KR101339349B1

KR101339349B1 - 보툴리눔 독소의 제조방법

Info

Publication number: KR101339349B1
Application number: KR1020130092024A
Authority: KR
Inventors: 김청세; 송관영; 민경민; 안영덕
Original assignee: 주식회사 대웅
Priority date: 2013-08-02
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2013-12-09
Also published as: HK1215715A1; HUE036840T2; MX2015016481A; WO2015016462A1; SI2920199T1; BR112015029973A2; CN105392795B; JP2017141237A; SA515370208B1; EP2920199A4; EP2920199B1; BR112015029973B1; CN105392795A; SG11201509486VA; CA2912553C; PL2920199T3; AR096541A1; NO2920199T3; EP2920199A1; MX362821B

Abstract

본 발명은 보툴리눔 독소의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 보툴리눔 독소 생산균주 배양액에 산을 처리하여 보툴리눔 독소를 산 침전시키는 단계; (b) 상기 침전된 보툴리눔 독소에 완충용액을 첨가한 후, 프로테아제 억제제(protease inhibitor) 및 핵산분해 효소를 처리하여 보툴리눔 독소를 추출하는 단계; (c) 상기 추출된 보툴리눔 독소에 산을 처리하여 보툴리눔 독소를 산 침전시킨 다음, 침전물을 완충용액에 용해시키는 단계; 및 (d) 음이온교환 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계를 포함하는 보툴리눔 독소의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 보툴리눔 독소의 제조방법을 이용하면, 간단한 공정으로 고순도의 보툴리눔 독소를 제조할 수 있으므로 매우 경제적이고 효율적이며, 본 발명의 방법으로 제조된 보툴리눔 독소는 기존의 방법으로 생산된 보툴리눔 독소에 비해 순도가 높아 국소작용력이 증가하므로 부작용으로 나타날 수 있는 보툴리눔 독소의 전신순환성이 낮아져 안전성이 증가하는 장점이 있어, 신경근육 장애의 치료, 주름살 제거제, 경직성 편마비 및 뇌성마비의 치료제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

Description

보툴리눔 독소의 제조방법{Methods for Preparing Botulinum Toxin}

본 발명은 보툴리눔 독소의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 보툴리눔 독소 생산균주 배양액에 산을 처리하여 보툴리눔 독소를 산 침전시키는 단계; (b) 상기 침전된 보툴리눔 독소에 완충용액을 첨가한 후, 프로테아제 억제제(protease inhibitor) 및 핵산분해 효소를 처리하여 보툴리눔 독소를 추출하는 단계; (c) 상기 추출된 보툴리눔 독소에 산을 처리하여 보툴리눔 독소를 산 침전시킨 다음, 침전물을 완충용액에 용해시키는 단계; 및 (d) 음이온교환 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계를 포함하는 보툴리눔 독소의 제조방법에 관한 것이다.

신경독성을 지닌 독소를 분비하는 다양한 클로스트리디움 속 균주들이 1890 년대부터 지금까지 발견되었으며, 지난 70년간 이들 균주들이 분비하는 독소에 대한 특성 규명이 이루어져 왔다 (Schant, E. J. et al ., Microbiol . Rev ., 56:80, 1992).

상기 클로스트리디움 속 균주들에서 유래한 신경독성을 지닌 독소, 즉 보툴리눔 독소(botulinum toxin)는 그 혈청학적 특징에 따라 A 내지 G형의 7가지 형으로 구분된다. 각 독소는 약 150KDa 정도의 독소 단백질을 가지고 있는데, 자연적으로는 여러 비독성 단백질들과 결합되어 있는 복합체로 이루어져 있다. 중간(Medium) 복합체(300kDa)는 독소 단백질과 비독성-비헤마글루티닌 단백질로 이루어져 있고, 큰(Large; 450kDa) 복합체 및 거대(Large-Large; 900kDa) 복합체는 중간 복합체가 헤마글루티닌과 결합되어 있는 형태를 띠고 있다 (Sugiyama, H., Microbiol . Rev ., 44: 419, 1980). 이러한 비독성 비헤마글루티닌 단백질들은 장내에서 낮은 pH와 각종 단백질 가수분해 효소로부터 독소를 보호하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다.

상기 독소는 세포 내에서 분자량이 약 150kDa인 하나의 폴리펩티드로 합성된 후, 세포내 단백질 분해 효소의 작용이나 트립신과 같은 인위적인 효소 처리에 의하여 N말단으로부터 1/3 되는 위치에서 절단되어 2개의 단위체인 경쇄(L: light chain)(분자량; 50 kDa) 및 중쇄(H: heavy chain)(분자량; 100kDa)로 나누어진다. 이렇게 나누어진 독소는 단일 폴리펩티드일 때에 비해 그 독성이 크게 증가한다. 두 단위체는 이황화결합에 의해 서로 연결되어 있으며, 각각은 다른 기능을 갖는다. 중쇄는 목표물(target)이 되는 세포의 수용체(receptor)와 결합하고(Park. M.K., et al ., FEMS Microbiol . Lett ., 72:243, 1990), 낮은 pH(pH4)에서 생체막과 반응하여 채널(channel)을 형성하는 기능을 가지며(Mantecucco, C. et al., TIBS ., 18:324, 1993), 경쇄는 약리활성를 가지고 있어 세제(detergent)를 사용하여 세포에 투과성을 부여하거나, 전기천공(electroporation) 등으로 세포 내 투입되었을 때 신경전달물질의 분비를 방해한다 (Poulain, B. et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA ., 85:4090, 1988).

상기 독소는 신경근육종말(neuromuscular junction)의 콜린성 전시냅스 (cholinergic presynapse)에서 아세틸콜린의 엑소시토시스(exocytosis)를 저해하여 전신 무력증을 일으킨다. 극미량의 독소를 처리해도 독성이 나타나는 것으로 보아 이 독소는 어떤 효소 활성을 가질 것으로 생각되어져 왔다 (Simpson, L. L. et al ., Ann . Rev . Pharmaeol . Toxicol ., 26:427, 1986).

최근에 밝혀진 바에 의하면, 독소는 메탈로펩티다제 활성(metallopeptidase activity)을 갖고 있으며 그 기질은 엑소시토시스 장치 복합체(exocytosis machinary complex)를 이루는 단위 단백질들인 시냅토브레빈(Synaptobrevin), 신택신(Syntaxin), 25KDa의 시냅토좀 연계 단백질(Synaptosomal associated protein of 25KDa) (SNAP25) 등이다. 각 형의 독소는 이 세 가지 단백질들 중 하나를 기질로 삼고 있는데, B, D, F 및 G형은 시냅토브레빈을, A와 E형은 SNAP25를, C형은 신택신을 특정 부위에서 절단하는 것으로 알려져 있다 (Binz, T. et al ., J. Biol . Chem ., 265:9153, 1994).

특히, 보툴리눔 독소 A 형은 pH 4.0~6.8의 묽은 수용액에 용해성인 것으로 알려져 있다. 약 7 이상의 pH에서 안정화 비-독소 단백질이 신경독소로부터 분리되어, 그 결과 독성이 점진적으로 손실되는데, 특히 pH 및 온도가 상승함에 따라 독성이 감소하는 것으로 알려져 있다.

상기 보툴리눔 독소는 소량으로 인체에 치명적이고 대량생산이 용이하므로 탄저균(Bacillus anthracis), 페스트(Yersinia pestis), 천연두(smallpox virus)와 더불어 4대 생물테러 무기로 사용될 수 있는 독소이다. 그러나, 상기 보툴리눔 독소(botulinum toxin) 중 A형 독소의 경우에는 전신적으로는 인체에 영향을 미치지 않는 용량 이하로 주사하면 상기 주사 부위의 국소 근육을 마비시킬 수 있는 것으로 밝혀졌는데, 이러한 특성을 이용하여 주름살 제거제, 경직성 편마비 및 뇌성마비의 치료제 등으로 광범위하게 사용할 수 있으므로, 수요가 급증하고 있으며 수요에 맞추어 보툴리눔 독소의 생산방법에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

현재 대표적으로 상용화되어 있는 제품은 미국 알러건(Allergan) 사의 BOTOX^®(보툴리눔 독소 A 형 정제된 신경독소 복합체)로, 각각의 BOTOX^®의 100 유닛 바이알은 약 5ng의 정제된 보툴리눔 독소 A 형 복합체, 0.5㎎ 인간 혈청 알부민, 및 0.9㎎ 염화나트륨으로 구성되고 진공-건조 형태로 제공되며, 보존제 없이(0.9% 염화나트륨 주입) 멸균 생리식염수를 이용하여 복원시킨다. 다른 상용화된 제품은 영국 Ipsen 사의 Dysport^®(보툴리눔 독소 약제학적 조성물 중에 락토오스 및 인간 혈청 알부민을 가지는 클로스트리디움 보툴리눔 A 형 독소 헤마글루티닌 복합체, 사용 전에 0.9% 염화나트륨를 이용하여 복원됨) 및 Solstice Neurosciences사의 MyoBloc™(보툴리눔 독소 B 형, 인간 혈청 알부민, 숙신산나트륨, 및 염화나트륨을 포함하는 약 pH 5.6 주사 용액) 등이 있다.

종래의 보툴리눔 독소의 제조를 위해서는 산 침전법, 염에 의한 석출법 및 크로마토그래피법 등이 이용되었다.

예를 들어, 일본공개특허 제1994-192296호에는 클로스트리듐 보툴리눔 세균을 배양한 다음 산침전, 추출, 핵산분해제 첨가 및 결정화단계를 거쳐 결정형(crystalline)의 보툴리눔 A형 독소를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 미국등록특허 제5696077호에는 클로스트리듐 보툴리눔 세균을 배양하고 이를 산침전, 추출, 이온교환 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피 및 결정화 단계를 거쳐 보툴리눔 B형 독소를 제조하는 방법이 개시되어 있다.

한편, Simpson 등은 중력 흐름 크로마토그래피를 사용한 보툴리눔 신경독소의 정제, HPLC, 친화성 수지를 사용한 포획 단계, 크기 배제 크로마토그래피, 및 두 가지의 상이한 이온 교환 컬럼의 사용을 포함하는 이온 (음이온 및 양이온) 교환 크로마토그래피를 사용하여 보툴리눔 A형 독소를 제조한바 있으며(Method in Enzymology , 165:76, 1988), Wang 등은 보툴리눔 독소 A 형을 정제하기 위한 침전과 이온 크로마토그래피방법을 사용하였다(Dermatol Las Faci Cosm Surg ., 2002:58, 2002).

또한, 미국등록특허 제6818409호에는 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 이온교환 및 락토오스 컬럼의 사용이 개시되어있고, 미국등록특허 제7452697호에는 이온교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피를 사용하여 보툴리눔 A형 독소를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 대한민국공개특허 제2009-0091501호에는 산 침전 및 음이온교환 크로마토그래피 방법을 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 방법이, 미국공개특허 제2013-0156756호는 음이온교환 크로마토그래피 및 양이온교환 크로마토그래피방법을 이용한 보툴리눔 독소의 정제방법이 개시되어 있다.

하지만, 기존 방법들에서의 음이온교환 크로마토그래피의 사용은 보툴리눔 독소의 겔 밴딩 패턴(gel banding pattern)에 유해한 영향을 미치며(미국등록특허 제7452697호), 정제기간이 길어 상업적으로 적용하기 등의 문제점이 남아있으며, 보툴리눔 독소 생산 균주인 클로스트리디움 보툴리눔은 혐기성 세균이므로 발효를 혐기성 시설 내에서 수행하여야 하기 때문에 대량생산이 어려운 문제점이 있으며, 상기 정제방법에 의하여 정제된 유효성분인 상기 보툴리눔 독소가 명확하게 분리 동정이 되지 않아 불순물이 포함되는 문제점이 있었다. 또한, 종래의 보툴리눔 독소의 제조방법은 고순도의 보툴리눔 독소를 정제하기 위해 여과 또는 투석 공정 등이 필수적으로 포함되어 정제 과정이 복잡하고 어려운 문제가 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 기존의 문제를 해결하기 위하여 노력한 결과, 보툴리눔 독소 생산 균주 배양액에 산을 처리하여 보툴리눔 독소를 산 침전시킨 다음, 형성된 침전물을 음이온교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하면, 여과(filtration), 투석(dialysis) 및 에탄올 침전(ethanol precipitation) 단계의 생략이 가능하여 보툴리눔 독소의 제조과정이 매우 용이하다는 점을 확인하였으며,

상기의 제조방법으로 순도 98% 이상의 보툴리눔 독소가 생산될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은

(a) 보툴리눔 독소 생산 균주 배양액에 산을 처리하여 보툴리눔 독소를 산 침전시키는 단계;

(b) 상기 침전된 보툴리눔 독소에 완충용액을 첨가한 후, 프로테아제 억제제(protease inhibitor) 및 핵산분해 효소를 처리하여 보툴리눔 독소를 추출하는 단계;

(c) 상기 추출된 보툴리눔 독소에 산을 처리하여 보툴리눔 독소를 산 침전시킨 다음 침전물을 완충용액에 용해시키는 단계; 및

(d) 음이온교환 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계; 를 포함하는 보툴리눔 독소의 제조방법을 제공한다 (도 1).

상기 방법을 통해 최종적으로 제조된 보툴리눔 독소는 냉동보관 및 동결건조 보관 등 다양한 방법에 따라 보관이 가능하다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계를 마친 후 (e) 보툴리눔 독소가 포함되어 있는 음이온교환 크로마토그래피 분획에 황산암모늄을 처리하여 침전시킨 다음, 침전물을 완충용액에 용해시키는 단계; 및 (f) 음이온교환 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 보툴리눔 독소 생산 균주는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)인 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 보툴리눔 독소 생산이 가능한 어떠한 균주라도 사용가능함은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.

본 발명의 '보툴리눔 독소'는 클로스트리디움 보툴리눔 균주에 의해 생성된 신경독소 뿐만 아니라 변형, 재조합, 하이브리드 및 키메라 보툴리눔 독소를 의미한다. 재조합 보툴리눔 독소는 비-클로스트리디움 종에 의하여 재조합으로 제조된 경쇄 및/또는 중쇄를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 '보툴리눔 독소'는 보툴리눔 독소 혈청형 A, B, C, D, E, F 및 G를 포괄하며, 보툴리눔 독소 복합체(즉 300, 600 및 900 kDa 복합체) 뿐만 아니라 순수 보툴리눔 독소(즉 약 150 kDa 신경독성 분자) 두 가지 모두를 포괄하고, 이들 모두 본 발명의 실시에서 유용하다.

본 발명의 '제조된 보툴리눔 독소'는 보툴리눔 독소가 배양 또는 발효 공정으로부터 수득될 때 보툴리눔 독소에 동반할 수 있는 다른 단백질 및 불순물로부터 분리되거나 실질적으로 분리된 순수 보툴리눔 독소 또는 보툴리눔 독소 복합체를 의미한다. 따라서, 제조된 보툴리눔 독소는 최소한 90%, 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 순도를 가지며, 특히 바람직하게는 본 발명에 있어서, 제조된 보툴리눔 독소는 순도 98% 이상의 보툴리눔 독소 A형 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.

보툴리눔 독소를 제조하기 위한 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양은 당업계에 공지된 통상의 방법을 사용하여 이루어질 수 있으며, 배양을 위해 사용될 수 있는 통상적인 배지를 이용하여 배양이 가능하다.

비제한적인 예로서, 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양을 위한 배지에는 카제인가수분해물(Casein hydrolysate), 효모추출물(Yeast extract), 글루코오스(Glucose) 등이 포함될 수 있으며, 25 내지 40℃의 온도에서 90 내지 180시간, 바람직하게는 100 내지 150시간 배양한다.

상기 (a) 단계에서의 산 침전 단계는 배양을 종료한 뒤 pH 센서를 이용하여 pH가 3.0 내지 4.5, 바람직하게는 3.3 내지 4.0, 가장 바람직하게는 3.4 내지 3.6이 되도록 산, 바람직하게는 황산 또는 염산을 첨가함으로써 이루어질 수 있다.

(a) 단계에 따른 산 침전 단계는 보툴리눔 균을 배양한 뒤 남아있는 균을 모두 사멸시키며 많은 종류의 단백질 용액에 산을 가함으로써 pH를 저하시켜 단백질이 등전점에 이르게 되어 침전되는 원리를 이용한 것이다. 넓은 의미에서 결정화도 포함되며, 순수하게 정제하는데 중점을 둔 결정화에 비하여 침전법은 혼합된 상태에서 목적물을 거칠게 분리하는 방법이다. 보통 침전법은 목적 물질과 구조적으로 유사한 불순물이 함께 침전된다. 이때, pH를 약 3.0 내지 4.5로 조절하며, 상기 보툴리눔 독소의 회수율은 pH가 낮을수록 높아지나 pH가 3.0 이하로 되는 경우 상기 보툴리눔 독소 자체에 영향을 미치며, pH가 4.5 이상이 되는 경우 상기 보툴리눔 독소의 회수율이 낮아지므로 상기 범위 내에서 이루어짐이 바람직하다.

특히, pH가 3.4 내지 3.6 일 때 상기 보툴리눔 독소의 회수율이 가장 높으므로 가장 바람직하다. 보툴리눔 균 배양액에 산을 서서히 가한 다음 pH가 적합한 범위에 도달하면 더 이상의 pH 변화를 나타내지 않을 때까지 첨가한 후 상온에서 15시간 내지 30시간 동안 방치한 다음 상등액을 제거한다.

상기 (b) 단계에 따른 보툴리눔 독소 추출 단계는 (a) 단계에서 얻은 독소를 인산완충액, 바람직하게는 소듐 인산완충액(sodium phosphate buffer)을 가하여 용해하고 침전을 제거하는 단계를 포함하는데, 이때, 인산완충액의 pH는 약 4.0 내지 약 7.0이 바람직하며, 염기, 바람직하게는 수산화나트륨(NaOH)를 첨가하여 최종 pH를 4.5 내지 6.5, 바람직하게는 5.0 내지 6.0으로 조절하고, 독소 추출을 상기 pH 범위에서 수행할 수 있다.

또한, 상기 (b) 단계에서의 핵산분해 효소는 DNase 및 RNase인 것을 특징으로 할 수 있으며, 프로테아제 억제제(protease inhibitor)는 벤자미딘 염산(benzamidine HCl)를 사용하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에 공지된 단백질 분해효소 활성을 억제할 수 있는 어떠한 물질이라도 사용가능하다.

(b) 단계에 따른 보툴리눔 독소 추출 단계에서의 핵산분해 효소 처리를 통해 (a) 단계에서 산에 의하여 침전된 침전물에 포함된 DNA, RNA 등의 불순물 분해가 가능하다. 효소처리 단계는 1.5시간 이하로 하면 DNA, RNA의 분해가 불충분하게 일어날 수 있으므로, 1.5 내지 7 시간, 바람직하게는 3 내지 6시간 동안 수행하는 것이 바람직하며, DNase 및 RNase는 0.05 내지 1.0 g/ℓ, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 g/ℓ의 농도로 첨가되는 것이 바람직하다.

상기 효소처리를 통해 수득된 추출액에는 보툴리눔 독소와 상기 보툴리눔 독소와 유사한 극성을 가지는 단백질이 포함되어 있으므로 상기 단백질을 염산으로 침전시키는 염산침전단계를 거쳐야 한다. 구체적으로는 상기 (c) 단계에 따른 염산 침전 단계는 효소처리된 추출액을 원심분리하여 수득한 상등액에 염산(HCl)을 첨가하여 pH 2.5 내지 4.5, 바람직하게는 pH 3.0 내지 4.0이 되도록 조절한 후, 4℃ 저온냉장고에서 염산침전 과정을 수행하는 것이 바람직하다. 특히, 상기 염산침전단계에서의 pH는 독소의 활성과 회수율을 높게 유지하기 위해 pH를 3.3 내지 3.8로 조절하는 것이 가장 바람직한데, 상기 pH 범위 내에서 염산 침전 단계가 수행되는 경우 보툴리눔 독소가 90% 이상으로 역가가 높으며, 단백질의 엉김 현상이 현저히 줄어드는 효과가 있다. 이후 상기 염산 침전물을 완충용액에 용해시키고, 다음 단계를 수행할 수 있다.

가장 중요한 단계인 상기 (d) 단계는 염산침전과정 완료 후 보툴리눔 독소 A형을 제외한 대부분의 주요 불순물을 제거하기 위하여 음이온교환수지를 이용하여 크로마토그래피를 수행하는 것으로, 음이온교환수지로는 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 사차 암모니움(Quaternary ammonium, Q)기들로 치환된 것들을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 미국특허 제5,696,077호, 국제특허공개 제WO96/05222 및 미국특허 제5,846,929호에 기재된 바와 같은 DEAE-Sephadex를 사용할 수 있다. 바람직하게는 강염기성의 사차 암모니움기를 가지는 그룹이나 또는 약염기성의 디에틸아미노에틸(DEAE) 그룹을 가지는 음이온 교환수지 중에서 어느 하나를 선택하여 사용한다.

예를 들면, 강염기성의 음이온교환 그룹으로는 Q Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, Resource Q, Source 15Q, Source 30Q, Mono Q, Mini Q, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q HyperCel, Q Cermic HyperD F, Nuvia Q, UNOsphere Q, Macro-Prep High Q, Macro-Prep 25 Q, Fractogel EMD TMAE(S), Fractogel EMD TMAE Hicap (M), Fractogel EMD TMAE (M), Eshmono Q, Toyopearl QAE-550C, Toyopearl SuperQ-650C, Toyopearl GigaCap Q-650M, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl SuperQ-650M, Toyopearl SuperQ-650S, TSKgel SuperQ-5PW (30), TSKgel SuperQ-5PW (20), TSKgel SuperQ-5PW 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에 공지된 음이온교환수지를 사용할 수 있다.

컬럼 완충액으로는 인산나트륨 완충액, 구연산 완충액을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 인산나트륨 완충액을 사용한다. 컬럼 완충액의 농도는 30mM 내지 70 mM로 조절하며, 바람직하게는 약 40 내지 60mM로 조절한다. 컬럼 완충액의 pH는 약 3.5 내지 7.5가 되도록 조절하며, 이동상의 유속은 0.5㎖/분 내지 5.0㎖/분으로 조절하며, 바람직하게는, 1.0 내지 3.0㎖/분으로 조절한다. 이때, 완충액의 전도도는 3 내지 30mS/cm로 맞추고 컬럼의 평형화가 끝나면 시료를 주입한다. 독소는 Flow through로 용출되며 대부분의 주요 불순물은 흡착된다. 즉, 상기 (d) 단계에 따른 음이온교환 크로마토그래피를 이용한 정제 단계에서 보툴리눔 독소 A형 단백질은 음이온교환수지에 흡착되지 않고 대부분의 주요 불순물은 흡착되어 제거된다.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 pH 3.5 내지 7.5, 바람직하게는 pH 4.5 내지 7.0, 전도도(conductivity)는 3 내지 30mS/cm, 바람직하게는 5 내지 20 mS/cm의 조건에서 수행되는 것이 바람직하다.

이후, (d) 단계의 음이온교환 크로마토그래피과정에서 완전히 제거되지 않고 남아있는 여분의 불순물을 제거하기 위해 필요한 경우 (e) 보툴리눔 독소가 포함되어 있는 음이온교환 크로마토그래피 분획에 황산암모늄((NH₄)₂SO₄)을 처리하여 침전시킨 다음, 침전물을 완충용액에 용해시키는 단계; 및 (f) 2차 음이온교환 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계를 추가로 포함시켜 보툴리눔 독소를 제조할 수 있다.

상기 (e) 단계에서 보툴리눔 독소가 포함되어 있는 음이온교환 크로마토그래피 분획에 황산암모늄을 처리하여 침전시킨 다음, 침전물을 완충용액에 용해시켰다. 상기 황산암모늄 침전단계는 염석 과정에 해당하는 것으로, 상기 염석은 물에 잘 용해하는 염(황산암모늄 등)을 단백질 혼합액에 가하여 이온 강도를 증가시켜 단백질을 침전시키는 것이다. 만약 목적으로 하는 단백질이 황산암모늄 30%(w/v) 포화 때 주로 침전하는 것을 알면 미리 30%(w/v) 포화 이하의 황산암모늄 농도로 목적 이외의 단백질을 침전시켜 제거하고 다음에 30%(w/v) 포화가 되도록 황산암모늄을 가하여 목적하는 단백질을 침전시키고 이것을 원심분리로 모을 수 있다. 염석 조작은 정제의 초기 수단으로 흔히 이용된다. 이때 사용되는 황산암모늄 용액은 10 내지 50% (w/v), 바람직하게는 20 내지 40% (w/v) 농도의 용액을 사용할 수 있다.

이후, 상기 (f) 단계에서 음이온교환 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제할 수 있다. 본 발명에 따른 고순도의 보툴리눔 독소의 정제는 (d) 단계의 음이온교환 크로마토그래피(1차 음이온교환 크로마토크래피)에서 대부분 이루어지며, (f) 단계의 음이온교환 크로마토그래피(2차 음이온교환 크로마토크래피)는 완전히 제거되지 않고 남아있는 여분의 불순물을 제거하기 위해 실시하는 것으로, (f) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 (d) 단계의 음이온교환 크로마토그래피와 동일한 방법으로 수행할 수 있다.

상기 정제 방법을 통해 얻어진 보툴리눔 독소 A형 단백질이 포함되어 있는 최종 분획을 제균 여과하여 원액을 제조할 수 있다. 제조된 원액은 사용시까지 동결보관할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 본 발명의 방법으로 제조된 보툴리눔 독소에 관한 것이다. HPLC를 이용한 정제된 보툴리눔 독소의 순도를 확인한 결과, 1차 음이온교환 크로마토그래피를 수행한 후의 보툴리눔 독소의 순도는 98.38%로(도 2), 1차 음이온교환 크로마토그래피 단계에서 대부분의 독소가 제거되어 알러건(Allergan) 사의 BOTOX^®(순도 약 95%)보다 순도가 높은 것을 확인할 수 있었으며, 2차 음이온교환 크로마토그래피를 수행한 후의 보툴리눔 독소의 순도는 98.99%인 것을 확인하였다 (도 3).

또한, 본 발명의 보툴리눔 독소의 제조방법은 여과(filtration), 투석(dialysis) 및 에탄올 침전(ethanol precipitation) 단계의 생략이 가능하여 보툴리눔 독소의 제조과정이 쉽고 간단하다는 장점이 있으며, 특히, 알러건(Allergan) 사의 BOTOX^®(미국공개특허 제2012-0156756호; Non-APF 방식)에 비해 2번의 여과(filtration) 단계 및 에탄올 침전(ethanol precipitation) 단계의 생략을 통해 정제 단계가 축소되어(5단계 -> 3단계), 보툴리눔 독소 원액 생산기간(4주 -> 2주)을 단축시킬 수 있다는 장점을 가진다.

본 발명의 또 다른 실시예에서 본 발명의 방법으로 제조된 보툴리눔 독소 A형 단백질(DWP450)의 안전성을 확인하기 위하여, 알러건(Allergan) 사의 BOTOX^®와 안전성을 비교하는 실험을 수행한 결과, 본 발명의 방법에 의해 제조된 보툴리눔 독소(DWP450)는 암컷에 대하여 60 U/kg의 NOAEL 값을 나타내 알러건(Allergan) 사 보톡스의 30 U/kg에 비하여 2배 이상 안전한 것으로 나타났으며, 이는 본 발명의 방법으로 제조된 보툴리눔 독소의 경우 순도가 높아 국소작용력이 증대되어 부작용으로 나타날 수 있는 보툴리눔 독소의 전신순환성이 낮아져 안전성이 2배 높게 나타난 것으로 볼 수 있다.

본 발명의 방법으로 제조된 보툴리눔 독소는 약학적 조성물의 유효성분이 된다. 상기 보툴리눔 독소는 활동 항진성 골격근을 특징으로 하는 신경근육 장애의 치료를 위하여 사용될 수 있다. 또한, 두통, 편두통, 긴장성 두통, 부비동 두퉁, 경추성 두통, 발한 장애, 겨드랑이 다한증, 손 다한증, 발 다한증, 프레이 증후군, 과운동성 피부 주름(hyperkinetic skin line), 안면 주름, 미간 주름, 눈가 주름, 입가 주름, 코입술 주름, 피부 장애, 이완불능증, 사시, 만성 치열, 안검경련, 근골격 통증, 섬유근통, 췌장염, 빈맥, 전립선 비대, 전립선염, 요폐, 요실금, 과민성 방광, 반측안면 경련, 떨림, 근경련, 위장관 장애, 당뇨병, 타액과다증, 배뇨근-조임근 협동장애, 뇌졸중 후 강직, 상처 회복, 소아 뇌성마비, 평활근 경련, 재협착, 국소 근긴장이상, 간질, 경부 근긴장이상증, 갑상선 장애, 고칼슘혈증, 강박 장애, 관절염 통증, 레이노 증후군, 튼살, 복막 유착, 혈관경련, 콧물, 근육 경축, 부상 근유, 후두 근긴장이상, 필기 경련 및 수근관 증후군 등 다양하게 사용될 수 있다.

본 발명의 '약학적 조성물'은 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 제제를 의미하며, '제제(formulation)'는 약학적 조성물에 보툴리눔 신경독소 활성 성분 이외에 최소한 한가지 이상의 추가적인 성분(부형제)이 포함될 수 있다. 상기 추가적인 성분은 알부민, 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 혈청 알부민, 젤라틴, 수크로오스, 트레할로오스, 하이드록시에틸 녹말, 콜라겐, 락토오스, 수크로오스 염화나트륨, 폴리사카라이드, 카프릴레이트, 폴리비닐피롤리돈 및 나트륨으로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 약학적 제제는 추가적인 성분(부형제)와 조합하는 단계를 포함하고, 조합단계는 냉동건조(freeze drying), 동결건조(lyophilization) 및 진공건조(vacuum drying)로 이루어진 공정의 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

그러므로 약학적 조성물은 인간 환자와 같은 대상에게 진단, 치료 또는 미용을 위하여(예를 들어 근육내 또는 피하 주사에 의하여 또는 데포(depot) 또는 임플란트의 삽입에 의하여) 투여하기 적절한 제제이다. 약학적 조성물은 예를 들어 동결건조되거나 진공건조된 상태, 동결건조되거나 진공건조된 약제학적 조성물을 식염수 또는 물로써 복원한 후 형성된 용액 또는; 복원을 필요로 하지 않는 용액일 수 있다. 활성 성분은 보툴리눔 독소 혈청형 A, B, C1, D, E, F 또는 G 중 하나 또는 클로스트리디움 박테리아에 의하여 천연으로 제조될 수 있는 모든 보툴리눔 독소일 수 있다. 언급된 바와 같이, 약제학적 조성물은 액체 또는 고체일 수 있고, 예를 들어 진공-건조될 수 있다. 보툴리눔 독소 활성 성분 약학적 조성물을 제제화하기 위한 대표적인 방법은 2002년 11월 5일에 공개된 미국 특허 공개공보 제2003-0118598호에 개시되어 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명의 방법으로 제조된 보툴리눔 독소 A형 단백질(DWP450)의 효능을 확인하기 위해서, 복합 근활동전위(compound muscle action potential: CMAP) 진폭 및 전도 속도(conduction velocities; tC)를 측정하였다. 두 개의 서로 다른 보툴리눔 독소 A형 단백질인 BTX-A-1(BOTOX^®, Allergan Inc. (California, USA))과 실시예 2에서 제조된 BTX-A-2(DWP450)를 사용하여 4개의 그룹으로 나누어 실험을 수행하였다. 그룹 1은 0.08㎖의 염화나트륨(sodium chloride; NaCl)을 하나의 TA 근육에 투여하였으며, 다른 쪽의 TA 근육에는 아무것도 투여하지 않았으며, 그룹 2는 0.02㎖의 BTX-A-1(두 개의 유닛)을 하나의 TA 근육에 투여하였으며, 다른 쪽의 TA 근육에는 0.02㎖의 BTX-A-2(두 개의 유닛)를 투여하였다. 그룹 3은 0.04㎖의 BTX-A-1(네 개의 유닛)을 하나의 TA 근육에 투여하였으며, 다른 쪽의 TA 근육에는 0.04㎖의 BTX-A-2(네 개의 유닛)를 투여하였으며, 그룹 4는 0.08㎖의 BTX-A-1(여덟 개의 유닛)을 하나의 TA 근육에 투여하였으며, 다른 쪽의 TA 근육에는 0.08㎖의 BTX-A-2(여덟 개의 유닛)를 투여하였다.

보툴리눔 독소의 1 유닛(unit)은 각각 약 18-20 그램으로 계량되는 암컷 스위스 웹스터 마우스에게 복강내 주사 시의 LD₅₀으로 정의되며, 보툴리눔 독소의 1 유닛은 암컷 스위스 웹스터 마우스 그룹의 50%를 죽이는 보툴리눔 독소의 양이다.

BTX-A-1 및 BTX-A-2의 투여에 따른 복합 근활동전위를 측정한 결과, 2㎐의 느린 자극 속도에서, BTX-A-1 및 BTX-A-2를 투여한 그룹은 투여 3일, 1주, 2주, 3주 및 4주 후에 TA근육(dY)의 마비효과를 관찰하였으며(도 4A), 20㎐의 빠른 자극 속도에서도 BTX-A-1 및 BTX-A-2를 투여한 그룹 모두 투여 3일, 1주, 2주, 3주 및 4주 후에 TA근육(dY)의 마비효과를 관찰하였다 (도 4B). 2㎐의 느린 자극 속도 및 20㎐의 빠른 자극 속도에서 BTX-A-1와 BTX-A-2 간에 유의적 차이(p < 0.05)가 없는 것을 확인하였으며, BTX-A-1 및 BTX-A-2 투여 군 모두 TA 근육에 마비 효과는 투여한 보툴리눔 독소의 용량과 관련이 있는 것을 확인하였다.

BTX-A-1 및 BTX-A-2의 투여에 따른 전도 속도(tC)를 측정한 결과, BTX-A-1와 BTX-A-2를 투여한 그룹 모두, 2㎐의 느린 자극 속도 및 20㎐의 빠른 자극 속도에서 전도 속도의 지연을 유발시키지 않는 것을 확인하였다 (도 5).

즉, 본 발명의 방법을 제조된 보툴리눔 독소는 이미 상업적으로 판매되고 있는 알러건(Allergan) 사의 BOTOX^®와 비슷한 효과를 가지고 있으며, 순도가 높아 보툴리눔 독소의 전신순환성이 낮아져 안전성이 2배 높으므로, 신경근육 장애의 치료, 주름살 제거제, 경직성 편마비 및 뇌성마비의 치료제 등 다양하게 이용될 수 있는 것을 확인하였다.

본 발명에 따른 보툴리눔 독소의 제조방법을 이용하면, 간단한 공정으로 고순도의 보툴리눔 독소를 제조할 수 있으므로 매우 경제적이고 효율적이며, 본 발명의 방법으로 제조된 보툴리눔 독소는 기존의 방법으로 생산된 보툴리눔 독소에 비해 순도가 높아 국소작용력이 증가하므로 부작용으로 나타날 수 있는 보툴리눔 독소의 전신순환성이 낮아져 안전성이 증가하는 장점이 있어, 신경근육 장애의 치료, 주름살 제거제, 경직성 편마비 및 뇌성마비의 치료제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 보툴리눔 독소의 제조과정을 나타낸 모식도.
도 2는 1차 음이온교환 크로마토그래피 정제 단계 후 보툴리눔 독소의 순도를 측정한 결과.
도 3은 2차 음이온교환 크로마토그래피 정제 단계 후 보툴리눔 독소의 순도를 측정한 결과.
도 4는 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 보툴리눔 독소와 알러건(Allergan) 사의 BOTOX^® 처리에 따른 복합 근활동전위 진폭의 증감정도를 측정한 결과.
(N: no injection; S: saline injection; B2: BTX-A-1, two units; D2: BTX-A-2, two units; B4: BTX-A-1, four units; D4: BTX-A-2, four units; B8: BTX-A-1, eight units; D8: BTX-A-2, eight units).
도 5는 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 보툴리눔 독소와 알러건(Allergan) 사의 BOTOX^® 처리에 따른 전도 속도(conduction velocities)를 측정한 결과.
(N: no injection; S: saline injection; B2: BTX-A-1, two units; D2: BTX-A-2, two units; B4: BTX-A-1, four units; D4: BTX-A-2, four units; B8: BTX-A-1, eight units; D8: BTX-A-2, eight units).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양

1-1 : 배양에 사용한 배지의 조성

보툴리눔 독소의 생산을 위한 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 종 배양 및 본 배양은 2% 카제인가수분해물(Casein hydrolysate), 1% 효모추출물(Yeast extract), 1% 글루코오스(Glucose) 및 0.5% 티오글리콜산염배지(Thioglycollate medium)의 조성을 가지는 배지를 사용하였다.

1-2 : 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 종 배양(seed culture)

실시예 1-1의 배지 조성을 가진 10㎖의 멸균된 배지가 들어있는 culture tube에 20㎕의 클로스트리디움 보툴리눔(질병관리본부 관리번호: 4-029-CBB-IS-001)을 접종하여 35℃에서 혐기적 조건으로 (22~30시간) 1차 종 배양(정치 배양)을 하였다. 1차 종 배양에서 균주의 성장이 확인되면 같은 배지 조성을 가진 800㎖의 멸균된 배지가 들어있는 1ℓ culture bottle에 8㎖의 1차 종 배양액을 접종하여 35℃에서 혐기적 조건으로 (8~15시간) 2차 종 배양(정치 배양)을 하였다.

1-3 : 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 본 배양

클로스트리디움 보툴리눔 균주를 배양하여 보툴리눔 독소를 생산하기 위해 본 배양을 실시하였으며, 실시예 1-1의 조성으로 배지 9.3ℓ를 조제하고, 10ℓ 배양기에 넣은 후, 배지 멸균을 실시하였다. 혐기적 조건은 질소를 공급하여 만들었으며, 온도는 35℃, 교반속도는 50rpm으로 설정하여 성장환경을 유지시켰다.

실시예 1-2에서 2차 종 배양을 완료한 1ℓ culture bottle을 10ℓ 배양기의 접종 포트와 연결된 접종 라인(line)을 통하여 10 ℓ 배양기에 접종하였다. 10ℓ 배양기에서의 클로스트리디움 보툴리눔 균주는 35℃, 50rpm 조건으로 배양되었으며, 배양이 진행되는 동안 배양설정조건으로 유지되는지 확인하고 기록하였다. 100시간 이상 배양되었을 때 본 배양을 종료하였다.

보툴리눔 독소의 제조

2-1 : 황산 침전 단계

황산 침전 단계는 보툴리눔 균을 배양한 뒤 남아있는 균을 모두 사멸시키며 많은 종류의 단백질이 포함된 배양액에 황산을 첨가함으로써 pH를 저하시켜 단백질이 등전점에 이르게 되어 침전시키는 단백질을 분리하는 방법으로, 실시예 1-3의 방법으로 본 배양을 실시하고, 배양이 완료되면 10ℓ 배양기의 pH 센서를 이용하여 pH 3.4 내지 3.6가 되도록 5N 황산을 자동 펌프(pump)로 첨가한 다음, 배양기의 수확 라인(harvest line)을 통하여 20ℓ 용기(AS ONE, Cat. No AS5.372.06)로 배양액을 이동시키고 황산 침전액이 들어있는 20ℓ 용기를 바로 생물안전작업대(BSC)로 옮겨 BSC 내에서 황산 침전을 실시하였다.

2-2 : 효소처리 및 독소 추출

상기 황산 침전물에서 상등액을 제거하고 pH 5.3의 1M 인산나트륨(sodium phosphate) 버퍼 700㎖을 첨가하였다. 그 다음, 5N 수산화나트륨(NaOH)를 이용하여 pH를 5.0 내지 6.0으로 조절하였으며, 침전물에 남아있는 DNA 및 RNA를 제거하기 위해 0.4M 벤자미딘 염산(benzamidine HCl) 60㎖, DNase 1g, RNase 1g을 첨가하고 보툴리눔 독소를 추출하기 위해 약 5시간 동안 반응시켰다.

2-3 : 염산 침전 및 독소용해

상기 독소 추출 배양액을 4℃, 12000 x ｇ에서 15분 동안 원심분리하여 펠렛(pellet)과 상등액을 분리하였으며, 분리된 상등액을 새로운 10ℓ 병(AS ONE, Cat. No AS5.372.04)에 옮긴 후, 1N 염산(HCl)을 첨가하여 pH 3.4 내지 3.6가 되도록 4℃ 저온냉장고에서 염산침전 과정을 수행하였다. 염산침전액을 4℃, 12000 x ｇ에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 제거한 다음, 독소침전물(pellet)에 pH 6.5의 50mM 인산나트륨(sodium phosphate) 버퍼 50㎖을 첨가하여 독소를 용해시켰다.

2-4 : 1차 음이온교환 크로마토그래피

침전과정 완료 후 보툴리눔 독소 A형을 제외한 대부분의 주요 불순물을 제거하기 위하여 이온교환수지를 이용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 음이온교환수지(Toyopearl SuperQ-650M, Tosoh Bioscience, P/N 17228)를 컬럼에 충진한 후, 상기 2-3 단계에서 침전시킨 시료를 주입하였으며, 50mM 인산나트륨 용출 완충용액으로 독소를 용출하였다. 1차 정제 단계에서 보툴리눔 독소 A형 단백질은 음이온교환수지에 흡착되지 않고 대부분의 주요 불순물은 흡착되어 제거되며, 이때 고순도 보툴리눔 독소의 정제를 위해 pH는 4.5 내지 7.0, 전도도(conductivity)는 5 내지 20mS/cm가 유지되도록 하였다.

2-5 : 황산암모늄 침전

음이온교환 크로마토그래피를 이용하여 정제된 보툴리눔 독소 A형 단백질이 포함되어 있는 분획을 모아 20 내지 40%(w/v)으로 황산암모늄(ammonium sulfate)을 첨가하여 보툴리눔 독소 A형 단백질을 다시 침전시켰으며, 침전된 보툴리눔 독소 A 형 단백질은 pH 6.5의 50mM 인산나트륨(sodium phosphate) 버퍼에 재용해하였다.

2-6 : 2차 음이온교환 크로마토그래피

황산 암모늄 침전과정 완료 후 보툴리눔 독소 A형을 제외한 소수의 불순물을 제거하기 위하여 이온교환수지를 이용한 크로마토그래피를 한번 더 수행하였다. 음이온교환수지(Toyopearl SuperQ-650M, Tosoh Bioscience, P/N 17228)를 컬럼에 충진한 후, 상기 2-5 단계에서 재용해한 황산암모늄 침전물을 주입하였으며, 50mM 인산나트륨 용출 완충용액으로 독소를 용출하였다. 이때, 보툴리눔 독소 A형 단백질은 흡착되지 않고 소수의 불순물은 흡착되어 제거된다.

고순도의 보툴리눔 독소로의 정제는 정제 1차 음이온교환 크로마토그래피 단계에서 대부분 이루어지며, 2차 음이온교환 크로마토그래피를 이용한 정제단계는 남아있는 여분의 불순물을 제거하기 위해 실시하는 것이다. 이때, 고순도 보툴리눔 독소의 정제를 위해 pH는 4.5 내지 7.0, 전도도(conductivity)는 5 내지 20mS/cm가 유지되도록 하였다.

2-7 : 원액제조

상기 2-6 단계의 음이온교환 크로마토그래피를 이용하여 정제된 보툴리눔 독소 A형 단백질이 포함되어 있는 분획을 모아, 0.2㎛ 제균 여과하여 원액을 제조하였으며, 제조된 원액은 -70℃ 이하에 보관하였다. 제조된 보툴리눔 독소 A형 단백질은 DWP450으로 명명하였다.

정제된 보툴리눔 독소의 순도 확인

HPLC(Waters사 e2695)는 SEC(size exclusion chromatography)방법으로 수행하였다. 이동상은 pH6.5의 100 mM 인산나트륨 용액을 사용하였으며, P/N 08542에 대한 가드컬럼(Tosoh Bioscience사, P/N 08543)에 TSKgel G4000SW_XL(Tosoh Bioscience사, P/N 08542) 컬럼을 연결하고 보툴리눔 A형 독소단백질 20 ㎍을 로딩(loading)하여 1 mL/min으로 30분간 흘려주었다. 그 결과, 1차 음이온교환 크로마토그래피를 수행한 후의 보툴리눔 독소의 순도는 98.38%로(도 2), 2차 음이온교환 크로마토그래피를 수행한 후의 보툴리눔 독소의 순도는 98.99%인 것을 확인하였다 (도 3).

정제된 보툴리눔 독소의 안전성 확인

실시예 2에서 정제된 보툴리눔 독소 A형 단백질(DWP450)의 안전성을 확인하기 위해여, 알러건(Allergan) 사의 BOTOX^®와 안전성을 비교하는 실험을 수행하였다.

SD(Sprauge-Dawley)종 흰쥐를 이용하여 군구성은 시험물질(DWP450) 30, 60U/kg 및 대조물질(알러건사의 BOTOX^®) 30, 60U/kg의 4개의 용량과 대조군(생리식염주사액)의 5군으로 하고, 군당 암수 각각 10마리씩, 1회/1주, 총5회, 5주간 근육 투여하였다. 시험물질(DWP450) 60U/kg 및 대조물질(BOTOX^®) 60U/kg 투여군에는 암수 각 5마리씩 추가하여 독성의 가역성을 평가하기 위해 12주간의 회복기간을 두어 비교반복 독성 시험을 수행하였다 (표 1).

정제된 보툴리눔 독소의 안전성 확인

Test	Species	Dosage (Units/kg)	NOAEL/MLD (Units/kg)
			DWP450	알러건
Comparative toxicity	SD rat	0, 30, 60	Male: <30 Female: 60	Male: <30 Female: 30

결과적으로 본 발명의 보툴리눔 독소(DWP450)는 암컷에 대하여 60 U/kg의 NOAEL 값을 나타내 알러건(Allergan) 사 보톡스의 30 U/kg에 비하여 2배 이상 안전한 것으로 나타났으며, 이는 본 발명의 보툴리눔 독소의 경우 순도가 높아 국소작용력이 증대되어 부작용으로 나타날 수 있는 보툴리눔 독소의 전신순환성이 낮아져 안전성이 2배 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다.

정제된 보툴리눔 독소의 효능 확인

실시예 2에서 정제된 보툴리눔 독소 A형 단백질(DWP450)의 효능을 확인하기 위해서, 복합 근활동전위(compound muscle action potential: CMAP) 진폭 및 전도속도(conduction velocities; tC)를 측정하였다.

SD(Sprague-Dawley)종 흰쥐 수컷 24마리를 임의로 6 마리씩 4개 군으로 나누어 실험을 진행하였다. 두 개의 서로 다른 보툴리눔 독소 A형 단백질인 BTX-A-1(BOTOX^®, Allergan Inc. (California, USA))과 실시예 2에서 정제된 BTX-A-2(DWP450)를 사용하였다. 이 두 제제는 표 2에 나타낸 봐와 같이 특성이 거의 동일하며, 모든 과정에서 보툴리눔 독소는 0.9 % 생리 식염수로 희석하여 사용하였다. 렛트(rat)에 10㎎/㎏의 케타민 하이드로클로라이드(Ketamine hydrochloride)를 복강주사(i.p. injection)하여 마취시킨 다음, BTX-A-1 및 BTX-A-2를 렛트의 전경골근(tibialis anterior; TA) 근육에 투여하였다.

BTX-A-1 및 BTX-A-2 특성 비교

	BTX-A-1(Allergan)	BTX-A-2
Clostridium botulinum strain	Wild-type hall	Wild-type hall
Serotype	Botulinum toxin type A	Botulinum toxin type A
Complex molecular weight (kDa)	900	900
Package (units/vial)	100	100
Excipients - Stabilizer	Human serum albumin	Human serum albumin
Excipients - Isotonic agent	sodium chloride	sodium chloride
Form	Vacuum dried	Lyophilized
Storage condition (℃)	2 - 8	2 - 8
Shelf life (months)	36	36 (ongoing)
pH	6.0 ± 0.5	6.0 ± 0.5

그룹 1은 0.08㎖의 염화나트륨(sodium chloride; NaCl)을 하나의 TA 근육에 투여하였으며, 다른 쪽의 TA 근육에는 아무것도 투여하지 않았으며, 그룹 2는 0.02㎖의 BTX-A-1(두 개의 유닛)을 하나의 TA 근육에 투여하였으며, 다른 쪽의 TA 근육에는 0.02㎖의 BTX-A-2(두 개의 유닛)를 투여하였다. 그룹 3은 0.04㎖의 BTX-A-1(네 개의 유닛)을 하나의 TA 근육에 투여하였으며, 다른 쪽의 TA 근육에는 0.04㎖의 BTX-A-2(네 개의 유닛)를 투여하였으며, 그룹 4는 0.08㎖의 BTX-A-1(여덟 개의 유닛)을 하나의 TA 근육에 투여하였으며, 다른 쪽의 TA 근육에는 0.08㎖의 BTX-A-2(여덟 개의 유닛)를 투여하였다.

CMAP 및 전도속도(conduction velocity)의 지연정도는 CyberAmp380과 Digidata1320((Axon Instruments. Inc, 미국)을 이용하여 측정하였으며, 사용된 전극은 악어입 클립(alligator clip)을 이용하여 피부에 부착시켰으며, 음극은 슬와(popliteal)근에 양극은 치골후극(retropubic space) 및 대퇴골의 대전자(greater trochanter of femur)에 부착시켰다. 기록전극은 앞정강근의 근복(belly muscle of the tibia anterior muscle), 레퍼런스 기록전극(reference recording electrode)은 왼쪽 뒷다리 힘줄(left hind calcaneal tendon) 및 발바닥에 부착하였다.

전기자극은 1 내지 5㎃로 하여 2㎐의 느린 자극 속도 및 20㎐의 빠른 자극 속도를 적용하였다. TA 근육의 마비 효과는 CMAPs(dY)의 피크 투 피크(peak to peak) 진폭을 측정하여 결정되었으며, 전도 속도(tC)의 지연은 자극 점과 네거티브 한 피크 시점 사이의 시간 간격을 측정하여 결정하였다.

상기 전기 자극에 의한 분석은 BTX-A-1 및 BTX-A-2의 투여 전과, 투여 3일, 1주, 2주, 3주 및 4주 후에 각각 측정하였으며, BTX-A-1 및 BTX-A-2 투여에 의한 CMAP 및 전도속도(conduction velocity)는 SAS(Version 9.2, SAS Institute Inc., 미국)을 사용하여 분산 편도 분석(ANOVA)으로 분석하였다.

그 결과, 2㎐의 느린 자극 속도에서, BTX-A-1 및 BTX-A-2를 투여한 그룹은 투여 3일, 1주, 2주, 3주 및 4주 후에 TA근육(dY)의 마비효과를 관찰하였으며(도 4A), 20㎐의 빠른 자극 속도에서도 BTX-A-1 및 BTX-A-2를 투여한 그룹 모두 투여 3일, 1주, 2주, 3주 및 4주 후에 TA근육(dY)의 마비효과를 관찰하였다 (도 4B).

2㎐의 느린 자극 속도 및 20㎐의 빠른 자극 속도에서 BTX-A-1와 BTX-A-2 간에 유의적 차이(p <0.05)가 없는 것을 확인하였으며, BTX-A-1 및 BTX-A-2 투여 군 모두 TA 근육에 마비 효과는 투여한 보툴리눔 독소의 용량과 관련이 있는 것을 확인하였다.

즉, 본 발명의 방법에 따라 제조된 보툴리눔 독소는 이미 상업적으로 판매되고 있는 알러건(Allergan) 사의 BOTOX^®와 비슷한 효과가 있는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 보툴리눔 독소의 제조방법:
(a) 보툴리눔 독소 생산 균주 배양액에 산을 처리하여 보툴리눔 독소를 산 침전시키는 단계;
(b) 상기 침전된 보툴리눔 독소에 완충용액을 첨가한 후, 프로테아제 억제제(protease inhibitor) 및 핵산분해 효소를 처리하여 보툴리눔 독소를 추출하는 단계;
(c) 상기 추출된 보툴리눔 독소에 산을 처리하여 보툴리눔 독소를 산 침전시킨 다음 침전물을 완충용액에 용해시키는 단계; 및
(d) 음이온교환 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계.
제1항에 있어서, 보툴리눔 독소 생산 균주는 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 정제된 보툴리눔 독소는 순도 98% 이상의 보툴리눔 독소 A형 단백질인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 산 침전은 pH 3.0 내지 4.5이 되도록 황산 또는 염산을 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 프로테아제 억제제(protease inhibitor)는 벤자미딘 염산(benzamidine HCl)인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 핵산분해 효소는 DNase 및 RNase인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 독소추출은 pH 4.5 내지 6.5에서 수행되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 산 침전은 pH 2.5 내지 4.5가 되도록 황산 또는 염산을 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 완충용액은 인산나트륨인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 pH 3.5 내지 7.5, 전도도(conductivity) 3 내지 30mS/cm의 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (d) 단계 이후,
(e) 보툴리눔 독소가 포함되어 있는 음이온교환 크로마토그래피 분획에 황산암모늄을 처리하여 침전시킨 다음, 침전물을 완충용액에 용해시키는 단계; 및
(f) 음이온교환 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 (e) 단계에서의 황산암모늄은 10 내지 50 중량% (w/v)의 농도가 되도록 첨가되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 (e) 단계의 완충용액은 인산나트륨인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 (e) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 pH 3.5 내지 7.5, 전도도(conductivity) 3 내지 30mS/cm의 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
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