KR101025617B1 - 클로스트리디움 보툴리눔으로부터 보툴리눔 독소를정제하는 방법 - Google Patents

클로스트리디움 보툴리눔으로부터 보툴리눔 독소를정제하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)에서 보툴리눔 독소(botulinum toxin)를 정제하는 방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 상기 클로스트리디둠 보툴리눔을 배양배지에 배양하는 제1단계, 상기 배양된 배양액을 1차 산침전시키고 아세테이트로 추출한 뒤 산을 첨가하여 2차 산침전시키는 것을 포함하는 제2단계, 상기 제2단계의 산 침전물에 DNase, RNase를 처리한 후, 에탄올에 침전시키고 상기 에탄올에 의한 침전물을 황산암모늄에 침전시켜 결정화를 유도하는 것을 포함하는 제3단계 및 상기 제3단계에 의한 상기 보툴리눔 독소가 포함된 침전물을 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 제4단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 상기 보툴리눔 독소의 정제 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 정제 방법은 혐기성 시설 내에서 이루어져야 할 필요가 없으므로 경제적인 효과가 있으며, 상기 정제방법에 의하여 보툴리눔 독소가 간편하면서도 명확하게 분리 동정될 수 있다.
클로스트리디움 보툴리눔, 보툴리눔 독소, 정제방법, 보톡스

Description

클로스트리디움 보툴리눔으로부터 보툴리눔 독소를 정제하는 방법{Method of purifying botulinum toxin from Clostridium botulinum}
본 발명은 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)에서 보툴리눔 독소(botulinum toxin)를 정제하는 방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 상기 클로스트리디움 보툴리눔을 배양배지에 배양하는 제1단계, 상기 배양된 배양액을 1차 산침전시키고 아세테이트로 추출한 뒤 산을 첨가하여 2차 산침전시키는 것을 포함하는 제2단계 및 상기 제2단계에 의한 상기 보툴리눔 독소가 포함된 침전물을 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 제3단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 상기 보툴리눔 독소의 정제 방법에 관한 것이다.
신경독성을 지닌 독소를 분비하는 클로스트리디움 균주들이 1890년대에서부 터 지금까지 발견되었으며, 지난 70년간 이들 균주들이 분비하는 독소에 대한 특성 규명이 연구되어 왔다(Schant, E. J. 등, Microbiol. Rev. 56; 80; 1992).
상기 보툴리눔 독소(botulinum toxin)는 그 혈청학적 특징에 따라 A 내지 G형의 7가지 형으로 나뉘어진다. 각 독소는 약 150KDa 정도의 독소 단백질을 가지고 있는데, 자연적으로는 여러 비독성 단백질들과 결합되어 있는 복합체로 이루어져 있다. 중간(Medium) 복합체(300kDa)는 독소 단백질과 비독성-비헤마글루티닌 단백질로 이루어져 있고, 큰(Large; 450kDa) 복합체 및 거대(Large-Large; 900kDa) 복합체는 중간 복합체가 헤마글루티닌과 결합되어 있는 형태를 띠고 있다(Sugiyama, H., Microbiol. Rev. , 44, 419; 1980). 이러한 비독성 비헤마글루티닌 단백질들은 장내에서 낮은 pH와 각종 단백질 가수분해 효소로부터 독소를 보호하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다(Sugiyama, H., Microbiol. Rev. ,44, 419; 1980).
상기 독소는 세포 내에서 분자량이 약 150kDa인 하나의 폴리펩티드로 합성된 후, 세포내 단백질 분해 효소의 작용이나 트립신과 같은 인위적인 효소 처리에 의하여 N말단으로부터 1/3되는 위치에서 절단되어 2개의 단위체인 경쇄(L: light chain)(분자량; 50 kDa)와 중쇄(H: heavy chain)(분자량; 100kDa)로 나뉘어진다.
이렇게 나뉘어진 독소는 단일 폴리펩티드일 때에 비해 그 독성이 크게 증가한다. 두 단위체는 이황화결합에 의해 서로 연결되어 있으며, 각각은 다른 기능을 갖는다. 중쇄는 목표물(target)이 되는 세포의 수용체(receptor)와 결합하고(Park. M.K., 등, FEMS Microbiol. Lett. 72, 243; 1990), 낮은 pH(pH4)에서 생체막과 반응하여 채널(channel)을 형성하는 기능을 가지며(Mantecucco, C. 등, TIBS 18, 324; 1993), 경쇄는 약리활성를 가지고 있어 세제(detergent)를 사용하여 세포에 투과성을 부여하거나, 전기천공(electroporation) 등으로 세포내 투입되었을 때 신경전달물질의 분비를 방해한다(Poulain, B. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4090 ; 1988).
상기 독소는 신경근육종말(neuromuscular junction)의 콜린성 전시냅스(cholinergic presynapse)에서 아세틸콜린의 엑소시토시스(exocytosis)를 저해하여 전신 무력증을 일으킨다. 극미량의 독소를 처리해도 독성이 나타나는 것으로 보아 이 독소는 어떤 효소 활성을 가질 것으로 생각되어져 왔다(Simpson, L. L. 등, Ann. Rev. Pharmaeol. Toxicol. 26, 427; 1986).
최근에 밝혀진 바에 의하면, 독소는 메탈로펩티다제 활성(metallopeptidase activity)을 갖고 있으며 그 기질은 엑소시토시스 장치 복합체(exocytosis machinary complex)를 이루는 단위 단백질들인 시냅토브레빈(Synaptobrevin), 신택신(Syntaxin), 25KDa의 시냅토좀 연계 단백질(Synaptosomal associated protein of 25KDa) (SNAP25) 등이다. 각 형의 독소는 이 세가지 단백질들 중 하나를 기질로 삼고 있는데, B, D, F 및 G형은 시냅토브레빈을, A와 E형은 SNAP25를, C형은 신택신을 특정 부위에서 절단하는 것으로 알려져 있다(Binz, T. 등, J. Biol. Chem. 265, 9153; 1994).
상기 보툴리눔 독소는 소량으로 인체에 치명적이고 대량생산이 용이하므로 탄저균(Bacillus anthracis), 페스트(Yersinia pestis), 천연두(smallpox virus)와 더불어 4대 생물테러 무기로 사용될 수 있는 독소이다. 그러나, 상기 보툴리눔 독소(botulinum toxin) 중 A형 독소의 경우에는 전신적으로는 인체에 영향을 미치지 않는 용량 이하로 주사하면 상기 주사 부위의 국소 근육을 마비시킬 수 있다. 상기와 같이 근육을 국소로 마비시킬 수 있어 주름살 제거제, 경직성 편마비 및 놔성마비의 치료제 등으로 광범위하게 사용할 수 있으므로 매우 유용한 독소이다.
상기와 같은 이유로 상기 보툴리눔 독소는 수요가 급증하고 있으며 상기 수요에 발맞추어 보툴리눔 독소의 정제방법에 대한 연구가 시작되었다. 상기 종래 보툴리눔 독소의 정제 방법으로 이온교환 크로마토그래피법을 사용하였는데 장기간 (약 10일 내지 14일)이 소요되어 산업적으로 적용하기가 매우 곤란하다는 문제점이 있었다. 또한, 상기 클로스트리디움 보툴리눔은 혐기성 세균이므로 상기 고정시에 혐기성 시설 내에서 하여야 한다는 문제점이 있어서 대량생산이 어려웠다. 게다가 상기 정제방법에 의하여 정제된 유효성분인 상기 보툴리눔 독소가 명확하게 분리 동정이 되지 않아 불순물이 포함되는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해서 안출된 것으로서, 상기 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)을 배양배지에 배양단계, 상기 배양된 배양액을 1차 산침전시키고 아세테이트로 추출한 후 산을 첨가하여 2차 산침전시키는 것을 포함하는, 보툴리눔 독소의 산침전단계 및 상기 산침전단계에 의한 상기 보툴리눔 독소가 포함된 침전물을 크로마토그래피를 이용하여 상기 보툴리눔 독소를 정제하는 단계를 포함하여 혐기 시설 없이 보툴리눔 독소만 대량생산 할 수 있는 정제 방법을 제공하는데 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 클로스트리디움 보툴리눔에서 보툴리눔 독소를 정제하는 방법은 클로스트리디움 보툴리눔을 배양배지에 배양하는 제1단계, 상기 배양된 배양액을 1차 산침전시키고 아세테이트로 추출한 뒤 산을 첨가하여 2차 산침전시키는 것을 포함하는 제2단계 및 상기 제2단계에 의한 상기 보툴리눔 독소가 포함된 침전물을 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 제3단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 배양단계의 배지는 펩톤, 효모추출물, 글루코오스 및 브레인 하트 인퓨전을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 배양배지는 효모추출물의 농도가 0.3 내지 0.5 중량% 이며, 상기 글루코오스의 농도가 0.5 내지 1 중량% 인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 배양단계의 배지에 3 내지 5일 동안 배양하고 발효기(fermentor)에 의한 배양하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 산침전단계는 황산(H2SO4)으로 클로스트리디움 보툴리눔의 단백질을 황산에 의하여 침전시키는 단계; 상기 황산에 침전된 단백질침전물에서 보툴리눔 독소를 아세테이트(acetate)로 추출하는 단계; 상기 아세테이트추출액을 염산을 사용하여 보툴리눔 독소를 침전시키는 단계;를 거친 후에, 상기 염산침전단계에 의한 침전물에 DNase, RNase를 처리하고, 에탄올(ethanol)에 침전시키는 단계; 및 상기 에탄올에 의한 침전물을 황산암모늄((NH4)2SO4)에 침전시켜 결정화를 유도하는 황산암모늄침전단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 황산침전단계의 황산의 pH 농도는 3.0 내지 3.9 인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 아세테이트추출단계의 아세테이트는 0.04 내지 0.09 몰농도(M)이고, 상기 아세테이트의 pH 농도는 6.3 내지 6.5 이며, 상기 추출시간은 1.5 내지 2.5 시간인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 염산침전단계의 염산은 pH가 3.5 내지 3.8이고, 상기 염산은 상기 아세테이트추출액의 pH가 5.0 내지 6.5인 경우에서는 0.1N의 염산을 첨가하고, 상기 아세테이트추출액의 pH가 5.0 내지 3.7에서는 1N의 염산을 첨가하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 에탄올침전단계의 DNase, RNase는 처리시간이 1.5 내지 3 시간인 것을 특징으로 한다.
더 바람직하게는, 상기 에탄올침전단계의 에탄올은 농도가 15 내지 18 부피% 이고, 상기 에탄올의 처리시간은 1 내지 24시간인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 정제단계 완충용액으로 트리스(tris), 인산칼륨(K3HPO4), 인산나트륨(Na2PO4), 아세트산나트륨(CH3COONa)을 사용할 수 있다. 아세트산나트륨을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명은 클로스트리디움 보툴리눔에서 보툴리눔 독소를 정제하는 방법에 있어서, 상기 클로스트리디움 보툴리눔을 배양배지에 배양단계, 상기 배양된 배양액을 1차 산침전시키고 아세테이트로 추출한 후 산을 첨가하여 2차 산침전시키는 것을 포함하는, 보툴리눔 독소의 산침전단계 및 상기 산침전단계에 의한 상기 보툴리눔 독소가 포함된 침전물을 액체크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계를 포함하여 이루어진다.
상기 배양배지는 펩톤, 효모추출물, 글루코오스 및 브레인 하트 인퓨젼을 포함한다. 호기성과 통성 혐기성 세균 배양용 배지는 영양성분이 강화된 액체 배지로 트립틱소이(Tryptic(Trypticase)soy), 부유성 펩톤(supplemented peptone), 브레인 하트 인퓨전, 콜롬비아(Columbia), 부르셀라(Brucella) 배지가 있는데, 혐기성 세균에는 티오글리콜레이트(thioglycollate), 티올(Thiol), 혐기성 브레인 하트 인퓨젼 배지 등이 권장된다.
상기 배양 배지는 효모추출물의 농도가 0.3 내지 0.5 중량% 이며, 상기 글루코오스의 농도가 0.5 내지 1 중량% 이다. 상기 글루코오스의 농도는 상기 농도 범위 이내여야 하는데 상기 농도범위 이하인 경우에는 원할하게 상기 클로스트리디움 보툴리눔에 영양공급이 안 되므로 균이 잘 배양되지 않는다. 또한, 상기 농도 범위 이상으로 되는 경우 배지의 농도가 상승하여 상기 클로스트리디움 보툴리눔이 용혈현상이 일어나고 글루코오스에 의하여 육안으로 관찰이 어려우므로 상기 범위 내에서 행하여짐이 바람직하다.
상기 배양배지에 3 내지 5일 동안 배양하고 발효기에 배양한다. 상기 3일 이하로 배양하는 경우 충분히 상기 클로스트리디움 보툴리눔이 배양되지 않으며, 5일 이상으로 배양시키는 경우 균의 용해현상 및 단백분해현상이 과도하게 일어나 보툴리눔 독소의 효능이 감소되므로 상기 범위 내가 바람직하다. 그리고, 정체 배양하는 것보다 발효기에 배양하는 것이 많은 수의 상기 클로스트리디움 보툴리눔의 확보가 가능하므로 발효기에서 배양한다.
상기 배양된 상기 클로스트리디움 보툴리눔은 상기 보툴리눔 독소를 추출해야 하므로 산침전단계를 거친다. 상기 산침전단계는 황산으로 클로스트리디움 보툴리눔의 단백질을 황산에 의하여 침전시키는 단계; 상기 황산에 침전된 단백질침전물에서 보툴리눔 독소를 아세테이트로 추출하는 단계; 상기 아세테이트추출액을 염산을 사용하여 보툴리눔 독소를 침전시키는 단계;를 거친 후에, 상기 염산침전단계에 의한 침전물에 DNase, RNase를 처리하고, 에탄올에 침전시키는 단계; 및 상기 에탄올에 의한 침전물을 황산암모늄에 침전시켜 결정화를 유도하는 황산암모늄침전단계;를 더 포함한다.
상기 산침전단계는 여러 단백질로 이루어진 클로스트리디움 보툴리눔에 산을 가함으로써 pH를 저하시켜 단백질이 등전점에 이르게 되어 침전되는 원리를 이용한 것이다. 넓은 의미에서 상기 산침전은 결정화도 포함되며, 순수하게 정제하는데 중점을 둔 결정화에 비하여 침전법은 혼합된 상태에서 목적물을 거칠게 분리하는 방법이다. 보통 산침전법은 목적 물질과 구조적으로 유사한 불순물이 함께 침전된다.
상기 황산침전단계의 황산의 pH 는 3.3 내지 3.8 이 바람직하다. 상기 황산에 의하여 상기 보툴리눔 독소와 유사한 단백질이 침전된다. 상기 보툴리눔 독소의 회수율은 pH가 낮을수록 높아지나 pH가 3.3 이하로 되는 경우 상기 보툴리눔 독소 자체에 영향을 미친다. 상기 pH가 4.0이상이 되는 경우 상기 보툴리눔 독소의 회수율이 낮아지므로 상기 범위 내에서 이루어짐이 바람직하다. 상기 pH 는 3.5일 때 상기 보툴리눔 독소의 회수율이 가장 높으므로 가장 바람직하다.
상기 황산침전단계에서 황산에 의하여 침전된 침전물에는 상기 보툴리눔 독소와 유사한 단백질이 모두 포함되어 있으므로 상기 보툴리눔 독소만 분리해 내어야 하므로 아세테이트추출단계를 거쳐야 한다.
상기 아세테이트추출단계의 아세테이트는 0.04 내지 0.09 몰농도이고, 상기 아세테이트의 pH 농도는 6.3 내지 6.5 이며, 상기 추출시간은 1.5 내지 2.5 시간으로 한다. 상기 아세테이트는 상기 보툴리눔 독소와 유사한 극성을 가지므로 상기 독소의 추출을 용이하게 한다. 상기 아세테이트의 몰농도가 0.04이하인 경우에는 추출이 되지 않으며, 0.09이상으로 되는 경우에는 추출액에 불필요한 RNA의 양이 많으므로 상기 범위 내에서 이루어짐이 바람직하다. 상기 추출시간은 1.5시간 이하로 하는 경우 제대로 추출되지 않으며, 2.5 이상으로 행하는 경우 역가가 감소되고 비경제적이므로 상기 시간 범위 내에서 행하여짐이 바람직하다. 상기 아세테이트의 pH 농도는 상기 범위 내에서 이루어지면 역가가 높으므로 상기 범위 내에서 이루어짐이 바람직하다. 상기 아세테이트로 추출시에 염화나트륨을 첨가하는 경우 역가가 떨어지므로 첨가하지 않음이 바람직하다. 또한, 염화칼슘을 첨가하는 경우 RNA 제거율이 일정 부분 증가하나 상기 보툴리눔 독소의 활성이 감소하므로 포함하지 않는 것이 바람직하다.
상기 아세테이트 추출액에는 보툴리눔 독소와 상기 보툴리눔 독소와 유사한 극성을 가지는 단백질이 포함되어 있으므로 상기 단백질을 염산으로 침전시키는 염산침전단계를 거쳐야 한다. 상기 염산침전단계의 염산은 pH가 3.5 내지 3.8이고, 상기 염산은 상기 아세테이트추출액의 pH가 5.0 내지 6.5인 경우에서는 0.1N의 염산을 첨가하고, 상기 아세테이트추출액의 pH가 5.0 내지 3.7에서는 1N의 염산을 첨가한다. 상기 pH 범위 내에서 행하여 지는 경우 보툴리눔 독소가 90% 이상이 되며 역가가 높다. 또한, RNA 제거율이 증가하므로 상기 범위 내에서 이루어짐이 바람직하다.
상기 염산은 상기 아세테이트추출액의 pH가 5.0 내지 6.5인 경우에서는 0.1N의 염산을 첨가하고, 상기 아세테이트추출액의 pH가 5.0 내지 3.7에서는 1N의 염산을 첨가하는데 상기 pH에 상관없이 1N의 염산을 첨가하는 경우 상기 독소의 활성과 회수율이 떨어지므로 상기와 같이 첨가함이 바람직하다. 또한, 상기와 같이 pH에 따라 다른 농도의 염산을 첨가하면 단백질의 엉김 현상이 현저히 줄어든다.
상기 염산에 의하여 침전시킨 침전물에는 보툴리눔 독소와 DNA, RNA도 함께 존재하므로 상기 DNA, RNA를 분해시키기 위해 DNase, RNase처리를 하고, 상기 독소만 뽑아내어야 하므로 에탄올에 침전시키는 것이 필요하다. 상기 에탄올침전단계의 DNase, RNase는 처리시간이 1.5 내지 3 시간으로 한다. 상기 DNase, RNase의 처리량에는 영향을 미치지 않으나 1.5시간 이하로 하면 DNA, RNA가 제대로 처리되지 않 고 3시간 이상으로 하는 경우 비경제적이므로 상기 범위내에서 행하는 것이 바람직하다. 또한 상기 에탄올침전단계에 있어 DNase, RNase를 처리함으로써, 발효 배지 중에 보툴리눔 독소와 함께 존재하는 핵산을 제거할 수 있다.
상기 에탄올침전단계의 에탄올은 농도가 15 내지 18 부피% 이고, 상기 에탄올의 처리시간은 1 내지 24시간으로 한다. 상기 에탄올은 상기 침전물의 비유전율을 변화시켜 침전물에 존재하는 단백질을 침전시키는 것이다. 상기 농도범위와 처리시간으로 하는 경우 역가가 높으며 회수율이 좋으므로 상기 농도범위와 시간 범위에서 행한다.
상기 에탄올에 의한 침전물을 황산암모늄에 침전시켜 결정화를 유도하는 황산암모늄침전단계를 포함한다. 상기 황산암모늄침전단계를 염석이라고 볼 수 있는데 상기 염석은 물에 잘 용해하는 염(황산암모늄 등)을 단백질혼합액에 가하여 이온강도를 증가시켜 단백질을 침전시키는 것이다. 만약 목적으로 하는 단백질이 황산암모늄 60% 포화 때 주로 침전하는 것을 알면 미리 60% 포화 이하의 황산암모늄 농도로 목적 이외의 단백질을 침전시켜 제거하고 다음에 60% 포화가 되도록 황산암모늄((NH4)2SO4)을 가하여 목적하는 단백질을 침전시키고 이것을 원심분리로 모은다. 염석 조작은 정제의 초기 수단으로 흔히 이용된다.
상기 정제단계의 완충용액으로 트리스(tris), 인산칼륨(K3HPO4), 인산나트륨(Na2PO4), 아세트산나트륨(CH3COONa)을 사용할 수 있으며, 아세트산나트륨을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
상기 정제 방법으로 정제된 보툴리눔 독소는 약학적 조성물의 유효성분이 된다. 상기 보툴리눔 독소는 활동 항진성 골격근을 특징으로 하는 신경근육 장애의 치료를 위하여 사용될 수 있다. 또한, 본태성 안검경련, 사시 및 반측안면 경련의 치료, 경부 디스토니아의 치료 및 미간(안면) 주름의 처치 등 다양하게 사용될 수 있다.
이상에서 상술한 바와 같이 상기와 같은 본 발명에 따른 클로스트리디움 보툴리눔에서 보툴리눔 독소를 정제하는 방법에 따르면, 상기 클로스트리디움 보툴리눔을 배양배지에 배양단계, 상기 배양된 배양액을 적어도 하나 이상의 산으로 순차적으로 처리하여 보툴리눔 독소를 침전시키는 산침전단계 및 상기 산침전단계에 의한 상기 보툴리눔 독소가 포함된 침전물을 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계를 포함하여 이루어져 보툴리눔 독소의 정제시간을 단축하는 효과가 있다. 또한, 상기 정제시간을 단축함으로써 상기 보툴리눔 독소의 대량생산이 가능하고 상기 대량생산으로 비용을 낮추는 효과가 있다.
또한 본 발명에 의한 정제 방법은 혐기성 시설 내에서 이루어져야 할 필요가 없으므로 경제적인 효과가 있으며, 상기 정제방법에 의하여 보툴리눔 독소가 명확하게 분리 동정되므로 상기 독소의 효능을 상승시킬 수 있는 효과가 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1 - 클로스트리디둠 보툴리눔 배양을 위한 배지>
1-1 배양 배지의 조성 결정
배지조성을 결정하기 위하여 펩톤 배지, 브레인 하트 인퓨전 배지, 게슬러 F. 보헬 H(Gessler F, Bohnel H.) 배지를 준비하였다. 상기 준비한 배지에 클로스트리디둠 보툴리눔을 접종하고 배양한 다음 배지별 배양액을 멸균 상태에서 사육한 흰쥐에 주사한 다음, 주사된 흰쥐 50%가 치사되는 반수치사량 LD 50(Lethal dose 50)을 조사하여 표 1에 나타내었다.
배지별 조성성분 및 반수치사량
배지 펩톤 배지 BHI 배지 Gessler F, Bohnel H. 배지
배지의 조성성분 2% peptone
1% yeast extract
1% N-Z amine
0.5% glucose
(pH 7.4)		 1% peptone
0.3% yeast extract
1% Brain Heart Infusion
0.5% glucose
(pH 7.4)		 1% peptone
0.3% yeast extract
1% N-Z amine
0.1% starch
0.5% NaCl
0.3% Sodium acetate
0.05%
L-cysteine-HCl
0.5% glucose
(pH 7.4)
LD50 (U/ml) 1×105 2×105 8×104
동일한 조건 하에 5일 동안 배양하여 역가 시험시 BHI 배지의 보툴리눔 독소에 따른 치사량이 다른 조건에 비하여 2배 이상 높음을 확인하였다. 또한, 배양액상에서 확인하였을 때 펩톤배지는 RNA가 많이 포함되었음을 확인하였고, BHI 배지는 RNA가 거의 없음을 확인하였다.
1-2 배양배지의 효모추출물 포함 % 결정
배지의 효모추출물(Yeast extract)의 포함양에 따른 독소의 양을 알아보기 위하여 각각 다른 농도의 배지를 준비하고 상기 배지에 클로스트리디둠 보툴리눔을 접종하고 배양한 다음 배지별 배양액을 멸균 상태에서 사육한 흰쥐에 주사한 다음 반수치사량 LD50을 조사하여 표 2 에 나타내었다.
배지별 조성성분 및 반수치사량
배지 Yeast extract(0.3%) Yeast extract(0.5%) Yeast extract(1.0%)
조성성분 0.3% yeast extract
0.5% glucose
(pH 7.4)		 0.5% yeast extract
0.5% glucose
(pH 7.4)		 1% yeast extract
0.5% glucose
(pH 7.4)
LD50 (U/ml) 2.5×105 3×105 2×105
상기 각각의 배지별로 동일한 조건 하에 5일 동안 배양하여 역가 시험시 효모추출물을 0.5% 포함하고 있는 배지의 보툴리눔 독소에 따른 치사량이 다른 조건에 비하여 1.5배까지 높음을 확인하였다.
1-3 배양 배지의 Glucose 포함 % 결정
배지의 글루코오스(Glucose)의 포함량에 따른 독소의 양을 알아보기 위하여 각각 다른 농도의 배지를 준비하고 상기 배지에 클로스트리디둠 보툴리눔을 접종하고 배양한 다음 배지별 배양액을 멸균 상태에서 사육한 흰쥐에 주사한 다음 반수치사량 LD50을 조사하여 표 3 에 나타내었다.
배지별 조성성분 및 반수치사량
배지 Glucose (0.5%) Glucose (1%) Glucose (1.5%)
조성성분 0.5% yeast extract
0.5% glucose
(pH 7.4)		 0.5% yeast extract
1% glucose
(pH 7.4)		 0.5% yeast extract
1.5% glucose
(pH 7.4)
LD50 (U/ml) 3×105 3.5×105 2×105
상기 각각의 배지별로 동일한 조건 하에 5일 동안 배양하여 역가 시험시 글루코오스(Glucose)를 1% 포함하고 있는 배지의 보툴리눔 독소에 따른 치사량이 다른 조건에 비하여 최소 1.5배까지 높음을 확인하였다.
1-4 배양 배지의 pH 결정
배지의 pH에 따른 보툴리눔 독소의 양을 알아보기 위하여 상기 실험예 1 내지 3의 배지조건 (0.5% yeast extract, 0.5% glucose)으로 하여 각각 다른 pH의 배지를 준비하고 상기 배지에 클로스트리디둠 보툴리눔을 접종하고 배양한 다음 배지별 배양액을 멸균 상태에서 사육한 흰쥐에 주사한 다음 반수치사량 LD50을 조사하여 표 4 에 나타내었다.
배지의 pH별 반수치사량
배지의 pH pH 6.8 pH 7.4 pH 8.0 pH 8.5
LD50 (U/ml) 2.5×105 3.5×105 4×105 2×105
상기 각각의 배지별로 동일한 조건 하에 5일 동안 배양하여 역가 시험시 pH 가 8.0인 배지의 보툴리눔 독소에 따른 치사량이 다른 조건에 비하여 최소 1.5~2배 높음을 확인하였다.
1-5 배지의 배양일수 결정
배양일수에 따른 보툴리눔 독소의 양을 알아보기 위하여, 상기 실험예 1 내지 4의 배지조건 (0.5%yeast extract, 0.5% glucose, pH 8.0)으로 하여 3일, 4일, 5일, 6일의 조건으로 하여 상기 클로스트리디둠 보툴리눔을 상기 배지에 배양하였다. 상기 각각의 배지별 배양액을 멸균 상태에서 사육한 흰쥐에 주사한 다음 반수치사량 LD50을 조사하였다. 또한, 상기 배양일수에 따른 배지의 배양액을 아세테이트로 추출한 단백질의 양을 조사하고, 상기 치사량과 함께 하기 표 5에 나타내었다.
배지의 배양일별 반수치사량
배양일수 3 Day 4 Day 5 Day 6 Day
LD50 (U/ml) 4×105 3×105 4×105 3×105
배양일수별 acetate 후(정제전) Protein (mg/ml) 13.5
 11
 8.4
 8.5
상기 표 5을 살펴보면 동일한 조건 하에 배양하여 역가 시험시 5일 배양시 의 보툴리눔 독소에 따른 치사량이 다른 배지에 비하여 1.5배 정도 높거나 비슷하였다. 또한, 상기 치사량이 비슷한 경우 정제시 보툴리눔 독소 이외의 단백질(protein)의 양이 적음으로 정제 후 순도가 높아짐을 확인하였다.
1-6 배양방법 결정
배양방법에 따른 보툴리눔 독소의 양을 알아보기 위하여, 상기 실험예 1 내지 4의 배지조건 (0.5%yeast extract, 0.5% glucose, pH 8.0)으로 하여 정체 배양과 발효기(fermentor) 배양 조건으로 하여 상기 클로스트리디둠 보툴리눔을 배양하였다. 상기 각각의 배지별 배양액을 멸균 상태에서 사육한 흰쥐에 주사한 다음 반수치사량 LD50을 조사하여 표 6에 나타내었다.
배지의 배양방법별 반수치사량
배양방법 정체 배양 발효기 배양
LD50 (U/ml) 5×104 4×105
상기 표 6을 살펴보면, 동일한 조건 하에 5일 동안 배양하여 역가시험시 발효기(rmentor) 배양의 경우 보툴리눔 독소에 따른 치사량이 정체 배양에 비하여 최소 5~10배 높음을 확인하였다.
< 실시예 2 - 산침전 단계>
2-1 황산침전
상기 실험예 1 내지 7에서 흰쥐의 치사량이 가장 높은 배양조건 (0.5%yeast extract, 0.5% glucose, pH 8.0인 배지에서 5일간 배양기에서 배양)으로 하여 상기 클로스트리디둠 보툴리눔을 배지에 배양한 다음 상기 배지의 배양액을 황산을 사용하여 각기 다른 pH로 침전시켰다. 상기 각각의 침전액을 멸균 상태에서 사육된 흰쥐에 주사하여 반수치사량 LD50을 조사하여 하기 표 7에 나타내었다.
황산의 pH 별 반수치사량
황산의 pH pH 2.5 pH 3.0 pH 3.5 pH 4.0
LD50 (U/ml) 1×105 3×105 4×106 2×105
상기 표 7을 살펴보면, 상기 보툴리눔 독소의 회수율은 pH가 낮을수록 높아지나, pH 2.5와 pH 3.0의 경우에서는 보툴리눔 독소 자체에 영향을 미쳐 역가가 낮아짐을 확인하였고, pH 4.0에서는 보툴리눔 독소의 회수율이 낮아져서 결국 pH 3.5가 가장 높은 역가를 회수함을 확인하였다.
2-2 아세테이트 추출
2-2-1 아세테이트추출단계에서의 아세테이트 농도
황산에 의하여 황산침전단계를 거친 상기 클로스트리디둠 보툴리눔의 침전된 단백질으로부터 보툴리눔 독소를 추출하기 위하여 아세테이트를 이용하여 추출하였다. 상기 아세테이트의 농도에 따른 보툴리눔 독소의 양을 알아보고자 0.05M, 0.1M 및 0.15M 농도의 아세테이트를 준비하고 각각의 농도에서 추출하였다. 상기 각각의 농도에서 추출한 추출액을 멸균 상태에서 사육된 흰쥐에 주사하여 반수치사량 LD50을 조사하였다.
또한, 상기 각각의 농도에서 추출된 추출액을 에탄올침전단계까지 거친 후 침전물을 멸균 상태에서 사육된 흰쥐에 주사하여 반수치사량 LD50을 조사하였다. 상기 조사한 결과를 하기 표 8 에 나타내었다.
아세테이트 농도에 따른 단계별 반수치사량
0.05M 0.1M 0.15M
각 농도별 acetate 처리 후 Mouse LD50 (U/ml) 1×106 2×106 1.5×106
각 농도별 산침전 과정 후(EtOH 처리 후) Mouse LD50 (U/Protein-mg) 4×106 2×106 1.5×106
상기 표 8을 살펴보면, 상기 아세테이트 농도를 0.1M로 한 경우 역가가 다른 농도에 비해 2배 정도 좋으나 이 후 산침전 과정을 거치면 0.05M과 역가가 비슷한 수치로 나오며 protein-mg당 toxin 회수율이 0.05M에서 가장 높은 것으로 나타났다.
2-2-2 아세테이트추출단계에서의 추출시간
황산에 의하여 황산침전단계를 거친 상기 클로스트리디둠 보툴리눔의 침전된 단백질을, 아세테이트를 이용하여 추출하였다. 상기 아세테이트의 추출시간에 따른 보툴리눔 독소의 양을 알아보고자 1시간, 2시간 및 24시간 동안 아세테이트로 추출하였다. 상기 각각의 농도에서 추출한 추출액을 멸균 상태에서 사육된 흰쥐에 주사하여 반수치사량 LD50을 조사하여 표 9 에 나타내었다.
아세테이트 추출 반응시간에 따른 반수치사량
추출시간 1 hr 2 hr 24 hr
반응시간별 acetate 처리 후 Mouse LD50 (U/ml) 1.5×106 2×106 1×106
상기 표 9을 살펴보면 상기 아세테이트로 2시간 동안 추출한 경우 역가가 가장 높았으며, 상기 추출시간을 24시간 동안 시행했을 때에는 역가가 2시간에 비해 1.5~2배 정도 감소됨을 확인하였다.
2-2-3 아세테이트추출단계에서의 아세테이트의 pH
상기 아세테이트의 pH에 따라 추출되는 보툴리눔 독소의 양을 알아보고자 pH 5.3, pH 6.0 및 pH 6.5로 된 아세테이트를 준비하고 상기 pH별로 추출한 추출액을 멸균 상태에서 사육된 흰쥐에 주사하여 반수치사량을 조사하였다.
상기 pH 5.3인 아세테이트의 치사량은 3×105 U/㎖로 나타났으며, pH 6.0인 아세테이트의 치사량은 2×106 U/㎖로 나타났다. 또한, pH 6.5인 아세테이트의 치사량은 4×105 U/㎖로 나타났다.
상기 아세테이트의 pH.6.5가 pH 5.3에 비해 역가가 5 내지 10배정도, pH 6.0에 비해 4 내지 5배 정도 높음을 확인하였다.
2-2-4 아세테이트추출단계에서의 염화나트륨 첨가여부
상기 아세테이트로 추출시에 염화나트륨(NaCl) 첨가 여부에 따른 보툴리눔 독소의 양을 알아보고자 0.05M, 0.1M 및 0.15M 농도의 염화나트륨을 준비하고 각각의 농도에서 추출하였다. 상기 각각의 농도에서 추출한 추출액을 멸균 상태에서 사육된 흰쥐에 주사하여 반수 치사량 LD50을 조사하였다.
상기 염화나트륨이 0.05M 인 아세테이트의 치사량은 1×106 U/㎖로 나타났으며, 염화나트륨이 0.1M 농도인 아세테이트로 추출한 추출액의 치사량은 1×106 U/㎖로 나타났다. 또한, 염화나트륨이 1M 인 아세테이트로 추출한 추출액의 치사량은 7×105 U/㎖로 나타났으며, 상기 염화나트륨이 포함되지 않은 아세테이트로 추출한 추출액의 치사량은 2×106 U/㎖로 나타났다.
상기 결과를 살펴볼 때 염화나트륨을 포함하지 않는 경우가 다른 조건에 비하여 역가가 2 내지 3배 정도 높음을 확인하였다.
2-2-5 아세테이트추출단계에서의 염화칼슘의 첨가여부
상기 아세테이트로 추출시에 염화칼슘(CaCl2)의 첨가 여부에 따른 보툴리눔 독소의 양을 알아보고자 0.15M, 0.6M 및 1M 농도의 염화칼슘을 준비하고 각각의 농도에서 추출하였다. 상기 각각의 농도에서 추출한 추출액을 멸균 상태에서 사육된 흰쥐에 주사하여 반수치사량을 조사하였다.
상기 염화칼슘이 0.15M 인 아세테이트의 치사량은 1×106 U/㎖로 나타났으며, 염화칼슘이 0.6M 농도인 아세테이트로 추출한 추출액의 치사량은 5×105U/㎖로 나타났다. 또한, 염화칼슘이 1M 인 아세테이트로 추출한 추출액의 치사량은 2×105 U/㎖로 나타났으며, 상기 염화칼슘이 포함되지 않은 아세테이트로 추출한 추출액의 치사량은 2×106 U/㎖로 나타났다.
상기 염화칼슘을 포함하는 경우 RNA 제거율이 일정 부분 증가되나 독성이 2 내지 10배정도 감소하였으므로 미포함하는 경우가 가장 좋음을 확인하였다.
< 실시예 3 - 염산 침전단계>
3-1 염산침전단계에서 염산의 pH 와 염산의 첨가 농도에 따른 독소의 양>
상기 아세테이트추출단계의 아세테이트추출액을 염산을 사용하여 보툴리눔 독소을 침전시키는 하는 염산침전단계에서 상기 염산의 pH에 따라 추출되는 보툴리눔 독소의 양을 알아보고자 pH 2.5, pH 3.0, pH 3.5 및 pH 3.7로 된 염산을 준비하고 상기 pH별 로 침전시킨 침전물을 멸균 상태에서 사육된 흰쥐에 주사하여 치사량을 조사하여 하기 표 10에 나타내었다.
pH 2.5 pH 3.0 pH 3.5 pH 3.7
HCl 처리 후 Mouse LD50 (U/ml) 3×106 3×106 5×106 5×106
상기 표 10을 참고하면, 상기 염산의 pH가 pH 3.7에서 보툴리눔 독소가 90% 이상 되며 다른 조건에 비해 역가가 1.5배 정도 높음을 확인하였다. 또한, 도 3을 참고하면, pH가 3.7인 염산에 의하여 침전시킨 경우가 다른 조건에 비하여 RNA 제거율이 높음도 확인하였다.
그리고, 상기 염산을 pH6.5 내지 pH5.0에서는 0.1N HCl, pH5.0 내지 pH3.7에서는 1N 염산을 첨가하는 방식이 1N 염산 (pH 6.5 ~ pH 3.7)으로만 첨가하는 것에 비하여 활성이나 독소(toxin) 회수율에서는 유사한 결과가 나왔으나 침전되는 형태, 즉, 단백질(protein)의 엉김 현상이 현저히 줄어들었음을 확인하였다.
< 실시예 4 - RNase / DNase 처리>
4-1 에탄올침전단계에서의 RNase 의 처리량 및 처리시간에 따른 RNA 의 제거율
상기 염산침전단계에 의한 침전물에 DNase, RNase를 처리하는데, 상기 DNase, RNase의 처리량에 따른 DNA, RNA의 제거율을 알아보기 위하여 상기 DNase, RNase를 50ug/ml, 100ug/ml 및 200ug/ml를 준비하였다. 상기 DNase, RNase의 양에 따른 DNA, RNA의 제거율을 조사하였으나 유의적인 차이를 보이지 않았다.
상기 DNase, RNase 처리시간에 따른 DNA, RNA의 제거율을 알아보기 위하여 상기 DNase, RNase를 1시간, 2시간 및 3시간 동안 처리하였다. 도 4를 참고하면, 상기 DNase, RNase로 2시간, 3시간 처리시 유의적 차이가 없었으나 DNA, RNA가 대부분 분해되었으며(전기영동시 band가 적음.), 1시간 처리시에는DNA, RNA가 많이 남았음을 확인하였다(전기영동시 band가 많음.).
실시예 5 - 에탄올침전
5-1 에탄올침전단계에서의 에탄올 농도
상기 염산침전단계에 의한 침전물에 DNase, RNase를 처리하고, 에탄올(ethanol)에 침전시키는 에탄올침전단계에서의 에탄올의 농도에 따른 독소의 양을 알아보기 위하여 전체 부피에 대한 %인 12%, 15%, 18% 및 21%의 에탄올을 준비하였다. 상기 각각의 농도에서 침전시킨 침전물을 멸균 상태에서 사육된 흰쥐에 주사하여 치사량을 조사하여 하기 표 11에 나타내었다.
EtOH 농도 12% 15% 18% 21%
LD50 (U/Protein-mg) 1×106 4×106 3×106 2×106
상기 표 11를 살펴보면, 상기 에탄올의 농도가 15, 18%인 경우에는 농도가 12, 21%에 비하여 역가가 좋으나 둘 간에는 유의적 차이를 보이지 않았다. 그러나, 회수되는 전체 단백질의 양이 15%가 적었으므로 15%가 가장 좋음을 확인하였다.
5-2 에탄올침전단계에서의 처리시간에 따른 독소의 양
상기 에탄올의 처리시간에 따른 독소의 양을 알아보기 위하여 에탄올 처리시간을 1시간과 24시간으로 처리하였다. 상기 각각의 처리시간에 따른 침전물을 멸균 상태에서 사육된 흰쥐에 주사하여 치사량을 조사하였다. 상기 에탄올을 1시간 동안 처리한 경우에는 치사량이 8×106 U/㎖이었고, 24시간동안 처리한 경우에는 치사량이 2×107U/㎖으로 나타났다. 상기 결과로 1시간 처리한 경우에 비해 24시간 처리한 경우에서 역가가 3배정도 높음을 확인하였다.
5-3 황산 암모늄 침전
상기 실시예 5-2의 에탄올에 의한 침전물을 황산암모늄((NH4)2SO4)에 침전시켜 보툴리눔 독소의 결정화를 유도하도록 하였다.
실시예 6 - 정제
6-1 정제단계에서의 사용 완충용액의 결정
상기 산침전단계에 의한 상기 보툴리눔 독소가 포함된 침전물을 액체크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 상기 정제를 위한 완충용액(buffer solution)을 결정하기 위하여 트리스(Tris), 인산칼슘(K3PO4), 인산나트륨(Na2PO4) 아세트산나트륨(CH3COONa)을 사용하여 상기 독소의 용해도를 조사하였다. 아세트산나트륨을 완충용액으로 사용시 보툴리눔 독소의 용해도가 근소하지만 다른 조건에 비하여 높았다.
또한, 상기 각각의 완충용액에 용해한 후 독소에 따른 치사량을 조사한 것을 하기 표 12에 나타내었다.
Tris Potassium phosphate Sodium phosphate Sodium acetate
LD50(U/ml) 5×106 8×106 1×106 1×107
A260/280 1.01 1.00 1.00 1.00
A260 0.092 0.083 0.089 0.103
A280 0.092 0.083 0.089 0.103
상기 표 12를 살펴보면 아세트산나트륨을 완충용액으로 선택한 경우 치사량이 가장 높음을 알 수 있다.
본 발명은 실시예를 참고로 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.
본 발명의 보툴리눔 독소의 정제방법은 정제시간을 단축함으로써 상기 보툴리눔 독소의 대량생산이 가능하고 상기 대량생산으로 비용을 낮추는 효과가 있으며, 혐기성 시설 내에서 이루어져야 할 필요가 없으므로 경제적인 효과가 있으며, 상기 정제방법에 의하여 보툴리눔 독소가 명확하게 분리 동정되므로 상기 독소의 효능을 상승시킬 수 있다. 상기 정제 방법으로 정제된 보툴리눔 독소는 약학적 조성물의 유효성분으로서, 신경근육 장애의 치료, 본태성 안검경련, 미간(안면) 주름의 처치 등 다양하게 사용될 수 있다.
도 1 은 보툴리눔 독소을 정제하는 과정을 나타낸 과정도;
도 2 는 브레인하트인퓨전배지와 펩톤배지에서의 산침전 과정의 핵산의 포함여부를 전기영동 결과로 비교한 것을 나타내는 도면;
도 3 은 산침전단계에서 HCl침전의 pH별 전기영동 결과를 나타내는 도면;
도 4 는 DNase, RNase 처리시간별 전기영동 결과를 나타내는 도면; 및
도 5 는 정제단계별 결과(SDS-PAGE)를 나타내는 도면이다.

Claims (11)

  1. 클로스트리디둠 보툴리눔을 배양배지에서 배양하는 제1단계;
    상기 제1단계에서 배양된 배양액을 1차 산침전시키고; 아세테이트로 추출한 후, 산을 첨가하여 2차 산침전시키는 것을 포함하는 제2단계;
    상기 제2단계의 산 침전물에 DNase, RNase를 처리한 후, 에탄올에 침전시키고 상기 에탄올에 의한 침전물을 황산암모늄에 침전시켜 결정화를 유도하는 것을 포함하는 제3단계; 및
    상기 제3단계의 침전물에 액체크로마토그래피를 실시하여 보툴리눔 독소를 정제하는 제4단계;
    를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 보툴리눔으로부터 보툴리눔 독소를 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1단계의 배양배지는 브레인 하트 인퓨전, 펩톤, 효모추출물 및 글루코오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 배양 배지는 효모추출물의 농도가 0.3 ~ 0.5 중량% 이며, 상기 글루코오스의 농도가 0.5 ~ 1 중량% 이며, 상기 배양은 3 내지 5일 동안 발효기(fermentor)에 의하여 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2단계는 1차 산침전은 황산에 의하여, 2차 산침전은 염산에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제2단계의 아세테이트추출에 사용되는 아세테이트는 0.04 ~ 0.09 M 이고, pH 가 6.3 ~ 6.5 이며, 상기 추출시간은 1.5 ~ 2.5 시간인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 황산의 pH 농도는 3.0 ~ 3.9 인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 염산에 의한 침전시, 아세테이트추출액의 pH가 5.0 ~ 6.5인 경우에서는 0.1N의 염산을 첨가하고, 상기 아세테이트추출액의 pH가 3.7 ~ 5.0에서는 1N의 염산을 첨가하며, 상기 첨가되는 염산의 pH는 3.5 ~ 3.8인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 제3단계는 에탄올침전단계의 DNase, RNase 처리시간이 1.5 ~ 3 시간인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 에탄올침전단계의 에탄올은 농도가 15 ~ 18 부피% 이고, 상기 에탄올의 처리시간은 1 ~ 24 시간인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제4단계는 아세트산나트륨 용액을 완충용액으로 사용함을 특징으로 하는 방법.
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