纹方面提供长持续时间作用，例如至少24周、 25周、26周、27周或28周、或30、32、34或36周，例如直到约一年。
在根据本发明的治疗过程中，基于通过如本文所述的本发明的组合物和方法的治疗和美容有效剂量得到的延长的作用持续时间，在初步治疗剂量之后，可注射制剂可以以更不频繁的间隔施用。例如，按照本发明的方法的实施，本发明的组合物可以向需要其的个体施用(或定量施用)约每年两次(约每6个月)，或更少次数，每年两次，如例如每7 个月、8个月、9个月、或10个月、或11个月、或每年一次。在一个特定实施方案中，施用个体一定剂量的本发明的组合物，每年两次。定量施用之间的中值持续时间可以为23周、24周、25周、26周、27周、 28周、29周、或30周、或31周、32周、33周、34周、35周或36周，取决于治疗或美容性治疗和/或治疗期望的，如由待治疗的个体所确定的。
更高的应答率
与延长的作用持续时间一起或在可替代的实施方案中，已经令人惊奇地发现与市售可获得的肉毒杆菌毒素制剂(如
)相比，在更高比例的接受治疗的个体中出现生物效应。即，在一些优选的实施方案中，与常规肉毒杆菌毒素制剂(如没有如本文所述的带正电荷的载体的制剂)相比，在施用本文公开的含肉毒杆菌毒素制剂之后，对于接受肉毒杆菌毒素药物制剂的更高比例的个体，治疗或美容效应出现和/或持续延长的持续时间。
例如，施用本文所述药物组合物可以产生生物效应，具有治疗或美容一处，如降低皱纹、细纹(例如眉间细纹)或沟纹的严重度，其在每次施用所述制剂的40-90％的个体中，持续至少约4周。在优选的实施方案中，在每次施用所述药物组合物的约55至约60％、约65％至约70％、或约65％至约75％的个体中，所述应答保持或所述作用持续约4周。在某些实施方案中，在每次施用如本文所述的药物制剂(例如，如实施例7中的)的至少超过约55％、超过约56％、超过约58％、超过约60％、超过约62％、超过约65％、超过约66％、超过约68％、超过约70％、超过约72％、超过约73％或超过约75％，直至在每次施用所述药物制剂约75％、约80％或约90％的个体中，所述应答保持或所述作用持续至少约4周。
在更优选的实施方案中，在每次施用所述制剂的约30％至约80％的个体中，所述作用如降低皱纹、细纹(例如，眉间细纹)或沟纹的严重度持续至少约16周，如在每次施用所述药物组合物的约35％至约 40％、约40％至约50％、或约50％至约70％的个体中，持续至少约16 周。在某些实施方案中，在每次施用如本文所述的药物制剂(例如，如实施例7中的)的超过约35％、超过约36％、超过约38％、超过约40％、超过约43％、超过约45％、超过约47％、超过约50％、超过约53％、超过约55％、超过约57％、超过约60％、超过约63％、超过约65％、超过约68％、更优选地超过70％、超过73％、或超过75％，直至在每次施用所述药物制剂的约75％、约80％或约90％的个体中，所述应答保持或所述作用持续至少约16周。
在甚至更优选的实施方案中，在每次施用所述制剂的10％至约30％的个体中，所述作用如降低皱纹、细纹(例如，眉间细纹)或沟纹的严重度持续至少约24周，如在每次施用所述药物组合物的15％至约20％、或约20％至约30％的个体中，持续约24周。在某些实施方案中，在每次施用如本文所述的药物制剂(例如，如实施例7中的)的至少超过约 15％、超过约16％、超过约18％、超过约20％、超过约22％、超过约 23％、超过约25％、超过约27％、超过约30％的个体中，直至在每次施用所述药物制剂的约30％、约40％或约50％的个体中，所述应答保持或所述作用持续至少约24周。
因此，如上所述使用的方法和组合物得到了降低有此需要的个体的皱纹、细纹(例如，眉间细纹)或沟纹的方法，与施用传统肉毒杆菌毒素制剂的个体相比，各自施用所述药物组合物的个体的应答率提高了。特别地，在通过将一定剂量的无菌可注射制剂注射到至少一个与皱纹、面部细纹或沟纹(如眉间复合区)有关的肌肉或面部结构中以取得在处理后(优选在第一次处理后)降低其严重度的实施方案中，获得了本节上述段落中的一个或多个结果。在一些这样的实施方案中，所述组合物包含注射用可药用稀释剂；肉毒杆菌毒素，如肉毒杆菌毒素A，优选不含附属蛋白质的150kDa分子；和带正电荷的载体，包括具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述效力基团具有氨基酸序列 (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、 (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或 (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数，优选地其中所述载体包含氨基酸序列 RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)或由其组成。更优选地，肉毒杆菌毒素以如下量的单次处理剂量通过注射施用至个体：每次注射处理其提供约10U至约100U、或约20、40、或60U肉毒杆菌毒素，最优选40U。在一个特定实例中，药物制剂进一步包含非还原二糖，如蔗糖或海藻糖，优选海藻糖二水合物；非离子表面活性剂，如聚山梨酯 20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80或脱水山梨醇酯；和生理学相容的缓冲液，如柠檬酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、马来酸和组氨酸，其能够保持合适的pH，如在pH 4.5至pH 6.5范围内或在pH 4.5.至pH 7.5范围内的pH，例如以如本文所述的w/v量；和/或所述载体：毒素的质量比为约20,000:1至约55,000:1，最优选约51,000:1。在仍然更优选的实施方案中，所述制剂不含蛋白和/或不含动物蛋白，并且所述药物组合物包含每50U的150kDa A型毒素(不含附属(非毒素)蛋白) 0.1mg聚山梨酯20、36mg海藻糖二水合物和8μg、9μg、10μg、 11μg、12μg、13μg、14μg、15μg，最优选11.7μg的RTP004，处理剂量为40U。
在一些这样的实施方案中，施用包括在单次处理约3-7次注射，优选5次注射，注射到眉间复合区，如其中在单次处理(例如，在单次就诊之内所有注射，在互相数秒至数分钟之内一系列注射)中将约5U至约15U、约7U至约10U、或约8U的肉毒杆菌毒素组分注射到右皱眉肌的内侧方向、右皱眉肌的外侧方向、左皱眉肌的内侧方向、左皱眉肌的外侧方向和降眉间肌的每个中，更优选地使用约0.01至约1ml/注射、约0.02至约0.8mL/注射、约0.04至约0.6mL/注射、约0.06至约 0.4mL/注射、约0.08至约0.2mL/注射、或约0.1mL/注射。也参见实施例7。
试剂盒
本发明也预期多种递送装置用于跨皮肤施用本文所述含肉毒杆菌毒素组合物产生关于期望的治疗或美容益处的生物效应的用途，所述生物效应优选为在接受处理的高百分比的受试者中延长的持续时间作用。这样的装置可以包括而不限于针和注射器，或者可以涉及能够分配组合物和监测组合物的分配，和任选地在一个或多个方面监测受试者的病症 (例如，监测受试者对于正进行分配的物质的反应)的更精密的装置。
应当注意到用于构建所述装置的材料的选择很重要。用于构建递送装置的优选材料是不会导致由于装置表面上的肉毒杆菌毒素的降解或不想要的吸附引起肉毒杆菌毒素/载体组合物的活性损失的那些。例如，当水溶液中的肉毒杆菌毒素/载体接触聚丙烯表面时，而不是当肉毒杆菌毒素/载体溶液接触聚氯乙烯(PVC)表面时，已经观察到这样的不想要的行为。
在某些实施方案中，所述组合物可以预先配制和/或预先安装在递送装置中。本发明还涉及其中组合物提供在分开储存一种或多种组分与其余组分的试剂盒中的实施方案。例如，在一些实施方案中，本发明提供试剂盒，其在不同容器(例如，第一和第二容器)中分别储存肉毒杆菌毒素组分和载体，用于在应用时或在应用前混合。载体与肉毒杆菌毒素的量将取决于选择哪种载体用于所讨论的组合物中.
例如，载体与肉毒杆菌毒素的量可以以选自下述的比例提供：约 0.01μg/U、约0.02μg/U、约0.04μg/U、约0.06μg/U、约0.08μg/U、约 0.1μg/U、约0.12μg/U、约0.14μg/U、约0.15μg/U、约0.16μg/U、约 0.18μg/U、约0.20μg/U、约0.22μg/U、约0.23μg/U、约0.234μg/U、约0.24μg/U、约0.25μg/U、约0.26μg/U、约0.28μg/U、约0.3μg/U、约0.32μg/U、约0.34μg/U、约0.36μg/U、约0.38μg/U或约0.4μg/U 肉毒杆菌毒素，优选150kDa A型毒素(不含附属蛋白质)，更优选地其中所述载体为RTP004。在特定的实施方案中，肉毒杆菌毒素以约40 U(指150kDa的A型毒素蛋白分子(不含附属蛋白质))的量提供，并且RTP004载体以约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约11μg 或约12μg的量提供。
在其它实施方案中，载体为RTP004，并且以大于约1.75μg/40U的 150kDa肉毒杆菌毒素肉毒杆菌毒素分子(不含附属蛋白质)的量提供，即大于约0.04μg/U。例如，载体与肉毒杆菌毒素的量可以以选自下述的比例提供：约0.045μg/U、约0.050μg/U、约0.055μg/U、约0.060μg/U、约0.065μg/U、约0.070μg/U、约0.075μg/U、约0.080μg/U、约0.085 μg/U、约0.090μg/U、约0.095μg/U或约0.1μg/U的肉毒杆菌毒素。在特定实施方案中，肉毒杆菌毒素以约20U、40U或60U(指150kDa 毒素蛋白分子(不含附属蛋白质))的量提供，并且RTP004载体分别以约1.5μg、约3.0μg或约4.5μg的量提供。
本发明还涉及用于将肉毒杆菌毒素组分施用至受试者或有此需要的患者的方法，其中将治疗有效量的肉毒杆菌毒素与如本文所述的载体一起施用。“连同...一起”是指在组合程序中施用所述两种组分(肉毒杆菌毒素和载体)，其可以涉及在向受试者施用之前将它们混合，或者分别施用它们，但是以使得它们一起发挥作用以提供治疗有效量的毒素的必需递送的方式。肉毒杆菌毒素可以以干燥形式储存在注射器或其它分配装置中，并且载体可以在应用毒素之前注射或局部应用，使得两者一起起作用，导致期望的组织渗透增强和/或相对于传统肉毒杆菌毒素制剂的其它特性改善，如上所述。在这个意义上，所述两种物质(载体和肉毒杆菌毒素)组合或相互作用在原位形成组合物或组合。因此，本发明还包括具有用于分配肉毒杆菌毒素和包含载体的液体、凝胶等的装置的试剂盒，所述装置适合于局部应用或注射至靶组织。用于在健康护理专业人员的指导下或由患者或受试者施用本发明的组合物的试剂盒也可包括适合于该目的的定制的施涂器。
具有长持续时间、高应答率和持续安全性的重复处理
在仍然另一个方面，本发明涉及用于施用多个连续肉毒杆菌毒素处理的方法和组合物，其一致地提供如上所述的结果和优点。特别地，可以向个体施用与带正电荷的载体非共价地相结合的肉毒杆菌毒素组分超过一次，以降低皱纹、细纹或沟纹，特别是在脸部的，例如眉间细纹的严重度。在一些优选的实施方案中，与在第一次或之前处理之后作用的持续时间相比，后续处理取得的治疗或美容效应的持续时间更长，如降低皱纹、细纹或沟纹的持续时间更长。在一些优选的实施方案，与在第一次或之前处理之后的应答率相比，后续处理取得更高百分比的接收治疗个体的应答，如显示眉间细纹减少和/或保持减少延长的时间段的受试者的百分比更高。在一些优选的实施方案，与第一次或之前处理有关的副作用相比，后续处理取得具有更少副作用的应答，如在重复处理眉间细纹之后不良事件更少。在更优选的实施方案中，后续处理相对于第一次或之前处理取得两种或多种改善，如同时获得较长的持续时间和较少的不良事件，同时获得持续时间更长和应答可能性更高，应当可能性更高和不良事件更少。在最优选的实施方案中，与在之前处理之后的个体应答相比，后续处理在接受重复处理的个体中获得的持续时间更长、不良事件更少和应答可能性更高。
在特定实施方案中，当重复处理时用于获得一种或多种改善的组合物包含剂量为每次注射处理时约1U至约300U、优选约10U至约200 U、更优选约20U至约100U；或更优选约10U至约30U、约30U至约50U、或约50U至约70U的肉毒杆菌毒素组分。在优选的实施方案中，将本发明的含肉毒杆菌毒素组合物通过注射施用至有此需要的受试者，以便提供大于约10U、约20U、约30U、约40U、约60U或约 80U的肉毒杆菌毒素的剂量。在优选的实施方案中，所述组合物以提供如下量注射施用：每次注射20U或至少20U；30U或至少30U；40U 或至少40U；50U或至少50U；60U或至少60U；70U或至少70U； 80U或至少80U；90U或至少90U；或100U或至少100U的肉毒杆菌毒素。也预期在前述量或剂量之间的量或剂量，例如25U或至少25U； 35U或至少35U；45U或至少45U，等。在特别优选的实施方案中，肉毒杆菌毒素的剂量的量选自约10U、约20U、约30U、约40U、约60U和约80U，更优选血清型A肉毒杆菌毒素，最优选150kDa血清型A肉毒杆菌毒素分子。通常，在本发明的液体可注射制剂中，约100 pg/kg的量的不含附属蛋白质的150kDa的肉毒杆菌毒素A分子将相当于约16U/kg。
在不同处理时，重复处理可以使用相同剂量或不同剂量，例如，递增剂量或递减剂量。在一个特定实施方案中，所述组合物在重复处理中通过注射施用，每次提供接近相同剂量，如在上述段落中列出的剂量，优选约20U、约40U或约60U剂量的具有150kDa MW的A型肉毒杆菌毒素(不含附属蛋白质)，引起皱纹、细纹或沟纹减少，如眉间细纹的严重度降低延长的持续时间，超过在第一次或之前处理之后的持续时间。
特别地，在包括通过将一定剂量的无菌可注射制剂注射到至少一个与皱纹、面部细纹或沟纹(如眉间复合区)有关的肌肉或面部结构中连续施用的实施方案中，获得了本节上述段落中的一个或多个结果。在一些这样的实施方案中，所述组合物包含注射用可药用稀释剂；肉毒杆菌毒素，如肉毒杆菌毒素A，优选不含附属蛋白质的150kDa分子；和带正电荷的载体，包括具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述效力基团具有氨基酸序列 (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2),或 (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20，优选地，其中所述载体包括氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)或由其组成。更优选地，肉毒杆菌毒素以如下量的处理剂量通过注射施用至个体：每次注射处理其提供约10U至约100U、或约20、40、或60U肉毒杆菌毒素，最优选40U。在一个特定实例中，药物制剂进一步包含非还原二糖，如蔗糖或海藻糖，优选海藻糖二水合物；非离子表面活性剂，如聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80或脱水山梨醇酯；和生理学相容的缓冲液，如柠檬酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、马来酸和组氨酸，其能够保持合适的pH，如在pH 4.5至pH 6.5范围内或在pH 4.5. 至pH7.5范围内的pH，例如以如本文所述的w/v量；和/或所述载体：毒素的质量比为约20,000:1至约55,000:1，最优选约51,000:1。在仍然更优选的实施方案中，所述制剂不含蛋白和/或不含动物蛋白，并且所述药物组合物包含0.1mg聚山梨酯20、36mg海藻糖二水合物和8μg、9μg、 10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、或15μg，最优选11.7μg的RTP004/50 U 150kDa A型毒素(不含附属(非毒素)蛋白)，并且处理剂量为40 U。
在一些这样的实施方案中，施用包括在单次处理中约3-7次注射，优选5次注射到眉间复合区，如其中在给定处理(例如，在单次就诊之内的所有注射，如在相互数秒或数分钟之内施用一系列注射)中，将约 10U至约30U、约15U至约20U、或约16U的肉毒杆菌毒素组分注射到右皱眉肌和左皱眉肌的每个中，和将约5U至约15U、约7U至约 10U、或约8U的肉毒杆菌毒素组分注射到降眉间肌中，更优选地使用约0.01至约1ml/注射、约0.02至约0.8mL/注射、约0.04至约0.6mL/ 注射、约0.06至约0.4mL/注射、约0.08至约0.2mL/注射或约0.1mL/ 注射。也参见例如实施例8。
在重复处理之后进一步延长持续时间
在一些特定实施方案中，本发明提供通过施用多次连续肉毒杆菌毒素处理来增加用于减少有此需要的个体中皱纹、细纹或沟纹的效应持续时间的方法和组合物，其中通过注射到或接近皱纹、细纹或沟纹向所述个体施用肉毒杆菌毒素组合物的第一次处理；接着至少一次连续处理。在优选的实施方案中，第一次处理减少所述皱纹、细纹或沟纹至少约20周，并且一次或多次连续处理减少所述皱纹、细纹或沟纹的持续时间比在第一次处理之后获得的更长。
在特定实施方案中，减低严重度的皱纹、细纹或沟纹是眉间细纹。在这样的实施方案中，施用可以包括至少一次注射到选自右皱眉肌、左皱眉肌和降眉间肌的一处或多处肌肉中。在更特别的实施方案中，在下述实施例7或实施例8中，施用是如上所述的。
通常可以根据本领域已知的或本文所述的任何方法，包括上述公开的用于在第一次处理之后期间和/或实施例8中评价的测量方法，评价在重复处理之后眉间细纹减少的作用的持续时间。特别优选的实施方案提供在施用第二次和后续处理剂量之前，眉间细纹严重度降低至少约20 周、至少约24周、至少约6个月、至少约28周、至少约7个月、至少约30周、至少约32周、至少约8个月、至少约34周、至少约36周、至少约9个月、至少约40周、至少约10个月或至少约42周。在特定实施方案中，在第一次处理剂量之后或在后续处理剂量之后，施用第二次或后续处理剂量的组合物之前的间隔大于或等于26周、28周、30周、 32周、34周、36周、38周、40周，或大于或等于42周。
通常，在作用的持续时间期间之后，例如在受试者的眉间细纹的严重度从不可见或轻度增加至出现中度或重度，或者在处理之前恢复到它们的基线之后，施用后续或连续处理。在某些实施方案中，例如，在皱纹变得可见之前，或者在第一次处理之前皱纹恢复其外观之前，较早施用后续或连续处理。因此，在某些实施方案中，施用连续或后续处理约 12周至约36周、约16周至约34周、约16周至约32周、约18周至约 36周、约20周至约36周、约21周至约35周、约22周至约34周、约 23周至约33周、约24周至约32周、约25周至约31周、和约26周至约30周。
在某些实施方案中，待处理的患者为65岁、至少65岁或超过65 岁。例如，患者可以为65、66、68、70、72、73、75、77、78、80岁或更年长。在优选的这样的实施方案中，延长的效应持续时间和/或在连续处理之间的间隔可以为上述公开的任何时间段或更长，特别地，约26至约52周、约27至约50周、约28至约48周、约29至约46周、约 30至约44周、约31至约42周、或约32至约40周。
应当理解，在后续处理之后增加效应持续时间允许连续处理之间的时间间隔越来越长。例如，采用包含非共价地相结合带正电荷的载体的肉毒杆菌毒素的组合物的处理过程可以在第一次和第二次处理之间具有第一个间隔，其比在第二次和第三次处理之间的第二个间隔更短，其可等于或短于在第三次和第四次之间的第三个间隔，等。例如，处理过程可以包括约12周的第一个间隔和大于12周，如约14周、约16周或约20周的第二个间隔。处理过程可以包括约16周的第一个间隔和大于 16周，如约18周、约20周或约22周的第二个间隔。处理过程可以包括约20周的第一个间隔和大于20周，如约22周、约24周或约26周的第二个间隔。处理过程可以包括约24周的第一个间隔和大于24周，如约26周、约28周或约30周的第二个间隔。对于一个、两个、三个或更多个治疗周期；或者仅对于前几个周期，如仅对于周期一、二和三，或者仅对与周期一和二，处理过程的间隔可以增加。
因此，在某些实施方案中，后续肉毒杆菌毒素处理之间的间隔为约 12周至约36周、约16周至约34周、约16周至约32周、约18周至约 36周、约20周至约36周、约21周至约35周、约22周至约34周、约 23周至约33周、约24周至约32周、约25周至约31周、和约26周至约30周。在优选的实施方案中，后续肉毒杆菌毒素处理之间的间隔为大于约20周至约36周，大于约22周至约34周，大于约24周至约32 周，或大于约26周至约30周。在更优选的实施方案中，后续间隔为第二个间隔、第三个间隔、第四个间隔和第五个间隔中至少一个。
应当进一步理解，在时期期间，如在受试者期望处理的期间，间隔越长就转化为处理越少。
在重复处理之后应答率增加
在一些特定实施方案中，本发明提供通过施用多个连续肉毒杆菌毒素处理用于在有此需要的个体中获得减少皱纹、细纹或沟纹的肉毒杆菌毒素应答的可能性的方法和组合物，其中通过注射到或接近皱纹、细纹或沟纹向个体施用肉毒杆菌毒素组合物的第一次处理；接着施用至少一个连续处理，其具有比第一次处理减少皱纹、细纹或沟纹的更大可能性。在优选的实施方案中，所述皱纹、细纹或沟纹是眉间细纹。特别地，降低皱纹、细纹或沟纹的应答是延长持续时间的应答，使得个体具有在重复处理之后保持肉毒杆菌毒素应答延长期的可能性增加。例如，如通过本文所述的一种多种测量方法评价，与在第一次处理之后保持眉间细纹减少4周的可能性相比，在后续处理之后，受试者可以具有保持眉间细纹减少4周的可能性增加。更优选地，如通过本文所述的测量方法评价，与在第一次处理之后保持眉间细纹分别减少8周、12周、16周、20周、 24周、28周、32周或36周的可能性相比，在后续处理之后，受试者可以具有保持眉间细纹减少8周、12周、16周、20周、24周、28周、32 周或36周的可能性增加。
在某些实施方案中，在施用第一个处理剂量之后，在至少80％的个体中，和/或在施用第二个或后续处理剂量之后，在至少85％的个体中，皱纹、细纹或沟纹如眉间细纹减少持续至少约4周。在优选的实施方案中，在施用第一个处理剂量之后，在至少85％的个体中，和/或在施用第二个或后续处理剂量之后，在至少90％的个体中，皱纹、细纹或沟纹如眉间细纹减少持续至少约4周。在更优选的实施方案中，在施用第一个处理剂量之后，在至少90％的个体中，和/或在施用第二个或后续处理剂量之后，在至少95％的个体中，皱纹、细纹或沟纹如眉间细纹减少持续至少约4周(参见，例如实施例8)。
例如，施用本文所述药物组合物可以产生皱纹、细纹(例如，眉间细纹)或沟纹的严重度降低，在第一次处理之后，其在40-90％的个体中持续至少约4周，并且在后续处理之后在更大百分比的个体中持续至少约 4周。在优选的实施方案中，在各自施用第一次处理的约55至约60％、约65％至约70％、或约65％至约75％的个体中，所述应答保持或所述作用持续约4周，并且在各自施用第二次处理的约60至约65％、约70％至约75％、或约70％至约80％的个体中持续约4周。在某些实施方案中，在各自施用第一次处理的至少超过约55％、超过约56％、超过约 58％、超过约60％、超过约62％、超过约65％、超过约66％、超过约68％、超过约70％、超过约72％、超过约73％或超过约75％、直到约 80％的个体中，所述应答保持或所述作用持续至少约4周，并且在各自施用第二次处理的至少超过约57％、超过约58％、超过约60％、超过约62％、超过约64％、超过约67％、超过约68％、超过约70％、超过约72％、超过约74％、超过约75％或超过约77％的个体(参见例如.,实施例8)，直至各自施用药物制剂的第二次处理的约80％、约85％或约 90％的个体中，所述应答保持或所述作用持续至少约4周。
在重复处理之后减少副作用
在一些特定实施方案中，本发明提供用于减少在通过施用多次连续肉毒杆菌毒素处理来减少有此需要的个体中皱纹、细纹或沟纹中与肉毒杆菌毒素施用有关的副作用的方法和组合物，其中通过注射到或接近皱纹、细纹或沟纹向所述个体施用肉毒杆菌毒素组合物的第一次处理；接着施用至少一次连续处理，其产生比第一次处理处理更少的副作用。在优选的实施方案中，所述皱纹、细纹或沟纹为眉间细纹。
与肉毒杆菌毒素施用有关的副作用或不良事件为在其与施用肉毒杆菌毒素相关的方面明确的、大概的或可能处理突发性的或处理相关的不良事件，例如如实施例8中所述的。所述不良事件可以是轻度的、中度的、重度的或严重的，例如如实施例8中所述的。特别地，使用包含与带正电荷的带正电荷的载体非共价地相结合的肉毒杆菌毒素的组合物可以减少通常与毒素向远处扩散有关的副作用(不良事件)。这样的不良事件包括，不限于调节障碍、反射消失、误吸、视力模糊、肉毒中毒、眼睑功能障碍、眼睑下垂、面神经麻痹、面神经轻瘫、第四脑神经轻瘫、周围神经麻痹、外周神经性瘫痪、盆底肌无力、误吸性肺炎、瞳孔反射受损、心动过缓、睫毛下垂、球麻痹、便秘、脑神经麻痹、脑神经瘫痪、隔膜麻痹、复视、口干燥、发音困难、吞咽困难、发声困难、呼吸困难、眼球外肌麻痹、轻瘫(paresis)、胃肠病症、四肢麻痹 (quadriparesis)、头痛、轻偏瘫、舌下神经麻痹、反射减弱、张力减退、单肢轻瘫、肌无力、麻痹、松弛性瘫痪(paralysis flaccid)、麻痹性肠梗阻、下肢轻瘫、脑神经麻痹、呼吸衰竭、呼吸停止、呼吸抑制、语言障碍、第三脑神经麻痹、三叉神经麻痹、尿滞留、声带麻痹(vocal cord paralysis)、声带麻痹(vocal cord paresis)和干眼症(干眼)。
在优选的实施方案中，根据本文的方法和用途的重复处理导致与初步处理相比一种或多种这样的不良事件的发生较少和/或严重度降低。在一个更优选的实施方案中，与在第一次处理之后的眼睑下垂相比，在后续处理之后，眼睑下垂的频率和/或严重度降低了。
应当理解，本文描述的下述实施例和实施方案仅仅用于示例说明的目的，提示根据其的各种修饰或变化将是本领域技术人员容易想到的，并且包括在本申请的精神和权限以及附加权利要求的范围之内。本文由“约”限定的数值也指精确数值。
将本文引用的所有出版物、专利和公布的专利申请的全部内容通过参考并入本文中，用于所有目的。
实施例
实施例1：在小鼠模型中局部肌肉麻痹的持续时间
该实施例比较了在用RT003或
进行注射的小鼠中局部肌肉麻痹的持续时间。RT003是根据本发明的示例性可注射制剂，其包含 A型肉毒杆菌毒素(其经纯化以去除所有内源性非毒素蛋白质)和具有序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR的带正电荷的载体。
也包含A型肉毒杆菌毒素，但是添加了外源性白蛋白以使所述A型肉毒杆菌毒素分子稳定。
使用由Aoki,K.R.在“A comparison of the safety margins of botulinumneurotoxin serotypes A,B,and F in mice”,Toxicon 2001；39(12):1815–1820中所报道的趾外展得分(DAS)测定法来测量肌肉麻痹。在所述DAS测定法中，将小鼠通过其尾巴短暂地悬吊以引起特征性的惊吓应答，其中小鼠伸展其后肢并外展其后趾。在五点量表 (0-4)上对小鼠能够展示出该惊吓应答的程度进行评分，其中零表示正常的惊吓应答和四表示趾外展和腿伸展的最大减少。所述评分由不知道受试者小鼠被用神经毒素进行处理的程度的观察者来进行。对于未处理的动物群体，使用该DAS测定法的基线得分被测得为0.4。
在本实施例中所报道的研究涉及10只动物(在RT003组中5只小鼠，和在
组中5只小鼠)。这些动物中的每一只用各自的肉毒杆菌毒素制剂(即，RT003或
)注射三次，其中在每次按剂量施用之间具有40天的时间段。在注射后，对在每个测试组中的所有动物均超过DAS测定法的0.4基线的天数进行计数。在图1中所显示的结果表明，关于经RT003处理的组的DAS测定法得分在第一、第二和第三次处理后停留在0.4基线值之上分别25、22和21天。相反地，关于经
处理的组的DAS测定法得分在第一、第二和第三次处理后停留在0.4基线值之上分别11、8和11天。
这些DAS测定法数据表明，由RT003所引起的局部肌肉麻痹持续的时间长度是由
所引起的局部肌肉麻痹的两倍。该结果对于 RT003和其他根据本发明的可注射的含肉毒杆菌毒素的化合物的治疗性用途具有重要的暗示。特别地，通过使用根据本发明的可注射组合物，可以显著地减少为了维持由肉毒杆菌毒素所引起的特别的美容或治疗效应所需要的后续注射的频次。反过来，减少的应用频次可以导致更好的长期功效，因为受试者更少倾向于发展出对于肉毒杆菌毒素的抗体。
实施例2：具有经改善的安全性特性谱的可注射肉毒杆菌毒素制剂
在过去的几十年内，肉毒杆菌毒素已被用作用于处理各种各样的状况(包括皱纹、多汗症和肌肉痉挛)的治疗性试剂。但是，由于肉毒杆菌毒素是已知对于人的最强有力的天然出现的毒素，因而该毒素的不适当施用可以是极其危险的。例如，肉毒杆菌毒素的意外的全身递送可以导致麻痹、呼吸困难和甚至死亡。此外，即使肉毒杆菌毒素作为治疗性处理的一部分而被正确地递送至身体的局部区域，该毒素也具有随着时间进行扩散的天然倾向，因而增加了在身体的其他部分中的不想要的麻痹的风险。例如，当在眼睛周围注射肉毒杆菌毒素以处理皱纹时，它可以扩散至控制眼睑运动的肌肉。如果这发生了，那么眼睑肌肉可能变得部分地被麻痹，这导致称为“眼睑下垂”的众所周知的状况，其中眼睑部分地闭合并且干扰正常的视觉。
本发明的一个方面是提供具有相比于目前可得的商业肉毒杆菌毒素制剂而言经改善的安全性特性谱的可注射肉毒杆菌毒素制剂。在优选的实施方案中，所述可注射肉毒杆菌毒素制剂具有降低的在注射后扩散的倾向。以这种方式，本发明的某些优选的制剂允许肉毒杆菌毒素的更准确的递送，从而大大地减少与肉毒杆菌毒素的不受控的局部扩散相关联的不想要的副作用。
该实施例报道了在各种制剂中肉毒杆菌毒素在注射后扩散的倾向的比较研究。所述研究涉及三种肉毒杆菌毒素制剂：(1)
(2)RT003，一种经缓冲和经稳定化的溶液，其包含与具有式 RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR的带正电荷的载体非共价地相结合的150kD A型肉毒杆菌毒素分子本身而不含附属蛋白质；和(3) RTT150，其与RT003制剂相同，除了不包含在RT003中存在的带正电荷的载体外。
用上面提及的肉毒杆菌毒素制剂之一对在该研究中所使用的小鼠中的每一只小鼠的腓肠肌进行注射，要么在肌肉的外侧至中线部分(图 2A)要么在肌肉的中线部分(图2B)。在用肉毒杆菌毒素进行注射后，在所述小鼠中的每一只上实施DAS测定法四天，以确定各自制剂的肉毒杆菌毒素是否展示出任何从腓肠肌向小鼠后爪扩散的倾向。从所述 DAS测定法中，将受试动物的任何降低的外展其后趾的能力解释为肉毒杆菌毒素扩散的指示。
图3显示了在用上面所描述的不同肉毒杆菌毒素制剂对受试动物进行注射后实施的DAS测定法的结果。注意，趾外展得分被归类成两个群集，其相应于注射是在腓肠肌的中线部分还是在腓肠肌的外侧至中线部分。相比于关于外侧至中线注射的DAS得分而言通常更低的关于中线注射的DAS得分表明，在受试动物的后爪中的麻痹程度通常在中线注射后是更低的。在不希望受限于理论的情况下，认为该行为产生自相比于外侧至中线注射而言在中线注射后肉毒杆菌毒素不得不行进更大的距离以到达受试动物的后趾。认为该更大的所需的肉毒杆菌毒素行进距离降低了后趾麻痹的可能性。
图3显示了，对于在RT003制剂的中线注射后的所有四天，趾外展得分为零。该结果表明，在RT003制剂中的肉毒杆菌毒素在注射后保持定位在腓肠肌的中线部分中，并且在该实验的时间尺度上没有出现引起麻痹的扩散。相反地，在注射RTT150和
制剂后观察到超过0.4DAS基线的趾外展得分，其中关于
制剂的平均DAS得分是更高的。关于RTT150和
制剂的DAS结果表明，在这些制剂的中线注射后观察到受试动物的后趾麻痹，其中在注射
制剂后观察到更大的麻痹程度。这些数据暗示，在RTT150和
制剂中的肉毒杆菌毒素分子能够在注射后局部地扩散，其中关于在
制剂中的肉毒杆菌毒素分子具有更大的局部扩散程度。
图3还显示了，在外侧至中线注射后对于所有受试动物均观察到后趾麻痹，与具体的肉毒杆菌毒素制剂无关。如上面所讨论的，该相比于中线注射而言在外侧至中线注射后更大的麻痹程度被认为与对于肉毒杆菌毒素来说至受试动物后爪的更短的行进距离有关。但是，虽然所有三种肉毒杆菌毒素制剂在外侧至中线注射后均展示出引起麻痹的扩散，但是在该实验的时间尺度期间在用RT003进行注射的受试动物中的麻痹程度平均而言比关于RTT150和
制剂所观察到的麻痹程度更低。因此，相应于外侧至中线注射的DAS测定法数据在性质上与关于中线注射的DAS测定法数据是相似的，因为它显示了相比于RTT150 和
而言降低的关于RT003制剂的肉毒杆菌毒素局部扩散的倾向。
在中线注射和外侧至中线注射后局部扩散率的比较可以通过考虑被称为“扩散指数”的参数来进行，所述参数按照等式(1)来定义：
由于趾外展得分可以从0至4变动，并且预期外侧至中线趾外展得分高于中线趾外展得分(如上面所讨论的)，因此扩散指数值将会典型地从0至100变动。接近100的扩散指数值表明，中线趾外展得分与外侧至中线趾外展得分的比例接近一。如果在注射后的扩散率是足够高的，从而对于肉毒杆菌毒素来说在中线注射和外侧至中线注射后到达受试动物的后趾并使之麻痹的扩散时间是相当的或几乎相同的，那么这可能出现。在另一个极端，接近零的扩散指数值表明，中线趾外展得分与外侧至中线趾外展得分的比例接近零。如果在中线注射后肉毒杆菌毒素的扩散是如此低，以至于它不足以在受试动物的后趾中引起麻痹(尽管在外侧至中线注射后观察到了麻痹)，那么这可能出现。
下面的表1显示了在
RT003和RTT150的中线注射或外侧至中线注射后使用趾外展得分所计算出的扩散指数值，如在相应于图3的实验中所报道的。在该实验的时间尺度上，相应于注射
制剂的扩散指数值比关于RTT150和RT003制剂所观察到的值高。这表明，关于注射
制剂，中线趾外展得分与外侧至中线趾外展得分的比例更接近于一，相比于关于RTT150和RT003制剂所观察到的比例而言。由于肉毒杆菌毒素在中线注射后必须进一步扩散以引起受试动物的后趾麻痹，因此在
注射后中线趾外展得分与外侧至中线趾外展得分的比例更接近于一这一观察结果暗示，在
的中线注射后肉毒杆菌毒素扩散率相对于在外侧至中线注射后的扩散率而言是相当大的。换言之，与中线注射相关联的增加的扩散路径长度对于引起后趾麻痹来说不会是太大的障碍。
相反地，关于RT003的扩散指数值在该实验的四天时间尺度上均是零。该结果表明，在RT003的中线注射后没有观察到诱导麻痹的扩散。换言之，RT003制剂(其包含与带正电荷的载体非共价地相结合的 A型肉毒杆菌毒素分子)允许所注射的A型肉毒杆菌毒素的增强的局部化。以这种方式，RT003制剂提供了相比于
制剂而言的经改善的安全性特性谱并且使不想要的麻痹最小化。
所观察到的关于RTT150的扩散指数值虽然不是零(如在RT003 的情况下)，但仍然比关于
制剂所观察到的那些小。参见表1。该结果表明，在该实验的四天时间尺度上出现了足够的肉毒杆菌毒素扩散从而产生可观察到的后趾麻痹，但是在中线注射后对于肉毒杆菌毒素的引起麻痹的扩散所需要的时间是相对更长的。
表1
关于RTT150、
和RT003的肉毒杆菌毒素扩散指数测量结果
实施例3：具有降低的产生抗体的倾向的可注射肉毒杆菌毒素制剂
当定期地将肉毒杆菌毒素注射到患者中以处理不想要的状况例如皱纹时，经常观察到肉毒杆菌毒素的功效随连续的注射而下降，虽然肉毒杆菌毒素的效应持续时间可以保持相同。该现象被认为是患者的免疫系统形成对于肉毒杆菌毒素的抗体的结果。从处理的角度来看，患者形成对于肉毒杆菌毒素的抗体是不希望的，因为那么就需要越来越大剂量的肉毒杆菌毒素以取得相同的效应，这具有与安全性和花费两者相关的严重问题。
在某些实施方案中，本发明提供了可注射肉毒杆菌毒素制剂，其具有相比于目前可得的商业可注射肉毒杆菌毒素制剂而言降低的诱导抗体形成的倾向。因此，在这些实施方案中，肉毒杆菌毒素制剂通过允许随着时间使用更少的毒素来取得相同的效应而有助于使与肉毒杆菌毒素注射相关联的风险最小化。
在该实施例中，随时间变化分析在重复的RT003和
注射 (如在实施例2中所描述的)后获得的DAS测定法数据，以确定在对相同的受试动物重复施用后这两种制剂的功效如何变化。通常，在重复施用任一种所述制剂后，与肉毒杆菌毒素相关联的效应持续时间是相同的。但是，在重复施用后肌肉麻痹的程度依赖于制剂而变化。为了定量肌肉麻痹程度的变化，按照等式(2)来确定在注射RT003或
后趾外展得分的变化百分比：
由于等式(2)的分子为在关于第n次和第一次处理所测量的趾外展得分之间的差，因此如果关于第n次处理所测量的趾外展得分比关于第一次处理所测量的趾外展得分小，那么DAS的变化百分比将会是负的。换言之，当相比于第一次处理而言在第n次处理后观察到更少的麻痹时， DAS的变化百分比是负的。表2显示了在按照在实施例2中所描述的程序重复施用RT003和
制剂后所测量的DAS值的变化百分比。
表2
在重复施用RT003和
后DAS值的变化百分比
如在表2中所指出的，在第一次复处理后，趾外展得分的变化百分比对于
制剂来说为-44％，这暗示了功效的重大下降。相反地，关于RT003制剂的趾外展得分的变化百分比为零，这表明在第二次复处理后的DAS得分与在初始处理和第一次复处理后的DAS得分是相同的。该结果表明，在RT003的第一次复处理后所观察到的麻痹程度与在第一次处理后的麻痹程度是相同的，并且即使在第一次复处理后在受试动物中出现了可忽略的中和抗体形成。在RT003和
的第2 次复处理后，所计算出的DAS值的变化百分比对于这两种制剂来说都是负的，虽然关于RT003制剂的DAS值的变化百分比的大小程度是关于
所测定的值的一半。关于
所观察到的更大的和负的DAS值的变化百分比暗示，受试动物具有相比于RT003而言更高的对于
的抗体产生率。因此，这些数据表明，由本发明所考虑的制剂，例如RT003，可以具有更低的诱导抗体形成的倾向，所述抗体中和肉毒杆菌毒素的效应。因此，该结果暗示，通过使用由本发明所考虑的制剂，可以随着时间使用更少的肉毒杆菌毒素来取得相同的治疗效应。
实施例4：具有经改善的稳定性的可注射肉毒杆菌毒素制剂
该实施例证明，在本发明的可注射肉毒杆菌毒素制剂中所使用的带正电荷的载体分子不仅增强制剂的安全性特性谱(实施例2)，而且还改善其稳定性。表3显示了老化实验的结果，其中将RT003和RTT150 制剂在4℃下(仅RT003)和在40℃下(RT003和RTT150两者)老化各种不同的时间间隔。在指定的温度下老化指定的时间后，通过一系列的小鼠IP LD50测定法来测量RT003和RTT150制剂的效能。在表3中所概括的结果表明，RT003的效能在于4℃进行老化后基本上没有变化，即使在六个月后。进一步地，即使将RT003制剂在升高的温度(40℃) 下老化六个月，通过在小鼠IP LD50测定法中所述制剂杀死靶动物的能力所测量的RT003制剂的效能仅稍微下降。相反地，RTT150制剂在于 40℃进行老化仅一个月后就展示出效能的显著降低。由于RT003和 RTT150制剂是相同的(除了RT003制剂还包含具有式RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR的带正电荷的载体分子外)，因而这些数据表明所述带正电荷的载体分子改善在RT003制剂中肉毒杆菌毒素的稳定性。
表3
在各种条件下进行RT003和RTT150的老化后小鼠IP LD50测定法的结果
实施例5：在眉间细纹处理中显示出长期持续时间的效应的可注射肉毒杆菌毒素
制剂
该实施例描述了在第24周的临床研究和结果的中期分析，以评价称为RT002的本发明的可注射组合物的安全性、功效和效应持续时间，所述本发明的可注射组合物包含肉毒杆菌毒素A和带正电荷的载体，所述带正电荷的载体包含具有共价地附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸多肽。所述RT002产品是可注射制剂，其包含不与具有式RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR的带正电荷的载体肽(RTP004；SEQ ID NO:4)共价地相结合的150kD亚型A肉毒杆菌毒素分子，并且其不包含附属蛋白质或源自动物的组分。在用于处理中度至重度眉间细纹的研究中使用RT002。每50U的150kDa A型毒素(不含附属蛋白质)，赋形剂包含0.1mg聚山梨酯20、36mg海藻糖二水合物和11.7μg RTP004，并且处理剂量为40U。
该临床研究是2期的、随机化的、双盲的、剂量变动的、活性产品和安慰剂-控制的、多中心的研究，其被设计并实施去评价用于在成人中临时改善眉间细纹外观的通过注射RT002来进行的单次(一次)处理的安全性和功效和效应持续时间。相比于活性产品即
(20U剂量，通过肌内注射)和安慰剂对照(肌内注射)而言来评价RT002的三个剂量，20U、40U和60U。所述注射处理是单次肌内注射。还评估了在所述三个剂量水平下RT002的单次处理的效应持续时间，相对于
Cosmetic。
所述RT002产品由配制成冻干粉末的经纯化的不含附属蛋白质的 150kDa肉毒杆菌神经毒素(称为RTT150)组成。在非临床研究中， RT002已显示展示出比其他形式的肉毒杆菌神经毒素A(BoNTA)更少的扩散，并且可以在靶位点处提供更多的效应控制，且具有更少的副作用(其是由于毒素远距离散布入邻近的肌肉中)。另外，RT002这种没有添加剂的A型肉毒杆菌毒素制剂具有提供更小的免疫原性潜力的能力，这是由于在所述制剂中不存在非活性蛋白质。另外，在大鼠中在直至50U/kg的重复剂量肌内施用后，RT002被很好地耐受。
按剂量施用方案和注射技术：对于该研究，RT002的按剂量施用方案为RT002(20U、40U或60U、安慰剂或
(其以20U/受试者进行按剂量施用)的单次处理，作为进入到经受处理的患者的在眉毛之间的前额上的5个注射位点中的每一个之中的0.1 mL肌内注射(总共0.5mL)。所有处理都是由经训练的医师来实施的肌内注射。更特别地，研究受试者接受向五个注射位点的0.1mL/注射处理的单次处理：两次注射入每处皱眉肌中，和一次注射在降眉间肌中。调查者、现场工作人员、受试者和主办者对于处理组分配是不知情的。大约250名成年的女性和男性受试者(30至65岁且处于良好的总体健康，在进入时具有中度至严重的眉间细纹)被招收参加了本研究。
眉间脸部细纹源于在脸部中的侧面的皱眉肌和垂直的降眉间肌。这些可以通过在让患者最大程度地皱眉时进行肌肉块的触诊而容易地鉴定。皱眉肌压低皮肤，从而产生垂直的细纹，即由绷紧的肌肉的嵴所围绕的沟纹(即皱眉细纹)。由于肌肉的位置、大小和使用在个体之中明显地变化，因而施用可注射肉毒杆菌毒素的医师必须理解所涉及的区域的相关解剖学和由于先前的外科手术程序而引起的对于解剖学的任何改变。为了降低上睑下垂的风险，最佳地实施下列步骤：(i)应当避免上睑提肌的或在上睑提肌附近的注射，特别是在具有较大的降眉肌的患者中；(ii)正中的皱眉肌注射应当在骨质的眶上嵴之上至少1厘米处；(iii)应当确保所注射的体积/剂量是准确的；和(iv)毒素不应当于比在中央眉毛之上1厘米近之处进行注射。通过在上正中眼眶边缘上施加指压并同时将针头穿过皮肤推进到下面的肌肉中来注射肉毒杆菌毒素。
对于该研究，由调查者和受试者来评估受试者的眉间细纹的严重度。关于调查者评估，如下来使用“调查者总体评估-面部皱纹严重度 (IGA-FWS)”评级得分系统：(0)的IGA-FWS评级得分表明没有面部皱纹严重度；(1)的IGA-FWS评级得分表明轻微的面部皱纹严重度；(2)的IGA-FWS评级得分表明中度的面部皱纹严重度；和(3) 的IGA-FWS评级得分表明严重的面部皱纹严重度。如由熟练的开业医生所意识到的，照片指南展示出了用于调查者和参考的皱纹严重度的等级。
患者面部皱纹严重度(Patient Facial Wrinkle Severity，PFWS)评估：患者面部皱纹严重度(PFWS)用于他的/她的面部皱纹严重度的受试者评估。受试者在最大皱眉下完成患者面部皱纹严重度(PFWS)，以在筛选就诊、处理就诊(第0天)(处理前)、随访就诊(第2、4、 8、12、16、20、24、28、32周)和研究结束就诊(第24、28、32或 36周，视情况而定)或早期中止就诊(若有可能)时评估眉间细纹的严重度。在使用所提供的手持式镜子来检查眉间细纹的时候，将评估表直接提供给受试者以进行填写。PFWS评级得分系统如下：(0)的PFWS 评级得分表明没有皱纹严重度，具有“没有皱纹”的相关描述；(1)的 PFWS评级得分表明轻微的皱纹严重度，具有“非常浅的皱纹”的相关描述；(2)的PFWS评级得分表明中度的皱纹严重度，具有“中度的皱纹”的相关描述；和(3)的PFWS评级得分表明严重的皱纹严重度，具有“深的皱纹”的相关描述。按照本研究，对于待被招收参加本研究的受试者来说，要求关于受试者的眉间细纹的(2)(中度的)的或(3)(严重的)的IGA-FWS和PFWS评级。
将受试者以1:1:1:1:1随机分至在下面的表4中所给出的处理之一中。
表4-处理组的描述
被招收参加本研究的受试者在整个直至36周的研究中具有筛选和处理就诊以及随访安全性和功效评价。在初始的2周时间段内提供受试者日记以记录处理应答的起始。在本研究的第1周用电话访问和在本研究的第2、4、8、12、16、20、24、28、32和36周在就诊期间对受试者进行评价。所有受试者在处理后被追踪至少24周。如果受试者在最大皱眉下的“调查者总体评估-面部皱纹严重度”(IGA-FWS)得分在24 周就诊和36周就诊之间返回基线，那么记录那个得分时所处的就诊被认为对于该受试者来说是研究结束就诊。
研究持续时间为直至38周(进行研究中)，包括直至两周的筛选期，随后为单次处理，和处理后直至36周的随访期。所有受试者在处理后被追踪至少24周。在筛选就诊、处理就诊(第0天)(处理前和后(以确定是否存在对于调查产品的立即反应))、随访就诊(第2、4、8、12、16、20、24、28、32周)和研究结束就诊(第24、28、32或36周，视情况而定)或早期中止就诊(若有可能)时对注射位点进行评价。所述评估以5个注射位点的总体评价来进行，并且评价了红斑、水肿、烧灼或刺痛感和瘙痒，由受试者所描述。
另外，在处理就诊(第0天)(处理前)时、在随访就诊(第2、4、 8、12、16、20、24、28、32周)时和在研究结束就诊(第24、28、32 或36周，视情况而定)或早期中止就诊(若有可能)时由调查者来对脑神经II–VII进行评价。如下获取关于脑神经评估的得分：(1)的评级相应于“正常”；(2)的评级相应于“不正常，不是在临床上显著的”； (3)的评级相应于“不正常，在临床上显著的”；(4)的评级相应于“未评估”。对于这些评估，脑神经II是视神经；脑神经III是动眼神经；脑神经IV是滑车神经；脑神经V是三叉神经；脑神经VI是展神经；和脑神经VII是面神经。区域House-Brackmann面神经分级系统(Yen, T.L.等人,2003,Otol.Neurotol.,24(1):118–122)被设计用于评价联带运动和使靶标和邻近的肌肉系统受神经支配的面神经(VII)的四个主要分支。调查者在处理就诊(第0天)(处理前)、随访就诊(第2、4、 8、12、16、20、24、28、32周)和研究结束就诊(第24、28、32或 36周，视情况而定)或早期中止就诊(若有可能)时对面神经(VII) 的功能性进行评价。
使用“关于肌肉力量评估的医学研究委员会(MRC)量表”(Medical ResearchCouncil Scale for Assessment of Muscle Power)来评价面部肌力。MRC是用于评估肌无力的可靠且经验证的量表，并且有助于周围神经损伤的调查(Paternostro-Sluga,2008)。评价了在脸的每一侧上的眼轮匝肌(眼睑)、侧提眉肌和侧颧轮匝肌。在用于肌肉力量评估的MRC 量表中，(0)的评级相应于“无运动”；(1)的评级相应于“肌肉中可感知的颤动”；(2)的评级相应于“只有当去除重力时才有运动”；(3) 的评级相应于“可以对抗重力移动四肢”；(4)的评级相应于“可以对抗重力和一些由检查者所施加的阻力进行移动”；和(5)的评级相应于“正常力量”。
在处理就诊(第0天)(处理后)、随访电话访问(第1周)、随访就诊(第2、4、8、12、16、20、24、28、32周)和研究结束就诊(第 24、28、32或36周，视情况而定)或早期中止就诊(若有可能)时对受试者进行毒素远距离散布询问。另外，在这些相同的时间点还评价了不利事件(AE)。不希望是限制性的，AE的例子包括复视、眼睑麻痹、肌无力、极度疲劳以及吞咽、呼吸和说话困难。
功效评估包括眉间细纹严重度和眉间细纹改善量表的调查者评估，眉间细纹严重度和改善的受试者评估，包括受试者问卷，和通过受试者日记所评价的效应的起始。对处于坐姿的受试者进行功效评估。为了在评估期间具有一致的眼睛位置布置，调查者要求受试者聚焦在检查室中的固定点上。所述评估应当在具有良好的头顶照明(不应当使用检查灯)或来自窗户的自然光(但不是直接的阳光)的房间中进行。在每次门诊就诊时，由调查者来评估眉间细纹的目视外观(在最大皱眉下和在最大皱眉后休息的情况下)，其中使用如下的用于脸部皱纹严重度得分的适合于目的的4点IGA-FWS量表/评级得分：(0)的评级得分相应于没有脸部皱纹；(1)的评级得分相应于轻微的脸部皱纹；(2)的评级得分相应于中度的脸部皱纹；和(3)的评级得分相应于严重的脸部皱纹。所述评估描绘了在每个给定时间点处的皱纹严重度，并且不是基于与处理前水平的比较。最佳地，由相同的调查者并且在每次就诊时在尽可能接近于一天中的相同时刻来完成评估。在使调查者之间的皱纹严重度评级标准化的努力中，将一套展示出皱纹严重度等级的训练照片用于调查者训练。还给每个研究中心提供照片指南以协助调查者的评估。
患者总体美学改善量表(GAIS)：调查者和受试者通过使用在下面的表5中所显示的7点严重度“患者总体美学改善量表”(GAIS)来评估从基线状况起的眉间细纹改善的目视外观(在最大皱眉下和在最大皱眉后休息的情况下)。研究受试者在最大皱眉下和在最大皱眉后休息下填写的“患者总体美学改善量表”(GAIS)，以在随访就诊(第2、 4、8、12、16、20、24、28、32周)和研究结束就诊(第24、28、32 或36周，视情况而定)或早期中止就诊(若有可能)时评估从基线状况起的眉间细纹改善的目视外观。在使用所提供的手持式镜子来检查所处理的区域的时候，将GAIS评估表直接提供给受试者以进行填写。具有隐形眼镜的受试者最佳地在佩戴其隐形眼镜的时候查看其眉间细纹。建议佩戴眼镜的受试者在没有眼镜的情况下查看其眉间细纹，如果可能。如果对于受试者来说需要眼镜以看清其眉间细纹，那么就佩戴眼镜来进行评估。受试者评估在调查者完成IGA-FWS评估之前完成。
表5-总体美学改善量表
| 评级得分 | 皱纹改善 |
| -3 | 非常大程度地变差 |
| -2 | 大程度地变差 |
| -1 | 变差 |
| 0 | 没有变化 |
| 1 | 经改善 |
| 2 | 大程度地经改善 |
| 3 | 非常大程度地经改善 |
在每次门诊就诊时，受试者通过使用下面的用于患者面部皱纹严重度的受试者评估的适合于目的的4点量表(下面的表6)来评估眉间细纹的目视外观(在最大皱眉下)。在使用所提供的手持式镜子来检查眉间处理区域的时候，将评估表直接提供给受试者以进行填写。关于上面的GAIS 评估，具有隐形眼镜的受试者最佳地在佩戴其隐形眼镜的时候查看其眉间细纹。建议佩戴眼镜的受试者在没有眼镜的情况下查看其眉间细纹，如果可能。如果对于受试者来说需要眼镜以看清其眉间细纹，那么就佩戴眼镜来进行评估。受试者评估在调查者完成IGA-FWS评估之前完成。所述评估描绘了在每个给定时间点处的皱纹严重度，并且不是基于与处理前缺陷水平的比较。最佳地，由受试者在每次就诊时在尽可能接近于相同时刻来完成评估。
表6-患者面部皱纹严重度(PFWS)
| 评级得分 | 皱纹严重度 | 描述 |
| 0 | 无 | 没有皱纹 |
| 1 | 轻微 | 非常浅的皱纹 |
| 2 | 中度 | 中度的皱纹 |
| 3 | 严重 | 深的皱纹 |
在该研究期间额外的受试者评估包括：在选择美学处理时效应持续时间的重要性的评级(在处理就诊(第0天)时提供的)；受试者对处理结果的满意度的评级(在第4周就诊时)，以问卷的形式以便对他们对处理结果的满意度进行评级-受试者被问及他们对脸部的经处理的区域的外观如何满意或不满意；和他们对处理效应持续时间的满意度的评级(在研究结束就诊(第24、28、32或36周，视情况而定)或早期中止就诊(若有可能)时)。
在处理就诊(第0天)(处理前)、随访就诊(第2、4、8、12、16、 20、24、28、32周)和研究结束就诊(第24、28、32或36周，视情况而定)或早期中止就诊时获取处理区域的数码照片。以受控和标准化的方式获取数码照片。向现场工作人员和调查者提供参考照片和合适的训练。最佳地，受试者不佩戴任何类型的眼睛或面部装饰品。为了使来自皮肤的光反射最小化，在获取任何照片之前用酒精片对经处理的区域进行擦吸清洁并让其干燥以去除皮肤油脂。照片包括在最大皱眉下和在最大皱眉后休息的情况下受试者的前额视图。
统计分析∶所有统计学程序设计和分析均通过使用9.3版本或更高版本的SAS来进行。由于该研究没有被赋予检测处于0.05水平的在处理组之间的任何在统计学上显著的差异的能力，因此期望从下面所描述的各种测试中所获得的p-值去建立统计学趋势。没有对测试的多重性进行调整。对于意向处理(intent-to-treat，ITT)群体、符合方案(per-protocol， PP)群体和安全性群体总结了人口统计和基线特征。由处理组以及由处理组和地理学/国家，在所有时间点对于所有功效变量提供了描述性的统计学。对于ITT和PP群体进行了功效分析。安全性分析在安全性群体上进行。
群体：所有被随机分组并接受处理(至少一个剂量的研究药物)的受试者被包括在意向处理(ITT)群体中。所有被随机分组、接受处理并已提供至少一个处理后安全性评估的受试者被包括在安全性群体中。符合方案(PP)群体包括完成了24-周评价而没有重大的方案违反的来自 ITT群体的受试者。因下列原因中的任一个而从PP群体中排除受试者： (i)受试者违反纳入/排除标准；(ii)受试者错过了第24周就诊；(iii)受试者使用了被禁止的药物；(iv)受试者的第24周就诊在计划表外±5天(在经计划安排的就诊日方面被允许的变化之外)。
关于安全性组和功效比较，将受试者随机分入5个处理组(RT002 20U；RT002 40U；RT002 60U；安慰剂；活性比较物)。在每个RT002 剂量与活性比较物之间，在每个RT002剂量与安慰剂之间，以及在活性比较物与安慰剂之间进行主要功效比较。评价风险收益比以检查在关键研究评价(在第6个月时的应答率和直至36周所测量的应答持续时间；AE的频次)方面相对于活性比较物而言有利于所述RT002剂量中的至少一个的趋势。
在每个处理组内，对于ITT群体的关于IGA-FWS、PFWS和GAIS 的缺失的得分通过马尔科夫链蒙特卡洛(Markov Chain Monte Carlo， MCMC)多重填补法(multipleimputation)来进行填补以用于基于应答率的分析。关于主要终点的灵敏度分析通过使用基于末次观察结果结转法(last observation carried forward method)的填补(imputation) 来进行。
使用描述性的统计学来总结人口统计特征(例如，年龄、性别、种族等)和背景特征(例如，IGA-FWS、PFWS等)。对于所有受试者总结过去或正在进行的医疗史、研究就诊顺从性以及先前和伴随的药物使用，并且由受试者呈现在列表中。
功效：关于功效，由通过使用IGA-FWS来对在最大皱眉下受试者的眉间细纹的严重度进行分级的不知情的评价者来评估主要临床功效。应答者被定义为这样的受试者，其在IGA-FWS方面相对于基线而言具有一个点或更大的改善，并且其在评价的时间点没有返回基线 IGA-FWS。为了主要分析的目的，在第24周在每个RT002剂量与活性比较物之间比较应答率。将每个RT002处理组分开地与安慰剂和活性比较物进行比较。还在每次就诊时将活性比较物与安慰剂进行比较。用通过基线IGA-FWS进行分层的Cochran-Mantel-Haenszel(CMH)检验来进行比较。
为了主要分析的目的，通过使用卡-迈(Kaplan-Meier)方法在每个所述RT002剂量与活性比较物之间比较应答持续时间。从注射的时刻至受试者恢复至他的/她的基线严重度(如由不知情的调查者基于 IGA-FWS所测量的)时所处的时间点，测量应答持续时间。如果受试者在第4周之时或之前未取得离基线一个点的改善(通过IGA-FWS)，那么就认为应答持续时间为零。如果受试者在第4周之时或之前取得了至少1个点的改善(基于IGA-FWS)，但是到第36周(最后的时间点)前未恢复至他的/她的基线，那么在第36周(最后评价的日期)时审查这样的受试者以用于分析。使用时序检验来在RT002与活性比较物之间比较应答持续时间。关于每个处理组所计算出的风险收益比等于处理相关的不利事件的数目之和除以关于在处理组中的受试者的应答持续时间的天数之和。如果受试者在第4周之时或之前取得了至少1个点的改善(基于IGA-FWS)但是到第36周(最后的时间点)前未恢复至他的/她的基线，那么他/她对于收益总和的贡献为在基线和最后就诊日之间的天数。
关于次要分析，所使用的次要终点如下进行定义：
(1)在第2周时和在第4-36周时的应答率，其中重点在于第12周和第24周的评价。在处理组之间的比较基于通过所分析的变量的基线严重度进行分层的CMH检验，在可能的情况下。对于具有基线严重度(其可能允许对于成功所需要的改善)的那些受试者，将每个处理组与安慰剂进行比较和分开地与活性比较物进行比较。还在每次就诊时将活性比较物与安慰剂进行比较。
基于几个定义来对应答者进行评价：(i)相对于基线而言改善了至少2个点(基于IGA-FWS)的那些；(ii)相对于基线而言改善了至少1 个点(基于IGA-FWS)的那些；(iii)具有0或1的IGA-FWS得分的那些；(iv)改善了至少1个点(基于PFWS)的那些；(v)改善了至少 2个点(基于PFWS)的那些；(vi)在GAIS量表上具有至少1的得分的那些。
(2)基于应答持续时间的各种定义的次要终点。给在第4周前未取得在下面的每个定义中所指定的改善的受试者分配0的持续时间；在第 36周(最后评价的日期)时审查取得了下面所定义的改善但是到第36 周前未恢复回基线的受试者。使用时序检验来对处理组进行比较。对于每个定义和处理组，如上面所描述的那样来计算风险收益比。关于应答持续时间的定义包括：(i)从注射至小于1的GAIS得分的时间，关于在GAIS中具有至少1个点的改善的应答者定义；(ii)从注射至恢复至基线的时间，关于在IGA-FWS中具有至少2个点的改善的应答者定义； (iii)从注射至恢复至基线的时间，关于在PFWS中具有至少1个点的改善的应答者定义；(iv)从注射至恢复至基线的时间，关于在PFWS中具有至少2个点的改善的应答者定义；(v)从注射至恢复至基线的时间，关于在IGA-FWS中具有至少1个点的改善的应答者定义，其中使用具有关于处理、基线严重度和处理/基线严重度相互作用的项目的比例危险模型；和(vi)从注射至恢复至基线的时间，关于在PFWS中具有至少1 个点的改善的应答者定义，其中使用具有关于处理、基线严重度和处理 /基线严重度相互作用的项目的比例危险模型。进行探索性分析以将受试者的GAIS评估得分与应答率(其基于PFWS，关于1-点和2-点变化这两者)相关联。使用相关分析和逻辑回归，视情况而定。
患者数据：患者报告的后果支持了关于RT002处理的持续时间和功效的调查者发现。在24周(6个月)时，40U RT002剂量继续给出在“受试者总体美学改善量表(SubjectGlobal Aesthetic Improvement Scale)”(GAIS)中的在临床上有意义的更高的应答率，其中46.3％的经RT002 40U处理的受试者具有至少1的评价得分，而31％的经
Cosmetic处理的受试者具有至少1的评价得分。在第16周，相比于
Cosmetic的“直至120天”的持续时间(基于其标签信息)而言，RT002 40U剂量取得了在统计学上显著的更高的应答率，如通过在“患者皱纹严重度(PWS)量表”上具有至少1-点改善和在“受试者总体美学改善量表”上具有至少1-点评级所测量的。76.9％的用RT002 40U进行处理的受试者保持了在PWS中的至少1-点改善，相比于58.5％的用
Cosmetic进行处理的受试者而言。另外，89.7％的用 RT002 40U进行处理的受试者保持了在GAIS中的至少1-点得分，相比于70.7％的用
Cosmetic进行处理的受试者而言。
安全性：RT002产品展示出与
Cosmetic高度相当的安全性和功效特性谱。不利事件通常是轻微的，并且主要与来自注射本身的效应相关联。所有RT002剂量组均展示出优异的总安全性特性谱，其中具有大部分地局部化的、暂时的和在严重性方面轻微的AE。在任何活性产品剂量组中没有严重的AE发生。20U和40U RT002剂量组被很好地耐受，并且就引起上睑下垂而言在临床上优于
另外， RT002在20U和40U剂量下展示出更少的向下散布。20U和40U剂量这两者在任何时间点处在任何用那些剂量的RT002进行处理的患者中均不引起上睑下垂，相比于在经
Cosmetic处理的组中的1.9％而言。在RT002 60U处理组的受试者中观察到5.7％的上睑下垂率。这些本质上是暂时的，如用
处理时典型地看到的那样。RT002 的减少的扩散与非临床的和先前的研究相一致，并且支持了毒素的减少的散布，如在用本发明的组合物进行处理的受试者中所观察到的，所述本发明的组合物，例如RT002，包含在本文中所描述的肉毒杆菌毒素例如肉毒杆菌毒素A，和带正电荷的载体(其包含具有一个或多个共价地附着的带正电荷的效力基团的主链，例如聚赖氨酸)。
剂量和效应持续时间：不希望是限制性的，中期分析结果支持选择 40U的剂量作为用于用本发明的含肉毒杆菌毒素的组合物进行单次处理的最佳剂量，基于高的应答率、效应持续时间和正面的安全性特性谱。另外，本发明的组合物，例如RT002，在通过注射向受试者进行施用后，具有持久的和长期的效应持续时间，例如至少6个月。如从研究结果的中期分析中所确定的，用RT002产品对受试者的眉间细纹进行的处理取得了更优的效应持续时间，当与用
Cosmetic对受试者中的眉间细纹进行的处理相比较时。的确，基于卡-迈分析方法，证明了在 RT002 40U剂量组中在IGA上具有1-点改善的5.9个月的平均持续时间 (23.6周)，相对于在用
Cosmetic进行处理的受试者中的18.8 周的持续时间而言(p＝0.020)(参见例如图4A和4B)。需注意的是，在第6个月，从持续时间的中期分析中审查了重大数目的经RT002处理的受试者，因为他们仍然是应答者。在第6个月，接近三分之一(～ 33％)的在RT002 40U处理组中的受试者在单次处理后仍然不具有或几乎不具有皱纹，相对于在
Cosmetic处理组中12％的受试者而言(p＝0.041)。进一步地，该高剂量组在处理后32周内进行追踪以评估应答持续时间，并且取得了29.4周或7.3个月的平均持续时间，基于调查者评估和受试者评估两者。
由本发明的组合物(例如RT002)以及其处理方法和用途所提供的效应持续时间提供了优点，因为经受处理的受试者认为对于美学处理而言，效应持续时间对他们来说具有高度的重要性。这样的长的、持久的效应持续时间(特别地通过产品即RT002的单次或一次注射剂量所取得的)允许对于受试者的更少的注射/处理过程，这对于受试者的舒适、方便和总体福利来说是重要的。提供在通过向受试者注射产品的单次处理剂量后保持至少6个月时间段的显著且持久的效应的产品为开业医生和患者两者提供了对于本领域中未满足的需要的解决方案。
中期结果的概括：结果证明，由RT002产品所代表的本发明的组合物经证实优于
Cosmetic，如通过在IGA-FWS上具有1-点和2-点改善的平均效应持续时间和应答率，和取得并保持没有皱纹或轻微的皱纹(依照上面所描述的IGA-FWS评分系统)的患者的百分比所测量的。关于在28天时在IGA-FWS上具有1-点改善的主要功效终点，所述研究取得了在统计学上显著的结果。第24周中期分析证明了相对于用
Cosmetic进行的注射而言，在通过用所注射的RT002的剂量对受试者进行的单次处理所提供的结果中的在临床上有意义的差别。
如也通过中期分析所确定的，RT002取得了大约6个月的效应持续时间，其中具有高的应答率。RT002取得了相比于
Cosmetic 而言更优的效应持续时间，其中基于卡-迈分析方法，证明了在40U剂量组中基于“调查者总体评估-面部皱纹严重度”(IGA-FWS)量表在眉间细纹方面具有1-点改善的5.9个月的平均持续时间(23.6周)，相对于关于 Cosmetic的18.8周而言(p＝0.020)。在24周(6个月)时，剂量为40U和60U的RT002继续给出在临床上有意义的更高的应答率，其中分别35.9％和29.3％的受试者保持1-点改善，相对于19％的经
Cosmetic处理的受试者而言。RT002取得了在28天时在调查者量表(IGA-FWS)上具有至少1-点改善的其主要功效终点，以及患者报告了后果。以在“调查者总体评估-面部皱纹严重度量表” (IGA-FWS)上具有1-点改善的28-天主要功效终点，RT002在所有剂量组中取得了100％的应答率。以在“患者面部皱纹量表”上具有1-点改善的28-天主要功效终点，RT002在所有剂量处理组中取得了大于97％的应答率。功效数据显示，96％的受试者在处理后4周通过临床调查者评估被评级为在最大皱眉下“没有皱纹”或“轻微的皱纹”的严重度，和 83％的受试者评估自己为在相同的时间点取得在最大皱眉下“没有皱纹”或“轻微的皱纹”。RT002被很好地耐受，并且没有发现严重的不利事件。在RT002 20U或40U剂量处理组中的受试者之中没有出现眼睑的上睑下垂。在该研究中观察到了剂量应答；施用了40U剂量的RT002 的受试者显示出特别高的应答率。
总的来说，用于注射的RT002在所有剂量水平上都被很好地耐受，没有任何全身或局部安全性担忧或散布的证据。用于注射的RTT150在临床试验中被很好地耐受，在任何剂量下都没有散布越过处理位点的证据。在1/2期剂量逐步升高的开放标记临床试验RT002-CL001中的不利事件通常是轻微的、局部化的和暂时的。所观察到的最普遍的不利事件是头痛和注射位点反应。在任何群组中没有受试者经历上睑下垂。不存在严重的不利事件，并且不利事件率并不随着增加的剂量而在频次、严重度或类型方面发生变化。三十四(34)名受试者报告了131次AE。所报告的最普遍的不利事件为头痛(31次报告；17名受试者)；注射位点瘙痒(34次事件；8名受试者)；注射位点疼痛(烧灼)(14次事件；6名受试者)；和眼睛病症(14次事件；5名受试者)。除了不利事件外，在RT002-CL001研究中的安全性评价包括临床实验室测试(血液学、化学、尿分析和凝血酶原时间)、关于RTT150毒素和RTP004 肽的血清抗体、脑神经II-VII和面部肌力的评估、伴随疗法药物治疗和对于具有分娩可能性的女性的尿液妊娠测试。在任何剂量下都不存在散布越过处理位点的证据，和不存在任何全身暴露的证据，基于临床实验室结果和身体评估。关于对于毒素和肽两者的抗体，所有受试者都是阴性的。
实施例6：关于在眉间细纹处理中显示出长期持续时间的效应的可注射肉毒杆菌毒素制剂的随访研究
还于在加拿大的2期的、剂量变动的、活性产品和安慰剂-对照的临床试验RT002-CL002中评价了RT002，以评价用于在成人中处理中度至严重的眉间细纹的单次施用的安全性、功效和持续时间。该试验招收了268名受试者(超过50名/处理组)，他们用20、40或60U的RT002， 20U的BOTOX Cosmetic，或安慰剂来进行处理。关于眉间细纹的处理，在该临床试验中所建议的按剂量施用方案为20、40或60个单位/受试者的单次处理，进入到在前额上的5个注射位点中的每一个之中的0.1mL 肌内注射。基于目前的盐水效能法的16、32、48或64U(相应于在以前的明胶磷酸盐缓冲液效能法中的25、50、75和100U)的剂量在1/2 期临床试验(RT002-CL001研究；12名受试者/剂量组；总共48名受试者)中被很好地耐受。
中期数据显示，在4周时，对于所有三个剂量，RT002取得了其主要功效测量结果。该研究证明了6个月的RT002平均效应持续时间，基于在调查者总体评估-面部皱纹严重度量表上的在最大皱眉下在眉间细纹方面的至少1-点改善。受试者报告的后果与关于RT002的持续时间和功效的调查者发现相一致。在所有群组中，RT002看起来通常是安全的和被很好地耐受。不利事件通常是轻微的、局部化的和暂时的。在所评价的三个剂量中的任一个下都不存在严重的不利事件或者任何全身暴露的证据。
实施例7：在中度至严重眉间细纹的处理中显示较高应答率和长期持续时间效应的可注射肉毒杆菌毒素制剂的功效和安全性(3期研究，组1和组2)
该实施例描述了在36周用于评价本发明的可注射组合物(称为 RT002)的安全性、功效和效应持续时间的两组临床研究和主要结果分析的结果，所述本发明的可注射组合物包含肉毒杆菌毒素A和带正电荷的载体，所述带正电荷的载体包含具有共价地附着的带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸多肽，称为RT002。RT002产品是一种可注射制剂，其含有不含附属蛋白质的150kD的亚型A肉毒杆菌毒素分子，其与带正电荷的载体肽非共价地相结合，所述带正电荷的载体肽具有式 RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(RTP004；SEQ IDNO:4)，并且其不包含附属蛋白质和动物来源的组分。在该研究中，使用RT002 用于处理中度至严重眉间细纹。所述赋形剂包含0.1mg聚山梨酯20、 36mg海藻糖二水合物和11.7μgRTP004/50U的不含附属蛋白质的150 kDa的A型毒素(并且处理剂量为40U)。
采用RT002的两个积极疗法组被包括在临床研究中，其为3期、随机的、双盲的、安慰剂-对照的、关键性的、多中心研究，被设计和进行用于评价单次(一次)注射施用RT002用于暂时性改善成年人中的中度至严重眉间细纹的外观的安全性、功效和效应持续时间。评价40U 剂量的RT002，与安慰剂对照(肌肉注射)进行比较。注射处理为单次肌肉注射，放入眉间复合区之内的5个不同区域，在降眉间肌(procecrus) 中一个，和在右皱眉肌和左皱眉肌的内侧和外侧方向中各一个(每个注射位点8U)。也评价在40U剂量下RT002的单次处理的效应持续时间。
所述RT002产品由配制成冻干粉末的经纯化的不含附属蛋白质的 150kDa的肉毒杆菌神经毒素(称为RTT150)组成。在非临床研究中， RT002已显示展示出比其他形式的肉毒杆菌神经毒素A(BoNTA)更少的扩散，并且可以在靶位点处提供更多的效应控制，且具有更少的副作用，所述副作用是由于毒素远距离散布入邻近的肌肉中导致的。另外， RT002这种没有添加剂的A型肉毒杆菌毒素制剂具有提供更小的免疫原性潜力的能力，这是由于在所述制剂中不存在非活性蛋白质。另外，在大鼠中在直至50U/kg的重复剂量肌内施用后，RT002被很好地耐受。在中，RTP004已经以最大可用剂量按剂量施用，而对皮肤、遗传毒性和生殖研究没有作用，并且在多达超过9,500倍的安全性方面，在非肠道研究中没有产生任何显著的发现。
按剂量施用方案和注射技术：对于该研究，RT002的按剂量施用方案为RT002(40U)或安慰剂的单次处理，作为0.1mL肌内注射到经受处理的患者的在眉毛之间的前额上的5个注射位点中的每一个之中 (总共0.5mL)。所有处理都是由经训练的医师来实施的肌内注射。更特别地，研究受试者接受向五个注射位点的0.1mL/注射的单次处理：两次注射入每处皱眉肌中，和一次注射在降眉间肌中。调查者、现场工作人员、受试者和主办者对于处理组分配是不知情的。大约300名成年的女性和男性受试者(18至75岁且处于良好的总体健康，在入选时具有中度至严重的眉间细纹)被招收参加了两个研究中的每种中，总共约 600名受试者。特别地，第一组中有303名患者，第二组中有306名。
试验持续时间为直至试验的38周，包括直至两周的筛选期，随后为单次处理，和处理后直至36周的随访期。在处理后，所有患者都被随访至少24周。从处理后第24周开始，患者被随访直到在调查者总体评估-面部皱纹严重度(IGA-FWS)和患者面部皱纹严重度(PFWS)评估中，他们的眉间细纹的皱纹严重度从最大皱眉返回基线。
眉间脸部细纹源于在脸部中的侧面的皱眉肌和垂直的降眉间肌。这些可以通过在让患者最大程度地皱眉时进行肌肉块的触诊而容易地鉴定。皱眉肌压低皮肤，从而产生垂直的细纹，即由绷紧的肌肉的嵴所围绕的沟纹(即，皱眉细纹)。由于肌肉的位置、大小和使用在个体之中明显地变化，因而施用可注射肉毒杆菌毒素的医师必须理解所涉及的区域的相关解剖学和由于先前的外科手术程序而引起的对于解剖学的任何改变。为了降低上睑下垂的风险，最佳地实施下列步骤：(i)应当避免上睑提肌的或在上睑提肌附近的注射，特别是在具有较大的降眉肌的患者中；(ii)正中的皱眉肌注射应当在骨质的眶上嵴之上至少1厘米处； (iii)应当确保所注射的体积/剂量是准确的；和(iv)毒素不应当于比在中央眉毛之上1厘米近之处进行注射。通过在上正中眼眶边缘上施加指压并同时将针头穿过皮肤推进到下面的肌肉中来注射肉毒杆菌毒素。
样本量的测定
从前述研究取得的处理功效的评估显示出，对于注射RT002 40U 和安慰剂而言分别为200和100的样本量，对于主要功效终点，具有超过99％的检测处理组之间的差异的能力：在第4周，2点复合区应答者的比例，基于2-侧卡方检验，在0.05的α水平下(至少50％对1％的应答率)。选择300名的样本量，以确保有足够的能力检测对于在随后就诊时关键次要终点的应答率而言处理组之间的差异。
眉间细纹严重度的评估
对于该研究，由调查者和受试者来评估受试者的眉间细纹的严重度。关于调查者评估，如下来使用“调查者总体评估-面部皱纹严重度 (IGA-FWS)”评级得分系统：(0)的IGA-FWS评级得分表明没有面部皱纹严重度(“无”)，描述为“没有皱纹”；(1)的IGA-FWS评级得分表明轻微的面部皱纹严重度(“轻度”)，描述为“非常浅的皱纹”；(2) 的IGA-FWS评级得分表明中度的面部皱纹严重度(“中度”)，描述为“中度皱纹”；和(3)的IGA-FWS评级得分表明严重的面部皱纹严重度(“严重”)，描述为“深的且有沟的皱纹”。在最大皱眉和其后其余时进行评价。如由本领域执业医生所意识到的，照片指南展示出了用于参考的皱纹严重度的等级。
患者面部皱纹严重度(PFWS)评估：将患者面部皱纹严重度(PFWS) 用于他的/她的面部皱纹严重度的受试者评估。受试者在最大皱眉下完成患者面部皱纹严重度(PFWS)，以在筛选就诊、处理就诊(第0天) (处理前)、随访就诊(第2、4、8、12、16、20、24、28、32周)和研究结束就诊(第24、28、32或36周，视情况而定)或早期中止就诊 (若有可能)时评估眉间细纹的严重度。在使用所提供的手持式镜子来检查眉间细纹的时候，将评估表直接提供给受试者以进行填写。PFWS 评级得分系统如下：(0)的PFWS评级得分表明没有皱纹严重度，具有“没有皱纹”的相关描述；(1)的PFWS评级得分表明轻微的皱纹严重度，具有“非常浅的皱纹”的相关描述；(2)的PFWS评级得分表明中度的皱纹严重度，具有“中度皱纹”的相关描述；和(3)的PFWS评级得分表明严重的皱纹严重度，具有“深的皱纹”的相关描述。按照本研究，对于待被招收的受试者来说，要求关于受试者的眉间细纹的(2) (中度的)的或(3)(严重的)的IGA-FWS和PFWS评级。
将受试者分别以2:1比例随机分成RT002或安慰剂处理组。被招收参加本研究的受试者在整个处理后的至少24周和直至36周的研究中进行筛选和处理就诊以及随访安全性和功效评价。在第0周给予单次施用。在第1、2、4(主要终点)，和此后每4周，患者返回随访就诊，第24 周开始最后的强制性就诊，并且每4周继续，直至第36周，最后一次就诊。
在处理期后的初始2-周的日记中，使用本文所述的4点严重度量表，患者获得他们在最大皱眉时细纹外观的评价。基于评价患者在处理后开始两周之内随着时间眉间细纹严重度的受试者日记，确定处理效应的起始。处理效应的起始定义为当患者评级得分从基线下降1点或更大时的时间。这包括在第二终点评估中。
功效和安全性评估
主要功效评估包括眉间细纹严重度和眉间细纹改善的调查者评估，以及眉间细纹严重度和改善的患者评估。
皱眉皱纹严重度-患者和调查者总体评估
由患者(皱眉皱纹严重度[PFWS])和调查者(调查者总体评估皱眉皱纹严重度[IGA-FWS])使用表7中所示的4点等级量表评估皱眉皱纹严重度。由患者和调查者在最大皱眉下和在最大皱眉后其余时评估所述严重度。得分范围为0＝无至3＝严重。
表7-皱眉皱纹严重度
主要功效终点
主要功效终点来源于在第4周得到的最大皱眉得分，并且定义为同时在IGA FWS和PFWS量表上取得0或1(无或轻度)的得分和从基线至少两个点的改善。该应答缩写为“2-点复合应答”。
次要功效终点：
来源于在最大皱眉下IGA-FWS和PFWS评估的次要终点描述如下。对于在第4周满足2点复合应答的患者评估的终点，在最大皱眉下观察的病例数据用于进行该评估。
(1)在第1、2、4、8、12、16、20、24、28、32和36周，在IGA-FWS 上取得得分0或1(无或轻度)的患者的比例。
(2)在第1、2、4、8、12、16、20、24、28、32和36周，在IGA-FWS 和PFWS上都取得得分0或1(无或轻度)的患者的比例。
(3)在第1、2、4*、8、12、16、20、24、28、32和36周，取得2 点复合应答的患者的比例(*这为主要终点)。
(4)在第1、2、4、8、12、16、20、24、28、32和36周，在PFWS 上取得得分0或1(无或轻度)的患者的比例。
(5)对于在第4周满足2点复合应答且位于RT002组中的患者，在 IGA-FWS和PFWS上均失去2个点或更大应答的时间。
(6)对于在第4周满足2点复合应答且位于RT002组中的患者，在 IGA-FWS或PFWS上失去2个点或更大应答的时间。
(7)对于在第4周满足2点复合应答且位于RT002组中的患者，在 IGA-FWS和PFWS上均返回基线或比基线更差的时间。
(8)对于RT002组中的所有患者，在IGA-FWS和PFWS上均返回基线或比基线更差的时间。
(9)对于在第4周满足2点复合应答且位于RT002组中的患者，在 IGA-FWS和PFWS上均返回中度至严重的时间。
(10)对于RT002组中的所有患者，在IGA-FWS和PFWS上均返回中度或严重的时间。
(11)对于在第4周满足2点复合应答且位于RT002组中的患者，在 IGA-FWS上均返回中度至严重的时间。
(12)对于RT002组中处于最大皱眉的所有患者，在IGA-FWS上返回中度或严重的时间。
探索性功效终点：
来源于在最大皱眉时IGA-FWS和PFWS评估的探索性终点为：
(1)在从第1周至第36周的每次就诊时，在IGA FWS和PFWS两个上同时(此后缩写为“1-点复合应答”)取得至少一个点改善的患者的比例。
(2)在从第1周至第36周的每次就诊时，在IGA-FWS上取得至少一个点的改善的患者的比例。
(3)在从第1周至第36周的每次就诊时，在PFWS上取得至少一个点的改善的患者的比例。
(4)在第4周取得2点复合应答的患者的亚组中，在从第1周至第36 周每次就诊时取得2点复合应答的患者的比例。
(5)在第4周取得2点复合应答的患者的亚组中，在从第1周至第36 周每次就诊时取得1点复合应答的患者的比例。
(6)在第4周取得2点复合应答的患者的亚组中，在从第1周至第36 周的每次就诊时在IGA-FWS和PFWS上均取得0或1(无或轻度)的得分的患者的比例。
(7)在从第1周至第36周的每次就诊时，在IGA-FWS上取得至少 2点改善的患者的比例。
(8)在从第1周至第36周的每次就诊时，在PFWS上取得至少2个点改善的患者的比例。
额外的评估
患者日记∶在处理期后的初始2-周的日记中，使用上述对于皱眉皱纹严重度的4点严重度量表，患者获得他们在最大皱眉时细纹外观的评价。基于评价患者在处理后开始两周之内随着时间眉间细纹严重度的受试者日记，确定处理效应的起始。处理效应的起始定义为当患者评级得分从基线下降1个点或更大时的时间。这包括在第二终点评估中。
患者对处理总体满意度问卷：在第4周，使用7点量表询问患者他们对于处理结果如何满足或不满意。该处理问卷是基于脸部已处理的区域看起来如何，根据表8。使用评级得分作为次要终点。
表8-对处理总体满意度问卷量表：
总体美学改善量表：调查者和患者使用以下7点严重度总体美学改善量表评估从基线状况起眉间细纹改善的目视外观(在最大皱眉时和在最大皱眉后其余时)，如表9所示。
表9-总体美学改善量表
来源于该评估的探索性功效终点为：
(1)在从第1周至第36周的每次就诊时，在GAIS上取得≥1的得分的患者的比例(在最大皱眉、在最大皱眉后其余时采用调查者的评估，和在最大皱眉时、在最大皱眉后其余时采用患者的自我评估，分别总结)
(2)在从第1周至第36周的每次就诊时，在GAIS上取得≥2的得分的患者的比例(即，大程度地改善或非常大程度地改善)(在最大皱眉、在最大皱眉后其余时采用调查者的评估，和在最大皱眉时、在最大皱眉后其余时采用患者的自我评估，分别总结)
(3)在从第1周至第36周的每次就诊时，在GAIS上取得≥3的得分的患者的比例(即，非常大程度地改善)(在最大皱眉、在最大皱眉后其余时采用调查者的评估，和在最大皱眉时、在最大皱眉后其余时采用患者的自我评估，分别总结)
(4)在从第1周至第36周随时间的GAIS得分(在最大皱眉、在最大皱眉后其余时采用调查者的评估，和在最大皱眉时、在最大皱眉后其余时，采用患者的自我评估，分别总结)
皱眉细纹影响量表：患者被要求使用皱眉细纹影响量表(FLIS)对于他们的关于他们的皱眉细纹的处理结果的感觉评级。FLIS由5个问题组成，其中每个都具有从0至10的11点量表。总得分从0至50，是5个问题的得分之和。探索性终点为总得分和关于个体问题的得分。
脸部年龄自我评价：患者对他们在脸部年龄自我评价(FASE)问卷上感觉的年龄进行评级和在处理后对他们感觉他们认为他们看起来多大进行评级(比实际年龄更年长、比实际年龄更年轻、实际年龄)。使用这些应答作为探索性终点。
照片：对于同意拍照的那些患者，采用处理区域的标准化数字照片，包括患者在最大皱眉时和在最大皱眉后其余时的患者正视图。使用 IGA-FWS皱眉皱纹严重度表(上述)和经由独立的小组检查(IPR)对照片的眉间细纹的严重度进行评分。另外，测定2点应答，定义为在第4 周取得0或1的得分(无或轻度的)和关于IGA-FWS从基线的至少2点改善。
安全性评估
不利事件：记录所有不利事件(AE)，并基于MedDRA术语学归类。将AE严重度分级为轻度、中度或严重。在研究处理的日期与时间时起始或在其之后的AE是处理突发性的。
来源于AE的安全性终点为：
(1)在处理后第一个四周和总的研究持续时间期间，处理-突发性不利事件的频次、严重度和与研究药物的关系。
(2)在处理后第一个四周和总的研究持续时间期间，处理-突发性严重的不利事件的频次、严重度和与研究药物的关系。
毒素远距离散布询问(特定的AE和神经肌肉无力症状的询问)：在处理前和处理后，处理就诊、随访就诊和最终评价就诊或早期中止就诊 (若有可能)时进行毒素远距离散布查询。患者被以通用方式询问潜在地表明毒素远距离散布的不利事件目录。
临床实验室数据:在筛选、第4周和最终评价就诊时，收集血液、化学、凝血(凝血酶原时间)和尿分析的非禁食样品。在筛选和第2、4和12 周就诊时，采集用于抗体的血液样品。
表10-临床实验室检验
WOCBP＝生育潜能的女性
抗体检验：使用筛选测定法定性地进行RT002和RTP004的抗体检验，并且如果是阳性的，通过证实测定法检验。如果是阳性的，则证实测定法得到定性评估(阳性/阴性)以及定量浓度。通过证实测定法确定的检验阳性的样品也用于中和抗体的检验。
生命体征：在筛选和处理就诊(处理前和处理后)、第2周、最终评价或早期中止就诊和在其中报道肉毒杆菌毒性的体征或症状时获得的生命体征(即，体温、呼吸率、静坐桡动脉脉搏率和静坐收缩压和舒张压)。
身体检查：在筛选、第2周和最终评价或早期中止就诊时，进行除了生命体征之外的身体检查，包括脸部、一般性外观、皮肤、颈(包括甲状腺)、眼睛、耳、鼻、咽喉、心脏、肺、腹部、淋巴结和四肢的神经学检查。在调查产品施用之前存在的有意义的身体检查发现被包括在医疗史页上。记录满足不利事件定义的有意义的身体检查发现。
12-导联ECG：在筛选和第4周，得到单一标准仰卧12-导联ECG。
注射位点评价：在筛选就诊、处理前和处理后的处理就诊、随访就诊和最终评价就诊或早期中止就诊(若有可能)时评价注射位点。该评价将作为5个注射位点的总体评价进行，如表11所示。
表11-注射位点评价
脑神经II-VII的评估：在筛选就诊、处理前和处理后的处理就诊、随访就诊和最终评价就诊或早期中止就诊(若有可能)时，由调查者进行脑神经II–VII(分别在左右侧)的评价。获得每个脑神经的得分，如表 12中列出的。
表12-脑神经评价
区域House-Brackmann面神经分级系统：在筛选就诊、处理前和处理后的处理就诊、随访就诊和最终评价就诊或早期中止就诊(若有可能)时，调查者评价面神经(VII)的功能。参见表13：
表13-区域House-Brackmann面神经分级系统
面部肌肉力量的评估：使用用于评估肌肉力量的医学研究委员会 (MRC)量表评价面部肌肉力量。评估面部每个侧面的下述肌肉：眼轮匝肌(眼睑)、侧提眉肌、颧轮匝肌。参见表14。在处理前和处理后处理就诊、随访就诊和最终评价就诊或早期中止就诊(若有可能)时，调查者评估面部肌肉力量。
表14-用于评估肌肉力量的MRC量表
统计学分析∶所有统计学程序设计均使用统计分析系统(SAS)版本9.3或更高版本来进行。
采用试验中心作为分层因素分析大部分功效终点。该试验旨在以一定方式进行，使得在每个试验中心/地点招收每个处理组中最少5名ITT 患者。在处理组中在单一地点存在太少患者的情况下，将该地点与另一个地点组合，以取得每个组中期望的最少样本量。将小中心(在处理组中，<5名ITT患者)从最大到最小合并，直到合并的中心具有每个处理组中≥5名ITT患者(William et al,2006,“Effects of a New Hormone Therapy,Drospirenone and 17-β-Estradiol,in Postmenopausal Women With Hypertension”,Hypertension,48:246-253)。如果任何中心需要被合并，则由试验中心进行的任何分析均由合并中心替代进行。
分析群体
意向处理群体：所有被随机分组并接受处理的受试者被包括在意向处理(ITT)群体中。对作为随机分组的处理进行概括。
符合方案群体：所述符合方案(PP)群体包括来自完成了第一个4周的研究而没有重大的方案违反的ITT群体的患者。在进行不盲目研究之前，进行关于从PP群体排除的决定，除了接受不当剂量/处理的患者外。因下列原因中的任一个而从PP群体中排除受试者：患者违反纳入/排除标准；患者接受了不当的剂量；患者接受了不当的治疗；患者在第4周之前使用了被禁止的药物；患者错过了第4周就诊；患者的第4周就诊距窗口大于±3天；患者在第4周错过了IGA-FWS或PFWS评价。
安全性群体：被随机分组、接受处理和提供至少一个处理后安全性评估的所有患者都包括在安全性群体中。对实际接受的处理进行概括。
进行参与研究的患者的持续时间的概括，包括在下述种类的持续时间中：<4周、4至<12周、12至<24周和24至36周，患者的n、平均值、 SD、中值、最少持续时间周数、和最长持续时间周数、以及数量和百分比。
人口统计和基线特征：使用描述统计学概括处理组和总体的人口统计和基线特征。使用未漏失观察的数量、平均值、标准偏差、中值、最小值和最大值概括连续变量。使用每个种类中患者的数量和百分比概括分类数据。
人口统计数据包括年龄、性别、人种和种族。对于由处理组和整体的概括而言，年龄分类为18至45、>45至55、和>55至75。基线特征包括之前的肉毒杆菌毒素A型、自从最后的之前的肉毒杆菌毒素A型注射的时间、和Fitzpatrick皮肤类型、以及功效问卷、PFWS、IGA-FWS、 FLIS和FASE的基线评估。对于通过随机分组处理的ITT和PP群体；和对于接受实际处理的安全性群体，得到概述。
功效分析：对于在所有时间点处理组的所有功效变量提供描述统计学。
除非另有规定，否则对于RT002组，处理漏失功效数据的主要方法是基于患者水平的最差结果填补(outcome imputation)，并且对于安慰剂组，其是基于患者水平的最好结果填补(最差/最好-结果填补)。根据该研究设计，所有患者都要随访至少24周。为此，仅进行所述填补直至第24周就诊。对于由研究评估复合的和/或衍生的终点，漏失数据的填补是在第一次初始评估上进行的。
也使用基于模型的多重填补方法作为另一种灵敏度分析。由于在第4 周之后使用被禁止药物而违反纳入/排除标准的患者，如果他们加在一起达到所述研究患者的10％或更高，则可以被包括在上述灵敏度分析中。
使用I型差错控制极化(Type I Error Control Plan)评估第二终点的多重性调整。提供未调整的p-值，以引导在I型差错控制极化中的假设检验规则。
主要功效分析：使用试验中心分层的Cochran–Mantel–Haenszel (CMH)试验，使用具有0.05的I型差错比例的双侧检验，使用具有最差/ 最好结果填补的ITT群体，比较RT002和安慰剂之间在第4周具有2点复合应答的患者比例。作为灵敏度分析，在ITT群体中使用多重填补代替最差/最好的结果填补，重复所述主要分析。作为一个另外的灵敏度分析，使用仅在PP群体中观察的病例进行CMH检验。计算Breslow-Day 试验，以检验优势率的均匀性。
提供基于2-侧CMH检验的P-值。采用常见风险差异的 Mantel-Haenszel估计来计算差异的点估计。为了检查一致性，也预期了常见风险差异的概述得分，并与Mantel-Haenszel估计进行比较，但没有报道在表中。使用Yan和Su的方法(2010)，计算2-侧95％CI，具有对于常见的风险差异而言的分层的Newcombe置信限度。所述分层的 Newcombe置信限度是由对于常见(全面的)行比例而言分层的Wilson置信限度构建的。首先，以每个2×2表(层)计算行比例的单独Wilson置信限度。然后，使用Mantel-Haenszel权重，合并这些层Wilson置信限度，形成用于整体行比例的分层的Wilson置信限度。
第二功效分析：存在多个第二终点。基于应用于其的统计分析法对他们分组。存在4组不同的第二终点，组A、B、C和D，每个组都具有不同的统计检验。使用ITT群体进行第二终点的填补，组A和B具有最差/最好的结果填补。关于ITT群体中组A和B中的终点，也进行多次填补。对于组A、B和C，对于所有患者以及符合基线严重度(中度至严重，按照IGA-FWS评估)的患者进行分析，以评估关于这些结果测量方法在基线时患者皱纹严重度的处理效应的大小。
组A：使用各种应答定义评估随时间变化严重度的降低，用于下述第二功效终点，其为具有应答的患者比例形式。对于选择就诊时的每个终点，使用由试验中心分层的CMH检验比较各处理组之间应答的患者比例。使用与主要终点相同的方法，计算p-值、点估计和95％CI。
(1)按照选择的就诊(第2、4、8、12、16、20和24周)，在最大皱眉时在IGA-FWS上取得0或1(无或轻度)得分的患者比例，其使用(a) 在ITT群体中，最差/最好的结果填补；(b)在ITT群体中，多重填补；(c) 在PP群体中，观察的病例。
(2)按照选择的就诊(第2、4、8、12、16、20和24周)，在最大皱眉时在IGA-FWS和PFWS上均取得0或1(无或轻度)得分的患者比例，其使用(a)在ITT群体中，最差/最好的结果填补；(b)在ITT群体中，多重填补；(c)在PP群体中，观察的病例。
组B：对于该组中的第二终点，按照处理组和就诊概述的应答者的比例和比例差，具有90％Wald CI。所述两个组A终点都包括在组B中，以便包括所有周数，并对于这些终点提供90％Wald CI。
(1)按照每次就诊(第1、2、4、8、12、16、20、24、28、32和36 周)，取得2点复合应答的患者比例，其使用(a)在ITT群体中，最差/最好的结果填补；(b)在ITT群体中，多重填补；(c)在PP群体中，观察的病例；(d)在ITT种群中，最差/最好的结果填补，按照基线IGA-FWS严重度。
(2)按照每次就诊(第1、2、4、8、12、16、20、24、28、32和36 周)，在IGA-FWS和PFWS上均取得0或1(无或轻度)的得分的患者比例，其使用(a)在ITT群体中，最差/最好的结果填补；(b)在ITT群体中，多重填补；(c)在PP群体中，观察的病例；(d)在ITT种群中，最差/最好的结果填补，按照基线IGA-FWS严重度。
(3)按照每次就诊(第1、2、4、8、12、16、20、24、28、32和36 周)，在IGA-FWS上取得0或1(无或轻度)的得分的患者比例，其使用(a) 在ITT群体中，最差/最好的结果填补；(b)在ITT群体中，多重填补；(c) 在PP群体中，观察的病例；(d)在ITT种群中，最差/最好的结果填补，按照基线IGA-FWS严重度。
(4)按照每次就诊(第1、2、4、8、12、16、20、24、28、32和36 周)，在PFWS上取得0或1(无或轻度)的得分的患者比例，其使用(a)在 ITT群体中，最差/最好的结果填补；(b)在ITT群体中，多重填补；(c) 在PP群体中，观察的病例；(d)在ITT种群中，最差/最好的结果填补，按照基线IGA-FWS严重度。
组C：对于RT002组，按照下述时间-对-事件终点，绘制卡-迈存活曲线。产生平均持续时间的点估计和2-侧95％CI，使用log-log转换。提供在第8、12、16、20和24周存活率的估计和2侧95％CI，使用log-log 转换。将第2周和第4周的比例包括在涉及RT002组中所有患者的分析中。对于ITT群体，使用观察的病例进行所有分析。
(1)在IGA-FWS和PFWS上均失去2点或更大的应答的时间，(a) 对于在第4周满足2点复合应答且在RT002组中最大皱眉时的患者；(b) 对于按照基线IGA-FWS严重度，在第4周满足2点复合应答且在RT002 组中最大皱眉时的患者。
(2)在IGA-FWS或PFWS上失去2点或更大的应答的时间，(a)对于在第4周满足2点或更大的应答且在RT002组中最大皱眉时的患者； (b)对于按照基线IGA-FWS严重度，在第4周满足2点复合应答且在 RT002组中最大皱眉时的患者。
(3)在IGA-FWS和PFWS上返回基线或比基线更差的时间，(a)对于在第4周满足2点两者更大的应答且在RT002组中最大皱眉时的患者； (b)对于按照基线IGA-FWS严重度，在第4周满足2点复合应答且在 RT002组中最大皱眉时的患者；(c)对于在RT002组中最大皱眉时的所有患者；(d)对于按照基线IGA-FWS严重度，在RT002组中最大皱眉时的所有患者。
(4)在IGA-FWS和PFWS上返回中度或严重的时间：(a)对于在第 4周满足2点两者更大的应答且在RT002组中最大皱眉时的患者；(b)对于按照基线IGA-FWS严重度，在第4周满足2点复合应答且在RT002 组中最大皱眉时的患者；(c)对于在RT002组中最大皱眉时的所有患者； (d)对于按照基线IGA-FWS严重度，在RT002组中最大皱眉时的所有患者。
(5)在IGA-FWS上返回中度或严重的时间：(a)对于在第4周满足2 点两者更大的应答且在RT002组中最大皱眉时的患者；(b)对于按照基线 IGA-FWS严重度，在第4周满足2点复合应答且在RT002组中最大皱眉时的患者；(c)对于在RT002组中最大皱眉时的所有患者；(d)对于按照基线IGA-FWS严重度，在RT002组中最大皱眉时的所有患者。
组D：如下描述性概述组D中的终点：
(1)患者对于治疗问卷的总体满意度使用具有各自应答的患者的数量和百分比概述。将表示使用渐近的Wald置信区间的2-侧90％CI。
(2)使用具有功效起始和没有功效起始的数量和百分比概述来自患者日记的处理效应的起始。另外，对具有处理效应起始的患者GEICHU 起始时间的描述统计学(平均值、最小值、最大值、百分之25和百分之 75)。处理效应的起始限于该研究的第一个第14天。
探索性功效分析：所有探索性功效终点都由处理组和就诊描述性概述。使用与用于主要和次要功效终点所规定的类似的方法，对于一些探索性终点进行处理组比较。在ITT群体中，仅对于观察的数据进行探索性终点的分析。
对于在每次就诊时来源于IGA-FWS和PFWS评估的每个探索性终点，使用由试验中心分层的CMH试验比较处理组之间具有应答的患者比例。使用与主要终点相同的方法，计算p-值、点估计和95％CI。
如同上述绘制时间与从基线改善至少1个点的失去的卡-迈存活曲线 (参见组C)。产生平均持续时间的点估计和2-侧95％CI，使用log-log转换。对于以下进行该分析：
(1)在IGA-FWS中由基线改善至少一个点的失去的时间，(a)对于 RT002组中最大皱眉的所有患者；(b)对于在IGA-FWS中取得由基线的至少1个点改善且在RT002组中最大皱眉的患者；
(2)在PFWS中由基线改善至少一个点的失去的时间，(a)对于RT002 组中最大皱眉的所有患者；(b)对于在PFWS中取得由基线的至少1个点改善且在RT002组中最大皱眉的患者；
(3)在IGA-FWS和PFWS中由基线改善至少一个点的失去的时间， (a)对于RT002组中最大皱眉的所有患者；(b)对于在IGA-FWS和PFWS 中取得由基线的至少1个点改善且在RT002组中最大皱眉的患者。
对于来源于GAIS评估的终点，按照处理组和就诊概述取得≥1、≥2 和≥3的患者的数量和百分比。对于GAIS得分，按照处理组和就诊概述在每个量表水平的患者的数量和百分比。对于在最大皱眉时进行的评估和在最大皱眉后其余时进行的评估，分别概述调查者和受试者评估。
采用n、平均值(SD)、SEM、中值、最小值和最大值，按照处理组和就诊描述性概述FLIS总分和单独问题的得分。
对于FASE问卷“你认为现在你看起来多大”，用n、平均值(SD)、 SEM、平均值、最小值和最大值概述年龄更年长的问题数量，和年龄更年轻的问题的数量。对于“你想要你看起来比你现在的实际年龄更年长或更年轻”的问题，按照处理组和就诊概述每个类别中患者的数量和百分比。
按照处理组和就诊在最大皱眉时处于每个严重度水平的患者的数量和百分比概述由独立的小组检查(IPR)评估的照片的IGA-FWS评价。另外，提供每个处理组在第4周在IGA-FWS上具有2点应答的患者的数量和百分比，并呈现处理组之间的差异，以及该差异的2-侧90％Wald CI。
亚组的检查：采用按照之前用肉毒杆菌毒素A型处理(是/否)、性别和年龄组(使用两个年龄亚组：18-45岁、>45-55岁、>55-75岁和18-65 岁、＞＝65岁)分类的亚组，进行与IGA-FWS和/或PFWS评估相关联的主要终点和关键次要终点的亚组分析。特别地，由亚组检查以下终点：
(1)取得2点复合应答的患者比例；(2)在IGA-FWS和PFWS上均取得0或1(无或轻度)的得分的患者比例；(3)在IGA-FWS上取得0或 1(无或轻度)的得分的患者比例；(4)在PFWS上均取得0或1(无或轻度)的得分的患者比例；(5)患者对处理问卷的总体满意度的应答；(6)来源于患者日记的处理效应的起始。
由于亚组分析固有地低于全群组分析的统计学能力，仅呈现了单独处理组的描述统计学。对于具有最差/最好结果填补的ITT群体，进行在组A和B中关于主要终点和次要终点的亚组分析。也概述了使用ITT群体上观察的数据进行的关于组C和D次要终点的亚组分析。
安全性分析
对安全性群体进行安全性概述和分析。呈现描述统计学以概述安全性数据。
暴露程度：所有患者都接受一次施用调查产品。由处理组使用描述统计学(未漏失观察的数量、平均数、中值数、最小数、最大数和标准偏差)概述注射的调查产品的总和与在五个注射位点的每个注射的调查产品的体积。
注射位点评价：使用按照处理组合就诊的报道每个项存在(红斑、水肿、烧灼或刺痛、发痒和擦伤)的患者的数量和百分比概述注射位点评价，以及在任何处理后就诊时有反应的患者的数量和百分比。另外，按照处理组和就诊以及在任何处理后就诊时概述报告任何注射位点项的患者的数量和百分比。另外，根据第一次就诊时存在反应，概述具有指定项的患者的数量和百分比。
不利事件∶将所有处理-突发性AE(TEAE)都列出，并按处理组、系统器官类型、优先项、严重度、相关性和严重度概述。按照处理组、严重度、和与研究药物的关系和患者所列出的分别概述严重不利事件 (SAE)。
神经评价：按照处理组和就诊，对脑神经II-VII检查列表，如右侧和左侧各自瞳孔对光和调节的反应、眼球外运动、运动和Gross感觉。
针对使靶标和邻近的肌肉系统(前额，眼，面中部和嘴)受神经支配的面神经(VII)的四个主要分支的右侧和左侧和联带运动的严重度，对局部House-Brackmann面神经分级系统(Yen,2003)进行制表。这些列表是按照处理组和就诊的。
按照处理组和就诊，对眼轮匝肌、侧提眉肌和侧颧轮匝肌每个的右侧和左侧的面部肌肉力量进行制表。
研究或设计分析进行中的变化：设计分析的变化包括安慰剂组漏失数据的处理方法、次要终点的选择和优化、以及控制整体研究I型差错的试验方法。特别地，进行以下终点变化：
(1)基于评估周的次要终点和探索性终点之间分开的IGA-FWS和PFWS应答者分析现在全都是次要终点。
(2)基于患者日记的处理效应的起始和患者对处理总体满意度从探索性的向次要的转移。
(3)GAIS终点全都是探索性的，而不是一些被认为是次要的。
(4)基于IGA-FWS和/或PFWS的额外的探索性终点包括：(a)在 IGA-FWS和PFWS上同时取得0或1(无或轻度)的得分的患者比例； (b)在IGA-FWS和PFWS上分别取得至少一点改善的患者的比例；(c)在 IGA-FWS和PFWS上分别取得至少二点改善的患者的比例；(d)在第4周取得2点复合应答的患者的亚组中，取得1-或2-点复合应答的患者的比例；(e)在第4周取得2点复合应答的患者的亚组中，在IGA-FWS和 PFWS上取得0或1(无或轻度)的得分的患者的比例。
(5)基于IGA-FWS和/或PFWS的达到事件终点的另外两个时间包括：(a)在IGA-FWS和PFWS上均失去2点或更大的应答的时间，(b) 在IGA-FWS或PFWS上均失去2点或更大的应答的时间，(c)在 IGA-FWS上返回中度至严重的事件。
(6)由具有除了随时间变化的平均得分之外，随时间变化得分＞＝1、＞＝2和＞＝3的患者比例，评估作为该终点去除的“在随时间变化最大皱眉后其余时符合GAIS评估的眉间细纹改善”的探索性终点。
也进行关于返回时间的评估。使用多个量度评估在IGA-FWS和 PFWS上返回基线或比基线更差的时间，包括：(1)观察从处理开始日至第一次就诊时的天数，在第一次就诊时，在IGA-FWS和PFWS从基线改善的第1、2和4周的后期之后，IGA-FWS和PFWS均返回基线或比基线更差。如果没有存在这样的就诊，则在IGA-FWS或PFWS可用的最后就诊进行检查(censoring)。如果在第1、2和4周在IGA-FWS 和PFWS中从基线没有改善，则时间设置为0；和(2)从在IGA-FWS 和PFWS两者上从基线的第一次改善至在IGA-FWS和PFWS两者上最早后续返回基线或比基线更差的天数。如果没有观察到任何后续返回基线或比基线更差，则在IGA-FSW和PFWS两者可用的最迟就诊进行检查。对于在第4周或其之后的任何就诊，在IFA-FWS和PFWS两者上没有从基线改善的患者，则时间设置为0。
研究结果：在第36周两个研究组的眉间细纹的3期顶线结果
受试者处置：表15描述了两个研究组中ITT的处置、安全性和符合方案群体。
表15
如表15所示，高比例(89.2-97.5％)的受试者完成第24周就诊，并且类似高比例(90.5-93.6％)的受试者完成该研究。在两组研究中，609 名受试者几乎全部(95.1-99.5％)完成第4周(主要终点)就诊。低的早期中止频次(6.4–9.5％)加强了两个研究实行良好。值得注意的是，从符合方案群体排除的受试者的比例相对低，并且范围在8.8-22.5％之间。
群体的分析：表16显示了不同群体的分析。
表16
人口分布：表17显示了研究群体的人口分布。关于女性受试者的比例(86.3-89.7％)和50(49.0-50.9)的平均年龄，两个安慰剂群组和活性产品群组得到良好地平衡。
表17
基线特征：表18显示了之前使用肉毒杆菌毒素的百分比及其它特征。在组1中，之前使用肉毒杆菌毒素的比例比组2(58.8-59.3％)更低 (44.1-45.8％)。自从最后一次使用肉毒杆菌毒素(22.6-32.2)的月份的基线值、在最大皱眉时的IGA-FWS和在最大皱眉时的PFWS在组1和组 2中得到相对良好的平衡，
表18
功效：采用40U的注射用RT002(RT002；Daxi)处理眉间细纹的组 1和2的关键性3期研究超过了实施例5中具有24周持续时间的2期研究观察到的结果或与其一致，在关键应答率和持续时间测量方面观察的。
在组1和2中，主要终点满足第4周2点复合应答的RT002为74％的，相对于安慰剂分别为0％和1％(p<0.0001)，该结果超过了在实施例5中观察到的。结果显示在图5A中。使用另一种测量方法的结果显示在图5B-5C中。
图5B呈现在组1和组2的RT002组中的患者(观察的病例)(ITT) 中，在IGA-FWS和PFWS量表上均返回基线或比基线更差的时间的卡 -迈曲线图。在IGA-FWS和PFWS两者上返回基线或比基线更差的时间为从处理开始日至第一次就诊时的天数，在第一次就诊时，在两者中都观察到从基线的改善的第1、2和4周的后期之后，IGA-FWS和PFWS 都返回基线或变得比基线更差。如果没有存在这样的就诊，则在 IGA-FWS或PFWS可用的最后就诊进行检查。如果在第1、2和4周在IGA-FWS和PFWS中均从基线没有改善，则时间设置为0。
图5C呈现在两组各自的RT002组的患者(观察的病例)(ITT) 中，在IGA-FWS或PFWS量表上保持无皱纹或轻度皱纹严重度的时间的卡-迈曲线图。在IGA-FWS和PFWS两者上返回中度或严重的时间为从处理开始日至第一次就诊时的天数，其中在IGA-FWS或PFWS都是无或轻度的第1、2和4周的后期之后，IGA-FWS和PFWS都返回中度或严重。如果没有存在这样的就诊，则在IGA-FWS或PFWS可用的最后就诊进行检查。如果在第1、2或4周在IGA-FWS或PFWS中均为无或轻度，则时间设置为0。
表19A-19B和表20A-20B提供关于返回分析的时间的附加数据。
表19A-19B呈现对于在最大皱眉下两个研究组的每个的RT002组中的所有患者(观察的病例)，在IGA-FWS和PFWS上统计学返回基线或比基线更差(意向处理群体)。N为RT002组中的患者数量。百分比是基于N。在IGA-FWS和PFWS上返回基线或比基线更差的时间是从处理开始日至第一次就诊时的天数，其中在两者中均观察到从基线的改善的第1、2和4周的后期之后，IGA-FWS和PFWS两者均返回基线或比基线更差。如果没有存在这样的就诊，则在IGA-FWS或PFWS 可用的最后就诊进行检查。如果在第1、2和4周在IGA-FWS和PFWS 中均从基线没有改善，则时间设置为0。概述统计学是卡-迈估计。+指示检查的观察结果。
表19A
表19B
表20A-20B呈现对于在第4周满足2点复合应答且在最大皱眉下两个研究组的每个的RT002组中的患者(观察的病例)，在IGA-FWS 和PFWS上返回基线或比基线更差(意向处理群体)。N为其第4周具有2点复合应答者的RT002组中的患者数量。百分比是基于N。在 IGA-FWS和PFWS两者上返回基线或比基线更差的时间为从处理开始日至第一次就诊时的天数，在第一次就诊时，在两者中都观察到从基线的改善的第1、2和4周的后期之后，IGA-FWS和PFWS都返回基线或变得比基线更差。如果没有存在这样的就诊，则在IGA-FWS或PFWS 可用的最后的就诊进行检查。如果在第1、2和4周在IGA-FWS和PFWS 中均从基线没有改善，则时间设置为0。概述统计学是卡-迈估计+指示检查的观察结果。
表20A
表20B
表21A-21B提供基于随时间变化的IGA-FWS和PFWS显示无或轻度皱纹的不同处理组的百分比结果，对于研究的两个组中各自而言。 *在两种情形中，p＜0.0001vs安慰剂。关于ITT群体，在每个时间点，使用由研究中心分层的Cochran-Mantel-Haensel试验进行Daxi(RT002) vs安慰剂的应答率比较。对于RT002而言，漏失数据用最差的基线后结果填补，并且对于安慰剂而言，其用最好的结果填补。
表21A-调查者评估(IGA-FWS)
表21B–患者评估(PFWS)
表22A-22B呈现对于两个研究组的每个中的患者，在第4周就诊时患者对处理的总体满意度(观察到的病例)(意向处理群体)。
表22A
表22B
表23A-23B提供基于随时间变化的IGA-FWS和PFWS显示无或轻度皱纹的不同处理组的百分比结果，对于研究的两个组中各自而言，与实施例5研究的结果进行比较。(*在两种情形中相对于安慰剂p＜ 0.0001；**p<0.01(在实施例5的研究中相对于安慰剂)。关于ITT群体，在每个时间点，使用由研究中心分层的Cochran-Mantel-Haensel试验进行Daxi(RT002)vs安慰剂的应答率比较。对于RT002而言，漏失数据用最差的基线后结果填补，并且对于安慰剂而言，其用最好的结果填补。
表23A
表23B
表24A-24B进一步显示在调查者评估(IGA-FWS)上(表24A)和在患者评估(PFWS)上(表24B)直至第24周观察到的增强的无或轻度应答率。(*直至第24周，在所有时间点，相对于安慰剂，p<0.0001；使用研究中心分层的Cochran-Mantel Haenszel试验对于ITT群上每个时间点的RT002相对于安慰剂的应答率进行比较；对于RT002而言，漏失数据用最差的基线后结果填补，和对于安慰剂而言，其用最好的结果填补)。例如，关于IGA-FWS，组1和组2在第16具有的应答率分别为 71％和74％，并且在第24周分别为35％和29％。
表25A-25B比较了这些结果与来自实施例5的结果，并且显示在研究者评估(IGA-FWS)(表25A)和在患者评估(PFWS)(表25B)上直至第24周观察的增强的无或轻度应答率(*p<0.0001(相对于安慰剂)， **p<0.01(相对于安慰剂)；使用研究中心分层的Cochran-Mantel Haenszel试验对于ITT群上每个时间点的RT002相对于安慰剂的应答率进行比较；对于RT002而言，漏失数据用最差的基线后结果填补，和对于安慰剂而言，其用最好的结果填补)。直至第24周，在IGA-FWS 上观察到增强的无或轻度应答。对于两个组各自的应答率，在第16周分别为71％和74％；和在第24周，为35％和29％(在直至第24周的所有时间点，相对于安慰剂p<0.0001)。在实施例5的研究中，在第 16周，RT002 40U剂量反应率为67％，和在第24周其为31％，与 OnabotulinumtoxinA 20U相比，在第16周，应答率为31.7％，和在第24周，应答率为11.9％(再次参见Carruthers 2017；和Allergan,Inc. 
(onabotulinumtoxinA)Prescribing Information,2013)。
也如图6A-6B中所示，这些结果超过了在实施例5中得到的那些，其显示在第4周，RT002的2点复合应答为52.8％(图6A)。(*p<0.0001 (在由研究中心分层的Cochran-Mantel-Haenszel试验上相对于安慰剂) (也参见Carruthers,2017)。
图6B比较了该研究的组1和组2与实施例5，在随时间变化在 IGA-FWS和PFWS上无应答或轻度应答方面。实施例5显示，在第16 周，应答为67％，和在第24周，应答为31％(图6B)。在3期研究中，漏失数据在直至第24周就诊时用最差的基线后结果(或对于安慰剂组，用最好的结果)填补。对于第24周后的就诊，使用无应答者填补。在实施例5中，应答率针对具有数据的受试者。
图7呈现了对于本研究的两个组各自，对于实施例5和对于各种其它肉毒杆菌毒素制剂，基于随时间变化的IGA-FWS和PFWS的得分保持无皱纹或轻度皱纹的受试者百分比。图7构建在图6上，包括按照 onabotulinumtoxinA、abobotulinumtoxinA和incobotulinumtoxinA的包装说明书，在IGA-FWS和PFWS随时间变化的无应答或轻度应答。例如，OnabotulinumtoxinA 20U，其在第16周显示31.7％的应答率和在第24周显示11.9％的应答率。特别地，亮蓝色实线表示Abobot GL-1 (在Dysport的US包装说明书中描述的AbobotulinumtoxinA，用于它们的GL-1研究)；亮蓝色虚线表示Abobot GL-3(在Dysport的US包装说明书中描述的abobotulinumtoxinA，用于它们的GL-3研究)，橙色表示OnabotUSP1(OnabotulinumtoxinA，如在相应US包装说明书中描述的)；红色空心三角形表示Incobot GL-1(在Xeomin的US包装说明书中描述的IncobotulinumtoxinA，用于它们的GL-1研究)；和红色实心三角形表示Incobot GL-2(在Xeomin的US包装说明书中描述的IncobotulinumtoxinA，用于它们的GL-2研究)。在3期研究组中，对于 ITT群体，漏失数据在就诊直至第24周用最差的基线后结果(或对于安慰剂组而言，最好的结果)填补。对于第24周后的就诊，使用无应答者填补。相对于实施例5的结果，应答率是针对具有数据的ITT受试者。
图8-10进一步呈现了3期研究的结果。图8描述了相对于实施例5，按照PFWS无应答或轻度应答。在3期研究组中，漏失数据在就诊直至第24周用最差的基线后结果(或对于安慰剂组而言，最好的结果)填补。对于第24周后的就诊，使用无应答者填补。在实施例5中，应答率是针对具有数据的受试者。
图9描述了相对于abobotulinumtoxinA而言，按照PFWS无应答或轻度应答。在3期研究(ITT)中，漏失数据在就诊直至第24周用最差的基线后结果(或对于安慰剂而言，最好的结果)填补。对于第24周后的就诊，使用无应答者填补。在实施例5中，应答率是针对具有数据的ITT受试者。
图10描绘了在本研究中的组1和组2(ITT)相对于实施例5(PP)，在随时间变化IGA-FWS上≥1点应答的比例。在3期研究组中，漏失数据在就诊直至第24周用最差的基线后结果(或对于安慰剂组而言，最好的结果)填补。对于第24周后的就诊，使用无应答者填补。在实施例5中，应答率是针对PP群体中的受试者。
图11-13进一步概述了这些结果。该研究的两个组是具有中度至严重眉间细纹的患者中进行的第一个和唯一的3期试验，其证明了在多个临床有意义的结果测量上≥24周的经证实的功效。两个3期研究超过了实施例5的研究结果，按照调查者(图11)和受试者评估(图12)，在 IGA-FWS和PFWS上从基线改善≥1-点的平均持续时间分别为24.1和 23.7–23.9周。相反，实施例5中的研究表明采用RT002 40U，在 IGA-FWS上≥1-点改善为23.6周平均持续时间，相比而言，采用 onabotulinumtoxinA 20U，其为18.8周(p<0.03)(Carruthers,2017)。图 13描绘了对于这该研究的两组而言IGA-FWS和PFWS的比较。
图14-16描绘在重复IGA-FWS和PFWS上，采用40U的RT002 保持无或轻度皱纹严重度状态(0或1的得分)所述持续时间，观察到≥1 点的改善结果。图14呈现对于本研究的两个组(紫线和蓝线)的每个和对于实施例5(红线)而言，随时间变化在IGA-FWS上保持无或轻度皱纹严重度状态(0或1的得分)的受试者的百分比。图15呈现对于本研究的两个组(紫线和蓝线)的每个而言，基于在第4周的2点复合应答者，随时间变化在IGA-FWS上保持无或轻度皱纹严重度状态(0 或1的得分)的受试者的百分比。图16存在对于本研究的两个组(紫线和蓝线)的每个而言，随时间变化在IGA-FWS或PFWS上保持无或轻度皱纹严重度状态(0或1的得分)的受试者的百分比。
图17描绘在该研究的组1和2中平均持续时间分别为27.7周(6.5 个月)和26周(6.1个月)。在IGA-FWS和PFWS上采用RT002返回基线皱纹严重度的平均时间超过六个月。
患者总体满意度：在该研究的两个组中，在第4周观察到高的患者总体满意率。图18描绘在7-点量表上，组1和2的“满意”或“非常满意”的满意率分别为91％和88％。
图19-20展示3期研究的示例性的受试者的照片。图19呈现在 RT002 40U处理之后，在第4周(最大皱眉)显示按照IGA-FWS和 PFWS的2点改善；和直至第24周，1点持续的效应持续时间的受试者的照片。
图20A-20B呈现在RT002 40U处理之后，在第4周(最大皱眉) 显示对于IGA-FWS和PFWS的2点改善；和直到第24周(图20B) 和第32周(图20B)保持1点持续的效应持续时间的不同受试者的照片。
安全性：
在两个组中，直到第36周，观察到RT002 40U通常是安全性和良好耐受的。在RT002组中，组1和2中具有不利事件的受试者的百分比分别为36％和46％；在安慰剂组中，其分别为25％和24％。参见表 26，概述了不利事件。在RT002中，大多数的事件在严重度方面是轻度的，被认为与研究药物无关。在RT002组中，没有受试者继发AE而中止。在RT002组中，各组中的两名受试者经历严重的AE，其中没有一个是处理相关的。在RT002组中，组1和2中处理相关的AE分别出现在17.4％和21.0％的受试者中；在安慰剂组中，其分别为8％和9％。
表26
在跨两个研究的RT002组中，最常见的事件是头痛(6-7％)和注射位点疼痛(2.4％-5％)；注射相关的水肿和红斑率≤2.4％，并且所有情形的严重度都是轻度的。观察到全部眼睑下垂率2.2％，平均持续时间为 60天。表27按照优先项概述了处理相关的不利事件的数量(在任一个组中＞2％)(*6例轻度严重度，3例中度严重度；全部都解决了而没有后遗症。平均持续时间60天；
每组具有>2例眼部病症。全部病例的严重度都是轻度的。
平均持续时间30天)。
表27
严重和严重(Severe和serious)不利事件呈现在表28和表29中。
表28按照优先项概述了严重不利事件**(*严重AE也是一种严重的AE；**没有一种严重不利事件是处理相关的)。
表28
表29按照优先项概述了严重不利事件**(*没有一种上述严重 AE是处理相关的)。
表29
实施例8:关于可注射的肉毒杆菌毒素制剂的随访安全性研究，显示在处理眉间细纹方面经过连续处理提高的安全性、更高的应答率和更长的效应持续时间
除了两个计划的关键性试验之外，3期方案包括长期、开放标记的安全性试验，其设计用于评价RT002在单次或反复处理施用之后在处理成年人中度至严重眉间细纹中的长期安全性。预期长期安全性试验在多个地点招收约1,500名受试者。根据处理数量和随访的持续时间，受试者可以参与试验中最大84周。
安全性研究包括3期预期的、开放标记的、多中心、重复剂量试验，以评价单次和重复施用RT002在处理中度至严重眉间细纹中的安全性。所述安全性研究包括约60个中心和约1,500名招收的受试者，除了来自本文所述实施例7的组1和2的3期的600名转来(roll-over)受试者(其用于重复处理)之外。受试者接受至多三次重复处理。来自实施例7的受试者在根本试验(parent trial)中接受一次处理，并且在该试验中至多两次，总共三次处理；重新招收的受试者接受至多两次处理。图21A 描绘研究设计。随访指当IGA-FWS和PFWS返回基线时受试者在第 12周开始再处理是合格的。图21B描绘该研究的概述，与实施例7的组1和2进行比较。*指US中心；**指US和加拿大中心。
在每次处理之后，所有受试者都随访至少12周和至多36周，用于安全性评估。如果在第12周就诊时，或者在第12周和第36周之间就诊时，如果在最大皱眉下的PFWS和IGA-FWS得分返回基线，则在其中记录这两个得分的就诊变成最终评价就诊，并且对于接受多次处理的那些受试者，该就诊充当再处理就诊并提供用于该试验的基线；同样，这些受试者在他们的最终合格处理之后在第12周进行最终评价就诊。
剂量方案：所有处理都由经训练的医师肌肉注射施用。如实施例7 所述进行施用。也参见图23，指示在该试验中使用的注射位点。受试者接受总共0.5mL的处理，5个注射位点中的每一个注射施用0.1mL；两个注射到每处皱眉肌中，一个注射到降眉间肌中。剂量为每次注射处理40U，在五个注射位点之间分配。受试者参与的持续时间可变化，取决于处理数量、对于RT002的应答和随访的持续时间。受试者可以处于试验中最多86周，包括两周的筛选期。
试验就诊：筛选(2周)，处理(0天)，第一次处理后，在第1、2、 4、8和12周进行随访，然后在第16、20、24、28、32、36周或者直至再处理进行随访。第二次处理后，在第1、2、4、8和12周进行随访(对于再处理的受试者)，然后在第16、20、24、28、32、36周或者直至再处理进行随访(第三次按剂量施用)。第三次处理后，在第1、2、4、8和 12周进行随访(对于接受第三次处理的受试者)。用于再处理合格的受试者显示IGA-FWS和PFWS严重度得分返回基线。对于第1周(处理后)而言，允许从按时间表就诊天的变化为+/-2天；对于第2、4、8、12、 16、20、24、28、32和36周各自而言，其为+/-3天。
图22进一步描绘了在该试验中遵循的试验评价的时间表。特别地，“a”指实施例7(3期研究，组1和2)在试验PT结束时的最终评价就诊，以及第12周的血清抗体试验，其在该试验中充当转来受试者(roll overs) 的基线；“b”指当在第12周或在第12周至第36周之间就诊时，IGA-FWS 和PFWS返回基线时，可能是再处理合格的受试者。“c”指接受多次处理的受试者，其在最终处理之后在第12周完成最终评价就诊；“d”指进行预处理的程序；“e”指进行后处理的程序；“f”指如果是阳性的，则该试验通过血清妊娠试验证实；“g”指在筛选时仅收集PT；“h”指如果报道毒素远距离散布的体征或症状，则记录生命体征；“i”指包括在最大皱眉时和最大皱眉后其余时受试者的正视图的照片。在第一次处理期间，在基线、第4、16、20、24和EOS拍照这些照片。在第二次处理期间，在基线、第4周和EOS拍照照片。在选择的中心，照片也包括在其余时和然后是在基线时的抬高前额最大时和所有随访就诊时的受试者前额；“j”指处于眉毛放松的主要凝视中和处于眉毛抬高的主要凝视中，得到的受试者的照片；“k”指如果记录或观察到眼睑下垂的症状，则获得照片。
安全性评价：临床实验室测试(血液学、化学、凝血酶原时间[PT]、尿分析)；对于生育潜能的女性(WOCBP)的尿妊娠测试(UPT)；RT002 和RTP004的血清抗体测试；注射位点评价；脑神经II–VII评估；面部肌肉力量的评价；伴随的药物；收集不利事件(AES)；毒素远距离散布问询；生命体征；和身体检查。
如表30所列，在筛选、第4周就诊、再处理之前(若有可能)和最终评价就诊时，采集非禁食样品，用于血液、化学、凝血(凝血酶原时间；仅用于筛选)和尿分析。在筛选和第2、4和12周就诊时，采集用于抗体的血液样品。
表30-临床实验室检查
WOCBP＝生育潜能的女性*仅在第2、4和12周就诊时筛选
抗体检验∶如果在RT002处理过程期间对样品出现了抗体滴度，则使来自该受试者的样品进行小鼠保护试验，以检验中和抗体。
使用描述统计学概述对于RT002和RTP004的血清抗体，对于阳性样品结果分析趋势，并与涉及免疫原性的临床显著事件相关联。特别地，给出描述统计学以显示阳性抗体结果的频数以及随时间变化与免疫原性有关的相关临床显著事件。
生命体征：在筛选和处理就诊(处理前和处理后)、第2周、最终评价或早期中止就诊和在其中报道肉毒杆菌毒性的体征或症状时获得的生命体征(即，体温、呼吸率、静坐桡动脉脉搏率和静坐收缩压和舒张压)。
身体检查：在筛选、第2周和最终评价或早期中止就诊时，进行除了生命体征之外的身体检查，包括脸部、一般性外观、皮肤、颈(包括甲状腺)、眼睛、耳、鼻、咽喉、心脏、肺、腹部、淋巴结和四肢的神经学检查。如调查产品施用之前存如的有意义的身体检查发现被包括如医疗史页上。记录满足不利事件定义的有意义的身体检查发现。
注射位点评价：在筛选就诊、处理前和处理后的处理就诊、随访就诊和最终评价就诊或早期中止就诊(若有可能)时评价注射位点。该评价将作为5个注射位点的总体评价进行，如上表11所示。
脑神经II-VII的评估：在筛选就诊、处理前和处理后的处理就诊、随访就诊和最终评价就诊或早期中止就诊(若有可能)时，由调查者进行脑神经II–VII(分别在左侧和右侧)的评价。获得每个脑神经的得分，如表12中列出的。检查方法如表3列出的。
表31:脑神经II–VII评价标准
区域House-Brackmann面神经分级系统：该系统被设计用于评价联带运动和使靶标和邻近的肌肉系统受神经支配的面神经(VII)的四个主要分支(Yen,等人,2003,OtolNeurotol.24(1):118-122)。调查者在筛选、处理前和处理后处理就诊、随访就诊和最终评价就诊或早期中止就诊(若有可能)时对面神经(VII)的功能性进行评价。参见上表13和下表32。
表32
面部肌肉力量的评价：使用关于肌肉力量评估的医学研究委员会 (MRC)量表评价面部肌肉力量(Paternostro-Sluga,等人,2008,J Rehabil Med.40:665-671)。评价了在脸的每一侧上的以下肌肉：眼轮匝肌 (眼睑)、侧提眉肌、颧轮匝肌。参见表14。调查者在处理前和处理后的处理就诊、随访就诊和最终评价就诊或早期中止就诊(若有可能)时评价面部肌肉力量。
不利事件：将不利事件(AE)分级为轻度、中度或严重，并在处理后的处理就诊、随访就诊和最终评价就诊或早期中止就诊(若有可能)时进行评价。
毒素远距离散布询问(特定的AE和神经肌肉无力症状的询问)：在处理前和处理后处理就诊、随访就诊和最终评价就诊或早期中止就诊 (若有可能)时进行毒素远距离散布查询。患者被以通用方式询问潜在地表明毒素远距离散布的不利事件清单，包括调节障碍、反射消失、误吸、视力模糊、肉毒中毒、眼睑功能障碍、眼睑下垂、面神经麻痹、面神经轻瘫、第四脑神经轻瘫、周围神经麻痹、外周神经性瘫痪、盆底肌无力、误吸性肺炎、瞳孔反射受损、心动过缓、睫毛下垂、球麻痹、便秘、脑神经麻痹、脑神经瘫痪、隔膜麻痹、复视、口干燥、发音困难、吞咽困难、发声困难、呼吸困难、眼球外肌麻痹、轻瘫(paresis)、胃肠病症、四肢麻痹(quadriparesis)、头痛、轻偏瘫、舌下神经麻痹、反射减弱、张力减退、单肢轻瘫、肌无力、麻痹、松弛性瘫痪(paralysis flaccid)、麻痹性肠梗阻、下肢轻瘫、脑神经麻痹、呼吸衰竭、呼吸停止、呼吸抑制、语言障碍、第三脑神经麻痹、三叉神经麻痹、尿滞留、声带麻痹(vocal cord paralysis)、声带麻痹(vocal cord paresis)和干眼症(干眼)。
有效性评价:调查者总体评估皱眉皱纹严重度(IGA-FWS)；患者皱眉皱纹严重度(PFWS)；和调查者和患者总体美学改善量表(GAIS)。如上所述进行评价。
其它评价：处理区域的照片。拍照经处理区域的标准数字照片。对于评价眼睑下垂存在的照片，在用于比较目的的基线，或在其中存在报道的或观察的疑似眼睑下垂体征的随后就诊，由主办者提供的照相机以标准方式拍照照片。在每个时间点拍照的两张照片为：1)处于眉毛放松的主要凝视中的受试者，和2)处于眉毛抬高的主要凝视中的受试者。照片也包括受试者在抬高前额最大时和抬高前额最大后其余时的前额。
诊断和主要简略的合格标准：门诊患者，男性或非妊娠、非护理中的女性，18岁或更年长，并且处于良好的一般健康，具有基于IGA-FWS 和PFWS而言在最大皱眉时的中度(2)或严重(3)眉间细纹。
试验物品、剂量，施用：RT002，40U，IM注射，0.5mL。所述 RT002产品为可注射制剂，其含有150kD的亚型A肉毒杆菌毒素分子，不含附属蛋白质，其与具有式RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR (RTP004；SEQ ID NO:4)的带正电荷的载体肽非共价地相结合，并且其不含附属蛋白质或动物来源的组分。所述赋形剂包含0.1mg聚山梨酯 20、36mg海藻糖二水合物和11.7μg RTP004/50U的150kDa A型毒素(不含附属蛋白质)，并且处理剂量为40U。
统计分析：所有统计学程序设计均使用统计分析系统(SAS)版本 9.4或更高版本来进行。
试验的受试者是合格地，能够接受至多三次处理。为了分析的目的，对于每次处理规定相应的概述期。对于试验总体概述，在试验期间观察到的所有可用数据都被包括。对于与特定处理相关的分析，所述概述包括从处理直到下次处理或直到试验的最后一次就诊(当没有后续处理时)所观察到的所有数据。为了说明受试者随访持续时间的变化，对于每个概述期，计算总随访持续时间(即，患者-年月)。对于试验总体概述，基线是在第一次处理之前最后一次可得到的值。对于与特定处理相关的概述，基线是在处理之前最后一次可得到的值(即，再次的基线)。
可评价安全性的群体包括暴露于调查产品和提供任何处理后安全性信息的所有受试者。关于可评价安全性的群体的亚组，仅包括接受试验处理和关于特定处理的处理后安全性信息的那些受试者，进行与三个处理期的每个相关的特定分析。这些可评价安全性的亚群分别确定为可评价的处理-1、可评价的处理-2或可评价的处理-3。
对于在之前的试验中处于积极处理组中的转来受试者，在该开放标记安全性试验中的第一次RT002处理实际上是他们的第二次RT002处理。基于受试者之前对RT002的暴露，规定以下两个概述组进行分析：组A和组B。前一组包括在实施例7的组1或组2中接受RT002的所有受试者，后一组将包括其余试验受试者。
安全性分析：记录试验之前出现的所有处理-突发性不利事件(AE)，并基于MedDRA术语学和如本文所述，进行归类。AE可以定义为在施用调查产品之后且直到试验参与结束出现或恶化的任何不幸的医学发生(例如，体征、症状、疾病、综合征、间发疾病(intercurrent illness)、临床显著的实验室发现结果异常、损伤或事故)，其可能不一定与施用调查产品有因果关系。因此，AE可以是与使用调查产品暂时相关的任何不利的和/或不期望的症状(包括临床显著的实验结果异常)、症状或疾病，无论是否与调查产品有关。处理-突发性AE是在暴露于处理的任何时期之后出现的那种。AE包括处理后在试验安全性评价中的任何临床显著的变化(例如，生命体征、注射位点评价、脑神经II–VII的评估、和面部肌肉力量的评估)。
预先存在的病症，由于调查产品的使用引起其频次或严重度增加或性质变化，也将被认为是不利事件。预料不到的AE是一种不良反应，其性质或严重度与可应用的产品信息不一致。
严重不利事件(SAE)是引起任一种以下结果的任何不幸的医学发生：死亡、危急生命、受试者进行正常生活功能的持续性或明显残疾/ 无力或实质性破坏、需要病人住院或延长住院(即，延长住院超过预期停留时长)；先天异常/出生缺陷(即，在怀孕之前或妊娠期间暴露于调查产品的受试者的儿童或胎儿中的不利后果)，没有遇到任一种上述严重标准但是基于合适的医学判断可能危及受试者或可能需要医学或外科手术以预防上述后果(即，显著的或重要的医学事件)之一。
对于可评价安全性的群体，概述从总体试验期间收集的安全性数据。在相应亚群(即，可评价的处理-1、可评价的处理-2或可评价的处理-3)上进行与三个处理期的每个相关的概述。为了解释可变的受试者随访持续时间，对每个概述周期计算总随访持续时间(即，患者年龄)。呈现统计学数据以概述安全性数据。
调查产品因果性和严重度：如下评价与AE与调查产品的关系：确定指在AE的起始和施用调查产品之间存在临床貌似真实的时间顺序；当所述事件对于撤回调查产品有应答和/或与再施用调查产品时复发；很可能指在AE的起始和调查产品的施用之间存在临床貌似真实的时间顺序；AE不可能是由于同时发生的/潜在疾病、其它药物或程序引起的；可能指在AE的起始和调查产品的施用之间可能或不可能有临床貌似真实的时间顺序，并且原因可能不会被排除；无关：指与施用的调查产品没有时间关系或因果关系。
AE种类：轻度指该事件可能值得受试者注意；并不影响每日活动；通常不需要介入；中度指该事件可能足够严重使得受试者不舒服的；每日活动性能可能受影响；可能需要介入；严重指该事件可能引起严重不适；通常妨碍每日活动；受试者不能继续参与该试验；通常需要处理或其它介入。
将所有报道的处理-突发性不利事件按照受试者报道事件的数量、系统器官类型、优先项、严重度、与试验药物的关系和严重度概述。当按照因果性和严重度概述事件时，通过使用在每个分类中具有最大关系和最高严重度的事件，将每名受试者仅在系统器官类型或优先项之类计算一次。提供导致受试者早期中止所述试验的AE清单。按照受试者、严重度概述、和与试验处理的关系列出严重不利事件(SAE)。对于整个试验和对于三个处理期的每个，进行AE和SAE的概述。对于SAE和关键AE(如建议毒素远距离散布的那些)，计算根据注射比率 (rate-per-injection)和根据患者年月比率(rate-per-patient-year)。关于该比率也提供95％置信区间。
有效性分析：在试验期间，随时间变化在最大皱眉时和在最大皱眉后其余时，评价有效性结果量度，如IGAFWS、PFWS、GAIS。计算应答率和应答持续时间。根据观察概述有效性数据，没有对漏失数据进行填补。在所有时间点，提供用于概述组的所有有效性变量的描述统计学。视情况而定，提供用于比较感兴趣的亚组之间(例如，女性相对于男性，第一次处理相对于第二次处理，等)的差异的95％置信区间和/或 p-值。针对时间-与-事件终点绘制卡-迈曲线。当进行比较(例如，女性相对于男性，第一次处理相对于第二次处理，等)时，在0.05的显著性水平下进行试验，而没有调整多重性。
样本量调整(Justification)：对于用相同调查产品处理的所有受试者，这是安全性试验。约2,100的样本量被认为基于数种方法足够评估安全性。在该试验中处理约2,100名受试者，当在试验期间没有发生这样的事件时，得出结论：在95％置信度下，不良事件的发生率不超过 0.15％。采用n＝2,100，当真实发生率为约50％时，估计事件发生率的精确度(基于95％精确置信区间)至多±2.22％，或者当真实发生率在5％范围中时，估计事件发生率的精确度为约±1.0％。n＝2,100的样本量也具有足够评价某一事件的发生率是否等于固定的发生率的能力，例如，在1.5％的等价边界(equivalent margin)和0.05的显著性水平(基于两个单侧检验)下，证实>95％的能力相当于发生率3％。
2,100名招收的受试者中至少400名接受至多三次处理，当实际事件发生率从第一次处理的3％增加至在第三次处理时的6％时，在0.05 的显著性水平(1-侧检验)下，检测从第一次处理到第三次处理的发生率增加的能力为86％。而且，n＝400，对于3％的观察的发生率，95％精确置信区间为1.6-5.2％，并且对于5％的观察的发生率，其为3.1-7.6％。
试验终点
安全性终点：在每次处理和整个试验期间处理-突发性不利事件的发生率、严重度、和与试验药物的关系；和在每次处理和整个试验期间处理-突发性不利事件的发生率、严重度、和与试验药物的关系。安全性可评价的群体包括暴露于调查产品的所有受试者。
有效性终点：除非另有规定，否则此后与IGA-FWS、PFWS或 GAIS相关的所有终点都是基于在最大皱眉下的评估。当可用时，也概述了基于在最大皱眉之后其余时的评估的类似终点。对于来源于与基线比较的终点，分别应用使用不同参考时间点的两个推导规则作为基线 (即，试验基线或处理基线)。这些包括：自从第一次试验处理计复处理的时间(关于仅可评价的处理-1)；自从第二次试验处理计复处理的时间(关于仅可评价的处理-2)；在IGA-FWS和PFWS上返回基线或比基线更差的时间；在IGA-FWS和PFWS上返回2或3(中度至严重) 的时间；随时间变化在每次就诊时，在IGAFWS和PFWS上从基线改善≥2点的受试者的比例；随时间变化在每次就诊时，在IGA-FWS上具有0或1的得分(无或轻度)的受试者的比例；随时间变化在每次就诊时，在PFWS上具有0或1的得分(即，无或轻度)的受试者的比例；随时间变化在每次就诊时，在IGAFWS和PFWS上具有从基线改善≥1点的受试者的比例；随时间变化在每次就诊时，在GAIS上具有改善≥1 点(即，改善，大程度改善，或非常大程度地改善)的受试者的比例(用调查者的评估或受试者的自我评估分别概述的)；随时间变化在每次就诊时，在GAIS上具有≥2点的得分(即，大程度改善，或非常大程度地改善)的受试者的比例(用调查者的评估或受试者的自我评估分别概述的)；随时间变化在每次就诊时，在GAIS上具有从基线改善≥3点的受试者的比例；随时间变化在每次就诊时，在GAIS上具有改善≥3点(即，非常大程度地改善)的受试者的比例(用调查者的评估或受试者的自我评估分别概述的)；随时间变化在每次就诊时，平均GAIS得分(用调查者的评估或受试者的自我评估分别概述的)。
关键有效性终点：
-随时间变化在IGA-FWS和PFWS上具有从基线改善≥2点的受试者的比例；
-在IGA-FWS和PFWS如评价的，随时间变化取得0或1的得分 (无或轻度)的受试者的比例；
-在IGA-FWS和PFWS上均失去无或轻度的时间；
-在IGA-FWS和PFWS上均返回基线或比基线更差的时间；和
-如由调查者和受试者评价的GAIS，随时间变化具有改善≥1点的受试者的比例。
对于试验整体改善和按照处理期，进行关键有效性终点。
与实施例7的简单比较：在试验起始，训练的调查者和受试者按经验证的4点皱纹严重度量表评价眉间皱眉细纹的严重度。在招收时，受试者被要求具有如由调查者和受试者评价的中度或严重的眉间细纹皱纹严重度。
实施例8的结果
该研究证实了在两个3期关键性研究(实施例7)中确定的安全性特性谱，没有报道新的可耐受性或安全性问题，在重复按剂量施用之后 AE的比率稳定或降低。在该研究中，向2691名受试者施用总共3830 次RT002(40U)处理。在3个处理期中，没有累积AE的证据，表明在重复按剂量施用之后RT002的安全性模式仍然是稳定的。
安全性概述：在眉间(皱眉)细纹中的3,800次处理中，RT002是良好耐受的；不利事件是轻微的、局部化的和暂时的；处理相关的AE的比率随连续处理而降低；每次处理时眼睑下垂比率小于1％。与在30 个地点进行的实施例7的组1和组2的研究(18％)相比，在66个临床地点的实施例8的研究中，在较少的处理(14％)中经历处理-相关不利事件。
AE的概述：在研究过程期间，39％的受试者经历不利事件。总的来说，TEAE的发生率不会随着连续处理周期升高，大部分事件的严重度轻微，并且所考虑的大多数事件与处理无关。所报道的最常见的不利事件为头痛(5.9％受试者)、鼻咽炎(4.3％)、注射位点疼痛(3.3％)、注射位点红斑(2.9％)、注射位点水肿(2.6％)、红斑(2.4％)和上呼吸道感染(2.0％)。严重的AE出现在1.1％的受试者中，并且与处理无关。
处理相关的AE：18％的受试者报道的不利事件被认为与RT002或施用方法有关。处理相关的AE的严重度通常是轻度的。最常出现的处理相关的AE是头痛(4.6％的受试者)、注射位点疼痛(3.2％)、注射位点红斑(2.7％)、注射位点水肿(2.6％)和红斑(2.0％)。在重复处理之后，逐渐降低百分比的受试者经历处理相关的AE。在接受三次连续处理的受试者中：对于处理1，13.5％的受试者经历处理相关的AE，对于处理2， 4.1％的受试者经历处理相关的AES；并且对于处理3，3.8％的受试者经历处理相关的AE。
眼睑下垂：观察到0.9％的低比率的眼睑下垂(在3830次处理中35 个事件)，并且在1.3％的受试者中在66个地点出现。这与在实施例7 的30个地点的研究中处理的405名受试者中2.2％的比率比较是有利的。
令人惊奇地，眼睑下垂的比率随后续RT002处理周期而降低：对于处理1，1.0％的受试者经历处理相关的AE，对于处理2，0.8％的受试者经历处理相关的AES；并且对于处理3，0.7％的受试者经历处理相关的AE。除了一个之外全部眼睑下垂表现为单侧的，大多数的严重度是轻度的，并且具有45天的平均持续时间。
有效性/功效概述：该研究证实功效超过在采用40U剂量的RT002 的实施例7研究的两组中看到的或与其可比较。跨过多个处理周期及评价应答率和效应持续时间的多个终点，RT002的功效高度一致。
跨过实施例7-实施例8的功效结果表示在用于中度至严重眉间细纹的登记试验中观察到的最高应答率和最长效应持续时间。DAXI(对于这些临床试验为RT002)的功效保持超过单次处理，早在第1周非常高比例的受试者就符合无或轻度皱纹的处理目标。总之，在第1周，存在大于90％的应答；功效超过在实施例7中可看到的或与其可比较。
跨过全部3次处理，直到第4周，在IGA-FWS上至少95％的调查者和在PFWS上91％的受试者认为无或轻度的应答率增加，证实在实施例7的组1和2中观察到的应答增强。在第4周，实施例8中的受试者取得大于95％的应答率和高2点的复合应答率，其随每个连续处理周期而增加：处理周期1＝73.2％，处理周期2＝77.5％和处理周期3＝ 79.6％。实施例8的结果证实在参与安慰剂对照的实施例7的组1和2 研究的受试者中，在第4周观察到高的2-点复合应答率分别为73.6％和74.0％。
应答率概述：该研究的结果表示在用于眉间细纹的登记试验中观察到的最高应答率。非常高比例的受试者满足处理目标。在第4周，95％的调查者和91％的受试者对跨过所有处理周期的受试者评级为具有无或轻度眉间细纹(分别在IGA-FWS PFWS量表上)。此外，在所有处理周期中，在第4周，在GAIS上，99％的调查者和97％的受试者报道了眉间细纹的改善。在第1和2周期中，在第24周，经报道的超过70％的调查者和超过60％的受试者保持改善。此外，满足FDA-要求的2点复合应答终点的受试者的比例与实施例7的组1和2的相当，在处理周期1、2和3中，在第4周，应答率分别为73.2％、77.5％和79.6％。
在接受3次处理的受试者(n＝340)中，重复按剂量施用RT002是有效的，具有延长的效应持续时间和高应答率，其随时间变化而增加：
-2点改善IGA:73.2％/77.7％/79.6％
-无或轻度IGA得分：95.8％/96.6％/97.7％
效应持续时间概述：实施例8的结果证实了在实施例7的组1和2 中采用40U剂量的RT001所观察到的临床益处的长持续时间，并且证明了跨过处理周期的一致性。在处理周期1和2中，返回基线眉间细纹严重度的平均时间为28周，并且也与在实施例7的组1和2的关键性研究中观察到的完全处理效应的消失所用的时间一致。在实施例8的处理周期1和2中，无或轻度皱纹严重度消失的平均时间为24周，如由调查者和受试者评价的，并且与在实施例7的组1和2中所观察到的临床益处的持续时间相同。
在年龄和之前的毒素暴露亚组中的效应持续时间与整个实施例8的群体类似或大于其，证明了RT002在处理眉间细纹中的可预测性和一致性。按照年龄：在年龄65岁或更年长的受试者中，返回基线皱纹严重度的时间为31周，与之相比，对于小于65岁的受试者和对于整个实施例8的群体而言，其为28周。年龄65岁或更大的受试者同时经历无或轻度皱纹严重度的消失，平均持续时间为24周，如同小于65岁和整体实施例8群体的那些受试者。按照之前的毒素暴露：返回基线皱纹严重度的平均时间为28周，并且返回无或轻度皱纹严重度的平均时间为 24周，与在RT002处理时之前的BoNTA暴露无关。
一致性概述：安全性、功效和持续时间超过实施例7中看到的或与其可比较；安全性特性谱与实施例7的组1&2及其它批准的神经调节剂一致；跨过所有处理组，看到延长的效应持续时间；包括年龄和毒素处理经历。
结论：这些研究评价了多次RT002处理用于处理中度至严重眉间细纹(GL)的长期功效和安全性。在每次处理之间的间隔为至少12周，最大处理持续时间为36周。该研究提供了至多84周的随访数据，以及比实施例7的试验更大量的研究药物的暴露。该研究是RT002用于在临床情形中模拟随时间变化重复施用的第一次长期研究。招收了总共 2691名受试者，其中1033名受试者接受多次(至多3次)处理。
在该研究中，在单次处理之后观察到高应答率和长效应持续时间，并且其在多次处理中持续，在更大量的研究中再证实了在实施例7的单次处理研究中看到的结果，临床地点的选择更宽。
在单次处理实施例7研究中观察到的增强的功效随着连续RT002 处理得到保持，并且没有观察到任何新的安全性问题，同时连续处理降低了处理相关的AE的发生率。该研究证实至多3次采用RT002处理眉间细纹经84周是良好耐受的，并且超过95％的患者达到的无或轻度严重度的处理目标，具有持续24周的效应持续时间，效应持续时间定义为直到无或轻度应答消失的平均时间。
研究结果的补充细节如下。
该研究招收接近2,700名受试者，满足至少2,100次单次处理和500 次三次处理的基准。
受试者分布：参见表33和表34A-34B。
表33
*继发于谋杀
表34A
| 实施例8中的总数 | |
| 受试者的数量 | 2,691 |
| 在实施例8中接受RT002 40U处理 | |
| 处理周期#1 | 2,380 |
| 处理周期#2 | 882 |
| 处理周期#3 | 568 |
| 处理总数 | 3,830 |
表34B
*从头(De novo)受试者；
来自实施例7组1和2的受试者；
51 受试者由于在第36周保持处理效应而有资格接受处理3。
与实施例7相比的人口分布：处理群体与实施例7的组1和2中的那些类似。参见表35和表36。
表35
表36
安全性结果：不利事件的概述，与实施例7进行比较；大部分AE 的严重度是轻度的，在实施例7和实施例8的任何试验中没有处理相关的SAE出现。参见表37。
表37
*继发于谋杀；**调查者认为是可能、很可能或确定地与所述处理相关。
表38显示与因果性无关的不利事件(≥2％)，与实施例7进行比较。
表38
表39A-39B和表40显示处理相关的不利事件(≥1％)，与实施例7 进行比较。如表39A所示，在实施例8的研究中，处理相关的AE比率低，且随连续处理而降低。
表39A
*29(85％)病例为轻度严重度，5(15％)病例为中度严重度。平均消退时间45天。
表39B
*29(85％)病例为轻度严重度，5(15％)病例为中度严重度。平均消退时间45天。
表40
表41显示在跨过处理周期在接受所有三次处理的受试者中的AE (n＝340)。
表41
*调查者认为可能、很可能或确定地与所述处理相关。
功效结果：图24A-24B描绘了跨过各研究在第4周保持眉间细纹改善的受试者的比例。图24A描绘在实施例7的组1&2和实施例8中，在第4周在最大皱眉下取得≥2点复合应答的受试者的比例。如所示的，跨过各研究和处理中，所述2点复合应答是可比较的。此外，RT002显著地改善眉间细纹严重度的外观，并且所述处理应答随连续处理周期而增加。图24B描绘了跨过实施例7组1&2的3期和实施例8的研究中，在第4周，在调查者和受试者GAIS分数上取得至少+1得分的受试者。
表42A和表42B显示如通过IGA-FWS和PFWS评价的，在处理之后的各个时间点，具有应答处理的“无”或“轻度”皱纹得分的实施例7 和实施例8中的受试者的百分比。如所示的，关于无/轻度结果的关键测量，存在增强的应答率。
图25A和图25B描绘了用图表表示的该数据，显示如通过 IGA-FWS(图25A)和PFWS(图25B)评价的，在处理之后的各个时间点，具有应答处理的“无”或“轻度”皱纹得分的实施例7和实施例8中的受试者的百分比。如所示的，在各研究和各周期之间的两种情形中结果是一致的。
图26A和图26B描绘了对于在IGA-FWS和PFWS(图26A)上“无”或“轻度”得分的失去；以及在IGA-FWS和PFWS上返回基线的失去(图 26B)而言，相对于处理后时间的实施例7和实施例8的受试者的百分比。如图26A所示，在实施例8的处理周期1和2中(即，在第一次和第二次RT002处理之后)，对于无/轻度皱纹严重度消失的时间而言，取得24周的平均持续时间，证实了在实施例7的组1&2中无/轻度得分失去的时间。如图26B所示，在实施例8的处理周期1和2中(即，在第一次和第二次RT002处理之后)，对于返回基线的时间而言，取得28周的平均持续时间，证实了在实施例7的组1&2中返回基线的时间。
图27A和图27B描绘了在处理后随时间变化，如按照受试者的 GAIS(P-GAIS)在最大皱眉(图27A)或按照调查者的GAIS(I-GAIS)在最大皱眉(图27B)时评价的，实施例8中显示应答的受试者的百分比。应答为大于或等于1的得分。
照片：图28A和图28B描绘了示例说明该研究中讨论的结果的照片。图28A描绘了在第4周按照IGA-FWS和PFWS改善2点，具有持续的效应持续时间直到第16周；和在第24周保持1点改善的受试者的实例。图28B描绘了在第4周按照IGA-FWS和PFWS改善2点，具有持续的效应持续时间直到第16周；和在第24周保持1点改善的受试者的另一个实例。
亚组分析：图29和图30提供关于亚组应答的附加信息。
图29描绘了由亚组进行的在IGA-FWS和PFWS上无或轻度得分失去的平均时间。如所示的，取得24周的处理持续时间，与年龄和之前的毒素经历无关。
图30描绘由亚组进行的在IGA-FWS和PFWS上返回基线的平均时间。如所示的，在65岁以下的受试者中，取得28周的处理持续时间，与之前的毒素经历无关，在那些65岁或更年长的受试者中，持续时间延长至31.4周。
总体概述：在该研究中，用RT002处理2,691名患者，没有新的安全性或可耐受性问题，提供了与实施例5和实施例7中的之前研究一致的安全性特性谱。总共在实施例8中施用3,830次RT002 40U注射。特别地，观察到低比率的眼睑下垂，即0.9％(在3,830次处理中，35个事件)，在66个地点出现在1.3％的受试者中。其可比于在实施例7的组1 和2中在30个地点处理的405名受试者中2.2％的比率。
实施例8证实功效超过在采用40U剂量的RT002的实施例7的组1 和2关键性试验中看到的或与其可比较。实施例8的结果证实了在实施例7的组1和2中采用40U剂量的RT002所观察到的临床益处的长持续时间，并且表明了跨过处理周期的一致性。如由调查者和受试者评价的，在实施例8的处理周期1和处理周期2中，无或轻度皱纹严重度消失的平均时间为24周。这与在实施例7的组1和2中所观察到的临床益处的持续时间相同。在处理周期1和2中，返回基线眉间细纹严重度的平均时间为28周，并且也与在安慰剂对照的实施例7的组1和2试验中观察到的完全处理效应的消失所用的时间一致。
Claims (151)
1.一种施用肉毒杆菌毒素以在个体中获得持续时间延长的治疗或美容效应的方法，所述方法包括：
通过注射来将处理剂量的无菌可注射组合物施用到需要处理的个体的区域中，以在用所述组合物进行处理后取得治疗或美容效应；
其中所述组合物包含适合于注射的可药用稀释剂；和
肉毒杆菌毒素组分，选自肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物；和
带正电荷的载体组分，其包含具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；
其中施用于所述个体的所述肉毒杆菌毒素组分的处理剂量为每次注射处理约10U至约100U；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素组分非共价地相结合；并且
其中通过注射向所述个体施用的所述组合物的所述处理剂量取得具有至少约28周效应持续时间的持续时间延长的治疗效应。
2.在有此需要的个体中减少皱纹、细纹或沟纹的方法，所述方法包括：
通过注射到与所述个体的眉间细纹相关联的一处或多处肌肉或面部结构向所述个体施用组合物，所述组合物包含：
用于注射的可药用稀释剂；
肉毒杆菌毒素组分，选自由肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物；和
带正电荷的载体组分，其包含具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；
其中以每次注射处理约10U至约100U的处理剂量的量将所述肉毒杆菌毒素组分施用给所述个体；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素组分非共价地相结合；并且
其中所述组合物的注射在所述个体中减少皱纹、细纹或沟纹方面提供具有至少约28周效应持续时间的单次处理剂量，从而对于所述个体延长了处理间隔持续时间。
3.在无菌可注射制剂中的药物组合物，其用途为用于在施用肉毒杆菌毒素以在个体中取得持续时间延长的治疗或美容效应中使用，
所述组合物包含适合于注射的可药用稀释剂；
10U至100U的处理剂量的肉毒杆菌毒素组分，其中所述肉毒杆菌毒素组分选自肉毒杆菌毒素复合物、缩减型肉毒杆菌毒素复合物或肉毒杆菌毒素；和
带正电荷的载体组分，其包含具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素组分非共价地相结合；并且
其中所述组合物的所述处理剂量在通过注射而施用了所述制剂的个体中取得具有至少约28周效应持续时间的持续时间延长的治疗或美容效应。
4.在无菌可注射制剂中的药物组合物，其用途为在用于在有此需要的个体中减少皱纹、细纹或沟纹中使用，所述组合物包含：
约10U至约100U的剂量的肉毒杆菌毒素组分，所述肉毒杆菌毒素组分选自肉毒杆菌毒素复合物、缩减型肉毒杆菌毒素复合物或肉毒杆菌毒素；
带正电荷的载体组分，其包含具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；和
用于注射的可药用稀释剂；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素组分非共价地相结合；并且
其中所述组合物的所述剂量在所述个体中减少皱纹、细纹或沟纹方面提供具有至少约28周效应持续时间的单次处理，从而对于所述个体延长了处理间隔持续时间。
5.根据权利要求1或权利要求2的方法，或者根据权利要求3或权利要求4的用于所述用途的药物组合物，其中所述组合物取得了至少约32周的延长的效应持续时间。
6.根据权利要求5的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述组合物包含血清型A的肉毒杆菌毒素。
7.根据权利要求6的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述组合物包含具有150kDa的分子量的不含附属蛋白质的血清型A肉毒杆菌毒素。
8.根据权利要求1至7中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的聚赖氨酸主链具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。
9.根据权利要求1至7中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的聚赖氨酸主链具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。
10.根据权利要求1至7中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的聚赖氨酸主链具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中下标p和q(i)各自独立地为0至8的整数，或(ii)各自独立地为2至5的整数。
12.根据权利要求1至11中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述一个或多个带正电荷的效力基团附着至所述带正电荷的载体的所述带正电荷的聚赖氨酸主链的两个末端。
13.根据权利要求12的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)。
14.根据权利要求1至13中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述组合物在注射后不从注射位点局部地扩散。
15.根据权利要求1至14中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述肉毒杆菌毒素的处理剂量以每次注射处理约40U的量施用给所述个体。
16.根据权利要求1至15中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的载体和所述肉毒杆菌毒素组分以约20,000:1至约55,000:1的质量比存在于所述药物组合物中。
17.根据权利要求16的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的载体以约8μg至约15μg/40U所述肉毒杆菌毒素组分的量存在于所述药物组合物中。
18.根据权利要求1至17中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述赋形剂包含至少一种选自L-组氨酸、L-组氨酸盐酸盐、聚山梨酯20和海藻糖二水合物的组分。
19.根据权利要求18的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述赋形剂包含海藻糖二水合物。
20.根据权利要求1至19中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述方法或用途包括单次施用所述药物组合物。
21.根据权利要求1至20中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述治疗或美容效应为与从选自下述的病症相关联的症状的减轻：半面痉挛、成人发作的痉挛性斜颈、肛裂、睑痉挛、脑性瘫痪、颈肌张力障碍、足底筋膜炎、偏头痛、斜视、颞下颌关节病症、神经性痛、膀胱过度活动症、鼻炎、鼻窦炎、痤疮、张力障碍、张力障碍性收缩、多汗症和由胆碱能神经系统控制的腺体的分泌过多。
22.根据权利要求1至20中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述治疗或美容效应为所述个体的皱纹、细纹或沟纹的减少。
23.根据权利要求22的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述治疗或美容效应为眉间细纹的严重度降低。
24.根据权利要求22或23的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述施用包括至少一次注射到选自右皱眉肌、左皱眉肌和降眉间肌的一处或多处肌肉中。
25.根据权利要求24的方法或用于所述用途的药物组合物，其中将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述右皱眉肌的内侧方向中，将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述右皱眉肌的外侧方向中；将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述左皱眉肌的内侧方向中，将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述左皱眉肌的外侧方向中；和将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到降眉间肌中。
26.无菌可注射组合物，其包含：
选自约10U至约100U的剂量数量的肉毒杆菌毒素组分，选自肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物；和
带正电荷的载体组分，其包含具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；和
用于注射的可药用稀释剂；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素组分非共价地相结合；
其中赋形剂包括至少一种选自L-组氨酸、L-组氨酸盐酸盐、聚山梨酯20和海藻糖二水合物的组分；
其中所述带正电荷的载体以与所述肉毒杆菌毒素组分约20,000:1至约55,000:1的质量比存在于所述药物组合物中；并且
其中在用所述可注射组合物单次处理个体之后，所述组合物提供持续至少约28周的治疗或美容效应。
27.根据权利要求26的组合物，其中所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)。
28.根据权利要求26或权利要求27的组合物，其中所述组合物包含具有150kDa的分子量的不含附属蛋白质的血清型A肉毒杆菌毒素。
29.根据权利要求26至28中任一项的组合物，其中施用给所述个体的所述肉毒杆菌毒素组分的处理剂量为约40U。
30.根据权利要求26至29中任一项的组合物，其中所述赋形剂包含海藻糖二水合物。
31.用可注射的肉毒杆菌毒素处理有此需要的个体的方法，其中所述处理方法包括具有多个处理间隔的处理过程，其具有延长的效应持续时间和处理间隔的持续时间，所述处理过程包括：
通过注射将初始处理剂量的无菌可注射组合物施用到有此需要的个体的区域中，以在用所述组合物进行的初始处理之后取得治疗或美容效应；
其中所述组合物包含适用于注射的可药用稀释剂；
肉毒杆菌毒素组分，选自由肉毒杆菌毒素、肉毒杆菌毒素复合物或缩减型肉毒杆菌毒素复合物；和
带正电荷的载体组分，其包含具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；
其中以每次注射处理约10U至约100U的处理剂量将所述肉毒杆菌毒素组分施用给所述个体；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素组分非共价地相结合；
其中通过注射向所述个体施用初始处理剂量的所述组合物提供持续至少约28周的治疗效应持续时间；并且
在初始处理剂量之后和在每次后续处理剂量之间，以包括持续时间大于或等于约28周至至少约52周的处理间隔通过向所述个体注射施用后续处理剂量的组合物。
32.根据权利要求31的方法，其中所述组合物包含具有150kDa的分子量的不含附属蛋白质的血清型肉毒杆菌毒素。
33.根据权利要求31或32的方法，其中所述带正电荷的聚赖氨酸主链具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。
34.根据权利要求31或32的方法，其中所述带正电荷的聚赖氨酸主链具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。
35.根据权利要求31或32的方法，其中所述带正电荷的聚赖氨酸主链具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。
36.根据权利要求31至35中任一项的方法，其中下标p和q(i)各自独立地为0至8的整数，或(ii)各自独立地为2至5的整数。
37.根据权利要求31至36中任一项的方法，其中所述一个或多个带正电荷的效力基团附着至所述带正电荷的载体的所述带正电荷的聚赖氨酸主链的两个末端。
38.根据权利要求31或32的方法，其中所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)。
39.根据权利要求31至38中任一项的方法，其中所述组合物在注射后不从注射位点局部地扩散。
40.根据权利要求31至39中任一项的方法，其中所述肉毒杆菌毒素以每次注射处理约40U的量施用给所述个体。
41.根据权利要求31至40中任一项的方法，其中所述带正电荷的载体和所述肉毒杆菌毒素组分以约20,000:1至约55,000:1的质量比存在于所述药物组合物中。
42.根据权利要求41的方法，其中所述带正电荷的载体以约8μg至约15μg/40U的所述肉毒杆菌毒素组分的量存在于所述药物组合物中。
43.根据权利要求31至42中任一项的方法，其中所述赋形剂包含至少一种选自L-组氨酸、L-组氨酸盐酸盐、聚山梨酯20和海藻糖二水合物的组分。
44.根据权利要求43的方法，其中所述赋形剂包括海藻糖二水合物。
45.根据权利要求31至44中任一项的方法，其中所述处理间隔的持续时间包括大于32周。
46.根据权利要求31至45中任一项的方法，其中所述处理间隔的持续时间包括大于36周。
47.根据权利要求31至46中任一项的方法，其中所述处理间隔的持续时间包括至少32周至40周。
48.根据权利要求31至47中任一项的方法，其中所述治疗或美容效应为所述个体的皱纹、细纹或沟纹的减少。
49.根据权利要求48的方法，其中所述治疗或美容效应为眉间细纹的严重度降低。
50.根据权利要求48或49的方法，其中所述施用包括至少一次注射到选自右皱眉肌、左皱眉肌和降眉间肌的一处或多处肌肉中。
51.根据权利要求50的方法，其中将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述右皱眉肌的内侧方向中，将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述右皱眉肌的外侧方向中；将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述左皱眉肌的内侧方向中，将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述左皱眉肌的外侧方向中；和将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到降眉间肌中。
52.根据权利要求31至47中任一项的方法，其中所述治疗或美容效应为与从选自下述的病症相关联的症状的减轻：半面痉挛、成人发作的痉挛性斜颈、肛裂、睑痉挛、脑性瘫痪、颈肌张力障碍、足底筋膜炎、偏头痛、斜视、颞下颌关节病症、神经性痛、膀胱过度活动症、鼻炎、鼻窦炎、痤疮、张力障碍、张力障碍性收缩、多汗症和由胆碱能神经系统控制的腺体的分泌过多。
53.根据权利要求1至52中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在各自施用所述药物组合物的超过55％的个体中，所述治疗或美容效应持续至少约4周。
54.根据权利要求53的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在施用所述药物组合物的超过60％的个体中，所述治疗或美容效应持续至少约4周。
55.根据权利要求54的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在施用所述药物组合物的超过70％的个体中，所述治疗或美容效应持续至少约4周。
56.根据权利要求1至52中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在各自施用所述药物组合物的超过35％的个体中，所述治疗或美容效应持续至少约16周。
57.根据权利要求56的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在施用所述药物组合物的超过50％的个体中，所述治疗或美容效应持续至少约16周。
58.根据权利要求57的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在施用所述药物组合物的超过70％的个体中，所述治疗或美容效应持续至少约16周。
59.根据权利要求1至52中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在各自施用所述药物组合物的超过15％的个体中，所述治疗或美容效应持续至少约24周。
60.根据权利要求59的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在施用所述药物组合物的超过25％的个体中，所述治疗或美容效应持续至少约24周。
61.在有此需要的个体中减少皱纹、细纹或沟纹的方法，所述方法包括：
通过注射到与所述个体的皱纹、细纹或沟纹相关联的一处或多处肌肉或面部结构向所述个体施用组合物，所述组合物包含：
用于注射的可药用稀释剂；
肉毒杆菌毒素组分，其为具有150kDa的分子量的不含附属非毒素蛋白质的血清型A肉毒杆菌毒素；
带正电荷的载体，其具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)；
其中以每次注射处理约40U的处理剂量的量将所述肉毒杆菌毒素组分施用给所述个体；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌组分非共价地相结合；和
其中所述组合物的注射在所述个体中减少皱纹、细纹或沟纹方面提供具有至少约26周效应持续时间的单次处理剂量，从而对于所述个体延长了处理间隔持续时间。
62.在无菌可注射制剂中的药物组合物，其用于在有此需要的个体中减少皱纹、细纹或沟纹，所述组合物包含：
约40U的剂量的肉毒杆菌毒素组分，其为具有150kDa的分子量的不含附属蛋白质的血清型A肉毒杆菌毒素；
带正电荷的载体，其具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)；和
用于注射的可药用稀释剂；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素组分非共价地相结合；并且
其中所述组合物的所述剂量在所述个体中减少皱纹、细纹或沟纹方面提供具有至少约26周效应持续时间的单次处理，从而对于所述个体延长了处理间隔持续时间。
63.根据权利要求61的方法，或者根据权利要求2的用于所述用途的药物组合物，其中所述组合物取得了至少约27周的效应持续时间延长。
64.根据权利要求61的方法，或者根据权利要求2的用于所述用途的药物组合物，其中所述组合物取得了至少约28周的效应持续时间延长。
65.根据权利要求61的方法，或者根据权利要求4的用于所述用途的药物组合物，其中所述组合物取得了至少约30周的效应持续时间延长。
66.根据权利要求61至65中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的载体和所述肉毒杆菌毒素组分以约20,000:1至约55,000:1的质量比存在于所述药物组合物中。
67.根据权利要求66的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的载体以每40U的所述肉毒杆菌毒素组分约8μg至约15μg的量存在于所述药物组合物中。
68.根据权利要求61至67中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述赋形剂包含至少一种选自L-组氨酸、L-组氨酸盐酸盐、聚山梨酯20和海藻糖二水合物的组分。
69.根据权利要求68的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述赋形剂包含海藻糖二水合物。
70.根据权利要求61至69中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述皱纹、细纹或沟纹的减少包括眉间细纹的严重度降低。
71.根据权利要求61至70中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述施用包括至少一次注射到选自右皱眉肌、左皱眉肌和降眉间肌的一处或多处肌肉中。
72.根据权利要求71的方法或用于所述用途的药物组合物，其中将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述右皱眉肌的内侧方向中，将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述右皱眉肌的外侧方向中；将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述左皱眉肌的内侧方向中，将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述左皱眉肌的外侧方向中；和将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到降眉间肌中。
73.根据权利要求61至72中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在各自施用所述药物组合物的超过55％的个体中所述皱纹、细纹或沟纹的减少持续至少约4周。
74.根据权利要求73的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在各自施用所述药物组合物的超过60％的个体中所述皱纹、细纹或沟纹的减少持续至少约4周。
75.根据权利要求74的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在各自施用所述药物组合物的超过70％的个体中所述皱纹、细纹或沟纹的减少持续至少约4周。
76.根据权利要求61至72中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在各自施用所述药物组合物的超过35％的个体中所述皱纹、细纹或沟纹的减少持续至少约16周。
77.根据权利要求76的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在各自施用所述药物组合物的超过50％的个体中所述皱纹、细纹或沟纹的减少持续至少约16周。
78.根据权利要求77的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在各自施用所述药物组合物的超过70％的个体中所述皱纹、细纹或沟纹的减少持续至少约16周。
79.根据权利要求61至72中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在各自施用所述药物组合物的超过15％的个体中所述皱纹、细纹或沟纹的减少持续至少约24周。
80.根据权利要求79的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在各自施用所述药物组合物的超过25％的个体中所述皱纹、细纹或沟纹的减少持续至少约24周。
81.用可注射的肉毒杆菌毒素处理有此需要个体中眉间细纹的方法，其中所述方法包括具有多个处理间隔的处理过程，其具有延长的效应持续时间和处理间隔的持续时间，所述处理过程包括：
通过注射将初始处理剂量的无菌可注射组合物施用到所述个体的眉间复合区中，以在用所述组合物进行的初始处理之后取得眉间细纹的严重度降低；
其中所述组合物包含适用于注射的可药用稀释剂；
肉毒杆菌毒素组分，其为具有150kDa的分子量的不含附属非毒素蛋白质的血清型A肉毒杆菌毒素；和
带正电荷的载体，其具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)；
其中以每次注射处理约40U的处理剂量将所述肉毒杆菌毒素组分施用给所述个体；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素组分非共价地相结合；
其中通过注射向所述个体施用初始处理剂量的所述组合物提供持续至少约26周的效应持续时间；并且
在初始处理剂量之后和在每次后续处理剂量之间，以包括持续时间大于或等于约26周至至少约40周的处理间隔通过向所述个体注射施用后续处理剂量的组合物。
82.根据权利要求81的方法，其中所述组合物取得至少约27周的延长的效应持续时间。
83.根据权利要求81的方法，其中所述组合物取得至少约28周的延长的效应持续时间。
84.根据权利要求81的方法，其中所述组合物取得至少约29周的延长的效应持续时间。
85.根据权利要求81的方法，其中所述处理间隔的持续时间包括至少30周。
86.根据权利要求81至85中任一项的方法，其中所述带正电荷的载体和所述肉毒杆菌毒素组分以约20,000:1至约55,000:1的质量比存在于所述药物组合物中。
87.根据权利要求86的方法，其中所述带正电荷的载体以每40U的所述肉毒杆菌毒素组分约8μg至约15μg的量存在于所述药物组合物中。
88.根据权利要求81至87中任一项的方法，其中所述赋形剂包括至少一种选自L-组氨酸、L-组氨酸盐酸盐、聚山梨酯20和海藻糖二水合物的组分。
89.根据权利要求88的方法，其中所述赋形剂包括海藻糖二水合物。
90.根据权利要求81至89中任一项的方法，其中所述减少包括如通过调查者总体评估-面部皱纹严重度(IGA-FWS)和/或患者面部皱纹严重度(PFWS.)评价的眉间细纹的严重度降低。
91.根据权利要求81至90中任一项的方法，其中所述施用包括至少一次注射到选自右皱眉肌、左皱眉肌和降眉间肌的一处或多处肌肉中。
92.根据权利要求91的方法，其中将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述右皱眉肌的内侧方向中，将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述右皱眉肌的外侧方向中；将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述左皱眉肌的内侧方向中，将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述左皱眉肌的外侧方向中；和将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到降眉间肌中。
93.根据权利要求81至92中任一项的方法，其中在各自施用所述药物组合物的超过55％的个体中，眉间细纹的减少持续至少约4周。
94.根据权利要求93的方法，其中在各自施用所述药物组合物的超过60％的个体中，眉间细纹的减少持续至少约4周。
95.根据权利要求94的方法，其中在各自施用所述药物组合物的超过70％的个体中，眉间细纹的减少持续至少约4周。
96.根据权利要求81至92中任一项的方法，其中在各自施用所述药物组合物的超过35％的个体中，眉间细纹的减少持续至少约16周。
97.根据权利要求96的方法，其中在各自施用所述药物组合物的超过50％的个体中，眉间细纹的减少持续至少约16周。
98.根据权利要求97的方法，其中在各自施用所述药物组合物的超过70％的个体中，眉间细纹的减少持续至少约16周。
99.根据权利要求81至92中任一项的方法，其中在各自施用所述药物组合物的超过15％的个体中，眉间细纹的减少持续至少约24周。
100.根据权利要求99的方法，其中在各自施用所述药物组合物的超过25％的个体中，眉间细纹的减少持续至少约24周。
101.一种用于增加用于减少有此需要的个体中皱纹、细纹或沟纹的肉毒杆菌毒素的效应持续时间的方法，所述方法包括施用多次连续的肉毒杆菌毒素处理，
其中通过注射到皱纹、细纹或沟纹或在皱纹、细纹或沟纹附近注射向所述个体施用肉毒杆菌毒素组合物的第一次处理，所述组合物包含：
用于注射的可药用稀释剂；
约10U至约100U的剂量的肉毒杆菌毒素组分，所述肉毒杆菌毒素组分包含具有150kDa的分子量的不含附属蛋白质的血清型A肉毒杆菌毒素，和
带正电荷的载体组分，其包含具有共价地附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)or(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌组分非共价地相结合；和
其中向所述个体施用至少一次重复所述施用步骤的连续处理；
其中所述第一次处理减少了所述皱纹、细纹或沟纹至少约20周，并且其中所述一次或多次连续处理减少了所述皱纹、细纹或沟纹的持续时间比在所述第一次处理之后取得的更长。
102.在无菌可注射的制剂中的药物组合物，其用途为用于在增加肉毒杆菌毒素在有此需要的个体中用于减少皱纹、细纹或沟纹的效应持续时间中使用，用于在多次连续的处理中重复施用，所述组合物包含：
用于注射的可药用稀释剂；
约10U至约100U的剂量的肉毒杆菌毒素组分，所述肉毒杆菌毒素组分包含具有150kDa的分子量的不含附属蛋白质的血清型A肉毒杆菌毒素，和
带正电荷的载体组分，其包含具有共价地附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)or(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素组分非共价地相结合；
其中向所述个体施用至少一次连续处理；并且
其中所述第一次处理减少了所述皱纹、细纹或沟纹至少约20周，并且其中所述一次或多次连续处理减少了所述皱纹、细纹或沟纹的持续时间比在所述第一次处理之后取得的更长。
103.一种用于增加在有此需要的个体中取得减少皱纹、细纹或沟纹的肉毒杆菌毒素应答可能性的方法，所述方法包括施用多次连续的肉毒杆菌毒素处理，
其中通过注射到皱纹、细纹或沟纹或在皱纹、细纹或沟纹附近注射向个体施用肉毒杆菌毒素组合物的第一次处理，所述组合物包含：
适用于注射的可药用稀释剂；
约10U至约100U的剂量的肉毒杆菌毒素组分；所述肉毒杆菌毒素组分包含具有150kDa的分子量的不含附属蛋白质的血清型A肉毒杆菌毒素；和
带正电荷的载体组分，其包含具有共价地附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素组分非共价地相结合；并且
其中向所述个体施用至少一次重复所述施用步骤的连续处理；
其中所述一次或多次连续处理具有比所述第一次处理更大的减少所述个体中皱纹、细纹或沟纹的可能性。
104.在无菌可注射制剂中的药物组合物，其用途为用于增加在有此需要的个体中减少皱纹、细纹或沟纹的可能性中使用，用于在多次连续处理的重复施用，所述组合物包含：
适用于注射的可药用稀释剂；
约10U至约100U的剂量的肉毒杆菌毒素组分；所述肉毒杆菌毒素组分包含具有150kDa的分子量的不含附属蛋白质的血清型A肉毒杆菌毒素；和
带正电荷的载体组分，其包含具有共价地附着的一个或多个带正电荷的效力基团的带正电荷的聚赖氨酸主链，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:1)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:2)或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQ ID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数；
其中所述带正电荷的载体与所述肉毒杆菌毒素组分非共价地相结合；
其中向所述个体施用至少一次连续处理；并且
其中所述一次或多次连续处理具有比所述第一次处理更大的减少所述个体中皱纹、细纹或沟纹的可能性。
105.根据权利要求101或103的方法，或者根据权利要求102或104的用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的聚赖氨酸主链具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q(SEQID NO:1)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。
106.根据权利要求101或103的方法，或者根据权利要求102或104的用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的聚赖氨酸主链具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q(SEQID NO:2)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。
107.根据权利要求101或103的方法，或者根据权利要求102或104的用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的聚赖氨酸主链具有与之共价地相附着的一个或多个带正电荷的效力基团，所述带正电荷的效力基团具有氨基酸序列(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q(SEQID NO:3)，其中下标p和q各自独立地为0至20的整数。
108.根据权利要求101至107任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中下标p和q(i)各自独立地为0至8的整数，或(ii)各自独立地为2至5的整数。
109.根据权利要求101至108中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述一个或多个带正电荷的效力基团附着至所述带正电荷的载体的所述带正电荷的聚赖氨酸主链的两个末端。
110.根据权利要求109的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的载体具有氨基酸序列RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)。
111.根据权利要求110的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在所述第一次处理之后，所述组合物取得了至少约24周的延长的作用持续时间。
112.根据权利要求110的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在所述第一次处理之后，所述组合物取得了至少约25周的延长的作用持续时间。
113.根据权利要求110的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在所述第一次处理之后，所述组合物取得了至少约26周的延长的作用持续时间。
114.根据权利要求110的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在所述第一次处理之后，所述组合物取得了至少约28周的延长的作用持续时间。
115.根据权利要求110的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在所述第一次处理之后，所述组合物取得了至少约30周的延长的作用持续时间。
116.根据权利要求110的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在所述第一次处理之后，所述组合物取得了至少约32周的延长的作用持续时间。
117.根据权利要求110的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在所述第一次处理之后，所述组合物取得了至少约34周的延长的作用持续时间。
118.根据权利要求110的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在所述第一次处理之后，所述组合物取得了至少约35周的延长的作用持续时间。
119.根据权利要求110的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在所述第一次处理之后，所述组合物取得了至少约36周的延长的作用持续时间。
120.根据权利要求110-119中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在之前处理之后约12周至约36周，施用至少一次所述连续处理。
121.根据权利要求110-119中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在之前处理之后约16周至约32周，施用至少一次所述连续处理。
122.根据权利要求110-119中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在之前处理之后约20周至约36周，施用至少一次所述连续处理。
123.根据权利要求110-119中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在之前处理之后约22周至约34周，施用至少一次所述连续处理。
124.根据权利要求110-119中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在之前处理之后约24周至约32周，施用至少一次所述连续处理。
125.根据权利要求110-119中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在之前处理之后约26周至约30周，施用至少一次所述连续处理。
126.根据权利要求120-125中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述连续处理时第二次处理。
127.根据权利要求110-126中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中向所述个体施用的肉毒杆菌毒素的处理剂量为每次注射处理约20U至约60U。
128.根据权利要求127的方法或药物组合物，其中向所述给体施用的肉毒杆菌毒素的处理剂量为每次注射处理约40U。
129.根据权利要求101-128中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的载体和所述肉毒杆菌毒素组分以约20,000:61至约55,000:61的质量比存在于所述药物组合物中。
130.根据权利要求129的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的载体以约8μg至约15μg/40U的所述肉毒杆菌毒素组分的量存在于所述药物组合物中。
131.根据权利要求130的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的载体以11.7μg/40U的量存在于所述药物组合物中。
132.根据权利要求101-131中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述赋形剂包含至少一种选自L-组氨酸、L-组氨酸盐酸盐、聚山梨酯20和海藻糖二水合物的组分。
133.根据权利要求132的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述赋形剂包含海藻糖二水合物。
134.根据权利要求101-133中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述皱纹、细纹或沟纹为眉间细纹。
135.根据权利要求134的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述施用包括至少一次注射到选自右皱眉肌、左皱眉肌和降眉间肌的一处或多处肌肉中。
136.根据权利要求135或根据权利要求100-109中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中将约16U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述右皱眉肌中，将约16U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述左皱眉肌中，和将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到降眉间肌中。
137.根据权利要求136的方法或用于所述用途的药物组合物，其中将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述右皱眉肌的内侧方向中，将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述右皱眉肌的外侧方向中；将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述左皱眉肌的内侧方向中，将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到所述左皱眉肌的外侧方向中；和将约8U的所述肉毒杆菌毒素组分注射到降眉间肌中。
138.根据权利要求101-137中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在第一次处理之后施用连续处理后减少了施用肉毒杆菌毒素的副作用。
139.根据权利要求138的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述副作用的减少为上睑下垂减少。
140.根据权利要求101-139中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在所述后续肉毒杆菌毒素处理之间的间隔长度大于第一次处理和第二次处理之间的间隔。
141.根据权利要求140的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在后续肉毒杆菌毒素处理之间的间隔大于约20周至约36周。
142.根据权利要求140的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在后续肉毒杆菌毒素处理之间的间隔大于约22周至约34周。
143.根据权利要求140的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在后续肉毒杆菌毒素处理之间的间隔大于约24周至约32周。
144.根据权利要求140的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在后续肉毒杆菌毒素处理之间的间隔大于约26周至约30周。
145.根据权利要求101-144中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在施用第一次处理剂量之后的至少80％的个体中，和/或在施用第二次或后续处理剂量的至少85％的个体中，所述皱纹、细纹或沟纹的减少持续至少约4周。
146.根据权利要求101-144中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在施用第一次处理剂量之后的至少85％的个体中，和/或在施用第二次或后续处理剂量的至少90％的个体中，所述皱纹、细纹或沟纹的减少持续至少约4周。
147.根据权利要求101-144中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中在施用第一次处理剂量之后的至少90％的个体中，和/或在施用第二次或后续处理剂量的至少95％的个体中，所述皱纹、细纹或沟纹的减少持续至少约4周。
148.根据权利要求101-147中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述皱纹、细纹或沟纹的减少相当于关于IGA-FWS的得分0或1。
149.根据权利要求101-147中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述皱纹、细纹或沟纹的减少相当于关于PFWS的得分0或1。
150.根据权利要求17、42、67或87中任一项的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述带正电荷的载体以11.7μg/40U的量存在于所述药物组合物中。
151.根据前述任一项中的方法或用于所述用途的药物组合物，其中所述受试者为至少65岁。
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