KR101853463B1 - 보툴리눔 독소의 정제 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 헤파린(Heparin) 친화성 컬럼을 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 보툴리눔 독소 정제 방법은 고순도의 보툴리눔 독소 생산에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

보툴리눔 독소의 정제 방법{Method for purifying botulinum toxin}
본 발명은 보툴리눔 독소의 정제 방법에 관한 것이다.
신경독성을 지닌 독소를 분비하는 클로스트리디움 균주들이 1890년대에서부터 지금까지 발견되었으며, 지난 70년간 이들 균주들이 분비하는 독소에 대한 특성 규명이 연구되어 왔다(Schant, E. J. 등, Microbiol. Rev. 56; 80; 1992). 그 중에서도 특히 보툴리눔 독소(botulinum toxin)는 제대로 멸균이 되지 않은 깡통 내용물이나 보존이 제대로 안 된 음식물에 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)이 발육함으로써 생성되는 신경독으로 식중독, 구토, 시각장애, 운동장애 등을 일으키는 것으로 알려져 있다. 이 독소를 섭취하면 잠복기는 12-72시간이며, 이후 운동 신경과 근육이 만나는 곳에서 신경전달 물질인 '아세틸콜린'의 분비를 막아 근육 마비를 초래한다. 상기 보툴리눔 독소는 소량으로 인체에 치명적이고 대량생산이 용이하므로 탄저균(Bacillus anthracis), 페스트(Yersinia pestis), 천연두(smallpox virus)와 더불어 4대 생물테러 무기로 사용될 수 있는 독소이다. 그러나, 보툴리눔 독소(botulinum toxin) 중 A형 독소의 경우에는 전신적으로는 인체에 영향을 미치지 않는 용량 이하로 주사하면 주사 부위의 국소 근육을 마비시킬 수 있어, 주름살 제거제, 경직성 편마비 및 뇌성마비의 치료제 등으로 광범위하게 사용할 수 있으므로 매우 유용한 독소이다.
상기와 같은 이유로 상기 보툴리눔 독소는 수요가 급증하고 있으며, 보툴리눔 독소의 정제 방법에 대한 연구가 시작되었다. 종래에는 보툴리눔 독소의 정제 방법으로 이온교환 크로마토그래피법을 사용하였는데, 정제된 유효성분인 보툴리눔 독소가 명확하게 분리 동정이 되지 않아 불순물이 포함되는 문제점이 있었다. 따라서 정제된 보툴리눔 독소의 순도를 향상시키기 위한 노력으로 정제 과정 중 DNase 및 RNase를 처리하는 방법(한국등록특허 제 1,025,617호), 산 침전, 추출, 핵산 분해제 첨가 및 결정화 단계를 거쳐 결정형(crystalline)의 보툴리눔 A형 독소를 제조하는 방법(일본공개특허 제1994-192296호), 이온교환 및 락토오스 컬럼을 이용하는 방법(미국등록특허 제 6,818,409호), 음이온교환 및 양이온교환 크로마토그래피를 이용하는 방법(미국공개특허 제2013-0156756호) 및 단백질 분해효소 억제제를 처리하는 방법(한국등록특허 제 1,339,349호) 등의 기술이 개발되었으나, 98% 이상의 순도를 보장하기가 어렵고, 정제 과정이 복잡하며, 정제기간이 길어(약 10일 내지 14일) 상업적으로 적용하기 어려운 문제가 있었다.
따라서 본 발명은, 헤파린(Heparin) 친화성 컬럼을 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 보툴리눔 독소의 정제 방법은 고순도의 보툴리눔 독소 생산에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 헤파린(Heparin) 친화성 컬럼을 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 방법에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구체예에서 보툴리눔 독소(botulinum toxin)란, 제대로 멸균이 되지 않은 깡통 내용물이나 보존이 제대로 안 된 음식물에 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)이 발육함으로써 생성되는 신경독으로 식중독, 구토, 시각장애, 운동장애 등을 일으키는 것으로 알려져 있다. 이 독소를 섭취하면 잠복기는 12 ~ 72시간이며, 이후 운동 신경과 근육이 만나는 곳에서 신경전달 물질인 '아세틸콜린'의 분비를 막아 근육 마비를 초래한다.
상기 보툴리눔 독소(botulinum toxin)는 그 혈청학적 특징에 따라 A 내지 G형의 7가지 형으로 나뉘어진다. 각 독소는 약 150KDa 정도의 독소 단백질을 가지고 있는데, 자연적으로는 여러 비독성 단백질들과 결합되어 있는 복합체로 이루어져 있다. 중간(Medium) 복합체(300kDa)는 독소 단백질과 비독성-비헤마글루티닌 단백질로 이루어져 있고, 큰(Large; 450kDa) 복합체 및 거대(Large-Large; 900kDa) 복합체는 중간 복합체가 헤마글루티닌(haemagglutinin)과 결합되어 있는 형태를 띠고 있다 (Sugiyama, H., Microbiol. Rev., 44: 419, 1980). 이러한 비독성 비헤마글루티닌 단백질들은 장내에서 낮은 pH와 각종 단백질 가수분해 효소로부터 독소를 보호하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 각 독소는 세포내 단백질 분해 효소의 작용이나 트립신과 같은 인위적인 효소 처리에 의하여 N 말단으로부터 1/3되는 위치에서 절단되어 2개의 단위체인 경쇄(L: light chain)(분자량; 50 kDa)와 중쇄(H: heavy chain)(분자량; 100kDa)로 나뉘어진다. 이렇게 나뉘어진 독소는 단일 폴리펩티드일 때에 비해 그 독성이 크게 증가한다. 두 단위체는 이황화결합에 의해 서로 연결되어 있으며, 각각은 다른 기능을 갖는다. 중쇄는 목표물(target)이 되는 세포의 수용체(receptor)와 결합하고(Park. M.K., 등, FEMS Microbiol. Lett. 72, 243; 1990), 낮은 pH(pH4)에서 생체막과 반응하여 채널(channel)을 형성하는 기능을 가지며(Mantecucco, C. 등, TIBS 18, 324; 1993), 경쇄는 약리활성를 가지고 있어 세제(detergent)를 사용하여 세포에 투과성을 부여하거나, 전기천공(electroporation) 등으로 세포내 투입되었을 때 신경전달물질의 분비를 방해한다(Poulain, B. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4090 ; 1988). 또한 상기 독소는 신경근육종말(neuromuscular junction)의 콜린성 전시냅스(cholinergic presynapse)에서 아세틸콜린의 엑소시토시스(exocytosis)를 저해하여 전신 무력증을 일으킨다. 극미량의 독소를 처리해도 독성이 나타나는 것으로 보아 이 독소는 어떤 효소 활성을 가질 것으로 생각되어 왔다(Simpson, L. L. 등, Ann. Rev. Pharmaeol. Toxicol. 26, 427; 1986).
최근에 밝혀진 바에 의하면, 독소는 메탈로펩티다제 활성(metallopeptidase activity)을 갖고 있으며 그 기질은 엑소시토시스 장치 복합체(exocytosis machinary complex)를 이루는 단위 단백질들인 시냅토브레빈(Synaptobrevin), 신택신(Syntaxin), 25KDa의 시냅토좀 연계 단백질(Synaptosomal associated protein of 25KDa) (SNAP25) 등이다. 각 형의 독소는 이 세 가지 단백질들 중 하나를 기질로 삼고 있는데, B, D, F 및 G형은 시냅토브레빈을, A와 E형은 SNAP25를, C형은 신택신을 특정 부위에서 절단하는 것으로 알려져 있다(Binz, T. 등, J. Biol. Chem. 265, 9153; 1994). 특히, 보툴리눔 독소 A 형은 pH 4.0~6.8의 묽은 수용액에 용해성인 것으로 알려져 있다. 약 7 이상의 pH에서 안정화 비-독소 단백질이 신경독소로부터 분리되어, 그 결과 독성이 점진적으로 손실되는데, 특히 pH 및 온도가 상승함에 따라 독성이 감소하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 구체예에서 헤파린(Heparin)이란, 황산기를 가진 산성 다당류의 일종으로 혈액응고 저지작용이 강한 물질이다. 1922년 발견되었으며, 고등동물의 간이나 폐 등 모세혈관이 많은 장기 및 혈액 속에 있다. 분자량은 약 1만 내지 2만이다. 모세혈관 주변의 비만세포(mast cell)로부터 생성되며, 조직 내에서는 단백질과 결합해서 무고 단백질을 만들며 알칼리, 효소 등에 의해 단백질을 제거하면 얻어진다. 화학적으로는 D-글루코사민과 D-글루쿠론산이 α-1,4의 결합으로 교대로 사슬 모양을 이룬다. 황산이 글루코사민의 N과 6위치 및 1개 걸러 글루쿠론산의 2위치에 결합하고 있다고 생각되고 있다. 트롬보플라스틴의 생성 및 트롬빈의 작용을 억제해서 혈액응고를 저지하므로, 현대 의학에서는 혈액응고방지 및 혈전방지에 사용된다. 또한, 상기 헤파린은 헤마글루티닌(hemagglutinin)과 결합하는 성질을 가진다. 식물 응집소(phytoagglutinius) 또는 렉틴(lectin)으로도 명명되는 헤마글루티닌은 많은 콩과식물에 천연적으로 존재하는 독성물질로서 적혈구를 응집시키는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 구체예에서 정제란, 어떤 물질로부터 혼재해 있는 불순물을 제거하여 순도를 높이는 조작을 의미하며, 그 방법으로 용해도의 차이를 이용한 재결정이나 분별결정, 증기압에 근거한 증류나 분별증류 및 분배, 흡착, 이온교환 크로마토그래피법, 전기영동법, 겔 여과법 등 여러 종류의 방법이 사용될 수 있다. 본 명세서에 있어서 정제는 보툴리눔균의 배양액으로부터 보툴리눔균이 과성장한 후 사멸되면서 생산한 보툴리눔 독소를 분리해내는 것이며, 보툴리눔 독소 정제 과정 중의 순도를 향상시키기 위한 방법으로 헤파린 친화성 컬럼을 사용할 수 있다. 헤파린은 헤마글루티닌(hemagglutinin)과 결합하는 성질을 가지며(Pethe K., 등, J Biol Chem. 2000 May 12;275(19):14273-80.), 보툴리눔 독소가 결합되어 있는 단백질 복합체는 헤마글루티닌을 포함하므로, 상기 헤파린 친화성 컬럼을 이용하여 순도 높은 보툴리눔 독소를 정제할 수 있을 것으로 기대된다. 본 명세서에 있어서 헤파린 친화성 컬럼은 헤파린-세파로오스 컬럼이나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, (a) 클로스트리디움 보툴리눔을 배양배지에서 배양하여 보툴리눔 독소를 생산하는 단계; (b) 상기 보툴리눔 독소가 생산된 배양액 내의 보툴리눔 독소를 침전시키는 단계; (c) 상기 침전물에 완충용액을 첨가한 후, 핵산을 제거하는 단계; (d) 음이온교환 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계; 및 (e) 헤파린 친화성 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소 단백질을 추출하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법을 제공하고, 상기 정제된 보툴리눔 독소는 순도 98% 이상의 보툴리눔 독소 A형 단백질인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법을 제공하며, 상기 (a) 단계에서의 배양배지는 카제인 다이제스트(casein digest), 효모추출물 및 글루코오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법을 제공하며, 상기 (b) 단계에서의 침전은 산을 이용한 산 침전인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법을 제공하며, 상기 산 침전은 황산으로 수행하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법을 제공하며, 상기 (c) 단계에서의 핵산 제거는 프로타민황산염으로 수행하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법을 제공하며, 상기 프로타민황산염은 최종 농도가 0.01 내지 0.2%(w/v)가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법을 제공하며, 상기 (d) 단계에서의 음이온교환 크로마토그래피는 다이에틸아미노에틸 셀룰로스 컬럼을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법을 제공하며, 상기 (e) 단계에서의 헤파린 친화성 크로마토그래피는 헤파린-세파로오스 컬럼을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법을 제공하며, 상기 (e) 단계 이후에 보툴리눔 독소 복합체를 단백질 크기별로 구획하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법을 제공하며, 상기 보툴리눔 독소 복합체를 단백질 크기별로 구획하는 단계는 수퍼로오스-6 컬럼을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, (a) 제 1항 내지 제 11항 중에서 선택된 어느 한 항 이상의 방법으로 보툴리눔 독소를 정제하는 단계; 및 (b) 상기 정제된 보툴리눔 독소를 인산염 완충액으로 희석하는 단계;를 포함하는 실용 보툴리눔 독소액의 제조 방법을 제공하고, 상기 실용 보툴리눔 독소액의 보툴리눔 독소 농도는 0.01 내지 1 ㎎/㎖인 실용 보툴리눔 독소액의 제조 방법을 제공한다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명은 헤파린(Heparin) 친화성 컬럼을 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 보툴리눔 독소의 정제 방법은 고순도의 보툴리눔 독소 생산에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 보툴리눔 독소의 정제 과정을 나타낸 모식도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
보툴리눔 균의 배양
-80℃에서 보관되어 있던 보툴리눔균(clostridium botulinum, 질병관리본부 관리번호: 4-003-CBB-CO-038)을 해동하여, CMM(Cooked Meat Medium)에 넣고 37℃ 혐기 조건에서 22 내지 26 시간 동안 배양하여 균 수를 증가시켰다. 상기의 균 수가 증가된 배양액을 TPM(독소생산배양액, Toxin production Medium; Casein digest 2%, Yeast extract 0.5%, glucose 0.5%)에 넣고 35℃ 혐기 조건 하에서 93 내지 99 시간 동안 추가 배양하여 과성장한 후 사멸된 보툴리눔균으로부터 독소를 생산하였다.
보툴리눔 독소의 정제
실시예 1의 방법으로 생산된 보툴리눔 독소를 정제하였다.
보툴리눔 독소 정제의 전체 공정 모식도는 도 1에 나타내었다.
2.1 황산 침전 및 독소 추출
실시예 1의 보툴리눔 독소 생산이 유도된 배양액에 pH 3.2 내지 3.5가 될 때까지 3.7N H2SO4 를 첨가하고, 2 내지 8℃에서 16 내지 24 시간 동안 침전시켰다. 상기 황산 침전액을 원심분리하여 침전물을 수득한 후, 침전물에 200mM 인산염 완충액에 용해시킨 1M NaCl (pH 6.0)을 첨가하고 1 시간 동안 회전시키면서 침전물로부터 단백질 용해하고, 이를 다시 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 상기 과정을 3회 반복하였다.
2.2 프로타민황산염(Protamine sulfate) 과 황산암모늄 (Ammonium sulfate) 처리
실시예 2-1의 방법으로 분리된 상층액에 9%의 황산프로타민을 최종 농도가 0.09%가 될 때까지 첨가하였다. 프로타민황산염은 연어 정자(sperm)로부터 추출된 물질로, 강한 양전하를 나타내므로 상층액 속의 핵산과 결합하여 보툴리눔 균 침전물에 섞여 있는 핵산을 제거하는 역할을 한다. 상기 황산프로타민이 첨가된 수용액을 원심분리하여 상층액을 분리하고, 황산암모늄을 최종 포화농도가 80% 이상이 될 때까지 첨가한 후 2 내지 8℃에서 12 내지 24 시간 동안 침전 반응시켰다. 이를 원심분리하여 침전물을 수득하였다.
2-3. DEAE 컬럼 정제
실시예 2-2의 방법으로 수득된 침전물을 50 mM 인산염 완충액(pH 6.0)으로 용해하고, 용액을 투과막(membrane)에 넣고 50 mM 구연산염 완충액(2 내지 8℃, pH 5.5) 속에서 투석하였다. 투석은 총 3회를 진행하되, 1차와 2차는 2시간 이상을, 3차는 12 시간 이상을 실시하였다. 상기의 투석액을 원심분리하여 상층액을 분리하고, 분리된 상층액을 DEAE(다이에틸아미노에틸 셀룰로스, Diethylaminoethyl cellulose, GE-Healthcare, 17-0709-01) 컬럼이 연결된 FPLC(고속 단백질 액체 크로마토그래피, Fast Protein Liquid Chromatography)에 주입하였다. 컬럼을 통과한 액체에 황산암모늄을 최종 포화농도 40%가 되도록 첨가하였고 3일 동안 침전시킨 후, 원심분리하여 침전물을 수득하였다.
2-4. 헤파린- 세파로오스 컬럼 정제
실시예 2-3의 방법으로 수득된 침전물을 50 mM 인산염 완충액(pH 6.0)으로 용해하고, 용액을 투과막(membrane)에 넣고 10 mM 구연산염 완충액(2 내지 8℃, pH 5.5) 속에서 투석하였다. 투석은 총 3회를 진행하되, 1차와 2차는 2시간 이상을, 3차는 12시간 이상을 실시하였다. 상기의 투석액을 원심분리하여 상층액을 분리하고, 분리된 상층액을 헤파린-세파로오스(Heparin-sepharose, GE-Healthcare, 17-0407-03) 컬럼이 연결된 FPLC에 주입하였다. 0 ~ 0.3 M NaCl로 단백질을 추출(elution)하고, SDS-PAGE 분리를 통해서 보툴리눔 독소 복합체(botulinum toxin complex)가 포함되어 있는 분획(fraction)을 수득하여 황산암모늄을 최종 포화농도 80%가 되도록 첨가하였다. 이를 12 내지 24 시간 동안 침전시킨 후, 원심분리하여 침전물을 수득하였다.
2-5. 수퍼로오스 -6 컬럼 정제
실시예 2-4의 방법으로 수득된 침전물을 50 mM 인산염 완충액(pH 6.0)으로 용해하고 원심분리 후, 상층액을 수퍼로오스-6(Superose-6, GE-Healthcare, 17-5172-01) 컬럼이 연결된 FPLC에 주입하였다. 수퍼로오스-6 컬럼은 입자 크기에 따른 분리용 컬럼으로 단백질을 크기에 따라 분리 정제할 수 있는 컬럼이다. 50 mM 인산염 완충액(pH 6.0)에 용해된 500 mM NaCl로 단백질을 추출(elution)하고, SDS-PAGE 분리를 통해서 보툴리눔 독소 복합체(botulinum toxin complex)가 있는 구획(fraction)을 수득하였다. 상기 구획을 투과막(membrane)에 넣고 50 mM 인산염 완충액에 용해된 250 mM NaCl 용액(2 내지 8℃, pH 6.0)에서 12시간 이상 투석을 수행하였다. 투석을 마친 후의 단백질 용액을 보툴리눔 독소 원액으로 명명하였다.
2-6. 보툴리눔 독소의 희석
상기 실시예 2-5의 방법으로 수득된 보툴리눔 독소 원액을 50 mM 인산염 완충액(pH 6.0)으로 희석하여 사용 가능한 농도의 보툴리늄 독소액(보툴리늄 독소 0.1 ㎎/㎖)을 제조하였다.
보툴리눔 독소의 효과 분석
하기와 같은 기준으로 보툴리눔 독소의 효과를 분석하였다.
순도
구분 정제시 사용한 컬럼
대조군 음이온 컬럼
제조예 1 음이온 컬럼+헤파린 친화성 컬럼
제조예 2 음이온 컬럼+헤파린 친화성 컬럼+단백질 사이즈 컬럼
대조군에 비해 제조예 1 및 제조예 2의 보툴리눔 독소 순도가 40% 이상 향상되었다.
생물학적 활성도
구분 정제시 사용한 컬럼
대조군 음이온 컬럼
제조예 1 음이온 컬럼+헤파린 친화성 컬럼
제조예 2 음이온 컬럼+헤파린 친화성 컬럼+단백질 사이즈 컬럼
대조군에 비해 제조예 1 및 제조예 2의 보툴리눔 독소의 생물학적 활성도가 2배 이상 향상되었다.
본 발명을 바람직한 방법에 관련하여 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범주 내에서 다른 실시형태, 개조 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 광범위한 종류의 신경독을 본 발명의 방법에 효과적으로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 두 가지 이상의 보툴리눔 독소와 같이, 두 가지 이상의 신경독을 동시에 또는 연속하여 투여하는 경구용 제형을 포함한다. 예를 들어, 임상적인 반응이 감소되거나, 항체 발현이 중성화될 때까지 보툴리눔 독소 타입 A를 투여한 다음, 보툴리눔 독소 타입 B 또는 E의 경구용 제형을 투여할 수 있다. 이와 달리, 바람직한 치료결과의 개시 및 지속시간을 제어하기 위하여 둘 이상의 보툴리눔 세로타입 A-G의 혼합물을 국부적으로 투여할 수 있다. 또한, 보툴리눔 독소와 같은 신경독이 치료 효과를 발휘하기 전에 탈신경화의 향상된 또는 더욱 신속한 개시와 같은 입증된 부가 효과를 얻기 위해, 신경독 경구용 제형을 투여하기 전에, 동시에 또는 후에 비신경독 화합물을 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 참조문헌, 기사, 공보 및 특허 및 특허 출원이 온전히 본 명세서에 참조로 병합되어 있다. 따라서, 하기 청구의 범위의 진의 및 범주는 상기한 바람직한 실시형태의 설명에 제한되어서는 안 된다.

Claims (13)

  1. 보툴리눔 독소의 생물학적 활성도를 증가시키기 위하여,
    (a) 클로스트리디움 보툴리눔을 배양배지에서 배양하여 보툴리눔 독소를 생산하는 단계;
    (b) 상기 보툴리눔 독소가 생산된 배양액 내의 보툴리눔 독소를 침전시키는 단계;
    (c) 상기 침전물에 완충용액을 첨가한 후, 핵산을 제거하는 단계;
    (d) 음이온교환 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계;
    (e) 헤파린 친화성 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소 단백질을 추출하는 단계; 및
    (f) 보툴리눔 독소 단백질을 단백질 크기별로 구획하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    정제된 보툴리눔 독소는 순도 98% 이상의 보툴리눔 독소 A 형 단백질인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서의 배양배지는 카제인 다이제스트(casein digest), 효모추출물 및 글루코오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서의 침전은 산을 이용한 산 침전인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 산 침전은 황산으로 수행하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서의 핵산 제거는 프로타민황산염으로 수행하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 프로타민황산염은 최종 농도가 0.01 내지 0.2%(v/v)가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서의 음이온교환 크로마토그래피는 다이에틸아미노에틸 셀룰로스 컬럼을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 (e) 단계에서의 헤파린 친화성 크로마토그래피는 헤파린-세파로오스 컬럼을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
  10. 삭제
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 (f) 단계에서의 보툴리눔 독소 단백질을 단백질 크기별로 구획은 수퍼로오스-6 컬럼을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
  12. (a) 제 1항의 방법으로 보툴리눔 독소를 정제하는 단계; 및
    (b) 상기 정제된 보툴리눔 독소를 인산염 완충액으로 희석하는 단계;를 포함하는 실용 보툴리눔 독소액의 제조 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 실용 보툴리눔 독소액의 보툴리눔 독소 농도는 0.01 내지 1 ㎎/㎖인 실용 보툴리눔 독소액의 제조 방법.



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