WO2013177647A1 - Meio de cultura para bactérias do gênero clostridium livre de componentes de origem animal e processo para produção de sobrenadante contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica - Google Patents

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culture
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supernatant
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Marcos Castanheira Alegria
Lucidio Cristóvão FARDELONE
Marina Baiochi Riboldi DELALANA
Josef Ernst Thiemann
Spartaco Astolfi Filho
Roberto Carlos Debom Moreira
Ogari De Castro Pacheco
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Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda.
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    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24003—Microbial collagenase (3.4.24.3)

Definitions

  • the present invention relates to the field of microbiology and biotechnology. Particularly, the present invention relates to bacterial culture media of the genus Clostridium, free of animal components, and process for the production of supernatant containing one or more proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity.
  • Collagenase (clostridiopeptidase A, EC 3.4.24.3) is a proteolytic enzyme capable of hydrolyzing proteins of the native and denatured collagen group (gelatines). No other enzyme is able to cleave native collagen due to its particular amino acid composition (presence of a large number of imino acids, represented by the Gly-Pro-X tripeptide, where residue X is often proline or hydroxyproline), and its unique macrostructure (complex triple helix structure).
  • Collagenase alone or as a major component of compositions containing other proteolytic enzymes, has been widely used in the treatment of various diseases and pathological conditions in the human body associated with excessive collagen deposition and erratic accumulation of collagen-rich fibrous tissue since the decade. These diseases and conditions are called collagen-mediated diseases, and the local application of collagenase-containing compositions is one of the possibilities of alternative treatment to surgical intervention. Debridement of Necrotic Tissues (burns, dermal lesions, etc.) is also one of the conditions under which the use of collagenase-containing compositions is approved by health surveillance agencies, demonstrating surprising results in the treatment of healing processes.
  • Some therapeutic applications of collagenase containing compositions are: treatment of burns, exerting a concomitant beneficial effect on tissue regeneration; enzymatic wound debridement and treatment of infected wounds and ulcers (skin and decubitus ulcers); treatment of intervertebral disc hernias; selective lysis of collagen fibers from the vitreous body of the eye; treatment of Dupuytren's disease; Peyronie's disease treatment; treatment for adhesive capsulitis; treatment of lateral epicondylitis, carpal tunnel syndrome and plantar fasciitis; increased regeneration of damaged nerves; It is also widely used by medical specialties such as plastic surgery and various dermatological and aesthetic procedures, for example in the treatment of mammalian cellulitis and scars such as acnes, keloids and other hypertrophic scars by intralesional injection of purified collagenase.
  • Collagenases have also been described as important tools for transplantation of some specific organs, such as for isolation of Langerhans cells from pancreatic islets, microvascular endothelial cells, hepatocytes and chondrocytes (WO 9824889, 1997). Tissue dissociations mediated by collagenolytic enzymes are a critical step in many cell isolation procedures. Most of the therapeutic uses described above use as a source of collagenase the supernatant, purified or not, from bacterial cultures, especially from Clostridium h ⁇ stolyticum strains. Clostridium histolyticum is a gram-positive, anaerobic, spore-forming cylindrical bacterium. The collagenolytic activity of extracellular enzymes in this bacterial species has been known for over 50 years, when an extracellular enzyme capable of digesting Achilles tendons from cattle was first isolated.
  • Clostridium sp mainly Clostridium histolyticum
  • Clostridium histolyticum remains the main source for obtaining collagenolytic and gelatinolytic enzymes for medicinal use due to their higher productivity and enzymatic activity against various forms of collagen and its peptides.
  • collagenases for therapeutic use include mammalian cells, crustaceans (crab, shrimp), fungi and other bacteria (Streptomyces, Pseudomonas and Vibrio).
  • Clostridium collagenases to digest various types of collagen (type I, II, III, VII, and X) and gelatin is the first factor that differentiates them from other collagen sources.
  • These clostridial enzymes besides having potent collagenolytic activity when compared to vertebrate collagenases, have an optimal pH for their activity close to the human physiological pH range.
  • Bond and Van Wart (1984; Biochemistry 23, 3077-3085) isolated six distinct enzymes from commercial collagenase preparations, with molecular weights ranging from 68 kDa to 130 kDa and isoelectric points between pH 5.5 and 6.5, classifying - those in two classes according to substrate specificity: Class I - have higher activity on high molecular weight collagen (native collagen: intact); Class II - exhibit a preference for low molecular weight collagen fragments (denatured collagen: gelatines). These activities are apparently complementary, with evidence of their synergistic action on native collagen.
  • collagenase In addition to the various class I and II collagenase isoforms, traditional collagenase preparations based on the bacterial culture supernatant of Clostridium histolyticum contain more than 30 different enzymes.
  • the primary constituent is collagenase (classes I and II), however, other important proteases found include neutral proteases such as gelatinases, clostripaines (clostridiopeptidase B, EC 3.4.22.8), trypsins, elastases and aminopeptidases.
  • Non-proteolytic enzymes are also found in traditional collagenase preparations, including: galactosidase, acetylglucosaminidase, fucosidase, phospholipase, neuraminidase (or sialidase) and hyaluronidase.
  • galactosidase acetylglucosaminidase
  • fucosidase fucosidase
  • phospholipase neuraminidase (or sialidase)
  • neuraminidase or sialidase
  • hyaluronidase hyaluronidase
  • proteolytic and non-proteolytic, sialidase, hyaluronidase and collagenase are very involved in the degradation process of extracellular matrix components, being desirable the presence of this "enzymatic combination" to obtain compositions that can be used as agents. of enzymatic debridement of dermal lesions and organ transplant
  • collagenase-containing composition for tissue dissociation and debridement is a crude or partially purified preparation (including a few purification steps) since enzymes are required to act on native collagen and reticular fibers, in addition to enzymes that hydrolyze other proteins, polysaccharides and lipids from the extracellular matrix of connective and epithelial tissues.
  • the complex composition of "crude" collagenase preparations introduces difficulties in their production process, mainly related to the definition of desirable proteolytic enzyme expression patterns in the final product composition.
  • collagenase compositions for the treatment of some of the collagen-mediated diseases requires high purity of the preparations due to the need for specific action on collagen-only digestion and their administration through injections. local.
  • the purification processes of the C. histolyticum culture supernatant are very long, including numerous steps with different purification strategies.
  • Enzyme activity and protease concentration in C. histolyticum culture supernatants vary with bacterial lineage, culture medium, culture conditions, culture age, cell density, among other variables.
  • the intrinsic variability of this type of biotechnological process implies exhaustive quality control testing of the produced batches, increasing production costs.
  • the loss of efficacy of traditional collagenases over time, despite the control of their storage conditions has been related to the enzymatic composition of the produced bacterial culture supernatant, requiring the definition of culture conditions capable of directing the expression of collagenolytic and gelatinolytic enzymes, in particular collagenases, by C. histolyticum.
  • Proteins and peptides are the main sources of carbon and nitrogen in culture of Clostridium bacteria.
  • brain-heart infusion Brain Heart Infusion - BHI
  • tryptose tryptose
  • peptone proteas protein extract
  • casein and gelatin are described as protein and peptide sources for growth and enzymatic production by C. histolyticum.
  • the composition of the liquid culture media described for growth of C. histolyticum also often includes inorganic salts, vitamins, glucose, yeast extract, sodium thioglycolate and iron sulfate in various concentrations.
  • animal peptones are bacto-peptone, peptone protose, casein hydrolyzate, triptych casein hydrolyzate, among others. Combinations of these components with vegetable peptones are described.
  • Clostridium histolyticum is considered as an amino acid fermenting strain, and is subclassified in the so-called Group II (C. botulinum; C. histolyticum; C. cochlearium; C. subterminale).
  • Serine, glutamine, glycine and valine despite being the main amino acids used by these species, have little or no effect on the amplitude of bacterial growth when added to the culture medium.
  • histolyticum present themselves as bad fermenters of simple carbohydrates, such as glucose, maltose, among others.
  • the reduction in C. histolyticum growth is even more pronounced when glucose cultures are performed under aerobic conditions, suggesting two inhibitory factors, sugars and oxygen / air.
  • bacterial growth and protease production by species of the genus Clostridium are influenced by the maintenance of an anaerobic environment.
  • C. histolyticum tolerates small amounts of oxygen, a fact observed for other species of the genus and can be considered as an aerotolerant microorganism.
  • minimum anaerobic conditions must be ensured.
  • Reducing agents are fundamental in anaerobic liquid cultures. Among the most commonly used agents are: meat digestion, glucose, sodium thioglycolate, cysteine, iron or metallic iron salts or mixtures thereof.
  • C. histolyticum cultivation processes have many disadvantages such as low yields, poor reproducibility and incomplete impurities separation. Moreover, one of the major problems of conventional C. histolyticum cultivation processes is the predominance of the use of animal components in the production of proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity for therapeutic use in humans.
  • C. histolyticum collagenolytic and gelatinolytic proteases for therapeutic use in humans undesirably adds a potential risk of infection and anaphylactic reactions in patients undergoing these treatments.
  • enzymatic A well-known example of disease caused by interspecific horizontal transmission of pathogens is spongiform bovine encephalitis (prion disease; "Mad Cow Disease") whose transmission from the original host animal (cattle) to Man was first registered in 1993 through human contact with physiological fluids and meat consumption of infected animals.
  • components based on soy and yeast extract are used as substitutes for peptides of animal origin, being able to support both growth and toxin production in the species already investigated.
  • genus Clostridium C. sporogenes, C. tetanus, C. botulinicum.
  • the culture media described so far have disadvantages such as: the presence of animal components, the high cost associated with their complex composition, the low expression of collagenases or the long cultivation time to obtain a supernatant with collagenolytic and gelatinolytic activity suitable for industrial production for therapeutic purposes.
  • WO2007089851 (2007; Auxilium) describes culture conditions of C. histolyticum for obtaining collagenases. Although describing the production of collagenases by C. histolyticum in a culture medium free of animal components, he highlights as preferred to produce, with better reproducibility, collagenase, a culture medium containing peptone protose (animal origin). Only culture medium with animal ingredients was able to produce collagenases in an appropriate proportion to maximize their synergistic activity, resulting in a therapeutic benefit. In addition to peptones (vegetables and / or animals), the described culture medium may contain amino acids (glutamine, tryptophan and asparagine), yeast extract, inorganic salts, glucose and vitamins.
  • the present invention aims to present a culture medium for bacteria of the genus Clostridium, preferably C. histolyticum, free of components of animal origin and process for producing supernatant containing one or more proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity suitable for production. collagenolytic and gelatinolytic enzymes, in particular collagenases, for therapeutic purposes.
  • the present invention relates to a culture medium for bacteria of the genus Clostridium free from animal origin, characterized in that it comprises water, non-animal peptone or derivatives thereof, yeast extract and the amino acids cysteine and arginine, or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the bacteria are from strains of the species Clostridium histolyticum.
  • the culture medium of the present invention may further comprise one or more additives selected from the group consisting of pH adjusting agent in the range of 7 to 8, reducing agent, inorganic salts, vitamins and mixtures thereof.
  • Peptone of non-animal origin may be a vegetable peptone or yeast peptone.
  • the non-animal peptone is a vegetable peptone selected from the group consisting of soybean, cotton, wheat, sunflower, rice, peanut, bean, pea, potato, corn or mixtures thereof. More preferably, the vegetable peptone is a soy peptone.
  • the culture medium of the present invention is characterized in that the non-animal peptone concentration is 0.5% to 5% w / v, the yeast extract concentration is 0.5% to 5% w / v , of the concentration of cistern or pharmaceutically acceptable salts thereof is from 0.01% to 0.1% w / v and the concentration of arginine or pharmaceutically acceptable salts thereof is from 0.1% to 1% w / v.
  • the culture medium of this invention is characterized in that the concentration of non-animal peptone is 1% to 4% w / v, the concentration of yeast extract is 1% to 4% w / v, the concentration of cistern, or pharmaceutically acceptable salts thereof, be from 0.03% to 0.07% w / v of the arginine concentration, or pharmaceutically acceptable salts thereof, from 0.25% to 0.7% w / v.
  • the culture medium of this invention is characterized in that the concentration of non-animal peptone is 3% w / v, the concentration of yeast extract is 3% w / v, The cysteine concentration or pharmaceutically acceptable salts thereof is 0.0625% w / v and the arginine concentration or pharmaceutically acceptable salts thereof is 0.375% w / v.
  • the culture media of the present invention are free of components of animal origin, and surprisingly stimulate the production of proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity, particularly collagenases. , superior to conventional peptone-containing culture media of animal origin.
  • the present invention also relates to a process for the production of a Clostridium histolyticum liquid culture supernatant containing one or more proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity comprising the steps of: a) providing a sterile culture medium free of components of animal origin; b) culturing an aliquot of Clostridium histolyticum stock culture in the culture medium from step (a) under anaerobic conditions at about 37 ° C to the stationary phase of bacterial growth to obtain an inoculum; c) providing a sterile culture medium free of components of animal origin in accordance with the present invention; d) adding to the culture medium of step (c) an inoculum volume of step (b) equal to or less than 10% of the final volume of medium defined in (c); e) cultivating the C.
  • Such a process may include one or more additional steps for purification of one or more proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity present in the supernatant of step (f).
  • the present invention also relates to a C. histolyticum liquid culture supernatant containing one or more proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity obtained according to the above-mentioned process, and pharmaceutical compositions comprising Clostridium histolyticum liquid culture supernatant as active ingredient. and pharmaceutically acceptable excipients.
  • FIG. 1 Comparison of bacterial growth (optical density 600 nm) of C. histolyticum (ATCC 21000) in cultures with culture media free of animal components (3% w / v vegetable peptone, 3% w / v yeast, 0.0625% w / v cysteine hydrochloride) which differ with respect to the type of vegetable Pepton and yeast extract employed. Standard culture medium (containing casein peptone) used as a comparator.
  • FIG. 1 Comparison of bacterial growth (optical density 600 nm) of C. histolyticum (ATCC 21000) in crops with culture media free of animal components that differ quantitatively with respect to the plant peptone component (HY Pep 1511) and plant extract. yeast (YE5114). Animal-free culture media contain 0.0625% w / v cistern hydrochloride. Standard culture medium (containing casein peptone) used as a comparator.
  • Figure 3 Influence on growth (OD) and enzymatic activity of different concentrations of yeast extract (0-3% w / v) on the composition of animal-free culture medium for C. histolyticum (ATCC 21000) containing 3 or 4% w / v soybean peptone and 0.0625% w / v cysteine hydrochloride.
  • FIG. 4 Influence of pH on bacterial growth (optical density 600 nm) of C. histolyticum (ATCC 21000) in animal component-free culture media containing 3% w / v soybean peptone (NZ Soy BL4) , 3% w / v Yeast Extract (YE251) and 0.0625% w / v cysteine hydrochloride.
  • FIG. 6 Influence of supplementation with inorganic salts, vitamins and amino acids on growth and collagenolytic and gelatinolytic activity of the supernatant obtained from C. histolyt ⁇ cum liquid culture (ATCC 21000) in animal component free culture medium containing: 30 g / L of soybean peptone (NZ SOY BL4), 30 g / l yeast extract (YE 251) and amino acids cysteine hydrochloride (0.625 g / l) and arginine hydrochloride (3.75 g / l).
  • Analysis of enzymatic activity in zymography gel (samples of supernatants obtained for each culture medium analyzed in duplicate).
  • the bars (1 - 4) in the graph refer to:
  • YE Extract YE 251 (30 g / L); Cysteine hydrochloride (0.625 g / l);
  • Figure 7 Comparison of collagenolytic and gelatinolytic activity of supernatant obtained from liquid culture of C. histolyticum (ATCC 21000) in cultures with culture media free of animal components (3% w / v vegetable peptone, 3% w / v Yeast extract, 0.0625% w / v cysteine hydrochloride) which differ with respect to the type of vegetable peptone and yeast extract employed. Standard culture medium (containing casein peptone) used as a comparator.
  • FIG. 1 Bacterial growth of C. histolyticum (ATCC 21000) and collagenolytic and gelatinolytic activity of the supernatant obtained from liquid culture of C. histolyticum in culture medium free of animal components (30 g / l NZ SOY BL4 soybean peptone 30 g / l YE251 and 0.625 g / l cysteine) additionally containing arginine, glycine or both.
  • animal components (30 g / l NZ SOY BL4 soybean peptone 30 g / l YE251 and 0.625 g / l cysteine) additionally containing arginine, glycine or both.
  • FIG. 9 Bacterial growth of C. histolyticum (ATCC 21000) and collagenolytic and gelatinolytic activity of the supernatant obtained from C. histolyticum liquid culture in animal component free culture medium (3% w / v NZ SOY soybean peptone BL4, 3% w / v YE251 and 0.0625% w / v cysteine) additionally containing amino acid groups (Groups 1 to 6). Analysis of enzymatic activity in zymography gel (1 to 6 represent the culture media containing the evaluated amino acid groups). The bars (Groups 1-6 and Control) in the graph refer to:
  • FIG. 10 Bacterial growth of C. histolyticum (ATCC 21000) and collagenolytic and gelatinolytic activity of the supernatant obtained from liquid culture of C. histolyticum in culture medium free of animal components (3% w / v of NZ SOY soybean peptone BL4, 3% w / v of YE 251 or YE 412 and 0.025% w / v cysteine) in Bioreactor (3 L scale). Analysis of enzymatic activity in zymography gel during cultivation.
  • FIG. 11 Bacterial growth of C. histolyticum (ATCC 21000) and collagenolytic and gelatinolytic activity of the supernatant obtained from C. histolyticum liquid culture in culture medium free of animal components (3% w / v of NZ SOY soybean peptone BL4, 3% w / v YE251 and 0.0625% w / v cysteine and 0.375% w / v arginine) in Biorreator (3 L scale). Analysis of enzymatic activity in zymography gel (B) and analysis of protein profile in SDS PAGE gel (C) throughout cultivation (results presented only after 7 hours of cultivation).
  • FIG. 12 Comparative analysis of growth and collagenolytic and gelatinolytic activity of supernatant obtained from C. histolyticum liquid culture (ATCC 21000) in media. free culture of animal components containing: 3% w / v NZ SOY BL4 soybean peptone, 3% w / v YE251 and 0.0625% w / v cysteine; or 3% w / v of NZ SOY BL4 soybean peptone, 3% w / v of YE251, 0.0255% w / v of cysteine and 0.375% w / v of arginine. Bioreactor Crops (3 L scale). Analyzes performed at the end of cultivation.
  • Figure 13 Recovery of proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity from the supernatant obtained from C. histolyticum liquid culture (ATCC 21000) in animal component free culture medium containing 3% w / v NZ SOY BL4,3 soybean peptone % w / v YE251, 0.0255% w / v cysteine and 0.375% w / v arginine.
  • Figure 14 Comparative analysis of growth (OD 600 nm) and collagenolytic and gelatinolytic activity (mU / mL) of supernatants obtained from C. histolyticum ATCC 21000 and T248 liquid culture in animal component free culture media containing: 3% w / v NZ SOY BL4 soybean peptone, 3% ⁇ / v YE251, 0.0255% w / v cysteine and 0.375% w / v arginine. Bioreactor Crops (3 L scale). Analyzes performed at the end of cultivation (14hr).
  • Proteases proteins, peptidases or proteolytic enzymes, EC 3.4
  • proteolytic enzymes EC 3.4
  • the present invention relates to Clostridium histolyticum type I and type II "collagenases" as described by Bond. D., van Wart, H.E., 1987, Biochemistry 23: 3077-3085 and Bond, M. D., van Wart, H.E., 1984, Biochemistry, 23: 3085.
  • Collagen proteins or “collagen” refer to the major structural proteins present in the skin and bone of most animals, important components of the extracellular matrix. Collagen molecules consist of 3 individual polypeptide chains (alpha chains) coiled together in a triple helix conformation, stabilized by hydrogen bridges.
  • gelatin refers to an irreversible protein form of partially hydrolyzed collagen.
  • Collagenolytic and gelatinolytic activity is the measure of protease activity in the degradation of collagen and / or gelatin molecules. In general, the collagenolytic and gelatinolytic activity of proteases is verified by the capacity and rate of collagen and gelatine degradation and represented in units / mL, units / L, units / mg or units / g of enzyme. Quantification of collagenolytic and gelatinolytic activity can be accomplished by viscometric, colorimetric (ninhydrin; Moore & Stein, JBC, 176, 367, 1948) or fluorimetric (fluorescein-labeled collagen and gelatin substrates; EnzChek®) assays. In the case of quantifications by colorimetric assay with ninhydrin, activity is measured by enzymatic hydrolysis of synthetic substrate (Carbobenzoxy-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala).
  • bacterial growth is defined as the division of a bacterial cell into two identical daughter cells during a process called binary fission. In this way, the doubling of the bacterial population occurs with each division. However, if the number of survivors exceeds the average, the bacterial population shows exponential growth. Measurement of exponential bacterial growth in a culture can be monitored by well-known methods, such as direct bacterial cell count (microscopy, flow cytometry), biomass value determination (milligrams, grams kilos or tons), colony count, optical density (measured by spectrophotometer, approximate wavelength of 600 nm), nutrient consumption, among others. Bacterial growth can be characterized by four different phases: “lag phase”, “exponential or log phase", “stationary phase” and “decline or death phase”.
  • bacteria adapt to growing conditions. It is a period in which cells are entering a state of maturity, yet unable to divide.
  • the "exponential or log phase” is a period characterized by cellular duplication. If growth is not limiting, cell duplication continues at a constant rate, so both cell number and growth rate double every time period. Exponential growth cannot continue indefinitely as the growth medium has nutritional restrictions and accumulation of often toxic metabolites produced by the dividing bacterial cells.
  • growth velocity decreases due to nutritional restrictions and accumulation of toxic metabolites. This phase characterizes the moment of exhaustion of resources present in the bacterial culture medium. In the "phase of decline or death,” bacteria deplete the nutrients still available in the culture medium and die.
  • pre-inoculum is defined as the suspension of microorganisms obtained from culturing a stock culture to be used for further growth of the microorganism for the production of an inoculum.
  • “Inoculum” is the name given to the suspension of microorganisms in suitable concentration, to be used for continued growth and / or fermentation of the microorganism on a larger scale (bigger volume of culture medium) than initial.
  • Anaerobic condition or “anaerobic condition” in this invention means maintaining a substantially oxygen free culture condition.
  • “Fresh culture medium” refers to any culture medium for growing or fermenting microorganisms that has not yet been used, ie has all of its components in its entirety.
  • Freezing medium is the name given to a composition capable of maintaining the viability of a micro-organism after freezing or lyophilization and storage and consequently its growth and fermentation capacity after the storage period.
  • Storage of the microorganism in the freezing medium may be performed at temperatures suitable for maintaining its freezing.
  • the Freezing medium is free of components of animal origin and additionally contains a cryopreservation agent.
  • cryopreservation agent is a substance capable of preserving the viability of the microorganism after freezing.
  • cryopreservation agents for microorganisms are sucrose, glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO), among others.
  • Wash or storage culture means an aliquot of the microorganism in freezing medium stored for a specified period.
  • Supernatant is the name used in this invention for the liquid phase of the culture medium (growth or fermentation medium) of a microorganism that is free of solid or particulate material.
  • the supernatant may be obtained by centrifugation and / or filtration methods known in the art.
  • Proteins are understood in the present invention to be mixtures of compounds formed by protein hydrolysis (comprising protein fragments, the composition of which depends on the protein source used for hydrolysis). Peptones are usually obtained by enzymatic or acid hydrolysis of natural products such as animal tissues, milk, plant tissues or microbial cultures.
  • “Free of components of animal origin” is the name given to the complete absence of any product or compound of animal origin.
  • “Animal” refers to mammals, birds, reptiles, fish, amphibians, arthropods and other animal species.
  • “Animal” excludes microorganisms such as bacteria and yeast.
  • “animal-free” may include proteases derived from bacteria of the genus Clostridium, such as C. histolyticum.
  • “Animal-free components” does not include animal derived proteins, such as: immunoglobulins; meat digestions, meat derivatives and milk products and their derivatives.
  • Component "ingredient”, “product” or “source” of "non-animal origin” in the context of the present invention are preferred sources of ingredients for the Clostridium histolyticum culture medium, including vegetables, microorganisms (such as yeast) and synthetic compounds.
  • Standard or traditional culture medium refers to culture media for the growth and / or fermentation of bacteria of the genus Clostridium, especially C. histolyticum, characterized in that they include ingredients of animal origin, including peptone proteas, tryptic meat digestions. or casein, casein peptone, among others.
  • animal peptones are considered essential ingredients of the culture medium, having a great influence on the production of proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity.
  • animal ingredients should be avoided throughout the process, eliminating the risk of interspecific horizontal transmission of pathogens and the induction of pathological immunological reactions against antigenic peptides. animal origin that may be present in the final product even after many purification steps.
  • the present invention describes an animal component-free culture medium for the growth and production of proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity by bacteria of the genus Clostridium.
  • a culture medium for C. histolyticum Preferably, a culture medium for C. histolyticum.
  • the culture medium described in the present invention stimulates the production of supernatant with higher collagenolytic and gelatinolytic activity than that obtained by culturing Clostridium histolyticum in standard culture medium (containing peptides of animal origin).
  • the present invention provides a culture medium for bacteria of the genus Clostridium, preferably C. histolyticum free of animal components, comprising water, non-animal peptone or derivatives thereof, yeast extract and the amino acids cysteine and arginine, or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the culture medium of the present invention may further comprise one or more additives selected from the group consisting of pH adjusting agent in the range of 7 to 8, reducing agent, inorganic salts, vitamins and mixtures thereof.
  • Optimal levels of bacterial growth and production of Proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity, specifically collagenase, are obtained for the culture medium described in this invention with pH ranging from 7.0 to 8.0.
  • the pH of the culture medium is about 7.0.
  • PH adjustment should be performed after sterilization procedure and prior to the commencement of cultivation of C. histolyticum using aqueous solutions of a prior art known pH-adjusting agent, eg ammonium sulfate, NaOH, acid sulfuric acid or nitric acid, not limited to these.
  • the additives which may be included in the culture medium free of animal components are selected from the known state of the art substances.
  • the culture medium according to the invention is characterized in that the reducing agent is selected from the group consisting of sodium thioglycolate, sodium bisulfite, iron salts, glucose and mixtures thereof.
  • the culture medium according to the invention is characterized in that the inorganic salts are selected from the group consisting of NaCl, KCl, Na 2 HP0 4 , NaH 2 P0 4 , KH 2 P0 4 , K 2 HP0, MgS0 4 , FeS0 4 , MnS0 4 , and mixtures thereof.
  • the culture medium according to the invention is characterized in that the vitamins are selected from the group consisting of biotin, pimelic acid, nicotinamide, calcium pantothenate, folic acid, thiamine nitrate, riboflavin, p-aminobenzoic acid (PABA). ) and mixtures thereof.
  • the vitamins are selected from the group consisting of biotin, pimelic acid, nicotinamide, calcium pantothenate, folic acid, thiamine nitrate, riboflavin, p-aminobenzoic acid (PABA). ) and mixtures thereof.
  • Non-animal peptones evaluated as ingredients of the Clostridium histolyticum culture medium are listed in Table 1.
  • Non-animal peptides can also be obtained from other suppliers, such as: Soy peptone® (Gibco), Bac-soytone® (Difco), SE50M® (DMV), 312® Soy Pepton (Biotecnica International, Mexico) , SE50MAF-UF® (DMV), Stedygro Soy® and Proyield Soy®.
  • the culture medium for animal component free Clostridium histolyticum is characterized in that the non-animal peptone is a vegetable peptone selected from the group consisting of soybean, cotton, wheat, sunflower, rice, peanut, bean, pea, potato, maize or mixtures thereof.
  • the vegetable peptone is a soybean, cotton, wheat or a mixture thereof.
  • the culture medium for Clostridium histolyticum free of animal components is characterized in that the vegetable peptone is from soybean.
  • the present invention reveals the surprising observation that peptides or other components of animal origin are not required in culture media for Clostridium histolyticum, and that the culture medium of the present invention, free of animal components, provides protease production with collagenolytic and gelatinolytic activity superior to that obtained in conventional culture media containing components of animal origin.
  • Plant origin peptones from different suppliers may be used as a component of the culture medium for animal-free Clostridium histolyticum according to the present invention.
  • the vegetable peptones are hydrolyzed and their preparation process is also free of components of animal origin.
  • the culture medium according to the invention is characterized in that the vegetable peptone is selected from the group consisting of Hy Soy®, Soytone®, Amisoy®, NZ Soy BL4®, NZ Soy BL7®, Hy Pep 1510®, Hy Pep 1511 ®, Hy Pep 5603®, Hy Pep 7504®, Stedygro Soy®, SE50M®, Proyield Soy®, SE50MAF-UF®, 312® Soy Pepton, and Hy Pep 4601® and mixtures thereof.
  • the vegetable peptone is selected from the group consisting of Hy Soy®, Soytone®, Amisoy®, NZ Soy BL4®, NZ Soy BL7®, Hy Pep 1510®, Hy Pep 1511 ®, Hy Pep 5603®, Hy Pep 7504®, Stedygro Soy®, SE50M®, Proyield Soy®, SE50MAF-UF®, 312® Soy Pepton, and Hy
  • the culture medium is characterized in that the vegetable peptone is selected from the group consisting of Hy Pep 4601®, NZ soy BL4®, HyPep 1511® and Hy Pep 7504®. More preferably, the culture medium according to the invention is characterized in that the vegetable peptone is NZ soy BL4®.
  • the culture medium developed for cultivating Clostridium histolitycum and described in the present invention has yeast extract as a key ingredient. Commercial suppliers evaluated for this ingredient are listed in Table 2.
  • Hy-Yeast 412® Sheffield TM Bioscience (Kerry, USA)
  • Hy-Yeast 503® Sheffield TM Bioscience (Kerry, USA)
  • the culture medium described in the present invention is characterized in that the yeast extract is selected from the group consisting of Bacto YE®, Hy-Pep YE®, Hy-Yeast 412®, Hy-Yeast 413®, Hy-Yeast 502 ®, Hy-Yeast 501®, Hy-Yeast 503® Prodex 710 SD®, Prodex NS70SD®, Pronal 5001®, YE 11®, YE 151®, YE 70161®, YE Y4250®, Synth®, YE 207®, YE 5114® and mixtures thereof. More preferably, the culture medium is characterized in that the yeast extract is YE 251®.
  • arginine is L-arginine and cysteine is L-cysteine or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the culture medium according to the invention is characterized in that the pharmaceutically acceptable salts are cysteine hydrochloride and arginine hydrochloride.
  • the culture medium described in this invention is characterized in that the concentration of non-animal peptone is 0.5% to 5% w / v, the concentration of yeast extract is 0.5% to 5% w / v, the concentration of cysteine, or pharmaceutically acceptable salts thereof, is from 0.01% to 0.1% w / v and the concentration of arginine, or pharmaceutically acceptable salts thereof, from 0.1% to 1% w / v v.
  • the culture medium is characterized in that the non-animal peptone concentration is 1% to 4% w / v, the yeast extract concentration is 1% to 4% w / v, the cysteine concentration , or their salts pharmaceutically acceptable salts be from 0.03% to 0.07% w / v of the arginine concentration or pharmaceutically acceptable salts thereof from 0.25 to 0.7% w / v. More preferably the culture medium is characterized in that the concentration of non-animal peptone is 3% w / v, the concentration of yeast extract is 3% w / v, the concentration of cysteine, or pharmaceutically acceptable salts thereof. be 0.625% w / v and the concentration of arginine or pharmaceutically acceptable salts thereof is 0.375% w / v.
  • the culture medium must be sterilized prior to inoculation of C. histolyticum. Sterilization may be performed by methods known to one of ordinary skill in the art, such as autoclaving wet heat treatment or filtration. Accordingly, the culture medium described in this invention is characterized by being sterile.
  • the animal free component culture medium described in this invention is characterized by being liquid.
  • the culture medium according to the present invention is also characterized in that it is used in a process for producing a Clostridium histolyticum liquid culture supernatant containing one or more proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity.
  • Proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity are secreted into the liquid phase of the culture medium for C. histolyticum, free of animal components of the present invention.
  • Collagenases are some of the secreted proteases, being the main proteinaceous components of the supernatant produced by cultivating C. histolyticum.
  • a process for producing a Clostridium histolyticum liquid culture supernatant containing one or more proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity characterized by culturing C. histolyticum in a free culture medium. of components of animal origin as disclosed in the present invention.
  • step (b) culturing an aliquot of Clostridium histolyticum stock culture in the culture medium from step (a) under anaerobic conditions at about 37 ° C to the stationary phase of bacterial growth to obtain an inoculum;
  • step (c) adding to the culture medium of step (c) an inoculum volume of step (b) equal to or less than 10% of the final medium volume defined in (c).
  • steps (b) and (e) of the above described process can be established by various techniques, not limited to those chosen to exemplify the present invention. Methods for maintaining anaerobic conditions for growth of microorganisms are well known to one of ordinary skill in the art. For example, the anaerobiosis of steps (b) and (e) may be maintained by adding 2 to the culture medium throughout the cultivation process.
  • the culture medium described in step (a) of the process for producing a Clostridium histolyticum liquid culture supernatant is used for the expansion of the number of microorganisms from a stock culture stored under conditions suitable for maintaining cell viability.
  • the stock culture is maintained at -80 ° C in culture medium free of animal components containing one or more cryopreservation agents.
  • the ideal is that the cultivation should be done from a stock culture characterized by containing free culture of animal components.
  • the stored stock culture is produced from animal component free culture medium comprising vegetable peptides, preferably soy peptone or derivatives thereof, yeast extract, cysteine, pH between 6.5 and 8.0 and additionally an agent. cryopreservation.
  • Cryopreservation agents for microorganisms, specifically bacteria are widely known to one of ordinary skill in the art and may be selected, without limitation, from a group consisting of glycerol, sucrose, dimethyl sulfoxide and glucose.
  • the amount of cryopreservation agent to be added to the stock culture medium varies according to bacterial lineage and should be adjusted prior to stock microorganism bank ("master cell bank” and "work cell bank”).
  • the objective of the growth phase is to increase the amount of available and viable microorganisms for the production of proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity, which occurs during step (e). Additionally, the growth phase allows dormant microorganisms from the stock culture to actively grow and secrete proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity in step (e).
  • the sterile, animal-free culture medium of step (a) of the process described above is characterized in that it comprises water, plant peptone, yeast extract and cistern.
  • the sterile, animal-free culture medium of step (a) is characterized in that it comprises water of 0.5 to 5% w / v of vegetable peptone, of 0.5 to 5% w / v of yeast extract, from 0.01 to 0.1% w / v cysteine or its pharmaceutically acceptable salts and pH between 6.5 and 8.0.
  • the culture medium of step (a) is characterized in that it comprises water, 3% w / v vegetable peptone, 3% w / v yeast extract, 0.0625% w / v cysteine or pharmaceutically acceptable salts thereof. and pH between 6.5 and 8.0.
  • Example 1 and 2 show that there is no need for arginine to be added to the animal component free culture medium for growth of C. histolyticum to be superior to that shown in standard culture medium (containing animal origin peptone). ).
  • standard culture medium containing animal origin peptone.
  • the preferred culture medium for step (a) has been defined only with its essential components.
  • results Similar to those shown for the culture medium of step (a) are observed in culture medium free of animal components further comprising arginine and other additives (inorganic salts, vitamins and reducing agents) as defined hereinbefore for the culture medium. for C. histolyticum.
  • the amino acid arginine is essential for the surprising results of this invention with respect to the production of proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity by C. histolyticum (step (e)).
  • the production of proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity during cultivation of C. histolyticum in animal component free culture medium according to the present invention comprising the amino acids cysteine and arginine is superior to the production observed with cultivation of C. histolyticum. in culture medium containing only the amino acid cysteine and is superior to that observed for cultures of this bacterial species in standard culture medium (containing animal peptone).
  • the process for producing a Clostridium histolyticum liquid culture supernatant containing one or more proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity is characterized in that the sterile culture medium free of animal components from step (c) comprises water. , plant peptone, yeast extract, cysteine and arginine, in the concentration ranges defined in the present invention, and pH between 7.0 and 8.0.
  • the process for producing a Clostridium histolyticum liquid culture supernatant containing one or more proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity is characterized in that the sterile, component-free culture medium of step (c) comprises water, 3% w / v vegetable peptone, 3% w / v yeast extract, 0.025% w / v cysteine, or pharmaceutically acceptable salts thereof, 0.375% w / v arginine, or pharmaceutically acceptable salts thereof, and pH between 7.0 and 8.0.
  • Bacterial growth can be monitored by measuring the optical density of the culture medium during the above described process (steps (b) and (e)) in spectrophotometer (reading at 600 nm) according to methods well known to one skilled in the art.
  • step (b) comprises at least the steps: 1) cultivating the stock culture in the culture medium of step (a) in proportion 0, 1: 1 v / v for about 16 hours to obtain a pre-inoculum; 2) add to the pre-inoculum a volume of medium equal to or greater than twice the volume of the culture medium from step (1) and maintain the culture for about 12 hours to obtain an inoculum.
  • step (b) It is critical that growth during step (b) does not cause cell lysis prior to its inoculation into the culture medium of step (c), thereby maintaining inoculum viability.
  • the process for producing a supernatant from a liquid Clostridium histolyticum culture can be characterized by comprising only steps (c) to (f), starting from the culture culture of C. histolyticum directly in the medium defined in step (c) without the need for inoculum production.
  • the process for producing a supernatant from a Clostridium histolyticum liquid culture is characterized in that the cultivation of C. histolyticum during step (e) involves the addition of one or more known pH-adjusting agents sufficient to maintain the pH of the culture medium at 6.5 to 8.0.
  • the separation of cellular matter or other particulate matter from the liquid phase of the culture medium can be accomplished by different filtration, centrifugation techniques. or chromatographic purification, known in the art, not limited to tangential filtration, centrifugation, gel filtration chromatography, among others.
  • step (f) is performed by filtration or centrifugation procedures or both.
  • the process for producing a Clostridium histolyticum liquid culture supernatant is characterized by containing one or more additional steps for purifying one or more proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity present in the supernatant obtained in step (f).
  • Purification may be accomplished by different filtration, chromatographic purification or salt precipitation methods, not limited to ammonium sulfate precipitation; tangential filtration; ion exchange chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, among others, individually or in combination.
  • the C. histolyticum liquid culture supernatant is a complex mixture comprising not only proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity, especially collagenases, but also other proteins, bacterial metabolites, components of the culture, among other substances.
  • a further aspect of the present invention relates to the supernatant of a Clostridium histolyticum liquid culture containing one or more proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity characterized by being produced by the process of the present invention as described above.
  • the supernatant according to the present invention is characterized in that it comprises 20 to 90% of collagenases after purification.
  • the supernatant according to the invention may be directly purified to obtain one or more proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity.
  • the supernatant may be stored in frozen or lyophilized form without, however, losing its collagenolytic and gelatinolytic activity.
  • the invention discloses the use of a C. histolyticum liquid culture supernatant obtained from the process described in the present invention characterized in that it is in the preparation of a medicament for the treatment of diseases that benefit from collagenolytic and gelatinolytic activity. of C. histolyticum proteases.
  • the invention describes the use of the supernatant of a C. histolyticum liquid culture characterized in that it is in the preparation of a medicament for the treatment of collagen-mediated diseases or fibrous tissue accumulation.
  • the invention describes the use of the supernatant of a C. histolyticum liquid culture characterized in that it is in the preparation of a medicament for the treatment of necrotic tissues and / or healing processes.
  • the use of the supernatant of a C. histolyticum liquid culture is characterized by preparation of a drug for enzymatic debridement.
  • Burns and dermal lesions of a diverse nature are examples of situations where treatment of necrotic tissues is required.
  • the present invention also discloses a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising as active ingredient the supernatant of a C. histolyticum liquid culture obtained from the process described in this invention and pharmaceutically acceptable excipients.
  • the pharmaceutical composition may include one or more pharmaceutically acceptable excipients, buffers, carriers, stabilizers, preservatives and thickeners.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is characterized for administration to an animal or human for therapeutic or cosmetic purposes.
  • compositions comprising as the active ingredient the supernatant of a C. histolyticum liquid culture may be administered by the oral, sublingual, nasal, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intraarticular, subcutaneous, transdermal, non-transdermal routes. being limited to these.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is characterized in that it is formulated for administration by subcutaneous, dermal and transdermal routes.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is characterized for topical use and comprises from 0.2 U to 1.8 U collagenase per gram of composition (ninhydrin colorimetric method).
  • compositions of the present invention comprise as active ingredient the supernatant of a C. histolyticum liquid culture, pharmaceutically acceptable excipients or carriers, in the form of cream or ointment formulations, lyophilisates or aqueous solutions.
  • excipients, carriers or stabilizers exhibit no toxicity to the recipient organism at the dosages and concentrations employed and may include buffers such as phosphate, citrate and other organic acids; antioxidants such as ascorbic acid and methionine; preservatives such as octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride, hexamethonium chloride, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, phenol, butyl alcohol, benzyl alcohol, alkyl parabens such as methyl and propylparaben, catechol, resorcinol, cyclohexanol, 3-pentanol and m-cresol; amino acids, monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates such as glucose, mannose, sucrose, mannitol or sorbitol; polysaccharides (such as the ficoll ® hydrophilic polysaccharide), polymeric excipients such as polyvinylpyr
  • Such pharmaceutical compositions find application in the treatment of diseases that benefit from the activity histolyticum proteases collagenolytic and gelatinolytic agents in the treatment of pathological conditions in the human body associated with excessive collagen deposition and erratic accumulation of collagen-rich fibrous tissue, in the treatment of necrotic tissues and in healing processes and in the treatment of debridement enzymatic.
  • the culture supernatant of C. histolyticum, as well as collagenolytic and gelatinolytic proteases, in particular collagenases, produced according to the process described in the present invention do not exhibit toxicity, a result observed by cytotoxicity and dermal toxicity study.
  • Examples 1-4 demonstrate the preparation of animal-free culture media as described in the present invention, and the growth and production of proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity by C. histolyticum.
  • the results presented prove the efficiency of the culture medium free of animal components in the growth of C. histolyticum compared to the standard culture medium, even without the amino acid arginine in its composition ( Figures 1 and 2).
  • the importance of yeast extract in the composition of the culture medium free of animal components is shown in Figure 3 and the preferred pH range for C. histolyticum cultivation is exemplified in Figure 4.
  • Culture medium supplementation free of animal components with vitamins and inorganic salts does not affect the growth and production of proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity by C.
  • these examples prove the quality of the supernatant obtained by culturing in a culture medium free of components of animal origin, which is characterized in that it comprises mostly high molecular weight proteases related to C. histolyticum collagenases, whose enzymatic activity also is demonstrated.
  • Example 5 presents the results of cultivation in Biorreator (3L) using the animal component free culture medium described in the present invention.
  • Figure 10 presents the results of culture in animal-free culture medium without arginine, demonstrating the lower protease production when compared to culture performed in animal-free culture medium described in the invention containing arginine ( Figure 11 ).
  • Figure 12 presents a comparative graph of growth and enzymatic production parameters between the culture media free of animal components evaluated (without and with arginine).
  • Example 6 reports a process for recovering the collagenolytic and gelatinolytic activity proteases present in the culture supernatant of C. histolyticum in an animal component free culture medium described in the present invention. Highlights supernatant quality obtained without precipitates, facilitating their manipulation. The results of the recovery of collagenolytic enzymes by ammonium sulfate precipitation followed by dialysis and lyophilization are presented ( Figure 13).
  • Example 7 presents a pharmaceutical composition for topical use comprising the C. histolyticum liquid culture supernatant produced in culture medium free of animal components.
  • the stability of the compositions is also described, proving the quality of the product obtained from the described fermentative processes and further defining an advantageous feature of the present invention.
  • Example 8 describes repeated dose dermal toxicity assays (21 days) in rats (male and female) demonstrating the absence of toxicity of pharmaceutical compositions prepared with collagenolytic enzymes obtained by lyophilized from C. histolyticum liquid culture supernatant produced in free culture of components of animal origin according to the invention and obtained after tangential filtration procedure.
  • the lack of toxicity of the pharmaceutical compositions again highlights the quality of the enzymatic composition of the C. histolitycum culture supernatant in media free of animal components according to the invention ( Figures 14 - 17).
  • Example 9 shows the results of culturing C. histolyticum ATCC21000 and T248 strains in Bioreactor (3L) using the animal-free component culture medium described in the present invention.
  • Figure 14 presents the results of this culture, demonstrating an equivalent production of proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity by both strains evaluated.
  • Example 10 presents the results of the Cytotoxicity to collagenolytic and gelatinolytic proteases obtained from the C. histolyticum liquid culture supernatant (ATCC 21000 and T248) in culture media free of animal components.
  • C. histolyticum strains can be obtained from a variety of sources, including American Type of Culture Collections (ATCC). Several strains of Clostridium histolyticum have already been used for collagenase purposes, so the present invention is not limited solely to the strain used for demonstrating the invention through the examples below.
  • ATCC American Type of Culture Collections
  • the Clostridium histolyticum ATCC 21000 strain was used (non-mobile wild-type, ground-isolated non-mobile mutant [ATCC 21000 TM). This strain was chosen because it is characterized as a good producer of collagenolytic and gelatinolytic enzymes.
  • the culture medium indicated by the ATCC for its cultivation includes peptides of animal origin, inorganic salts and liver digestion (culture medium Reinforced Clostridial Medium - RCM - Oxoid CM149, pH 8.0; anaerobic culture).
  • Examples 9 and 10 show results of cultivation using the animal component free culture medium described in the present invention for the Clostridium histolyticum strain T248, isolated from a private soil surface sample (Espirito Santo do Pinhal / SP, Brazil).
  • the T248 strain was characterized by morphological (gram positive, sporulated bacillus), biochemistry (facultative anaerobic, which degrades gelatins) and genetically (tpi gene and 16S, 23S and 16S intergenic ribosomal regions and
  • Example 1 Preparation of standard medium and lyre culture medium of animal components for growth of Clostrldinm hlstolyticvan ..
  • Standard or traditional culture medium was prepared using the following ingredients for each liter of medium: Protein peptone n. 3 or casein peptone (20 g); Yeast extract (5 g); glucose (5 g); sodium thioglycolate (250 mg) at pH 7.0 (adjusted with 5 M NaOH).
  • Animal-free growth medium was prepared using the following ingredients for each liter of medium: plant-derived peptone (10-40 g); yeast extract (0-30 g); cysteine hydrochloride (0.625 g) at pH 7.0 (adjusted with 5M NaOH).
  • the culture medium was autoclaved at 121 ° C for 20 minutes.
  • a glucose solution was prepared separately, autoclaved (121 ° C for 20 minutes) and added to the standard culture medium only at the time of cultivation.
  • Example 2 Growth of C. histolyticum in Lyre culture medium from components of animal origin and in standard medium as defined in Example 1.
  • the frozen stock culture of Clostridium histolyticum 100 ⁇ L was suspended in 1 mL of the standard medium or 1 mL of the animal component free culture medium (described in Example 1), separately in two tubes that were completed with the culture media for the final volume of 10 mL (culture called inoculum). Tubes containing the inoculum were incubated at 37 ° C in anaerobic for approximately 16 hours.
  • the 3 mL of the inoculum was incubated in 250 mL vials containing 150 mL of the respective C. histolyticum culture media.
  • the inoculated culture was then maintained at 37 ° C for about 12 - 14 hours in anaerobiosis (anaerobiosis maintained by addition N2). All analyzes presented in Example 2 were performed at the end of 12-14 hours of this cultivation step.
  • Bacterial growth was determined by optical density - OD - by a spectrophotometer at 600 nm.
  • Figure 1 shows OD (optical density) results of C. histolyticum (ATCC 21000) cultures in animal component free culture medium comprising vegetable peptone (3% w / v) and yeast extract (3% w / v) from different suppliers. Evaluated Suppliers Demonstrate Bacterial Growth Results similar. Figure 1 also demonstrates a significant increase in OD observed when culturing in animal free component growth medium according to the present invention compared to bacterial growth obtained in standard culture medium with animal origin peptones ( Vetec + Casein). All animal-free culture media represented in Figure 1 contain 0.625 g / l cysteine hydrochloride and pH approximately 7.0.
  • Figure 2 shows the result of C. histolyticum growth when cultivation is performed in culture medium free of animal components considering variations in the amounts of vegetable peptone (Hy-pep 1511; 1-3% w / v) and extract. Yeast (YE 251; 0-3% w / v). All animal-free culture media represented in Figure 2 contain 0.625 g / l cysteine hydrochloride and pH approximately 7.0. There is some variation regarding C. histolyticum growth among these cultures in culture medium free of animal components, however, the OD (optical density) values achieved are always higher than those obtained by C. histolyticum culture. in standard culture medium (with animal peptone).
  • yeast extract in the composition of animal component-free culture medium is shown in Figure 3 (animal component-free culture media containing 0, 1, 2 or 3% yeast extract) .
  • the absence of yeast extract in the culture medium composition inhibits both bacterial growth and protease production with collagenolytic and gelatinolytic activity, even considering an increase in the amount of vegetable peptone in its composition. (evaluated concentrations of peptone of vegetal origin: 3 and 4%).
  • All animal-free culture media represented in Figure 3 contain 0.625 g / l cysteine hydrochloride and pH approximately 7.0. Evaluation of collagenolytic and gelatinolytic activity was performed as described in example 4.
  • Figure 4 represents the bacterial growth results obtained by cultivating C. histolyticum in growth medium with pH ranging from 6.5 to 8.5. Within the evaluated pH range, only the most basic pH (pH 8.5) negatively influenced bacterial growth.
  • Example 3 Preparation of Clostrldlxxm histolyticum liyre culture medium from animal components and standard culture medium for the production of protease-containing supernatants with collagenolytic and gelatinolytic activity.
  • the animal component free culture medium of the present invention was prepared using the following ingredients for each liter of medium: plant origin peptone (30 g); yeast extract (30 g); cysteine hydrochloride (0.625 g), arginine hydrochloride (3.75 g) and pH 7 (adjusted with NaOH 5).
  • Vegetable peptones and yeast extracts suitable for composing the culture medium free of animal components are not limited to those used in the examples of the present invention. Plant peptides and yeast extracts that demonstrate good water solubility can be used for the preparation of C. histolyticum culture medium. according to the present invention, provided that they are free of components of animal origin.
  • the medium was autoclaved at 121 ° C for 20 minutes.
  • Example 4 Production of supernatant from a Clostrldium histolyticvaa liquid culture containing one or more proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity in free culture medium of components of animal origin defined in Example 3 and standard medium defined in Example 1.
  • Example 3 After 12-14 hours of cultivation of C. histolyticum in the animal component free culture media described in Example 3, the bacterial cells were centrifuged and the quantification of collagenolytic and gelatinolytic activity of the proteases contained in the supernatant. Eight milliliters (8 mL) of the bacterial cultures were centrifuged at 5000 rpm for 30 minutes at 4 ° C to remove insoluble material (cells, cell debris, precipitates, among others).
  • the protein profile of the supernatant obtained was evaluated by SDS PAGE 7.5% gel electrophoresis under non-reducing conditions (silver nitrate staining). Enzyme activity profile (non-specific) was evaluated on non-reducing SDS-PAGE gel containing 10% gelatin and stained with Coomassie blue (zymography). Both analysis methodologies are widely known to one skilled in the art.
  • the quantification of collagenolytic and gelatinolytic activity of the obtained supernatants was performed by EnzChek® Gelatinase / Collagenase Assay Kit reagent (Molecular Probes, Invitrogen). Assays were performed according to manufacturer's instructions on microplates using gelatin and / or fluorescein-conjugated collagen as substrate.
  • Readings were taken on a fluorescence reader. Briefly, 100 ⁇ l of the culture supernatant, after centrifugation, was mixed with the diluted substrate in the incubation buffer prepared according to the manufacturer's instructions. Samples were incubated at 37 ° C for 15 minutes and read at 515 nm in a microplate fluorescence reader. As a negative control, the entire incubation procedure with sterile culture medium was performed in place of the culture supernatant. As a positive control, the collagenase reagent supplied by the kit was prepared according to the manufacturer's instructions.
  • Bacterial growth was determined by optical density - OD - through a spectrophotometer at 600 nm.
  • Figure 9 shows the results of collagenolytic and gelatinolytic activity and OD (600 nm) observed in C. histolyticum culture with medium 3 (cysteine-free animal components and amino acid groups).
  • medium 3 medium free of animal components and only the amino acid cysteine.
  • no other amino acids, or amino acid combinations, added to the culture medium were able to increase the collagenolytic and gelatinolytic activity observed in the C. histolyticum liquid culture supernatant as surprisingly provided by the amino acid arginine ( Figure 8).
  • Example 5 Production of supernatant from a Clostridium histolyticvan liquid culture containing proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity in free culture medium of animal components - cultured in Bioreactors.
  • the frozen stock culture of Clostridium histolyticum (100 ⁇ ) was suspended in 1 mL of the animal component-free culture medium (medium 1, defined below), and then added culture medium to the final 10 mL volume ( pre-inoculum cultivation). Tubes containing the pre-inoculum were incubated at 37 ° C in anaerobiosis for approximately 16 hours. After this time, the 3 mL of the pre-inoculum was incubated in 250 mL flasks containing 150 mL of the respective C. histolyticum culture media. The culture was then maintained at 37 ° C for about 12 - 14 hours in anaerobiosis (anaerobiosis maintained by addition N 2; so-called inoculum culture).
  • C. histolyticum ATCC 21000
  • Agar plates Animal-free medium comprising soy peptone, yeast extract and agar.
  • High growth colonies were isolated and inoculated into cell bank medium containing the same ingredients as the solid medium except agar.
  • the C. histolyticum culture grown in this medium was then combined with glycerol (10% sterile), fractionated in cryovials and frozen at -80 ° C for later use. This freezing medium can be used to store the culture for at least 1 year without loss of cell viability.
  • Bacterial growth was monitored by measuring optical density (600 nm) performed every 2 hours of spectrophotometer cultivation.
  • Example 4 Obtaining C. histolyticum liquid culture supernatant and recovery of collagenolytic and gelatinolytic proteases: Obtaining the liquid culture supernatant and recovery of collagenolytic and gelatinolytic enzymes were performed as described in Example 4 (centrifugation to obtain the supernatant). and by saline precipitation, dialysis and lyophilization according to the detailed description given in Example 6 or tangential filtration (5KDa pore size) followed by lyophilization. Collagenolytic and gelatinolytic activity of the supernatant was monitored by fluorimetric enzyme activity assays described in detail in Example 4 (results shown in Figures 10 and 11).
  • Figure 10 presents the results (OD, enzymatic activity and zymography) of two fermentative processes performed with culture medium 1 (medium 1).
  • Figure 11 presents the results (OD, enzymatic activity, SDS-Page gel / silver nitrate and zymography) of a fermentation process performed with culture medium 6 (medium 6).
  • the analysis of Figure 11 shows a bacterial growth curve similar to that obtained in fermentations in bioreactors with medium 1 (containing only the amino acid cysteine, Figure 10), however, and surprisingly, a significantly higher collagenolytic and gelatinolytic activity is observed.
  • arginine to the culture medium free of animal components to increase the production of collagenolytic and gelatinolytic enzymes in C. histolyticum cultures (activity in U / mL).
  • Figure 12 shows the comparison of collagenolytic and gelatinolytic activity (mU / mL) and optical density (OD 600 nm) between medium 1 cultures (containing only the amino acid cysteine) and medium 6 cultures (containing the amino acids cysteine and arginine ), clearly demonstrating an average increase of about 30% of the collagenolytic and gelatinolytic activity of the C. histolyticum culture supernatant in medium containing cysteine and arginine.
  • Example 6 Recovery of proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity obtained from the C. histolyticum liquid culture supernatant in free culture medium of components of animal origin.
  • the supernatant containing the proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity was obtained by culturing C. histolyticum as described in Example 5, using medium 6 (containing the amino acids cysteine and arginine) as step 3 medium.
  • Example 7 Pharmaceutical composition for topical use containing C. histolyticvan collagenases - Stability Assays
  • composition used to exemplify the present invention was a dermatological ointment comprising the ingredients set forth below:
  • Specific collagenase activity was determined by enzymatic hydrolysis of synthetic substrate (Carbobenzoxy-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala) and quantified by ninhydrin colorimetric assay.
  • An enzyme unit is defined as being responsible for releasing 1 mol of Gly-Pro-Ala from the Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala hexapeptide in 1 minute at 37 ° C.
  • the pharmaceutical composition was prepared by dispersing the lyophilisate (amount equivalent to specific collagenase activity equal to 0.2 U, 0.6 U and 1.8 U / g formulation) obtained according to example 5 (lyophilized supernatant). obtained in culture with medium 6 and after tangential filtration procedure), in the other excipients and homogenization.
  • the 0.6U / g dose of composition is considered to be the appropriate therapeutic dose for human use.
  • the stability study was carried out with the formulation
  • compositions used to exemplify the present invention are the same as those used for performing the stability tests described above (Example 7).
  • a repeated dose dermal toxicity test (21 days) was performed on scarified rat skin with the compositions prepared according to Example 7 (active ingredient: lyophilized with specific collagenase activity of 0.2U / g, 0.6U / gel, 8U / g).
  • active ingredient lyophilized with specific collagenase activity of 0.2U / g, 0.6U / gel, 8U / g.
  • a placebo composition prepared according to Example 7 without, however, adding the active ingredient was used.
  • the OECD Guideline 410-based trial consisted of surgically provoking a previously anesthetized rat into a wound using a 4mm sterile punch in the center of the dorsal midline on the first day of administration (dorsal hair removed with a hair removal device).
  • the topical application of the composition (0.425g; compositions containing 0.2U, 0.6U and 1.8U collagenase per gram) in an area equivalent to 30-40cm2 was performed with spatula aid, in and around the wound, once daily for 21 days to three groups of Rattus norvegicus (albino variety, istar strain) by sex (10 rats per group, 5 males and 5 females, Nuliparas and non-pregnant).
  • the application site was preserved by gauze dressing and a non-irritating tape for approximately 24 hours after administration.
  • a control group (10 rats, 5 males and 5 females) received placebo only (Placebo Collagenase). Additionally, two satellite groups were constituted, one evaluated with the highest dose of the test composition (10 rats, 5 males and 5 females) and another with the control composition (10 rats, 5 males and 5 females), treated for 21 days and followed for a further 14 days after the end of the exposure period, in order to verify reversibility, persistence or the late effects of exposure to the test substance.
  • Body weight (Table 5) and water and feed intake were recorded weekly.
  • blood samples were collected for hematological analyzes (hematocrit, hemoglobin concentration, erythrocyte count, calculation of hematimetric indices, differential and total leukocytes, prothrombin time, activated partial thromboplastin time and platelet count - Table 6 ) and biochemical (sodium, potassium, calcium, phosphorus, triglycerides, albumin, creatinine, urea, total proteins, alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase and cholesterol, glycemia - Table 7). Then the animals were euthanized and necropsied (Table 8). Tissue samples were referred for histopathological analysis.
  • Table 8 Analysis of body organ weights (male and female). Experimental groups for repeated dose (21 days) dermal toxicity of topical composition containing purified and lyophilized supernatant derived from C. histolyticum culture (ATCC 21000) in soybean peptone-free animal component culture medium (30 g / L), Yeast Extract (30 g / L), Cysteine Hydrochloride (0.625 g / L) and Arginine Hydrochloride (3.75 g / L). Control composition: with excipients only.
  • Clostridlvaa hxstolyticvau (ATCC 21000 and T248 strains) containing proteases with collagenolytic activity and optical gelatinol in culture medium of animal components - cultivation in Bioreactors.
  • Bioreactor cultures to obtain the evaluated supernatants and the methods of analysis used were performed as described previously in Example 5, using as medium of step 3 medium 6 (containing the amino acids cistern and arginine).
  • Figure 14 shows the comparison of collagenolytic and gelatinolytic activity (mU / mL) and optical density (OD 600 nm) between Clostridium histolyticum ATCC 21000 and T248 strains. There is no significant difference (Statistical analysis: Mann Whitney; p ⁇ 0.05) on collagenolytic and gelatinolytic activity between C. histolyticum culture supernatants of both strains evaluated.
  • Example 10 Cytotoxicity assay of proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity obtained from the supernatant of liquid culture of C. hxstolytxcvaa (ATCC 21000 and T248) in free culture medium of components of animal origin.
  • Proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity were obtained as described in Example 6 (lyophilized samples).
  • the cells used in the cytotoxicity assays were fibroblastic type, from the strain established in culture V79 clone M-8, derived from Chinese Hamster lung (Cricetulus griseus). Fibroblasts were maintained in continuous culture in 25cm2 bottles (TPP, Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland) until they reached confluence density. Cultivation was performed in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (Nutricell), 100 IU / mL penicillin, and 10C ⁇ g / mL streptomycin sulfate (Nutricell) in a 37 ° C greenhouse under a humid atmosphere containing 5% CO2 (Melo et al., 2000, 2001).
  • Cytotoxicity assays were performed in 96-well plates (IWAKI, Asahi Techno Glass, Co., Funabasi, Japan) with 3 x 10 4 cells / mL in each well (100 L / well) followed by incubation at 37 ° C. for 48 hours. Initial cell viability was verified by the Trypan Blue exclusion test. Media was removed after 48 hours and cultures were exposed for 24 hours to supplemented DMEM medium containing different concentrations (up to a maximum concentration of 1 mg / mL) of the freeze-dried samples described below:
  • DNA incorporation of neutral red (VN) and reduction of MTT (MTT).
  • Proteases with collagenolytic and gelatinolytic activity obtained from the cultivation of C. histolyticum according to the present invention do not present cytotoxicity, a result observed from the results presented in Table 9.

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Abstract

A presente invenção refere-se a meio de cultura e processo para a produção de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica por bactérias do gênero Clostridium. Particularmente, a presente invenção refere-se a meio de cultura para C. histolyticum, livre de componentes de origem animal caracterizado por compreender peptonas de origem não animal, preferivelmente peptonas vegetais, extrato de levedura e os aminoácidos cisteína e arginina. A presente invenção também se refere a processo para a produção de um sobrenadante de uma cultura líquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica e composição farmacêutica compreendendo como ingrediente ativo o sobrenadante ou o sobrenadante purificado obtido.

Description

MEIO DE CULTURA PARA BACTÉRIAS DO GÉNERO CLOSTRIDITJM LIVRE DE COMPONENTES DE ORIGEM ANIMAL E PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE SOBRENADANTE CONTENDO UMA OU MAIS PROTEASES COM ATIVIDADE COLAGENOLITICA E GELATINOLITICA. Campo de aplicação
A presente invenção refere-se ao campo da microbiologia e biotecnologia. Particularmente, a presente invenção refere-se a meio de cultura para bactérias do género Clostridi m, livre de componentes de origem animal, e processo para a produção de sobrenadante contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica .
Antecedentes da invenção
A colagenase (clostridiopeptidase A, EC 3.4.24.3) é uma enzima proteolitica capaz de hidrolisar proteínas do grupo colágeno, nativo e desnaturado (gelatinas) . Nenhuma outra enzima é capaz de clivar o colágeno nativo, devido a sua composição particular de aminoácidos (presença de um grande número de iminoácidos, representados pelo tripeptídeo Gly- Pro-X, onde o resíduo X é, frequentemente, prolina ou hidroxiprolina ) , e a sua macroestrutura singular (estrutura complexa de tripla hélice) .
A colagenase, isolada ou como principal componente de composições contendo outras enzimas proteolíticas , tem sido amplamente utilizada no tratamento de várias doenças e condições patológicas do corpo humano associadas ao depósito excessivo de colágeno e ao acúmulo errático de tecido fibroso rico em colágeno, desde a década de 70. Essas doenças e condições são denominadas doenças mediadas por colágeno, sendo a aplicação local de composições contendo colagenase uma das possibilidades de tratamento alternativo à intervenção cirúrgica. O debridamento de tecidos necrosados (queimaduras, lesões dérmicas, etc.) também é uma das condições na qual o uso de composições contendo colagenase é aprovado pelos órgãos de vigilância sanitária, demonstrando resultados surpreendentes no tratamento de processos de cicatrização.
Algumas aplicações terapêuticas de composições contendo colagenase são: tratamento de queimaduras, exercendo um efeito benéfico concomitante sobre a regeneração tecidual; debridamento enzimático de feridas e tratamento de ferimentos infectados e úlceras (de pele e úlceras de decúbito) ; tratamento de hérnias de disco intervertebral; lise seletiva de fibras de colágeno do corpo vitreo do olho; tratamento de doença de Dupuytren; tratamento de doença de Peyronie; tratamento para capsulite adesiva; tratamento de epicondilite lateral, síndrome do túnel cárpico e fascite plantar; aumento da regeneração de nervos danificados; sendo também muito utilizada por especialidades médicas como cirurgia plástica e em diversos procedimentos dermatológicos e estéticos, por exemplo, no tratamento de celulite e cicatrizes de mamíferos, como acnes, queloides e outras cicatrizes hipertróficas através de injeção intralesional de colagenase purificada.
Outros estudos apontam o uso de composições contendo colagenase em artrite reumatóide, metástase, angiogênese e cirrose .
Colagenases também têm sido descritas como ferramentas importantes para o transplante de alguns órgãos específicos, como por exemplo, para o isolamento de células de Langerhans das ilhotas pancreáticas, células endoteliais microvasculares, hepatócitos e condrócitos (WO 9824889, 1997) . As dissociações de tecido mediadas pelas enzimas colagenolíticas são um passo crítico em vários procedimentos de isolamento celular. A maioria dos usos terapêuticos descritos acima utiliza como fonte de colagenase o sobrenadante, purificado ou não, de cultivos bacterianos, especialmente de cultivos de linhagens de Clostridium hístolyticum. Clostridium histolyticum é uma bactéria cilíndrica, anaeróbia, gram- positiva e formadora de esporos. A atividade colagenolítica das enzimas extracelulares dessa espécie bacteriana é conhecida há mais de 50 anos, quando se isolou pela primeira vez uma enzima extracelular capaz de digerir tendões de Achilles de bovinos.
Atualmente, sabe-se que várias espécies de microrganismos cultivados em condições definidas são capazes de produzir colagenases, entretanto, Clostridium sp, principalmente Clostridium histolyticum, continua sendo a principal fonte de obtenção de enzimas colagenolíticas e gelatinolíticas para uso medicinal devido a sua maior produtividade e atividade enzimática frente a diversas formas de colágeno e seus peptídeos.
Outras fontes de colagenases para uso terapêutico incluem células de mamíferos, crustáceos (caranguejo, camarão) , fungos e outras bactérias {Streptomyces, Pseudomonas e Vibrio) .
A habilidade das colagenases de Clostridium de digerirem vários tipos de colágenos (tipo I, II, III, VII e X) e gelatina é o primeiro fator que as diferenciam das outras fontes de colagenases. Essas enzimas clostridiais além de possuírem potente atividade colagenolítica quando comparadas às colagenases de vertebrados, apresentam um pH ótimo para sua atividade próximo da faixa de pH fisiológico humano.
Após a descrição inicial das enzimas proteolíticas de Clostridium histolyticum, estudos do final da década de 1950 até o meio da década de 1980 observaram a existência de muitas colagenases produzidas por C. histolyticum e a especificidade e estabilidade dessas frações foram aos poucos sendo caracterizadas.
Bond e Van Wart (1984; Biochemistry 23, 3077-3085), isolaram seis enzimas distintas de preparações de colagenase comercial, com pesos moleculares que variam de 68 kDa a 130 kDa e pontos isoelétricos entre pH 5,5 e 6,5, classificando- as em duas classes de acordo com a especificidade de substratos: Classe I - possuem maior atividade sobre colágenos de alto peso molecular (colágeno nativo: intacto); Classe II - exibem uma preferência por fragmentos de colágenos de baixo peso molecular (colágeno desnaturado: gelatinas) . Essas atividades aparentemente são complementares, havendo evidências da sua ação sinérgica sobre o colágeno nativo.
Além das várias isoformas de colagenases das classes I e II, as preparações tradicionais de colagenase, baseadas no sobrenadante de culturas bacterianas de Clostridium histolyticum, contêm mais de 30 enzimas diferentes. O constituinte primário é colagenase (classes I e II) , entretanto, outras proteases importantes encontradas incluem proteases neutras como: gelatinases, clostripainas ( clostridiopeptidase B, EC 3.4.22.8), tripsinas, elastases e aminopeptidases . Enzimas não proteoliticas também são encontradas nas preparações tradicionais de colagenase, incluindo: galactosidase, acetilglucosaminidase, fucosidase, fosfolipase, neuraminidase (ou sialidase) e hialuronidase . Destas enzimas, proteoliticas e não proteoliticas, sialidase, hialuronidase e colagenase estão muito envolvidas no processo de degradação dos componentes da matriz extracelular, sendo desejável a presença dessa "combinação enzimática" para obtenção de composições que possam ser utilizadas como agente de debridamento enzimático de lesões dérmicas e transplante de órgãos (ex. isolamento de ilhotas pancreáticas) .
Sozinha, a colagenase, purificada ou recombinante, é ineficiente para a dissociação de tecidos devido à hidrólise incompleta de todos os polipeptideos do colágeno e à sua atividade limitada quando em altas concentrações de proteínas não-colágeno e de outras macromoléculas encontradas na matriz extracelular . Por este motivo, a composição contendo colagenase mais utilizada para dissociação tecidual e debridamento é uma preparação bruta ou parcialmente purificada (incluindo algumas poucas etapas de purificação) uma vez que há a necessidade da presença de enzimas para atuar no colágeno nativo e nas fibras reticulares, em adição às enzimas que hidrolisam outras proteínas, polissacarídeos e lipídios da matriz extracelular dos tecidos conjuntivo e epitelial. A complexa composição das preparações de colagenase "bruta" introduz dificuldades ao seu processo de produção, relacionadas principalmente a definição de padrões de expressão das enzimas proteolíticas desejáveis na composição do produto final.
De modo contrário, o uso de composições de colagenase para o tratamento de algumas das doenças mediadas por colágeno, exige uma alta pureza das preparações, devido à necessidade de ação específica sobre a digestão apenas de colágeno, sendo a sua forma de administração através de injeções locais. Nesses casos, os processos de purificação do sobrenadante das culturas de C. histolyticum são muito longos, incluindo inúmeras etapas com diferentes estratégias de purificação.
De maneira geral, a pureza das composições de colagenase está diretamente relacionada à aplicação terapêutica desejada. No entanto, independente da aplicação terapêutica, a existência de um processo definido para o cultivo de Clostridium histolyticum é fundamental para direcionar a produção das principais proteases no sobrenadante, purificado ou não, desses cultivos.
A atividade enzimática e a concentração de proteases nos sobrenadantes dos cultivos de C. histolyticum variam com a linhagem bacteriana, meio de cultura, condições de cultivo, idade da cultura, densidade celular, entre outras variáveis. A variabilidade intrínseca desse tipo de processo biotecnológico implica em testes exaustivos para controle de qualidade dos lotes produzidos, aumentando os custos de produção. Além disso, a perda da eficácia das colagenases tradicionais ao longo do tempo, apesar do controle das suas condições de estocagem, tem sido relacionada à composição enzimática do sobrenadante do cultivo bacteriano produzido, exigindo a definição de condições de cultivo capazes de direcionar a expressão de enzimas colagenolíticas e gelatinolíticas , em especial colagenases, por C. histolyticum.
É bem conhecido que a produção de proteases extracelulares em microrganismos é fortemente influenciada por componentes do meio, especialmente pelas fontes de carbono e nitrogénio, e fatores físicos como, por exemplo, pH, temperatura, volume do inoculo, velocidade da agitação orbital e tempo de incubação. Não há um meio de cultura geral para a produção de proteases por diferentes linhagens microbianas. Cada microrganismo possui os seus próprios requerimentos físico-químicos e nutricionais idiossincráticos para o crescimento e secreção enzimática.
Proteínas e peptídeos são as principais fontes de carbono e nitrogénio em cultura de bactérias do género Clostridium. Convencionalmente, infusão cérebro-coração (Brain Heart Infusion - BHI), triptose, proteose peptona, extrato de carne, caseína e gelatina são descritos como fontes de proteínas e peptídeos para o crescimento e produção enzimática por C. histolyticum. A composição dos meios de cultura líquidos descritos para o crescimento de C. histolyticum também inclui, frequentemente, sais inorgânicos, vitaminas, glicose, extrato de levedura, tioglicolato de sódio e sulfato de ferro, em diversas concentrações.
A presença de peptonas de origem animal tem sido definida como fundamental para o crescimento e produção enzimática por C. histolyticum por diversos autores desde a década de 30.
Na década de 50, MacLennan et al. (1953; J. clin. Invest. 32: 1317) avaliaram os efeitos de diversas fontes de carbono e nitrogénio (fitonas, peptonas, colágeno e derivados, glicose) , além da concentração de vitaminas, sais inorgânicos, pH e Fe++ sobre o crescimento e produção de enzimas colagenolíticas e gelatinolíticas por C. histolyticum (diversas linhagens). As concentrações de sal ferroso e peptona de origem animal foram definidas como críticas para o rendimento máximo de produção enzimática. Tal estudo tornou- se referência e o principal meio de cultura investigado por MacLennan et al. foi considerado um "meio de cultura convencional" para obtenção de colagenases de C. histolyticum durante décadas.
Como peptonas de origem animal, são comumente descritos: bacto-peptona, proteose peptona, hidrolisado de caseína, hidrolisado tríptico de caseína, entre outros. Combinações desses componentes com peptonas vegetais são descritas.
Por exemplo, Bergman et al. (1961; Journal of Bacteriology, 82 : 5829) obtém sucesso nos cultivos de C. histolyticum através de um meio de crescimento contendo proteose peptona, hidrolisado de caseína, hidrolisados trípticos de soja e vitaminas. Demonstra que, na ausência de sais inorgânicos, a produtividade de colagenase é igual ou superior à apresentada por MacLennan et al. (1953), entretanto, com redução da produção de azocaseínas, fato interessante por facilitar os procedimentos posteriores de purificação (denominado meio PTV) .
Além da importância das peptonas de origem animal para o crescimento e produção enzimática em culturas de C. histolyticum, também foi investigada a influência de outros componentes do meio de cultura a fim de definir padrões metabólicos para a espécie e, desta forma, aperfeiçoar as suas condições de cultivo.
Mead (1971; J. Gen. Microbiol. 67:47) descreve o padrão de utilização de aminoácidos em diversas espécies do género Clostridium ao longo do seu crescimento, classificando-os em grupos de acordo com as suas necessidades nutricionais. Nesse trabalho, Clostridium histolyticum é considerado como uma linhagem fermentadora de aminoácidos, e sub-classifiçado no chamado Grupo II (C. botulinum; C. histolyticum; C. cochlearium; C. subterminale) . Serina, glutamina, glicina e valina, apesar de serem os principais aminoácidos utilizados por essas espécies, produzem pouco ou nenhum efeito sobre a amplitude do crescimento bacteriano quando adicionados no meio de cultura. A substituição do hidrolisado parcial de caseína por casaminoácidos , de modo contrário, aumenta significativamente o crescimento observado (meio de cultura utilizado: vitaminas, sais inorgânicos, triptofano, cloridrato de cisteína, casaminoácidos - 2 g/L ou hidrolisado de caseína - 3% p/v e extrato de carne) . Apesar desta observação, o autor não avalia a produção de proteases. Mais comum do que o consumo de aminoácidos, a utilização de glicose como fonte energética para o crescimento é bem relatada para diversos microrganismos. Particularmente para C. histolyticum a adição de glicose (e outros açúcares) foi relacionada à redução do crescimento bacteriano (Mead, 1971) . Assim, apesar de inicialmente consideradas espécies sacaroliticas , por serem capazes de utilizarem carboidratos como fontes de energia, diversas linhagens de C. histolyticum apresentam-se como más fermentadoras de carboidratos simples, como glicose, maltose, entre outros. A redução do crescimento de C. histolyticum é ainda mais pronunciada quando os cultivos com glicose são realizados em condições de aerobiose, sugerindo-se a existência de dois fatores inibitórios, açúcares e oxigênio/ar.
Não só a diminuição do crescimento bacteriano, mas também a expressão de proteases já foi relacionada à presença de glicose no meio de cultivo de espécies de Clostridium (C. difficile, por exemplo) , sugerindo a existência de uma relação entre a repressão da expressão da toxina em um ambiente de cultivo com recursos de carbono rapidamente consumíveis .
Como já evidenciado acima, além dos requerimentos nutricionais, o crescimento bacteriano e produção de proteases por espécies do género Clostridium são influenciados pela manutenção de um ambiente anaeróbio. Como alguns anaeróbios, C. histolyticum tolera pequenas quantidades de oxigénio, fato esse observado para outras espécies do género, podendo ser considerado como um microrganismo aerotolerante . Apesar disso, para a definição de processos de crescimento e produção de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica por C. histolyticum em meio liquido, condições mínimas de anaerobiose devem ser asseguradas .
Os agentes redutores são fundamentais em culturas líquidas de anaeróbios. Entre os agentes mais utilizados estão: digesto de carne, glicose, tioglicolato de sódio, cisteína, sais de ferro ou ferro metálico ou misturas destes.
Hoje, ainda pouco se sabe sobre os componentes do meio de cultivo que influenciam o crescimento e secreção de proteases por C. histolyticum. Dos estudos realizados até o momento, há um consenso apenas sobre a importância dos ingredientes de origem animal, principalmente peptonas, sobre o crescimento de Clostridum histolyticum e a influência desses componentes sobre a produção de proteases, entre elas as colagenases.
Os processos convencionais de cultivo C. histolyticum, apresentam muitas desvantagens como, por exemplo, baixos rendimentos, pouca reprodutibilidade e separação incompleta de impurezas. Além disso, um dos maiores problemas dos processos convencionais de cultivo de C. histolyticum é a predominância do uso de componentes de origem animal na produção de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica para uso terapêutico em humanos.
A presença de componentes de origem animal ao longo do processo de produção de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica de C. histolyticum para uso terapêutico em humanos adiciona, indese avelmente, um risco potencial de ocorrência de infecções e reações anafiláticas nos pacientes submetidos a esses tratamentos enzimáticos. Um exemplo muito conhecido de doença causada pela transmissão horizontal interespecífica de patógenos é a encefalite bovina espongiforme (doença de prion; "Doença da Vaca Louca") cuja transmissão do animal hospedeiro original (bovinos) para o homem foi registrada pela primeira vez em 1993, através do contato do ser humano com fluidos fisiológicos e consumo de carne dos animais infectados.
Na última década, os órgãos regulatórios têm incentivado a indústria farmacêutica a usar meios de cultura bacterianos compreendendo ingredientes de origem não animal ao invés de ingredientes de origem animal. Entretanto, atenção especial deve ser dada à esses ingredientes de origem não animal, pois frequentemente eles são submetidos à tratamentos enzimáticos com ingredientes de origem animal para a digestão dos seus componentes protéicos e carboidratos em peptonas e açúcares. Mesmo esses extratos enzimáticos animais sendo uma fração mínima da composição do produto final, a sua presença impede a classificação do produto como livre de componentes de origem animal ("animal free") .
Alguns meios de cultivo de espécies do género Clostridium livres de componentes de origem animal encontram- se descritos nos documentos: 09854296 (1998, Chiron) , WO0105997 (2000, Massachusetts Institute of Technology), WO2005035749 (2004, Allergan) , Busta & Schroder (1971, Effect of soy proteins on the growth of Clostridium perfringens. Appl Microbiol, 22(2), 177-183; Demain et al. (2007, Tetanus toxin production in soy-based médium: nutritional studies and scale-up into small fermentors. Lett Appl Microbiol, 45{6), 635-638); Fang et al. (2009, Production of Clostridum difficile toxin in a médium totally free of both animal and dairy proteins or digests. PNAS, vol. 106: 13225-13229).
Em geral, componentes a base de soja e extrato de levedura são utilizados como substituintes das peptonas de origem animal, sendo capazes de suportar tanto o crescimento, quanto a produção de toxinas nas espécies já investigadas do género Clostridium (C. sporogenes, C. tetanus, C. botulinicum) .
No caso do cultivo de C. histolyticum, especialmente para a produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica, o estado da arte pouco revela sobre a composição de meios de cultura livres de componentes de origem animal capazes de estimular a produção dessas proteases de maneira pelo menos equivalente aos meios tradicionais contendo peptonas de origem animal.
Para C. histolyticum, os meios de cultivo descritos até o momento apresentam desvantagens como, por exemplo: a presença de componentes animais, o alto custo associado a sua composição complexa, a baixa expressão de colagenases ou o longo tempo de cultivo para a obtenção de um sobrenadante com atividade colagenolitica e gelatinolitica adequada para a produção industrial com fins terapêuticos.
Tentativas de obtenção de um meio de cultura livre de componentes de origem animal adequado para o crescimento e produção de colagenases por C. histolyticum são relatadas a seguir .
O documento WO2007089851 (2007; Auxilium) descreve condições de cultivo de C. histolyticum para a obtenção de colagenases. Apesar de descrever a produção de colagenases por C. histolyticum em um meio de cultura livre de componentes de origem animal, destaca como preferido para produzir, com melhor reprodutibilidade, colagenase, um meio de cultura contendo proteose peptona (origem animal) . Apenas o meio de cultura com ingredientes de origem animal foi capaz de produzir as colagenases em proporção adequada para maximizar a sua atividade sinergistica, resultando em um beneficio terapêutico. Além das peptonas (vegetais e/ou animais) , o meio de cultura descrito pode conter aminoácidos (glutamina, triptofano e asparagina) , extrato de levedura, sais inorgânicos, glicose e vitaminas.
O documento US20100086971 (2009; Roche) descreve um meio de cultura para C. histolyticum que inclui peptona derivada de plantas, entretanto, um aditivo derivado de animal gelatina de peixe - é apontado como crucial para maior atividade colagenolitica do sobrenadante dessas culturas. Destaca que a composição liquida contendo peptonas vegetais e gelatina de peixe suporta maior crescimento bacteriano e maior atividade colagenolitica do que o meio de cultura padrão contendo peptona de origem animal.
Assim, até o presente momento, nenhum meio de cultura completamente livre de componentes de origem animal foi capaz de suportar a produção industrial adequada de colagenases por C. histolyticum como demonstrado para os meios de cultura tradicionais, contendo peptonas animais.
Desta forma, é evidente a necessidade do desenvolvimento de meios de cultura livres de componentes de origem animal e processos para a produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica de C. histolyticum.
Assim, a presente invenção tem como objetivo apresentar um meio de cultura para bactérias do género Clostridium, preferencialmente C. histolyticum, livre de componentes de origem animal e processo para produção de sobrenadante contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica adequado para a produção industrial de enzimas colagenoliticas e gelatinoliticas , em especial colagenases, para fins terapêuticos.
Descrição Resumida da Invenção
A presente invenção refere-se a um meio de cultura para bactérias do género Clostridium, livre de componentes de origem animal, caracterizado por compreender água, peptona de origem não animal, ou seus derivados, extrato de levedura e os aminoácidos cisteina e arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis . Preferivelmente, as bactérias são de linhagens da espécie Clostridium histolyticum .
O meio de cultura da presente invenção pode compreender adicionalmente um ou mais aditivos selecionados do grupo constituído por agente para ajuste de pH na faixa entre 7 a 8, agente redutor, sais inorgânicos, vitaminas e misturas destes.
A peptona de origem não animal pode ser uma peptona vegetal ou peptona de levedura. Preferivelmente a peptona de origem não animal é uma peptona vegetal selecionada do grupo constituído por soja, algodão, trigo, girassol, arroz, amendoim, fava, ervilha, batata, milho ou misturas destes. Mais preferivelmente, a peptona vegetal é uma peptona de soja.
O meio de cultura da presente invenção é caracterizado pelo fato da concentração da peptona de origem não animal ser de 0,5% a 5% p/v, da concentração de extrato de levedura ser de 0,5% a 5% p/v, da concentração de cisterna, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,01% a 0,1% p/v e da concentração de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,1% a 1% p/v. Preferivelmente, o meio de cultura desta invenção é caracterizado pelo fato da concentração da peptona de origem não animal ser de 1% a 4% p/v, da concentração de extrato de levedura ser de 1% a 4% p/v, da concentração de cisterna, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,03% a 0,07% p/v e da concentração de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,25% a 0,7% p/v. Mais preferivelmente, o meio de cultura desta invenção é caracterizado pelo fato da concentração da peptona de origem não animal ser de 3% p/v, a concentração de extrato de levedura ser de 3% p/v, a concentração de cisteina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,0625% p/v e a concentração de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,375% p/v.
Diferentemente dos meios utilizados convencionalmente para cultivo de C. histolyticum compreendendo pelo menos um ingrediente de origem animal, os meios de cultura da presente invenção são livres de componentes de origem animal, e surpreendentemente estimulam a produção de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica, particularmente colagenases, de maneira superior aos meios de cultura convencionais contendo peptonas de origem animal.
A presente invenção também se refere a um processo para a produção de um sobrenadante de uma cultura líquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica caracterizado por compreender as etapas de: a) fornecer um meio de cultura estéril, livre de componentes de origem animal; b) cultivar uma alíquota de cultura estoque de Clostridium histolyticum no meio de cultura da etapa (a) em condições de anaerobiose à cerca de 37 °C até a fase estacionária de crescimento bacteriano para obtenção de um inoculo; c) fornecer um meio de cultura estéril, livre de componentes de origem animal, de acordo com a presente invenção; d) adicionar ao meio de cultura da etapa (c) um volume do inoculo da etapa (b) igual ou inferior a 10% do volume final do meio definido em (c) ; e) cultivar a cultura de C. histolyticum obtida em (d) em condições de anaerobiose à cerca de 37°C até a fase estacionária de crescimento bacteriano; f) separar a matéria celular e outra matéria particulada da fase líquida do cultivo da etapa (e) produzindo um sobrenadante contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica. Tal processo pode incluir uma ou mais etapas adicionais para a purificação de uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica presentes no sobrenadante da etapa (f) .
A presente invenção também se refere a um sobrenadante de cultura liquida de C. histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica obtido de acordo com o processo acima mencionado, e composições farmacêuticas compreendendo como ingrediente ativo o sobrenadante de cultura liquida de Clostridium histolyticum e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
Breve Descrição das figuras
Aspectos da invenção são explicados ou ilustrados pelas seguintes figuras:
Figura 1. Comparação do crescimento bacteriano (densidade óptica 600 nm) de C. histolyticum (ATCC 21000) em cultivos com meios de cultura livre de componentes de origem animal (3% p/v de peptona vegetal, 3% p/v Extrato de levedura, 0,0625% p/v de cloridrato de cisteina) que diferem com relação ao tipo de Peptona vegetal e Extrato de levedura empregado. Meio de cultura padrão (contendo peptona de caseína) utilizado como comparador.
Figura 2. Comparação do crescimento bacteriano (densidade óptica 600 nm) de C. histolyticum (ATCC 21000) em cultivos com meios de cultura livre de componentes de origem animal que diferem quantitativamente com relação ao componente peptona vegetal (HY Pep 1511) e extrato de levedura (YE5114). Os meios de cultura livres de componentes de origem animal contém 0,0625% p/v de cloridrato de cisterna. Meio de cultura padrão (contendo peptona de caseína) utilizado como comparador. Figura 3. Influência sobre o crescimento (DO) e atividade enzimática de diferentes concentrações de extrato de levedura (0-3% p/v) na composição do meio de cultura livre de componentes de origem animal para C. histolyticum (ATCC 21000) contendo 3 ou 4% p/v de peptona de soja e 0,0625% p/v de cloridrato de cisteina.
Figura 4. Influência do pH no crescimento bacteriano (densidade óptica 600 nm) de C. histolyticum (ATCC 21000) em cultivos com meios de cultura livre de componentes de origem animal contendo 3% p/v de peptona de soja (NZ Soy BL4), 3% p/v de Extrato de levedura (YE251) e 0,0625% p/v de cloridrato de cisteina.
Figura 5. Influência da suplementação com sais inorgânicos, vitaminas e aminoácidos sobre o crescimento e atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura liquida de C. histolyticum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo: 3% p/v de peptona de soja (NZ SOY BL4), 3% p/v de extrato de levedura (YE 251) e 0,0625% p/v de cloridrato de cisteina. As barras (1-8) no gráfico referem-se a:
1 - Meio Ctrl:
-NZ-soy BL4 (3%) ;
-Ext. levedura YE 251 (3%);
-Cloridrato de cisteina (0,0625%);
2 - Ctrl + Sais*
3 - Ctrl + Vitaminas**
4 - Ctrl + Vitaminas** + Sais*
5 - Ctrl + Aa***
6 - Ctrl + Aa*** + Vitaminas**
7 - Ctrl + Aa*** + Sais*
8 - Ctrl + Aa*** + Vitaminas** + Sais* As vitaminas, e os sais foram testados nas seguintes concentrações :
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Figura 6. Influência da suplementação com sais inorgânicos, vitaminas e aminoácidos sobre o crescimento e atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura liquida de C. histolytícum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo: 30 g/L de peptona de soja (NZ SOY BL4), 30 g/L de extrato de levedura (YE 251) e os aminoácidos cloridrato de cisteina (0,625 g/L) e cloridrato de arginina (3,75 g/L). Análise da atividade enzimática em gel de zimografia (amostras dos sobrenadantes obtidos para cada meio de cultura analisadas em duplicata). As barras (1 - 4) no gráfico referem-se a:
1 - Meio Ctrl+arginina :
-peptona vegetal NZ-soy BL4 (30 g/L) ;
-Extrato de levedura YE 251 (30 g/L); -Cloridrato de cisteína (0, 625 g/L) ;
-L-arginina (3,75 g/L).
2 - Ctrl + Vitaminas
3 - Ctrl + Fosfatos
4 - Ctrl + Vitaminas + Fosfatos
Figura 7. Comparação da atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura liquida de C. histolyticum (ATCC 21000) em cultivos com meios de cultura livre de componentes de origem animal (3% p/v de peptona vegetal, 3% p/v Extrato de levedura, 0,0625% p/v de cloridrato de cisteina) que diferem com relação ao tipo de Peptona vegetal e Extrato de levedura empregado. Meio de cultura padrão (contendo peptona de caseína) utilizado como comparador .
Figura 8. Crescimento bacteriano de C. histolyticum (ATCC 21000) e atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura líquida de C. histolyticum em meio de cultura livre de componentes de origem animal (30 g/L de peptona de soja NZ SOY BL4, 30 g/L de YE251 e 0,625 g/L de cisteína) contendo, adicionalmente, arginina, glicina ou ambos. Na legenda do eixo horizontal temos que:
Ctrl* = NZ-SoyBL4 (30 g/L); Extrato de levedura YE 412 (30 g/L); Cloridrato de cisteína (0,625 g/L); e GA** = Glicina + L-arginina-HCl
Figura 9. Crescimento bacteriano de C. histolyticum (ATCC 21000) e atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura líquida de C. histolyticum em meio de cultura livre de componentes de origem animal (3% p/v de peptona de soja NZ SOY BL4, 3% p/v de YE251 e 0,0625% p/v de cisteína) contendo adicionalmente grupos de aminoácidos (Grupos de 1 a 6) . Análise da atividade enzimática em gel de zimografia (1 a 6 representam os meios de cultura contendo os grupos de aminoácidos avaliados) . As barras (Grupos de 1 -6 e Controle) no gráfico referem-se a:
Figure imgf000022_0001
'Aminoácidos à lmg/ral cada.
Figura 10. Crescimento bacteriano de C. histolyticum (ATCC 21000) e atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura liquida de C. histolyticum em meio de cultura livre de componentes de origem animal (3% p/v de peptona de soja NZ SOY BL4, 3% p/v de YE 251 ou YE 412 e 0, 0625% p/v de cisteina) em Biorreator (escala 3 L) . Análise da atividade enzimática ém gel de zimografia ao longo do cultivo .
Figura 11. Crescimento bacteriano de C. histolyticum (ATCC 21000) e atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura liquida de C. histolyticum em meio de cultura livre de componentes de origem animal (3% p/v de peptona de soja NZ SOY BL4, 3% p/v de YE251 e 0,0625% p/v de cisteina e 0,375% p/v de arginina) em Biorreator (escala 3 L) . Análise da atividade enzimática em gel de zimografia (B) e análise do perfil protéico em gel SDS PAGE (C) ao longo do cultivo (resultados apresentados apenas após 7 horas de cultivo) .
Figura 12. Análise comparativa do crescimento e atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura liquida de C. histolyticum (ATCC 21000) em meios de cultura livre de componentes de origem animal contendo: 3% p/v de peptona de soja NZ SOY BL4 , 3% p/v de YE251 e 0,0625% p/v de cisteina; ou 3% p/v de peptona de soja NZ SOY BL4, 3% p/v de YE251, 0, 0625% p/v de cisteina e 0, 375% p/v de arginina. Cultivos em Biorreator (escala 3 L) . Análises realizadas ao final do cultivo.
Figura 13. Recuperação de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura liquida de C. histolyticum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo 3% p/v de peptona de soja NZ SOY BL4, 3% p/v de YE251, 0, 0625% p/v de cisteina e 0,375% p/v de arginina. Análise do perfil protéico em gel SDS PAGE ao longo do processo. No gráfico temos que as colunas de 1 a 6 se referem a:
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Figura 14. Análise comparativa do crescimento (DO 600 nm) e atividade colagenolitica e gelatinolitica (mU/mL) dos sobrenadantes obtidos de cultura liquida de C. histolyticum ATCC 21000 e T248 em meios de cultura livre de componentes de origem animal contendo: 3% p/v de peptona de soja NZ SOY BL4, 3% ρ/v de YE251, 0, 0625% p/v de cisteina e 0, 375% p/v de arginina. Cultivos em Biorreator (escala 3 L) . Análises realizadas ao final do cultivo (14hr).
Descrição detalhada da invenção
Para garantir uma melhor compreensão do escopo da invenção, sem que isso seja um fator limitante, os termos específicos das áreas de tecnologia relacionadas a presente invenção são definidos a seguir.
"Proteases" (proteinases, peptidases ou enzimas proteolíticas, EC 3.4), de acordo com esta invenção são enzimas que quebram ligações peptídicas entre os aminoácidos das proteínas.
A presente invenção se refere à " colagenases" de Clostridium histolyticum tipo I e tipo II de acordo com a descrição fornecida por Bond . D., van Wart, H. E., 1987, Biochemistry 23:3077-3085 e Bond, M. D., van Wart, H. E., 1984, Biochemistry, 23: 3085.
"Proteínas de colágeno" ou " colágeno" se referem às principais proteínas estruturais presentes na pele e osso da maioria dos animais, importantes componentes da matriz extracelular . As moléculas de colágeno consistem de 3 cadeias polipeptídicas individuais (cadeias alfa) enroladas umas às outras em uma conformação tripla hélice, estabilizada por pontes de hidrogénio.
Na presente invenção, "gelatina" se refere a uma forma protéica irreversível de colágeno parcialmente hidrolisado.
"Atividade colagenolítica e gelatinolítica" é a medida da atividade de proteases na degradação de moléculas de colágeno e/ou gelatinas. De maneira geral, a atividade colagenolítica e gelatinolítica de proteases é verificada através da capacidade e velocidade de degradação de colágeno e gelatinas e representada em unidades/mL, unidades/L, unidades/mg ou unidades/g de enzima. A quantificação da atividade colagenolítica e gelatinolítica pode ser realizada através de ensaios viscosimétricos , colorimétricos (ninidrina; Moore & Stein, JBC, 176, 367, 1948) ou fluorimétricos (substratos colágeno e gelatina marcados com fluoresceína; EnzChek®) . No caso das quantificações através de ensaio colorimétrico com ninidrina, a atividade é medida através da hidrólise enzimática de substrato sintético (Carbobenzoxy-Gly-Pro-Gly- Gly-Pro-Ala) .
Nesta invenção, "crescimento bacteriano" é definido como a divisão de uma célula bacteriana em duas células-filhas idênticas durante um processo chamado de fissão binária. Desta forma, a duplicação da população bacteriana ocorre a cada divisão. Entretanto, se o número de sobreviventes excede a média, a população bacteriana apresenta crescimento exponencial. A medida do crescimento bacteriano exponencial em uma cultura pode ser monitorada através de métodos muito bem conhecidos, como por exemplo, contagem direta de células bacterianas (microscopia, citometria de fluxo) , determinação de valor de biomassa (miligramas, gramas quilos ou toneladas) , contagem de colónias, densidade óptica (medida em espectrofotômetro, comprimento de onda aproximado de 600 nm) , consumo de nutrientes, entre outros. O crescimento bacteriano pode ser caracterizado por quatro diferentes fases: "fase lag" , "fase exponencial ou log", "fase estacionária" e "fase de declínio ou morte".
De maneira geral e em teoria, durante a "Fase lag", as bactérias se adaptam às condições de crescimento. É um período no qual as células estão entrando em um estado de maturação, sendo ainda incapazes de se dividirem. A "fase exponencial ou log" é um período caracterizado pela duplicação celular. Se o crescimento não é limitante, a duplicação celular continua em uma velocidade constante, assim ambos, o número de células e a velocidade de crescimento, duplicam a cada período de tempo. O crescimento exponencial não pode continuar indefinidamente, já que o meio de crescimento possui restrições nutricionais e acúmulo de metabólitos, muitas vezes tóxicos, produzidos pelas células bacterianas em divisão. Durante a "fase estacionária" a velocidade de crescimento diminui em razão das restrições nutricionais e acúmulo de metabólitos tóxicos. Essa fase caracteriza o momento de exaustão de recursos presentes no meio de cultura bacteriana. Na "fase de declínio ou morte", as bactérias esgotam os nutrientes ainda disponíveis no meio de cultura e morrem.
Nesta invenção, "pré-inóculo" é definido como a suspensão de microrganismos obtida a partir do cultivo de uma cultura estoque, a ser utilizado para a continuação do crescimento do microrganismo para a produção de um inoculo.
"Inoculo"' é a denominação dada à suspensão de microrganismos em concentração adequada, a ser usada para a continuação do crescimento e/ou fermentação do microrganismo em escala maior (maior volume de meio de cultivo) do que a inicial .
"Condição anaeróbia" ou "anaerobiose" nesta invenção significa a manutenção de condição de cultivo substancialmente livre de oxigénio.
"Meio de cultura fresco" se refere a qualquer meio de cultura para crescimento ou fermentação de microrganismos que não tenha sido ainda utilizado, ou seja, possua integralmente todos os seus componentes.
"Meio de congelamento" é a denominação dada a uma composição capaz de manter a viabilidade de um microrganismo após o seu congelamento, ou liofilização e armazenamento e, consequentemente, a sua capacidade de crescimento e fermentação após o período de armazenamento.
0 armazenamento do microrganismo no meio de congelamento pode ser realizado em temperaturas adequadas para a manutenção do seu congelamento. Além disso, também é possível executar uma etapa de liofilização do microrganismo em meio de congelamento antes do seu armazenamento. Nesta invenção, o meio de congelamento é livre de componentes de origem animal e contém adicionalmente um agente de criopreservação .
"Agente de criopreservação", ou crioprotetor, é uma substância capaz de preservar a viabilidade do microrganismo após o seu congelamento. Dentre os agentes de criopreservação conhecidos para microrganismos destacam-se: sacarose, glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO) , entre outros.
"Cultura estoque ou de armazenamento" corresponde a uma aliquota do microrganismo em meio de congelamento armazenado por um período determinado.
"Sobrenandante" é a denominação utilizada nesta invenção para a fase líquida do meio de cultivo (meio de crescimento ou de fermentação) de um microrganismo, que seja livre de material sólido ou particulado. O sobrenadante pode ser obtido por métodos de centrifugação e/ou filtração conhecidos no estado da técnica.
"Peptonas" são compreendidas na presente invenção como sendo misturas de compostos formados através da hidrólise de proteínas (compreende fragmentos de proteínas, cuja composição depende da fonte protéica utilizada para hidrólise) . Usualmente, as peptonas são obtidas por hidrólise enzimática ou ácida de produtos naturais como tecidos animais, leite, tecidos vegetais ou culturas microbianas.
Frequentemente a fonte de proteína para a produção de peptonas de origem animal é um produto secundário da manufatura de carnes e alimentos derivados de leite. Assim, como resultado da sua hidrólise, há inúmeros outros compostos, além de peptídeos e aminoácidos, como por exemplo, gorduras, metais, sais e vitaminas.
"Livre de componentes de origem animal" é a denominação dada à ausência completa de qualquer produto ou composto de origem animal. "Animal" diz respeito a mamíferos, pássaros, répteis, peixes, anfíbios, artrópodes e outras espécies animais. "Animal" exclui microrganismos como bactérias e leveduras. Assim, "livre de componentes de origem animal" pode incluir proteases derivadas de bactérias do género Clostridium, como por exemplo, C. histolyticum. "Livre de componentes de origem animal" não inclui proteínas derivadas de animais, como por exemplo: imunoglobulinas ; digestos de carne, derivados de carne e produtos do leite e seus derivados .
"Componente", "ingrediente", "produto" ou "fonte" "de origem não animal" no contexto da presente invenção são as fontes preferidas de ingredientes para o meio de cultura de Clostridium histolyticum, incluindo vegetais, microrganismos (como por exemplo, levedura) e compostos sintéticos.
"Meio de cultura padrão ou tradicional" refere-se aos meios de cultura para crescimento e/ou fermentação de bactérias do género Clostridium, especialmente C. histolyticum, caracterizados por compreender ingredientes de origem animal, entre eles, proteose peptona, digestos trípticos de carne ou caseína, peptona de caseína, entre outros .
Descrição da invenção
Sabe-se que no caso do crescimento de Clostridium histolyticum, peptonas de origem animal são consideradas ingredientes essenciais do meio de cultura, tendo uma grande influência sobre a produção de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica . Entretanto, para a produção de proteases para uso terapêutico em humanos, o ideal é que ingredientes de origem animal sejam evitados ao longo de todo processo, eliminando o risco de transmissão horizontal interespecífica de patógenos e a indução de reações imunológicas patológicas contra peptídeos antigênicos de origem animal que possam estar presentes no produto final, mesmo após muitas etapas de purificação.
Desta forma, a presente invenção descreve um meio de cultura livre de componentes de origem animal para o crescimento e produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica por bactérias do género Clostridium . Preferivelmente, um meio de cultura para C. histolyticum.
0 crescimento bacteriano e a produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica através do meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito nesta invenção foram comparados às observações dos mesmos parâmetros para cultivos em meio de cultura contendo ingredientes de origem animal como proteose peptona ou hidrolisado de caserna (denominado de meio de cultura padrão ou tradicional).
Particularmente, o meio de cultura descrito na presente invenção estimula a produção de sobrenadante com atividade colagenolitica e gelatinolitica maior do que a obtida através do cultivo de Clostridium histolyticum em meio de cultura padrão (contendo peptonas de origem animal) .
Desta forma, a presente invenção apresenta um meio de cultura para bactérias do género Clostridium, preferivelmente C. histolyticum livre de componentes de origem animal caracterizado por compreender água, peptona de origem não animal, ou seus derivados, extrato de levedura e os aminoácidos cisteina e arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
O meio de cultura da presente invenção pode compreender adicionalmente um ou mais aditivos selecionados do grupo constituído por agente para ajuste de pH na faixa entre 7 a 8, agente redutor, sais inorgânicos, vitaminas e misturas destes.
Níveis ótimos de crescimento bacteriano e produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica, especificamente colagenase, são obtidos para o meio de cultura descrito nesta invenção com pH variando entre 7,0 a 8,0. Preferivelmente, o pH do meio de cultura é cerca de 7,0. O ajuste do pH deve ser realizado após procedimento de esterilização e antes do inicio do cultivo de C. histolyticum, utilizando-se soluções aguosas de um agente para ajuste de pH conhecido do estado da técnica, por exemplo, sulfato de amónio, NaOH, ácido sulfúrico ou ácido nítrico, não se limitando a estes.
Os aditivos (agente redutor, sais inorgânicos e vitaminas) gue podem ser incluídos no meio de cultura livre de componentes de origem animal são selecionados dentre as substâncias conhecidas do estado da arte.
O meio de cultura de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato do agente redutor ser selecionado do grupo constituído por tioglicolato de sódio, bissulfito de sódio, sais de ferro, glicose e misturas destes.
Adicionalmente, o meio de cultura de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato dos sais inorgânicos serem selecionados do grupo constituído por NaCl, KC1, Na2HP04, NaH2P04, KH2P04, K2HP0, MgS04, FeS04, MnS04, e misturas destes.
Além disso, o meio de cultura de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato das vitaminas serem selecionadas do grupo constituído por biotina, ácido pimélico, nicotinamida, pantotenato de cálcio, ácido fólico, nitrato de tiamina, riboflavina, ácido p-aminobenzóico (PABA) e misturas destes.
As peptonas de origem não animal avaliadas como ingredientes do meio de cultivo de Clostridium histolyticum, encontram-se listadas na Tabela 1.
Tabela 1. Peptonas de origem não animal avaliadas como ingredientes do meio de cultura para Clostridium histolyticum descrito na presente invenção.
Peptonas de origem não animal Fornecedor
Amysoy® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)
HYP A® BioSpringer (França)
Hy-Pep 1510® Sheffield ™ Bioscience ( erry, EUA)
Hy-Pep 1511® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)
Hy-Pep 4601® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)
Hy-Pep 4605® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)
Hy-Pep 5603® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)
Hy-Pep 7504® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)
Hy-soy® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)
NZ-Soy BL4® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)
NZ-Soy BL7® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)
Peptona de soja 312 - AF® Biotecnica Internacional (México)
Peptonas de origem não-animal também podem ser obtidas de outros fornecedores, como por exemplo: Soy peptone® (Gibco) , Bac-soytone® (Difco) , SE50M® (DMV) , Peptona de soja 312® (Biotecnica International, México), SE50MAF-UF® (DMV), Stedygro Soy® e Proyield Soy®.
0 meio de cultura para Clostridium histolyticum livre de componentes de origem animal é caracterizado pelo fato da peptona de origem não animal ser uma peptona vegetal selecionada do grupo constituído por soja, algodão, trigo, girassol, arroz, amendoim, fava, ervilha, batata, milho ou misturas destes. Preferivelmente a peptona vegetal é uma peptona de soja, algodão, trigo ou uma mistura destas. Mais preferivelmente, o meio de cultura para Clostridium histolyticum livre de componentes de origem animal é caracterizado pelo fato da peptona vegetal ser de soja.
A presente invenção revela a observação surpreendente de que peptonas ou outros componentes de origem animal não são necessários em meios de cultura para Clostridium histolyticum, e que o meio de cultura da presente invenção, livre de componentes de origem animal, propicia uma produção de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica superior àquela obtida em meios de cultura convencionais contendo componentes de origem animal.
Peptonas de origem vegetal de diferentes fornecedores podem ser utilizadas como componente do meio de cultura para Clostridium histolyticum livre de componentes de origem animal de acordo com a presente invenção. Preferivelmente, as peptonas vegetais são hidrolisadas e o seu processo de preparação também é livre de componentes de origem animal.
O meio de cultura de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato da peptona vegetal ser selecionada do grupo constituído por Hy Soy®, Soytone®, Amisoy®, NZ Soy BL4®, NZ Soy BL7®, Hy Pep 1510®, Hy Pep 1511®, Hy Pep 5603®, Hy Pep 7504®, Stedygro Soy®, SE50M®, Proyield Soy®, SE50MAF-UF®, Peptona de soja 312®, e Hy Pep 4601® e misturas destas.
Preferivelmente, o meio de cultura é caracterizado pelo fato da peptona vegetal ser selecionada do grupo constituído por Hy Pep 4601®, NZ soy BL4®, HyPep 1511® e Hy Pep 7504®. Mais preferivelmente, o meio de cultura de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato da peptona vegetal ser NZ soy BL4®.
Além das peptonas de origem não animal ou peptonas vegetais, o meio de cultura desenvolvido para cultivo de Clostridium histolitycum e descrito na presente invenção possui extrato de levedura como um ingrediente fundamental. Os fornecedores comerciais avaliados para esse ingrediente encontram-se listados na Tabela 2.
Tabela 2. Extratos de Levedura avaliados como ingredientes do meio de cultura para Clostridium histolyticum descrito na presente invenção.
Extrato de levedura Fornecedor
Bacto YE® BD Bioscience (EUA)
Hy-Pep YE® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)
Hy-Yeast 412® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)
Hy-Yeast 413® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)
Hy-Yeast 502® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)
Hy-Yeast 501® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)
Hy-Yeast 503® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)
Prodex 710 SD® BioSpringer (França)
Prodex NS70SD® BioSpringer ( França )
Pronal 5001® BioSpringer (França) Extrato de levedura Fornecedor
YE 11® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA) YE151® Biotecnica Internacional (México) YE251® BioSpringer (França)
YE 70161® Fluka (Sigma-Aldrich GmbH)
YE Y4250® Sigma-Aldrich GmbH
Synth® Synth® (Brasil)
YE 207® BioSpringer (França)
YE 5114® Vetec Química Fina (Brasil)
Preferivelmente, o meio de cultura descrito na presente invenção é caracterizado pelo fato do extrato de levedura ser selecionado do grupo constituído por Bacto YE®, Hy-Pep YE®, Hy-Yeast 412®, Hy-Yeast 413®, Hy-Yeast 502®, Hy-Yeast 501®, Hy-Yeast 503® Prodex 710 SD®, Prodex NS70SD®, Pronal 5001®, YE 11®, YE 151®, YE 251®, YE 70161®, YE Y4250®, Synth®, YE 207®, YE 5114® e misturas destes. Mais preferivelmente, o meio de cultura é caracterizado pelo fato do extrato de levedura ser YE 251®.
Com relação aos aminoácidos, arginina é L-arginina e cisteína é L-cisteína ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Preferivelmente, o meio de cultura de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato dos sais farmaceuticamente aceitáveis serem cloridrato de cisteína e cloridrato de arginina.
Quantitativamente, o meio de cultura descrito nesta invenção é caracterizado pelo fato da concentração da peptona de origem não animal ser de 0,5% a 5% p/v, da concentração de extrato de levedura ser de 0,5% a 5% p/v, da concentração de cisteína, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,01% a 0,1% p/v e da concentração de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,1% a 1% p/v.
Preferivelmente, o meio de cultura é caracterizado pelo fato da concentração da peptona de origem não animal ser de 1% a 4% p/v, da concentração de extrato de levedura ser de 1% a 4% p/v, da concentração de cisteína, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,03% a 0,07% p/v e da concentração de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,25 a 0,7% p/v. Mais preferivelmente o meio de cultura é caracterizado pelo fato da concentração da peptona de origem não animal ser de 3% p/v, a concentração de extrato de levedura ser de 3% p/v, a concentração de cisteina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0, 0625% p/v e a concentração de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,375% p/v.
De acordo com a presente invenção, o meio de cultura deve ser esterilizado antes do inoculo de C. histolyticum. A esterilização pode ser realizada através de métodos conhecidos por um técnico no assunto, como por exemplo, tratamento por calor úmido em autoclave ou filtração. Desta forma, o meio de cultura descrito nesta invenção é caracterizado por ser estéril.
Preferivelmente, o meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito nesta invenção é caracterizado por ser liquido.
O meio de cultura de acordo com a presente invenção também é caracterizado por ser utilizado em um processo para a produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica .
As proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica são secretadas na fase liquida do meio de cultura para C. histolyticum, livre de componentes de origem animal da presente invenção. Colagenases são algumas das proteases secretadas, sendo os principais componentes de natureza protéica do sobrenadante produzido através do cultivo de C. histolyticum. Em um outro aspecto da presente invenção, é descrito um processo para a produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica caracterizado por compreender o cultivo de C. histolyticum em um meio de cultura livre de componentes de origem animal conforme revelado na presente invenção.
0 processo para a produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica é caracterizado por compreender as etapas de:
a) fornecer um meio de cultura estéril, livre de componentes de origem animal;
b) cultivar uma aliquota de cultura estoque de Clostridium histolyticum no meio de cultura da etapa (a) em condições de anaerobiose à cerca de 37°C até a fase estacionária de crescimento bacteriano para a obtenção de um inoculo;
c) fornecer um meio de cultura estéril, livre de componentes de origem animal, de acordo com o descrito na presente invenção;
d) adicionar ao meio de cultura da etapa (c) um volume do inoculo da etapa (b) igual ou inferior a 10% do volume final do meio definido em (c) .
e) cultivar a cultura de C. histolyticum obtida em (d) em condições de anaerobiose à cerca de 37°C até a fase estacionária de crescimento bacteriano;
f) separar a matéria celular e outra matéria particulada da fase liquida do cultivo da etapa (e) produzindo um sobrenadante contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica. A anaerobiose das etapas (b) e (e) do processo acima descrito pode ser estabelecida através de várias técnicas, não se limitando àquelas escolhidas para exemplificar a presente invenção. Métodos para manutenção de condições de anaerobiose para crescimento de microrganismos são bem conhecidos por um técnico no assunto. Por exemplo, a anaerobiose das etapas (b) e (e) pode ser mantida através da adição de 2 ao meio de cultura durante todo o processo de cultivo.
O meio de cultura descrito na etapa (a) do processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum é utilizado para a expansão do número de microrganismos de uma cultura estoque, armazenada em condições adequadas para a manutenção da viabilidade celular. Preferivelmente, a cultura estoque é mantida à -80°C em meio de cultivo livre de componentes de origem animal contendo um ou mais agentes de criopreservação . Para o crescimento de C. histolyticum em meio livre de componentes de origem animal, o ideal é que o cultivo seja realizado a partir de uma cultura estoque caracterizada por conter meio de cultura livre de componentes de origem animal.
A cultura estoque armazenada é produzida a partir do meio de cultura livre de componentes de origem animal compreendendo peptonas vegetais, preferivelmente peptona de soja, ou seus derivados, extrato de levedura, cisteina, pH entre 6,5 e 8,0 e adicionalmente um agente de criopreservação. Agentes de criopreservação para microrganismos, especificamente bactérias, são amplamente conhecidos por um técnico no assunto e podem ser selecionados , sem limitação, de um grupo consistindo de glicerol, sacarose, dimetilsulfóxido e glicose. A quantidade do agente de criopreservação a ser adicionado ao meio de cultura estoque varia de acordo com a linhagem bacteriana e deve ser ajustada previamente a elaboração do banco de microrganismo estoque ("master cell bank" e "work cell bank") .
O objetivo da fase de crescimento (etapa (b) ) é aumentar a quantidade de microrganismos disponíveis e viáveis para a produção das proteases com atividade colagenolitica e gelatinolítica, fato este que ocorre durante a etapa (e) . Adicionalmente, a fase de crescimento permite que os microrganismos dormentes da cultura estoque cresçam ativamente e secretem as proteases com atividade colagenolitica e gelatinolítica na etapa (e) .
O meio de cultura estéril e livre de componentes de origem animal da etapa (a) do processo acima descrito é caracterizado por compreender água, peptona de origem vegetal, extrato de levedura e cisterna. Especificamente, o meio de cultura estéril, livre de componentes de origem animal da etapa (a) é caracterizado por compreender água, de 0,5 a 5% p/v de peptona vegetal, de 0,5 a 5% p/v de extrato de levedura, de 0,01 a 0,1% p/v de cisteína ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis e pH entre 6,5 e 8,0. Preferivelmente, o meio de cultura da etapa (a) é caracterizado por compreender água, 3% p/v de peptona vegetal, 3% p/v de extrato de levedura, 0,0625% p/v de cisteína ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis e pH entre 6,5 e 8,0.
Os resultados apresentados nos Exemplos 1 e 2 mostram que não há necessidade de adição de arginina ao meio de cultura livre de componentes de origem animal para que o crescimento de C. histolyticum seja superior ao apresentado em meio de cultura padrão (contendo peptona de origem animal). Assim, considerando apenas a composição mínima do meio de cultura para atingir os resultados descritos na presente invenção, o meio de cultura preferido para a etapa (a) foi definido apenas com os seus componentes essenciais. Entretanto, resultados semelhantes aos demonstrados para o meio de cultura da etapa (a) são observados em meio de cultura livre de componentes de origem animal compreendendo adicionalmente arginina e outros aditivos (sais inorgânicos, vitaminas e agentes redutores) conforme definido previamente nesta invenção para o meio de cultura para C. histolyticum.
O aminoácido arginina é essencial para os resultados surpreendentes desta invenção com relação à produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica por C. histolyticum (etapa (e) ) . A produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica durante o cultivo de C. histolyticum em meio de cultura livre de componentes de origem animal de acordo com a presente invenção compreendendo os aminoácidos cisteina e arginina é superior à produção observada com o cultivo de C. histolyticum em meio de cultura contendo apenas o aminoácido cisteina e é superior ao observado para os cultivos dessa espécie bacteriana em meio de cultura padrão (contendo peptona de origem animal) .
Desta forma, o processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica é caracterizado pelo fato do meio de cultura estéril, livre de componentes de origem animal da etapa (c) compreender água, peptona vegetal, extrato de levedura, cisteina e arginina, nas faixas de concentração definidas na presente invenção, e pH entre 7,0 e 8,0.
Preferivelmente, o processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica é caracterizado pelo fato do meio de cultura estéril, livre de componentes de origem animal da etapa (c) compreende água, 3% p/v de peptona vegetal, 3% p/v de extrato de levedura, 0, 0625% p/v de cisteina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, 0,375% p/v de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e pH entre 7,0 e 8,0.
O crescimento bacteriano pode ser monitorado pela medida de densidade óptica do meio de cultura durante o processo acima descrito (etapas (b) e (e) ) em espectrofotômetro (leitura à 600 nm) de acordo com métodos bem conhecidos por um técnico no assunto.
0 cultivo de C. histolyticum durante a etapa (b) pode ocorrer em uma ou mais etapas. Preferivelmente, o processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum é caracterizado pelo fato da etapa (b) compreender pelo menos as fases: 1) cultivar a cultura estoque em meio de cultura da etapa (a) na proporção 0,1:1 v/v por cerca de 16 horas para a obtenção de um pré-inóculo; 2) adicionar ao pré-inóculo um volume de meio igual ou superior ao dobro do volume do meio de cultura da fase (1) e manter o cultivo por cerca de 12 horas para a obtenção de um inoculo.
É fundamental que o crescimento durante a etapa (b) não acarrete a lise celular antes da sua inoculação no meio de cultura da etapa (c) , mantendo desta forma a viabilidade do inoculo .
O processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum pode ser caracterizado por compreender apenas as etapas de (c) a (f) , sendo iniciado a partir do cultivo de cultura estoque de C. histolyticum diretamente no meio definido na etapa (c) , sem a necessidade da produção de um inoculo.
Preferivelmente, o processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum é caracterizado pelo fato do cultivo de C. histolyticum durante a etapa (e) envolver a adição de um ou mais agentes conhecidos para ajuste de pH em quantidade suficiente para manutenção do pH do meio de cultura entre 6,5 a 8,0.
Na presente invenção, durante a etapa (f) do processo de obtenção das enzimas colagenoliticas de C. histolyticum, a separação da matéria celular ou outra matéria particulada da fase liquida do meio de cultura, pode ser realizada através de diferentes técnicas de filtração, centrifugação ou purificação cromatográfica, conhecidas no estado da técnica, não se limitando a filtração tangencial, centrifugação, cromatografia de gel filtração, entre outras.
Assim, o processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum é caracterizado pelo fato da etapa (f) ser realizada através de procedimentos de filtração ou centrifugação ou ambos.
Adicionalmente, o processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum é caracterizado por conter uma ou mais etapas adicionais para a purificação de uma ou mais proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica presentes no sobrenadante obtido na etapa (f) . A purificação pode ser realizada através de diferentes métodos de filtração, purificação cromatográfica ou precipitação salina, não se limitando a precipitação com sulfato de amónio; filtração tangencial; cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, cromatografia de gel filtração, entre outros, individualmente ou combinados.
De acordo com a presente invenção, o sobrenadante da cultura líquida de C. histolyticum é uma mistura complexa compreendendo não só proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica, especialmente colagenases, mas também outras proteínas, metabólitos bacterianos, componentes do meio de cultura, entre outras substâncias.
Desta forma, um aspecto adicional da presente invenção refere-se ao sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica caracterizado por ser produzido pelo processo da presente invenção conforme descrito acima.
Particularmente, o sobrenadante de acordo com a presente invenção é caracterizado por ser constituído de 20 a 90% de colagenases após purificação.
O sobrenadante de acordo com a invenção pode ser diretamente purificado para a obtenção de uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica. Alternativamente, o sobrenadante pode ser armazenado na forma congelada ou liofilizada, sem, no entanto, perder a sua atividade colagenolitica e gelatinolitica.
Em um outro aspecto, a invenção revela o uso do sobrenadante de uma cultura líquida de C. histolyticum obtido a partir do processo descrito na presente invenção caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças que se beneficiam da atividade colagenolitica e gelatinolitica das proteases de C. histolyticum. Particularmente, a invenção descreve o uso do sobrenadante de uma cultura líquida de C. histolyticum caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças mediadas por colágeno ou acúmulo de tecidos fibrosos. Adicionalmente, a invenção descreve o uso do sobrenadante de uma cultura líquida de C. histolyticum caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de tecidos necrosados e/ou processos de cicatrização. Além disso, o uso do sobrenadante de uma cultura líquida de C. histolyticum é caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o debridamento enzimático.
Queimaduras e lesões dérmicas de natureza diversa são exemplos de situações onde o tratamento dos tecidos necrosados faz-se necessário.
A presente invenção também revela uma composição farmacêutica caracterizada por compreender como ingrediente ativo o sobrenadante de uma cultura liquida de C. histolyticum obtido a partir do processo descrito nesta invenção e excipientes farmaceuticamente aceitáveis . A composição farmacêutica pode incluir um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tampões, carreadores, estabilizadores, preservativos e espessantes.
A composição farmacêutica, de acordo com a invenção, é caracterizada por ser para a administração em um animal ou humano para fins terapêuticos ou cosmético.
Conforme a presente invenção, as composições farmacêuticas compreendendo como ingrediente ativo o sobrenadante de uma cultura liquida de C. histolyticum podem ser administradas pelas vias oral, sublingual, nasal, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intra-articular, subcutânea, cutânea, transdérmica, não sendo limitada a estas. Preferivelmente, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é caracterizada por ser formulada para administração pelas vias subcutânea, cutânea e transdérmica.
Mais preferivelmente, a composição farmacêutica de acordo com a invenção é caracterizada por ser para uso tópico e compreender de 0,2U a 1,8U de colagenase por grama de composição (método colorimétrico com ninidrina) .
Os carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis são selecionados em função da apresentação final da composição que pode ser na forma de, mas não limitados à cápsulas, comprimidos, soluções para a administração oral, soluções para administração nasal, solução injetável para administração intramuscular, intravenosa, cutânea ou subcutânea ou ainda soluções, pomadas ou cremes para uso tópico. Assim, as composições farmacêuticas da presente invenção compreendem como ingrediente ativo o sobrenadante de uma cultura liquida de C. histolyticum, excipientes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis, na forma de formulações em creme ou pomada, liofilizados ou soluções aquosas. Excipientes, carreadores ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis não apresentam toxicidade ao organismo receptor nas dosagens e concentrações empregadas e podem incluir os tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes como ácido ascórbico e metionina; preservantes como cloreto de octadecildimetilbenzil amónio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, álcool butilico, álcool benzílico, alquil parabenos como metil- e propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol; aminoácidos, monossacarideos, dissacarideos e outros carboidratos como glicose, manose, sacarose, manitol ou sorbitol; polissacarídeos (como o polissacarideo hidrofilico ficoll®) , excipientes poliméricos como polivinilpirrolidonas, , dextrinas, polietileno glicóis, agentes de sabor, adoçantes, agentes anti-estáticos , agentes quelantes como EDTA ou EGTA; sais liberadores de ions como sódio, complexos metálicos, surfactantes não-iônicos como polisorbatos "T EEN 20" e "TWEEN 80", lipídeos como fosfolipídeos , ácidos graxos e esteróides como colesterol. Métodos para preparação de composições farmacêuticas são bem conhecidos, ou serão aparentes à luz da presente invenção, pelo especialista da arte em tecnologia farmacêutica .
Tais composições farmacêuticas encontram aplicação no tratamento de doenças que se beneficiam da atividade colagenolitica e gelatinolitica das proteases de C. histolyticum, no tratamento de condições patológicas do corpo humano associadas ao depósito excessivo de colágeno e ao acúmulo errático de tecido fibroso rico em colágeno, no tratamento de tecidos necrosados e em processos de cicatrização e no tratamento por debridamento enzimático.
O sobrenadante do cultivo de C. histolyticum, bem como as proteases com atividade colagenoliticas e gelatinolitica, em particular colagenases, produzidos de acordo com o processo descrito na presente invenção não apresentam toxicidade, resultado este observado através de estudo de citotoxicidade e Toxicidade Dérmica.
Para uma melhor compreensão dos ensinamentos contidos na presente invenção, os exemplos 1 a 10 são apresentados, sem, no entanto, limitar o seu escopo.
Os Exemplos 1-4 demonstram o preparo de meios de cultura, livres de componentes de origem animal, de acordo com o descrito na presente invenção, e o crescimento e produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica por C. histolyticum. Os resultados apresentados comprovam a eficiência do meio de cultura livre de componentes de origem animal no crescimento de C. histolyticum em comparação com o meio de cultura padrão, mesmo sem o aminoácido arginina na sua composição (Figuras 1 e 2) . A importância do extrato de levedura na composição do meio de cultura livre de componentes de origem animal é observada na Figura 3 e a faixa de pH preferida para o cultivo de C. histolyticum encontra-se exemplificada na Figura 4. A suplementação do meio de cultura livre de componentes de origem animal com vitaminas e sais inorgânicos não afeta o crescimento e produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica por C. histolyticum, como demonstrado nas Figuras 5 e 6, definindo essa suplementação como opcional. A maior produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica é observada apenas com a adição de arginina ao meio de cultura livre de componentes de origem animal, definindo o meio de cultura da presente invenção (Figuras 7 e 8). A comprovação da importância da presença dos aminoácidos arginina e cisteina para a produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica no meio de cultura livre de componentes de origem animal da invenção pode ser observada na Figura 9.
Adicionalmente, esses exemplos comprovam a qualidade do sobrenadante obtido através do cultivo em meio de cultura livre de componentes de origem animal, sendo este caracterizado por compreender em sua maioria proteases de alto peso molecular, relacionadas às colagenases de C. histolyticum, cuja atividade enzimática também é demonstrada.
O Exemplo 5 apresenta os resultados do cultivo em Biorreator (3L) utilizando o meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito na presente invenção. A Figura 10 apresenta os resultados do cultivo em meio de cultura livre de componentes de origem animal sem arginina, demonstrando a menor produção de proteases quando comparado ao cultivo realizado em meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito na invenção contendo arginina (Figura 11) . A Figura 12 apresenta um gráfico comparativo dos parâmetros crescimento e produção enzimática entre os meios de cultura livres de componentes de origem animal avaliados (sem e com arginina) .
O Exemplo 6 relata um processo de recuperação das proteases com atividade colagenoliticas e gelatinolitica presentes no sobrenadante do cultivo de C. histolyticum em meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito na presente invenção. Destaca a qualidade do sobrenadante obtido, com ausência de precipitados, facilitando a manipulação dos mesmos. São apresentados os resultados da recuperação das enzimas colagenoliticas por precipitação com sulfato de amónio, seguida de diálise e liofilização (Figura 13).
O Exemplo 7 apresenta uma composição farmacêutica para uso tópico compreendendo o sobrenadante da cultura liquida de C. histolyticum produzido em meio de cultura livre de componentes de origem animal. A estabilidade das composições também é descrita, comprovando a qualidade do produto obtido a partir dos processos fermentativos descritos e definindo mais uma característica vantajosa da presente invenção.
0 Exemplo 8 descreve ensaios de toxicidade dérmica doses repetidas (21dias) em ratos (machos e fêmeas) , demonstrando a ausência de toxicidade das composições farmacêuticas preparadas com as enzimas colagenoliticas obtidas através liofilizado do sobrenadante de cultura líquida de C. histolyticum produzido em meio de cultura livre de componentes de origem animal, de acordo com a invenção, e obtido após procedimento de filtração tangencial. A ausência de toxicidade das composições farmacêuticas destaca, novamente, a qualidade da composição enzimática do sobrenadante das culturas de C. histolitycum em meios livres de componentes de origem animal de acordo com a invenção (Figuras 14 - 17).
O Exemplo 9 apresenta os resultados do cultivo das linhagens de C. histolyticum ATCC21000 e T248 em Biorreator (3L) utilizando o meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito na presente invenção. A Figura 14 apresenta os resultados desse cultivo, demonstrando uma produção equivalente de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica por ambas as linhagens avaliadas.
O Exemplo 10 apresenta os resultados do ensaio de citoxicidade para as proteases com atividade colagenolitica e gelatinolítica obtidas do sobrenadante da cultura liquida de C. histolyticum (ATCC 21000 e T248) em meio de cultura livre de componentes de origem animal.
EXEMPLOS
Os exemplos citados a seguir são meramente ilustrativos, devendo ser empregados somente para uma melhor compreensão dos desenvolvimentos constantes na presente invenção, não devendo, contudo, serem utilizados com o intuito de limitar os objetos descritos.
Linhagens de C. histolyticum podem ser obtidas de diversas fontes, incluindo American Type of Culture Collections (ATCC) . Diversas linhagens de Clostridium histolyticum já foram utilizadas para fins de obtenção da colagenase, assim a presente invenção não se limita apenas à linhagem utilizada para a demonstração da invenção através dos exemplos abaixo.
Em todos os exemplos, a linhagem de Clostridium histolyticum ATCC 21000 foi utilizada (mutante não-móvel de uma linhagem móvel, selvagem, isolada do solo [ATCC 21000™) . Essa linhagem foi escolhida por ser caracterizada como boa produtora de enzimas colagenoliticas e gelatinoliticas . 0 meio de cultura indicado pela ATCC para o seu cultivo inclui peptonas de origem animal, sais inorgânicos e digesto de figado (meio de cultura Reinforced Clostridial Médium - RCM - Oxoid CM149, pH 8,0; cultivo em anaerobiose).
Adicionalmente, os Exemplos 9 e 10 apresentam resultados do cultivo utilizando o meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito na presente invenção para a linhagem de Clostridium histolyticum denominada de T248, isolada de amostra de solo superficial de área privada (Espirito Santo do Pinhal/SP, Brasil) . A linhagem T248 foi caracterizada morfológica (bacilo gram positivo, esporulado) , bioquímica (anaeróbio facultativo, que degrada gelatinas) e geneticamente (gene tpi e regiões ribossomais 16S, 23S e intergênica 16S e
23S) , tendo sido completamente sequenciados os genes ColG e ColH, presentes exclusivamente em cepas de C. histolyticum , que codificam Colagenases de classe I e II. A cepa também foi caracterizada filogeneticamente, utilizando as sequências da região 16S-intergênica-23S .
Exemplo 1. Preparo do meio padrão e do meio de cultura liyre de componentes de origem animal para o crescimento de Clostrldinm hlstolyticvan..
O meio de cultura padrão ou tradicional foi preparado usando os seguintes ingredientes para cada litro de meio: Proteose peptona n. 3 ou peptona de caseína (20 g) ; Extrato de levedura (5 g) ; glicose (5 g) ; tioglicolato de sódio (250 mg) em pH 7,0 (ajustado com NaOH 5 M) .
0 meio de crescimento livre de componentes de origem animal foi preparado utilizando os seguintes ingredientes para cada litro de meio: peptona de origem vegetal (10-40 g) ; extrato de levedura (0-30 g) ; cloridrato de cisteína (0,625 g) em pH 7,0 (ajustado com NaOH 5M) .
Após a dissolução de todos os ingredientes descritos acima em água (com exceçâo da glicose, presente apenas no meio padrão) e ajuste do pH para 7,0 (NaOH 5 M) , o meio de cultura foi esterilizado em autoclave à 121 °C por 20 minutos. Uma solução de glicose foi preparada separadamente, esterilizada em autoclave (121 °C por 20 minutos) e adicionada ao meio de cultura padrão apenas no momento de realização dos cultivos.
Foram avaliadas diferentes peptonas de origem vegetal e extratos de levedura, em diferentes quantidades no meio de cultura livre de componentes de origem animal para o crescimento de C. histolyticum descrito acima.
Variação do pH do meio de cultura livre de componentes de origem animal (3% p/v NZ soy BL4, 3% p/v YE251 e 0, 0625% p/v cloridrato de cisteina, pH 7,0) também foi investigada, sendo a faixa avaliada de 6,5 a 8,5.
Exemplo 2. Crescimento de C. histolyticum em meio de cultura liyre de componentes de origem animal e em meio padrão conforme definidos no Exemplo 1.
Inicialmente, a cultura estoque congelada de Clostridium histolyticum (100 pL) foi suspendida em 1 mL do meio padrão ou 1 ml do meio de cultura livre de componentes de origem animal (descrito no Exemplo 1) , separadamente em dois tubos que foram completados com os respectivos meios de cultura para o volume final de 10 mL (cultivo denominado inoculo) . Os tubos contendo o inoculo foram incubados à 37 °C, em anaerobiose, por aproximadamente 16 horas.
Após esse período, o 3 mL do inoculo foram incubados em frascos de 250 mL contendo 150 mL dos respectivos meios de cultura de C. histolyticum. A cultura inoculada foi então mantida à 37 °C por cerca de 12 - 14 horas em anaerobiose (anaerobiose mantida através da adição N2) . Todas as análises apresentadas no Exemplo 2 foram realizadas ao final das 12-14 horas dessa etapa de cultivo.
0 crescimento bacteriano foi determinado pela densidade óptica - DO - através de um espectrofotômetro à 600 nm.
A Figura 1 apresenta os resultados de DO (densidade óptica) de cultivos de C. histolyticum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal compreendendo peptona vegetal (3% p/v) e extrato de levedura (3% p/v) de diferentes fornecedores. Os fornecedores avaliados demonstram resultados de crescimento bacteriano semelhantes. A Figura 1 também demonstra um aumento significativo da DO observada quando o cultivo é realizado em meio de crescimento livre de componentes de origem animal de acordo com a presente invenção em comparação ao crescimento bacteriano obtido em meio de cultura padrão, com peptonas de origem animal (Vetec + Caseína) . Todos os meios de cultura livre de componentes de origem animal representados na Figura 1 contem 0,625 g/L de cloridrato de cisteina e pH aproximadamente 7,0.
A Figura 2 apresenta o resultado do crescimento de C. histolyticum quando o cultivo é realizado em meio de cultura livre de componentes de origem animal considerando variações nas quantidades de peptona vegetal (Hy-pep 1511; 1-3% p/v) e extrato de Levedura (YE 251; 0-3% p/v) . Todos os meios de cultura livre de componentes de origem animal representados na Figura 2 contem 0,625 g/L de cloridrato de cisteina e pH aproximadamente 7,0. Observa-se alguma variação com relação ao crescimento de C. histolyticum entre esses cultivos em meio de cultura livre de componentes de origem animal, entretanto, os valores de DO (densidade óptica) alcançados são sempre superiores àqueles obtidos através do cultivo de C. histolyticum em meio de cultura padrão (com peptona de origem animal) .
A importância do extrato de levedura na composição do meio de cultura livre de componentes de origem animal de origem animal é demonstrada na Figura 3 (meios de cultura livre de componentes de origem animal contendo 0, 1, 2 ou 3% de Extrato de levedura) . Observa-se que a ausência de extrato de levedura na composição do meio de cultura inibe tanto o crescimento bacteriano quanto a produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica, mesmo considerando um aumento na quantidade de peptona vegetal na sua composição (concentrações avaliadas de peptona de origem vegetal: 3 e 4%). Todos os meios de cultura livre de componentes de origem animal representados na Figura 3 contem 0,625 g/L de cloridrato de cisteina e pH aproximadamente 7,0. A avaliação da atividade colagenolítica e gelatinolitica foi realizada de acordo com o descrito no exemplo 4.
A F-igura 4 representa os resultados de crescimento bacteriano obtidos através do cultivo de C. histolyticum em meio de crescimento com pH variando de 6,5 a 8,5. Dentro da faixa de pH avaliada, apenas o pH mais básico (pH 8,5) influenciou negativamente o crescimento bacteriano.
Exemplo 3. Preparo do meio de cultura para Clostrldlxxm histolyticum liyre de componentes de origem animal e meio de cultura padrão para a produção de sobrenadante contendo proteases com atividade colagenolítica e gelatinolitica.
O meio de cultura padrão foi preparado de acordo com o descrito no Exemplo 1.
O meio de cultura livre de componentes de origem animal da presente invenção foi preparado utilizando os seguintes ingredientes para cada litro de meio: peptona de origem vegetal (30 g) ; extrato de levedura (30 g) ; cloridrato de cisteina (0, 625 g) , cloridrato de arginina (3,75 g) e pH 7 (ajustado com NaOH 5 ) .
Experimentos para demonstração do efeito surpreendente do meio de cultura para C. histolyticum livre de componentes de origem animal definido pela invenção e descrito acima foram realizados com cinco tipos de meios de cultura contendo para cada litro de meio, os componentes:
• Meio 1: peptona de soja (30 g; NZ-Soy BL4®) ; extrato de levedura (30 g; YE 251®); cloridrato de cisteina (0,625 g) em pH 7,0 (ajustado com NaOH 5 M) . • Meio 2: peptona de soja (30 g; NZ-Soy BL4®) ; extrato de levedura (30 g; YE 251®); cloridrato de cisteina (0,625 g) em pH 7,0 (ajustado com NaOH 5 M) e adicionalmente sais e/ou vitaminas e/ou aminoácidos (descritos na legenda da Figura 5) .
• Meio 3: peptona de soja (30 g; NZ-Soy BL4®) ; extrato de levedura (30 g; YE 251®); cloridrato de cisteina (0,625 g) em pH 7,0 (ajustado com NaOH 5 M) e adicionalmente grupos de aminoácidos (Grupos de 1 a 6, descritos na legenda da Figura 9) .
• Meio 4 : peptona de soja (30 g; NZ-Soy BL4®) ; extrato de levedura (30 g; YE 251®); cloridrato de cisteina (0,625 g) em pH 7,0 (ajustado com NaOH 5 M) e adicionalmente glicina e/ou arginina.
• Meio 5: peptona de soja (30 g; NZ-Soy BL4®) ; extrato de levedura (30 g; YE 251®); cloridrato de cisteina (0,625 g) , cloridrato de arginina (3,75 g) em pH 7,0 (ajustado com NaOH 5 M) e adicionalmente sais inorgânicos e vitaminas (descritos na legenda da Figura 6) .
Outras peptonas de origem vegetal foram avaliadas com relação ao cultivo de C. histolyticum para a produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica, demonstrando resultados semelhantes à NZ-Soy BL4®. Da mesma forma, os diferentes extratos de levedura avaliados apresentam resultados semelhantes ao YE 251® utilizado nos meios de cultura livre de componentes de origem animal.
As peptonas vegetais e extratos de leveduras adequados para compor o meio de cultura livre de componentes de origem animal não se limitam às utilizadas nos exemplos da presente invenção. Peptonas vegetais e extratos de levedura que demonstrem boa solubilidade em água podem ser utilizados para a preparação de meio de cultura para C. histolyticum de acordo com a presente invenção, desde que sejam livres de componentes de origem animal.
Após a dissolução de todos os componentes do meio de cultura livre de componentes de origem animal em água e ajuste do pH para 7,0 (NaOH 5M) , o meio foi esterilizado em autoclave à 121 °C por 20 minutos.
Exemplo 4. Produção de sobrenadante de uma cultura liquida de Clostrldium histolyticvaa contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica em meio de cultura liyre de componentes de origem animal definidos no Exemplo 3 e meio padrão definido no Exemplo 1.
O cultivo de C. histolyticum em meio de cultura livre de componentes de origem animal foi realizado de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 2. Os meios de cultura avaliados encontrara-se descritos no Exemplo 3 (meios de 1 a 5) .
Ao final de 12-14 horas de cultivo de C. histolyticum nos meios de cultura livre de componentes de origem animal descritos no Exemplo 3, as células bacterianas foram centrifugadas e a quantificação da atividade colagenolitica e gelatinolitica das proteases contidas no sobrenadante foi determinada. Oito mililitros (8 mL) das culturas bacterianas foram submetidos à centrifugação a 5000 rpm por 30 minutos à 4 °C para remoção do material insolúvel (células, restos celulares, precipitados, entre outros) .
O perfil protéico do sobrenadante obtido foi avaliado através eletroforese em gel SDS PAGE 7,5% em condições não redutoras (coloração por nitrato prata) . O perfil de atividade enzimática (não-especifica) foi avaliado em gel SDS-PAGE não redutor contendo 10% de gelatina e corado com Coomassie blue ( zimografia) . Ambas as metodologias de análise são amplamente conhecidas por um técnico no assunto. A quantificação da atividade colagenolitica e gelatinolitica dos sobrenadantes obtidos foi realizada através do reagente EnzChek® Gelatinase/Collagenase Assay Kit (Molecular Probes, Invitrogen) . Os ensaios foram realizados de acordo com instruções do fabricante, em microplacas, utilizando como substrato gelatina e/ou colágeno conjugado com fluoresceina . As leituras foram realizadas em um leitor.de fluorescências. Resumidamente, 100 L do sobrenadante da cultura, após centrifugação, foram misturados ao substrato diluído no tampão de incubação preparado de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram incubadas à 37 °C por 15 minutos e a leitura à 515 nm foi realizada em um leitor de fluorescência de microplacas. Como controle negativo foi realizado todo o procedimento de incubação com meio de cultura estéril no lugar do sobrenadante da cultura. Como controle positivo utilizou-se o reagente Colagenase fornecido pelo kit e preparado de acordo com instruções do fabricante .
O crescimento bacteriano foi determinado pela densidade óptica - DO - através de um espectrofotômetro à 600 nm.
Inicialmente, a suplementação do meio de cultura livre de componentes de origem animal (meio 2; compreendendo peptona vegetal, extrato de levedura e cisteína) com vitaminas, sais inorgânicos e aminoácidos foi avaliada, demonstrando a pouca influência desses aditivos sobre o crescimento e produção de um sobrenadante de uma cultura líquida de Clostridium histolyticum contendo proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica (Figura 5) . Como controle desse experimento foi utilizado o meio 1.
A adição de vitaminas, sais inorgânicos e aminoácidos ao meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito pela invenção (meio 5; compreendendo peptona vegetal, extrato de levedura, cisterna e arginina) também resulta em pouca variação na biomassa (DO) e na atividade colagenolítica e gelatinolítica do sobrenadante desses cultivos. A Figura 6 demonstra esses resultados, confirmando a caracterização dessa suplementação com vitaminas e sais como opcional ao meio de cultura da presente invenção. Como controle desse experimento foi utilizado o meio 1.
Variações qualitativas (diferentes fornecedores) dos componentes peptona vegetal e extrato de levedura também foram avaliados (Meio 1 contendo peptona vegetal, extrato de levedura e cisterna) com relação a produção de um sobrenadante de uma cultura de C. histolyticum contendo proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica. A Figura 7 mostra que os resultados de atividade colagenolítica e gelatinolítica obtidos para esses cultivos são da mesma ordem dos resultados obtidos para o cultivo de C. histolyticum em meio padrão (com peptona animal) . Dessa forma, observa-se a necessidade de um ingrediente adicional ao meio de cultura para o aumento da atividade colagenolítica e gelatinolítica observada no sobrenadante da cultura líquida de C. histolyticum, o que foi solucionado pelo meio de cultura da presente invenção.
Surpreendentemente, observa-se através da Figura 8 que o cultivo de C. histolyticum no meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito na presente invenção e que contém os aminoácidos cisteína e arginina (meio 4), resulta em um sobrenadante com atividade colagenolítica e gelatinolítica significativamente maior do que a apresentada para o cultivo em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo apenas o aminoácido cisteína (Meio 1, utilizado como controle desse experimento) . Tal efeito é devido a arginina uma vez que a adição de outro aminoácido, por exemplo glicina, reduz a atividade colagenolitica e gelatinolitica observada.
A Figura 9 apresenta os resultados de atividade colagenolitica e gelatinolitica e DO (600 nm) observados em cultivo de C. histolyticum com o meio 3 (meio livre de componentes de origem animal com cisteina e grupos de aminoácidos) . Como controle foi realizado o cultivo em meio 1 (meio livre de componentes de origem animal e apenas o aminoácido cisteina) . Observa-se que nenhum outro aminoácido, ou combinação de aminoácidos, adicionado ao meio de cultura foi capaz de aumentar a atividade colagenolitica e gelatinolitica observada no sobrenadante de cultura liquida de C. histolyticum como propiciado surpreendentemente pelo aminoácido arginina (Figura 8).
Adicionalmente, observa-se que apenas 14 horas de fermentação são suficientes para a recuperação do sobrenadante contendo enzimas colagenoliticas e gelatinolitica em níveis adequados para uma produção industrial, um período inferior ao comumente empregado, sendo este um parâmetro com grande influência nos processos produtivos em escala industrial.
Exemplo 5. Produção de sobrenadante de uma cultura líquida de Clostridium histolyticvan contendo proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica em meio de cultura liyre de componentes de origem animal - cultivo em Biorreatores .
Inicialmente, a cultura estoque congelada de Clostridium histolyticum (100 μΐ,) foi suspendida em 1 mL do meio cultura livre de componentes de origem animal (meio 1, definido abaixo) , e posteriormente adicionado meio de cultura para o volume final de 10 mL (cultivo denominado pré-inóculo) . Os tubos contendo o pré-inóculo foram incubados à 37 °C, em anaerobiose, por aproximadamente 16 horas. Após esse período, o 3 mL do pré-inóculo foram incubados em frascos de 250 mL contendo 150 mL dos respectivos meios de cultura de C. histolyticum. A cultura foi então mantida à 37 °C por cerca de 12 - 14 horas em anaerobiose (anaerobiose mantida através da adição N2; cultivo denominado inoculo) .
Para os cultivos realizados em Biorreator (New Brunswick) , 60 mL do inoculo foram adicionados a 3 litros de meio de cultura de C. histolyticum. As culturas foram então incubadas à 37 °C em condições de anaerobiose (adição N2) . O pH do meio de cultura foi monitorado ao longo do processo (fermentação), sendo ajustado para a faixa de 6,5-8,0 com hidróxido de amónio (5 M) ou ácido sulfúrico (2 M) . O tempo de cultura foi de cerca de 14 horas, momento no qual a fase da cultura já se caracterizava como fase estacionária por pelo menos 2 horas.
Foram avaliados dois meios de cultura, cuja composição para cada litro de meio, segue abaixo:
• Meio 1: peptona de soja (30 g; NZ-Soy BL4®) ; extrato de levedura (30 g YE 251®) ; cloridrato de cisteína (0, 625 g) e pH 7 (ajustado com hidróxido de amónio 5 M após esterilização) .
• Meio 6: peptona de soja (30 g; NZ-Soy BL4®) ; extrato de levedura (30 g YE 251®) ; cloridrato de cisteína (0,625 g) , cloridrato de arginina (3,75 g) e pH 7 (ajustado com hidróxido de amónio 5 M após esterilização) .
Abaixo são descritas detalhadamente as etapas do processo de produção de um sobrenadante de uma cultura de C. histolyticum contendo proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica de acordo com a presente invenção.
1 - Preparo do banco celular: foi realizado através do cultivo de C. histolyticum (ATCC 21000) em placas de Agar (meio livre de componentes de origem animal compreendendo peptona de soja, extrato de levedura e ágar) . Colónias que apresentam grande crescimento foram isoladas e inoculadas em meio para banco de células contendo os mesmos ingredientes do meio sólido, com exceção do ágar. A cultura de C. histolyticum cultivada nesse meio foi então combinada com glicerol (10%, estéril), fracionada em criotubos e congelada à -80 °C para uso posterior. Esse meio de congelamento pode ser utilizado para estocar a cultura por pelo menos 1 ano sem a perda de viabilidade celular.
2 - Fase de crescimento (preparo do pré-inóculo e inoculo) : uma aliquota do banco celular foi descongelada à temperatura ambiente e rapidamente, ΙΟΟμΙ dessa aliquota foram transferidos para lml do meio de cultura livre de componentes de origem animal (Meio 1) , ao qual foram adicionados mais 9 mL do mesmo meio para o crescimento da bactéria à 37°C em anaerobiose por cerca de 16 horas (pré- inóculo) . Posteriormente, o pré-inóculo foi utilizado para preparar o inoculo de acordo com a descrição apresentada anteriormente.
3 - Fase de Fermentação (produção de sobrenadante de cultura liquida de C. histolyticum contendo proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica) : 60 mL do inoculo foram transferidos para um fermentador contendo 3 L de meio de cultura livre de componentes de origem animal (pH 7, Meio 1) e mantido por cerca de 14 horas à 37 °C em condições anaeróbias (através da adição de N2) . Ao longo do cultivo, o controle de pH da fermentação foi realizado através da adição de hidróxido de amónio (5 M) toda vez que o pH apresentou-se inferior à 6,5, ou ácido sulfúrico (2 M) toda vez que o pH apresentou-se superior à 8. O crescimento bacteriano máximo e a melhor produção de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolitica ocorreram após 14 horas de fermentação bacteriana (Figura 10) .
O mesmo processo foi realizado utilizando-se o Meio 6 como meio de cultura livre de componentes de origem animal da etapa 3.
O crescimento bacteriano foi monitorado através de medidas de densidade óptica (600 nm) realizadas a cada 2 horas de cultivo em espectrofotômetro .
O perfil protéico e perfil enzimático do sobrenadante obtido dos cultivos de C. histolyticum descritos acima foram avaliados através de eletroforese em gel SDS PAGE 7,5% em condições não redutoras (Figura 11; coloração por nitrato prata) e gel SDS-PAGE não redutor contendo 10% de gelatina e corado com Coomassie blue (Figuras 10 e 11; zimografia) .
4 - Obtenção do sobrenadante de cultura liquida de C. histolyticum e recuperação das proteases com atividade colagenolítica e gelatinolitica: A obtenção do sobrenadante de cultura líquida e recuperação das enzimas colagenolíticas e gelatinolitica foram realizadas como descrito no exemplo 4 (centrifugação para obtenção do sobrenadante) e através de precipitação salina, diálise e liofilização, de acordo com a descrição detalhada apresentada no Exemplo 6 ou filtração tangencial (5KDa de tamanho de poro) seguida de liofilização . A atividade colagenolítica e gelatinolitica do sobrenadante foi monitorada através de ensaios fluorimétricos de atividade enzimática descritos detalhadamente no Exemplo 4 (resultados apresentados na Figura 10 e 11) .
A Figura 10 apresenta os resultados (DO, atividade enzimática e zimografia) de dois processos fermentativos realizados com o meio de cultura 1 (meio 1) . A Figura 11 apresenta os resultados (DO, atividade enzimática, gel SDS-Page/nitrato de prata e zimografia) de um processo fermentativo realizado com o meio de cultura 6 (meio 6) . Observa-se através da análise da Figura 11, uma curva de crescimento bacteriano semelhante ao obtido nas fermentações em biorreatores com meio 1 (contendo apenas o aminoácido cisteina, Figura 10), entretanto e surpreendentemente observa-se uma atividade colagenolitica e gelatinolitica significativamente superior, demonstrando a influência da adição de arginina ao meio de cultura livre de componentes de origem animal para o aumento da produção de enzimas colagenoliticas e gelatinolitica nos cultivos de C. histolyticum (atividade em U/mL) .
A Figura 12 apresenta a comparação da atividade colagenolitica e gelatinolitica (mU/mL) e densidade óptica (DO 600 nm) entre os cultivos com meio 1 (contendo apenas o aminoácido cisteina) e cultivos com o meio 6 (contendo os aminoácidos cisteina e arginina) , demonstrando claramente um aumento médio de cerca de 30% da atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante do cultivo de C. histolyticum em meio contendo cisteina e arginina.
Adicionalmente, imagens da eletroforese em gel de zimografia e SDS PAGE (coloração com nitrato de prata) dos sobrenadantes obtidos do cultivo de C. histolyticum são apresentadas, demonstrando a qualidade dos sobrenadantes, com a presença predominante de proteínas de alto peso molecular, identificadas aqui como sendo correspondentes às colagenases (Figuras 10 e 11) .
Exemplo 6. Recuperação das proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica obtidas do sobrenadante da cultura liquida de C. histolyticum em meio de cultura liyre de componentes de origem animal . O sobrenadante contendo as proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica foi obtido através do cultivo de C. histolyticum de acordo com o descrito no Exemplo 5, utilizando como meio da etapa 3 o meio 6 (contendo os aminoácidos cisteina e arginina) .
Para a recuperação das proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica obtidas do sobrenadante da cultura liquida de C. histolyticum, inicialmente, adicionou- se 243,73 g de (NH4)2S04 em 500 mL de sobrenadante, agitou-se a mistura e reservou-a em geladeira por 2 h (etapa de precipitação salina) . Em seguida, centrifugou a mistura a 8500 rpm por 30 min e à 4°C. O material obtido após precipitação salina e centrifugação, foi resuspendido em 12,0 mL de tampão fosfato de sódio 2 mM pH 7,2, sendo então submetido à diálise com tampão fosfato de Sódio 2 mM pH 7,2. Foram realizadas 3 trocas de tampão antes do congelamento e liofilização das amostras. A liofilização foi realizada por pelo menos 18 h. O material liofilizado foi coletado para análise e caracterização.
A caracterização do sobrenadante após diálise e liofilização foi realizada através de eletroforese das amostras em gel SDS-PAGE 7,5% em condições não redutoras, com posterior coloração por nitrato de prata. A Figura 13 representa os resultados obtidos através do procedimento descrito acima, demonstrando a excelente qualidade do sobrenadante obtido através do cultivo de C. histolyticum em meio de cultura de acordo com a presente invenção e a estabilidade das proteases após processamento e liofilização. Através da análise em gel SDS PAGE é possível observar a presença predominante de proteínas de alto peso molecular (colagenases) , cuja prevalência é aumentada após a sua liofilização. O processo aqui descrito para a liofilização do sobrenadante de C. histolyticum contendo proteases com atividade colagenolítica e gelatinolitica apresenta um bom rendimento, sendo recuperado aproximadamente 90% da atividade enzimática do sobrenadante inicial.
Exemplo 7. Composição farmacêutica para uso tópico contendo colagenases de C. histolyticvan - Ensaios de Estabilidade
A composição farmacêutica utilizada para exemplificar a presente invenção foi uma pomada dermatológica compreendendo os ingredientes apresentados abaixo:
Figure imgf000062_0001
A atividade colagenase especifica foi determinada pela hidrólise enzimática de substrato sintético (Carbobenzoxy- Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala) , sendo quantificada através de ensaio colorimétrico com ninidrina. Uma unidade de enzima é definida como sendo responsável pela liberação de 1 mol de Gly-Pro-Ala do hexapeptideo Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala em 1 minuto à 37 °C.
A composição farmacêutica foi preparada através da dispersão do liofilizado (quantidade equivalente à atividade colagenase especifica igual a 0,2 U, 0,6 U e 1,8 U/g de formulação), obtido de acordo com o exemplo 5 (liofilizado do sobrenadante obtido em cultivo com o meio 6 e após procedimento de filtração tangencial) , nos demais excipientes e homogeneização. A dose de 0,6U/g de composição é considerada a dose terapêutica adequada para uso humano. O estudo de Estabilidade foi realizado com a formulação
2 descrita acima, armazenada em bisnagas de alumínio em apresentação de 30g. Os testes realizados, especificação e os resultados observados encontram-se descritos nas tabelas 3 e 4. Todos os ensaios de estabilidade foram realizados em câmaras climáticas especificas para ensaios de estabilidade.
Tabela 3. Estabilidade de longa duração: 30°C ± 2°C, 75% ± 5% de UR (Umidade Relativa) .
Figure imgf000063_0001
Observa-se a manutenção das características do produto inicial em ambas a condições avaliadas, comprovando a qualidade do produto obtido através do meio de cultura (meio 6, contendo cisteína e arginina) e processo para a produção de um sobrenadante de uma cultura líquida de Clostridium histolyticum descritos na presente invenção. Exemplo 8. Composição farmacêutica para uso tópico contendo colagenases de C. istolyticvaar- Toxicidade
As composições farmacêuticas utilizadas para exemplificar a presente invenção é a mesma utilizada para a realização dos ensaios de estabilidade descritos acima (Exemplo 7) .
Foi realizado um ensaio de toxicidade dérmica doses repetidas (21 dias) em pele escarificada de ratos com as composições preparadas de acordo com o Exemplo 7 (ingrediente ativo: liofilizado com atividade Colagenase especifica de 0,2U/g, 0,6U/g e l,8U/g). Como controle do ensaio, uma composição placebo, preparada de acordo com o Exemplo 7, sem, no entanto, adicionar o ingrediente ativo, foi utilizada.
0 ensaio, baseado no Guideline 410 da OECD consistiu em provocar cirurgicamente, a ratos previamente anestesiados, uma ferida utilizando punch" estéril de 4mm no centro da linha média dorsal no primeiro dia da administração (pêlos da região dorsal removidos por meio de aparelho depilador) . A aplicação tópica da composição (0,425g; composições contendo 0,2U, 0,6U e 1,8U de colagenase por grama) em uma área equivalente a 30-40cm2 foi realizada com auxilio de espátula, dentro e ao redor da ferida, uma vez ao dia, durante 21 dias, a três grupos de Rattus norvegicus (variedade albina, linhagem istar) por sexo (10 ratos por grupo, 5 machos e 5 fêmeas, nuliparas e não prenhes) .
O local da aplicação foi preservado por meio de curativo com gaze e uma fita adesiva não irritante por aproximadamente 24 horas após a administração.
Em paralelo, um grupo controle (10 ratos, 5 machos e 5 fêmeas) recebeu apenas o placebo (Placebo Colagenase) . Adicionalmente, foram constituídos dois grupos satélites, um avaliado com a maior dose da composição teste (10 ratos, 5 machos e 5 fêmeas) e outro com a composição controle (10 ratos, 5 machos e 5 fêmeas) , tratados por 21 dias e acompanhados por mais 14 dias após o final do periodo da exposição, a fim de se verificar a reversibilidade, a persistência ou os efeitos tardios da exposição à substância- teste .
Diariamente e logo após cada aplicação foram observados os seguintes parâmetros:
1. Alterações na pele e pêlos.
2. Alterações nos olhos e membranas da mucosa.
3. Alterações respiratórias e circulatórias.
4. Alterações do Sistema Nervoso Central e Autónomo.
5. Alterações na atividade somato-motora e comportamento padrão .
6. Outras alterações como tremores, convulsão, salivação, diarreia, letargia, sonolência e coma.
Foram registrados semanalmente o peso corporal (Tabela 5) e os consumos de água e ração. Ao final do estudo, amostras de sangue foram coletadas para análises hematológicas (hematócrito, concentração de hemoglobina, contagem de eritrócitos, cálculo dos índices hematimétricos, leucócitos diferenciais e totais, tempo de protrombina, tempo de tromboplastina parcial ativada e contagem de plaquetas - Tabela 6) e bioquímicas (sódio, potássio, cálcio, fósforo, triglicérides, albumina, creatinina, ureia, proteínas totais, alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase e colesterol, glicemia - Tabela 7) . Em seguida, os animais foram submetidos à eutanásia e necropsia (Tabela 8) . Amostras de tecidos foram encaminhadas para análise histopatológica.
A administração em doses repetidas (21 dias) para a composição farmacêutica descrita, em todas as doses avaliadas, não induziu mortes, nem alterações nas avaliações clínicas, no peso corporal e nos consumos de ração e água, nos exames hematológicos, bioquímicos e/ou anatomopatológicos passíveis de relação com a exposição ao ingrediente ativo da composição. Assim, os resultados obtidos demonstraram que a administração da composição farmacêutica contendo o liofilizado (quantidade equivalente à atividade colagenase específica igual a 0,2 U, 0,6 U e 1,8 U/g de formulação), obtido de acordo com o exemplo 5 (liofilizado do sobrenadante obtido após procedimento de filtração tangencial) durante um período de 21 dias por via dérmica a Rattus novergicus nas formulações de 0,2U/g, 0,6U/g e l,8U/g foi bem tolerada e não promoveu alterações passíveis de relação com toxicidade. Observa-se, surpreendentemente, que mesmo em dose três vezes superior à dose terapêutica considerada para humanos, a composição descrita na presente invenção não apresenta sinais de toxicidade em ratos.
Tabela 5. Peso corporal (ratos machos e fêmeas). Grupos experimentais para avaliar a toxicidade dérmica em doses repetidas (21 dias) de composição tópica contendo sobrenadante purificado e liofilizado derivado da cultura de C. histolyticum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo peptona de soja (30 g/L), Extrato de levedura (30 g/L), cloridrato de cisteína (0,625 g/L) e cloridrato de arginina (3,75 g/L). Composição controle: apenas com excipientes.
Grupos- machos
0,2U/g 0,6U/g l,8U/g
Semanas MÉDIA D.P. n MÉDIA D.P. n MÉDIA D.P. n
0 296,40 22,56 5 302,12 26, 92 5 306,56 13, 94 5
1 279,14 17, 93 5 282,68 28, 46 5 292,72 19, 68 5
2 283,04 17, 54 5 277,10 15, 17 5 301,68 15, 09 5
3 280,94 19,34 5 273,42 18, 43 5 291,20 20, 19 5
4
5
Grupos - machos Controle Controle-Satélite l,8U/g-Satélite
Semana MÉDIA D.P. n MÉDIA D.P. n MÉDIA D.P. n
0 298,68 14, 04 5 284,00 39, 46 5 311,18 18, 05 5
1 279,42 15, 00 5 285,16 15, 10 5 292,58 15, 10 5
2 287,22 19, 90 5 293,50 17, 76 5 295,92 14, 75 5
3 278,96 16, 01 5 298,08 16, 36 5 300,94 15, 77 5
4 328,12 9, 95 5 335,12 21, 56 5
5 324,26 9,24 5 338,34 17, 92 5
Grupos -fêmeas
0,2U/g 0,6U/g l,8U/g
Semanas MÉDIA D.P. n MEDIA D.P. n MÉDIA D.P. n
0 252,20 21,28 5 221,00 7,89 5 238,86 14, 88 5
1 238,02 21,38 5 215,14 15, 93 5 226,60 10,31 5
2 247,14 21, 54 5 218,36 10, 92 5 235,10 12, 05 5
3 244,42 15, 77 5 212,52 12, 20 5 240,98 12,59 5
4
5
Grupos -fêmeas
Controle Cont ole-Satélite l,8U/g-Satélite
Semana MÉDIA D.P. n MÉDIA D.P. n MÉDIA D.P. n
0 230,56 19,88 5 252,72 32, 44 5 234,16 8, 57 5
1 223,60 9, 98 5 228,32 11, 05 5 226,70 9,75 5
2 235,72 15, 04 5 238,44 7, 61 5 227,64 8, 16 5
3 225,42 13, 91 5 247,70 15, 98 5 242,98 11, 99 5
4 258,32 12, 35 5 256,58 9, 85 5
5 247,16 6, 91 5 247,12 7,71 5
Tabela 6. Análise hematológica (ratos machos e fêmeas). Grupos experimentais para avaliar a toxicidade dérmica em doses repetidas (21 dias) de composição tópica contendo sobrenadante purificado e liofilizado derivado da cultura de C. histolyticum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo peptona de soja (30 g/L), Extrato de levedura (30 g/L), cloridrato de cisteina (0,625 g/L) e cloridrato de arginina (3,75 g/L). Composição controle: apenas com excipientes.
Figure imgf000067_0001
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000069_0001
Tabela 7. Análise bioquímica (machos e fêmeas). Grupos experimentais para avaliar a toxicidade dérmica em doses repetidas (21 dias) de composição tópica contendo sobrenadante purificado e liofilizado derivado da cultura de C. histolyticum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo peptona de soja (30 g/L) , Extrato de levedura (30 g/L) , cloridrato de cisteina (0,625 g/L) e cloridrato de arginina (3,75 g/L). Composição controle: apenas com excipientes. * p<0,05 vs . grupo controle
{ANOVA seguida do post hoc de Bonferroni) .
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
Tabela 8. Análise de pesos de órgãos corporais (machos e fêmeas) . Grupos experimentais para avaliar a toxicidade dérmica em doses repetidas (21 dias) de composição tópica contendo sobrenadante purificado e liofilizado derivado da cultura de C. histolyticum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo peptona de soja (30 g/L), Extrato de levedura (30 g/L), cloridrato de cisteina (0,625 g/L) e cloridrato de arginina (3,75 g/L). Composição controle: apenas com excipientes.
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
Clostridlvaa hxstolyticvau (linhagens ATCC 21000 e T248) contendo proteases com atividade colagenolitica e gelatinol tica em meio de cultura liyre de componentes de origem animal — cultivo em Biorreatores .
Os cultivos em biorreator para a obtenção dos sobrenadantes avaliados e os métodos de análise utilizados foram realizados conforme descrito previamente no Exemplo 5, utilizando como meio da etapa 3 o meio 6 (contendo os aminoácidos cisterna e arginina) .
A Figura 14 apresenta a comparação da atividade colagenolitica e gelatinolitica (mU/mL) e densidade óptica (DO 600 nm) entre os cultivos das linhagens de Clostridium histolyticum ATCC 21000 e T248. Observa-se que não há diferença significativa (Análise estatística: Mann Whitney; p<0,05) sobre a atividade colagenolitica e gelatinolitica entre os sobrenadantes do cultivo de C. histolyticum de ambas as linhagens avaliadas.
Exemplo 10. Ensaio de citoxicidade de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica obtidas do sobrenadante da cultura liquida de C. hxstolytxcvaa (ATCC 21000 e T248) em meio de cultura liyre de componentes de origem animal .
As proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica foram obtidas de acordo com o descrito no Exemplo 6 (amostras liofilizadas ) .
As células utilizadas nos ensaios de citotoxicidade foram do tipo fibroblástico, da linhagem estabelecida em cultura V79 clone M-8, oriunda de pulmão de Hamster Chinês (Cricetulus griseus) . Os fibroblastos foram mantidos em cultura continua em garrafas de 25cm2 (TPP, Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland) até atingirem a densidade de confluência. 0 cultivo foi realizado em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (Nutricell) , 100UI/mL de penicilina, e 10C^g/mL de sulfato de estreptomicina (Nutricell), em estufa a 37°C sob atmosfera úmida e contendo 5% de C02 (Melo et al., 2000, 2001).
Os ensaios de citotoxicidade foram realizados em placas de 96 cavidades (IWAKI, Asahi Techno Glass, Co., Funabasi, Japan) , com 3 x IO4 células/mL em cada cavidade (lOO L/cavidade) seguido de incubação a 37°C por 48 horas. A viabilidade celular inicial foi verificada pelo teste de exclusão do Azul de Tripan. O meio foi retirado após as 48 horas e as culturas foram expostas durante 24 horas ao meio DMEM suplementado contendo diferentes concentrações (até a concentração máxima de 1 mg/mL) das amostras liofilizadas abaixo descritas:
Amostra Procedência Linhagem
1 Adquirida de terceiros -
2 Adquirida de terceiros -
Obtida de acordo com a
presente invenção
3 (Exemplo 6) . ATCC 21000
Obtida de acordo com a
presente invenção
4 (Exemplo 6) . ATCC 21000 Obtida de acordo com a
presente invenção
5 (Exemplo 6) . T248
Após 24 horas de tratamento, as culturas foram processadas de acordo com os protocolos específicos dos testes para determinação do conteúdo de ácidos nucléicos
(DNA) , incorporação do vermelho neutro (VN) e redução do MTT (MTT) .
As proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica obtidas do cultivo de C. histolyticum de acordo com a presente invenção não apresentam citotoxicidade, resultado este observado através dos resultados apresentados na Tabela 9.
Tabela 9. Resultado dos ensaios de Citotoxicidade de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica obtidas do sobrenadante de Clostridium histolyticum, ATCC2100 e T248, produzido de acordo com a presente invenção, e proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica presentes em matéria-prima adquirida de terceiros.
IC50 (mg/mL) IC50 (U/mL)
Atividade
Amostra
(U/g) Ácidos Ácidos
MTT VN MTT VN
Nucléicos Nucléicos
1 2.214,00 0, 35 0, 35 0, 35 0, 69 0, 69 0, 648
2 2.090,00 0, 33 0, 33 0,31 0, 69 0, 69 0, 648
3 2.429, 00 * * 0, 90 2, 43 2,43 2, 186
4 3.073, 00 * * * 3,07 3,07 3,073
5 3.646, 00 0,20 0, 20 0,20 0,73 0,73 0, 729

Claims

REIVINDICAÇÕES
Meio de cultura para bactérias do género Clostridium. livre de componentes de origem animal caracterizado por compreender água, peptona de origem não animal, ou seus derivados, extrato de levedura e os aminoácidos cisteina e arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de ser para Clostridium histolyticum .
Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por compreender adicionalmente um ou mais aditivos selecionados do grupo constituído por agente para ajuste de pH na faixa entre 7 a 8, agente redutor, sais inorgânicos, vitaminas e misturas destes.
Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato da peptona de origem não animal ser uma peptona vegetal selecionada do grupo constituído por soja, algodão, trigo, girassol, arroz, amendoim, fava, ervilha, batata, milho e misturas destas .
Meio de cultura de acordo com a reivindicação 4 caracterizado pelo fato da peptona vegetal ser de soja. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 4 caracterizado pelo fato da peptona vegetal ser selecionada do grupo constituído por Hy Soy, Soytone, Amisoy, NZ Soy BL4, NZ Soy BL7, Hy Pep 1510, Hy Pep 1511, Hy Pep 5603, Hy Pep 7504, Stedygro Soy SE50 , Proyield Soy, SE50MAF-UF, Peptona de soja 312, Hy Pep 4601 e misturas destas.
7. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo fato da peptona vegetal ser NZ soy BL .
8. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato do extrato de levedura ser selecionado do grupo constituído por Bacto YE, Hy-Pep YE, Hy-Yeast 412, Hy-Yeast 413, Hy-Yeast 502, Hy-Yeast 501, Hy-Yeast 503 Prodex 710 SD, Prodex NS70SD, Pronal 5001, YE 11, YE 151, YE 251, YE 70161, YE Y4250, Synth, YE 207, YE 5114 e misturas destes.
9. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 8 caracterizado pelo fato do extrato de levedura ser YE 251.
10. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de cisteina ser cloridrato de cisteina e arginina ser cloridrato de arginina.
11. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 3 caracterizado pelo fato do agente redutor ser selecionado do grupo constituído por tioglicolato de sódio, bissulfito de sódio, sais de ferro, glicose e misturas destes.
12. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 3 caracterizado pelo fato dos sais inorgânicos serem selecionados do grupo constituído por NaCl, KC1, Na2HP04, NaH2P04, KH2P04, K2HP04, MgS04, FeS04, MnS0 e misturas destes.
13. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 3 caracterizado pelo fato das vitaminas serem selecionadas do grupo constituído por biotina, ácido pimélico, nicotinamida, pantotenato de cálcio, ácido fólico, nitrato de tiamina, riboflavina, ácido p- aminobenzóico (PABA) e misturas destas. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato da concentração da peptona de origem não animal ser de 0,5% a 5% p/v, da concentração de extrato de levedura ser de 0,5% a 5% p/v, da concentração de cisteina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,01% a 0,1% p/v e da concentração de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,1% a 1% p/v.
Meio de cultura de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo fato da concentração da peptona de origem não animal ser de 1% a 4% p/v, da concentração de extrato de levedura ser de 1% a 4% p/v, da concentração de cisteina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,03% a 0,07% p/v e da concentração de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,25% a 0,7% p/v.
Meio de cultura de acordo com a reivindicação 15 caracterizado pelo fato da concentração da peptona de origem não animal ser de 3% p/v, da concentração de extrato de levedura ser de 3% p/v, da concentração de cisteina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0, 0625% p/v e da concentração de arginina, ou seus , sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,375% p/v.
Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por ser liquido.
Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por ser estéril.
Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por ser utilizado em um processo para a produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica.
0. Processo para a produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum. contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica caracterizado por compreender o cultivo de Clostridium histolyticum em meio de cultura livre de componentes de origem animal de acordo a reivindicação 1.
1. Processo para a produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridiπτη histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica caracterizado por compreender as etapas de :
a) fornecer um meio de cultura estéril, livre de componentes de origem animal;
b) cultivar uma aliquota de cultura estoque de Clostridium histolyticum no meio de cultura da etapa (a) em condições de anaerobiose e à cerca de 37 °C antes do inicio da fase estacionária de crescimento bacteriano para a obtenção de um inoculo;
c) fornecer um meio de cultura estéril livre de componentes de origem animal de acordo com a reivindicação 1;
d) adicionar ao meio de cultura da etapa (c) um volume do inoculo da etapa (b) igual ou inferior a 10% do volume final do meio definido em (c) .
e) cultivar a cultura de C. histolyticum obtida em (d) em condições de anaerobiose à cerca de 37 °C até a fase estacionária de crescimento bacteriano; f) separar a matéria celular e outra matéria particulada da fase liquida do cultivo da etapa (e) produzindo um sobrenadante contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica .
22. Processo de acordo com a reivindicação 21 caracterizado pelo fato da etapa (b) compreender pelo menos as fases: 1) cultivar a cultura estoque em meio de cultura da etapa (a) na proporção 0,1:1 v/v por cerca de 16 horas para a obtenção de um pré-inóculo; 2) adicionar ao pré-inóculo um volume de meio de cultura da etapa (a) igual ou superior ao dobro do volume do meio de cultura da fase (1) e manter o cultivo por cerca de 12 horas para a obtenção de um inoculo.
23. Processo de acordo com a reivindicação 21 caracterizado pelo fato do cultivo de C. histolyticum durante a etapa (e) envolver a adição de um ou mais agentes para ajuste de pH em quantidade suficiente para manutençã do pH do meio de cultura entre 6,5 a 8,0.
24. Processo de acordo com a reivindicação 21 caracterizado pelo fato da etapa (f) ser realizada através de procedimentos de filtração, centrifugação ou ambos.
25. Processo de acordo com a reivindicação 21 caracterizado por compreender uma ou mais etapas adicionais para a purificação de uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica presentes no sobrenadante obtido na etapa (f) .
26. Processo de acordo com a reivindicação 21 caracterizado pelo fato do meio de cultura estéril livre de componentes de origem animal da etapa (a) compreender água, de 0,5% a 5% p/v de peptona vegetal, de 0,5% a 5% p/v de extrato de levedura, de 0,01% a 0,1% p/v de cisteina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e pH entre 6,5 e 8,0.
27. Processo de acordo com a reivindicação 26 caracterizado pelo fato do meio de cultura compreender água, 3% p/v de peptona vegetal, 3% p/v de extrato de levedura, 0, 0625% p/v de cisteina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e pH entre 6,5 e 8,0.
28. Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato do meio de cultura estéril livre de componentes de origem animal da etapa (c) compreender água, 3% p/v de peptona vegetal, 3% p/v de extrato de levedura, 0,0625% p/v de cisteina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, 0,375% p/v de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e pH entre 7,0 e 8,0.
29. Sobrenadante de uma cultura liquida de Clostrxdivau histolyticva contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica caracterizado por ser produzido pelo processo da reivindicação 21.
30. Sobrenadante de acordo com a reivindicação 29 caracterizado por ser constituído de 20 a 90% de colagenases após purificação.
31. Composição farmacêutica caracterizada por compreender como ingrediente ativo o sobrenadante de acordo com a reivindicação 29 e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
32. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 31 caracterizada por ser para uso tópico e compreender de 0,2U a 1,8U de colagenase por grama de composição .
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