CN117561075A - 肉毒杆菌神经毒素的肌内注射组合物 - Google Patents

Abstract

本公开提供了结合肉毒杆菌神经毒素(BoNT)和细胞穿透肽(CPP)的融合蛋白，其适用于肌内注射。与单独的BoNT蛋白或商业产品

Description

肉毒杆菌神经毒素的肌内注射组合物

本发明要求申请日为2021年4月26日的PCT/CN2021/089918的优先权，其全部内容并入本文。

背景技术

肉毒杆菌神经毒素(BoNT)是由肉毒杆菌(Clostridium botulinum)和相关菌种产生的神经毒性蛋白。A型BoNT(BoNTA)及其衍生物是一种广泛用于治疗神经肌肉疾病的美容剂和治疗剂。BoNTA由100kDa的重链(HC)和50kDa的轻链(LC)组成。BoNTA-HC与运动神经末梢上的SV2受体结合，从而介导细胞对BoNTA的吸收。BoNTA-LC特异性地切割25kD的突触体神经相关蛋白(SNAP-25)，该蛋白负责细胞囊泡对接和融合。

根据复合辅助蛋白和配制辅料的不同，市售BoNTA产品的肌内注射治疗指数在5至15之间，其定义为半数最大致死剂量(IMLD₅₀)与半数最大有效剂量(IMED₅₀)之比。随着BoNTA的医疗适应症的不断扩大，出现严重和长期不良反应的情况也越来越多，这凸显了提高BoNTA的治疗指数的重要性。先前的研究表明，LC结构域的工程化可将BoNTA的治疗指数提高多达2倍。

发明内容

本公开提供了结合肉毒杆菌神经毒素(BoNT)和细胞穿透肽(CPP)的融合蛋白，其适用于肌内注射。与单独的BoNT蛋白或商业产品肉毒杆菌毒素A(onabotulinumtoxinA)相比，这些CPP-BoNT融合蛋白具有卓越的细胞吸收能力、强大的治疗效果和显著提高的治疗指数。此外，还提供了可从昆虫细胞中制备的未被切割形成双链多肽但仍保留较强酶活性的BoNT融合蛋白。

在一个实施方案中，本公开提供了一种向哺乳动物递送肉毒杆菌毒素(BoNT)的方法，该方法包括肌内注射一种包含多肽的药物组合物，该多肽包含与细胞穿透肽(CPP)融合的BoNT，其中BoNT包含轻链和重链。

CPP的非限制性示例包括锌指肽(ZFP，EKPYKCPECGKSFSASAALVAHQRTHTG，SEQ IDNO:1)、TAT(GRKKRRQRRRPQ，SEQ ID NO:18)和Pep-1(N-乙酰基-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-OH，SEQ ID NO:19)，以及表3中提供的其他CPP。

CPP可与BoNT的轻链的N端、重链的C端或两者融合，但不限于此。

在某些实施方案中，组合物中至少50％、优选至少75％、80％、85％、90％、或95％、或全部BoNT为单链，即轻链和重链位于同一条肽链上。

在某些实施方案中，组合物中至少50％、优选至少75％、80％、85％、90％、或95％、或全部BoNT由昆虫细胞表达。昆虫细胞可为草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞，但不限于此。

肌内注射可注入哺乳动物体内的任何肌肉，例如皮肤下或眼睛粘膜下，或在耳、鼻、口、唇、尿道口、肛门或舌头处。

在某些实施方案中，哺乳动物需要治疗面部皱纹、肌张力障碍、痉挛、面肌痉挛、多汗症或唾液分泌过多症。在某些实施方案中，哺乳动物需要进行肌肉塑形。

还提供了一种药物制剂，其包含药学上可接受的赋形剂和多肽，该多肽包含与细胞穿透肽(CPP)融合的BoNT，其中BoNT包含轻链和重链。

在某些实施方案中，药物制剂为冻干制剂。在某些实施方案中，药物制剂为可注射溶液。在某些实施方案中，药物制剂被配制用于肌内注射。

CPP的非限制性示例包括锌指肽(ZFP，EKPYKCPECGKSFSASAALVAHQRTHTG，SEQ IDNO:1)、TAT(GRKKRRQRRRPQ，SEQ ID NO:18)和Pep-1(N-乙酰基-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-OH，SEQ ID NO:19)，以及表3中提供的其他CPP。

CPP可与BoNT的轻链的N端、重链的C端或两者融合，但不限于此。

在某些实施方案中，组合物中至少50％、优选至少75％、80％、85％、90％、或95％、或全部BoNT为单链，即轻链和重链位于同一条肽链上。

在某些实施方案中，组合物中至少50％、优选至少75％、80％、85％、90％、或95％、或全部BoNT由昆虫细胞表达。昆虫细胞可为草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞，但不限于此。

附图说明

图1示出了实施例中测试的各种BoNTA融合蛋白的结构。

图2示出了细胞穿透BoNTA蛋白的体外活性的SNAPtide测定结果。阳性对照为市售重组BoNTA轻链(BoNTA-LC，R&D Systems)。空白对照(Mock)为SNAPtide单独的反应。

图3示出了经细胞穿透BoNTA蛋白处理的人真皮成纤维细胞的细胞裂解的SNAPtide测定结果。阴性对照为市售重组BoNTA-LC(R&D Systems)。

图4示出了细胞穿透BoNTA蛋白的体内效应的代表性图像。

图5示出了经细胞穿透BoNTA蛋白处理的小鼠的趾外展(digit abduction)的散点图。A：用0.9％氯化钠生理盐水处理。B：注射BOTOX。C：用微针预处理，然后用BOTOX处理。D：用微针预处理，然后用细胞穿透BoNTA-ZFP(Protein ID:6)处理。E：没有微针预处理的情况下，用细胞穿透BoNTA-ZFP(Protein ID:6)处理。

图6为示意图，示出了实施例3中使用的CPP-BoNTA的设计。

图7示出了纯化的CPP-BoNTA蛋白的还原的SDS-PAGE的凝胶图像。

图8示出了纯化的CPP-BoNTA蛋白的溶液稳定性测试结果。在水溶液中于4℃孵育1个月后，使用报告肽测定BoNTA活性。使用单因素方差分析和邓尼特(Dunnett)多重比较检验确定BoNTA和CPP-BoNTA之间的显著差异。

图9示出了BoNTA阳性细胞的平均荧光强度的定量结果。进行了三个生物重复，每个重复分析了1000个细胞。

图10示出了通过切割报告肽确定的CPP-BoNTA的体外活性结果。数据表示为平均值±标准差(SD；n＝8)。使用单因素方差分析和邓尼特多重比较检验确定野生型(WT)和CPP-BoNTA之间的显著差异。

图11示出了通过对切片组织进行免疫荧光实验确定CPP融合改善了小鼠腓肠肌纤维的吸收。

图12示出了BoNTA蛋白处理前后印迹面积和步幅长度的定量结果。步态出现同步兔跳行为或肘部接触玻璃板的定义为零。无法完成行走的小鼠从分析中剔除。

图13示出了对CPP-BoNTA蛋白的体内效力进行跑步机分析的结果。

图14示出了不同BoNTA蛋白诱导的中和抗体的滴度。结果表明，在重复给药过程中TAT和双端ZFP融合减少了中和抗体的量。

图15示出了重复给药后CPP-BoNTA的肌肉弱化作用的持续时间。在重复给药过程中TAT和双端ZFP融合增加了注射BoNTA的持续时间。在第0、30和47天注射BoNTA蛋白。

图16示出了BoNTA蛋白对C57BL/6小鼠腓肠肌肥大的肌肉塑形效果。当腓肠肌功能恢复时拍摄的图像。i.m.表示肌内注射。

图17示出了BoNTA蛋白对SD大鼠腓肠肌肥大的影响。注射后12周实现腓肠肌功能恢复时拍摄的图像。注射肢体的腓肠肌用红色框突出显示。对侧肢体(空白对照)的腓肠肌用蓝色框突出显示。

具体实施方式

定义

应当注意的是，术语“一种”或“一个”实体是指一种(个)或多种(个)该实体，例如“一种抗体”应理解为一种或多种抗体。因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种(个)或多种(个)”和“至少一种(个)”在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“多肽”意在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸组成的任何单条链或多条链，而不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或更多个氨基酸组成的单条链或多条链的任何其他术语都包括在“多肽”的定义中，术语“多肽”可代替上述任何一个术语，或与上述任何一个术语互换使用。术语“多肽”也意指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以衍生自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不一定从指定的核酸序列翻译而来。多肽可以以任何方式产生，包括通过化学合成。

如本文所用，关于细胞、核酸(例如DNA或RNA)的术语“分离的”是指分别与其他DNA或RNA分离的分子。这些分离的分子存在于大分子的天然来源中。如本文所用，术语“分离的”还指通过重组DNA技术生产时基本上不含细胞物质、病毒物质或培养基的核酸或肽，或化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质的核酸或肽。此外，“分离的核酸”意在包括核酸片段，这些核酸片段不是天然存在的片段，也不会在自然状态下发现。术语“分离的”在本文中也用于指从其他细胞蛋白质或组织中分离的细胞或多肽。分离的多肽意在涵盖纯化的和重组的多肽。

如本文所用，术语“重组”涉及多肽或多核苷酸时，意指非天然存在的多肽或多核苷酸的形式，其非限制性示例可通过组合产生通常不会同时存在的多核苷酸或多肽。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中可以为了比较的目的而进行比对的位置来确定。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度是由序列共有的匹配或同源位置的数量组成的函数。“不相关”或“非同源”序列与本公开的序列之一的同一性小于40％，但优选小于25％。

多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列具有一定百分比(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者99％)的“序列同一性”是指当进行比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。

术语“等价核酸或多核苷酸”是指具有与核酸或其互补序列的核苷酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的核苷酸序列的核酸。双链核酸的同源物意指包括具有与其或其互补序列具有一定程度的同源性的核苷酸序列的核酸。一方面，核酸的同源物能够与核酸或其互补序列杂交。同样地，“等价多肽”是指与参考多肽的氨基酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的多肽。在某些方面，序列同一性至少约为70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些方面，与参考的多肽或多核苷酸相比，等价多肽或多核苷酸具有1、2、3、4或5个添加、缺失、取代及其组合。在某些方面，等价序列保留参考序列的活性(例如表位结合)或结构(例如盐桥)。

术语“编码”应用于多核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多核苷酸，如果在其天然状态或当通过本领域技术人员熟知的方法操作时，其可以被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这种核酸的互补序列，编码序列可以从反义链中推导出来。

如本文所用，术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可与第二个硫醇基团形成二硫键或桥的硫醇基团。

如本文所用，术语“治疗”是指治疗性手段和预防性措施，其目的是预防或减缓(减轻)不希望发生的生理变化或疾病，例如不希望出现的皱纹。有益的或期望的临床结果包括但不限于：症状减轻、疾病程度减小、疾病状态稳定(即不恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和以及缓解(无论是部分缓解还是完全缓解)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以意指与不接受治疗的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的人包括已经患有这种病症或疾病的人，以及容易患有这种病症或疾病的人，或者需要预防这种病症或疾病的人。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指任何需要对其进行诊断、预后或治疗的受试者，尤其是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、家畜、农场动物以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。

如本文所用，“对需要治疗的患者”或“需要治疗的受试者”等短语包括受试者，例如哺乳动物受试者，这些受试者将受益于本公开的抗体或组合物的给药，例如用于检测、诊断程序和/或治疗。

CPP-BoNT融合蛋白的肌内注射

市场上存在经皮递送BoNT蛋白的需求。蛋白质的经皮递送实质上是困难的，尤其是跨皮肤。皮肤由两层细胞构成，称为表皮和真皮。表皮是皮肤的最上层，是由基底和分化的角质细胞组成的复层鳞状上皮。角质细胞是表皮的主要细胞类型。基底层的角质细胞可以通过有丝分裂增殖且经历多个细胞分化阶段而成为无核细胞。无核或分化的角质细胞是高度组织化的组织结构，其分泌角蛋白和脂质，为抵御病原体等入侵物质提供保护屏障。

已经考虑过BoNT的肌内递送。目前仍有两大挑战。一个问题是注射的BoNT仍需要被靶细胞吸收。另一个问题是肌内注射的BoNT的治疗指数(安全系数)往往较低，这引起了安全问题。

本发明的第一个意外发现是，尽管所有测试的CPP均提高了培养细胞对BoNT的吸收(图9)，但当肌内注射BoNT蛋白时，吸收的全面增加更为显著(图11)。

第二个意外发现是，肌内递送的CPP-BoNT融合蛋白的毒性显著降低，尤其是与市售BoNT产品肉毒杆菌毒素A相比。例如，TAT-BoNTA的安全性是肉毒杆菌毒素A的7倍，Pep1-BoNTA的安全性是肉毒杆菌毒素A的10倍，而ZFP3-BoNTA-ZFP3的安全性则是肉毒杆菌毒素A的229倍(表6)。因此，所有这些CPP-BoNT融合蛋白的治疗指数都大大高于肉毒杆菌毒素A(表6)。

目前尚不完全清楚为什么这些CPP-BoNT融合蛋白在肌内注射时具有如此出色的治疗指数。不过可以预期这是由于它们的免疫原性大大降低(图14)。

第三个意外发现是，所有这些测试的CPP-BoNT融合蛋白实际上都是单链蛋白(图7)。BoNT单链前体蛋白实质上自行分离成两条肽链，即BoNT轻链(LC)和BoNT重链(HC)，两者通过二硫键连接。单链前体被认为相对无活性。因此，这些单链融合蛋白的强大活性是完全出乎意料的。

CPP-BoNT蛋白缺乏自我切割功能被认为是因为这些蛋白在昆虫细胞(例如草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾细胞)中表达。

第四个意外发现是，肌内注射这些CPP-BoNT融合蛋白后，表现出显著的肌肉塑形(变薄)效果，而肉毒杆菌毒素A仅具有一般的效果(图16)。因此，本公开的融合蛋白和组合物可具有比肉毒杆菌毒素A更广泛的治疗功能，例如用于减少肌肉质量、使肌肉收紧或变薄。

第五个意外发现是，当肌内注射时，融合蛋白在重复给药后的半衰期显著延长(图15)。因此，增加持续时间有助于减少给药频率，为所述的治疗方法带来更多便利。

因此，根据本公开的一个实施方案，提供了一种向哺乳动物递送肉毒杆菌毒素(BoNT)的方法。在某些实施方案中，所述方法需要肌内注射一种包含多肽的药物组合物，所述多肽包含与细胞穿透肽(CPP)融合的BoNT，其中BoNT包含轻链和重链。

细胞穿透肽(CPP)为短肽(例如，长度小于200个氨基酸)，可促进细胞对纳米级颗粒到小化合物再到DNA大片段的分子的摄取和吸收。CPP的氨基酸组成通常含有高相对丰度的带正电荷的氨基酸(例如赖氨酸或精氨酸)，或者其序列含有极性带电荷氨基酸和非极性疏水氨基酸的交替模式。这两种类型的结构分别称为聚阳离子结构或两亲性结构。第三类CPP为疏水肽，仅含有低净电荷的非极性残基或对细胞吸收至关重要的疏水氨基酸基团。

来自人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)的转录反式激活因子(TAT)为首次发现的CPP。后来又发现了更多的CPP，涉及多个类别和类型。表3提供了非限制性示例。

CPP的一个示例是锌指蛋白，其为天然存在的转录因子，可重新编程以识别靶标基因组位点。锌指核酸酶——含有N端ZFP结构域和C端Fok I核酸内切酶结构域的嵌合蛋白——已被证明具有内在的细胞渗透性。一些ZFP包括Cys₂-His₂ ZFP结构域。Cys₂-His₂ZFP由大约30个具有ββα构型的氨基酸组成。

另一个示例是TAT(GRKKRRQRRRPQ，SEQ ID NO:18，或简单地RKKRRQRRR，SEQ IDNO:30)，其源自人类免疫缺陷病毒的转录反式激活因子(TAT)。另一个示例是Pep-1(N-乙酰基-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-OH，SEQ ID NO:19)，其为一种两亲性CPP，第一部分是疏水的，含有几个可参与膜去稳定过程的色氨酸残基(W)，第二部分是阳离子的，带有赖氨酸和精氨酸残基。

肉毒杆菌毒素至少有七种类型，称为A至G型。A型和B型能够引起人类疾病，也用于商业和医学领域。C至G型不太常见。A型和B型肉毒杆菌毒素在医学上用于治疗各种肌肉痉挛和以肌肉过度活跃为特征的疾病。每个BoNT血清型还可能有亚型。例如，已知以下亚型：BoNT A1至A10、B1至B8、E1至E9，以及F1至F7。

BoNT蛋白由通过单个二硫键连接在一起的重链和轻链组成。它们被合成为相对无活性的单链多肽，分子质量约为150kDa，当多肽链被蛋白水解切割为100kDa的重链和50kDa的轻链时被激活(活性约为100倍)。

在某些实施方案中，所施用或配制的BoNT蛋白为单链蛋白，或者所施用或配制的组合物中至少大部分为单链，意外地发现其在CPP-BoNT融合蛋白形式中具有活性。在某些实施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或所有BoNT蛋白为单链。在某些实施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或所有BoNT蛋白为单链且不能将自身切割成两条链。

在某些实施方案中，单链BoNT蛋白由昆虫细胞产生。昆虫细胞的示例包括鳞翅目细胞、夜蛾科细胞、灰翅夜蛾属细胞和草地贪夜蛾细胞。可以预期昆虫生产系统产生的BoNT蛋白在蛋白折叠或翻译后修饰方面与原核细胞产生的BoNT蛋白有所不同。因此，这些蛋白无法自我切割。

在某些实施方案中，CPP-BoNT融合蛋白中包含的BoNT是具有一个或多个使切割失效的突变的突变型BoNT。例如，对于BoNTA，可将氨基酸残基Lys438-Ala449(根据ProteinID:1的残基编号)突变为不同的氨基酸。在某些实施方案中，所述突变为非保守突变。突变的示例包括但不限于HTQSLDQGYNDDDDKA(SEQ ID NO:136)和HTQSLDQGGENLYFQGA(SEQ IDNO:137)。

在某些实施方案中，CPP位于BoNT蛋白的N端侧。在某些实施方案中，CPP位于BoNT蛋白的C端侧。在某些实施方案中，至少一个CPP位于BoNT蛋白的N端侧，至少一个CPP位于BoNT蛋白的C端侧。在某些实施方案中，在N端和C端的其中一侧或两侧，存在多于一个CPP分子。

在某些实施方案中，所述融合(嵌合)多肽的总大小不大于5000个氨基酸残基，或者不大于4000个氨基酸残基，不大于3000个氨基酸残基，不大于2000个氨基酸残基，不大于1800个氨基酸残基，不大于1600个氨基酸残基，不大于1500个氨基酸残基，不大于1400个氨基酸残基，不大于1300个氨基酸残基，不大于1200个氨基酸残基，不大于1100个氨基酸残基，不大于1000个氨基酸残基，不大于900个氨基酸残基，不大于800个氨基酸残基，不大于700个氨基酸残基，不大于600个氨基酸残基，不大于500个氨基酸残基，不大于450个氨基酸残基，不大于400个氨基酸残基，不大于350个氨基酸残基，不大于300个氨基酸残基，不大于250个氨基酸残基，或不大于200个氨基酸残基。

术语BoNT或其特定类型或亚型也涵盖其等价的多核苷酸，例如具有一定程度(例如，至少85％、90％、95％、98％或99％)的序列同一性的多核苷酸或用一个或多个氨基酸残基的添加、缺失或取代修饰的多核苷酸。在某些实施方案中，所述取代为保守氨基酸取代。

“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，多肽中的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。在另一个实施方案中，一串氨基酸可以用侧链家族成员中顺序和/或组成不同的、结构相似的一串氨基酸取代。

下表提供了保守氨基酸取代的非限制性示例，其中相似性分数为0或更高表示两个氨基酸之间存在保守取代。

表1A.氨基酸相似性矩阵

	C	G	P	S	A	T	D	E	N	Q	H	K	R	V	M	I	L	F	Y	W
																					W	-8	-7	-6	-2	-6	-5	-7	-7	-4	-5	-3	-3	2	-6	-4	-5	-2	0	0	17
Y	0	-5	-5	-3	-3	-3	-4	-4	-2	-4	0	-4	-5	-2	-2	-1	-1	7	10
																					F	-4	-5	-5	-3	-4	-3	-6	-5	-4	-5	-2	-5	-4	-1	0	1	2	9
L	-6	-4	-3	-3	-2	-2	-4	-3	-3	-2	-2	-3	-3	2	4	2	6
																					I	-2	-3	-2	-1	-1	0	-2	-2	-2	-2	-2	-2	-2	4	2	5
M	-5	-3	-2	-2	-1	-1	-3	-2	0	-1	-2	0	0	2	6
																					V	-2	-1	-1	-1	0	0	-2	-2	-2	-2	-2	-2	-2	4
R	-4	-3	0	0	-2	-1	-1	-1	0	1	2	3	6
																					K	-5	-2	-1	0	-1	0	0	0	1	1	0	5
H	-3	-2	0	-1	-1	-1	1	1	2	3	6
																					Q	-5	-1	0	-1	0	-1	2	2	1	4
N	-4	0	-1	1	0	0	2	1	2
																					E	-5	0	-1	0	0	0	3	4
D	-5	1	-1	0	0	0	4
																					T	-2	0	0	1	1	3
A	-2	1	1	1	2
																					S	0	1	1	1
P	-3	-1	6
																					G	-3	5
C	12

表1B.保守氨基酸取代

在某些实施方案中，BoNT肽包含来自天然BoNT肽的不超过1个、不超过2个或不超过3个的以上取代。

BoNT轻链的非限制性示例包含SEQ ID NO:8(BoNT A轻链)和与SEQ ID NO:8具有至少90％(或至少95％、至少98％或至少99％)序列同一性的氨基酸序列。BoNT重链的非限制性示例包含SEQ ID NO:9(BoNT A重链)和与SEQ ID NO:9具有至少90％(或至少95％、至少98％或至少99％)序列同一性的氨基酸序列。以下表2提供了SEQ ID NO:8和9的氨基酸序列。

表2.代表性的BoNT序列

“锌指模体”是小型蛋白质结构模体，其特征在于配位一个或多个锌离子以稳定折叠。一般来说，锌指通过半胱氨酸和组氨酸残基的组合来配位锌离子。这些残基的数量和顺序可用于划分不同类型的锌指(例如Cys₂His₂、Cys₄和Cys₆)。另一方法是基于折叠结构域中蛋白质骨架的整体形状将锌指蛋白划分为折叠群。锌指最常见的折叠群为Cys₂His₂型锌指(经典的锌指)、高音谱号锌指(treble clef)、带状锌指(zinc ribbon)、塞结状锌指(gagknuckle)、Zn₂/Cys₆型锌指和类TAZ2结构域型锌指。

Cys₂His₂折叠群采用简单的ββα折叠且具有如下氨基酸序列模体：

X₂-Cys-X_2,4-Cys-X₁₂-His-X_3,4,5-His。

单个锌指结构域可以以两个、三个或更多个指结构的串联重复序列形式出现，所述指结构包含蛋白的DNA结合结构域。

锌指模体可以经修饰以去除或降低其与DNA结合的能力。例如，经修饰的Cys₂His₂在锌指模体中的α-螺旋片段的残基-1、2、3或6上包含至少一个丙氨酸。锌指模体的非限制性示例显示在下表3中。表3中的一些序列，SEQ ID NO:1和5至7是单个锌指模体，而另一些序列(锌指模体的串联序列)，SEQ ID NO:2至4包含多个串联的锌指模体。当两个或更多个锌指串联使用时，其可以彼此相邻或通过肽接头连接，即长度为1、2或3个氨基酸残基到2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的短肽。SEQ ID NO:1中经修饰的丙氨酸残基加下划线并加粗。

表3.CPP序列的示例

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BoNT轻链、重链和CPP之间的距离可以根据偏好和需求进行调整。在某些实施方案中，CPP与相邻的BoNT轻链或重链的N端或C端之间的距离不超过200个氨基酸残基。在某些实施方案中，所述距离为0至约150个、5至100个、10至75个、10至50个、10至40个、10至30个、10至20个、20至150个、20至100个、20至50个、或50至100个氨基酸残基。在某些实施方案中，通过插入间隔序列(例如丙氨酸、甘氨酸或其组合)来提供距离。

SEQ ID NO:10至17(表4)提供了融合多肽序列的非限制性示例。在某些实施方案中，融合多肽未被切割(单链)。

表4.代表性的嵌合多肽序列

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在某些实施方案中，所述多肽可以与治疗剂、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应修饰剂、药物制剂或PEG缀合。所述多肽可以与治疗剂缀合或融合，所述治疗剂可包括可检测标记(例如放射性标记)、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活性治疗剂或诊断剂、细胞毒性剂(可以是药物或毒素)、超声增强剂、非放射性标记、其组合以及本领域已知的其他此类制剂。

所述多肽可以通过与化学发光化合物偶联进行可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来确定带化学发光标签的抗原结合多肽的存在。特别有用的化学发光标记化合物的示例为鲁米诺、异鲁米诺、热敏吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

还可以使用荧光发射金属(例如¹⁵²Eu或镧系元素的其他金属)对所述多肽进行可检测地标记。可以使用诸如二乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团将这些金属连接至抗体。

本公开还提供了编码本公开的多肽、其变体或衍生物的分离的多核苷酸或核酸分子。本公开的多核苷酸可以在相同的多核苷酸分子上或在分开的多核苷酸分子上编码多肽、其变体或衍生物的整个重链和轻链。另外，本公开的多核苷酸可以在相同的多核苷酸分子上或在分开的多核苷酸分子上编码多肽、其变体或衍生物的重链和轻链的一部分。

可以将编码融合多肽或其结构域的多核苷酸插入“表达载体”。术语“表达载体”是指可被改造使其含有编码本公开多肽的多核苷酸的遗传构建体，例如质粒、病毒或本领域已知的其他载体。此类表达载体通常是包含促进宿主细胞中插入的遗传序列转录的启动子序列的质粒。表达载体通常包含复制起点、启动子以及允许对转化细胞进行表型筛选的基因(例如抗生素抗性基因)。在本公开中可使用各种启动子，包括诱导型和组成型启动子。通常，表达载体包含复制子位点和源自与宿主细胞相容的物种的控制序列。

可以使用本领域技术人员熟知的常规技术通过多核苷酸转化或转染宿主细胞。例如，在宿主细胞为大肠杆菌的情况下，可以使用本领域已知的CaCl₂、MgCl₂或RbCl方法制备能够吸收DNA的感受态细胞。或者，可以使用物理手段，例如电穿孔或显微注射。电穿孔允许通过高压电脉冲将多核苷酸转移到细胞中。另外，可以使用本领域熟知的方法通过原生质体融合将多核苷酸引入宿主细胞。还已知用于转化真核细胞的合适方法，例如电穿孔和脂转染。

本公开涵盖的术语“宿主细胞”为其中本公开的多核苷酸可用于表达融合多肽或其功能结构域的任何细胞。该术语还包括宿主细胞的任何后代。有用的宿主细胞包括细菌细胞(例如肉毒杆菌)、真菌细胞(例如酵母细胞)、昆虫细胞(例如灰翅夜蛾属)、植物细胞和动物细胞。本公开的融合多肽可以在原核生物中通过表达编码融合多肽的多核苷酸来生产。这些原核生物包括但不限于微生物，例如用编码本公开的融合多肽的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌。可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔将构建体引入宿主细胞。

这些构建体可以在天然产生BoNT蛋白的肉毒杆菌中表达。本公开的令人惊讶的发现是，可以在昆虫细胞(例如草地贪夜蛾Sf9)中有效地产生含有BoNT轻链和/或重链的嵌合蛋白。因此，在一个实施方案中，宿主细胞可以是昆虫细胞，例如鳞翅目细胞、夜蛾科细胞、灰翅夜蛾属细胞和草地贪夜蛾细胞。

为了长期、高产量地生产重组蛋白，通常使用稳定表达。可以使用编码由适当表达控制元件(例如启动子，增强子，序列，转录终止子，聚腺苷酸化位点等)控制的本公开的融合多肽的cDNA和筛选标记转化宿主细胞，而不是使用含有病毒复制起点的表达载体。筛选标记赋予对选择性杀伤剂的抗性，且在异源多核苷酸的稳定整合后，允许抗性细胞的生长。这些抗性细胞生长形成灶，进而可以将其克隆并扩增为细胞系。

如本文所述，本发明的融合多肽可以通过肌内注射有效递送，其提供了优异的疗效并大大提高了治疗指数。

此外，如实施例中所证明的，在重复给药后，融合多肽的持续时间长于野生型。因此，在某些实施方案中，融合多肽的肌内注射不超过每4、8、12、16或24周一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月一次。

本文所述的方法具有广泛的美容和治疗应用。在美容方面，这些方法可用于治疗皱纹，调整嘴角或上唇线条。在治疗发面，这些方法可用于治疗神经系统疾病，例如肌张力障碍、痉挛、面肌痉挛、多汗症(出汗过多)、唾液分泌过多症(唾液过多)。这些方法还可用于泌尿系统疾病，例如逼尿肌括约肌协同失调、特发性逼尿肌过度活跃、神经源性逼尿肌过度活跃、尿潴留、肛裂、良性前列腺增生。其他适应症还有胃肠病、耳鼻喉科疾病或其他医学上的病况。在某些实施方案中，这些方法用于治疗面部皱纹、肌张力障碍、痉挛、面肌痉挛、多汗症或唾液分泌过多症。

用于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所使用的特定多肽、其变体或衍生物、患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、给药时间、排泄率、药物组合以及所治疗特定疾病的严重程度。医疗护理人员对这些因素的判断属于本领域普通技术范围。剂量还取决于接受治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所使用的化合物的特性、疾病的严重程度以及预期效果。可以通过本领域公知的药理学和药代动力学原理来确定剂量。

组合物

本公开还提供了适用于肌内注射的药物组合物和制剂。此类组合物/制剂包含有效量的CPP-BoNT融合多肽和可接受的载体。

在一个具体的实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准，或列入美国药典或其他公认的药典中的可用于动物，尤其是人类。此外，“药学上可接受的载体”通常是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料或制剂助剂。

术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。此类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉注射药物组合物时，水是优选的载体。生理盐水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，尤其是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物还可包含少量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂，例如苯甲醇或羟苯甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；以及用于调节肌肉张力的制剂，例如氯化钠或葡萄糖，也是可以考虑的。这些组合物可以采取凝胶剂、乳膏剂、喷雾剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。所述组合物可以与传统的粘合剂和载体(例如甘油三酯)一起配制为栓剂。

因此，根据本公开的一个实施方案，提供了一种药物组合物或制剂，其包含多肽，该多肽包含与细胞穿透肽(CPP)融合的BoNT，其中BoNT包含轻链和重链。

表3提供了CPP的非限制性示例。CPP的一个示例为锌指蛋白，其为天然存在的转录因子，可被重新编程以识别靶标基因组位点。另一个示例为TAT(GRKKRRQRRRPQ，SEQ ID NO:18，或简单地RKKRRQRRR，SEQ ID NO:30)，其源自人类免疫缺陷病毒的转录反式激活因子(TAT)。另一个示例为Pep-1(N-乙酰基-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-OH，SEQ ID NO:19)，其为一种两亲性CPP——第一部分是疏水的，含有几个可参与膜去稳定过程的色氨酸残基(W)，第二部分是阳离子的，带有赖氨酸和精氨酸残基。

在某些实施方案中，所施用或配制的BoNT蛋白为单链蛋白，或者所施用或配制的组合物中至少大部分为单链，意外地发现其在CPP-BoNT融合蛋白形式中具有活性。在某些实施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或所有BoNT蛋白为单链。在某些实施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或所有BoNT蛋白为单链且不能将自身切割成两条链。

在某些实施方案中，单链BoNT蛋白由昆虫细胞产生。昆虫细胞的示例包括鳞翅目细胞、夜蛾科细胞、灰翅夜蛾属细胞和草地贪夜蛾细胞。可以预期昆虫生产系统产生的BoNT蛋白在蛋白折叠或翻译后修饰方面与原核细胞产生的BoNT蛋白有所不同。因此，这些蛋白无法自我切割。

在某些实施方案中，CPP-BoNT融合蛋白中包含的BoNT是一种突变型BoNT，具有一个或多个使切割失效的突变。例如，对于BoNTA，可将氨基酸残基Lys438-Ala449(根据Protein ID:1的残基位置)突变为不同的氨基酸。在某些实施方案中，所述突变是非保守突变。突变的示例包括但不限于HTQSLDQGYNDDDDKA(SEQ ID NO:136)和HTQSLDQGGENLYFQGA(SEQ ID NO:137)。

在某些实施方案中，CPP位于BoNT蛋白的N端侧。在某些实施方案中，CPP位于BoNT蛋白的C端侧。在某些实施方案中，至少一个CPP位于BoNT蛋白的N端侧，至少一个CPP位于BoNT蛋白的C端侧。在某些实施方案中，在N端和C端的其中一侧或两侧，存在多于一个CPP分子。

在某些实施方案中，所述制剂为冻干制剂。在某些实施方案中，所述制剂为可注射水溶液。在某些实施方案中，所述制剂被填装在药匣(cartridge)或药瓶(vial)中。

在某些实施方案中，还提供了试剂盒和包装，其包括组合物或其制剂，以及使用所述组合物或制剂的说明书。在某些实施方案中，所述试剂盒或包装还包括用于递送所述组合物或制剂的针。

实施例

实施例1.从大肠杆菌中表达BoNTA-CPP融合蛋白及其活性研究

本实验证明，BoNTA-CPP(细胞穿透肽)融合蛋白可以从大肠杆菌细胞中表达和纯化，其能够切割肉毒杆菌底物SNAP-25，并被细胞吸收。

方法

蛋白表达

将含有不同BoNTA构建体的pET28b载体(Protein ID:1至8；图1)转化到BL21(DE3)大肠杆菌细胞中。SEQ ID NO:10至17中提供了这些构建体的序列。His₆：组氨酸标签；BoNTA-LC：BoNT A轻链；BoNTA-HC：BoNT A重链；ZFP₂：串联锌指肽(SEQ ID NO:1)；TAT：转录反式激活因子；Pep-1：pep-1肽。TAT和Pep-1是已知的细胞穿透肽(CPP)。

从琼脂平板中挑取单个菌落，并在添加有50μg/mL卡那霉素和90μM ZnCl₂的10mL溶菌肉汤(LB)培养基中于37℃培养过夜。第二天，将10mL发酵剂接种到添加有50μg/mL卡那霉素和90μM ZnCl₂的1L的LB培养基中，并培养至OD₆₀₀为0.8。用0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在25℃下诱导蛋白表达4小时。在5000rpm下离心10分钟收获细胞沉淀。

蛋白纯化

将来自2L培养物(约30g)的细胞沉淀重悬于200mL BoNTA裂解缓冲液(20mMHEPES，pH 7.0，500mM NaCl，0.01％ Triton X-100，1×蛋白酶混合物(Roche)和10％甘油)，在冰上超声处理3次。将裂解的细胞在25000g下于4℃离心1小时，并将上清液转移至新试管中。向该上清液中添加1mL(设定体积)经平衡处理的Ni-NTA树脂(Qiagen)。使含有His₆标签的BoNTA蛋白与树脂旋转结合30分钟。将树脂转移到柱上，并弃去流穿液。用50mLBoNTA洗涤缓冲液(20mM HEPES，pH 7.0，500mM NaCl和10％甘油，20mM咪唑)洗涤树脂，然后用50mL BoNTA洗脱缓冲液(20mM HEPES，pH 7.0，500mM NaCl和10％甘油，300mM咪唑)洗脱树脂。接着浓缩洗脱部分，再使用起始缓冲液(20mM TrisHCl，pH 8.5)和终止缓冲液(20mMTrisHCl，pH 8.5，1MNaCl)通过离子交换进一步纯化。将具有最佳纯度的部分重新合并，通过旋转浓缩进行浓缩，添加10％甘油，然后于-80℃储存以备进一步使用。

使用SNAPtide^TM测定法进行肉毒杆菌活性测定

用反应缓冲液(20mM，pH 7.4，0.25mM ZnCl₂，5mM DTT，0.05％ Tween-20)将SNAPtide(Millipore，Cat.No.567333-200NMOL)稀释至5μM。将各重组BoNTA-ZFP融合蛋白(200nM；Protein ID:1至8)添加到含有SNAPtide的反应缓冲液中。反应于37℃孵育40分钟。使用酶标仪以320nm的激发波长和420nm的发射波长记录荧光度。SNAPtide是源自SNAP-25(BoNTA的细胞内底物)的短肽。SNAPtide包含BoNTA的切割位点以及荧光团和淬灭基团。肽的切割释放荧光团并激活荧光。反应的阳性对照为购自R&D Systems(Cat.No.4489-ZN-010)的市售重组BoNTA轻链(BoNTA-LC)蛋白。所有数据都进行三次重复。

含重组BoNTA-ZFP融合蛋白的hDF细胞的转导

将hDF细胞接种到预包被有聚赖氨酸的6孔板上。接种后24小时，将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。用DMEM无血清培养基稀释BoNTA-ZFP蛋白(Protein ID:5和ProteinID:6)和对照蛋白(R&D BoNTA-LC，即来自R&D Systems的市售BoNTA轻链)。将细胞用BoNTA-ZFP蛋白(0.15μM)和BoNTA-LC(0.5μM)于37℃处理2小时。然后将细胞用添加有0.5mg/mL肝素的PBS洗涤3次，以去除表面结合的蛋白，然后通过胰蛋白酶处理收获细胞。通过超声处理裂解收集的细胞，并如上所述测定BoNTA活性。

结果和数据分析

一步亲和提纯化产生仅具有中等纯度的蛋白。经过第二步离子交换后，纯度大大提高。总产量估计为每升培养物0.1mg，最终产物的纯度为90％。

图2中的活性数据表示为平均值±标准差，并通过单尾t(Student’s t)检验进行分析。所有测试的样品，包括市售BoNTA-LC的信号均显著高于SNAPtide对照组(p<0.05)。如图3所示，ZFP的单端和双端融合都保留了BoNTA在源自SNAP-25的肽底物上的活性。

用BoNTA-ZFP蛋白(尤其是Protein ID:6)处理的hDF细胞表现出明显的BoNTA活性，其信号显著高于对照组(p<0.05)。这表明BoNTA-ZFP融合蛋白可以有效地穿透细胞。

实施例2.BoNTA-ZFP蛋白在小鼠中的体内活性

本实验证明，当应用于完整的或经微针处理的小鼠皮肤时，BoNTA-ZFP融合蛋白可引起肌肉麻痹，其特征在于趾外展。

趾外展实验

将15只体重约36g的C57雌性小鼠随机分为5组(n＝3)。在所有小鼠中，未经治疗的左腿作为对照，并用不同的药物治疗右腿。在治疗前将小鼠麻醉。在空白对照组(A)中，给小鼠施用储存缓冲液(20mM HEPES，pH 7.0，300mM NaCl和10％甘油)。在BOTOX(Allergan)注射组(B)中，按照说明用0.9％ NaCl生理盐水复溶BOTOX，并向右腿注射5μL的45U/mL溶液。在C组中，用微针滚轮(RoHS MR20，0.2mm，家用)对小鼠的腿和脚进行预处理，然后局部应用60μL的45U/mL BOTOX。在D组中，用微针滚轮(RoHS MR20，0.2mm，家用)对小鼠的腿和脚进行预处理，然后局部应用60μL浓度为0.05mg/mL的在储存缓冲液(20mM HEPES，pH 7.0，300mMNaCl和10％甘油)中的ZFP₃-BoNTA-ZFP₃蛋白(Protein ID:6)。在E组中，局部应用60μL浓度为0.05mg/mL的在储存缓冲液(20mM HEPES，pH 7.0，300mM NaCl和10％甘油)中的BoNTA-ZFP蛋白。通过在腿和脚上滚动三次来进行微针滚轮治疗。局部应用时，将物质均匀涂抹在腿和脚上，进行按摩，然后风干，重复多次，直到所有溶液都施用完毕。在第0天小鼠醒来后记录趾外展情况，然后在接下来的四天内每天记录一次。

结果和数据分析

经微针预处理的可注射BOTOX和BoNTA-ZFP均表现出明显的趾外展(图4)，其评分显著高于对照组A(p<0.05；t检验)。直接施用BoNTA-ZFP效果甚微。趾外展评分(DAS)由三位独立研究人员以盲法进行评估。DAS在第2天达到峰值(图5)。因此，本实施例表明，当应用于小鼠皮肤时，细胞穿透BoNTA-ZFP可引起肌肉麻痹，这表明了SNAP-25切割的体内活性。

实施例3.肌内注射CPP-BoNT融合蛋白提高治疗指数

市售BoNTA产品的肌内治疗指数通常在5至15之间。本实施例表明，将细胞穿透肽(CPP)与BoNTA的150kDa核心蛋白融合，可将其在小鼠体内的肌内治疗指数提高超过10倍。此外，当反复施用这些CPP-BoNTA时，其在小鼠体内的免疫原性降低，持续时间延长。

质粒构建

BoNTA基因由GENEWIZ公司(中国江苏南京)合成，并经密码子优化，可在草地贪夜蛾Sf9细胞或粉纹夜蛾Hi-5细胞中表达。将His₆标签、FLAG标签、TEV切割位点和GS连接子如所示添加到融合基因中。将重组BoNTA和CPP-BoNTA基因克隆至pFastBac1载体的XbaI和HindIII位点。所有质粒构建体均通过桑格(Sanger)测序验证，之后称为pFastBac-CPP-BoNTA。测试的融合蛋白如图6所示，其序列如表4所示。

生产杆状病毒

根据Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)制造商的说明书，在DH10Bac大肠杆菌中通过转座将CPP-BoNTA编码序列从pFastBac转移至杆粒(bacmid)。根据制造商的方案，使用大分子量DNA提取试剂盒(QIAGEN，美国马里兰州日耳曼敦)从大肠杆菌细胞中分离和纯化重组杆粒。使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen)通过用重组杆粒转染Sf9细胞在昆虫细胞中表达CPP-BoNTA。收集P1杆状病毒原液并用于感染Sf9细胞以产生P2病毒。简而言之，在25mL Sf-900II培养基(Gibco，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)中将2mL的P1原液以1.5×10⁶个细胞/毫升的密度添加到Sf9细胞中。Sf9细胞在完全湿润的培养箱中于27℃培养72小时，并在110rpm下振荡。通过在1000g离心15分钟来收集P2病毒原液，以去除细胞或细胞碎片。为了生成高滴度P3杆状病毒原液，如上所述，将1.5mL的P2原液添加到100mL培养基(1.5％，v/v)中的Sf9细胞中。按上述方法培养转导细胞，并在感染后72小时收集P3病毒原液。

蛋白表达和纯化

为了表达CPP-BoNTA，使用P3病毒原液在ESf 921昆虫细胞培养基(表达系统(Expression System)，美国加利福尼亚州戴维斯)中以约1.8至2.0×10⁶个细胞/mL的细胞密度感染Hi-5细胞，稀释度为1:100(v/v)。将培养物于27℃培养48小时，然后通过1000g离心15分钟收获细胞。

根据蛋白构建体的等电点(pI)，在结合缓冲液(20mM MOPS，2M NaCl，10％甘油，10μM ZnCl₂，pH 7.0或pH 7.9)中于4℃超声裂解收集的细胞。细胞裂解液于4℃在16000rpm离心30分钟。在非变性条件下将细胞上清液上样到Ni²⁺-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖亲和树脂(QIAGEN)上。用50×树脂体积的结合缓冲液和6个树脂体积的洗涤缓冲液(20mM MOPS，100mM NaCl，10％甘油，10μM ZnCl₂，pH 7.0或pH 7.9)洗涤树脂。使用洗脱缓冲液(20mMMOPS，100m M NaCl，10％甘油，10μM ZnCl₂，pH7.0或pH 7.9，以及梯度浓度分别为20mM、40mM和300mM的咪唑)洗脱结合的蛋白。使用截留分子量(MWCO)为30kDa的旋转浓缩器(Millipore，美国马萨诸塞州伯灵顿)浓缩收集的洗脱部分。使用带有Superdex200Increase 10/300GL色谱柱的快速蛋白液相色谱(GE Healthcare，中国上海)进一步纯化蛋白。收获蛋白并将其储存在储存缓冲液(20mM MOPS，pH 7.0或pH 7.9，100mM NaCl，10％甘油)中，置于-80℃。CPP-BoNTA的质谱分析

使用C18 ZipTips(Millipore)对样品进行脱盐，并用50％乙腈和0.1％甲酸洗脱。然后将样品与α-氰基-4-羟基肉桂酸(安捷伦科技(Agilent Technologies)，美国加利福尼亚州圣克拉拉)混合。使用标准操作条件在布鲁克(Brucker)Autoflex MALDI-TOF质谱仪(布鲁克，美国马萨诸塞州比尔里卡)上以正离子反射模式进行分析。所有LC-MS/MS分析均使用配备有Waters nano-ESI源的Q-TOF Premier质谱仪(Waters，马萨诸塞州米尔福德)，该Waters nano-ESI源直接与带有100μm×15cm反相色谱柱(BEH C18，Waters)的Nano-Acquity UPLC系统(Waters)耦合。使用Mascot软件(2.2.1版，Matrix Science，英国伦敦)进行数据库搜索和光谱解读。

体外肽切割测定

通过荧光共振能量转移(FRET)进行体外肽切割测定。肽底物包含源自天然BoNTA底物SNAP-25的序列。在本实施例中，我们合成了一种底物肽，其序列为FITC-Thr-(D-Arg)-Ile-Asp-Gln-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-(DABCYL)-Nle-NH₂(吉尔生化有限公司，中国上海，SEQ ID NO:135)。该肽的N端荧光团为异硫氰酸荧光素(FITC)，C端淬灭剂为4-((4-(二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(DABCYL)。肽切割后，将释放荧光团FITC，激活的荧光信号可通过光谱进行测量。FRET肽的合成程序和表征可在补充信息中找到。切割反应包含20mMHEPES(pH 7.4)、0.05％ Tween-20、100nM重组CPP-BoNTA和10μM SNAPtide底物，于37℃培养40分钟。通过酶标仪以490nm的激发波长和523nm的发射波长测量荧光度。

细胞培养

将小鼠神经母细胞瘤N2a细胞在含5％ CO₂的完全湿润的气氛下于37℃维持在添加有10％ FBS(Gbico)、1％非必需氨基酸(Gbico)和100U/mL青霉素/链霉素(Gbico)的DMEM(Gbico)中。

实验动物

所有实验均按照美国实验动物管理认证协会(AAALAC)的指导方针进行。所有动物实验均按照上海模式生物中心动物护理和使用委员会的规定进行。在屏障设施中饲养8周龄的C57BL/6J雌性小鼠(17至22g，上海模式生物中心，中国上海)，维持12小时的光/暗循环(上午7点至晚上7点)，小鼠可自由饮食和饮水。

注射程序

每只小鼠的右侧腓肠肌头部均接受CPP-BoNTA或载体的肌内注射。使用连接到250μL汉密尔顿(Hamilton)无菌注射器的30号针头以5μL的固定体积进行注射。对于每个实验，每个剂量注射八至十只小鼠。实验采用四至六个生物重复。

免疫荧光染色

将小鼠神经母细胞瘤N2a细胞接种在培养皿的盖玻片上，培养至70％至80％的汇合度。然后使用4％多聚甲醛(BBI生命科学有限公司，中国上海)固定细胞，并用含0.1％Triton X-100的磷酸盐缓冲液(PBS)透化10分钟。使用含添加有3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS的封闭液(索莱宝科技有限公司，中国北京)封闭细胞，并用山羊抗FLAG抗体(NovusBiologicals，美国科罗拉多州利特尔顿)和兔抗SV2A抗体(Novus)在添加有0.2％ BSA的PBS中以1:200的稀释度孵育过夜。然后用添加有0.2％ BSA的PBS洗涤细胞，并用Alexa568缀合的驴抗兔IgG二抗(Invitrogen)和Alexa488缀合的驴抗山羊IgG(Invitrogen)二抗孵育。

将经处理的腓肠肌切片，立即用4％多聚甲醛固定，并在30％蔗糖中脱水过夜。然后将组织块在纸巾上干燥，并放置在组织模具上，于-80℃在4小时内依次填充100％最佳切割温度(OCT)化合物。沿水平方向以10μm间隔对OCT包埋的腓肠肌进行连续冷冻切片。切片用含PBS和5％ FBS的封闭液(索莱宝)封闭，然后用抗FLAG抗体(Novus)孵育，用PBS洗涤，再用Alexa568缀合的驴抗山羊IgG抗体(A11057，Invitrogen)孵育。

用Hoechst 33342(Invitrogen)对抗体标记的细胞和组织切片进行染色以观察细胞核。使用LSM710激光扫描共聚焦显微镜(卡尔蔡司显微镜有限公司，德国耶拿)和TissueFAXS(TissueGnostics，奥地利维也纳)荧光成像系统获得图像。对于共聚焦显微镜，红色和绿色通道的激发/发射滤光片分别为410nm/507nm和493nm/598nm。通过ZEN 2011成像软件(蔡司)测量每个细胞的荧光强度。用TissueFAXS扫描整个切片，并使用TissueQuest软件(TissueGnostics)基于用Hoechst 33342(Invitrogen)进行的细胞核染色计算荧光强度。

趾外展评分(DAS)测定

小鼠DAS测定用于通过测量肌肉弱化效果来确定BoNTA制剂的药理活性。在DAS测定中，短暂地将小鼠尾巴悬挂，以引发其特有的惊吓反应，其中小鼠伸出后肢并外展后趾。注射BoNTA后，由两名独立观察者按五分制对趾外展程度进行评分，评分越高表明肌肉弱化作用越明显。将每个剂量的峰值DAS反应(通常在注射后第2天或第3天观察到)拟合到线性或对数回归方程，用于计算肌内注射的半数有效剂量(IMED₅₀)。IMED₅₀值定义为半数小鼠的DAS值达到2时的剂量。

肌内注射确定全身效应和治疗指数

肌内注射的半数致死剂量(IMLD₅₀)定义为治疗后半数小鼠死亡的剂量。监测终点设定为第5天，此后没有再发现死亡病例。这种致死率反映了BoNTA的全身效应，即神经毒素从肌肉中逸出并在全身循环。每个样品的肌内治疗指数或安全系数定义为从同一实验中获得的IMLD₅₀值与DASIMED₅₀值之比。

步态动态测定

所有步态动态测定均使用DigiGait成像系统和Walk Analysator分析软件(移数信息科技有限公司，中国上海)进行。简而言之，将小鼠放在暗室中的Walk Analysator的玻璃板上，让其自愿行走。荧光灯发出的光束聚焦在玻璃板上，反射设定为水平方向。由于爪接触时产生的力，光束会向下反射。爪印图像由数码相机(映美精有限公司，德国)以120帧/秒的速率捕获，并存储为音频视频交错(AVI)文件以供后续分析。每只爪平均收集10个连续的步幅，这在我们的实验中得到验证，足以分析小鼠的行走行为。在检查之前，每天三次让动物习惯于探索玻璃室。

跑步机测试

跑步机测试在带有梯度倾角和跑步机后部配备有电网的电动啮齿动物跑步机(移数信息科技有限公司，中国上海)上进行。检查前一天，让小鼠习惯于跑步机。每次测试都安排了热身行走，速度为5米/分钟且无倾角。测试开始后，跑步机的速度每5分钟增加3米/分钟，倾角增加3°，最大倾角为12°。每次跑步的终点定义为小鼠在跑步机最后三分之一处停留超过10秒或反复接触电网。

酶联免疫吸附测定

小鼠从肌肉麻痹中恢复后，重复注射CPP-BoNTA或载体。血液样本取自小鼠眼眶。收集血清并于-80℃储存，直至使用。ELISA板用10ng/mL的包被缓冲液中的抗原于4℃包被过夜，用200mL的0.05％ Tween的PBS溶液(PBST)洗涤3次，并用添加有5％BSA的PBS缓冲液封闭1小时。将1:10稀释的血清(100μL)添加到微量滴定板的每个孔中，并在室温下孵育1小时。洗涤板，然后用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(R&D，HAF007)以1:1000的稀释度在室温下孵育30分钟。洗涤板3次，测定405nm处的光密度(OD₄₅₀)。BoNTA和包被缓冲液分别作为阳性和阴性对照。

结果

本实施例设计了与各种类型的CPP(包括ZFP、Pep1和TAT)融合的重组BoNTA蛋白(图6，表4)。如图所示(未显示信号肽和其他非关键结构域)，与野生型(WT-BoNTA)对照(Protein ID:A；SEQ ID NO:10)相比，TAT-BoNTA(Protein ID:B；SEQ ID NO:16)在BoNTA蛋白的N端包含TAT肽。同样地，Pep1-BoNTA(Protein ID:C；SEQ ID NO:17)使用Pep1作为CPP，而ZFP₃-BoNTA(Protein ID:D；SEQ ID NO:12)包含三个ZFP序列。在BoNTA-ZFP₃(ProteinID:E；SEQ ID NO:13)中，ZFP序列位于BoNTA序列的C端侧。还制备了ZFP₃-BoNTA-ZFP₃(Protein ID:F；SEQ ID NO:15)，其中ZFP₃插入到BoNTA的N端侧和C端侧。

使用杆状病毒表达系统从昆虫细胞中高度同质地表达和纯化的野生型(WT)蛋白和CPP融合的BoNTA(CPP-BoNTA)蛋白(图7)。通过质谱(MS)分析确定了CPP-BoNTA蛋白的整体分子量和N端序列。

出乎意料的是，这些昆虫细胞产生的BoNTA蛋白仍然是完整的肽链，而不是切割的LC和HC。

本实施例接下来表征了CPP-BoNTA的切割和细胞穿透活性。根据荧光共振能量转移(FRET)肽报告基因的测定，CPP融合以不同方式和程度影响BoNTA的肽切割活性。WT-BoNTA蛋白和CPP-BoNTA蛋白具有相似的稳定性，于4℃孵育1个月后仍可保留大部分的切割活性(图8)。不同的CPP不同程度地增强了细胞对BoNTA的吸收，其中TAT和双端ZFP融合的改善程度最高(图9)。重要的是，发现内化的CPP-BoNTA与BoNTA受体SV2共定位。CPP融合对BoNTA的切割和内化活性的影响似乎并不相关(图9和10)。一致地，CPP融合也增强了腓肠肌中肌内注射的BoNTA的体内细胞吸收(图11)。

本实施例接下来描述了CPP-BoNTA在小鼠体内的肌内毒性和效力。与市售Botox(肉毒杆菌毒素A)相比，自制纯化的BoNTA核心蛋白(WT-BoNTA)表现出不同的药理学特性。这种差异可能源于不同的生产程序或化学结构。结果发现，所有具有ZFP融合的BoNTA构建体均比具有双端ZFP融合的WT-BoNTA(ZFP₃-BoNTA-ZFP₃)显示出更低的毒性(更高的IMLD₅₀)，表现出最大程度的改善。按照使用全身致死率定义BoNTA效力的常规标准，我们将BoNTA的一个活性单位定义为通过肌内注射导致半数死亡的蛋白量。通过趾外展评分(DAS)测定确定的CPP-BoNTA的体内疗效与剂量和时间有关，通常在治疗后第2天观察到峰值效应。因此，我们使用第2天的DAS值来确定WT-BoNTA和CPP-BoNTA的体内效力。BoNTA的IMED₅₀定义为导致半数小鼠的最小DAS值为2的蛋白量。结果发现，所有CPP-BoNTA蛋白均比WT-BoNTA具有更高的效力(更低的IMED₅₀值)。最重要的是，与肉毒杆菌素(Botox)或WT-BoNTA相比，CPP-BoNTA均显示出提高的治疗指数(根据IMLD₅₀和IMED₅₀之间的差异定义)，观察到ZFP₃-BoNTA-ZFP₃的治疗指数提高多达10倍(表5)。

表5.蛋白的治疗指数

由于DAS被视为半定量分析，因此我们打算使用完全定量的步态和跑步机分析来表征所选BoNTA变体的最佳候选者的肌肉麻痹活动。考虑到体外和体内的表现，我们选择了WT-BoNTA、TAT-BoNTA和ZFP3-BoNTA-ZFP3作进一步研究。步态分析表明，注射BoNTA能以剂量依赖的方式减少小鼠的印迹面积和步幅长度，这表明了肌肉弱化作用。结果发现，TAT-BoNTA和ZFP₃-BoNTA-ZFP₃的效力始终高于WT-BoNTA(图12)。类似地，跑步机分析表明，肌内注射BoNTA可减少小鼠的跑步距离，而CPP融合增强了BoNTA的肌肉弱化作用(图13)。重要的是，步态和跑步机分析与确定IMED₅₀时的DAS一致，这支持了我们的结论，即CPP融合提高了BoNTA的治疗指数。

为了探索CPP介导的治疗指数改善的可能作用机制，我们分析了WT-BoTNA、TAT-BoNTA和ZFP₃-BoNTA-ZFP₃在诱导最大DAS值的最小剂量下的免疫原性。结果发现，与WT-BoNTA蛋白相比，在重复给药期间，CPP-BoNTA蛋白的中和抗体滴度较低(图14)，这表明CPP融合可降低BoNTA的免疫原性。一致地，尽管初始给药时持续时间较短，但重复给药后CPP-BoNTA的持续时间长于WT-BoNTA(图15)。与肉毒杆菌素(Botox)等其他产品相比，这些肽的这种优越特性使其施用频率更低(例如每2个月、每3个月、每4个月、每5个月或每6个月施用一次)。

此外，还研究了CPP融合的生理效应。如图16(C57BL/6小鼠腓肠肌肥大)和图17(SD大鼠腓肠肌肥大)所示，CPP融合改善了野生型BoNTA的肌肉塑形效果。

因此，本实施例表明，肌内注射CPP-BoNT融合蛋白可提高小鼠体内纯化的BoNTA蛋白的治疗指数、免疫原性和持续时间。这些昆虫细胞产生的蛋白令人惊讶地保持单链。同样令人惊讶的是，尽管已知单链BoNT蛋白相对无活性，但这些昆虫细胞产生的BoNT蛋白具有高度的体外和体内活性。

***

本公开不受限于所描述的具体实施方案的范围，所述具体实施方案旨在作为本公开的各个方面和本公开范围内功能上等同的任何组合物或方法的单个说明。对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本公开的实质或范围的情况下，可以对本公开的方法和组合物进行各种修改和变化。因此，本公开旨在涵盖本公开的修改和变化，只要这些修改和变化落入所附权利要求及其等同物的范围内。

本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体且单独地指明通过引用并入一样。

序列表

<110> 上海科技大学

<120> 肉毒杆菌神经毒素的肌内注射组合物

<130> P23118330CP

<150> PCT/CN2021/089918

<151> 2021-04-26

<160> 137

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 1

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<220>

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<211> 1388

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625 630 635 640

Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr Asp Lys

645 650 655

Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn

660 665 670

Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu Ile Phe

675 680 685

Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala Ile Pro

690 695 700

Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys Val Leu

705 710 715 720

Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp

725 730 735

Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val Asn

740 745 750

Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn

755 760 765

Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn Gln Tyr

770 775 780

Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu Ser

785 790 795 800

Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Lys

805 810 815

Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met Ile Pro

820 825 830

Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala

835 840 845

Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gln Val

850 855 860

Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile Pro

865 870 875 880

Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser Thr Phe

885 890 895

Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg

900 905 910

Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile

915 920 925

Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile

930 935 940

Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn

945 950 955 960

Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp

965 970 975

Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr

980 985 990

Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu

995 1000 1005

Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile

1010 1015 1020

Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

1025 1030 1035

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1040 1045 1050

Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1055 1060 1065

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile

1070 1075 1080

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1085 1090 1095

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1100 1105 1110

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1115 1120 1125

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1130 1135 1140

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1145 1150 1155

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1160 1165 1170

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1175 1180 1185

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1190 1195 1200

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1205 1210 1215

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1220 1225 1230

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1235 1240 1245

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn

1250 1255 1260

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1265 1270 1275

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1280 1285 1290

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1295 1300 1305

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1310 1315 1320

Arg Pro Leu

1325

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 18

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln

1 5 10

<210> 19

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 19

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

1 5 10 15

Lys Lys Arg Lys Val

20

<210> 20

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 20

Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser

1 5 10 15

<210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 21

Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys

1 5 10 15

Pro

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 22

Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro

1 5 10 15

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 23

Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Pro Arg Ser

1 5 10 15

Arg

<210> 24

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 24

Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg

1 5 10 15

His Leu

<210> 25

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 25

Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys

1 5 10 15

Arg Lys Arg

<210> 26

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 26

Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg

1 5 10 15

Met Asp Val

<210> 27

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 27

Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Leu Gly Ser Gly

1 5 10

<210> 28

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 28

Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg

1 5 10 15

<210> 29

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 29

Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg

1 5 10 15

Arg Glu Arg Gln Ser Arg

20

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 30

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5

<210> 31

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 31

Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg

1 5 10 15

<210> 32

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 32

Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln

1 5 10 15

Arg

<210> 33

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 33

Thr Arg Arg Gln Arg Thr Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg

1 5 10

<210> 34

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 34

Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp

1 5 10 15

Thr Ala Arg

<210> 35

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 35

Asn Ala Lys Thr Arg Arg His Glu Arg Arg Arg Lys Leu Ala Ile Glu

1 5 10 15

Arg

<210> 36

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 36

Met Asp Ala Gln Thr Arg Arg Arg Glu Arg Arg Ala Glu Lys Gln Ala

1 5 10 15

Gln Trp Lys Ala Ala Asn

20

<210> 37

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 37

Thr Ala Lys Thr Arg Tyr Lys Ala Arg Arg Ala Glu Leu Ile Ala Glu

1 5 10 15

Arg Arg

<210> 38

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 38

Thr Arg Arg Asn Lys Arg Asn Arg Ile Gln Glu Gln Leu Asn Arg Lys

1 5 10 15

<210> 39

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 39

Pro Arg Arg Arg Arg Ser Ser Ser Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10 15

Pro Arg Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg

20 25 30

<210> 40

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 40

Arg Ile Lys Ala Glu Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser

1 5 10 15

Lys Ser Arg Lys Arg Lys Leu Glu Arg Ile Ala Arg

20 25

<210> 41

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 41

Lys Arg Arg Ile Arg Arg Glu Arg Asn Lys Met Ala Ala Ala Lys Ser

1 5 10 15

Arg Asn Arg Arg Arg Glu Leu Thr Asp Thr

20 25

<210> 42

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 42

Lys Arg Ala Arg Asn Thr Glu Ala Ala Arg Arg Ser Arg Ala Arg Lys

1 5 10 15

Leu Gln Arg Met Lys Gln

20

<210> 43

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 43

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 44

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 44

Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 45

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 45

Ser Lys Arg Thr Arg Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu

1 5 10 15

Glu Lys Glu Phe His Phe Asn Arg Tyr Ile Thr Arg Arg Arg Arg Ile

20 25 30

Asp Ile Ala Asn Ala Leu Ser Leu Ser Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp

35 40 45

Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Ser Lys Lys Asp Arg

50 55 60

<210> 46

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 46

Ser Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ala Lys Ile Lys Lys

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<210> 47

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 47

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1 5 10 15

<210> 48

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 48

Lys Gln Ile Asn Asn Trp Phe Ile Asn Gln Arg Lys Arg His Trp Lys

1 5 10 15

<210> 49

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 49

Arg His Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

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<210> 50

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 50

Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly

1 5 10 15

Ala Lys Lys Lys Arg Lys Val

20

<210> 51

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 51

Met Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala

1 5 10 15

Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro

20 25 30

<210> 52

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 52

Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp

1 5 10 15

Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro

20 25

<210> 53

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 53

Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro Val Gln Arg Lys

1 5 10 15

Arg Gln Lys Leu Pro

20

<210> 54

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 54

Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro

1 5 10

<210> 55

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 55

Arg Arg Ile Arg Pro Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Arg Pro Arg

1 5 10 15

Pro Leu Pro Phe Pro Arg Pro Gly

20

<210> 56

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 56

Val Asp Lys Gly Ser Tyr Leu Pro Arg Pro Thr Pro Pro Arg Pro Ile

1 5 10 15

Tyr Asn Arg Asn

20

<210> 57

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 57

Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro

1 5 10 15

Val Ser Cys Ile Lys Arg

20

<210> 58

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 58

Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Trp Pro Val Gly Arg Val His

1 5 10 15

Arg Leu Leu Arg Lys

20

<210> 59

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 59

Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu

1 5 10 15

Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln

20 25

<210> 60

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 60

Gly Ile Gly Lys Trp Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe

1 5 10 15

Val Gly Glu Ile Met Asn Ser

20

<210> 61

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 61

Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu

1 5 10 15

Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val

20 25 30

Pro Arg Thr Glu Ser Cys

35

<210> 62

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 62

Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr

1 5 10 15

Gly Arg

<210> 63

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 63

Tyr Lys Gln Cys His Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Ser Gly

1 5 10

<210> 64

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 64

Ala Leu Trp Lys Thr Leu Leu Lys Lys Val Leu Lys Ala Pro Lys Lys

1 5 10 15

Lys Arg Lys Val

20

<210> 65

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 65

His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys

1 5 10 15

Gly Lys Phe Trp

20

<210> 66

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 66

Thr Lys Arg Arg Ile Thr Pro Lys Asp Val Ile Asp Val Arg Ser Val

1 5 10 15

Thr Thr Glu Ile Asn Thr

20

<210> 67

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 67

Arg Gln Gly Ala Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gln Leu Arg

1 5 10 15

Ile Ala Gly Lys Arg Leu Glu Gly Arg Ser Lys

20 25

<210> 68

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 68

Asn Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr

1 5 10 15

Gln Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro

20 25 30

Val Gln

<210> 69

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 69

Arg His Ser Arg Ile Gly Ile Ile Gln Gln Arg Arg Thr Arg Asn Gly

1 5 10 15

<210> 70

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 70

Lys Leu Ile Lys Gly Arg Thr Pro Ile Lys Phe Gly Lys Ala Asp Cys

1 5 10 15

Asp Arg Pro Pro Lys His Ser Gln Asn Gly Met Gly Lys

20 25

<210> 71

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 71

Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro

1 5 10

<210> 72

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 72

Asp Pro Lys Gly Asp Pro Lys Gly Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr

1 5 10 15

Val Thr Gly Lys Gly Asp Pro Lys Pro Asp

20 25

<210> 73

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 73

Arg Arg Ile Pro Asn Arg Arg Pro Arg Arg

1 5 10

<210> 74

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 74

Arg Leu Arg Trp Arg

1 5

<210> 75

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 75

Met Val Arg Arg Phe Leu Val Thr Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly

1 5 10 15

Pro Pro Arg Val Arg Val

20

<210> 76

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 76

Met Val Thr Val Leu Phe Arg Arg Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly

1 5 10 15

Pro Pro Arg Val Arg Val

20

<210> 77

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 77

Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His

1 5 10 15

Ser Lys

<210> 78

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 78

Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala

1 5 10 15

Ser Gly

<210> 79

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 79

Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala

1 5 10 15

Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp

20 25

<210> 80

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 80

Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro

1 5 10 15

<210> 81

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 81

Val Pro Thr Leu Lys

1 5

<210> 82

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 82

Pro Met Leu Lys Glu

1 5

<210> 83

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 83

Val Pro Ala Leu Arg

1 5

<210> 84

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 84

Val Ser Ala Leu Lys

1 5

<210> 85

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 85

Ile Pro Ala Leu Lys

1 5

<210> 86

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 86

Pro Phe Val Tyr Leu Ile

1 5

<210> 87

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 87

Pro Ile Glu Val Cys Met Tyr Arg Glu Pro

1 5 10

<210> 88

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 88

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 89

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 89

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 90

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 90

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 91

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 91

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 92

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 92

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

1 5 10 15

Lys Arg Lys Val

20

<210> 93

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 93

Gly Leu Ala Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly

1 5 10 15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

20 25

<210> 94

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 94

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu

1 5 10 15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

20 25

<210> 95

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 95

Ala Gly Tyr Leu Leu Gly His Ile Asn Leu His His Leu Ala His Leu

1 5 10 15

Ala Ile Asx His His Ile Leu

20

<210> 96

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 96

Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 97

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 97

Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Arg Arg

1 5

<210> 98

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 98

Gly Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu

1 5 10 15

Leu Trp Arg Ala

20

<210> 99

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 99

Leu Ile Arg Leu Trp Ser His Leu Ile His Ile Trp Phe Gln Asn Arg

1 5 10 15

Arg Leu Lys Trp Lys Lys Lys

20

<210> 100

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 100

Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His

1 5 10 15

Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala

20 25 30

<210> 101

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 101

Leu Lys Thr Leu Thr Glu Thr Leu Lys Glu Leu Thr Lys Thr Leu Thr

1 5 10 15

Glu Leu

<210> 102

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 102

Gln Leu Ala Leu Gln Leu Ala Leu Gln Ala Leu Gln Ala Ala Leu Gln

1 5 10 15

Leu Ala

<210> 103

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 103

Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg

1 5

<210> 104

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 104

Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg

1 5 10

<210> 105

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 105

Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg

1 5 10 15

<210> 106

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 106

Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro

1 5 10 15

Pro Arg

<210> 107

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 107

Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg

1 5

<210> 108

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 108

Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg

1 5 10

<210> 109

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 109

Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg

1 5 10 15

<210> 110

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 110

Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro

1 5 10 15

Arg Arg

<210> 111

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 111

Gly Pro Ser Gln Pro Thr Tyr Pro Gly Asp Asp Ala Pro Val Arg Asp

1 5 10 15

Leu Ile Arg Phe Tyr Arg Asp Leu Gln Arg Tyr Leu Asn Val Val Thr

20 25 30

Arg His Arg Tyr

35

<210> 112

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 112

Gly Pro Ser Gln Pro Thr Tyr Pro Gly Asp Asp Ala Pro Val Arg Asp

1 5 10 15

Leu Ile Arg Phe Tyr Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Leu Asn Val Val Thr

20 25 30

Arg His Arg Tyr

35

<210> 113

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 113

Gly Pro Ser Gln Pro Thr Tyr Pro Gly Asp Asp Ala Pro Val Arg Asp

1 5 10 15

Leu Arg Arg Phe Tyr Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Leu Asn Val Val Thr

20 25 30

Arg His Arg Tyr

35

<210> 114

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(4)

<223> Xaa can be any amino acid and residues 2-4 can repeat

<400> 114

Gly Pro Xaa Xaa Pro

1 5

<210> 115

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 115

Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro

1 5 10 15

Pro Pro

<210> 116

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 116

Val Glu Leu Pro Pro Pro Val Glu Leu Pro Pro Pro Val Glu Leu Pro

1 5 10 15

Pro Pro

<210> 117

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 117

Phe Lys Ile Tyr Asp Lys Lys Val Arg Thr Arg Val Val Lys His

1 5 10 15

<210> 118

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 118

Arg Ala Ser Lys Arg Asp Gly Ser Trp Val Lys Lys Leu His Arg Ile

1 5 10 15

Leu Glu

<210> 119

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 119

Lys Gly Thr Tyr Lys Lys Lys Leu Met Arg Ile Pro Leu Lys Gly Thr

1 5 10 15

<210> 120

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 120

Leu Tyr Lys Lys Gly Pro Ala Lys Lys Gly Arg Pro Pro Leu Arg Gly

1 5 10 15

Trp Phe His

<210> 121

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 121

His Ser Pro Ile Ile Pro Leu Gly Thr Arg Phe Val Cys His Gly Val

1 5 10 15

Thr

<210> 122

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 122

Tyr Thr Ala Ile Ala Trp Val Lys Ala Phe Ile Arg Lys Leu Arg Lys

1 5 10 15

<210> 123

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 123

Ile Ala Trp Val Lys Ala Phe Ile Arg Lys Leu Arg Lys Gly Pro Leu

1 5 10 15

Gly

<210> 124

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 124

Arg Leu Ser Gly Met Asn Glu Val Leu Ser Phe Arg Trp Leu

1 5 10

<210> 125

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 125

Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr

1 5 10 15

<210> 126

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 126

Val Thr Trp Thr Pro Gln Ala Trp Phe Gln Trp Val

1 5 10

<210> 127

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 127

Gly Ser Pro Trp Gly Leu Gln His His Pro Pro Arg Thr

1 5 10

<210> 128

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 128

Gly Pro Phe His Phe Tyr Gln Phe Leu Phe Pro Pro Val

1 5 10

<210> 129

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 129

Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu

1 5 10

<210> 130

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 130

Arg Cys Gly Arg Ala Ser Arg Cys Arg Val Arg Trp Met Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Ile

<210> 131

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 131

Pro Tyr Ser Arg Pro His Val Gln Leu Trp Tyr Pro Asn Arg Glu Ser

1 5 10 15

Cys Arg Ser Leu Ile Arg Ser Leu Gly Pro

20 25

<210> 132

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 132

Pro Leu Ile Leu Leu Arg Leu Leu Arg Gly Gln Phe

1 5 10

<210> 133

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 133

Pro Leu Ile Tyr Leu Arg Leu Leu Arg Gly Gln Phe

1 5 10

<210> 134

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 134

Lys Leu Trp Met Arg Trp Tyr Ser Pro Thr Thr Arg Arg Tyr Gly

1 5 10 15

<210> 135

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Arg is D-Arg

<400> 135

Thr Arg Ile Asp Gln Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys

1 5 10

<210> 136

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 136

His Thr Gln Ser Leu Asp Gln Gly Tyr Asn Asp Asp Asp Asp Lys Ala

1 5 10 15

<210> 137

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成物

<400> 137

His Thr Gln Ser Leu Asp Gln Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5 10 15

Ala

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种向哺乳动物递送肉毒杆菌毒素(BoNT)的方法，其包括肌内注射一种包含多肽的药物组合物，所述多肽包含与细胞穿透肽(CPP)融合的BoNT，其中所述BoNT包含轻链和重链。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述CPP选自由锌指肽(ZFP，EKPYKCPECGKSFSASAALVAHQRTHTG，SEQ ID NO:1)、TAT(GRKKRRQRRRPQ，SEQ ID NO:18)、Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV，SEQ ID NO:19)，以及表3中提供的其他CPP组成的组。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述CPP与所述BoNT的所述轻链的N端融合。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述CPP与所述BoNT的所述重链的C端融合。

5.根据权利要求1所述的方法，其包含至少两个CPP，其中所述CPP中的至少一个与所述轻链的N端融合，所述CPP中的另一个与所述重链的C端融合。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少50％、优选至少75％、80％、85％、90％或95％的所述BoNT包含单个多肽链上的所述轻链和所述重链。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少50％、优选至少75％、80％、85％、90％或95％的所述BoNT由昆虫细胞表达。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾细胞。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述肌内注射是在皮肤下或眼睛粘膜下，或在耳、鼻、口、唇、尿道口、肛门或舌头处。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物需要治疗面部皱纹、肌张力障碍、痉挛、面肌痉挛、多汗症或唾液分泌过多症。

11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物需要进行肌肉塑形。

12.一种药物制剂，其包含药学上可接受的赋形剂和多肽，所述多肽包含与细胞穿透肽(CPP)融合的BoNT，其中所述BoNT包含轻链和重链。

13.根据权利要求12所述的药物制剂，其为冻干制剂。

14.根据权利要求12所述的药物制剂，其为可注射溶液。

15.根据权利要求14所述的药物制剂，其被配制用于肌内注射。

16.根据权利要求12至15中任一项所述的药物制剂，其中所述CPP选自由锌指肽(ZFP，EKPYKCPECGKSFSASAALVAHQRTHTG，SEQ ID NO:1)、TAT(GRKKRRQRRRPQ，SEQ ID NO:18)、Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV，SEQ ID NO:19)，以及表3中提供的其他CPP组成的组。

17.根据权利要求12至16中任一项所述的药物制剂，其中所述CPP与所述BoNT的所述轻链的N端融合。

18.根据权利要求12至16中任一项所述的药物制剂，其中所述CPP与所述BoNT的所述重链的C端融合。

19.根据权利要求12至16中任一项所述的药物制剂，其包含至少两个CPP，其中所述CPP中的至少一个与所述轻链的N端融合，所述CPP中的另一个与所述重链的C端融合。

20.根据权利要求12至19中任一项所述的药物制剂，其中所述组合物中至少50％、优选至少75％、80％、85％、90％或95％的所述BoNT包含单个多肽链上的所述轻链和所述重链。

21.根据权利要求12至20中任一项所述的药物制剂，其中所述组合物中至少50％、优选至少75％、80％、85％、90％或95％的所述BoNT由昆虫细胞表达。

22.根据权利要求21所述的药物制剂，其中所述昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾细胞。

23.根据权利要求1至11中任一项所述的方法或根据权利要求12至22中任一项所述的药物制剂，其中所述BoNT选自BoNT A、B、C、D、E、F或G或与其具有至少90％序列同一性的变体。

24.根据权利要求23所述的药物制剂，其中所述BoNT选自亚型BoNTA1至A10、B1至B8、E1至E9，以及F1至F7。

25.根据权利要求23所述的药物制剂，其中所述BoNT为BoNT A。

Claims (25)

1.一种向哺乳动物递送肉毒杆菌毒素(BoNT)的方法，其包括肌内注射一种包含多肽的药物组合物，所述多肽包含与细胞穿透肽(CPP)融合的BoNT，其中所述BoNT包含轻链和重链。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述CPP选自由锌指肽(ZFP，EKPYKCPECGKSFSASAALVAHQRTHTG，SEQ ID NO:1)、TAT(GRKKRRQRRRPQ，SEQ ID NO:18)、Pep-1(N-乙酰基-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-OH，SEQ ID NO:19)，以及表3中提供的其他CPP组成的组。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述CPP与所述BoNT的所述轻链的N端融合。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述CPP与所述BoNT的所述重链的C端融合。

5.根据权利要求1所述的方法，其包含至少两个CPP，其中所述CPP中的至少一个与所述轻链的N端融合，所述CPP中的另一个与所述重链的C端融合。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少50％、优选至少75％、80％、85％、90％或95％的所述BoNT包含单个多肽链上的所述轻链和所述重链。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少50％、优选至少75％、80％、85％、90％或95％的所述BoNT由昆虫细胞表达。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾细胞。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述肌内注射是在皮肤下或眼睛粘膜下，或在耳、鼻、口、唇、尿道口、肛门或舌头处。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物需要治疗面部皱纹、肌张力障碍、痉挛、面肌痉挛、多汗症或唾液分泌过多症。

11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物需要进行肌肉塑形。

12.一种药物制剂，其包含药学上可接受的赋形剂和多肽，所述多肽包含与细胞穿透肽(CPP)融合的BoNT，其中所述BoNT包含轻链和重链。

13.根据权利要求12所述的药物制剂，其为冻干制剂。

14.根据权利要求12所述的药物制剂，其为可注射溶液。

15.根据权利要求14所述的药物制剂，其被配制用于肌内注射。

16.根据权利要求12至15中任一项所述的药物制剂，其中所述CPP选自由锌指肽(ZFP，EKPYKCPECGKSFSASAALVAHQRTHTG，SEQ ID NO:1)、TAT(GRKKRRQRRRPQ，SEQ ID NO:18)、Pep-1(N-乙酰基-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-OH，SEQ ID NO:19)，以及表3中提供的其他CPP组成的组。

17.根据权利要求12至16中任一项所述的药物制剂，其中所述CPP与所述BoNT的所述轻链的N端融合。

18.根据权利要求12至16中任一项所述的药物制剂，其中所述CPP与所述BoNT的所述重链的C端融合。

19.根据权利要求12至16中任一项所述的药物制剂，其包含至少两个CPP，其中所述CPP中的至少一个与所述轻链的N端融合，所述CPP中的另一个与所述重链的C端融合。

20.根据权利要求12至19中任一项所述的药物制剂，其中所述组合物中至少50％、优选至少75％、80％、85％、90％或95％的所述BoNT包含单个多肽链上的所述轻链和所述重链。

21.根据权利要求12至20中任一项所述的药物制剂，其中所述组合物中至少50％、优选至少75％、80％、85％、90％或95％的所述BoNT由昆虫细胞表达。

22.根据权利要求21所述的药物制剂，其中所述昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾细胞。

23.根据权利要求1至11中任一项所述的方法或根据权利要求12至22中任一项所述的药物制剂，其中所述BoNT选自BoNT A、B、C、D、E、F或G或与其具有至少90％序列同一性的变体。

24.根据权利要求23所述的药物制剂，其中所述BoNT选自亚型BoNT A1至A10、B1至B8、E1至E9，以及F1至F7。

25.根据权利要求23所述的药物制剂，其中所述BoNT为BoNT A。