ES2665288T3

ES2665288T3 - Procedimiento de producción de toxina botulínica

Info

Publication number: ES2665288T3
Application number: ES14832966.7T
Authority: ES
Inventors: Chung Sei Kim; Kwan Young Song; Kyoung Min Min; Yeong Duk An
Original assignee: Daewoong Co Ltd
Current assignee: Daewoong Co Ltd
Priority date: 2013-08-02
Filing date: 2014-05-07
Publication date: 2018-04-25
Anticipated expiration: 2034-05-07
Also published as: CN105392795A; PT2920199T; PL2920199T3; HK1215715A1; MX362821B; SA515370208B1; NO2920199T3; HRP20180679T1; EP2920199A1; JP2016521968A; DK2920199T3; AR096541A1; BR112015029973B1; JP2017141237A; MX2015016481A; RU2627159C2; PH12015501855A1; CY1120410T1; CN105392795B; CA2912553C

Abstract

Un procedimiento de producción de toxina botulínica, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) tratar un cultivo de una cepa productora de toxina botulínica con ácido para precipitar una toxina botulínica; (b) añadir tampón a la toxina botulínica precipitada, seguido de un tratamiento con un inhibidor de proteasa y nucleasa, extrayendo así la toxina botulínica; (c) tratar la toxina botulínica extraída con ácido para precipitar la toxina botulínica y disolver el precipitado en tampón; y (d) purificar la toxina botulínica mediante cromatografía de intercambio aniónico, en el que la precipitación ácida de la etapa (c) se realiza añadiendo ácido sulfúrico o ácido clorhídrico a la toxina botulínica extraída, de modo que la toxina botulínica alcance un pH de 2,5-4,5.

Description

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caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos. Además, se puede usar para diversas afecciones, que incluyen dolor de cabeza, migraña, cefalea tensional, cefalea sinusal, cefalea cervicogénica, trastornos de sudoración, hiperhidrosis axilar, hiperhidrosis palmar, hiperhidrosis plantar, síndrome de Frey, una línea de piel hipercinética, una arruga facial, líneas glabelares, patas de gallo, líneas de marioneta, un pliegue nasolabial, un trastorno de la piel, acalasia, estrabismo, fisura anal crónica, blefaroespasmo, dolor musculoesquelético, fibromialgia, pancreatitis, taquicardia, agrandamiento de próstata, prostatitis, retención urinaria, incontinencia urinaria, vejiga hiperactiva, espasmo hemifacial, temblores, mioclonías, trastornos gastrointestinales, diabetes, sialorrea, disinergia detrusor-esfínter, espasticidad post ictus, cicatrización de heridas, parálisis cerebral juvenil, espasmo del músculo liso, reestenosis, distonía focal, epilepsia, distonía cervical, trastorno de la tiroides, hipercalcemia, un trastorno obsesivo compulsivo, dolor artrítico, síndrome de Raynaud,, estrías gravídicas, adherencia peritoneal, vasoespasmos, rinorrea, contractura muscular, músculo dañado, distonía laríngea, calambre del escritor y síndrome del túnel carpiano.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "composición farmacéutica" significa una formulación que comprende la toxina botulínica como principio activo, y la formulación puede comprender al menos un ingrediente adicional (excipiente) en la composición farmacéutica además del principio activo neurotoxina botulínica. El ingrediente adicional puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en albúmina, albúmina de suero humano, albúmina de suero humano recombinante, gelatina, sacarosa, trehalosa, hidroxietil almidón, colágeno, lactosa, sacarosa, cloruro de sodio, polisacárido, caprilato, polivinilpirrolidona y sodio, pero sin limitación a los mismos. Además, un procedimiento para preparar una composición farmacéutica que comprende la toxina botulínica como principio activo comprende una etapa de combinar la toxina botulínica con un ingrediente adicional (excipiente), y la etapa de combinación puede seleccionarse de entre el grupo de procedimientos que consiste en secado por congelación, liofilización y secado al vacío.

Por lo tanto, una composición farmacéutica es una formulación que es adecuada para la administración diagnóstica, terapéutica o cosmética (p. ej., mediante la inyección intramuscular o subcutánea o mediante la inserción de un depósito o implante) a un sujeto, tal como un paciente humano. La composición farmacéutica puede ser: en un estado liofilizado o secado al vacío, una solución formada después de la reconstitución de la composición farmacéutica liofilizada o secada al vacío con solución salina o agua, o; como una solución que no requiere reconstitución. El principio activo puede ser uno de los serotipos de toxina botulínica A, B, C1, D, E, F o G o una toxina botulínica, las cuales pueden prepararse de forma nativa con bacterias Clostridial. Como se indica, una composición farmacéutica puede ser líquida o sólida, por ejemplo, secada al vacío. Los procedimientos ejemplares para formular una composición farmacéutica de principio activo de toxina botulínica se desvelan en la Publicación de Patente de los EE.UU. N.º 2003-0118598 publicada el 5 de noviembre de 2002.

En otro ejemplo de la presente invención, con el fin de confirmar el efecto de la proteína toxina de tipo A botulínica (DWP450) producida por el procedimiento de la presente invención, se midieron la amplitud del potencial de acción muscular compuesto (PAMC) y las velocidades de conducción (tC). En el experimento, se usaron dos proteínas diferentes de toxina botulínica de tipo A, BTX-A-1 (BOTOX®, Allergan Inc., California, EE. UU.) Y BTX-A-2 (DWP450) producidas por el Ejemplo 2 de la presente invención, en cuatro grupos divididos. En el grupo 1, se administraron 0,08 ml de cloruro de sodio (NaCl) a un músculo TA y no se trató otro músculo. En el grupo 2, se administraron 0,02 ml de BTX-A-1 (dos unidades) a un músculo TA y se administraron 0,02 ml de BTX-A-2 (dos unidades) a otro músculo TA. En el grupo 3, se administraron 0,04 ml de BTX-A-1 (cuatro unidades) a un músculo TA, y se administraron 0,04 ml de BTX-A-2 (cuatro unidades) a otro músculo TA. En el grupo 4, se administraron 0,08 ml de BTX-A-1 (ocho unidades) a un músculo TA y se administraron 0,08 ml de BTX-A-2 (ocho unidades) a otro músculo.

Una unidad de toxina botulínica se define como la LD50 tras la inyección peritoneal en ratones hembra Swiss Webster que pesan aproximadamente 18-20 gramos cada uno. Una unidad de toxina botulínica es la cantidad de toxina botulínica que mata al 50% de un grupo de ratones hembra Swiss Webs.

Se midieron las amplitudes del potencial de acción muscular compuesto (PAMC) causadas por la administración de BTX-A-1 y BTX-A-2, y como resultado, a una velocidad de estímulo lenta de 2 Hz, los grupos administrados con BTX-A-1 y BTX-A-2 mostraron un efecto paralítico sobre el músculo TA (dY) a los 3 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas y 4 semanas después de la administración (Fig. 4A), y a una velocidad de estímulo rápida de 20 Hz, los grupos administrados con BTX-A-1 y BTX-A-2 mostraron un efecto paralítico sobre el músculo TA (dY) a los 3 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas y 4 semanas después de la administración (Fig. 4B). No hubo diferencias significativas (p <0,05) entre BTX-A-1 y BTX-A-2 a una velocidad de estímulo lenta de 2 Hz y a un evaluador de estímulo rápido de 20 Hz, y el efecto paralítico sobre el músculo TA (dY) en los grupos administrados con BTX-A-1 y BTX-A-2 se relacionó con la dosificación de toxina botulínica administrada.

Se midieron las velocidades de conducción (tC) causadas por la administración de BTX-A-1 y BTX-A-2, y como resultado, se demostró que los grupos administrados con BTX-A-1 y BTX-A-2 no indujeron un retraso en la velocidad de conducción a una velocidad de estímulo lenta de 2 Hz y a una velocidad de estímulo rápida de 20 Hz (Fig. 5).

Específicamente, la toxina botulínica producida por el procedimiento de la presente invención muestra un efecto similar al de BOTOX® disponible en el mercado (Allergan, Inc.) y es dos veces más segura, porque tiene una mayor

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pureza que conduce a una disminución en la propiedad de circulación sistémica. de la toxina botulínica. Por tanto, se puede usar para diversos fines, incluido el tratamiento de trastornos neuromusculares, eliminación de arrugas y tratamiento de la hemiplejía espástica y parálisis cerebral.

Ejemplos

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a ejemplos. Será obvio para un experto en la técnica que estos ejemplos son solo con fines ilustrativos y no deben interpretarse para limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1: Cultivo de la cepa de Clostridium botulinum

1-1: Composición del medio usado en el cultivo

un medio que tiene una composición que comprende 2 % de hidrolizado de caseína, 1 % de extracto de levadura, 1 % de glucosa y 0,5 % de tioglicolato se usó para el cultivo de siembra y el cultivo principal de la cepa de Clostridium botulinum con el fin de producir una toxina botulínica.

1-2: Cultivo de siembra de la cepa de Clostridium botulinum

Se inocularon 20 μl de Clostridium botulinum (los Centros Coreanos para el Control y la Prevención de Enfermedades N.º de Acceso: 4-029-CBB-IS-001) en un tubo de cultivo que contenía10 ml de un medio estéril que tiene la composición descrita en el Ejemplo 1-1 y se sometió a cultivo de siembra primario (cultivo estacionario) a 35 °C durante 22-30 horas en condiciones anaeróbicas. Cuando se confirmó el crecimiento de la cepa en el cultivo de siembra primario, se inocularon 8 ml del cultivo de siembra primario en un frasco de cultivo de 1 l que contenía 800 ml de un medio estéril que tenía la misma composición del medio y se sometió a un cultivo de siembra secundario (cultivo estacionario) a 35 °C durante 8-15 horas en condiciones anaeróbicas.

1-3: Cultivo principal de la cepa de Clostridium botulinum

Con el fin de producir una toxina botulínica mediante el cultivo de la cepa de Clostridium botulinum, se realizó el cultivo principal de la cepa. Específicamente, se prepararon 9,3 l de un medio que tenía la composición descrita en el Ejemplo 1-1 y se colocaron en una incubadora de 10 l, seguido de la esterilización del medio. Se suministró nitrógeno para crear condiciones anaeróbicas, y el crecimiento de la cepa se realizó a una temperatura de 35 °C y a una velocidad de agitación de 50 rpm.

La cepa en el frasco de cultivo de 1 l sometida a cultivo de siembra secundario en el Ejemplo 1-2 se inoculó en una incubadora de 10 l a través de una línea de inoculación conectada al puerto de inoculación de la incubadora de 10 l. La cepa de Clostridium botulinum en la incubadora de 10 l se cultivó bajo las condiciones de 35 °C y 50 rpm y las condiciones de cultivo establecidas se mantuvieron, se verificaron y se registraron. Cuando la cepa se cultivó durante 100 horas o más, se completó el cultivo principal.

Ejemplo 2: Producción de toxina botulínica

2-1: Etapa de precipitación con ácido sulfúrico

La etapa de precipitación con ácido sulfúrico es un procedimiento de separación de proteínas en la que se añade ácido sulfúrico a un cultivo que contiene muchos tipos de proteínas para reducir el pH del cultivo al tiempo que mata las bacterias botulínicas que quedan después del cultivo de modo que las proteínas alcanzan el punto isoeléctrico para precipitar. El cultivo principal se realizó como se describe en el Ejemplo 1-3 y después de completar el cultivo principal, se añadió ácido sulfúrico 5N al cultivo mediante una bomba automática para alcanzar un pH de 3,4-3,6 medido con el sensor de pH de la incubadora de 10 l, y luego el cultivo se transfirió a un recipiente de 20 l (AS ONE, Cat. N.º AS5.372.06) a través de la línea de cosecha de la incubadora, y el recipiente de 20 l que contenía el precipitado de ácido sulfúrico se transfirió a una cabina de seguridad biológica (CSB). A continuación, se realizó la precipitación con ácido sulfúrico en la CSB.

2-2: Tratamiento enzimático y extracción de la toxina

Después de eliminar el sobrenadante del precipitado de ácido sulfúrico, se añadieron 700 ml de tampón de fosfato de sodio 1 M (pH 5,3) al precipitado. A continuación, la solución se ajustó a un pH de 5,0-6,0 mediante la adición de hidróxido de sodio 5N (NaOH). Para eliminar el ADN y el ARN del precipitado, se añadieron 60 ml de benzamidina HCl 0,4 M, 1 g de DNasa y 1 g de RNasa y se hicieron reaccionar con la solución durante aproximadamente 5 horas para extraer la toxina botulínica.

2-3: Precipitación del ácido clorhídrico y disolución de la toxina

El cultivo que incluía extracto de toxina se centrifugó a 4 °C a 12000 xg durante 15 minutos para separarlo en microgránulos y un sobrenadante, y el sobrenadante separado se transfirió a un frasco nuevo de 10 l (AS ONE, Cat. N.º AS5.372.04 ), y luego se ajustó a un pH de 3,4-3,6 mediante la adición de ácido clorhídrico 1N (HCl) y se

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sometió a precipitación con ácido clorhídrico en un refrigerador a 4 °C. El precipitado de ácido clorhídrico se centrifugó a 4 °C a 12000 x g durante 15 minutos, y se retiró el sobrenadante, después de lo cual se añadieron 50 ml de tampón de fosfato de sodio (pH 6,5) a los microgránulos de toxina para disolver la toxina.

2-4: Cromatografía de intercambio aniónico primaria

Después de la finalización del procedimiento de precipitación, con el fin de eliminar la mayoría de las impurezas principales distintas de la toxina botulínica de tipo A, se realizó la cromatografía usando resina de intercambio iónico. Específicamente, la resina de intercambio aniónico (Toyopearl SuperQ-650M, Tosoh Bioscience, P/N 17228) se empaquetó en una columna, después de lo cual la muestra que precipitó en el Ejemplo 2-3 se inyectó en la columna, y la toxina se eluyó con 50 mM. de tampón de elución de fosfato de sodio. En la etapa de purificación primaria, la proteína toxina de tipo A botulínica no se adsorbió en la resina de intercambio aniónico, y la mayoría de las impurezas principales se eliminaron por adsorción. Para la purificación de una toxina botulínica de alta pureza, la muestra se mantuvo a un pH de 4,5-7,0 y a una conductividad de 5-20 mS/cm.

2-5: Precipitación con sulfato de amonio

Se recogieron las fracciones que contenían la proteína toxina de tipo A botulínica purificada por cromatografía de intercambio aniónico, y se añadió sulfato de amonio a las mismas a una concentración de 20-40 % (p/v) para precipitar de nuevo la proteína toxina de tipo A botulínica. La proteína toxina de tipo A botulínica precipitada se disolvió de nuevo en fosfato de sodio 50 mM (pH 6,5).

2-6: Cromatografía de intercambio aniónico secundaria

Después de la finalización del procedimiento de precipitación con sulfato de amonio, con el fin de eliminar las impurezas menores distintas de la toxina botulínica de tipo A, se realizó cromatografía usando resina de intercambio iónico una vez más. Específicamente, la resina de intercambio aniónico (Toyopearl SuperQ-650M, Tosoh Bioscience, P/N 17228) se empaquetó en una columna, después de lo cual el precipitado de sulfato de amonio disuelto en el Ejemplo 2-5 se inyectó en la columna y la toxina se eluyó con tampón de elución de fosfato de sodio 50 mM. En este momento, la proteína toxina de tipo A botulínica no se adsorbió, y las impurezas menores se eliminaron por adsorción.

La purificación de una toxina botulínica de alta pureza se logra principalmente en la etapa de cromatografía de intercambio aniónico primaria, y la etapa de purificación mediante cromatografía de intercambio aniónico secundaria se realiza con el fin de eliminar las impurezas restantes. Para la purificación de una toxina botulínica de alta pureza, el precipitado de sulfato de amonio se mantuvo a un pH de 4,5-7,0 y q una conductividad de 5-20 mS/cm.

2-7: Preparación del líquido bruto

Las fracciones que contienen la proteína toxina de tipo A botulínica purificada mediante cromatografía de intercambio aniónico en el Ejemplo 2-6 se recogieron, se esterilizaron y se filtraron a través de un filtro de 0,2 mm para preparar un líquido bruto. El líquido bruto preparado se almacenó por debajo de -70 °C. La proteína toxina de tipo A botulínica producida se denominó "DWP450".

Ejemplo 3: Análisis de la pureza de la toxina botulínica purificada

La HPLC (e2695, Waters) se realizó mediante SEC (cromatografía de exclusión por tamaño). La fase móvil usada fue tampón de fosfato de sodio 100 mM (pH 6,5) y una columna TSK gel G4000SWXL (Tosoh Bioscience, P/N 08542) se conectó a una columna protectora (Tosoh Bioscience, P/N 08543) para P/N 08542 y se cargaron 20 μg de la proteína toxina de tipo A botulínica en la columna y se dejaron fluir a una velocidad de 1 ml/min durante 30 minutos. Como resultado, se demostró que la pureza de la toxina botulínica después de la cromatografía de intercambio aniónico primaria era del 98,38 % (Fig. 2) y la pureza de la toxina botulínica después de la cromatografía secundaria de intercambio aniónica fue del 98,99 % (Fig. 3).

Ejemplo 4: Evaluación de la seguridad de la toxina botulínica purificada

Con el fin de confirmar la seguridad de la proteína toxina de tipo A botulínica (DWP450) purificada en el Ejemplo 2, se realizó un experimento para comparar con la seguridad de BOTOX® (Allergan, Inc).

Las ratas macho blancas SD (Sprague-Dawley) se dividieron en los siguientes cinco grupos, que consistían cada uno compuesto en 10 machos y 10 hembras: un grupo administrado con 30 U/kg de un material de ensayo (DWP450); un grupo administrado con 60 U/kg del material de ensayo; un grupo administrado con 30 U/kg de un material comparativo (BOTOX® disponible de Allergan, Inc.); un grupo administrado con 60 U/kg del material comparativo; y un grupo de control (solución salina). Cada uno de los materiales de ensayo, el material comparativo y la solución salina se administró por vía intramuscular un total de cinco veces por semana durante 5 semanas.

En los grupos administrados con 60 U/kg del material de ensayo y 60 U/kg del material comparativo (BOTOX®), se añadieron adicionalmente cinco hembras y cinco machos, y se realizó un ensayo de toxicidad comparativa durante un período de recuperación de 12 semanas con el fin de evaluar la reversibilidad de la toxicidad (Tabla 1).

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estímulo rápida de 20 Hz. El efecto paralítico sobre el músculo TA se determinó midiendo la amplitud pico a pico de PAMC (dY), y el retraso en la velocidad de conducción se determinó midiendo el intervalo de tiempo entre el punto de estímulo y el punto máximo negativo.

El análisis por estimulación eléctrica se realizó antes de la administración de BTX-A-1 y BTX-A-2 y a los 3 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas y 4 semanas después de la administración, y las PAMC y las velocidades de conducción causadas por la administración de BTX-A-1 y BTX-A-2 se analizaron mediante ANOVA usando SAS (Versión 9.2, SAS Institute Inc., EE. UU.).

Como resultado, se observó que, a una velocidad de estímulo lenta de 2 Hz, los grupos administrados con BTX-A-1 y BTX-A-2 mostraron un efecto paralítico sobre el músculo TA (dY) a los 3 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas y 4 semanas después de la administración (Fig. 4A), y a una velocidad de estímulo rápida de 20 Hz, los grupos administrados con BTX-A-1 y BTX-A-2 mostraron un efecto paralítico sobre el músculo TA (dY) a los 3 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas y 4 semanas después de la administración (Fig. 4B).

No hubo diferencias significativas (p <0,05) entre BTX-A-1 y BTX-A-2 a una velocidad de estímulo lenta de 2 Hz y a un evaluador de estímulo rápido de 20 Hz, y el efecto paralítico sobre el músculo TA (dY) en los grupos administrados con BTX-A-1 y BTX-A-2 se relacionó con la dosificación de toxina botulínica administrada.

Se midieron las velocidades de conducción (tC) causadas por la administración de BTX-A-1 y BTX-A-2, y como resultado, se demostró que los grupos administrados con BTX-A-1 y BTX-A-2 no indujeron un retraso en la velocidad de conducción a una velocidad de estímulo lenta de 2 Hz y a una velocidad de estímulo rápida de 20 Hz.

Específicamente, se encontró que la toxina botulínica producida por el procedimiento de la presente invención mostraba un efecto similar al de BOTOX® disponible en el mercado (Allergan, Inc.).

Aplicabilidad industrial

El uso del procedimiento de la invención para la producción de una toxina botulínica hace posible producir una toxina botulínica de alta pureza mediante un procedimiento simple, lo que sugiere que el procedimiento de la invención es muy económico y eficiente. La toxina botulínica producida por el procedimiento de la presente invención tiene alta pureza en comparación con las toxinas botulínicas producidas por procedimientos convencionales, y por tanto tiene una mayor capacidad para actuar en un área local. Por tanto, la circulación sistémica de la toxina botulínica, que puede provocar efectos secundarios, se reduce para aumentar la seguridad. Por consiguiente, la toxina botulínica de la presente invención se puede usar para diversos fines, que incluyen el tratamiento de trastornos neuromusculares, eliminación de arrugas y tratamiento de la hemiplejía espástica y parálisis cerebral.

Aunque la presente invención se ha descrito en detalle con referencia a las características específicas, será evidente para los expertos en la técnica que esta descripción es solo para una realización preferente y no limita el alcance de la presente invención. Por tanto, el alcance sustancial de la presente invención estará definido por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

Claims

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