JP6955491B2 - 治療効果又は美容効果の長い持続時間を有する、注射用ボツリヌス毒素製剤及びこれらの使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、様々な治療目的、審美的目的及び／又は美容目的のために対象に投与することができる、ボツリヌス毒素を含む新規の注射用組成物に関する。注射用組成物及び本組成物が使用されている方法は、高い応答者（responder）の比率、効果の長い持続時間、例えば、２０〜２４週以上にわたる間の効果の持続時間がもたらされる、有利な治療を提供する。

皮膚は、外部環境の脅威から体の臓器を保護し、体温を維持するためのサーモスタットとして作用する。皮膚は、いくつかの異なる層からなり、それぞれは特殊機能を有する。主要な層は、表皮、真皮、及び皮下組織を含む。表皮は、真皮を覆う上皮細胞の重層化している層であり、この層は、結合組織からなる。表皮及び真皮はどちらも、脂肪組織の内部層である皮下組織によってさらに支持されている。

皮膚の最上層である表皮は、厚さがわずか０．１〜１．５ミリメートルである。（Inlander, Skin, New York, N.Y.: People's Medical Society, 1-7 (1998)）。表皮は、角質層と生存表皮にさらに分類され、これは、顆粒メルフィギアン（granular melphigian）と基底細胞からなる。角質層は吸湿性であり、その屈曲性と柔軟性を維持するために少なくとも１０重量％の水分を必要とする。吸湿性はケラチンの水保持能力にある程度起因する。角質層がその柔軟性と屈曲性を失うと、粗くかつ脆くなり、乾燥皮膚をもたらす。

表皮の真下に存在する真皮は、厚さが１．５〜４ミリメートルである。これは、皮膚の３つの層のうちで最も厚い。汗腺及び脂腺（これは、毛穴又は面皰と呼ばれる、皮膚の開口部を通じて物質を分泌する）、毛嚢、神経終末、並びに血管及びリンパ管を含めて、皮膚構造のほとんどは、真皮内に見出される（Inlander, Skin, New York, N.Y.: People's Medical Society, 1-7 (1998)）。しかし、真皮の主成分は、コラーゲンとエラスチンである。

皮下組織は、皮膚の最深部層である。これは、体温保存のための断熱材及び臓器保護のための衝撃吸収剤の両方として作用する（Inlander, Skin, New York, N.Y.: People's Medical Society, 1-7 (1998)）。さらに、皮下組織はまた、エネルギー備蓄のための脂肪も貯蔵する。皮膚のｐＨは通常、５〜６である。この酸性度は、皮脂腺の分泌物に由来する両性アミノ酸、乳酸、及び脂肪酸の存在によるものである。用語「酸外套」とは、皮膚のほとんどの領域上に水溶性物質が存在することを指す。皮膚の緩衝能は、皮膚の角質層中に貯蔵されたこれらの分泌物にある程度起因する。

加齢の隠しようもない徴候の１つであるしわは、皮膚に対する環境的損傷から蓄積する生化学的、組織学的、及び生理学的変化によって生じ得る。（Benedetto, "International Journal of Dermatology," 38:641-655 (1999)）。さらに、顔のしわの特徴的なくぼみ、溝、及びひだを引き起こすおそれのある他の二次的要因が存在する（Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nd^ed., St. Louis, Mo.: Mosby Year Book: 5-15 (1990)）。これらの二次的要因には、重力の不断の引力、皮膚に対する頻繁かつ不断の位置的圧力（例えば、就寝中）、及び顔面筋の収縮によって生じる顔面運動の繰り返しが含まれる（Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nd^ed., St. Louis, Mo.: Mosby Year Book: 5-15 (1990)）。

加齢の徴候の一部を潜在的に和らげるために、様々な技法が利用されている。これらの技法は、αヒドロキシ酸とレチノールを含有する顔用保湿剤から、外科的処置及び神経毒の注射にまで及ぶ。例えば、１９８６年に、眼形成（ocuplastic）外科医と皮膚科医からなる夫婦チームであるJean及びAlastair Carruthersは、眉間領域における運動関連しわを治療するために、Ａ型の形態のボツリヌス毒素を使用する方法を開発した（Schantz and Scott, In Lewis G. E. (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981)）。Carruthers夫妻がしわの治療でＡ型の形態のボツリヌス毒素を使用したことにより、１９９２年にこの手法に関する重大な出版がなされた（Schantz and Scott, In Lewis G. E. (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981)）。１９９４年までに、同じチームが、顔面上の他の運動関連しわでの経験を報告した（Scott, Ophthalmol, 87:1044-1049 (1980)）。これにより、続いて、Ａ型の形態のボツリヌス毒素を使用する美容治療の時代が誕生した。

Ａ型の形態のボツリヌス毒素は、人類が知る最も致死性の天然生物剤であることが報告されている。Ｃ．ボツリヌス種（C. botulinum）の胞子は、土壌中に見出され、不適切に滅菌され密封された食品容器中で増殖することができる。致命的となり得るボツリヌス中毒は、細菌の摂取によって生じ得る。ボツリヌス毒素は、神経筋接合部にわたるアセチルコリンの放出を阻害することにより、シナプス伝達を妨げることによって筋肉の麻痺を生じるように作用し、その上他の様式でも作用すると考えられている。その作用により、筋肉の痙攣又は収縮を通常引き起こすシグナルが本質的に遮断され、麻痺に陥る。過去１０年の間に、ボツリヌス毒素の筋肉麻痺活性を活かすことで、様々な治療効果が実現された。ボツリヌス毒素の制御投与を使用して筋肉麻痺をもたらし、それによって、様々な医学的状態を、例えば、機能亢進性骨格筋により特徴付けられる神経筋障害を治療してきた。ボツリヌス毒素で治療されてきた状態として、片側顔面痙攣、成人発症型痙性斜頚、裂肛、眼瞼痙攣、脳性麻痺、頚部ジストニア、片頭痛、斜視、側頭下顎関節障害、並びに様々な種類の筋痙攣及び痙攣が挙げられる。さらに最近では、ボツリヌス毒素の筋肉麻痺効果は、しわ、渋面のしわ線、及び顔面筋の痙攣又は収縮の他の結果の治療などの、治療的及び美容的顔面用途に適用されている。

Ａ型の形態のボツリヌス毒素に加えて、グラム陽性細菌のクロストリジウム・ボツリナム種（Clostridium botulinum）によってまた産生される、他の７種の血清学的に異なる形態のボツリヌス毒素が存在する。これらの８種の血清学的に異なる型のボツリヌス毒素のうち、麻痺を引き起こすことができる７種は、ボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧと命名された。これらのそれぞれは、型特異的抗体を用いた中和によって識別される。ボツリヌス毒素タンパク質のそれぞれの分子量は、約１５０ｋＤである。ボツリヌス毒素の分子サイズ及び分子構造のために、ボツリヌス毒素は、角質層及び下にある皮膚構造の複数の層を横断することができない。ボツリヌス毒素の様々な血清型は、様々な動物種において、その効果、並びにこれらが誘起する麻痺の重症度及び持続時間が異なる。例えば、ラットにおいて、ボツリヌス毒素Ａ型は、麻痺の割合によって測定して、ボツリヌス毒素Ｂ型より５００倍強力であると判定された。さらに、ボツリヌス毒素Ｂ型は、Ａ型に対する霊長類のＬＤ_５０の約１２倍である、４８０Ｕ／ｋｇの用量で、霊長類において非毒性であると判定された。

クロストリジウム・ボツリナム種細菌によって放出される場合、ボツリヌス毒素は、付随する非毒素タンパク質とともに、約１５０ｋＤのボツリヌス毒素タンパク質分子を含有する毒素複合体の成分である。これらの内因性非毒素タンパク質は、血球凝集素タンパク質、並びに非血球凝集素タンパク質のファミリーを含むと考えられている。非毒素タンパク質は、毒素複合体中のボツリヌス毒素分子を安定化させ、毒素複合体が摂取されるとき、消化性酸による変性からボツリヌス毒素分子を保護すると報告されている。したがって、毒素複合体の非毒素タンパク質はボツリヌス毒素の活性を保護し、それによって、毒素複合体が消化管を介して投与される場合、全身性の浸透を増強する。さらに、非毒素タンパク質の一部は、血液中でボツリヌス毒素分子を特に安定化させると考えられている。

毒素複合体中の非毒素タンパク質の存在により、毒素複合体に、先に述べたように約１５０ｋＤであるボツリヌス毒素分子だけの分子量よりも大きい分子量が、典型的にはもたらされる。例えば、クロストリジウム・ボツリナム種細菌は、約９００ｋＤ、５００ｋＤ、又は３００ｋＤの分子量を有するボツリヌスＡ型毒素複合体を産生することができる。ボツリヌス毒素Ｂ及びＣ型は、約７００ｋＤ又は約５００ｋＤの分子量を有する複合体として産生される。ボツリヌス毒素Ｄ型は、約３００ｋＤ又は５００ｋＤの分子量を有する複合体として産生される。ボツリヌス毒素Ｅ及びＦ型は、約３００ｋＤの分子量を有する複合体としてのみ産生される。

ボツリヌス毒素にさらなる安定性を提供するために、毒素複合体は、製造中に複合体をアルブミンと組み合わせることによって従来安定化される。例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標）（Allergan, Inc.社製、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）は、アクセサリータンパク質、０．５ミリグラムのヒトアルブミンと０．９ミリグラムの塩化ナトリウムとともに１００ＵのＡ型ボツリヌス毒素を含有するボツリヌス毒素含有製剤である。アルブミンは、製造、輸送、貯蔵、及び投与に関連するものを含めて、異種環境中で、毒素複合体に結合し、これを安定化させるように機能する。

通常は、ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素複合体とアルブミンを含有する組成物を慎重に制御して注射することによって患者に投与される。しかし、この手法に関連するいくつかの問題が存在する。所望の治療効果又は美容効果を実現するためには、注射が苦痛であるだけでなく、注射部位の周囲に、典型的には大きな、毒素の皮下原泉（well）が局所的に生成される。ボツリヌス毒素は、これらの皮下原泉から移動して、身体の周囲領域内に望まれない麻痺を引き起こすおそれがある。この問題は、治療されるべき領域が大きく、その領域を治療するのに、毒素の多くの注射が必要とされる場合、悪化する。さらに、注射される毒素複合体は、非毒素タンパク質とアルブミンを含有し、これらは、ボツリヌス毒素を安定化し、毒素コンプレックスの分子量を増加させるので、毒素複合体は、体内で長い半減期を有し、患者中に望ましくない抗原反応を引き起こすおそれがある。例えば、一部の患者は、現在の市販の製剤中で安定剤として使用されるアルブミンに対してアレルギーを経時的に発症する。また、毒素複合体は、患者の免疫系を誘発して中和抗体を形成する場合があり、その結果、同じ効果を実現するのに、その後の投与においてより大量の毒素が必要とされる。これが起こる場合、その後の注射は、こうした注射により、患者の血流中に大量の毒素が放出されないように慎重に行わなければならず、大量の毒素が放出されると、特に非毒素タンパク質とアルブミンは血液中でボツリヌス毒素を安定化させるので、致命的な全身性の毒作用に至るおそれがある。

Inlander, Skin, New York, N.Y.: People's Medical Society, 1-7 (1998) Benedetto, International Journal of Dermatology, 38:641-655 (1999) Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nded., St. Louis, Mo.: Mosby Year Book: 5-15 (1990) Schantz and Scott, In Lewis G. E. (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981) Scott, Ophthalmol, 87:1044-1049 (1980)

現在のボツリヌス毒素製剤に関連する欠点を考慮すると、効果的で安定であるが、抗原性が低下した、及び注射後の局所的拡散傾向がより低い注射用ボツリヌス毒素製剤を有することが非常に望ましい。様々な治療目的、審美的目的及び／又は美容目的のためにそのようなボツリヌス毒素製剤を使用することも望ましい。

本発明の態様の一つでは、本発明は、正に帯電した担体分子と非共有結合で会合したボツリヌス毒素を含む注射用組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、従来の市販のボツリヌス毒素製剤、例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標）又はＭＹＯＢＬＯＣ（登録商標）に勝る１又は２以上の利点を有する。例えば、ある特定の実施形態では、組成物は、抗原性の低下、注射後に周囲組織中への拡散を起こす傾向の低下、従来のボツリヌス毒素製剤と比べた、臨床的有効性の持続時間の増大又は改善された効力、臨床的有効性のより速やかな発現、及び／又は安定性の改善を含めて、従来の注射用ボツリヌス製剤に勝る１又は２以上の利点を示すことができる。

本発明の別の態様は、ある特定の非天然分子（すなわち、クロストリジウム・ボツリナム種細菌から得られるボツリヌス毒素複合体中に見出されない分子）を、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、特に、低ボツリヌス毒素複合体（reduced botulinum toxin complex）（本明細書に定義の通り）に付加して、組織を通しての毒素の拡散を改善することができるという認識である。非天然分子は、毒素と非共有結合で会合し、注射後に毒素が標的構造に到達する能力を改善する、浸透促進剤として作用する。さらに、非天然分子は、注射前後の毒素の安定性を増大させることができる。例として、浸透促進剤は、陽イオンペプチドなどの正に帯電した担体とすることができ、これは、固有のボツリヌス毒素様活性をまったく有さず、しかも、本明細書に記載のように１又は２以上のタンパク質形質導入ドメインを含有する。

本発明の別の態様は、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体（又は１５０ｋＤの神経毒自体のみ、若しくは天然複合タンパク質の、全部ではないが、一部を有する神経毒を含む、低タンパク質ボツリヌス毒素複合体）及び正に帯電した担体を含む組成物を提供することである。

本発明の態様の別のものでは、本発明はさらに、そのような治療を必要とする対象又は患者に、本発明の組成物の有効量、好ましくは治療有効量を注射することによって、生物学的効果を生じる方法に関する。生物学的効果としては、例えば、筋肉麻痺、過分泌若しくは発汗の低減、神経性疼痛若しくは片頭痛の治療、鼻炎若しくは副鼻腔炎の管理、機能亢進性膀胱の治療、筋痙攣の低減、ざ瘡の予防若しくは低減、免疫応答の低減若しくは増強、特に顔面の、しわ、小じわ、若しくは渋面のしわ線としても知られている眉間のしわ線の低減、又は様々な他の障害の予防若しくは治療を挙げることができる。

別の態様では、本発明は、治療を必要とする対象又は患者に注射による投与に続いて、長期継続的な、持続的有効性、例えば、長い持続時間の奏効率が得られる、本発明の組成物の有効用量及び有効量を提供する。このような用量及び量は、当該用量及び量が投与されている対象において所望の治療効果又は美容的効果を生じるか又はもたらす治療的又は美容的有効用量及び有効量であることが好ましい。一実施形態では、顔面のしわ及びしわ線、特に眉間のしわ線の低減効果は、この効果は必要とする対象又は患者への単回治療として注射によって投与された本発明の一組成物の一用量によりもたらされたが、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃの注射などの従来の治療と比較して、数週間〜数か月続いた。特定の実施形態では、本明細書の実施例に記載の通り、２０Ｕ〜６０Ｕの治療有効量で、本明細書に記載の、ボツリヌス毒素Ａなどのボツリヌス毒素と正に帯電した担体とを含む、本発明の組成物で対象又は患者を単回治療することによって、従来のＢＯＴＯＸ（登録商標）注射と比較して、少なくとも２０週の間、少なくとも２４週の間、若しくは約６ヶ月から１０ヶ月の間、又はさらに長い間、しわ及び顔面のしわ線の低減に関して奏功率が得られた。さらに、本発明の組成物によって、注射後に注射部位からの拡散又は広がりが低減するという属性が提供され、これによって、所望の場所での毒素及びその効果が局所化され、治療のための注射部位から離れた部位又は場所での毒素の非特異的又は望ましくない効果が低下する。

本発明の組成物、例えば、実施例５のＲＴ００２により並びに記載の治療方法及び使用により、提供される効果の持続時間によって、当技術分野と比べて、大きな利点が得られる。例として、ボツリヌス毒素を含有する組成物による美容治療などの治療を受けている対象は、治療後の効果の持続時間は彼らにとって重要性が高いことを考慮する。有効量の本発明の生成物、例えば、ＲＴ００２での単回治療によっても実現される、効果のこのような長い、持続性持続時間によって、患者に対する治療コース１回当たりの注射の数を減らすことができ、このようなことは対象にとって極めて重要なことである。本明細書に記載の本発明の組成物及び方法によって提供されるような、明瞭な有効性及び安全性を有する生成物での単回治療による長時間の持続時間効果によって、治療のコースを受けている患者に対して、より小さい不快感、より低コスト、より高い利便性が提供される。さらに、生成物による対象への単回注射による治療の後、少なくとも２０若しくは２４週の期間、又は少なくとも６ヶ月の期間、又は６ヶ月超の期間維持される有意かつ持続的な効果を奏する生成物によって、開業医と患者双方にとって、当技術分野で満たされていないニーズに対する解決策が提供される。したがって、本発明の組成物及び方法によって、治療があまりにも頻繁である問題に対する解決策が提供され、患者の全体的な健康感が向上する。作用の持続時間がこのように長期であると、全体的な治療コースにわたって治療の数が減ることになる。

別の態様では、本発明は、ボツリヌス毒素を投与して、個体において持続時間の延長された治療効果又は美容効果を実現する方法であって、治療を必要とする個体のある領域に滅菌注射用組成物の一用量を注射により投与して、組成物での第１の治療後に治療効果又は美容効果を実現するステップを含み；組成物が、注射に適した薬学的に許容される希釈剤と、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分と、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）_ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑ、（ｇｌｙ）_ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑ又は（ｇｌｙ）_ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑを有する正に帯電した１又は２以上の効率基（efficiency group）が共有結合で結合している正に帯電したポリリジン骨格を含む正に帯電した担体成分とを含み；ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分が、２０Ｕ〜６０Ｕの治療用量で個体に投与され；正に帯電した担体が、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分と非共有結合で会合し；個体に注射により投与された組成物の第１の治療用量によって、少なくとも約６ヶ月〜約１０ヶ月の効果の持続時間を有する、持続時間の延長された治療効果又は美容効果が実現され、任意で、その後に、第２の又はそれ以降の治療用量が投与される、方法を提供する。

別の態様では、本発明は、それを必要とする個体におけるしわ、しわ線、又は溝を低減する方法であって、注射用の薬学的に許容される希釈剤と、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体と、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）_ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑ、（ｇｌｙ）_ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑ又は（ｇｌｙ）_ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑを有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している正に帯電したポリリジン骨格を含む正に帯電した担体成分とを含む組成物を、単回投与の注射として個体に投与するステップを含み；ボツリヌス毒素が２０Ｕ〜６０Ｕの量で個体に投与され；正に帯電した担体が、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分と非共有結合で会合し；組成物の単回投与の注射により、個体におけるしわ、しわ線、又は溝の低減において少なくとも約６ヶ月〜約１０ヶ月の効果の持続時間を有する単回治療が提供され、これによって個体に対して治療間隔の持続時間が延長される、方法を提供する。一実施形態では、組成物は、個体の顔面の眉間のしわ線を低減するか、又はその重症度を軽減する。

別の態様では、本発明は、注射用の薬学的に許容される希釈剤と、２０Ｕ、４０Ｕ、及び６０Ｕから選択される投与量のボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体と、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）_ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑ、（ｇｌｙ）_ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑ又は（ｇｌｙ）_ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑを有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している正に帯電したポリリジン骨格を含む正に帯電した担体とを含む滅菌注射用組成物であって；正に帯電した担体が、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分と非共有結合で会合し；組成物が、注射用組成物の有効用量での個体の治療後に、少なくとも２０〜２４週の間、又は少なくとも６ヶ月の間、又は６ヶ月超、例えば約６ヶ月〜約１０ヶ月持続する美容効果又は治療効果を提供する、組成物を提供する。

これらの上記の方法及び組成物の一部の実施形態では、組成物は、血清型Ａのボツリヌス毒素を、好ましくは分子量１５０ｋＤａを有する血清型Ａのボツリヌス毒素を含む。一実施形態では、正に帯電した担体は、アミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）_１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する。一実施形態では、ボツリヌス毒素は２０Ｕの投与量で組成物中に存在する。一実施形態では、ボツリヌス毒素は４０Ｕの投与量で組成物中に存在する。一実施形態では、ボツリヌス毒素は６０Ｕの投与量で組成物中に存在する。一実施形態では、組成物は、組成物の注射による単回治療を受けた個体において眉間のしわ線の重症度を低減する。ある特定の実施形態では、治療効果の持続時間は、６ヶ月超、７ヶ月超、８ヶ月超、９ヶ月超、又は少なくとも６ヶ月〜１０ヶ月を含む。

本発明の態様の別のものでは、本発明は、注射用ボツリヌス毒素での治療を必要とする個体を治療する方法であって、治療の方法が、効果の持続時間及びそれぞれの治療間隔の間の持続時間の時間が長時間である複数の治療間隔を有する治療コースを含み、治療コースが、治療を必要とする個体のある領域に滅菌注射用組成物の最初の治療用量を注射により投与して、組成物での最初の治療後に治療効果又は美容効果を実現するステップであって、組成物が、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分と、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）_ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑ、（ｇｌｙ）_ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑ又は（ｇｌｙ）_ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑを有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している正に帯電したポリリジン骨格を含む正に帯電した担体成分とを含み；ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分が２０Ｕ〜６０Ｕの治療用量で前記個体に投与され：正に帯電した担体が、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分と非共有結合で会合し；個体に注射により投与された組成物の最初の治療用量によって、少なくとも約１０ヶ月を通じて続く効果の治療的又は美容的持続時間が提供される、ステップ；並びに、最初の治療用量の後及びそれぞれのそれ以降の治療用量の間に３ヶ月以上〜少なくとも約１０ヶ月の持続時間を含む治療間隔で、個体に注射により組成物のそれ以降の治療用量を投与するステップを含む、方法を提供する。

上記治療方法の実施形態では、治療効果又は美容効果は、しわ、しわ線、又は溝の治療又は低減である。一実施形態では、治療効果又は美容効果は、個体の顔面の眉間のしわ線の低減である。一実施形態では、組成物は、血清型Ａのボツリヌス毒素を、好ましくは分子量１５０ｋＤａを有する血清型Ａのボツリヌス毒素を含む。一実施形態では、正に帯電した担体は、アミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する正に帯電したペプチドである。一実施形態では、組成物は注射後に注射の部位から局所的に拡散しない。特定の実施形態では、ボツリヌス毒素は２０Ｕの量で、又は４０Ｕの量で、又は６０Ｕの量で個体に投与される。一実施形態では、治療効果は、片側顔面痙攣、成人発症型痙性斜頚、裂肛、眼瞼痙攣、脳性麻痺、頭痛、斜視、側頭下顎関節障害、神経性疼痛、過活動膀胱、鼻炎、副鼻腔炎、ざ瘡、ジストニア、ジストニア収縮、多汗症、及びコリン作動性神経系によって制御される腺の過分泌からなる群から選択される障害に関連する症状の低減である。ある特定の実施形態では、治療間隔の持続時間は、３ヶ月超、４ヶ月超、５ヶ月超、６ヶ月超、７ヶ月超、８ヶ月超、９ヶ月超、又は少なくとも６ヶ月〜１０ヶ月を含む。

本発明はまた、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、若しくは低タンパク質ボツリヌス毒素複合体と正に帯電した担体とを含有する製剤若しくは組成物、又はそのような製剤若しくは組成物を産生するのに使用することができるプレミックスを調製するためのキットも提供する。また、ボツリヌス毒素複合体（又は、１５０ＫＤの神経毒自体のみ若しくはいくつかの天然の複合タンパク質を有する神経毒を含む、低ボツリヌス毒素複合体）と正に帯電した担体とを順次に投与するための手段を含有するキットも提供される。

ＲＴ００３又はＢＯＴＯＸ（登録商標）のいずれかの反復投与後、ベースライン指外転スコア（ＤＡＳ，digit abduction score）値（０．４）に戻るのに必要な時間を示す棒グラフである。 図２Ａは、正中線外側への注射の影響を受けたマウス腓腹筋部分を示すため、暗色色素を注射されたマウス後肢を示す画像である。図２Ｂは、正中線への注射の影響を受けたマウス腓腹筋部分を示すため、暗色色素を注射されたマウス後肢を示す画像である。 マウス腓腹筋の正中線外側部分又は正中線部分のいずれかにＲＴ００３、ＲＴＴ１５０、又はＢＯＴＯＸ（登録商標）を注射した後の時間に応じて測定された指外転スコア（ＤＡＳ）を提示するグラフである。 本明細書の実施例５に記載される臨床試験での、各種治療群における奏効期間を示すKaplan-Meier曲線である。Kaplan-Meier曲線は、臨床試験の主要有効性解析結果を表し、示される治療群において、治験責任医師による包括的評価−顔面しわ重症度（ＩＧＡ−ＦＷＳ，Investigator Global Assessment-Facial Wrinkle Severity）評価でベースラインから少なくとも１ポイント改善した奏効期間を示す。図４Ａは、プラセボ治療群、ＶＩＳＴＡＢＥＬ（登録商標）／ＢＯＴＯＸ（登録商標） ２０Ｕ治療群及びＲＴ００２ ４０Ｕ治療群についてのKaplan-Meier曲線を提示する。図４Ｂは、プラセボ治療群、ＶＩＳＴＡＢＥＬ（登録商標）／ＢＯＴＯＸ（登録商標） ２０Ｕ治療群、ＲＴ００２ ２０Ｕ治療群、ＲＴ００２ ４０Ｕ治療群及びＲＴ００２ ６０Ｕ治療群についてのKaplan-Meier曲線を提示する。

本発明は、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体を含む新規の注射用組成物に関する。好ましい実施形態では、本組成物は、毒素を安定化させ、又は注射後に組織を通して毒素を輸送若しくは送達することを可能にし、その結果、本発明の毒素は、外因性アルブミンに結合している従来の市販のボツリヌス毒素複合体（例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標）又はＭＹＯＢＬＯＣ（登録商標））と比較して、抗原性の低下、より良好な安全性プロファイル、改善された効力、臨床的有効性のより速やかな発現及び／又は臨床的有効性のより長い持続時間を有する。本発明の組成物は、本明細書に記載のように、様々な治療目的、審美的目的、及び／又は美容目的のために、対象にボツリヌス毒素を供給するための注射用適用物として使用することができる。本発明の組成物はまた、ボツリヌス毒素に関して他の組成物及び送達方法に勝る、改善された安全性プロファイルを有する。加えて、こういった組成物によって、ボツリヌス毒素に対する免疫応答において有益な低下を与えることができる。複数の実施形態では、本発明の注射用組成物が、特に、２０Ｕ以上の量でボツリヌス毒素を含むものが、眉間のしわ線などのしわ及び顔面のしわ線の治療のために注射により投与されている対象において、本発明の注射用組成物によって、長期継続的な有効性、例えば、少なくとも２０週、少なくとも２４週、少なくとも６ヶ月、又は６ヶ月超、例えば約１０ヶ月まで継続する効果が提供される。

用語「ボツリヌス毒素」とは、本明細書で使用する場合、細菌によって産生されるものであっても、組換え技法によって産生されるものであっても、既知の型のボツリヌス毒素（例えば、Ｃ．ボツリヌス種の様々な血清型に関連する１５０ｋＤのボツリヌス毒素タンパク質分子）のいずれか、さらに新しく発見される血清型を含めて、引き続き発見され得るそのようないかなる型、並びに改変されたバリアント又は融合タンパク質を指すことができる。上述のように、現在、７つの免疫学的に異なるボツリヌス神経毒が特徴付けられ、すなわちボツリヌス神経毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧであり、このそれぞれは、型特異的抗体を用いた中和によって識別される。ボツリヌス毒素血清型は、例えば、Sigma-Aldrich社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から、及びMetabiologics, Inc.社（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から、並びに他の供給源から市販されている。ボツリヌス毒素の様々な血清型は、これらが影響する動物種において変化し、並びにこれらが誘起する麻痺の重症度及び持続時間において異なる。ボツリヌス毒素の少なくとも２つの型、すなわちＡ型及びＢ型が、ある特定の状態を治療するための製剤中で市販されている。Ａ型は、例えば、商標ＢＯＴＯＸ（登録商標）を有するAllergan社、及び商標ＤＹＳＰＯＲＴ（登録商標）を有するIpsen社の製剤中に含まれており、Ｂ型は、商標ＭＹＯＢＬＯＣ（登録商標）を有するElan社の製剤中に含まれている。

本発明の組成物中に使用される用語「ボツリヌス毒素」とは、別の態様では、ボツリヌス毒素誘導体、すなわち、ボツリヌス毒素活性を有するが、自然由来のボツリヌス毒素又は組換え天然ボツリヌス毒素と比べて、任意の部分上に又は任意のアミノ酸鎖上に、１若しくは２以上の化学的又は機能的改変を含有する化合物を指すことができる。例えば、ボツリヌス毒素は、天然型と比較した場合に、そのアミノ酸のうちの少なくとも１つが欠失、修飾、又は置換された神経毒素である修飾神経毒素とすることができ、或いは修飾神経毒素は、組換えで産生された神経毒素、又はその誘導体若しくは断片とすることができる。例えば、ボツリヌス毒素は、例えば、その特性を増強し又は望ましくない副作用を減少させる方法で修飾されているが、所望のボツリヌス毒素活性を依然として保持するものであってもよい。或いは、本発明で使用されるボツリヌス毒素は、組換え技法又は合成化学技法を使用して調製された毒素、例えば、様々なボツリヌス毒素血清型のサブユニット若しくはドメインから調製された、例えば、組換えペプチド、融合タンパク質、ハイブリッド神経毒（例えば、米国特許第６，４４４，２０９号明細書を参照）とすることができる。ボツリヌス毒素はまた、分子全体のうちの必要なボツリヌス毒素活性を有することが示された一部分とすることもでき、かかる場合にはそのままで、又は、組合せ分子若しくはコンジュゲート分子の一部として、例えば融合タンパク質の一部として使用することもできる。或いは、ボツリヌス毒素はボツリヌス毒素前駆体の形とすることができ、かかる前駆体はそれ自体非毒性であって、例えばタンパク質分解的切断時に毒性となる非毒性亜鉛プロテアーゼとすることができる。

用語「ボツリヌス毒素複合体」又は「毒素複合体」とは、本明細書で使用する場合、付随する内因性非毒素タンパク質（すなわち、クロストリジウム・ボツリナム種細菌によって産生される血球凝集素タンパク質及び非毒素非血球凝集素タンパク質）を伴った、約１５０ｋＤのボツリヌス毒素タンパク質分子（ボツリヌス毒素血清型Ａ〜Ｇのいずれかに属する）を指す。しかし、ボツリヌス毒素複合体は、単一の毒素複合体として、クロストリジウム・ボツリナム種細菌に由来する必要はないことに留意されたい。例えば、ボツリヌス毒素又は修飾ボツリヌス毒素を組換えで最初に調製し、次いで引き続いて非毒素タンパク質と組み合わせる場合もある。組換えボツリヌス毒素を購入し（例えば、List Biological Laboratories社製、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ＣＡ）、次いで非毒素タンパク質と組み合わせることもできる。

本発明はまた、１又は２以上の外因性安定剤の添加、内因性安定剤の除去、又はこれらの組合せを通じて、ボツリヌス毒素分子の安定性を調節することも企図する。例えば、本発明は、「低ボツリヌス毒素複合体」の使用を企図し、この場合、クロストリジウム・ボツリナム種細菌によって産生されるボツリヌス毒素複合体中に自然界に見出される量と比較して、ボツリヌス毒素複合体は非毒素タンパク質の量が低下している。一実施形態では、クロストリジウム・ボツリナム種細菌に由来するボツリヌス毒素複合体から、血球凝集素タンパク質又は非毒素非血球凝集素タンパク質の画分を抽出する、従来の任意のタンパク質分離方法を使用して、低ボツリヌス毒素複合体が調製される。例えば、低ボツリヌス毒素複合体は、ｐＨ７．３で赤血球に曝露することにより、ボツリヌス毒素複合体を解離させることによって産生することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、欧州公開特許公報第１５１４５５６Ａ１号を参照）。ＨＰＬＣ、透析、カラム、遠心分離、及びタンパク質からタンパク質を抽出するためのその他の方法を使用することができる。或いは、低ボツリヌス毒素複合体を、合成で産生されるボツリヌス毒素を非毒素タンパク質と組み合わせることによって産生する場合、自然由来のボツリヌス毒素複合体に存在すると考えられるよりも少ない血球凝集素又は非毒素非血球凝集素タンパク質を混合物に単に添加することができる。本発明による低ボツリヌス毒素複合体中の非毒素タンパク質のいずれも（例えば、血球凝集素タンパク質若しくは非毒素非血球凝集素タンパク質、又は両方）、独立して任意の量だけ減少することができる。ある特定の例示的な実施形態では、１又は２以上の非毒素タンパク質は、ボツリヌス毒素複合体中に通常見出される量と比較して、少なくとも約０．５％、１％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少されている。上述のように、クロストリジウム・ボツリナム種細菌は、７つの異なる血清型の毒素を産生し、市販の製剤は、様々な相対的量の非毒素タンパク質（すなわち、様々な量の毒素複合体）とともに製造される。例えば、ＭＹＯＢＬＯＣ（商標）は、０．０５％のヒト血清アルブミン、０．０１Ｍのコハク酸ナトリウム、及び０．１Ｍの塩化ナトリウムとともに、１ｍｌ当たり５０００Ｕのボツリヌス毒素Ｂ型を有する。ＤＹＳＰＯＲＴ（商標）は、１２５ｍｃｇのアルブミン及び２．４ｍｇのラクトースとともに、５００Ｕのボツリヌス毒素Ａ型−血球凝集素複合体を有する。ある特定の実施形態では、クロストリジウム・ボツリナム種細菌に由来するボツリヌス毒素複合体中に通常見出される、非毒素タンパク質のうちの実質的に全て（例えば、血球凝集素タンパク質及び非毒素非血球凝集素タンパク質の９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、又は９９％超）が、ボツリヌス毒素複合体から除去されている。さらに、内因性非毒素タンパク質の量を、場合によっては同じ量で減少させることができるが、本発明は、内因性非毒素タンパク質のそれぞれを異なる量で減少させること、並びに内因性非毒素タンパク質のうちの少なくとも１つを減少させるが、他のものは減少させないことも企図する。

上述のように、外因性安定剤（例えば、アルブミン）を、ボツリヌス毒素製剤を安定化するために通常は添加する。例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標）の場合では、複合体を安定化するために、Ａ型ボツリヌス毒素複合体１００Ｕ当たり、０．５ｍｇのヒトアルブミンが添加されている。一般に、本発明による組成物を安定化するために添加することができる外因性安定剤の量は、特に制限されない。一部の実施形態では、添加される安定剤の量は、本発明の正に帯電した担体がそれ自体で安定剤として作用する能力により、従来添加する量より少なくすることができる。例えば、添加する外因性アルブミンの量は、外因性アルブミンの従来の１０００倍過剰に満たない任意の量とすることができ、本発明のある特定の例示的な実施形態では、ボツリヌス毒素１００Ｕ当たり、わずか約０．２５、０．２０、０．１５、０．１０、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．００００１、０．０００００５、０．０００００１、又は０．００００００１ｍｇである。一実施形態では、外因性アルブミンは、本発明の組成物に安定剤としてまったく添加されず、したがって、アルブミンフリーのボツリヌス毒素組成物が産生される。

本発明の好ましい組成物は、タンパク質性賦形剤無しで、特に動物タンパク質由来の賦形剤無しで安定化している液体の、ボツリヌス毒素含有組成物である。このような液体組成物は、ボツリヌス毒素、好ましくは血清型Ａのボツリヌス毒素、正に帯電した担体（例えば、ペプチド）、非還元性二糖又は非還元性三糖、非イオン性界面活性剤、及び４．５〜７．５の間のｐＨを維持するための生理的適合性緩衝剤を含む。液体組成物の非還元性糖の濃度は１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲であり、非イオン性界面活性剤の濃度は０．００５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲である。好ましい組成物により、単回注射での治療後に長期間の効果が提供される。好ましい一実施形態では、ボツリヌス毒素Ａは分子量（ＭＷ、molecular weight）１５０ｋＤａを有する。好ましい組成物は、ボツリヌス毒素、好ましくボツリヌス毒素Ａ、より好ましくは１５０ｋＤａＭＷのボツリヌス毒素Ａ、本明細書に記載の正に帯電した担体（例えば、ペプチド）、非還元性二糖、例えば、スクロース、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、又はソルビタンエステル、並びに生理的適合性緩衝剤、例えば、クエン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、マレイン酸、及びヒスチジンを含むとともに、ｐＨ４．５〜ｐＨ７．５の範囲のｐＨを有する。

本発明によれば、タンパク質形質導入ドメイン、又は効率基を有する正に帯電した担体分子は、本明細書に記載のように、ボツリヌス毒素向けの輸送システムとして適しており、これを使用すると、筋肉及び／又は他の皮膚に関連する構造などの標的構造への浸透が改善された状態で毒素を注射することが可能となることが見出された。輸送は、ボツリヌス毒素の共有結合性修飾無しで進行する。ボツリヌス毒素の浸透を増強することに加えて、本発明の正に帯電した担体は、ある特定の好ましい実施形態では、分解に対してボツリヌス毒素を安定化することができる。そのような実施形態では、ボツリヌス毒素を安定化させるために通常存在する血球凝集素タンパク質及び非毒素非血球凝集素タンパク質を、減少させるか又は完全に省略することができる。同様に、製造の間に通常添加される外因性アルブミンも省略することができる。

用語「担体」に関連して用語「正に帯電した」又は「陽イオン性の」を使用することにより、担体が、少なくとも何らかの溶液相条件下で、より好ましくは、少なくとも何らかの生理学的に適合性の条件下で、正電荷を有することを意味する。より具体的には、「正に帯電した」及び「陽イオン性の」とは、本明細書で使用する場合、対象の基は、全てのｐＨ条件下で帯電している官能基、例えば、四級アミンを含有しているか、又は一級アミンの場合においてはｐＨ変化などのある特定の溶液相条件下で、正電荷を獲得することができる官能基を含有することを意味する。より好ましくは、「正に帯電した」又は「陽イオン性の」とは、本明細書で使用する場合、生理学的に適合性の条件にわたって陰イオンと会合する挙動を有するそういった基を指す。当業者であれば明らかなように、多数の正に帯電した部分を有するポリマーは、ホモポリマーである必要はない。正に帯電した部分のその他の例は、従来技術においてよく知られており、当業者であれば明らかなように、容易に使用することができる。

一般に、正に帯電した担体（「正に帯電した骨格」とも呼ばれる）は典型的には、生理的ｐＨで正電荷を担持する、鎖中の基、又は骨格から延びる側鎖に結合している、正電荷を担持する基のいずれかを有する原子の鎖である。ある特定の好ましい実施形態では、正に帯電した骨格は、陽イオンペプチドである。本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」とは、アミノ酸配列を指すが、アミノ酸配列内のアミノ酸残基の数に関して意味を持たない。したがって、用語「ペプチド」とはまた、ポリペプチド及びタンパク質も包含し得る。ある特定の好ましい実施形態では、正に帯電した骨格自体は、特定の酵素的又は治療的生物活性を有さない。ある特定の実施形態では、骨格は直鎖状炭化水素骨格であり、これは、一部の実施形態では、窒素、酸素、硫黄、ケイ素、及びリンから選択されるヘテロ原子が介在している。骨格鎖の原子の大部分は、通常、炭素である。さらに、骨格は、反復単位（例えば、アミノ酸、ポリ（エチレンオキシ）、ポリ（プロピレンアミン）、ポリアルキレンイミンなど）のポリマーであることが多いが、ヘテロポリマーであってもよい。実施形態のうちの一群では、正に帯電した骨格は、ポリプロピレンアミンであり、いくつかのアミン窒素原子が、正電荷を担持するアンモニウム基（テトラ置換された）として存在する。別の実施形態では、正に帯電した骨格は非ペプチジルポリマーであり、これは、約１０，０００〜約２，５００，０００、好ましくは、約１００，０００〜約１，８００，０００、最も好ましくは、約５００，０００〜約１，４００，０００の分子量を有する、ポリアルキレンイミン、例えば、ポリエチレンイミン又はポリプロピレンイミンなどのヘテロポリマー又はホモポリマーとすることができる。実施形態の別の群では、骨格は、正に帯電した基（例えば、アンモニウム基、ピリジニウム基、ホスホニウム基、スルホニウム基、グアニジウム基、又はアミジニウム基）を含む複数の側鎖部分を結合している。実施形態のうち、こういった群における側鎖部分は、骨格に沿って間隔を置いて配置することができ、この間隔は、離間が一貫しているか、又は可変である。さらに、側鎖の長さは、類似していても異なっていてもよい。例えば、実施形態のうちの一群では、側鎖は、１〜２０個の炭素原子を有し、上述の正に帯電した基の１つの遠位端（骨格から離れた）で終端となる直鎖状又は分岐状の炭化水素鎖とすることができる。正に帯電した担体とボツリヌス毒素の間の会合は、非共有結合性相互作用によるものであり、その非限定例としては、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、又はこれらの組合せが挙げられる。

実施形態群のうちの一群では、正に帯電した骨格は、複数の正に帯電した側鎖基（例えば、リジン、アルギニン、オルニチン、ホモアルギニン等）を有するポリペプチドである。好ましくは、ポリペプチドは、約１００〜約１，５００，０００、より好ましくは約５００〜約１，２００，０００、最も好ましくは約１０００〜約１，０００，０００の分子量を有する。本発明のこの部分にアミノ酸が使用される場合には、側鎖が結合の中心でＤ型又はＬ型（Ｒ立体配置又はＳ立体配置）のいずれかを有し得ることを、当業者であれば理解するであろう。ある特定の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、約５００〜約５０００、より好ましくは１０００〜約４０００、より好ましくは２０００〜約３０００の分子量を有する。他の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、１０〜２０個のアミノ酸、又は１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個のアミノ酸、好ましくはポリリジンを含む。

或いは、骨格は、アミノ酸アナログ及び／又は合成アミノ酸を含むことができる。骨格はまた、ペプトイドなどのポリペプチドのアナログとすることもできる。例えば、Kessler, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32:543 (1993); Zuckermann et al. Chemtracts-Macromol. Chem. 4:80 (1992)；及びSimon et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:9367 (1992)を参照されたい。要約すると、ペプトイドは、その側鎖が、α−炭素原子ではなく骨格の窒素原子に結合しているポリグリシンである。上記のように、側鎖の一部分が、正に帯電した基で典型的に終止することによって、正に帯電した骨格成分をもたらす。ペプトイドの合成は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８７７，２７８号明細書に記載されている。その用語が本明細書で使用される場合、アルファ−炭素位に自然由来の側鎖を有するアミノ酸から構成されていないので、ペプトイド骨格構成を有する正に帯電した骨格が「非ペプチド」とみなされる。

例えば、ポリペプチドの立体的又は電子的模倣体を利用して、様々な他の骨格を使用することができ、この場合、ペプチドのアミド連結は代替物で、例えば、エステル連結、チオアミド（−−ＣＳＮＨ−−）、逆チオアミド（−−ＮＨＣＳ−−）、アミノメチレン（−−ＮＨＣＨ_２−−）又は逆メチレンアミノ（−−ＣＨ_２ＮＨ−−）基、ケト−メチレン（−−ＣＯＣＨ_２−−）基、ホスフィネート（−−ＰＯ_２ＲＣＨ_２−−）、ホスホンアミデート及びホスホンアミデートエステル（−−ＰＯ_２ＲＮＨ−−）、逆ペプチド（−−ＮＨＣＯ−−）、ｔｒａｎｓ−アルケン（−−ＣＲ＝ＣＨ−−）、フルオロアルケン（−−ＣＦ＝ＣＨ−−）、ジメチレン（−−ＣＨ_２ＣＨ_２−−）、チオエーテル（−−ＣＨ_２Ｓ−−）、ヒドロキシエチレン（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２−−）、メチレンオキシ（−−ＣＨ_２Ｏ−−）、テトラゾール（ＣＮ_４）、スルホンアミド（−−ＳＯ_２ＮＨ−−）、メチレンスルホンアミド（−−ＣＨＲＳＯ_２ＮＨ−−）、逆スルホンアミド（−−ＮＨＳＯ_２−−）で、並びにマロネート及び／又はｇｅｍ−ジアミノ−アルキルサブユニットを有する骨格で、置き換えられてあり、例えば、Fletcher et al.（(1998) Chem. Rev. 98:763）により概説され、そこに引用されている文献により詳述されている。前述の置換の多くが、α−アミノ酸から形成される骨格と比べて、ほぼ等配電子のポリマー骨格をもたらす。

上に提供の骨格のそれぞれにおいて、正に帯電した基を担持する側鎖基を付加することができる。例えば、スルホンアミドと連結した骨格（−−ＳＯ_２ＮＨ−−及び−−ＮＨＳＯ_２−−）は、窒素原子に結合した側鎖基を有することができる。同様に、ヒドロキシエチレン（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２−−）連結は、ヒドロキシ置換基に結合している側鎖基を有することができる。当業者であれば、他の連結化学を適用して、標準的な合成法を使用することにより、正に帯電した側鎖基を容易に提供することができる。

一実施形態では、正に帯電した骨格とは、タンパク質形質導入ドメイン（効率基とも呼ばれる）を有するポリペプチドである。本明細書で使用する場合、効率基又はタンパク質形質導入ドメインとは、組織又は細胞膜を通して、正に帯電した骨格の転移を促進する効果を有する任意の薬剤である。タンパク質形質導入ドメイン又は効率基の非限定例としては、−（ｇｌｙ）_ｎ１−（ａｒｇ）_ｎ２、ＨＩＶ−ＴＡＴ若しくはその断片、又はアンテナペディアのタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ、protein transduction domain）若しくはその断片が挙げられ、ここで、下付き文字ｎ１は、０〜２０、より好ましくは０〜８、さらにより好ましくは２〜５の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立して、約５〜約２５、より好ましくは約７〜約１７、最も好ましくは約７〜約１３の奇整数である。一部の実施形態では、ジスルフィド凝集に関連する問題を最小限にするために、ＨＩＶ−ＴＡＴ断片は、システインを多く含む、ＨＩＶ−ＴＡＴ分子の領域を含有しない。好ましくは、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びアンテナペディアタンパク質形質導入ドメインの断片は、完全タンパク質のタンパク質形質導入活性を保持している。なおさらに好ましいのは、ＨＩＶ−ＴＡＴ断片はアミノ酸配列（ｇｌｙ）_ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ―（ｇｌｙ）_ｑ、（ｇｌｙ）_ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑ又は（ｇｌｙ）_ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑを有している実施形態であり、ここで、下付き文字ｐ及びｑはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、又はｐ及びｑはそれぞれ独立して整数１である。別の実施形態では、断片又は効率基は、断片又は効率基のアミノ酸配列のＣ末端又はＮ末端のいずれかを介して骨格に結合している。ある特定の好ましい実施形態では、ｐは１でありかつｑは０であり、又はｐは０でありかつｑは１である。好ましいＨＩＶ−ＴＡＴ断片は、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して、０〜８、より好ましくは０〜５の整数のものである。別の好ましい実施形態では、正に帯電した側鎖又は分岐基は、アンテナペディア（Ａｎｔｐ，Antennapedia）タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、又は活性を保持するその断片である。これらは、例えば、Console et al., J. Biol. Chem. 278:35109 (2003)から、当技術分野において知られており、本発明によって企図されるアンテナペディアＰＴＤの非限定例は、アミノ酸配列ＳＧＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＣを有するＰＴＤである。他の実施形態では、正に帯電した担体とは、本発明の組成物及び方法において使用するための、アミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）_１５−Ｇ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する正に帯電したペプチドであり；又はアミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）_１５−Ｇ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する正に帯電したペプチドであり；又はアミノ酸配列ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）_１５−Ｇ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲを有する正に帯電したペプチドである。

好ましくは、正に帯電した担体は、全担体重量の百分率として少なくとも約０．０１％、好ましくは約０．０１〜約５０重量％、より好ましくは約０．０５〜約４５重量％、最も好ましくは約０．１〜約３０重量％の量で側鎖が正に帯電したタンパク質形質導入ドメイン又は正に帯電した効率基を含む。式−（ｇｌｙ）_ｎ１−（ａｒｇ）_ｎ２を有する正に帯電したタンパク質形質導入ドメインの場合、好ましい範囲は約０．１〜約２５％である。

別の実施形態では、骨格部分はポリリジンであり、正に帯電したタンパク質形質導入ドメインは、リジン側鎖のアミノ基に、又はＣ末端若しくはＮ末端に結合している。一部の好ましい実施形態では、ポリリジンは、少なくとも１００Ｄ、２００Ｄ、３００Ｄ、４００Ｄ、５００Ｄ、６００Ｄ、７００Ｄ、８００Ｄ、９００Ｄ、１０００Ｄ、１５００Ｄ、２０００Ｄ、２５００Ｄ、３０００Ｄ、３５００Ｄ、４０００Ｄ、４５００Ｄ、５０００Ｄ、５５００Ｄ、又は６０００Ｄであり、並びに約２，０００，０００Ｄ未満、１，０００，０００Ｄ未満、５００，０００Ｄ未満、２５０，０００Ｄ未満、１００，０００Ｄ未満、７５，０００Ｄ未満、５０，０００Ｄ未満、及び２５，０００Ｄ未満である分子量を有することができる。１００〜２，０００，０００Ｄの範囲内で、下限及び／又は上限の範囲は、それぞれ１００増減することができ、得られる各サブ範囲は、本発明の特に企図された実施形態であることが、企図されている。一部の例示的な実施形態では、ポリリジンは、約１，０００〜約１，５００，０００Ｄ、約２，０００〜約８００，０００Ｄ、又は約３，０００〜約２００，０００Ｄの分子量を有する。他の例示的な実施形態では、ポリリジンは、約１００〜約１０，０００Ｄ、約５００〜約５，０００Ｄ、約１，０００〜約４，０００Ｄ、約１，５００〜約３，５００Ｄ、又は約２，０００〜約３，０００Ｄの分子量を有する。好ましいのは、１０〜２０個のリジン、より好ましくは、１５個のリジンを有するポリリジンポリペプチドである。一部の実施形態では、本発明によって企図されるポリリジンは、例えば、ＭＷ＞７０，０００を有するポリリジン、７０，０００〜１５０，０００のＭＷを有するポリリジン、１５０，０００〜３００，０００のＭＷを有するポリリジン、及びＭＷ＞３００，０００を有するポリリジンなどの、市販の（Sigma Chemical Company社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、米国）ポリリジンのいずれかとすることができる。適切なポリリジンの選択は、組成物の残りの成分に依存し、組成物に全体的な正味の正電荷を提供するのに十分であり、負に荷電した成分の長さの好ましくは合計の１〜４倍である長さを提供するのに十分である。好ましい正に帯電したタンパク質形質導入ドメイン又は効率基には、例えば、−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ（−Ｇｌｙ_３Ａｒｇ_７）又はＨＩＶ−ＴＡＴが含まれる。

別の好ましい実施形態では、正に帯電した骨格はポリアルキレンイミンであり、その非限定例としては、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、及びポリブチレンイミンが挙げられる。ある特定の実施形態では、ポリアルキレンイミンは、少なくとも１００Ｄ、２００Ｄ、３００Ｄ、４００Ｄ、５００Ｄ、６００Ｄ、７００Ｄ、８００Ｄ、９００Ｄ、１０００Ｄ、１５００Ｄ、２０００Ｄ、２５００Ｄ、３０００Ｄ、３５００Ｄ、４０００Ｄ、４５００Ｄ、５０００Ｄ、５５００Ｄ、又は６０００Ｄ、並びに約２，０００，０００Ｄ未満、１，０００，０００Ｄ未満、５００，０００Ｄ未満、２５０，０００Ｄ未満、１００，０００Ｄ未満、７５，０００Ｄ未満、５０，０００Ｄ未満、及び約２５，０００Ｄ未満の分子量を有する。１００〜２，０００，０００Ｄの範囲内で、下限及び／又は上限の範囲は、それぞれ１００増減することができ、得られる各サブ範囲は、本発明の特に企図された実施形態であることが、企図されている。

本発明の他の実施形態では、担体は、比較的短いポリリジン又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ、polyethyleneimine）骨格（これは、直鎖状であっても分岐状であってもよい）であり、これは、正に帯電した分岐基を有する。理論によって束縛されることを望むものではないが、輸送効率を劇的に減少させる、治療組成物中での骨格とボツリヌス毒素との非制御的凝集を最小限にするのに、そのような担体は有用であると考えられる。担体が比較的短い直鎖状ポリリジン又はＰＥＩ骨格である場合、骨格は、７５，０００Ｄ未満、より好ましくは、３０，０００Ｄ未満、最も好ましくは、２５，０００Ｄ未満の分子量を有することになる。しかし、担体が比較的短い分岐状ポリリジン又はＰＥＩ骨格である場合、骨格は、６０，０００Ｄ未満、より好ましくは、５５，０００Ｄ未満、最も好ましくは、５０，０００Ｄ未満の分子量を有することになる。

特に興味深い一実施形態では、非天然分子は、固有のボツリヌス毒素様活性をまったく有さず、しかも本明細書に記載の１又は２以上のタンパク質形質導入ドメインを含有する陽イオンペプチドである。なんら特定の科学的な理論に束縛されることを望むものではないが、このペプチドは、注射後の、複合体中で会合した分子の組織浸透を増強する一方で、皮膚内及びインビトロでボツリヌス毒素の安定化を増強すると考えられる。これらのペプチドで得られる組織浸透の増強によって、外因性アルブミン（例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標）又はＭＹＯＢＬＯＣ（登録商標））に結合している従来の市販のボツリヌス毒素複合体と比較して、特に、抗原性の低下、より良好な安全性プロファイル、改善された効力、臨床的有効性のより速やかな発現、又は臨床的有効性のより長い持続時間が得られると考えられる。

好ましい実施形態では、本発明による組成物中の正に帯電した担体の濃度は、例えば、運動神経板などの分子標的へのボツリヌス毒素の送達を増強するのに十分である。さらに、理論に束縛されることを望むわけではないが、浸透速度は、受容体媒介性速度論に従い、その結果、浸透増強分子の量が飽和点まで高まるのに伴って組織浸透が高まり、こうして、輸送速度は一定になると考えられる。したがって、好ましい一実施形態では、添加される浸透増強分子の量は、飽和直前で浸透速度を最大にする量に等しい。本発明の注射用組成物中の正に帯電した担体（又は担体ペプチド）についての有用な濃度範囲は、本明細書に記載の通り、ボツリヌス毒素１ユニット（Ｕ、Unit）当たり担体約０．１ｐｇ（０．１ｐｇ／Ｕ）〜ボツリヌス毒素１ユニット当たり約１．０ｍｇ（ｍｇ／Ｕ）である。本発明の局所用組成物中の正に帯電した担体（又は担体ペプチド）についての有用な濃度範囲は、約１．０ｐｇ／ボツリヌス毒素１Ｕ〜０．５ｍｇ／ボツリヌス毒素１Ｕ（担体の量／ボツリヌス毒素１Ｕ）である。他の実施形態では、正に帯電した担体（又は担体ペプチド）は、例えば、１０ｎｇ／ボツリヌス毒素１Ｕ〜２００ｎｇ／ボツリヌス毒素１Ｕの範囲で、又は１ｎｇ／ボツリヌス毒素１Ｕ〜１０００ｎｇ／ボツリヌス毒素１Ｕの範囲で、又は０．１ｎｇ／ボツリヌス毒素１Ｕ〜１０，０００ｎｇ／ボツリヌス毒素１Ｕの範囲で、本発明の注射用組成物に存在する。一部の実施形態では、本発明の組成物に存在するボツリヌス毒素のユニットに対する正に帯電した担体（又は担体ペプチド）の量は、非限定的例として、ボツリヌス毒素１ユニット当たり、担体５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ｎｇ等（ｎｇ／Ｕ）である。好ましくは、ボツリヌス毒素は血清型Ａであり、特に血清型Ａボツリヌス毒素の１５０ｋＤ型である。

一般に、ボツリヌス毒素の活性を測定するための方法及び手順、すなわち、ボツリヌス毒素活性の単位（Ｕ）は、当業者に知られており、彼らによって実施されている。要約すると、マウスにおける半数致死アッセイ（ＬＤ_５０アッセイ）は、高精度でボツリヌス毒素の単位数を推定するために従来から使用されている。全ての市販のボツリヌス毒素の用量は、生物学的活性の単位で表現されている。一例として、ボツリヌス毒素の１単位は、メスＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける、計算された半数腹腔内致死量（ＬＤ５０）に相当する。当技術分野での致死アッセイについても記載している、Hoffman, R.O. et al., 1986, Int. Ophthalmol. Clin., 26:241-50、並びにDePass, L.R., 1989, Toxicol. Letters, 49:159-170；及びPearce, L.B. et al., 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol., 128:69-77を参照されたい。より具体的には、本発明の組成物のボツリヌス毒素成分についてボツリヌス毒素ユニットを決定する適切な方法は次の通りである：体重１７〜２３グラムの四十八（４８）匹のメスＣＤ−１マウスを、１用量群当たり八（８）匹の動物で、被験物質の６用量（１．５４、１．３１、１．１１、０．９５、０．８０、及び０．６８Ｕ／０．５ｍＬ）に無作為に割り当てる。被験物質とはアッセイ又は試験されるボツリヌス毒素調製物又は試料を指す。動物をケージ当たり８匹収容し、被験物質での投与の２４時間以内に秤量する。投与の日に、被験物質を等張食塩水（０．９％ＮａＣｌ）中で適切な濃度に希釈する。各動物に腹腔内注射を介して希釈した被験物質０．５ｍＬを投与する。注射の後、マウスをケージに戻し、死亡数を３日間毎日記録する。致死率を注射後７２時間スコアし、その結果をプロビット又はロジスティック解析により解析して、同一の投薬レジメンを使用して評価される標準品に対してＬＤ_５０値を導出する。一例として、被験物質の相対的効力を導出する比較のために使用される、本発明の同一組成物の特に認定されかつ較正されたロットが、標準品である。次いで、決定したＬＤ_５０値を実施した累積希釈に対して補正して、ニートの（非希釈）被験物質に対して相対的効力値を割り当てる。

本発明の組成物は、対象又は患者、（すなわち、特定の治療を必要とするヒト又は他の哺乳動物）の皮膚又は上皮への注射を可能とする形態であることが好ましい。用語「必要とする」とは、薬学的ニーズ又は健康関連のニーズ（例えば、望ましくない顔面筋痙攣を伴う状態を治療すること）、並びに美容的ニーズ及び主観的ニーズ（例えば、顔の組織の外見を変更又は改善すること）の両方を含むものとする。好ましい実施形態では、組成物は、ボツリヌス毒素（付随する非毒素タンパク質、又は付随する低非毒素タンパク質のいずれかを含有する）を、正に帯電した担体と、及び通常、１又は２以上の追加の薬学的に許容される担体又は賦形剤と混合することによって調製される。その最も単純な形態では、これらは、緩衝食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水）などの水性の薬学的に許容される希釈剤を含有することができる。しかし、組成物は、適用される組織と適合性である皮膚科学的又は薬学的に許容される担体、媒体、又は媒質を含めて、注射用の医薬組成物又は薬用化粧品組成物中に一般に見出される他の成分を含有することができる。用語「皮膚科学的又は薬学的に許容される」とは、本明細書で使用する場合、そのように記載される組成物又はその成分は、全体として過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応などを伴うことなく、そういった組織との接触で使用するのに、又は患者において使用するのに適していることを意味する。適宜、本発明の組成物は、検討中の分野、特に、化粧品及び皮膚科学において従来から使用される任意の成分を含むことができる。

その形態の観点から、本発明の組成物は、筋肉及び組成物を使用することができる他の組織に注射するのに使用される、溶液、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）、懸濁液、ゲル、粉末、又はその他の一般的な固体組成物若しくは液体組成物を含むことができる。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、シリンジを用いて注射するのに適した低粘度の、滅菌製剤中に存在する。本明細書で使用する場合、用語、組成物及び製剤は、本発明による組成物及び製剤に言及する場合、本質的に同じ意味で用いられる。本発明の組成物は、注射する前に薬学的に許容される液体希釈剤を使用して再構成される凍結乾燥粉末の形態とすることができる。ある特定の実施形態では、凍結乾燥粉末は、液体希釈剤を用いて再構成されて、約０．１〜約２０００ｃＰ、より好ましくは、約０．２〜約５００ｃＰ、さらにより好ましくは、約０．３〜約５０ｃＰ、さらにより好ましくは、約０．４〜約２．０ｃＰの粘度を有する注射用製剤を形成する。本発明の組成物は、ボツリヌス毒素及び正に帯電した担体に加えて、抗菌剤、水和剤、組織増量剤又は組織充填剤、保存剤、乳化剤、天然油又は合成油、溶媒、界面活性剤、洗剤、ゲル化剤、抗酸化剤、充填剤、増粘剤、粉剤、粘度制御剤及び水など、並びに麻酔薬、かゆみ止め活性物、植物抽出物、品質改良剤、ミネラル、ポリフェノール、シリコーン又はその誘導体、ビタミン、及び植物薬を含めてもよいが、こういった製品において一般に使用される他の成分を含有することができる。

本発明による注射用組成物は、制御放出組成物又は徐放組成物の形態とすることができ、これらの組成物は、カプセル化されているか、又は他の方法で材料内に収められたボツリヌス毒素及び正に帯電した担体を含み、その結果、これらは、経時的に制御された様式で組織内で放出される。ボツリヌス毒素及び正に帯電した担体を含む組成物は、マトリックス、リポソーム、ベシクル、マイクロカプセル、微小球内など、又は固体微粒子材料内に含有させることができ、これらの全ては、経時的にボツリヌス毒素を放出するように選択及び／又は構築されている。ボツリヌス毒素及び正に帯電した担体は、一緒に（すなわち、同一カプセル内）又は別個に（すなわち、別個のカプセル内）カプセル化することができる。

複数の実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載のボツリヌス毒素、本明細書に記載の正に帯電した担体（又はペプチド）、非還元性二糖又は非還元性三糖、非イオン性界面活性剤、及びｐＨ４．５〜ｐＨ７．５、又はｐＨ４．５〜ｐＨ６．８、又はｐＨ４．５〜ｐＨ６．５の範囲のｐＨなどの適切なｐＨを維持できる生理的適合性緩衝剤を含む液体（水性）組成物（又は製剤）を含む。適切なｐＨは、この範囲の上限のｐＨ値及び下限のｐＨ値、例えば、６．５のｐＨ又は７．５のｐＨも含むことが理解されよう。液体組成物中の非還元糖の濃度は１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲であり、非イオン性界面活性剤の濃度は０．００５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲である。液体組成物は、好ましくは凍結乾燥で乾燥して安定な固体組成物を産生することができ、このような固体組成物は、例えば、滅菌食塩水又はその他の既知の生理的に及び薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は媒体、特に注射用製剤での使用向けに知られているものを使用して、使用のためにその後に再構成することができる。好ましくは、乾燥、例えば、凍結乾燥した固体組成物は、非晶質及びアモルファス固体組成物であり、例えば、粉剤の形態とすることができる。また、好ましくは、本発明の組成物は、アルブミンなどの動物タンパク質由来の産物を含まない。本発明に適した組成物はまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１０／０３３０１２３号明細書にも記載されている。特定の実施形態では、組成物は血清型Ａのボツリヌス毒素を含む。他の特定の実施形態では、組成物は分子量１５０ｋＤａを有する血清型Ａのボツリヌス毒素を含む。

ある特定の実施形態では、本発明の組成物は非還元糖を含有し、これは二糖が好ましく、この非限定的例には、その無水型及び水和型を含めてトレハロース、又はスクロース、並びにそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、トレハロースの水和型、トレハロース二水和物が好ましい。他の実施形態では、組成物は三糖を含有し、その非限定的例はラフィノースである。一般に、本発明の組成物中の、非還元糖、好ましくは二糖の、例えばスクロースの濃度は、１０％〜４０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１０％〜２５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１５％〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲である。一部の好ましい実施形態では、非還元糖、好ましくは二糖の、例えばスクロースの濃度は、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％（ｗ／ｖ）である。

一般に、本発明の組成物は、ボツリヌス毒素を安定化する能力を有するとともに製薬学的用途に適した任意の非イオン性界面活性剤を含むことができる。一部の実施形態では、非イオン性界面活性剤はポリソルベートであり、例えば、その非限定的一例として、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、及びポリソルベート８０である。他の実施形態では、非イオン性界面活性剤はソルビタンエステルであり、その非限定的例には、ＳＰＡＮ（登録商標）２０、ＳＰＡＮ（登録商標）６０、ＳＰＡＮ（登録商標）６５、及びＳＰＡＮ（登録商標）８０が挙げられる。非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００又はＮＰ−４０も使用することができる。加えて、様々な非イオン性界面活性剤の組合せを使用することができる。ある特定の好ましい実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート、ポロキサマー及び／又はソルビタンであり、ポリソルベート及びソルビタンが特に好ましい。複数の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、上限値及び下限値を含めて、０．００５％〜０．５％の範囲で、又は０．０１％〜０．２％の範囲で、又は０．０２％〜０．１％の範囲で、又は０．０５〜０．０８％の範囲で、本発明の組成物中に存在する。加えて、本発明の組成物は、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１０％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、又は０．１５％の量で、非イオン性界面活性剤を含有することができる。

一般に、本発明の組成物に対して、上記の範囲のｐＨを維持することができる任意の生理的適合性緩衝剤が使用に適している。そのような緩衝剤の非限定的例としては、クエン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、マレイン酸、及びヒスチジンの塩が挙げられる。適切な緩衝剤濃度の非限定的例としては、０．４００％〜０．６００％、０．４５０％〜０．５７５％、又は０．５００％〜０．５６５％の範囲の緩衝剤濃度が挙げられる。本発明の組成物はまた、緩衝剤塩の混合物を含むことができ、その非限定的例としては、クエン酸塩／酢酸塩、クエン酸塩／ヒスチジン、クエン酸塩／酒石酸塩、マレイン酸塩／ヒスチジン、又はコハク酸塩／ヒスチジンが挙げられる。したがって、単回注射による治療後に長期間の効果を提供する本発明の組成物は、本明細書に記載のボツリヌス毒素Ａ又は１５０ｋＤａＭＷのボツリヌス毒素Ａなどのボツリヌス毒素、本発明に記載の正に帯電した担体（又はペプチド）、スクロースなどの非還元性二糖、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、又はソルビタンエステルなどの非イオン性界面活性剤、並びにクエン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、マレイン酸、及びヒスチジンなどの生理的適合性緩衝剤を含む。生理的適合性緩衝剤は、本明細書に記載のｗ／ｖの量で、ｐＨ４．５〜６．５の範囲のｐＨ又はｐＨ４．５〜７．５の範囲のｐＨなどの適切なｐＨを維持することできる。

本発明の特定の一組成物は、アルブミンフリー、液体（水性）組成物であり、これは、ボツリヌス毒素Ａ、好ましくは血清型Ａのボツリヌス毒素、又は分子量１５０ｋＤａを有するボツリヌス毒素Ａ；正に帯電した担体（又はペプチド）；１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する、非還元性二糖又は非還元性三糖、好ましく二糖、；０．００５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する、非イオン性界面活性剤、好ましくはポリソルベート又はソルビタンエステル；並びに、４．５〜７．５の間のｐＨを維持するために０．４００％〜０．６００％、０．４５０％〜０．５７５％、又は０．５００％〜０．５６５％の範囲で存在する、クエン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、マレイン酸、又はヒスチジンなどの生理的適合性緩衝剤を含む。

本発明によるボツリヌス毒素製剤は、注射によって（典型的にはシリンジを使用して）、皮膚の下にある筋肉に、又は皮膚内の腺構造に、麻痺を生じさせ、弛緩を生じさせ、収縮を軽減し、痙攣を予防若しくは軽減し、腺の排出量を低減するのに有効な量で、又はその他の所望の効果を生じさせるのに有効な量で送達することができる。このようにしてボツリヌス毒素を局所的に送達することにより、注射用材質又は移植可能材質と比べて、投与量の減少をもたらし、毒性を低減し、所望の効果に関してより正確な投与量の最適化を可能とすることができる。

ボツリヌス毒素の有効量、好ましくは治療的有効量又は美容的有効量を送達するために、本発明の組成物が投与される。用語「有効量」又は「治療的有効量又は美容的有効量」とは、本明細書で使用する場合、所望の筋肉麻痺効果、又はその他の生物学的若しくは審美的効果を生じるのに十分であるが、暗黙的に安全な量、すなわち、深刻な副作用を回避するのに十分低い量である、上に定義のボツリヌス毒素の量を意味する。所望の効果には、例えば、特に顔面における小じわ及び／若しくはしわの出現を低減する目的での、又は目の拡張、口角の持上げ、若しくは上唇から扇形に広がるしわ線の平滑化などの他の方法での顔面の外見を調整する目的での、ある特定の筋肉の弛緩、或いは筋肉の緊張の一般的緩和が含まれる。最後に述べた効果、すなわち筋肉の緊張の一般的緩和は、顔又は他の場所で有効化することができる。

本発明の組成物は、単回用量の治療として適用するために、適切な有効量のボツリヌス毒素を含有することができ、又は投与箇所で希釈するためでも、複数の適用において使用するためでも、より濃縮することができる。本発明の正に帯電した担体を使用することにより、ボツリヌス毒素は、しわ、望ましくない顔面筋の若しくは他の筋肉の痙攣、多汗症、ざ瘡などの状態、又は筋肉痛若しくは筋痙攣の緩和が望まれる、身体の他の部分での状態を治療するために、対象に注射で投与することができる。本発明の組成物は、顔面の小じわなどの小じわ、及び対象の顔面の「渋面のしわ線」としても知られている眉間のしわ線の治療に特に適している。ボツリヌス毒素は、筋肉、又は他の皮膚に関連する組織構造、若しくは他の標的組織構造に注射によって投与される。投与は、例えば、脚、肩、背中（下背を含む）、腋窩、手掌、足、首、顔、鼠径部、手若しくは足の背側、肘、上腕、膝、太股、臀部、胴体、骨盤、又はボツリヌス毒素の投与が望まれる身体の他の任意の部分に行うことができる。

本発明の注射用ボツリヌス毒素含有組成物の投与は、アセチルコリンのシナプス伝達又は放出の予防によって、治療的な利益が付与される任意の状態を含めて、他の状態を治療するのに実施することもできる。例えば、本発明による組成物によって治療することができる状態として、限定されないが、神経性疼痛、片頭痛又は他の頭痛、過活動膀胱、鼻炎、副鼻腔炎、ざ瘡、ジストニア、ジストニア収縮（主観的であっても臨床的であっても）、多汗症（主観的であっても臨床的であっても）、及びコリン作動性神経系によって制御される１又は２以上の腺の過分泌が挙げられる。本発明の組成物はまた、免疫応答を低下若しくは増強するために、又は注射によるボツリヌス毒素の投与が提案若しくは実施されたその他の状態を治療するために使用することもできる。

最も好ましくは、組成物は、医師又は他の健康管理専門家によって、又はこれらの指導の下で投与される。組成物は、単回治療において、又は経時的に一連の治療において投与することができる。好ましい実施形態では、本発明による組成物は、ボツリヌス毒素に関連する効果が望まれるある位置で又は複数の位置で注射される。その性質のために、ボツリヌス毒素は、いずれの有害な結果又は望まれない結果も生じることなく、所望の結果を生じる量、適用割合、及び頻度で投与されることが好ましい。例えば、ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、皮膚表面１ｃｍ^２当たり、約１Ｕ〜約２０，０００Ｕ、より好ましくは約１Ｕ〜約１０，０００Ｕのボツリヌス毒素の割合で適用される。こういった範囲内でより高い投与量を、例えば、本明細書に記載されるように、ボツリヌス毒素を制御放出物質と併せて投与する状況において用いることができる。ある特定の実施形態では、本発明のボツリヌス毒素製剤は、ボツリヌス毒素を、注射１回当たり１Ｕ〜４００Ｕ、好ましくは１０Ｕ〜３００Ｕ、好ましくは１０Ｕ〜３５０Ｕ、好ましくは３０Ｕ〜２５０Ｕ、好ましくは５０Ｕ〜２００Ｕ供給するように投与される。他の好ましい実施形態では、本発明のボツリヌス毒素含有組成物は、１０Ｕ〜１００Ｕ、若しくは２０Ｕ〜１００Ｕ、若しくは２０Ｕ〜８０Ｕ、若しくは２０Ｕ〜６０Ｕ、又は少なくとも２０Ｕ、少なくとも４０Ｕ、若しくは少なくとも６０Ｕ、又は１０Ｕ、２０Ｕ、３０Ｕ、４０Ｕ、５０Ｕ、６０Ｕ、７０Ｕ、８０Ｕ、９０Ｕ、若しくは１００Ｕのボツリヌス毒素、好ましくは血清型Ａのボツリヌス毒素、又は分子量１５０ｋＤａを有する血清型Ａのボツリヌス毒素を、治療を受けている対象に供給するように注射で投与される。複数の実施形態では、本発明の組成物の有効用量による単回治療によって、ボツリヌス毒素によって治療可能な適応症の向けの治療、例えば、しわ、しわ線及び溝の治療のコース中、対象が、回数の少ない注射で、おそらくは単回注射のみで、又は単回治療セッション中の一連の注射で済むように、延長された時間にわたって、例えば、少なくとも６ヶ月若しくは６ヶ月超、すなわち、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、又は１０ヶ月を含めてより長く持続する長期間の効果が、付随効果とともに得られる。治療のゴール又は効果を維持するために複数の治療を使用している場合、作用の持続時間がより長いことによって、治療と治療の間のより長い間隔又は期間が提供される。一実施形態では、例えば、合間を含めて、少なくとも６ヶ月又は７、８、９、若しくは１０ヶ月などの６ヶ月超、ボツリヌス毒素を２０Ｕ〜１００Ｕ、若しくは２０Ｕ〜６０Ｕ、又は２０Ｕ、４０Ｕ、若しくは６０Ｕ供給する本発明の組成物を使用する、個体への投与後の、又はそれらの投薬後の組成物の効果のより長い持続時間は、本発明による正に帯電した担体（又はペプチド）を含有していないボツリヌス毒素含有組成物又は製品の効果の持続時間と相対的である。場合によっては、本発明の正に帯電した担体（又はペプチド）無しのボツリヌス毒素含有組成物又は製品は、３ヶ月又は４ヶ月などの６ヶ月未満の間有効である。

ある特定の実施形態では、ボツリヌス毒素と、本明細書に記載の、共有結合で結合し正に帯電した１又は２以上の効率基を有する正に帯電したポリマー骨格を含む正に帯電した担体とを含む、本発明の組成物を、特に顔面のしわ、しわ線、又は溝の治療のために、１回の注射当たりボツリヌス毒素を２０Ｕ〜６０Ｕ、又は少なくとも２０Ｕ〜少なくとも６０Ｕ供給する量で又は用量にて、それを必要とする対象又は患者に単回注射として投与する。本発明によれば、対象又は患者の治療における単回注射後に、治療効果が、すなわち、眉間のしわ線などの、しわ、しわ線、又は溝の低減が、数週間又は数ヶ月間、例えば、少なくとも２０週間、少なくとも２４週間、又は少なくとも６ヶ月間若しくは６ヶ月超、すなわち、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、若しくは１０ヶ月、或いはより長く、持続する。複数の実施形態では、ボツリヌス毒素は血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、又はＧである。一実施形態では、ボツリヌス毒素は血清型Ａである。一実施形態では、血清型Ａのボツリヌス毒素は分子量１５０ｋＤａを有する。一実施形態では、上に記載のように血清型Ａのボツリヌス毒素はより高分子量の複合体の形態である。好ましい実施形態では、１５０ｋＤａボツリヌス毒素又は毒素のより高分子量の形態はアルブミンフリー製剤である。一実施形態では、正に帯電したポリマー骨格はポリリジン又はポリエチレンイミンである。一実施形態では、正に帯電した１又は２以上の効率基は−（ｇｌｙ）_ｎ１−（ａｒｇ）_ｎ２を含み、ここで、下付き文字ｎ１は、０〜２０、より好ましくは０〜８、さらにより好ましくは２〜５の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立して、約５〜約２５、より好ましくは約７〜約１７、最も好ましくは約７〜約１３の奇整数である。一部の実施形態では、正に帯電した１又は２以上の効率基は、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）_ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑ、（ｇｌｙ）_ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑ又は（ｇｌｙ）_ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑを有する。ある特定の好ましい実施形態では、ｐは１でありかつｑは０であり、又はｐは０でありかつｑは１である。他の好ましい実施形態では、下付き文字ｐ及びｑはそれぞれ独立して、０〜８、より好ましくは０〜５の整数である。特定の一実施形態では、正に帯電した担体は、アミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）_１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する。他の実施形態では、正に帯電した１又は２以上の効率基は、効率基、例えばアミノ酸配列のＣ末端若しくはＮ末端のいずれかを介して正に帯電した骨格に結合している。一部の実施形態では、正に帯電した１又は２以上の効率基は、正に帯電した担体の正に帯電したポリリジン骨格のいずれかの末端、又は両端に結合している。特定の実施形態では、正に帯電した骨格はポリリジンであり、ボツリヌス毒素は血清型Ａである。別の特定の実施形態では、血清型Ａのボツリヌス毒素は分子量１５０ｋＤａを有し、正に帯電した骨格はポリリジンであり、共有結合で結合し正に帯電した１又は２以上の効率基は、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるか、又はそれぞれ独立して上に記載の値である、アミノ酸配列（ｇｌｙ）_ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑ、（ｇｌｙ）_ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑ又は（ｇｌｙ）_ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）_ｑを有し、或いは正に帯電した担体はアミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）_１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する。複数の実施形態では、１回の注射当たり、ボツリヌス毒素を２０Ｕ若しくは少なくとも２０Ｕ；３０Ｕ若しくは少なくとも３０Ｕ；４０Ｕ若しくは少なくとも４０Ｕ；５０Ｕ若しくは少なくとも５０Ｕ；６０Ｕ若しくは少なくとも６０Ｕ；７０Ｕ若しくは少なくとも７０Ｕ；８０Ｕ若しくは少なくとも８０Ｕ；９０Ｕ若しくは少なくとも９０Ｕ；又は１００Ｕ若しくは少なくとも１００Ｕ供給する量又は用量で、組成物は注射により投与される。前述の量又は用量の間の量又は用量も、例えば、２５Ｕ若しくは少なくとも２５Ｕ；３５Ｕ若しくは少なくとも３５Ｕ；４５Ｕ若しくは少なくとも４５Ｕ等も、企図されている。特定の実施形態では、組成物は、ボツリヌス毒素を２０Ｕ；４０Ｕ；又は６０Ｕ供給する量で単回治療用量として注射により投与され、応答又は効果が、例えば、眉間のしわ線などのしわ及び顔面のしわ線の低減が、長い持続時間、例えば、少なくとも２０週、少なくとも２４週、例えば、６、７、８、９若しくは１０ヶ月、又はより長くなどの、少なくとも６ヶ月又は６ヶ月超、実現かつ維持される。特定の一実施形態では、記載の正に帯電した担体と４０Ｕの投与量で１５０ｋＤａボツリヌス毒素Ａとを含有する本発明の一組成物の単回用量によって、眉間のしわ線の治療において長期間の効果が、例えば少なくとも６ヶ月間、可能性としてより長い間、もたらされる。例えば、図４Ｂを参照されたい。

限定することを望むものではないが、治療のコースにおいて、本発明の組成物は、本明細書に記載の本発明の組成物及び方法に関する治療的有効用量又は美容的有効用量によって得られる効果の延長された持続時間に基づいて、最初の治療用量後に頻度の少ない間隔で投与することができる。例えば、本発明の組成物は、本発明の方法の実施によって、１年当たり約２回（約６ヶ月毎）、又は７ヶ月毎に、８ヶ月毎に、９ヶ月毎に、若しくは１０ヶ月毎に、或いはより長期毎に、必要とする対象に投与（又は投薬）することができる。特定の一実施形態では、個体は本発明の一組成物の一用量を１年当たり２回投与される。用量と用量の間の中央持続時間は、治療処置又は美容的治療及び／又は治療を受ける個体によって決定される治療に対する要望に応じて、６ヶ月、少なくとも６ヶ月、又は６ヶ月超とすることができる。したがって、本発明の組成物での個体の投薬は、１年に２回又は１年に２回より長期で、例えば、初回用量後、６ヶ月毎に、７ヶ月毎に、８ヶ月毎に、９ヶ月毎に、又は１０ヶ月毎に、行うことができる。本発明の一組成物は、組成物中ボツリヌス毒素を２０Ｕ〜１００Ｕ、より好ましくは、２０Ｕ〜６０Ｕ、より好ましくは、２０Ｕ、４０Ｕ、又は６０Ｕで、適切な間隔で投薬することができる。

本発明は、皮膚を通して、本明細書に記載のボツリヌス毒素含有組成物を注射するための、様々な送達デバイスの使用も企図する。そのようなデバイスには、限定されないが、針及びシリンジを挙げることができ、又は、組成物を調剤し、組成物の調剤をモニターし、任意で、１又は２以上の態様において対象の状態をモニターする（例えば、調剤される物質に対する対象の反応をモニターすること）ことができる、より高度なデバイスが含まれてもよい。

一部の実施形態では、組成物は、予め製剤化し、及び／又はそのようにして送達デバイス内に予め取り付けることができる。本発明は、組成物が、残りの成分から１又は２以上の成分を、別個に格納するキットで提供される、実施形態も企図する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、適用時又は適用前に混合するために、ボツリヌス毒素及び正に帯電した担体を、別個に格納するキットを提供する。正に帯電した担体の量、又はこれらの分子とボツリヌス毒素の濃度比は、対象とする組成物において使用するのにどの担体が選択されるかに依存する。所与の場合における担体分子の適切な量又は比は、例えば、以下に記載のものなどの１又は２以上の実験を行うことによって、容易に決定することができる。

全体的に、本発明はまた、ボツリヌス毒素（或いは、ボツリヌス毒素複合体又は低ボツリヌス毒素複合体として）を、その必要のある対象又は患者に投与するための方法も企図し、この場合、本明細書に記載されるように、有効量のボツリヌス毒素が正に帯電した担体と併せて投与される。「と併せて」とは、２つの成分（ボツリヌス毒素及び正に帯電した担体）が、組合せの手順で投与されることを意味し、２つの成分が一緒に作用して、有効量の治療用タンパク質に関して必要とされる送達が提供されるように、この手順は、対象に投与する前にこれらを組み合わせるステップを含んでもよいし、これらを別々に投与するステップを含んでもよい。例えば、正に帯電した担体を含有する組成物を対象の皮膚に最初に投与し、その後、ボツリヌス毒素を含有する皮膚パッチ、シリンジ、又は他のデバイスを適用することができる。ボツリヌス毒素は、シリンジ又は他の調剤デバイス内に乾燥形態で格納することができ、そして、正に帯電した担体を注射し、その後毒素を適用することができ、その結果、２つが一緒に作用し、所望の組織浸透の増強がもたらされる。したがって、その意味で、２つの物質（正に帯電した担体及びボツリヌス毒素）は、組合せで作用し、又はおそらく相互作用して、インサイチュで組成物又は組合せを形成する。したがって、本発明はまた、ボツリヌス毒素を調剤するためのデバイスと、正に帯電した担体を含有するとともに、対象の皮膚又は標的組織に注射するのに適した液体、ゲル等とを有するキットも含む。健康管理専門家の指示下で、又は患者若しくは対象によっていずれかで、本発明の組成物を投与するためのキットは、その目的に適した特注のアプリケーターも含むことができる。

本発明の組成物は、約４．５〜約６．３の範囲のｐＨを有する生理学的環境で使用するのに適しており、したがって、そのようなｐＨを有することができる。しかし、約４．５〜約７．５の範囲のｐＨを有する組成物も本明細書に記載の本発明によって包含される。本発明による組成物は、室温で又は冷蔵条件下のいずれかで貯蔵することができる。

一部の実施形態では、治療される患者は、６５歳、少なくとも６５歳、又は６５歳超である。例えば、患者は、６５、６６、６８、７０、７５、８０歳、又はこれより年長であってもよい。

本明細書に記載する以下の実施例及び実施形態は、例示のためのものに過ぎず、それらに照らした多様な改変形態又は変化形態が当業者に示唆され、それらは本出願及び添付の特許請求の範囲の精神及び趣旨の内に含まれるものとすることが理解される。

本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
［実施例］

マウスモデルにおける局所筋麻痺の持続時間
本実施例では、ＲＴ００３又はＢＯＴＯＸ（登録商標）のいずれかを注射されたマウスにおける局所筋麻痺の持続時間を比較する。ＲＴ００３は、Ａ型ボツリヌス毒素（内因性非毒素タンパク質を全て除去するため精製済み）及び配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）_１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する正に帯電した担体を含む、本発明による例示的な注射用製剤である。ＢＯＴＯＸ（登録商標）もＡ型ボツリヌス毒素を含むが、Ａ型ボツリヌス毒素分子を安定化するため外因性アルブミンが添加されている。

筋麻痺は、Aoki, K.R.により"A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice", Toxicon 2001;39(12):1815-1820で報告された指外転スコア（ＤＡＳ）アッセイを使用して測定した。ＤＡＳアッセイでは、マウスが後肢を伸長させ後肢の指を外転させる特有の驚愕反応を引き起こすように、マウスを尾で短時間吊るす。マウスがどの程度この驚愕反応を示すことができるかを５ポイントスケール（０〜４）でスコア化し、ゼロは正常な驚愕反応を表し、４は指の外転及び脚の伸長が最大限低下したことを表す。スコア化は、対象マウスがどの程度神経毒で処置されたかを知らない観察者が行う。ＤＡＳアッセイを使用したベースラインスコアは、未処置の動物集団での０．４に決定した。

本実施例で報告される研究には、動物１０匹（ＲＴ００３群のマウス５匹及びＢＯＴＯＸ（登録商標）群のマウス５匹）が関与した。動物それぞれに、各ボツリヌス毒素製剤（すなわち、ＲＴ００３又はＢＯＴＯＸ（登録商標））を各投薬間の期間を４０日として３回注射した。注射後、各被検群の動物全てがＤＡＳアッセイの０．４ベースラインを超えた日数を計数した。図１に示す結果は、ＲＴ００３で処置した群のＤＡＳアッセイスコアが、１回目、２回目、及び３回目の処置後にそれぞれ２５、２２、及び２１日間０．４ベースライン値を超え続けたことを示している。対照的に、ＢＯＴＯＸ（登録商標）で処置した群のＤＡＳアッセイスコアは、１回目、２回目、及び３回目の処置後にそれぞれ１１、８、及び１１日間０．４ベースライン値を超え続けた。

これらのＤＡＳアッセイデータは、ＲＴ００３製剤により引き起こされる局所筋麻痺が、ＢＯＴＯＸ（登録商標）により引き起こされる局所筋麻痺より約２倍長く持続することを示している。この結果は、本発明によるＲＴ００３及びその他の注射用ボツリヌス毒素を含む化合物を治療で使用することについて重要な意味合いを有する。特に、本発明による注射用組成物を使用することで、ボツリヌス毒素により引き起こされる特定の美容効果又は治療効果を維持するのに必要なフォローアップ注射の頻度を顕著に減少させることができる。すると、施用頻度の減少により、対象においてボツリヌス毒素に対する抗体が生じにくくなるため、より良好な長期的有効性がもたらされる。

安全性プロファイルが改善された注射用ボツリヌス毒素製剤
最近の数十年の間に、ボツリヌス毒素にはしわ、多汗症、及び筋痙攣を含む様々な状態を治療するための治療剤としての用途が見出されてきた。しかし、ボツリヌス毒素はヒトが知る天然に存在する最も強力な毒素であるため、毒素の不適切な投与は極めて危険となり得る。例えば、ボツリヌス毒素が偶発的に全身へ送達されると、麻痺、呼吸困難、及び死亡にまでつながるおそれがある。さらに、ボツリヌス毒素が治療処置の一環として体の局所領域に適切に送達されたとしても、毒素は時間が経つと拡散するという天然の傾向を有し、それにより体のその他の部分における望ましくない麻痺のリスクが増大する。例えば、しわを治療するため、目の周囲にボツリヌス毒素を注射すると、眼瞼の運動を制御する筋肉にボツリヌス毒素が拡散し得る。これが起こると、眼瞼の筋肉が部分的に麻痺し、眼瞼が部分的に閉じて正常な視野を妨げる、「眼瞼下垂」として知られる周知の状態となるおそれがある。

本発明の一態様は、現在入手可能な市販のボツリヌス毒素製剤と比較して安全性プロファイルが改善された注射用ボツリヌス毒素製剤を提供することである。好ましい実施形態では、注射用ボツリヌス毒素製剤で注射後に拡散する傾向が減少している。このようにして、本発明のある特定の好ましい製剤により、ボツリヌス毒素のより正確な送達が可能となり、ボツリヌス毒素の制御されない局所拡散に関連する望ましくない副作用が劇的に低減される。

本実施例では、各種製剤中のボツリヌス毒素が注射後に拡散する傾向についての比較研究を報告する。研究には、３種のボツリヌス毒素製剤：（１）ＢＯＴＯＸ（登録商標）；（２）ＲＴ００３、式ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）_１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する正に帯電した担体と非共有結合で会合した１５０ｋＤ Ａ型ボツリヌス毒素分子を含む、緩衝化及び安定化された溶液；並びに（３）ＲＴ００３に存在する正に帯電した担体を含まないことを除いてＲＴ００３製剤と同一である、ＲＴＴ１５０が関与した。

研究に使用するマウスそれぞれの腓腹筋に、上述のボツリヌス毒素製剤のうち１つを筋肉の正中線外側部分（図２Ａ）、又は筋肉の正中線部分（図２Ｂ）のいずれかに注射した。ボツリヌス毒素注射後４日間、マウスそれぞれにＤＡＳアッセイを実施し、各製剤のボツリヌス毒素がマウスの腓腹筋から後肢へ拡散する傾向を示すかどうかを決定した。ＤＡＳアッセイから、被検動物の、後肢の指を外転させるいかなる能力の低下をボツリヌス毒素拡散の兆候と解釈した。

図３は、被検動物に上記の様々なボツリヌス毒素製剤を注射した後に実施されたＤＡＳアッセイの結果を示す。指外転スコアが、注射が腓腹筋の正中線部分になされるか正中線外側部分になされるかに対応する２つのクラスターに分類されることに留意されたい。正中線外側への注射におけるＤＡＳスコアと比較して、正中線への注射におけるＤＡＳスコアが概してより小さいことから、被検動物の後肢での麻痺の程度が正中線への注射後では概してより小さいことが示される。理論に限定されることを望むものではないが、この挙動は、正中線外側への注射と比較して、正中線への注射後では被検動物の後肢の指に到達するためにボツリヌス毒素が移動しなければならない距離がより大きいことから生じると考えられる。この、ボツリヌス毒素にとって必要な移動距離がより大きいことにより、後肢の指が麻痺する可能性が低下すると考えられる。

図３は、ＲＴ００３製剤の正中線への注射後４日間全てで指外転スコアゼロを示す。この結果は、ＲＴ００３製剤中のボツリヌス毒素が、注射すると腓腹筋の正中線部分に局在化したままとなり、実験の時間スケールでは、麻痺の原因となる拡散が発生しないことを示している。一方、ＲＴＴ１５０及びＢＯＴＯＸ（登録商標）製剤の注射後には０．４ＤＡＳベースラインを超える指外転スコアが観察され、平均ＤＡＳスコアはＢＯＴＯＸ（登録商標）製剤でより大きい。ＲＴＴ１５０及びＢＯＴＯＸ（登録商標）製剤でのＤＡＳ結果は、これらの製剤を正中線へ注射した後に被検動物の後肢の指の麻痺が観察され、ＢＯＴＯＸ（登録商標）製剤の注射後ではより大きい程度の麻痺が観察されたことを示している。これらのデータは、ＲＴＴ１５０及びＢＯＴＯＸ（登録商標）製剤中のボツリヌス毒素分子が注射後に局所的に拡散することができ、ＢＯＴＯＸ（登録商標）製剤中のボツリヌス毒素分子では局所拡散の程度がより大きいことを示唆している。

図３は、特定のボツリヌス毒素製剤に関係なく、正中線外側への注射後には全ての被検動物で後肢の指の麻痺が観察されることも示している。上記の通り、この、正中線への注射と比較して正中線外側への注射後では麻痺の程度がより大きいことは、ボツリヌス毒素が被検動物の後肢へ移動する距離がより短いことに関連すると考えられる。しかし、正中線外側への注射後には３種のボツリヌス毒素製剤全てが麻痺を引き起こす拡散を示すが、実験の時間スケール中では、ＲＴ００３を注射した被検動物での麻痺の程度は、平均すると、ＲＴＴ１５０及びＢＯＴＯＸ（登録商標）製剤で観察された麻痺の程度よりも小さい。したがって、ＲＴＴ１５０及びＢＯＴＯＸ（登録商標）と比較してＲＴ００３製剤ではボツリヌス毒素の局所拡散傾向の減少を示すという点において、正中線外側への注射に対応するＤＡＳアッセイデータは、正中線への注射でのＤＡＳアッセイデータと質的に類似している。

正中線への注射及び正中線外側への注射後の局所拡散速度の比較は、方程式（１）：

により定義される「拡散指数」と呼ばれるパラメータを検討することで行うことができる。指外転スコアは０〜４の範囲をとることができ、正中線外側指外転スコアは正中線指外転スコアより高いと予想される（上記の通り）ため、拡散指数値は通常、０〜１００の範囲をとることになる。１００に近い拡散指数値は、正中線及び正中線外側指外転スコアの比が均一に近いことを示す。これは、注射後の拡散速度が十分に速く、正中線及び正中線外側への注射後にボツリヌス毒素が被検動物の後肢の指に到達してこれを麻痺させる拡散時間が、同等であるかほぼ同じとなる場合に発生し得る。その一方で、ゼロに近い拡散指数値は、正中線及び正中線外側指外転スコアの比がゼロに近いことを示す。これは、たとえ正中線外側への注射後に麻痺が観察されたとしても、正中線への注射後のボツリヌス毒素の拡散が非常に小さく、被検動物の後肢の指に麻痺を引き起こすのに不十分である場合に発生し得る。

以下の表１は、図３に対応する実験で報告したように、ＢＯＴＯＸ（登録商標）、ＲＴ００３、及びＲＴＴ１５０を正中線又は正中線外側へ注射した後の指外転スコアを使用して算出した拡散指数値を示す。実験の時間スケールでは、ＢＯＴＯＸ（登録商標）製剤の注射に対応する拡散指数値は、ＲＴＴ１５０及びＲＴ００３製剤で観察された値より高い。このことは、ＲＴＴ１５０及びＲＴ００３製剤で観察された比と比較して、ＢＯＴＯＸ（登録商標）製剤の注射では、正中線及び正中線外側指外転スコアの比が均一により近いことを示している。正中線への注射後に、ボツリヌス毒素は被検動物の後肢の指の麻痺を引き起こすようにさらに拡散するはずであるため、ＢＯＴＯＸ（登録商標）注射後の正中線及び正中線外側指外転スコアの比が均一により近いという観察は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）を正中線へ注射した後のボツリヌス毒素拡散速度が、正中線外側へ注射した後の速度と相当に実質的な関連があることを示唆している。言い換えれば、正中線への注射に関連して拡散経路の長さが増加することは、後肢の指の麻痺を引き起こすことを妨げる障壁というほどのものではない。

対照的に、ＲＴ００３の拡散指数値は、実験の４日間の時間スケールでは全てゼロである。この結果は、ＲＴ００３の正中線への注射後には、麻痺を誘導する拡散が観察されないことを示している。言い換えれば、正に帯電した担体と非共有結合で会合したＡ型ボツリヌス毒素分子を含むＲＴ００３製剤により、注射されたＡ型ボツリヌス毒素の局在性を増強することが可能となる。このようにして、ＲＴ００３製剤は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）製剤と比較して改善された安全性プロファイルをもたらし、望ましくない麻痺を最小限にする。

ＲＴＴ１５０で観察された拡散指数値は、ＲＴ００３の場合のようにゼロではないものの、ＢＯＴＯＸ（登録商標）製剤で観察されたものよりは小さい。表１を参照。この結果は、実験の４日間の時間スケールで、観察可能な後肢の指の麻痺を生じさせるのに十分なボツリヌス毒素拡散が発生するが、麻痺を引き起こすボツリヌス毒素拡散に必要な時間は正中線への注射後比較的長いということを示している。

抗体を生成する傾向が減少した注射用ボツリヌス毒素製剤
しわなどの望ましくない状態を治療するためにボツリヌス毒素を定期的に患者に注射すると、ボツリヌス毒素の効果の持続時間が同じままであるにもかかわらず、連続的な注射によりボツリヌス毒素の有効性が減少することがしばしば観察される。この現象は、患者の免疫系によりボツリヌス毒素に対する抗体が形成された結果であると考えられる。治療観点からいえば、同じ効果を実現するのに次第に大きな用量のボツリヌス毒素が必要となり、安全性及び費用の両方に関連する深刻な問題を引き起こすため、患者によるボツリヌス毒素に対する抗体の形成は望ましくない。

ある特定の実施形態において、本発明は、現在入手可能な市販の注射用ボツリヌス毒素製剤と比較して、抗体形成を誘導する傾向が減少した注射用ボツリヌス毒素製剤を提供する。したがってこれらの実施形態で、ボツリヌス毒素製剤は、長い時間の間で同じ効果を実現するのにより少ない毒素の使用を可能にすることにより、ボツリヌス毒素注射に関連するリスクを最小限にする一助となる。

本実施例では、実施例２に記載されるように、ＲＴ００３及びＢＯＴＯＸ（登録商標）の反復注射後に得られたＤＡＳアッセイデータを時間に応じて解析し、同じ被検動物に反復投与するとこれらの２種の製剤の有効性がどのように変化するかを決定する。概して、いずれの製剤の反復投与後でも、ボツリヌス毒素に関連する効果の持続時間は同じであった。しかし、反復投与した際の筋麻痺の程度は製剤によって変動した。筋麻痺の程度の変化を定量化するため、ＲＴ００３又はＢＯＴＯＸ（登録商標）のいずれかを注射した後の指外転スコアのパーセント変化を、方程式（２）：

に従って決定した。

方程式（２）の分子はｎ回目及び１回目の処置で測定された指外転スコアの差であるため、ｎ回目の処置で測定された指外転スコアが１回目の処置で測定された指外転スコア未満である場合、ＤＡＳのパーセント変化は負となることになる。言い換えれば、１回目の処置と比較してｎ回目の処置後により小さい麻痺が観察されれば、ＤＡＳのパーセント変化は負となる。表２は、実施例２に記載される手順に従って、ＲＴ００３及びＢＯＴＯＸ（登録商標）製剤の反復投与後に測定されたＤＡＳ値のパーセント変化を示す。

表２に示すように、１回目の再処置後、ＢＯＴＯＸ（登録商標）製剤で指外転スコアのパーセント変化は−４４％となり、有効性が実質的に降下したことを示唆している。対照的に、ＲＴ００３製剤での指外転スコアのパーセント変化はゼロとなり、２回目の再処置後のＤＡＳスコアが最初の投与後及び１回目の再処置後と同じであったことを示している。この結果は、ＲＴ００３の１回目の再処置後に観察された麻痺の程度が１回目の処置後の麻痺の程度と同じであり、１回目の再処置後でも、被検動物で中和抗体の形成がごくわずかしか発生しなかったことを示している。ＲＴ００３及びＢＯＴＯＸ（登録商標）の２回目の再処置後、ＤＡＳ値の算出されたパーセント変化は両製剤で負となったが、ＲＴ００３製剤でのＤＡＳ値のパーセント変化の大きさはＢＯＴＯＸ（登録商標）で決定された値の半分であった。ＢＯＴＯＸ（登録商標）で観察されたＤＡＳ値のより大きな負のパーセント変化は、被検動物で、ＲＴ００３と比較してＢＯＴＯＸ（登録商標）に対する抗体の生成速度がより大きかったことを示唆している。したがって、ＲＴ００３などの、本発明により企図される製剤は、ボツリヌス毒素の効果を中和する抗体の形成を誘導する傾向がより小さい可能性があることをこれらのデータは示している。したがって、この結果は、本発明により企図される製剤を使用することにより、長い時間の間で、同じ治療効果を実現するのにより少ないボツリヌス毒素を使用できることを示唆している。

安定性が改善された注射用ボツリヌス毒素製剤
この実施例では、本発明の注射用ボツリヌス毒素製剤に使用される正に帯電した担体分子が、製剤の安全性プロファイルを増強する（実施例２）だけでなく、製剤の安定性も改善することを実証する。表３は、ＲＴ００３及びＲＴＴ１５０製剤を、４℃（ＲＴ００３のみ）及び４０℃（ＲＴ００３及びＲＴＴ１５０両方）で各種期間エージングするエージング実験の結果を示す。特定の温度で特定の時間エージングした後、一連のマウスＩＰ ＬＤ_５０アッセイによりＲＴ００３及びＲＴＴ１５０製剤の効力を測定した。表３に要約される結果は、ＲＴ００３の効力が、４℃でエージングした後、６ヶ月後でも本質的に変化していないことを示している。さらに、マウスＩＰ ＬＤ_５０アッセイで、製剤の標的動物を死滅させる能力によって測定したところ、ＲＴ００３製剤の効力は、ＲＴ００３製剤を温度上昇下で（４０℃）で６ヶ月間エージングした場合であってもわずかに減少するのみである。一方、ＲＴＴ１５０製剤は、４０℃でわずか１ヶ月間エージングした後に効力の顕著な低下を示した。ＲＴ００３製剤が、式ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）_１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する正に帯電した担体分子も含むことを除いてＲＴ００３及びＲＴＴ１５０製剤は同一であるため、これらのデータは、正に帯電した担体分子によりＲＴ００３製剤中のボツリヌス毒素の安定性が改善されることを示している。

眉間のしわ線の治療において長く続く持続時間の効果を示す注射用ボツリヌス毒素製剤
本実施例では、ボツリヌス毒素Ａ、及び１又は２以上の正に帯電した効率基が共有結合している正に帯電したポリリジンポリペプチドを含む正に帯電した担体を含む、ＲＴ００２と呼ばれる本発明の注射用組成物の安全性、有効性及び効果の持続時間を評価するための、臨床試験及び２４週目の結果についての中間解析について記載する。ＲＴ００２製品は、式ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）_１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する正に帯電した担体ペプチドと共有結合で会合していない１５０ｋＤサブタイプＡボツリヌス毒素分子を含み、アクセサリータンパク質又は動物由来の成分を含まない注射用製剤であり、中等度〜重度の眉間のしわ線の治療のための研究に使用される。

臨床試験は、成人の眉間のしわ線の外見を一時的に改善するための、ＲＴ００２の注射による単回（一回限りの）治療の、安全性及び有効性及び効果の持続時間を評価するため設計及び実施された、第２相無作為化二重盲検用量範囲探索実薬及びプラセボ対照多施設試験であった。３種の用量２０Ｕ、４０Ｕ及び６０ＵのＲＴ００２を、実薬、すなわち、ＶＩＳＴＡＢＥＬ（登録商標）／ＢＯＴＯＸ（登録商標）（筋肉内注射で用量２０Ｕ）、及びプラセボ対照（筋肉内注射）と比較して評価した。注射治療は単回の筋肉内注射であった。ＶＩＳＴＡＢＥＬ（登録商標）／ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃに対する、３種の投与量レベルのＲＴ００２による単回治療の効果の持続時間も評価した。

ＲＴ００２製品は、ＲＴＴ１５０と呼ばれる精製済み１５０ｋＤａボツリヌス神経毒から構成され、凍結乾燥粉末として製剤化される。非臨床試験で、ＲＴ００２はその他の形態のボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴＡ）よりも小さい拡散を示すことが示されており、近隣の筋肉への毒素の遠隔分散に起因する副作用が小さいことにより標的部位での効果をよりよく制御することができる。さらに、ＲＴ００２添加剤不含Ａ型ボツリヌス毒素製剤は、製剤に存在する非活性タンパク質が存在しないことにより、より小さい免疫原性をもたらすという能力を有する。さらに、ＲＴ００２は、ラットでの最大５０Ｕ／ｋｇの反復用量筋肉内投与後の忍容性が良好であった。

投薬レジメン及び注射技術：本試験でのＲＴ００２の投薬レジメンは、ＲＴ００２（２０Ｕ、４０Ｕ、又は６０Ｕ）、プラセボ、又はＶＩＳＴＡＢＥＬ（登録商標）／ＢＯＴＯＸ（登録商標）のいずれかの単回治療であり、これらが、治療を受ける対象の額の眉間の注射部位５カ所それぞれへの筋肉内注射０．１ｍＬ（合計０．５ｍＬ）として、対象１人当たり２０Ｕで投薬された。治療は全て、熟練した医師により投与される筋肉内注射であった。より具体的には、試験の対象は、５カ所の注射部位：各皺眉筋への注射２回、及び鼻根筋への注射１回、への、注射１回当たり０．１ｍＬの単回治療を受けた。治験責任医師、現場スタッフ、対象、及びスポンサーは治療群の割付けに対して盲検化されていた。エントリー時に中等度〜重度の眉間のしわ線を有する、３０〜６５歳で全身の健康が良好な成人約２５０名の女性及び男性対象を試験に登録した。

眉間の顔面しわ線は、顔面において水平方向の皺鼻筋及び垂直方向の鼻根筋から生じる。これらは、患者に最大限顔をしかめてもらっている間に、筋肉のかたまりを触診することにより容易に特定できる。皺鼻筋は皮膚をくぼませ、緊張した筋肉の隆起に取り囲まれた垂直方向のしわ線、すなわち溝（すなわち、しかめ面に伴うしわ線（frown line））を作り出す。筋肉の位置、サイズ及び使用は個人間で著しく異なるため、注射用ボツリヌス毒素を投与する医師は、関係する領域の関連する解剖学的構造、及び事前の外科的手法による解剖学的構造の変化を理解していなければならない。眼瞼下垂のリスクを低減させるため、以下のステップが最適に実施される：（ｉ）特に、大きな眉毛下制筋を有する患者には、上眼瞼挙筋、又はその付近への注射は回避すべきである；（ii）内側皺鼻筋（medial corrugator）への注射は、骨の眼窩上隆起の少なくとも１センチメートル上方にすべきである；（iii）注射される体積／用量を確実に正確にすべきである；（iv）毒素は、眉毛の中央の上方１センチメートルより近くに注射すべきでない。ボツリヌス毒素は、皮膚を通って根底にある筋肉に針を進める間、眼窩縁の上内側に指圧を加えることにより注射される。

試験では、対象の眉間のしわ線の重症度が、治験責任医師及び対象により評価された。治験責任医師の評価では、治験責任医師による包括的評価−顔面しわ重症度（ＩＧＡ−ＦＷＳ）格付けスコアシステムが以下の通り使用された：ＩＧＡ−ＦＷＳ格付けスコア（０）は顔面しわ重症度なしを示し、ＩＧＡ−ＦＷＳ格付けスコア（１）は軽度の顔面しわ重症度を示し、ＩＧＡ−ＦＷＳ格付けスコア（２）は中等度の顔面しわ重症度を示し、ＩＧＡ−ＦＷＳ格付けスコア（３）は重度の顔面しわ重症度を示した。当業者が理解するように、写真ガイドが、治験責任医師及び参照に使用されるしわ重症度のグレードを示す。

患者顔面しわ重症度（ＰＦＷＳ，Patient Facial Wrinkle Severity）評価：対象が自身の顔面しわ重症度を評価するのには、患者顔面しわ重症度（ＰＦＷＳ）が使用された。対象は、スクリーニング来診、治療来診（０日目）時の治療前、フォローアップ来診（２、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２週目）、及び試験終了来診（２４，２８，３２又は３６週目、必要に応じて）又は該当する場合には早期中止来診時の眉間のしわ線の重症度について評価するため、最大限顔をしかめた時の患者顔面しわ重症度（ＰＦＷＳ）を遂行した。供給される手鏡を使用して眉間のしわ線を精査する間記入するために、評価フォームは対象に直接提供された。ＰＦＷＳ格付けスコアシステムは以下の通りであった：ＰＦＷＳ格付けスコア（０）はしわ重症度なしを示し、「しわなし」という説明を伴い；ＰＦＷＳ格付けスコア（１）は軽度のしわ重症度を示し、「非常に浅いしわ」という説明を伴い；ＰＦＷＳ格付けスコア（２）は中等度のしわ重症度を示し、「中等度のしわ」という説明を伴い；ＰＦＷＳ格付けスコア（３）は重度のしわ重症度を示し、「深いしわ」という説明を伴う。試験に従って、対象が試験に登録されるには、対象の眉間のしわ線について、ＩＧＡ−ＦＷＳ及びＰＦＷＳ格付けで（２）中等度又は（３）重度が必要とされた。

対象を、以下の表４に提示する治療のうち１つに１：１：１：１：１で無作為化した。

試験に登録された対象は、スクリーニング及び治療来診、並びに最大３６週間の試験を通してフォローアップ安全性及び有効性評価を行った。治療応答の発現を記録するため、最初の２週間の期間中、対象日誌が提供された。対象は、試験１週目の電話で、並びに２、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２及び３６週目の来診中に評価された。対象は全て、治療後少なくとも２４週間追跡された。最大限顔をしかめた時の、対象の治験責任医師による包括的評価−顔面しわ重症度（ＩＧＡ−ＦＷＳ）スコアが２４週来診と３６週来診の間にベースラインに戻った場合、そのスコアが記録された来診がその対象にとっての試験終了来診とみなされた。

試験期間は、単回治療前の最大２週間のスクリーニング期間、及び治療後の最大３６週間のフォローアップ期間を含む、試験において最大３８週間であった。対象は全員、治療後少なくとも２４週間追跡された。スクリーニング来診、治療来診（０日目）時の治療前後（被検製品に対する即時反応があるかどうかを決定するため）、フォローアップ来診（２、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２週目）、及び試験終了来診（２４、２８、３２又は３６週目、必要に応じて）又は該当する場合には早期中止来診時に、注射部位が評価された。評価は注射部位５カ所の包括的な評価として行われ、対象によって記載される紅斑、浮腫、灼熱又は刺すような感覚、及びかゆみを評価した。

さらに、治療来診（０日目）時の治療前、フォローアップ来診（２、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２週目）及び試験終了来診（２４、２８、３２、又は３６週目、必要に応じて）又は該当する場合には早期中止来診時に、治験責任医師により脳神経II〜VIIが評価された。脳神経評価用のスコアは以下の通り取得された：格付け（１）は「正常」に相当し、格付け（２）は「臨床的に有意ではない異常」に相当し、格付け（３）は「臨床的に有意な異常」に相当し、格付け（４）は「評価せず」に相当した。これらの評価では、脳神経IIは視神経であり、脳神経IIIは動眼神経であり、脳神経IVは滑車神経であり、脳神経Ｖは三叉神経であり、脳神経VIは外転神経であり、脳神経VIIは顔面神経である。標的の筋系及び隣接している筋系を神経支配する顔面神経（VII）の共同運動及び４つの主要な枝について評価するため、Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｈｏｕｓｅ−Ｂｒａｃｋｍａｎｎ顔面神経格付けシステム（Yen、T.L. et al., 2003、Otol. Neurotol., 24(1):118-122）が設計された。治験責任医師は、治療来診（０日目）時の治療前、フォローアップ来診（２、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２週目）及び試験終了来診（２４、２８、３２、又は３６週目、必要に応じて）又は該当する場合には早期中止来診時に、顔面神経（VII）の機能性について評価した。

筋力評価のための医学研究評議会スケール（ＭＲＣ，Medical Research Council Scale for Assessment of Muscle Power）を使用して顔面筋力を評価した。ＭＲＣは、筋脱力を評価するのに有効な信頼に足るスケールであり、末梢神経損傷の検査に役立つ（Paternostro-Sluga、２００８）。顔面両側の眼輪筋（眼瞼）、水平方向の眉毛挙筋（brow elevator）、及び水平方向の頬骨輪筋（orbicularis zygomaticus muscle）が評価された。筋力評価のためのＭＲＣスケールでは、格付け（０）は「運動なし」に相当し、格付け（１）は「筋肉の知覚可能なぴくりとした動き（flicker）」に相当し、格付け（２）は「運動は重力のみによる」に相当し、格付け（３）は「重力に逆らって四肢を動かすことができる」に相当し、格付け（４）は「重力及び試験者が及ぼす抵抗力に逆らって動くことができる」に相当し、格付け（５）は「正常な力」に相当する。

治療来診（０日目）時の治療後、フォローアップ電話（１週目）、フォローアップ来診（２、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２週目）、及び試験終了来診（２４、２８、３２、又は３６週目、必要に応じて）又は該当する場合には早期中止来診時に、対象に対し毒素の遠隔分散についてのクエリーが実施された。さらに、これらと同じ時点で有害事象（ＡＥ，adverse event）についても評価された。限定されることを望むものではないが、ＡＥの例には、複視、眼瞼の麻痺、筋脱力、極度の疲労、並びに嚥下、呼吸及び発話困難が含まれる。

有効性評価は、眉間のしわ線の重症度及び眉間のしわ線の改善スケールについての治験責任医師による評価、対象の質問票を含む、眉間のしわ線の重症度及び改善についての対象による評価、並びに対象の日誌により評価される効果の発現を含んでいた。有効性評価は、座位の対象に対し実施された。評価中、目の位置取りを一定にするため、治験責任医師は対象に、検査室内の固定された点に焦点を合わせるよう求める。評価は、良好な天井の照明（検査用ライトは使用すべきでない）又は窓からの自然光（ただし直射日光ではない）を有する部屋で実施されるべきである。各来院時、眉間のしわ線の外見（最大限顔をしかめた時、及び最大限顔をしかめた後の休息時）が、適格な４ポイントのＩＧＡ−ＦＷＳスケール／顔面しわ重症度スコア用の格付けスコアを使用して、以下の通り治験責任医師により評価された：格付けスコア（０）は顔面しわなしに相当し、格付けスコア（１）は軽度の顔面しわに相当し、格付けスコア（２）は中等度の顔面しわに相当し、格付けスコア（３）は重度の顔面しわに相当した。評価は所与の各時点でのしわ重症度を表し、治療前レベルとの比較に基づくものではなかった。評価は同じ治験責任医師により、各来診時に１日の中で可能な限り同じ時間に最適に遂行された。治験責任医師間でしわ重症度の格付けを統一するために、しわ重症度のグレードを示す一連の訓練写真を治験責任医師の訓練に使用した。治験責任医師の評価を支援するため、各試験センターに写真ガイドも提供した。

患者包括的審美的改善スケール（ＧＡＩＳ，Global Aesthetic Improvement Scale）：治験責任医師及び対象は、以下の表５に示す７ポイントの重症度の患者包括的審美的改善スケール（ＧＡＩＳ）を使用して、ベースライン状態からの眉間のしわ線の外見（最大限顔をしかめた時、及び最大限顔をしかめた後の休息時）の改善について評価した。フォローアップ来診（２、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２週目）、及び試験終了来診（２４、２８、３２、又は３６週目、必要に応じて）又は該当する場合には早期中止来診時の、ベースライン状態からの眉間のしわ線の外見の改善について評価するため、試験の対象は、最大限顔をしかめた時、及び最大限顔をしかめた後の休息時の患者包括的審美的改善スケール（ＧＡＩＳ）を遂行した。ＧＡＩＳ評価フォームは、供給される手鏡を使用して治療を受けた領域を精査する間記入するように、対象に直接提供された。コンタクトレンズを用いる対象は、コンタクトを装着したままで眉間のしわ線を最適に見た。眼鏡をかけている対象は、可能であれば眼鏡なしで眉間のしわ線を見るように勧められた。対象が眉間のしわ線を見るのに眼鏡が必要であれば、評価のために眼鏡が装着された。対象による評価は、治験責任医師がＩＧＡ−ＦＷＳ評価を完了する前に完了された。

各来院時、対象は、患者による顔面しわ重症度の対象による評価のための以下の適格な４ポイントのスケールを使用して、眉間のしわ線の外見（最大限顔をしかめた時）を評価した（以下の表６）。評価フォームは、供給される手鏡を使用して眉間の治療領域を精査する間記入するように、対象に直接提供された。上記のＧＡＩＳ評価については、コンタクトレンズを用いる対象は、コンタクトを装着したままで眉間のしわ線を最適に見た。眼鏡をかけている対象は、可能であれば眼鏡なしで眉間のしわ線を見るように勧められた。対象が眉間のしわ線を見るのに眼鏡が必要であれば、評価のために眼鏡が装着された。対象による評価は、治験責任医師がＩＧＡ−ＦＷＳ評価を完了する前に完了された。評価は所与の各時点でのしわ重症度を表し、治療前の難点レベルとの比較に基づくものではなかった。評価は対象により、各来診時の可能な限り同じ時間に最適に遂行された。

試験中の、対象によるさらなる評価は、（治療来診（０日目）時に提供される）審美治療を選ぶ時の、効果の持続時間の重要性の格付け；治療結果に対する満足を格付けする質問票の形態での、治療結果に対する対象の満足についての格付け（４週目来診時）−対象には、顔面の治療を受けた領域の外見に対しどれくらい満足しているか又は不満であるかを尋ねた；及び治療効果の持続時間に対する満足の格付け（試験終了来診（２４、２８、３２、又は３６週目、必要に応じて）又は該当する場合には早期中止来診時）を含んでいた。

治療来診（０日目）時の治療前、フォローアップ来診（２、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２週目）、及び試験終了来診（２４、２８、３２、又は３６週目、必要に応じて）又は早期中止来診時に治療領域のデジタル写真が撮影された。デジタル写真は制御及び統一された様式で撮影された。参照写真及び適切な訓練を現場スタッフ及び治験責任医師に提供した。対象は最適に目又は顔用の化粧品を一切施していなかった。皮膚からの光の反射を最小限にするため、いかなる写真を撮影する前に皮脂を除去するように、治療を行った領域をアルコールパッドで拭いて乾燥させた。写真は、最大限顔をしかめた時、及び最大限顔をしかめた後の休息時の対象の正面像を含んでいた。

統計解析：統計プログラミング及び解析は全て、ＳＡＳバージョン９．３又はそれを超えるものを使用して実施した。本試験は、０．０５レベルで治療群間のいかなる統計的に有意な差を検出するように強化されたものではないため、下記の各種試験から得られたｐ値は統計上の傾向を確立すると予想される。検定の多重度について補正は行わなかった。人口統計学的特性及びベースライン特性を、治療企図（ＩＴＴ，intent-to-treat）、パープロトコル（ＰＰ，per-protocol）及び安全性集団についてまとめた。治療群ごとに、さらに治療群及び地域／国ごとに、全ての時点での全ての有効性変数について記述統計値を出した。有効性解析はＩＴＴ及びＰＰ集団で実施した。安全性解析は安全性集団で実施した。

集団：治療企図（ＩＴＴ）集団は無作為化され治療を受けた対象全員を含む。安全性集団は無作為化され、治療を受け、少なくとも１つの治療後安全性評価を提供した対象を全員含む。パープロトコル（ＰＰ）集団は、重大なプロトコル違反なしに２４週目の評価を完了したＩＴＴ集団の対象を含む。以下の理由のいずれかにより対象をＰＰ集団から除外した：（ｉ）対象が組入れ／除外基準に違反した、（ii）対象が２４週目の来診に来なかった、（iii）対象が禁止医薬品を使用した、（iv）対象の２４週目の来診が±５日でスケジュール通りでなかった（予定された来診日の変更が許可された場合以外）。

安全性群及び有効性比較において、対象を５つの治療群（ＲＴ００２ ２０Ｕ、ＲＴ００２ ４０Ｕ、ＲＴ００２ ６０Ｕ、プラセボ、実薬対照）に無作為化した。各ＲＴ００２用量と実薬対照、各ＲＴ００２用量とプラセボ、さらに実薬対照とプラセボ間で主要有効性比較を実施した。リスク対ベネフィット比を評価して、重要な試験評価における、実薬対照に対してＲＴ００２用量のうち少なくとも１つを支持する傾向について検査した（６ヶ月目でのレスポンダーの割合及び３６週まで測定された奏効期間；ＡＥの頻度）。

レスポンダーの割合に基づく解析のため、各治療群内で、ＩＴＴ集団におけるＩＧＡ−ＦＷＳ、ＰＦＷＳ、及びＧＡＩＳの欠測スコアには、マルコフ連鎖モンテカルロ（ＭＣＭＣ，Markov Chain Monte Carlo）多重代入法により代入を行った。主要エンドポイントについての感度解析は、ｌａｓｔ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｃａｒｒｉｅｄ ｆｏｒｗａｒｄ法に基づく代入を使用して実施した。

記述統計値を使用して、人口統計学的特性（例えば、年齢、性別、人種など）及び背景特性（例えば、ＩＧＡ−ＦＷＳ、ＰＦＷＳなど）をまとめた。過去又は進行中の病歴、試験来診コンプライアンス、並びに以前の及び同時の薬物使用を対象全てについてまとめ、対象ごとの一覧として提示した。

有効性：有効性については、ＩＧＡ−ＦＷＳを使用して、最大限顔をしかめた時の対象の眉間のしわ線の重症度を格付けする盲検化された評価者によって、主要臨床有効性が評価された。レスポンダーは、ＩＧＡ−ＦＷＳでベースラインに対して１ポイント又はそれを超える改善を有し、評価の時点でベースラインＩＧＡ−ＦＷＳに戻っていない対象として定義する。主要解析のため、２４週目の各ＲＴ００２用量と実薬対照の間でレスポンダーの割合を比較した。各ＲＴ００２治療群を、プラセボ及び実薬対照と別々に比較した。実薬対照を各来診時にプラセボと比較もした。比較は、ベースラインＩＧＡ−ＦＷＳで層化したコクラン−マンテル−ヘンツェル（ＣＭＨ，Cochran-Mantel-Haenszel）検定により行った。

主要解析のため、Kaplan-Meier法を使用して、ＲＴ００２用量のそれぞれと実薬対照の間で奏効期間を比較した。奏効期間は、注射時点から、盲検化された治験責任医師がＩＧＡ−ＦＷＳに基づき測定して、対象が各自のベースライン重症度に戻った時点までを測定した。対象がＩＧＡ−ＦＷＳにより４週目かそれ以前にベースラインから１ポイントの改善を実現しなかった場合、奏効期間はゼロとみなした。対象がＩＧＡ−ＦＷＳに基づき４週目かそれ以前に少なくとも１ポイントの改善を実現し、３６週目（最終時点）までに各自のベースラインに戻らなかった場合、このような対象は解析のため３６週目（最終評価の日付）で打ち切った。ログランク検定を使用して、ＲＴ００２と実薬対照の間で奏効期間を比較した。各治療群について計算されたリスク対ベネフィット比は、治療関連有害事象数の合計を治療群の対象における奏効期間日数の合計で割ったものに等しかった。対象が、ＩＧＡ−ＦＷＳに基づき４週目かそれ以前に少なくとも１ポイントの改善を実現したが、３６週目（最終時点）までに各自のベースラインに戻った場合、ベネフィット合計に対する各自の寄与率はベースラインと最終来診日の間の日数であった。

副次的解析のため、使用した副次エンドポイントを以下の通り定義する：
（１）１２週目及び２４週目評価に重点をおいた、２週目及び４〜３６週目のレスポンダーの割合。治療群間の比較は、可能であれば解析を行う変数の、ベースライン重症度で層化したＣＭＨ検定に基づいた。成功に必要な改善を可能にし得るベースライン重症度を有する対象において、各治療群をプラセボと比較し、別に実薬対照と比較した。各来診時に実薬対照をプラセボと比較もした。

いくつかの定義に基づきレスポンダーを評価した：（ｉ）ＩＧＡ−ＦＷＳに基づき、ベースラインに対し少なくとも２ポイント改善した者、（ii）ＩＧＡ−ＦＷＳに基づき、ベースラインに対し少なくとも１ポイント改善した者、（iii）ＩＧＡ−ＦＷＳスコア０又は１を有した者、（iv）ＰＦＷＳに基づき少なくとも１ポイント改善した者、（ｖ）ＰＦＷＳに基づき少なくとも２ポイント改善した者、（vi）ＧＡＩＳスケールで少なくともスコア１を有した者；

（２）奏効期間についての各種定義に基づく副次エンドポイント。４週目までに以下の各定義で指定される改善を実現しなかった対象には持続時間０を割り当てた；以下で定義される改善を実現し、３６週目までにベースラインに戻らなかった対象は３６週目（最終評価の日付）で打ち切った。ログランク検定を使用して治療群を比較した。各定義及び治療群について、リスク対ベネフィット比を上記の通り計算した。奏効期間の定義は、（ｉ）ＧＡＩＳで少なくとも１のレスポンダー定義では、注射からＧＡＩＳスコア１未満までの時間；（ii）ＩＧＡ−ＦＷＳで少なくとも２ポイント改善のレスポンダー定義では、注射からベースラインに戻るまでの時間；（iii）ＰＦＷＳで少なくとも１ポイント改善のレスポンダー定義では、注射からベースラインに戻るまでの時間；（iv）ＰＦＷＳで少なくとも２ポイント改善のレスポンダー定義では、注射からベースラインに戻るまでの時間；（ｖ）ＩＧＡ−ＦＷＳで少なくとも１ポイント改善のレスポンダー定義では、治療、ベースライン重症度、及びベースライン重症度との相互作用による治療に関する比例ハザードモデルを使用した、注射からベースラインに戻るまでの時間；及び（vi）ＰＦＷＳで少なくとも１ポイント改善のレスポンダー定義では、治療、ベースライン重症度、及びベースライン重症度との相互作用による治療に関する比例ハザードモデルを使用した、注射からベースラインに戻るまでの時間を含む。対象によるＧＡＩＳ評価スコアを、ＰＦＷＳに基づく１及び２ポイントの変化両方でのレスポンダー率と関連付けるため、探索的解析を実施した。相関解析及びロジスティック回帰を必要に応じて使用した。

眉間のしわ線治療についての中間解析及び試験結果
対象の１００％が１２週目の来診を完了する（又はそれ以前に中止される）と、主要変数の中間解析を実施した。解析により、主要エンドポイントで定義されるレスポンダーの割合についての、９５パーセント信頼区間での点推定値が与えられた。９５パーセント信頼区間での点推定値は、実薬対照（治療群５）と各活性治療群ＲＴ００２ ２０Ｕ、ＲＴ００２ ４０Ｕ及びＲＴ００２ ６０Ｕ（治療群１、２及び３）との間のレスポンダーの割合の差についても与えられた。１２週目及び２４週目の来診について、対象の７５％がこれらの来診をそれぞれ完了すると、副次有効性エンドポイントの中間解析を実施した。２４週目に安全性及び有効性について実施された中間解析は、２４週目の来診を完了したかこれ以前に中止された対象のうち少なくとも７５％（事実上１００％）を含んでいた。解析は、主要及び副次有効性エンドポイント（最大限顔をしかめた時）並びに安全性データも含んでいた。中間解析の時点で、スタッフ及び対象は盲検化されたままであった。結果を以下にまとめる。

有効性：ＲＴ００２は、ＩＧＡ−ＦＷＳでの１ポイントの改善という２８日目の主要有効性エンドポイントで、全ての用量群において１００％奏効率を実現した。（患者の成功のためのプレースホルダー）。ＲＴ００２用量は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃよりも長い１ポイントのベネフィットを維持した。ＲＴ００２は、しわなし又は軽度のしわを有する患者のパーセンテージで測定すると、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃよりも優れて機能した。１６週目では、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃによる治療と比較して、２倍を超える数のＲＴ００２ ４０Ｕ及び６０Ｕで治療を行った対象が、しわなし又は軽度のしわを維持した（ＩＧＡ−ＦＷＳスコア化システムによる）（Ｐが０．０５未満）。しわなし又は軽度のしわを有する（ＩＧＡ−ＦＷＳスコア化システムによる）対象のパーセンテージは、１６週目で、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃと比較して３つのＲＴ００２用量群全てで統計的に優れていた。しわなし又は軽度のしわを有する（ＩＧＡ−ＦＷＳスコア化システムによる）対象のパーセンテージは、１６週目以降の全ての時点で、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃ治療群と比較してＲＴ００２ ４０Ｕ用量群で統計的に優れていた。

患者データ：患者報告アウトカムは、ＲＴ００２治療の持続時間及び有効性についての治験責任医師の知見を支持するものであった。２４週目（６ヶ月目）では、対象包括的審美的改善スケール（ＧＡＩＳ）で、格付けスコア少なくとも１を有する対象が、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃで治療を行った対象で３１％であったのに対し、ＲＴ００２ ４０Ｕで治療を行った対象では４６．３％であり、４０Ｕ ＲＴ００２用量は、臨床的に有意義なより高い奏効率を発揮し続けた。１６週目では、患者しわ重症度（ＰＷＳ，Ｐａｔｉｅｎｔ Ｗｒｉｎｋｌｅ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ）スケールでの少なくとも１ポイントの改善、及び対象包括的審美的改善スケールでの少なくとも１ポイントの格付けにより測定すると、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃのそのラベル情報に基づく「最大１２０日」の持続時間と比較して、ＲＴ００２ ４０Ｕ用量は統計的に有意なより高い奏効率を実現した。ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃで治療を行った対象での５８．５％と比較して、ＲＴ００２ ４０Ｕで治療を行った対象のうち７６．９％がＰＷＳで少なくとも１ポイントの改善を維持した。さらに、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃで治療を行った対象での７０．７％と比較して、ＲＴ００２ ４０Ｕで治療を行った対象のうち８９．７％がＧＡＩＳで少なくとも１ポイントのスコアを維持した。

安全性：ＲＴ００２製品は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃと高度に同等の安全性及び有効性プロファイルを示した。有害事象は概して軽度であり、主に注射そのものに由来する効果に関連したものであった。ＲＴ００２用量群は全て、大部分が局在化しており一時的で重症度が軽度のＡＥを有する優れた全体的な安全性プロファイルを示した。いずれの活性用量群でも重篤なＡＥは発生しなかった。２０Ｕ及び４０Ｕ ＲＴ００２用量群は忍容性が良好で、眼瞼下垂を引き起こすことに関してＢＯＴＯＸ（登録商標）よりも臨床的に優れていた。さらに、ＲＴ００２は２０Ｕ及び４０Ｕ用量で下方向への分散をあまり示さなかった。ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃで治療を行った群での１．９％と比較して、２０Ｕ及び４０Ｕ用量の両方では、いかなる時点でもこれらの用量のＲＴ００２で治療を行った対象で眼瞼下垂が一切引き起こされない。ＲＴ００２ ６０Ｕ治療群の対象では５．７％の眼瞼下垂率が観察された。これらは、ＢＯＴＯＸ（登録商標）治療で通常見られるように、実際には一時的なものであった。ＲＴ００２の拡散の減少は、非臨床試験及び事前試験と一致し、ボツリヌス毒素Ａなどのボツリヌス毒素、及び本明細書に記載される、１又は２以上の正に帯電した効率基が共有結合で結合している、ポリリジンなどの骨格を含む正に帯電した担体を含む、ＲＴ００２などの本発明の組成物で治療を行った対象において観察される毒素の分散の減少を支持するものである。

投与量及び効果の持続時間：限定されることを望むものではないが、中間解析結果は、高いレスポンダー率、効果の持続時間及び陽性の安全性プロファイルに基づき、本発明のボツリヌスを含む組成物による単回治療に最適な用量として４０Ｕの用量選択を支持する。さらに、ＲＴ００２などの本発明の組成物は、例えば、対象への注射による投与後少なくとも６ヶ月間の、持続し長く続く効果の持続時間を有する。試験結果の中間解析から決定すると、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃによる対象の眉間のしわ線の治療と比較して、ＲＴ００２製品による対象の眉間のしわ線の治療では優れた持続時間の効果が実現された。実際、Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ解析法に基づき、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃで治療を行った対象での１８．８週間の持続時間に対し、ＲＴ００２ ４０Ｕ用量群ではＩＧＡでの１ポイントの改善について５．９ヶ月の持続時間中央値（２３．６週間）が示された（ｐ＝０．０２０）。（例えば、図４Ａ及び４Ｂを参照のこと）。注目すべきは、６ヶ月目で、ＲＴ００２で治療を行った有意な数の対象が未だレスポンダーであったため、持続時間の中間解析のため打ち切られたことである。６ヶ月目で、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃ治療群の対象での１２％に対して、ＲＴ００２ ４０Ｕ治療群の対象ではほぼ３分の１（約３３％）が、単回治療後に未だしわがまったく、又はほとんどなかった（ｐ＝０．０４１）。さらに、高用量群については、治療後３２週間追跡して奏効期間を評価し、治験責任医師及び対象による評価両方に基づいて２９．４週間すなわち７．３ヶ月間の持続時間中央値が実現された。

ＲＴ００２などの、本発明の組成物によりもたらされる効果の持続時間、及び治療方法及びその使用により、治療を受ける対象が、彼らにとって治療後の効果の持続時間が審美治療においては非常に重要であると考えるという点において、利点がもたらされる。特に単回すなわち一回限りの注射用量の製品、つまりＲＴ００２により実現されるこのような長い、持続する効果の持続時間により、対象にとって治療過程当たりの注射をより少なくすることが可能となり、このことが対象の快適性、利便性及び全体的な幸福において重要である。対象への製品の注射による単回治療投薬後少なくとも６ヶ月の期間維持される、有意かつ持続する効果をもたらす製品は、専門家及び患者の両方に、当技術分野で満たされていないニーズに対する解決策を提供する。

中間結果の概要：結果は、ＩＧＡ−ＦＷＳでの１ポイント及び２ポイントの改善についての効果の持続時間の中央値及びレスポンダー率、並びに上記のＩＧＡ−ＦＷＳスコア化システムに従ってしわなし又は軽度のしわを実現及び維持した患者のパーセンテージにより測定すると、ＲＴ００２製品に代表される本発明の組成物が、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃよりも優れていることが判明したことを実証している。試験は、２８日目にＩＧＡ−ＦＷＳでの１ポイントの改善という主要有効性エンドポイントにおいて統計的に有意な結果を実現した。２４週目の中間解析は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃによる注射に対して、注射用量のＲＴ００２による対象の単回治療でもたらされる結果が、臨床的に有意義に区別されることを実証した。

中間解析でも決定されたように、ＲＴ００２は、高いレスポンダー率とともに約６ヶ月の効果の持続時間を実現した。ＲＴ００２は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃと比較して優れた効果の持続時間を実現し、Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ解析法に基づいて、４０Ｕ用量群では治験責任医師による包括的評価−顔面しわ重症度（ＩＧＡ−ＦＷＳ）スケールに基づく眉間のしわ線の１ポイントの改善について、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃでの１８．８週間に対し５．９ヶ月間（２３．６週間）の持続時間の中央値を示した（ｐ＝０．０２０）。２４週（６ヶ月）目で、ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃで治療を行った対象での１９％に対して、用量４０Ｕ及び６０ＵのＲＴ００２では対象のうちそれぞれ３５．９％及び２９．３％で１ポイントの改善が維持され、臨床的に有意義なより高い奏効率が発揮され続けた。ＲＴ００２は、２８日目で治験責任医師によるスケール（ＩＧＡ−ＦＷＳ）及び患者報告アウトカムで少なくとも１ポイントの改善という主要有効性エンドポイントを実現した。ＲＴ００２は、治験責任医師による包括的評価−顔面しわ重症度スケール（ＩＧＡ−ＦＷＳ）での１ポイントの改善という２８日目の主要有効性エンドポイントにおいて全用量群で１００％の奏効率を実現した。ＲＴ００２は、患者顔面しわスケールでの１ポイントの改善という２８日目の主要有効性エンドポイントにおいて全用量治療群で９７％を超える奏効率を実現した。有効性データは、対象のうち９６％が、治験責任医師による評価で治療後４週間、最大限顔をしかめた時にしわ重症度なし又は軽度のしわ重症度と格付けされ、対象のうち８３％が同じ時点で最大限顔をしかめた時、しわなし又は軽度のしわを実現したと自身を評価したことを示した。ＲＴ００２は忍容性が良好であり、重篤な有害事象が見られなかった。ＲＴ００２ ２０Ｕ又は４０Ｕ用量治療群の対象では、眼瞼下垂が発生しなかった。試験では用量反応が観察された；４０Ｕ用量のＲＴ００２を投与された対象は特に高い奏効率を示した。

概して、注射用DaxibotulinumtoxinAは、全身若しくは局所安全性に対する懸念又は分散の形跡がなく全ての用量レベルで忍容性が良好である。注射用ＲＴＴ１５０は、いずれの用量でも治療部位を超える分散の形跡がなく、臨床試験において忍容性が良好である。第１／２相用量漸増非盲検臨床試験、ＲＴ００２−ＣＬ００１における有害事象は概して軽度で、局在化しており一時的であった。観察された最も一般的な有害事象は、頭痛及び注射部位反応であった。いずれのコホートでも、対象が眼瞼下垂とならなかった。重篤な有害事象はなく、用量を増大させても有害事象率は頻度、重症度、又は種類において変化しなかった。３４名の対象が１３１のＡＥを報告した。報告された最も一般的な有害事象は、頭痛（３１報告；１７対象）、注射部位のかゆみ（３４イベント；８対象）、注射部位の痛み（灼熱）（１４イベント；６対象）、及び眼障害（１４イベント；５対象）であった。有害事象に加えて、ＲＴ００２−ＣＬ００１試験にける安全性評価は、臨床検査（血液学、化学、検尿、及びプロトロンビン時間）、ＲＴＴ１５０毒素及びＲＴＰ００４ペプチドに対する血清抗体、脳神経II〜VII及び顔面筋力の評価、併用治療薬、並びに出産可能性のある女性には尿妊娠検査を含んでいた。いずれの用量でも治療部位を超える分散の形跡がなく、臨床検査結果及び物理的評価に基づく全身曝露の形跡もなかった。対象は全員、毒素及びペプチド両方に対する抗体について陰性であった。

眉間のしわ線の治療において長く続く持続時間の効果を示す注射用ボツリヌス毒素製剤に関するフォローアップ試験
成人における中等度〜重度の眉間のしわ線の治療のための単回投与の安全性、有効性及び持続時間を評価するための、カナダでの第２相用量範囲探索実薬及びプラセボ対照臨床試験、ＲＴ００２−ＣＬ００２でもＲＴ００２が評価された。試験には対象２６８名（治療群当たり５０名超）が登録され、２０、４０若しくは６０ＵのＲＴ００２、２０ＵのＢＯＴＯＸ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ、又はプラセボで治療を受けた。眉間のしわ線の治療において、臨床試験での提案された投薬レジメンは、額の注射部位５カ所それぞれへの筋肉内注射０．１ｍＬでの、対象当たり２０、４０又は６０ユニットの単回治療であった。現行の生理食塩水効力法に基づく１６、３２、４８、又は６４Ｕの用量（以前のゼラチンリン酸緩衝液効力法では２５、５０、７５及び１００Ｕに相当）は、第１／２相臨床試験（試験ＲＴ００２−ＣＬ００１；用量群当たり対象１２名；合計対象４８名）で忍容性が良好であった。

中間データは、ＲＴ００２が４週目で３種の用量全てにおいてその主要有効性測定値を実現したことを示した。試験は、治験責任医師による包括的評価−顔面しわ重症度スケールでの、最大限顔をしかめた時の眉間のしわ線の少なくとも１ポイントの改善に基づく、６ヶ月目の効果の持続時間のＲＴ００２中央値を示した。対象報告アウトカムは、ＲＴ００２の持続時間及び有効性についての治験責任医師の知見と一致していた。コホート全てにおいて、ＲＴ００２は概して安全かつ忍容性が良好であると思われた。有害事象は概して軽度であり、局在化しており一時的であった。評価された３種の用量のいずれにおいても、重篤な有害事象又は全身曝露の形跡はなかった。

Claims (23)

1. ボツリヌス毒素を投与して、個体において持続時間の延長された治療効果又は美容効果を実現するための、滅菌注射用製剤のための医薬組成物であって、
   前記医薬組成物が、
   注射に適した薬学的に許容される希釈剤と、
   ２０Ｕ〜６０Ｕの治療有効量を供給するためのボツリヌス毒素成分であって、血清型Ａであり、１５０ｋＤaの分子量を有する、前記ボツリヌス毒素成分と、
   アミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）_１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを含む正に帯電した担体成分と
   を含み、
   前記正に帯電した担体が、前記ボツリヌス毒素成分と非共有結合で会合し、
   前記医薬組成物の前記有効量によって、注射により前記製剤が投与された前記個体において少なくとも約６ヶ月〜約１０ヶ月の効果の持続時間を有する、持続時間の延長された治療効果又は美容効果が実現される、
   前記医薬組成物。
2. ボツリヌス毒素の有効量が、２０Ｕである、請求項１に記載の医薬組成物。
3. ボツリヌス毒素の有効量が、４０Ｕである、請求項１に記載の医薬組成物。
4. ボツリヌス毒素の有効量が、６０Ｕである、請求項１に記載の医薬組成物。
5. ボツリヌス毒素の有効量が、２０Ｕ〜４０Ｕである、請求項１に記載の医薬組成物。
6. 正に帯電した担体成分が、ボツリヌス毒素成分１ユニットあたり、１〜２００ｎｇの比で医薬組成物中に存在する、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
7. 正に帯電した担体成分が、ボツリヌス毒素成分１ユニットあたり、１０〜１００ｎｇの比で医薬組成物中に存在する、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 正に帯電した担体成分が、ボツリヌス毒素成分１ユニットあたり、５０〜１００ｎｇの比で医薬組成物中に存在する、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 正に帯電した担体成分が、ボツリヌス毒素成分１ユニットあたり、５０〜６０ｎｇの比で医薬組成物中に存在する、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 正に帯電した担体成分が、ボツリヌス毒素成分１ユニットあたり、約５５ｎｇの比で医薬組成物中に存在する、請求項７に記載の医薬組成物。
11. 非還元性二糖又は非還元性三糖をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の医薬組成物。
12. 糖が、スクロース又はトレハロースの少なくとも１つである、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 糖がトレハロースである、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の医薬組成物。
15. 非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ソルビタン、ポロキサマー、又はＮＰ４０の少なくとも１つである、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート２０である、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 医薬組成物のｐＨが、６．５〜７．５である、請求項１〜１６のいずれかに記載の医薬組成物。
18. 正に帯電した担体成分が、ボツリヌス毒素成分１ユニットあたり、約２００ｎｇの比で医薬組成物中に存在し、かつ前記医薬組成物がトレハロース及びポリソルベート２０をさらに含む、請求項３に記載の医薬組成物。
19. 正に帯電した担体成分が、ボツリヌス毒素成分１ユニットあたり、約２００ｎｇの比で医薬組成物中に存在し、かつ前記医薬組成物がトレハロース及びポリソルベート２０をさらに含む、請求項４に記載の医薬組成物。
20. 正に帯電した担体成分が、ボツリヌス毒素成分１ユニットあたり、約２００ｎｇの比で医薬組成物中に存在し、かつ前記医薬組成物がトレハロース及びポリソルベート２０をさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。
21. ボツリヌス毒素の有効量が、４０Ｕ〜６０Ｕである、請求項１に記載の医薬組成物。
22. ボツリヌス毒素の有効量が、３５Ｕ〜６０Ｕである、請求項１に記載の医薬組成物。
23. 美容的効果が、個体における眉間のしわ線の低減である、請求項１に記載の医薬組成物。

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