ES2659820T3 - Toxina botulínica no difusiva que provoca una parálisis muscular localizada y procedimiento de purificación de la misma - Google Patents
Toxina botulínica no difusiva que provoca una parálisis muscular localizada y procedimiento de purificación de la misma Download PDFInfo
- Publication number
- ES2659820T3 ES2659820T3 ES11789976.5T ES11789976T ES2659820T3 ES 2659820 T3 ES2659820 T3 ES 2659820T3 ES 11789976 T ES11789976 T ES 11789976T ES 2659820 T3 ES2659820 T3 ES 2659820T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- botulinum toxin
- propagation
- pii
- toxin
- botulinum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 title claims description 38
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 title claims description 23
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 title claims description 11
- 239000003053 toxin Substances 0.000 title claims description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 15
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 claims abstract description 46
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 44
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 15
- 229940094657 botulinum toxin type a Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 claims description 21
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 15
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 15
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 210000003019 respiratory muscle Anatomy 0.000 claims description 5
- 244000309466 calf Species 0.000 claims description 4
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 20
- 229940089093 botox Drugs 0.000 description 20
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 13
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 8
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 8
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 5
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 5
- 229960004716 idoxuridine Drugs 0.000 description 5
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 3
- 206010052904 Musculoskeletal stiffness Diseases 0.000 description 3
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001807 Botulinum neurotoxin A light chain Proteins 0.000 description 1
- 101710117542 Botulinum neurotoxin type A Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 description 1
- 208000005248 Vocal Cord Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 108010079650 abobotulinumtoxinA Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 238000005844 autocatalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940066189 botox cosmetic Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940098753 dysport Drugs 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 1
- 210000003108 foot joint Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000012729 immediate-release (IR) formulation Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000009616 inductively coupled plasma Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000004220 muscle function Effects 0.000 description 1
- 210000004237 neck muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
- A61K38/4893—Botulinum neurotoxin (3.4.24.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P23/00—Anaesthetics
- A61P23/02—Local anaesthetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/96—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation using ion-exchange
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Anesthesiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
Abstract
Procedimiento para purificar una toxina botulínica sin propagación, que comprende las etapas de: separar el producto de toxina botulínica de tipo A en subfracciones mediante la realización de cromatografía de intercambio iónico usando un tampón de pH 4,5 a 5,5 y 0,02-0,2 M de cloruro de sodio (NaCl); y recoger una subfracción de toxina botulínica sin propagación que tiene un valor de A260/A280 de 0,4-0,6, a partir de dichas subfracciones separadas.
Description
DESCRIPCIÓN
Toxina botulínica no difusiva que provoca una parálisis muscular localizada y procedimiento de purificación de la misma
5
Campo técnico
[0001] La presente invención se refiere a un procedimiento para la purificación de una toxina botulínica sin propagación que provoca parálisis muscular localizada y a una toxina botulínica sin propagación obtenida de este modo. 10
Técnica anterior
[0002] La Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos (FDA) advirtió que el Botox® que se utiliza con fines cosméticos, tales como la eliminación de arrugas, puede causar efectos secundarios graves, tales como la 15 muerte, en los casos graves.
[0003] La FDA de los Estados Unidos dijo que se describió un efecto secundario de la parálisis muscular en zonas distintas de un área inyectada con Botox® y que personas inyectadas con Botox® fueron hospitalizadas o murieron.
20
[0004] Además, la FDA de los Estados Unidos dijo que los pacientes en los que se produjeron efectos secundarios graves por Botox® eran en su mayoría pacientes infantiles cuyos músculos de la pierna fueron inyectados con Botox® con el fin de curar la rigidez muscular causada por la parálisis cerebral.
[0005] El Botox® se utiliza ampliamente para el tratamiento de los músculos de pacientes con parálisis cerebral, 25 rigidez muscular de cuello, dolor causado por la rigidez muscular y parálisis de las cuerdas vocales. En el campo de la terapia cosmética, el Botox® se utiliza para la eliminación de las arrugas y la prevención o el tratamiento del envejecimiento. Dado que las terapias anti-envejecimiento se han popularizado recientemente, la cantidad de Botox® utilizado ha aumentado cada año.
30
[0006] Cuando el Botox® se inyecta en los músculos, los nervios musculares se paralizan. Por lo tanto, el Botox® ha sido inyectado en niños con parálisis cerebral cuyos músculos de las piernas son excesivamente rígidos, con el fin de hacer que caminen de forma más natural.
[0007] La FDA considera que el Botox® influye en la función muscular respiratoria mientras se propaga a zonas 35 distintas de las piernas, lo que provoca efectos secundarios [FDA NEWS RELEASE FOR IMMEDIATE RELEASE, 30 de abril del 2009, FDA Patient Safety News: Show # 74, April 2008]. En relación con esto, la FDA dijo que los pacientes y los médicos deben prestar atención a si se produce una disminución de la tasa o dificultad para respirar en la deglución después de la inyección con Botox® [etiquetado para pacientes aprobado por la FDA 7/31/09 APPENDIX 1: MEDICATION GUIDE BOTOX, BOTOX cosmetic (Boe-tox®) (on a botulinum toxin A) for Injection)]. 40
[0008] Sin embargo, la FDA dijo que un efecto secundario grave de Botox® para fines cosméticos, tales como la eliminación de arrugas, aún no ha sido descrito. La FDA no requirió a los médicos detener los tratamientos con Botox® para fines cosméticos.
45
[0009] La Unión de Consumidores de Estados Unidos pidió a la FDA reforzar la advertencia de que se describieron 180 casos de efectos secundarios relacionados con el Botox® ante la FDA entre los años 1997 y 2006, y 16 casos de los mismos produjeron la muerte y que el uso de Botox® puede causar anormalidades.
[0010] En la técnica anterior, la toxina botulínica se ha purificado mediante la realización de la precipitación con 50 ácido (USP 7.354.740, titulada "Sistema libre de productos animales y procedimiento para purificar una toxina botulínica", Allergan, Inc.) o la realización de cromatografía después de la precipitación con ácido (USP 7.452.697, titulada "Procedimiento cromatográfico y sistema para la purificación de una toxina botulínica", Allergan, Inc; solicitud de patente coreana nº 10-2008-0016800, titulada "Procedimiento de purificación de la toxina botulínica de Clostridium botulinum, Medexgen Inc.; solicitud de patente coreana No. 10-2002-0000685, titulada "Procedimiento 55 para la purificación de la toxina A de tipo Clostridium botulinum", Medexgen Inc.).
[0011] Sin embargo, se sabe que las toxinas botulínicas purificadas por los procedimientos anteriores se propagan de manera significativa a las zonas en el cuerpo que no sean el área inyectada para paralizar los órganos circundantes o los músculos respiratorios, y en casos graves, causan efectos secundarios graves que conducen a la 60 muerte .
[0012] Ashraf Ahmed S. et al. (Journal of Protein Chemistry, vol. 23, no. 7, 2004, páginas 445-451) describen los efectos de los tampones y sales en la autocatálisis de la cadena ligera de la neurotoxina A botulínica, en presencia y ausencia de cloruro de zinc. Cliff Sandeep H. et al. (Journal of Cosmetic Dermatology, vol. 7, no. 1, 2008, páginas 65 50-54) dan a conocer que las diferentes formulaciones de toxina botulínica de tipo A presentan diferencias en el
grado de migración del complejo de neurotoxina-proteína desde su sitio de inyección.
[0013] Pickett et al. (Toxicon, vol. 54, no. 5, 2009, páginas 683-689) proporcionan una revisión de las propiedades farmacológicas de Dysport que influyen en la acción de la toxina, y también una comparación con otros productos de toxina botulínica. 5
[0014] Gilsdorf J. et al. (Protein Expression and Purification, vol. 46, no. 2, 2006, páginas 256-267) proporcionan la expresión, purificación y caracterización de cadena ligera de tipo B de Clostridium botulinum.
[0015] Li L. et al. (Protein Expression and Purification, vol. 17, no. 3, 1999, páginas 339-344) proporcionan un alto 10 nivel de expresión, purificación y caracterización de la cadena ligera de neurotoxina botulínica de tipo A recombinante. Brodsky Matthew A. et al. (Tremor and Other Hyperkinetic Movements, vol. 2, 2012) proporcionan una revisión que analiza las variables que afectan a la difusión de la toxina botulínica, incluyendo la composición de la proteína y tamaño molecular, así como factores de inyección. También se analizan datos de difusión a partir de estudios comparativos en modelos animales y ensayos clínicos humanos que ilustran las diferencias entre los 15 productos de toxina botulínica disponibles.
[0016] Kerscher M. et al. (Archive of Dermatological Research, vol. 304, núm. 2, 2011, páginas 155-161) proporcionan la investigación de la propagación de tres preparaciones aprobadas de toxina botulínica de tipo A, con y sin proteínas complejantes, midiendo y comparando el tamaño de la halos anhidróticos producidos después de la 20 inyección de dosis equivalentes en un volumen idéntico en la frente de los pacientes.
[0017] Ramírez-Castaneda J et al. (Movement disorders, 2013, XP055074742) proporcionan una revisión de la difusión, difusión, y la migración de la toxina botulínica.
25
[0018] Malizio CJ et al. (Methods in Molecular Biology, vol. 145, 2000, páginas 27-39) describen la purificación de la neurotoxina de C. botulinum de tipo A.
[0019] El documento KR-A-20050074806 describe un procedimiento para la producción de toxina botulínica cristalina. 30
[0020] El documento KR-A-20030060150 proporciona un procedimiento de purificación de toxina de Clostridium botulinum de tipo A.
[0021] Gessler F et al (Fems Inmunology and Medical Microbiology, vol. 24, 1999, pág. 361-367) proporcionan la 35 producción y purificación de neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo C y D.
[0022] El documento US-2005238664 da a conocer una formulación farmacéutica de toxina botulínica libre de proteínas de origen animal, que comprende una toxina botulínica y una albúmina recombinante, adecuada para la administración terapéutica a un paciente humano, y procedimientos para tratar pacientes con diversas 40 enfermedades y afecciones con formulación.
[0023] Walker TJ y Dayan SH (páginas J Clin Aesthet Dermatol, vol. 7, no. 2, 2014, 31-39) proporcionan una revisión de la literatura más reciente sobre todas las toxinas botulínicas disponibles comercialmente en Estados Unidos, sus indicaciones, aprobaciones de la Administración de Alimentos y Fármacos, y la manipulación. 45
[0024] Ranoux et al. (J Neurol Neurosurg Psychiatry, vol. 72, no. 4, 2002, páginas 459-462) proporcionan una comparación de la eficacia de Botox con dos proporciones diferentes de Dysport.
[0025] Sugiyama H et al. (Appl Environm Microbiol, vol. 33, no. 4, 1977, páginas 963-966) describen un 50 procedimiento de purificación para la obtención de cristales de C. botulinum de tipo A que se utilizan para muchos propósitos, por ejemplo, purificación de neurotoxinas (página 963, líneas 13-17 de la columna de la izquierda).
[0026] Schantz EJ y Johnson EA (Micro Rev, vol. 56, no. 1, 1992, páginas 80-99) describen los usos terapéuticos de la toxina de C. botulinum de tipo A, y mencionan explícitamente el problema técnico de la difusión (página 85, tres 55 últimos párrafos de la columna izquierda).
[0027] Chun et al. (Eur J Biochem, vol. 122, 1982, páginas 493-500) describen un cromatograma de un procedimiento convencional de preparación de toxina botulínica, en el que se eluye un primer pico que conduce al producto. 60
Descripción detallada de la invención
Problema técnico
65
[0028] Por lo tanto, la presente invención se ha realizado en vista de los problemas anteriormente mencionados, y
los presentes inventores han encontrado que, cuando se somete una toxina botulínica de tipo a existente purificada mediante cualquiera de precipitación ácida o cromatografía después de la precipitación ácida, cromatografía de intercambio iónica usando cloruro de sodio, se obtienen tres subfracciones heterogéneas, y una subfracción de las mismas tiene actividad paralizante de los músculos, y, al mismo tiempo, no se propaga en el cuerpo.
5
[0029] Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar una toxina botulínica sin propagación, que no se propaga en el cuerpo y, al mismo tiempo, localiza la actividad paralizante de los músculos, y a un procedimiento para la purificación de la misma.
Solución técnica 10
[0030] Para lograr los objetivos anteriores, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para purificar una toxina botulínica sin propagación, que comprende las etapas de: separar el producto de toxina botulínica de tipo A en subfracciones mediante la realización de cromatografía de intercambio iónico usando un tampón de pH 4,5-5,5 y 0,02-0,2 M de cloruro de sodio (NaCl), y recoger una subfracción toxina 15 botulínica sin propagación, que tiene un valor de A260/A280 de 0,4-0,6, a partir de dichas subfracciones separadas.
[0031] De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona una preparación de toxina botulínica sin propagación, que se purifica por el procedimiento anterior, que comprende concentraciones de iones de Zn, Fe y Mg de al menos 150, 80, y 140 ppb por 100 U, respectivamente. 20
[0032] De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para determinar una toxina botulínica sin propagación, que comprende: inyectar la toxina botulínica sin propagación de la reivindicación 2 en el músculo de la pantorrilla de la extremidad posterior izquierda o derecha de ratón (4-6 semanas de vida, peso de 18-22 g) en una cantidad equivalente a 1,5-3 veces la LD50 de la toxina; y determinar si los 25 músculos de la extremidad posterior derecha y los músculos respiratorios del ratón se paralizaron y si el ratón murió.
[0033] De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona dicho procedimiento, en el que la preparación de toxina botulínica sin propagación muestra una tasa de supervivencia de al menos el 80% a las 96 horas después de la inyección de 2 U de preparación de toxina en el volumen 50 l en el músculo de la pantorrilla de 30 la extremidad posterior izquierda o derecha de ratón (4-6 semanas de vida, peso de 18-22 g).
Efectos ventajosos
[0034] Según la presente invención, se puede obtener una toxina botulínica sin propagación que causa parálisis 35 muscular localizada que causa parálisis muscular en un área deseada, no se propaga a otras áreas del sitio de administración y tiene el efecto de paralizar músculos en una de forma rápida y duradera.
[0035] Además, es posible obtener una toxina botulínica sin propagación que tiene un título de toxina elevado en comparación con productos de toxina botulínica convencionales. 40
[0036] Además, de acuerdo con la presente invención, se puede obtener una toxina botulínica sin propagación que no se mezcla con una toxina de propagación en grandes cantidades mediante el control de las condiciones cromatográficas de aniones.
45
Breve descripción de los dibujos
[0037] La figura 1 muestra los resultados de la separación de la toxina botulínica en subfracciones mediante cromatografía de intercambio iónico en el Ejemplo 1. 50
La figura 2 es un diagrama gráfico que muestra cambios en los % de área del pico de las subfracciones de acuerdo con los cambios en el pH del tampón.
La figura 3 es un diagrama gráfico que muestra un cambio en el % de área del pico de cada subfracción de acuerdo con el volumen de carga de una muestra.
La figura 4 muestra las tasas de supervivencia de acuerdo con los cambios en la dosis (A) y el tiempo después de la 55 administración (B) de las fracciones activas (pI y pII) entre las subfracciones separadas en el Ejemplo 1 [Ratón: ICR, hembra, 4 semanas de edad, 18-22 g, n = 10, inyección IM en la pata posterior derecha].
La figura 5 es un conjunto de fotografías que muestran una comparación de la difusión en el cuerpo desde el sitio de la administración medida 12 horas después de administrar una fracción activa sin propagación (pII) entre las subfracciones separadas en el Ejemplo 1 y un producto disponible comercialmente en la extremidad posterior 60 derecha de los ratones.
La figura 6 es un conjunto de gráficos que muestran las tasas de supervivencia de acuerdo con la dosis (A) y el tiempo después de la administración (B), medida después de administrar una fracción activa sin propagación (pII) entre las subfracciones separadas en el Ejemplo 1 y un producto disponible comercialmente en la extremidad posterior derecha de los ratones. 65
La figura 7 muestra una comparación del tiempo de inicio de la parálisis muscular, medida después de administrar 1 U de cada uno de una fracción activa sin propagación (pII) entre las subfracciones separadas en el Ejemplo 1 y un producto disponible comercialmente en la extremidad posterior derecha de ratones.
La figura 8 muestra una comparación del tiempo de duración de la parálisis muscular, medido después de administrar 0,5 U de cada uno de una fracción activa sin propagación (pII) entre las subfracciones separadas en el 5 Ejemplo 1 y un producto disponible comercialmente en la extremidade posterior derecha de ratones.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
[0038] En lo sucesivo, cada paso de un procedimiento para la purificación de una toxina botulínica sin propagación 10 de acuerdo con la presente invención se describirá con más detalle.
[0039] Un procedimiento para la purificación de una toxina botulínica sin propagación de acuerdo con la presente invención comprende las etapas de: separar el producto de toxina botulínica de tipo A en subfracciones mediante la realización de cromatografía de intercambio iónico usando tampón de pH 4,5 a 5,5, utilizando 0,02-0,2 M de cloruro 15 de sodio (NaCl); y recoger una subfracción de toxina botulínica sin propagación, que tiene un valor A260/A280 de aproximadamente 0,4-0,6, a partir de dichas subfracciones separadas.
[0040] El procedimiento según la invención para la purificación de una toxina botulínica sin propagación es un procedimiento en el que una toxina botulínica existente obtenida por cualquiera de precipitación ácida o 20 cromatografía de intercambio iónico después de la precipitación ácida, se somete a un nuevo procedimiento cromatográfico de intercambio iónico desarrollado por los presentes inventores, obteniendo de este modo una fracción de toxina botulínica sin propagación.
[0041] Por lo tanto, el procedimiento de la invención para la purificación de una toxina botulínica sin propagación se 25 realiza usando una toxina botulínica de tipo A obtenida por cualquiera de precipitación ácida a partir de un caldo de cultivo de una cepa de Clostridium botulinum de tipo A o purificación cromatográfica después de la precipitación ácida.
[0042] Cuando la toxina botulínica purificada de tipo A se somete a cromatografía de intercambio iónico utilizando 30 cloruro de sodio, se pueden obtener tres subfracciones a partir de la resina de intercambio iónico. Para realizar la cromatografía de intercambio iónico, se usa tampón de acetato de sodio, y la concentración de cloruro de sodio se añade al tampón con el fin de obtener subfracciones incrementadas gradualmente, y se toma cada fracción separada. Se encontró que, cuando no se utilizó cloruro de sodio (0 M de NaCl), la fracción separada era una fracción activa (pico I, pI) que se propaga en el cuerpo, y cuando se utilizó cloruro de sodio a una concentración de 35 0,02-0,2 M, la fracción separada era una fracción activa (pico II, pII), que no se propaga en el cuerpo, y cuando se utilizó sodio a una concentración de 1 M, la fracción separada fue una fracción inactiva (pico III, pIII) que se propaga en el cuerpo.
[0043] Específicamente, la concentración de cloruro de sodio que se utiliza para obtener la fracción pII está en el 40 intervalo de 0,02 a 0,2 M, y cuando no se utiliza cloruro de sodio o la concentración de cloruro de sodio está fuera del intervalo anterior, la fracción pII puede contener la fracción pI o pIII, sugiriendo que es difícil obtener una fracción activa sin propagación que tenga un efecto de paralizar los músculos localizados buscada por la presente invención.
[0044] Mientras tanto, cuando la cromatografía de intercambio iónico se lleva a cabo usando cloruro de sodio en un 45 tampón que tiene un pH que varía de 4,5 a 5,5, la cantidad de fracción pI o pIII en las subfracciones separadas se reduce, y la pureza de la fracción pII aumenta. Esto puede ser confirmado mediante la comparación de los valores de A260/A280 o la medición del grado de parálisis tras la inyección en los músculos de la extremidad posterior derecha de ratones.
50
[0045] Además, cuando la cromatografía de intercambio iónico se lleva a cabo usando cloruro de sodio de tal manera que la cantidad de una muestra de toxina botulínica de tipo A purificada es 1/5-1 veces el volumen de la columna de cromatografía de intercambio iónico utilizado, la cantidad de la fracción pII aumenta. Específicamente, cuando el volumen de la columna es de 1 ml y la cantidad de la muestra de toxina botulínica de tipo A purificada es de 0,2-1 ml, la cantidad de la fracción pII obtenida está en el intervalo de 20% a 50%. 55
[0046] Mientras tanto, se encontró que la fracción pII obtenida por el procedimiento de la invención para la purificación de la toxina botulínica de tipo A sin propagación tiene una LD50 total de 1 X 105-5 X 105 U/ml, tal como se mide usando ratones. Además, se puede observar que la fracción pll no se propaga a otras áreas distintas de un área deseada tras la inyección y se inicia la parálisis muscular en un corto período de tiempo de manera significativa 60 y se mantiene la parálisis muscular durante un largo tiempo en comparación con un producto comercialmente disponible.
[0047] Además, la fracción pII obtenida por el procedimiento de la invención para la purificación de la toxina botulínica sin propagación comprende, por 100 U, al menos 150 ppb de iones de Zn, al menos 80 ppb de iones de 65 Fe, y al menos 140 ppb de Mg iones.
[0048] El procedimiento según la invención para la purificación de la toxina botulínica sin propagación se caracteriza en que el contenido de Mg, Fe y Zn es significativamente mayor que el de una toxina botulínica de tipo A purificado por un procedimiento convencional.
5
[0049] Se encontró que, cuando se inyectó la toxina botulínica sin propagación obtenida por el procedimiento de purificación de la presente invención en la extremidad posterior derecha de los ratones en una cantidad equivalente a 1,5-3 veces la LD50 de la toxina, se paralizaron los músculos de la extremidad posterior derecha, mientras que no se paralizaron los músculos respiratorios y no tenía actividad letal, lo que sugiere que la toxina botulínica sin propagación de la presente invención no se propaga en el cuerpo. 10
Modo de llevar a cabo la invención
[0050] En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle con referencia a los ejemplos y los dibujos adjuntos, pero el alcance de la presente invención no se limita a estos ejemplos y dibujos. 15
[0051] Un producto disponible en el mercado usado en los ejemplos de la presente invención es un producto Botox (Allergan, Inc) preparado por el procedimiento descrito en USP 7.354.740 [titulada "Sistema libre de productos animales y procedimiento para purificar una toxina botulínica"]. Sin embargo, la presente invención se aplica no sólo al producto disponible comercialmente anterior o productos de toxina botulínica de tipo A purificados por el 20 procedimiento anterior, pero también a cualquier producto de toxina botulínica de tipo A purificado por precipitación con ácido.
Ejemplo 1: Fraccionamiento mediante cromatografía de intercambio iónico
25
[0052] Una muestra purificada a partir de un medio de cultivo de toxina botulínica por precipitación ácida se sometió a cromatografía de intercambio iónico, separando de este modo la muestra en tres subfracciones. Los resultados de la cromatografía se muestran en la figura 1 [pI, pico I (una fracción activa que se propaga en el cuerpo); pII, pico II (una fracción activa que no se propaga en el cuerpo); pIII, pico III (una fracción inactiva)].
30
[0053] La cromatografía de intercambio iónico se realizó usando un instrumento AKTA FPLC (GE Healthcare), una columna Hitrap DEAE FF (GE Healthcare), y tampón de acetato de sodio (pH 5,5) como tampón de trabajo (tampón de elución).
[0054] Específicamente, la muestra se eluyó con 0 M de NaCl (pH 5,5) en acetato de sodio para obtener una 35 fracción de lavado no unida (pI, una fracción activa que se propaga en el cuerpo), y después se eluyó con NaCl 0,05 M para obtener una fracción (pII, una fracción activa que no se propaga en el cuerpo), y se eluyó con NaCl 1 M para obtener una fracción (pIII, una fracción inerte). La muestra se sometió a precipitación ácida a una velocidad de flujo de 1 ml/min, seguido de desalación.
40
Ejemplo 2: Cambios en picos y características en función de los cambios en el pH del tampón
[0055] La figura 2 muestra los % de áreas de pico de las subfracciones de acuerdo con los cambios en el pH del tampón usado en la cromatografía de intercambio iónico. Como puede verse en la figura 2, cuando el pH del tampón estaba en el intervalo de 4,5 a 5,5, aumentó el % de área del pico de la fracción pII. La tabla 1 a continuación 45 muestra los valores de A260/A280 de las subfracciones en función del pH del tampón, y en la Tabla 2 a continuación muestra la LD50 total (unidad) de las subfracciones.
[Tabla 1]
50
- A260/A280
- pH 4,5
- pH 5,0 pH 5,5 pH 6,0
- pI
- 0,76 ± 0,15 0,69 ± 0,09 0,67 ± 0,05 0,63 ± 0,08
- pII
- 0,50 ± 0,05 0,55 ± 0,04 0,55 ± 0,03 0,81 ± 0,19
- pIII
- 0,76 ± 0,10 0,82 ± 0,13 0,84 ± 0,12 0,79 ± 0,09
[0056] Como puede verse en la Tabla 1 anterior, cuando el pH del tampón estaba en el intervalo de 4,5 a 5,5, el valor de A260/A280 de la fracción pII estaba en el intervalo de 0,45 a 0,6, lo que sugiere que la fracción pII es adecuada para la administración.
55
[0057] Por lo tanto, es preferible ajustar el pH del tampón a de 4,5 a 5,5 con el fin de obtener una fracción activa purificada (pII) que no se propaga en el cuerpo.
[Tabla 2]
- LD50 total (unidad)
- pH 4,5
- pH 5,0 pH 5,5 pH 6,0
- Producto convencional (premuestra) purificado mediante precipitación ácida
- 5 ± 0,8 5 ± 1 5 ± 0,8 5 ± 1,2
- pI
- 1,5 ± 0,4 3 ± 0,5 2 ± 0,4 2 ± 0,8
- pII
- 0,2 ± 0,2 1 ± 0,2 3 ± 0,4 0,4 ± 0,2
- pII
- - 0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1 2 ± 1
- (Unidad: 105 U)
5
[0058] Como puede verse en la Tabla anterior 2, cuando el pH del tampón estaba en el intervalo de 5,0 a 5,5, la LD50 total de la fracción pII estaba en el intervalo de 0,8 X 105-3,5 X 105 U/ml, lo que sugiere que la tasa de retorno de pII es relativamente alta.
[0059] Por lo tanto, es preferible ajustar el pH del tampón a de 4,5 a 5,5 con el fin de obtener una fracción activa de 10 seguridad (PII) que no se propaga en el cuerpo.
Ejemplo 3: Cambios en picos y características en función de los cambios en el volumen de carga de la muestra
[0060] Se obtuvieron subfracciones de la misma manera que en el Ejemplo 1. La figura 3 muestra los cambios en el 15 % de área del pico de las subfracciones (pI, pII y pIII) en función de los cambios en el volumen de carga de la muestra utilizada para obtener las subfracciones. También, la Tabla 3 muestra los cambios en los valores de A260/A280 de las subfracciones en función del volumen de carga de la muestra, y la Tabla 4 a continuación muestra los cambios en la LD50 total (unidad) de las subfracciones en función del volumen de carga de la muestra.
20
[Tabla 3]
- A260/A280
- 0,25 ml
- 0,5 ml 1 ml 2 ml
- pI
- 0,67 ± 0,08 0,64 ± 0,07 0,68 ± 0,09 0,67 ± 0,13
- pII
- 0,55 ± 0,02 0,56 ± 0,01 0,55 ± 0,04 0,55 ± 0,03
- pIII
- 0,85 ± 0,14 0,84 ± 0,09 0,82 ± 0,18 0,84 ± 0,24
[0061] Como puede verse en la Tabla anterior 3, cuando el volumen de carga de la muestra estaba en el intervalo de 0,25 a 2 ml, el valor de A260/A280 de la fracción pII era de 0,4-0,6, lo que sugiere que se trata de una muestra 25 ajustable para la administración.
[0062] Por lo tanto, es preferible controlar el volumen de carga de la muestra en el intervalo de 1/5 a 2 veces el volumen de la columna a fin de obtener una gran cantidad de una fracción activa (pII) que no se propaga en el cuerpo. 30
[Tabla 4]
- LD50 total (unidad)
- 0,25 ml
- 0,5 ml 1 ml 2 ml
- Producto convencional (premuestra) purificado mediante precipitación ácida
- 2,5 ± 0,5 5 ± 1 10 ± 4 20 ± 5
- pI
- 0,8 ± 0,2 1,6 ± 0,4 5 ± 2 15 ± 4,8
- pII
- 1,6 ± 0,2 4 ± 0,6 4 ± 0,9 4 ± 1,5
- pII
- 0,2 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,8 ± 0,2 0,6 ± 0,3
- (Unidad: 105 U)
[0063] Como puede verse en la Tabla anterior 4, cuando el volumen de carga de la muestra estaba en el intervalo de 35 0,25 a 1 ml, la LD50 total de la fracción pII estaba en el intervalo de 0,8 X 105-3,5 X 105 U/ml, lo que sugiere que la tasa de retorno de pII es relativamente alta.
[0064] Por lo tanto, es preferible controlar el volumen de carga de la muestra en el intervalo de 1/5 a 2 veces el volumen de la columna con el fin de obtener una fracción activa de seguridad (pII) que no se propaga en el cuerpo.
Ejemplo de ensayo 1: Comparación de los efectos paralizantes de los músculos 5
1) Inyección en los músculos de la extremidad posterior derecha
[0065] Con el fin de examinar los efectos paralizantes de los músculos de las subfracciones obtenidas en el Ejemplo 1, se realizó la inyección en los músculos de la extremidad posterior derecha de los ratones. 10
[0066] Se dividieron ratones ICR (hembras, 4 semanas de vida, 18-22 g) en tres grupos, cada grupo constaba de 10 ratones. El peso de cada ratón se midió y registró con precisión. Cada una de las subfracciones se llenó en una jeringa Hamilton de 50 l a una concentración de 1 U/20 l en ausencia de aire, y a continuación la aguja de la jeringa se introdujo en el tobillo de la pata posterior derecha de cada ratón ICR hasta una profundidad de 15 aproximadamente 3 cm, y cada una de las subfracciones se inyectó en los músculos de cada ratón. Después de la inyección en los músculos, se evaluó la puntuación de parálisis de las extremidades para cada ratón en diversos puntos de tiempo de acuerdo con los criterios mostrados en la Tabla 5, y se midió la tasa de supervivencia de los ratones. Los resultados de la medición se muestran en la Figura 4.
20
[Tabla 5]
- Puntuación
- Criterio
- 0
- Aspecto de las extremidades y andar de ratones normales
- 1
- Los ratones caminan arrastrando pero los dedos no están juntos
- 2
- Junto con el criterio 1, los dedos están juntos
- 3
- Junto con el criterio 2, las articulaciones del pie se doblan hacia dentro
- 4
- Junto con el criterio 3, los pies están en contacto con los músculos de las piernas y las piernas están cojas
[Tabla 6]
- Fracciones
- Área paralizada tras la inyección en extremidades derechas traseras de ratones
- Fracción activa que se propaga en el cuerpo
- Varias áreas en el cuerpo, incluyendo la extremidad trasera derecha, el diafragma , etc
- Fracción activa que no se propaga en el cuerpo
- Extremidad posterior derecha
- Fracción inactiva que se propaga en el cuerpo
- -
25
[0067] Como puede verse en la figura 4, entre las subfracciones obtenidas en el Ejemplo 1, la fracción activa (pII) que no se propaga en el cuerpo mostró un aumento significativo en la dosis frente a la tasa de supervivencia en comparación con la fracción activa (pI) que se propaga en el cuerpo (Figura 4A), y la tasa de supervivencia a una dosis de 2 U fue del 100% para la fracción pII y 0% para la fracción pI, que difieren extremadamente entre sí (Figura 4B). 30
Ejemplo de ensayo 2: Comparación de la difusión en el cuerpo entre el producto comercial y fracción activa (pII) que no se propaga en el cuerpo
[0068] Con el fin de examinar los efectos paralizantes de los músculos de un producto comercial (Botox de Allergan) 35 y la subfracción pII obtenida en el Ejemplo 1, se realizó la inyección en los músculos de la extremidad posterior derecha de ratones.
[0069] Se dividieron ratones ICR (hembras, 4 semanas de vida, 18-22 g) en dos grupos, cada grupo constaba de 10 ratones. El peso de cada ratón se midió y registró con precisión. Cada uno del producto comercial y la subfracción 40 pII se llenaron en una jeringa Hamilton de 50 l a una concentración de 1 U/20 l en ausencia de aire, y a continuación se introdujo la aguja de la jeringa en el tobillo pata posterior derecha de cada ratón ICR hasta una profundidad de aproximadamente 3 cm, y cada uno del producto comercial y la subfracción se inyectó en los músculos de cada ratón. Después de la inyección en los músculos, se observó visualmente el grado de parálisis de los ratones con el fin de determinar la propagación in vivo del producto comercial y la subfracción. La figura 5 45 muestra el estado de los ratones fotografiados a las 12 horas después de la inyección, y la figura 6 muestra la tasa de supervivencia de los ratones en función de la dosis y tiempo de administración. Además, la figura 7 muestra el momento de la iniciación del efecto paralizante de los músculos, y la figura 8 muestra el tiempo de duración del efecto paralizante de los músculos.
50
[0070] Como puede verse en la figura 5, la subfracción pII paralizó solamente la extremidad posterior derecha en la que se inyectó por vía intramuscular, pero el producto comercial se propagó y paralizó la cintura y la extremidad
opuesta.
[0071] Como puede verse en la figura 6, la subfracción pII mostró un aumento significativo en la dosis frente a la tasa de supervivencia en comparación con el producto comercial (figura 6A), y la tasa de supervivencia a una dosis de 2 U fue del 100% para la subfracción pII y del 0% para el producto comercial, que difieren extremadamente entre 5 sí (figura 6B).
[0072] Como puede verse en la figura 7, la subfracción pII inició el efecto paralizante de los músculos a una dosis de 1 U dentro de un período de tiempo significativamente corto en comparación con el producto comercial.
10
[0073] Como puede verse en la figura 8, el tiempo de duración del efecto paralizante de los músculos de la subfracción pII era más largo que el del producto comercial por 80 días o más a una dosis de 0,5 U.
Ejemplo de Ensayo 3: Análisis del contenido de iones de toxinas botulínicas liofilizadas
15
[0074] Un producto comercial (Botox de Allergan) y la subfracción pII obtenida en el Ejemplo 1 se liofilizaron y se analizó el contenido de iones de los mismos.
[0075] Para la comparación con el producto comercial, la fracción pII diluida y la misma cantidad de toxina botulínica (100 U) se liofilizaron con aditivos, y se utilizó una prueba letal de ratón para confirmar que los productos liofilizados 20 del producto comercial y la subfracción pII tenían la misma actividad, después de lo cual se analizó el contenido de iones de los productos liofilizados. Específicamente, cada uno de los dos productos liofilizados se disolvió en 10 ml de agua destilada, y a continuación se midió el contenido de iones de los mismos usando un espectrómetro de masas de plasma acoplado inductivamente. Los resultados de la medición se muestran en la Tabla 7 a continuación.
25 [Tabla 7]
- Mg Fe Zn
- pII
- 183,0 ± 19,3* 105,4 ± 22,1** 332,6 ± 140,8***
- Producto comercial
- 78,1 ± 7,4* 39,6 ± 3,3 65,6 ± 25,9
- *p < 0,0015, ** p < 0,011, ***p < 0,045
[0076] Como puede verse en la Tabla 7 anterior, el contenido de Mg, Fe y Zn en el producto liofilizado de la toxina botulínica sin propagación (fracción PII) purificadaa por la presente invención fue significativamente mayor que el del 30 producto comercial.
[0077] Aunque las realizaciones preferidas de la presente invención se han descrito con fines ilustrativos, los expertos en la técnica entenderá que son posibles diversas modificaciones, adiciones y sustituciones, sin apartarse del alcance de la invención, tal como se describe en las reivindicaciones adjuntas. 35
Aplicabilidad industrial
[0078] Según la presente invención, se puede obtener en grandes cantidades una toxina botulínica sin propagación que causa parálisis muscular localizada. Esta toxina botulínica sin propagación causa parálisis muscular en un área deseada, no se propaga a áreas distintas del área deseada y tiene el efecto de paralizar los músculos de una manera rápida y duradera. 40
Claims (4)
- REIVINDICACIONES1. Procedimiento para purificar una toxina botulínica sin propagación, que comprende las etapas de:separar el producto de toxina botulínica de tipo A en subfracciones mediante la realización de cromatografía de intercambio iónico usando un tampón de pH 4,5 a 5,5 y 0,02-0,2 M de cloruro de sodio (NaCl); y 5recoger una subfracción de toxina botulínica sin propagación que tiene un valor de A260/A280 de 0,4-0,6, a partir de dichas subfracciones separadas.
- 2. Preparación de toxina botulínica sin propagación, que se purifica mediante el procedimiento anterior, que comprende concentraciones de iones Zn, Fe y Mg de al menos 150, 80, y 140 ppb por 100 U, respectivamente. 10
- 3. Procedimiento para determinar una toxina botulínica sin propagación, que comprende la inyección de la preparación de toxina botulínica sin propagación, según la reivindicación 2, en el músculo de la pantorrilla de la extremidad posterior izquierda o derecha del ratón (4-6 semanas de vida, 18-22 g de peso) en una cantidad equivalente a 1,5-3 veces la LD50 de la toxina; y determinar si los músculos de la extremidad posterior inyectados y 15 los músculos respiratorios del ratón se paralizaron y si el ratón murió.
- 4. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que la preparación de toxina botulínica sin propagación muestra una tasa de supervivencia de al menos el 80% a las 96 horas después de la inyección de 2 U de una preparación de toxina en el volumen 50 l en el músculo de la pantorrilla de la extremidad posterior izquierda o derecha del ratón (4-20 6 semanas de vida, 18-22 g de peso).
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020100051076A KR101134146B1 (ko) | 2010-05-31 | 2010-05-31 | 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법 |
KR20100051076 | 2010-05-31 | ||
PCT/KR2011/003547 WO2011152618A2 (ko) | 2010-05-31 | 2011-05-13 | 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2659820T3 true ES2659820T3 (es) | 2018-03-19 |
Family
ID=45067165
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES11789976.5T Active ES2659820T3 (es) | 2010-05-31 | 2011-05-13 | Toxina botulínica no difusiva que provoca una parálisis muscular localizada y procedimiento de purificación de la misma |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9598683B2 (es) |
EP (1) | EP2578228B1 (es) |
JP (2) | JP5919608B2 (es) |
KR (1) | KR101134146B1 (es) |
CN (1) | CN102985102B (es) |
AU (1) | AU2011262499B2 (es) |
ES (1) | ES2659820T3 (es) |
WO (1) | WO2011152618A2 (es) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101134146B1 (ko) * | 2010-05-31 | 2012-04-19 | 메덱스젠 주식회사 | 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법 |
KR101775682B1 (ko) * | 2015-11-30 | 2017-09-06 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조방법 |
Family Cites Families (38)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE303567B (es) * | 1959-02-17 | 1968-09-02 | Behringwerke Ag | |
US3409605A (en) * | 1965-06-15 | 1968-11-05 | American Cyanamid Co | Concentration and purification of growth factor-placental origin (human) |
WO1996005222A1 (en) * | 1994-08-08 | 1996-02-22 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Purification and pharmaceutical compositions containing type g botulinum neurotoxin |
US5939070A (en) * | 1996-10-28 | 1999-08-17 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Hybrid botulinal neurotoxins |
AU2340299A (en) * | 1998-01-26 | 1999-08-09 | University Of Massachusetts | Biologically active hemagglutinin from type a (clostridium botulinum) and methods of use |
DE19925739A1 (de) * | 1999-06-07 | 2000-12-21 | Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh | Therapeutikum mit einem Botulinum-Neurotoxin |
GB9921592D0 (en) * | 1999-09-13 | 1999-11-17 | Microbiological Res Authority | Preparation of highly pure toxin fragments |
US20030118598A1 (en) | 2000-02-08 | 2003-06-26 | Allergan, Inc. | Clostridial toxin pharmaceutical compositions |
US6670322B2 (en) * | 2000-06-01 | 2003-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of targeting pharmaceuticals to motor neurons |
KR100455280B1 (ko) | 2000-06-28 | 2004-11-08 | 삼성코닝 주식회사 | 인듐 틴 옥사이드(ito)의 제조방법 |
DE10035156A1 (de) * | 2000-07-19 | 2002-02-07 | Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh | Proteinkomplex als Vehikel für oral verfügbare Protein-Arzneimittel |
JP2003009897A (ja) * | 2001-07-03 | 2003-01-14 | Keiji Oguma | ボツリヌス毒素の分離・精製法 |
KR20030060150A (ko) * | 2002-01-07 | 2003-07-16 | (주)메디톡스 | 클로스트리디움 보툴리눔 a형 독소를 정제하는 방법 |
JPWO2003082315A1 (ja) * | 2002-03-29 | 2005-07-28 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 筋緊張亢進疾患治療剤 |
US6673598B1 (en) * | 2002-10-29 | 2004-01-06 | Synthecon, Inc. | Disposable culture bag |
US7452697B2 (en) * | 2003-09-25 | 2008-11-18 | Allergan, Inc. | Chromatographic method and system for purifying a botulinum toxin |
WO2006096164A1 (en) * | 2005-03-03 | 2006-09-14 | Allergan, Inc. | Media for clostridium bacterium and processes for obtaining a clostridial toxin |
US7160699B2 (en) * | 2003-09-25 | 2007-01-09 | Allergan, Inc. | Media for clostridium bacterium and processes for obtaining a clostridial toxin |
US7148041B2 (en) * | 2003-09-25 | 2006-12-12 | Allergan, Inc. | Animal product free media and processes for obtaining a botulinum toxin |
KR20050074806A (ko) * | 2004-01-14 | 2005-07-19 | 팜텍(주) | 결정형 보툴리늄 독소의 제조방법 |
US7514088B2 (en) * | 2005-03-15 | 2009-04-07 | Allergan, Inc. | Multivalent Clostridial toxin derivatives and methods of their use |
US7064639B2 (en) * | 2004-07-30 | 2006-06-20 | Delta Systems, Inc. | Electromagnetic latching switch |
US7465457B2 (en) * | 2005-04-14 | 2008-12-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method for preparing botulinum neurotoxin type A light chain |
KR101234969B1 (ko) | 2005-06-03 | 2013-02-20 | 라이온 가부시키가이샤 | 지방산 저급 알킬에스테르의 제조 방법 및 지방산 저급알킬에스테르 및 경유 대체연료 |
JP4979690B2 (ja) * | 2006-04-28 | 2012-07-18 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | 神経毒素の定量方法 |
AR061669A1 (es) * | 2006-06-29 | 2008-09-10 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Aplicacion de alta frecuencia de terapia con toxina botulinica |
ES2537579T3 (es) * | 2006-10-27 | 2015-06-09 | The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Preparación que contiene toxina botulínica de tipo A muy purificada derivada de patógeno de botulismo del lactante |
CN101204577A (zh) * | 2006-12-21 | 2008-06-25 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种a型肉毒毒素结晶复合物的制备方法 |
KR101025617B1 (ko) * | 2008-02-25 | 2011-03-30 | 메덱스젠 주식회사 | 클로스트리디움 보툴리눔으로부터 보툴리눔 독소를정제하는 방법 |
KR20090120222A (ko) * | 2008-05-19 | 2009-11-24 | (주)메디톡스 | 식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법 |
DK3332805T3 (da) * | 2008-12-31 | 2022-05-16 | Revance Therapeutics Inc | Injicerbare botulinumtoksinformuleringer |
US8440204B2 (en) * | 2009-04-30 | 2013-05-14 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Subtype of Closteridium botulinum neurotoxin type A and uses thereof |
US8129139B2 (en) * | 2009-07-13 | 2012-03-06 | Allergan, Inc. | Process for obtaining botulinum neurotoxin |
MX2012004703A (es) * | 2009-10-21 | 2012-06-08 | Revance Therapeutics Inc | Metodos y sistemas para purificar la neurotoxina botulinica no acomplejada. |
US20130085267A1 (en) * | 2009-12-18 | 2013-04-04 | Allergan, Inc. | Stabilization of Therapeutic Agents to Facilitate Administration |
SI2684890T1 (sl) * | 2010-01-25 | 2016-10-28 | Allergan, Inc. | Metode znotrajcelične pretvorbe enoverižnih beljakovin v njihovo dvoverižno obliko |
KR101134146B1 (ko) * | 2010-05-31 | 2012-04-19 | 메덱스젠 주식회사 | 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법 |
PL3434346T3 (pl) * | 2010-07-30 | 2021-04-06 | Medimmune, Llc | Oczyszczone aktywne polipeptydy lub immunokoniugaty |
-
2010
- 2010-05-31 KR KR1020100051076A patent/KR101134146B1/ko active IP Right Grant
-
2011
- 2011-05-13 EP EP11789976.5A patent/EP2578228B1/en not_active Revoked
- 2011-05-13 US US13/700,867 patent/US9598683B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-05-13 WO PCT/KR2011/003547 patent/WO2011152618A2/ko active Application Filing
- 2011-05-13 CN CN201180028634.2A patent/CN102985102B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-05-13 AU AU2011262499A patent/AU2011262499B2/en not_active Ceased
- 2011-05-13 ES ES11789976.5T patent/ES2659820T3/es active Active
- 2011-05-13 JP JP2013513102A patent/JP5919608B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-05-07 JP JP2015094777A patent/JP5998419B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2017
- 2017-02-01 US US15/422,129 patent/US10369235B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2017-02-01 US US15/422,083 patent/US20170145399A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101134146B1 (ko) | 2012-04-19 |
US20170143849A1 (en) | 2017-05-25 |
WO2011152618A9 (ko) | 2012-03-22 |
JP5919608B2 (ja) | 2016-05-18 |
US10369235B2 (en) | 2019-08-06 |
CN102985102B (zh) | 2016-06-08 |
JP5998419B2 (ja) | 2016-09-28 |
US9598683B2 (en) | 2017-03-21 |
WO2011152618A4 (ko) | 2012-07-12 |
AU2011262499B2 (en) | 2015-01-22 |
JP2015200659A (ja) | 2015-11-12 |
EP2578228A4 (en) | 2013-10-02 |
CN102985102A (zh) | 2013-03-20 |
EP2578228A2 (en) | 2013-04-10 |
AU2011262499A1 (en) | 2013-01-24 |
WO2011152618A3 (ko) | 2012-05-24 |
US20170145399A1 (en) | 2017-05-25 |
JP2013533856A (ja) | 2013-08-29 |
KR20110131572A (ko) | 2011-12-07 |
WO2011152618A2 (ko) | 2011-12-08 |
EP2578228B1 (en) | 2017-11-15 |
US20130071331A1 (en) | 2013-03-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220306704A1 (en) | Neurotoxins for use in inhibiting cgrp | |
US10729636B2 (en) | Compositions comprising peptide WKDEAGKPLVK | |
JP2011506511A (ja) | 副作用を軽減または防止するためのボツリヌス菌毒素複合体の神経毒成分の使用 | |
JP6676062B2 (ja) | 認知低下を処置するための方法 | |
US20210196784A1 (en) | Peptides for use in promoting transport of glucose | |
WO2017009485A1 (en) | Topical compositions | |
ES2659820T3 (es) | Toxina botulínica no difusiva que provoca una parálisis muscular localizada y procedimiento de purificación de la misma | |
CN112274644B (zh) | 一种用于治疗脊柱与骨关节病变并减轻其疼痛的药物 | |
Raghavan | Metadichol® and healthy skin: one approach many possible cures | |
US20130230500A1 (en) | Botulinum Toxin for Smoking Cessation | |
TWI739368B (zh) | A型肉毒桿菌毒素複合物、其配製劑和使用方法 | |
US20240189389A1 (en) | Drug with prolonged analgesic action | |
KR20190041594A (ko) | Clasp2 폴리펩티드를 포함하는 상처 치유 또는 피부 재생용 조성물 | |
KR20230071072A (ko) | 보툴리눔 독소 조성물 | |
TW202406540A (zh) | 類黃酮化合物在對抗蛇毒誘發的毒性上的用途 | |
Leyden | Candida albicans is associated with moderate and severe diaper dermatitis (DD) |