KR101134146B1 - 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법 - Google Patents

국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법과 이에 의하여 정제된 비확산형 보툴리눔 독소에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제를 염화나트륨(NaCl)의 농도를 조절하여 첨가한 음이온 크로마토그래피를 수행하여 아분획을 분리하는 단계와 상기 아분획 중 A260/A280의 값이 일정범위인 분획을 수득하는 단계를 포함하여 이루어지는 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법과, 이에 의하여 정제된 것으로 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 목적하는 부분에 근마비효과가 발생되고 그 외의 부분에는 독소가 확산되지 않으면서, 근마비 효과가 빠르고 지속적으로 발생하는 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소를 다량으로 얻을 수 있다.

Description

국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법{A method of isolating a non-diffusible and local-paralyzing botulinum toxin subfraction from conventional toxin preparations for clinical use}
본 발명은 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법과 그에 의하여 얻어진 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소에 관한 것이다.
미국 식품의약품안전청(FDA)은 주름제거 등 미용치료에 쓰이는 '보톡스'(Botox)가 심한 경우 사망 등 심각한 부작용을 일으킬 수 있다고 경고했다.
"보톡스를 주사한 부위가 아닌 다른 부위에 근육마비 반응이 일어나는 부작용이 보고됐다"며 "보톡스 주사를 맞고 병원에 입원하거나 사망하기도 했다"고 말했다. 심각한 보톡스 부작용이 발생한 환자 대부분은 뇌성마비로 인한 근육경직을 치료하기 위해 다리 근육에 보톡스 주사를 맞은 어린이 환자들이라고 FDA는 밝혔다.
국내에서도 보톡스는 뇌성마비 환자 근육 치료는 물론 경직된 목 근육 치료나 안면 근육 경직으로 인한 통증 치료 및 성대 마비 치료 등에 광범위하게 쓰이고 있다. 미용 치료 분야에서는 주름살 제거?피부 노화 방지 치료 등에 쓰이고 있으며, 최근 노화 방지 의료가 유행을 이루면서 보톡스 사용량은 매년 증가하고 있다.
보톡스를 근육에 주사하면 근육 신경이 마비되는 효과가 있다. 이로 인해 다리 근육이 과도하게 경직된 뇌성마비 어린이에게 보톡스를 주사해 걸음걸이를 자연스럽게 하는 치료가 시행돼 왔다. FDA는 보톡스 독소가 다리 외에 체내의 다른 부위로 퍼져나가면서 호흡 근육기능에 영향을 미쳐 부작용이 발생한 것으로 보고 있다[FDA NEWS RELEASE FOR IMMEDIATE RELEASE April 30, 2009, FDA Patient Safety News: Show #74, April 2008]. FDA는 이와 관련, "보톡스를 맞고 나서 호흡이 느려지거나 삼키기 힘들어지는 증세가 생기는지 환자와 의사들은 주의할 필요가 있다"고 말했다[FDA-approved Patient Labeling 7/31/09 APPENDIX 1: MEDICATION GUIDE BOTOX, BOTOX Cosmetic(Boe-tox)(on a botulinum toxin A) for Injection)].
그러나 FDA는 "주름살 제거 등 미용 목적으로 쓰인 보톡스 주사에서는 아직까지 심각한 부작용 사례가 보고된 바 없다"고 말했다. FDA는 이와 관련해 의사들에게 보톡스 처방을 중단하라는 조치를 취하지는 않았다.
미국의 소비자 단체들은 최근 "1997년부터 2006년까지 FDA에 보고된 보톡스 관련 부작용 사례가 180건이고 그 중 16건의 사망 사례도 있다"며 보톡스 사용시 이상 반응이 생길 수 있다는 경고를 강화하라는 청원을 FDA에 냈었다.
종래의 발명에서는 산침전(USP 7,354,740. Animal product free system and process for purifying a botulinum toxin, Allergan, Inc.), 또는 산침전 후 크로마토그래피를 추가적으로 시행(USP 7,452,697. Chromatographic method and system for purifying a botulinum toxin, Allergan, Inc. 한국특허출원제10-2008-0016800호 클로스트리디움 보툴리눔으로부터 보툴리눔 독소를 정제하는 방법, 메덱스젠; 한국특허출원 제10-2002-0000685호 클로스트리디움 보툴리눔 Ａ형 독소를 정제하는 방법, 메디톡스)하여 보툴리눔 독소를 정제하여 왔다.
그러나, 상기한 방법으로 정제된 보툴리눔 독소는 상당량이 치료부위 이외의 체내로 퍼져 주변 장기나 호흡 근육이 마비되는 증상이 나타나고 있으며, 심각한 경우에는 사망에 이르는 심각한 부작용을 갖는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 제안되는 것으로, 산침전 또는 산침전 후 크로마토크래피에 의하여 정제된 기존의 보툴리눔 독소 A형 제제를 염화나트륨을 사용하여 음이온 이온교환수지 크로마토그래피하여 3개의 이질적인 아분획이 존재함을 확인하고, 그 중 하나의 아분획이 근마비 활성을 가지면서도 체내 비확산형임을 확인하였다.
즉, 본 발명은 체내 비확산형이면서 국소제한적으로 근마비 활성을 가지는 비확산형 보툴리눔 독소와 이를 분리하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법은, 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제를 pH는 4.5 내지 6.5 범위, 염화나트륨(NaCl)의 농도를 0.02 내지 0.2M로 조절하여 첨가한 음이온 이온교환수지 크로마토그래피를 수행하여 아분획을 분리하는 단계; 및, 상기 아분획 중 A260/A280의 값이 0.4 내지 0.6 수준을 유지하는 비확산성 보툴리눔 독소 분획을 수득하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소는, 상기한 방법에 의하여 분리 정제된 것으로, 독소 100U/ml당 Zn 이온이 적어도 150ppb, Fe 이온이 적어도 80ppb, Mg 이온이 적어도 140ppb로 포함되는 것을 특징으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소를 판별하는 방법은, 상기 비확산형 보툴리눔 독소를 그의 반수치사량의 1.5 내지 3배의 양으로 마우스 우하지에 주사하고, 우하지 근육과 호흡근의 마비 여부와 치사여부를 판단하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법을 단계별로 구체적으로 설명한다.
본 발명은, 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제를 염화나트륨(NaCl)의 농도를 조절하여 첨가한 음이온 크로마토그래피를 수행하여 아분획을 분리하는 단계와 상기 아분획 중 A260/A280의 값이 0.4 내지 0.6 수준을 유지하는 비확산성 보툴리눔 독소 분획을 수득하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법은 기존의 산침전법이나 산침전 후 이온수지 크로마토그래피를 이용하여 얻어진 보툴리눔 독소를 다시 본 발명의 발명자에 의하여 제안된 새로운 음이온 이온교환수지 크로마토그래피법을 적용하여 비확산형 보툴리눔 독소의 분획을 획득하는 방법이다.
따라서, 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법에는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) A 형 균주 배양액으로부터 보툴리눔 독소 A 형 제제를 산침전시키거나, 산침전 후 크로마토그래피에 의하여 분리하고 정제하여 얻어진 보툴리눔 독소 A 형 제제를 사용한다.
상기한 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제를 염화나트륨을 사용하여 음이온 이온교환수지 크로마토그래피를 수행할 경우, 이온교환 수지로부터 3개의 아분획을 얻을 수 있다. 상기 음이온 이온교환수지 크로마토그래피를 수행하기 위하여 사용되는 완충액은 아세트산나트륨(sodium acetate) 완충액이었으며, 여기에 아분획을 얻기 위해 첨가되는 염화나트륨 농도를 순차적으로 높여 분리되는 각 분획을 취하는데, 염화나트륨을 사용하지 않을 경우(농도 0M NaCl)에는 분리되는 분획은 체내 확산형 활성분획(peak I, pI)임이 확인되었고, 염화나트륨의 농도를 0.02 내지 0.2 M로 한 경우에 분리되는 분획은 체내 비확산형 활성분획(peak II, PII) 임이 확인되었으며, 염화나트륨의 농도를 이보다 높여 1M 으로 한 경우에 분리되는 분획은 체내 확산형 비활성분획(peak III, pIII)임이 확인되었다.
즉, 상기한 pII를 얻기 위하여 사용되는 염화나트륨의 농도는 0.02 내지 0.2M 범위이며, 염화나트륨을 사용하지 않거나, 염화나트륨의 농도가 상기 범위보다 높거나 낮을 경우에는 수득되는 아분획에 pI 또는 pIII 분획이 혼합될 수 있으므로 본 발명에서 목적하는 국소적 근마비 효과를 가지는 비확산형 활성분획을 얻기 곤란하다.
한편, 상기와 같이 염화나트륨을 사용한 음이온 이온교환수지 크로마토그래피의 경우 완충액의 pH가 4.5 내지 5.5 범위에서 수행될 경우, 분리되는 아분획 중 pI 또는 pIII 분획의 혼합 정도가 적어지고 pII 분획의 순도가 높아지는데, 이는 A260/A280을 비교하거나 마우스 우하지근육주사시 마비부위 정도로 확인할 수 있다.
또한, 상기와 같이 염화나트륨을 사용한 음이온 이온교환수지 크로마토그래피의 경우 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제 시료양이 사용되는 음이온 이온교환수지 크로마토그래피 칼럼 부피 대비 1/5 내지 1배 범위에서 수행될 경우 pII의 분획량이 커진다. 즉, 칼럼의 부피가 1ml 이고 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제 시료양이 0.2 내지 1 ml일 경우 얻어지는 pII의 분획량은 20% 내지 50% 범위로 나타낸다.
한편, 상기한 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법에 의하여 얻어진 pII 분획은 마우스를 사용하여 확인한 반수치사량(total LD50)이 1 X 105 U/ml 내지 5 X 105 U/ml 로 나타나는 등 안정한 것으로 확인되었으며, 처치 대상에 투여시 목적 부위 외로 확산되는 현상이 없고, 시판제품과 비교할 경우 근마비 효과 개시가 유의적으로 빠른 것을 확인할 수 있으며, 근마비 지속시간이 길다는 것을 확인할 수 있다.
또한, 상기한 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법에 의하여 얻어진 비확산형 보툴리눔 독소(pII 분획)는 독소 100U/ml당 Zn 이온이 적어도 150ppb, Fe 이온이 적어도 80ppb, Mg 이온이 적어도 140ppb로 포함되는 것으로, 기존의 방법에 의하여 정제된 보툴리눔 독소 A 형 보다 Mg, Fe 및 Zn 의 함량이 유의적으로 높게 나타나는 특징이 확인되었다.
이러한 본 발명의 정제방법에 의하여 얻어진 비확산형 보툴리눔 독소는 그의 반수치사량의 1.5 내지 3 배의 양으로 마우스의 우하지에 주사시, 우하지 근육은 마비되는 반면, 호흡근의 마비나 치사활성을 없는 것으로 확인되었고, 이로써 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소의 확산 여부를 판별할 수 있다.
상기한 본 발명에 의하면, 목적하는 부분에 근마비효과가 발생되고 그 외의 부분에는 독소가 확산되지 않으면서, 근마비 효과가 빠르고 지속적으로 발생하는 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소를 얻을 수 있다.
또한 본 발명에 의하면, 기존과 달리 각 생산 배치별 단백질 대비 독소 역가가 높은 비확산형 보툴리눔 독소를 얻을 수 있다.
또한 본 발명에 의하면, 음이온 크로마토그래피 조건을 조절하여 확산성 독소와 혼합되지 않는 비확산형 보툴리눔 독소를 다량으로 얻을 수 있다.
도 1은 실시예 1에 의하여 아분획을 분리한 결과를 나타낸 이온수지 크로마토그래피 결과이다.
도 2는 버퍼의 pH 변화에 의한 아분획 피크%의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 시료 시료양에 따른 각 아분획 피크%의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 1에 의하여 분리된 아분획 중 활성분획(pI 및 pII)의 투여량(A) 및 투여 후 시간 변화(B)에 따른 생존율을 나타낸 것이다[Mouse: ICR, female, 4week, 18~22g n=10, IM injection into right hind leg].
도 5는 실시예 1에 의하여 분리된 아분획 중 체내 비확산형 활성분획(pII)과 기존 시판제품을 마우스의 우하지에 투여 후 12 시간의 체내 확산성을 비교한 사진이다.
도 6은 실시예 1에 의하여 분리된 아분획 중 체내 비확산형 활성분획(pII)과 기존 시판제품을 마우스의 우하지에 투여 후 투여량(A) 및 투여 후 시간(B)에 따른 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 1에 의하여 분리된 아분획 중 체내 비확산형 활성분획(pII)과 기존 시판제품 1U씩 마우스의 우하지에 투여 후 근마비 효과 개시 시간을 비교한 그래프이다.
도 8은 실시예 1에 의하여 분리된 아분획 중 체내 비확산형 활성분획(pII)과 기존 시판제품 0.5U씩 마우스의 우하지에 투여 후 근마비효과 지속시간을 비교한 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예 및 도면 등에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예 및 도면 등에 의하여 한정되는 것은 아니다. 이하, 본 발명의 실시예 등에서 사용된 시판제품은 USP 7,354,740[Animal product free system and process for purifying a botulinum toxin]에 개시된 방법에 의하여 제조된 알러간 사(Allergan, Inc)의 보톡스 제제(Lot#: C2066 C2, C2481 C2)이나, 본 발명이 이에 제시된 시판제품이나 방법에 의하여 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제에만 적용되는 것은 아니며, 그 외 산침전 등에 의하여 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제로서 사용 가능한 것이면 충분히 적용될 수 있을 것이다.
실시예 1. 음이온 이온수지 크로마토그래피 분리 분획
보툴리눔 독소 배양액을 기존의 산침전법으로 정제한 정제물을 시료로 하여 음이온 크로마토그래피를 실시하여 3개의 아분획을 분리하였으며, 분리 결과는 도 1 에 나타내었다[pI, Peak I(체내 확산형 활성분획); pII, Peak II(체내 비확산형 활성분획); pIII, PeakIII(비활성 분획)].
음이온 이온교환 크로마토그래피 시 사용기기는 AKTA FPLC(GE Healthcare)이고, 사용 칼럼(column)은 Hitrap DEAE FF 1ml(GE healthcare, Cat# 17-5055-01)이며, 사용 완충액(buffer)는 러닝 완충액(running buffer)로서 아세트산나트륨 완충액(Sodium Acetate buffer)(pH 5.5), 일루션 완충액(elution buffer)로서 아세트산나트륨(Sodium Acetate buffer) +1M 염화나트륨 (pH 5.5), 일루션(Elution) 조건 0M NaCl로 unbound wash(pI, 체내 확산형 활성분획) 후 0.05M NaCl(pII, 체내 비확산형 활성분획)을 이용하여 피크(peak) 분리 후 1M NaCl로 일루션(elution)(pIII, 비활성 분획), 유속(Flow rate) 1ml/min, 시료 전처리로서 산침전 후 탈염(desalting)하여 사용하였다.
실시예 2. 버퍼( Buffer ) pH 변화에 의한 피크( Peak ) 변화 및 특성
상기 음이온 이온교환 크로마토그래피 시 사용한 버퍼의 pH의 변화에 따른 아분획의 피크 %는 도 2 에 나타내었다. 도 2 에 도시한 바와 같이, 버퍼의 pH가 4.5 내지 5.5 범위인 경우 pII의 피크%가 커짐을 확인할 수 있다. 버퍼의 pH에 따른 아분획의 A260/A280 는 다음 표 1에 나타내었으며, 반수치사량(Total LD50(Unit))을 다음 표 2 에 나타내었다.
A260/A280
pH 4.5 pH 5.0 pH 5.5 pH 6.0
pI 0.76± 0.15 0.69± 0.09 0.67± 0.05 0.63± 0.08
pII 0.50± 0.05 0.55± 0.04 0.55± 0.03 0.81± 0.19
pIII 0.76± 0.10 0.82± 0.13 0.84± 0.12 0.79± 0.09
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 버퍼의 pH가 4.5 내지 5.5 범위인 경우, A260/A280가 0.45 내지 0.6 으로 나타나서 투여 시료로 적합한 것으로 판단할 수 있다.
따라서, 정제된 체내 비확산형 활성분획(pII)을 얻기 위해서는 버퍼의 pH를 4.5 내지 5.5 로 조절하는 것이 바람직할 것이다.
Total LD50(Unit)
pH 4.5 pH 5.0 pH 5.5 pH 6.0
기존 산침전법 정제물(전시료) 5± 0.8 5± 1 5± 0.8 5± 1.2
pI 1.5± 0.4 3± 0.5 2± 0.4 2± 0.8
pII 0.2± 0.2 1± 0.2 3± 0.4 0.4± 0.2
pIII - 0.2± 0.1 0.2± 0.1 2± 1
(단위: 105 U)
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 버퍼의 pH가 5.0 내지 5.5 범위인 경우, 반수치사량이 0.8 X 105 U/ml 내지 3.5 X 105 U/ml 으로 나타나서 pII의 회수율이 높은 것으로 판단할 수 있다.
따라서, 안정한 체내 비확산형 활성분획(pII)을 얻기 위해서는 버퍼의 pH를 5.0 내지 5.5 로 조절하는 것이 바람직할 것이다.
실시예 3. 시료양 ( sample loading ) 변화에 의한 피크 변화 및 특성
실시예 1과 동일한 방법으로 아분획을 얻되, 이를 위한 시료의 양 변화에 의한 각 아분획(pI, pII 및 pIII)의 피크 특성 변화를 도 3 에 나타내었고, 각 아분획별 A260/A280의 변화를 다음 표 3에 나타내었으며, 반수치사량(Total LD50 (Unit))을 다음 표 4 에 나타내었다.
A260/A280
0.25 ml 0.5ml 1ml 2ml
pI 0.67± 0.08 0.64± 0.07 0.68± 0.09 0.67± 0.13
pII 0.55± 0.02 0.56± 0.01 0.55± 0.04 0.55± 0.03
pIII 0.85± 0.14 0.84± 0.09 0.82± 0.18 0.84± 0.24
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 시료양이 0.25 내지 2 ml 범위인 경우, A260/A280가 0.4 내지 0.6 으로 나타나서 투여 시료로 적합한 것으로 판단할 수 있다.
따라서, 체내 비확산형 활성분획(pII)을 다량으로 얻기 위해서는 시료양을 컬럼 부피 대비 1/5 내지 2배 범위로 조절하는 것이 바람직할 것이다.
Total LD50(Unit)
0.25 ml 0.5 ml 1 ml 2 ml
기존 산침전법 정제물(전시료) 2.5± 0.5 5± 1 10± 4 20± 5
pI 0.8± 0.2 1.6± 0.4 5± 2 15± 4.8
pII 1.6± 0.2 4± 0.6 4± 0.9 4± 1.5
pIII 0.2± 0.1 0.4± 0.1 0.8± 0.2 0.6± 0.3
(단위: 105 U)
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 시료양이 0.25 내지 1 ml 범위인 경우, 반수치사량이 0.8 X 105 U/ml 내지 3.5 X 105 U/ml 으로 나타나서 pII의 회수율이 높은 것으로 판단할 수 있다.
따라서, 안정한 체내 비확산형 활성분획(pII)을 얻기 위해서는 시료양을 컬럼 부피 대비 1/5 내지 1배 범위로 조절하는 것이 바람직할 것이다.
실험예 1. 근마비 효과 비교 시험 방법
1) 우하지근육주사 방법
상기 실시예 1에 의하여 분리된 아분획의 근마비 효과를 확인하기 위하여 마우스를 사용하여 우하지근육 주사법을 수행하였다.
사용한 마우스(ICR mouse, female, 4week, 18~22g)는 실험군당 10 마리이며, 마우스의 무게를 정확히 측정하고 기록한 후 50 ㎕ 해밀턴 주사기에 상기 아분획을 1U/20 ㎕ 농도로 단위에 맞게 공기 없이 채운 다음 ICR 마우스의 오른쪽 뒷다리 발목부위에서 바늘을 3cm가량 집어넣어 근육내에 주사하였다. 근육내 주사 후 시간대별로 다음 표 5에 제시된 마비지수 및 측정기준에 준하여 마비지수 및 사망유무를 관찰하여 그 결과를 도 4 에 나타내었다.
Score 측정 기준
0 정상 쥐의 발 모양새와 걸음걸이
1 발가락은 모아지지 않았으나 걸을 때 다리를 끈다.
2 1의 기준과 함께 발가락이 모아져 있다.
3 2의 기준과 함께 발마디가 안쪽으로 굽어있다.
4 3의 기준과 함께 발이 다리근육쪽으로 완전히 붙어있으며 다리를 못 쓴다.
분획 마우스 우하지주사시 마비부위
체내 확산형 활성 분획 우하지, 횡경막, 좌하지 등 체내 여러 부위
체내 비확산형 활성 분획 우하지
체내 확산형 비활성 분획 -
도 4 에 도시된 바와 같이, 상기 실시예 1 에서 분리된 아분획 중 체내 비확산형 활성분획(pII)는 확산형 활성분획(pI)에 비하여 투여용량대비 유의한 생존률 증가를 보였고(A), 투여용량 2U에서 시간 경과에 따른 생존율은 pII 100% 대비 pI 0%의 극단적인 차이를 나타냄(B)을 확인할 수 있다.
실험예 2. 시판제품과 체내 비확산형 활성분획(pII)간의 체내 확산성 비교
시판제품(알러간사 보톡스(Lot#: C2066 C2, C2481 C2))과 상기 실시예 1 에 의하여 분리된 아분획 pII의 근마비 효과를 확인하기 위하여 마우스를 사용하여 우하지근육 주사법을 수행하였다.
사용한 마우스(ICR mouse, female, 4week, 18~22g)는 실험군당 10 마리이며, 마우스의 무게를 정확히 측정하고 기록한 후 50 ㎕ 해밀턴 주사기에 정제 전 시료와 아분획 pII 을 1U/20 ㎕ 농도로 단위에 맞게 공기 없이 채운 다음 ICR 마우스의 오른쪽 뒷다리 발목부위에서 바늘을 3cm가량 집어넣어 근육내에 주사하였다. 근육내 주사 후 체내 확산성을 마우스의 마비정도를 육안으로 확인하고 주사 후 12 시간이 경과된 마우스의 상태를 사진을 도 5에 나타내었으며, 투여시간 및 투여량에 따른 사망 유무를 관찰한 결과를 도 6에 나타내었다. 또한, 근마비 효과 개시 시간은 도 7에 나타내었고, 근마비효과 지속시간을 도 8에 나타내었다.
도 5에 도시된 바와 같이, pII는 근육내 주사한 우하지만 마비되나, 기존 시판제품은 허리 및 반대쪽 다리까지 확산되어서 마비되었음을 보여준다.
도 6에 도시된 바와 같이, pII는 시판제품에 비하여 투여용량 대비 유의한 생존률 증가를 보였고(A), 투여용량 2U에서 시간 경과에 따른 생존율은 pII 100% 대비 기존 기술제조품 0%의 극단적인 차이를 나타냄을 확인할 수 있다(B).
도 7에 도시된 바와 같이, pII는 시판제품에 비하여 투여용량 1U에서 근마비효과 개시가 유의적으로 빠르게 나타남을 확인할 수 있다.
도 8에 도시된 바와 같이, pII는 시판제품에 비하여 투여용량 0.5U에서 근마비효과가 지속기간이 80일 이상 길었다.
실험예 3. 보툴리눔 독소 동결건조물의 이온함량 분석
시판제품(알러간사 보톡스(Lot#: C2066 C2, C2481 C2))과 상기 실시예 1 에 의하여 분리된 아분획 pII의 동결건조물간의 이온함량에 대한 분석을 수행하였다.
시판제품과 비교하기 위하여 pII 분획을 희석하여 같은 양의 보툴리눔 독소(100U)와 부수 첨가물을 병입하여 동결건조를 수행하였으며 마우스 반수치사 시험법을 이용하여 시판제품과 pII 동결건조물간의 활성이 동일함을 확인한 후 이온함량 분석을 진행하였다. 두 동결건조물을 증류수 10ml을 이용하여 녹인 후 유도결합 플라즈마 질량분석기를 이용하여 이온함량을 측정하였으며, 그 결과를 다음 표 7에 나타내었다.
Mg Fe Zn
pII 183.0 ± 19.3* 105.4 ± 22.1** 332.6 ± 140.8***
시판제품 78.1 ± 7.4* 39.6 ± 3.3 65.6 ± 25.9
* p<0.0015, ** p<0.011, ***p<0.045
상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의하여 정제된 비확산형 보툴리눔 독소(pII분획)의 동결건조물이 시판제품에 비하여 Mg, Fe, Zn이온의 함량이 유의적으로 높음을 확인할 수 있었다.
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.
pI는 체내 확산형 활성분획, pII는 체내 비확산형 활성분획, pIII는 체내 확산형 비활성 분획이다.
도 5에서 부분은 마비된 부분을 나타낸다.

Claims (3)

  1. 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제를 pH는 4.5 내지 6.5 범위, 염화나트륨(NaCl)의 농도를 0.02 내지 0.2M로 조절하여 첨가한 음이온 이온교환수지 크로마토그래피를 수행하여 아분획을 분리하는 단계; 및,
    상기 아분획 중 A260/A280의 값이 0.4 내지 0.6 수준을 유지하는 비확산성 보툴리눔 독소 분획을 수득하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법.
  2. 청구항 1에 의하여 분리 정제된 것으로,
    독소 100U/ml당 Zn 이온이 적어도 150ppb, Fe 이온이 적어도 80ppb, Mg 이온이 적어도 140ppb로 포함되는 것을 특징으로 하는 비확산형 보툴리눔 독소
  3. 청구항 2의 비확산형 보툴리눔 독소를 그의 반수치사량의 1.5 내지 3배의 양으로 마우스 우하지에 주사하고, 우하지 근육과 호흡근의 마비 여부와 치사여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 비확산형 보툴리눔 독소를 판별하는 방법.
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